ES2315648T3

ES2315648T3 - Composiciones farmaceuticas que comprenden una combinacion de rapamicina o su derivado y pimecrolimus para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino (ibd).

Info

Publication number: ES2315648T3
Application number: ES04720871T
Authority: ES
Inventors: Henrietta Moore
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2003-03-17
Filing date: 2004-03-16
Publication date: 2009-04-01
Anticipated expiration: 2024-03-16
Also published as: KR100855140B1; MA27671A1; BRPI0408423A; AU2004222563B2; WO2004082681A1; US20060154952A1; EP1608368B1; JP2006515017A; DE602004016830D1; TW200835484A; PE20050313A1; AR043504A1; NO20054778D0; HRP20050800A2; CA2517671A1; ECSP056006A; EP1608368B8; KR20050110023A; EP1608368A1; CL2004000535A1

Abstract

El uso de una combinación de rapamicina o un derivado de rapamicina y un compuesto de fórmula (Ver fórmula) en la que bien R1 es un grupo (a) de fórmula (Ver fórmula) en la que R5 es cloro, bromo, yodo o azido, R6 es hidroxi o metoxi, y R 4 es hidroxi y existe un enlace sencillo en la posición 10,11; o R 4 está ausente y existe un doble enlace en la posición 10,11, o bien R1 es un grupo (b) o (c) de fórmula (Ver fórmula) en las que R6 es como se define anteriormente, y R4 es hidroxi y existe un enlace sencillo en la posición 10,11, R 2 es oxo y existe un enlace sencillo en la posición 23,24; o R2 es hidroxi opcionalmente protegido y existe un enlace sencillo o doble en la posición 23,24; o R 2 está ausente y existe un doble enlace en la posición 23,24; y R3 es metilo, etilo, propilo o alilo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino y enfermedades asociadas con la misma.

Description

Composiciones farmacéuticas que comprenden una combinación de rapamicina o su derivado y pimecrolimus para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD).

La presente invención se refiere al uso de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) y enfermedades asociadas con la misma.

En un aspecto, la presente invención proporciona el uso de una combinación de rapamicina o un derivado de rapamicina y un compuesto de fórmula

1

en la que bien

R_{1} es un grupo (a) de fórmula

2

en la que

R_{5} es cloro, bromo, yodo o azido,

R_{6} es hidroxi o metoxi, y

R_{4} es hidroxi y existe un enlace sencillo en la posición 10,11; o está ausente, y existe un doble enlace en la posición 10,11, o bien

R_{1} es un grupo (b) o (c) de fórmula

3

en las que

R_{6} es como se define anteriormente, y

R_{4} es hidroxi y existe un enlace sencillo en la posición 10,11,

R_{2} es oxo y existe un enlace sencillo en la posición 23,24; hidroxi opcionalmente protegido y existe un enlace sencillo o doble en la posición 23,24; o está ausente y existe un doble enlace en la posición 23,24;

R_{3} es metilo, etilo, propilo o alilo,

además de al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino y enfermedades asociadas con la misma.

La IBD en el hombre, como muchas otras enfermedades inflamatorias o autoinmunes crónicas, puede observarse como resultado de una convergencia de interacciones entre genes de susceptibilidad, el ambiente y el sistema inmunitario. La extensión del efecto recíproco entre estos factores determina la manifestación clínica de la enfermedad; enfermedad de Crohn (CD) o colitis ulcerativa (UC) y los diversos subgrupos clínicos que se definen por la gravedad y la localización. La principal hipótesis actual sobre la patogénesis de la IBD es que es una respuesta inmunitaria desregulada a antígenos bacterianos entéricos normales (véase, por ejemplo, Kirsner JB, Inflammatory Bowel Disease, 5ª ed; W.B. Saunders, p. 208-39, p. 299-304; p. 305-14 y p. 315-25). Tanto en la CD como en la UC, el número de linfocitos T de la lámina propia se incrementa (véase, por ejemplo, Selby et al. (1984), Gut; 25 (1): 32-40). Existe una evidencia, principalmente a partir de modelos experimentales tales como el modelo de SCID-IBD, de que los subgrupos supresores de células T evitan una reacción con la flora normal encontrada en el intestino (véase, por ejemplo, Groux H, et al. (1999), Immunol. Today; 20 (10):442-5). En la IBD, este equilibrio se ha perturbado y la cascada inflamatoria resultante se desarrolla en una respuesta crónica. La transferencia de células T CD4^{+} singeneicas que expresan altos niveles de CD45RB (DD4^{+}CD45RB^{Hi}) a ratones SCID (SCID-IBD) induce una colitis grave y enfermedad debilitante que habitualmente da como resultado la muerte de los ratones en 4-8 semanas después de la transferencia de las células CD4^{+}CD45RB^{Hi} patológicas (véase, por ejemplo, Powrie F et al. (1993), Int. Immunol.; 5 (11):1461-71). Este modelo grave de colitis comparte muchas de las características de la IBD humana y en efecto se ha usado a lo largo de los 90 para potenciar la comprensión adicional de la enfermedad en el hombre y se considera que refleja la IBD más que cualquier otro modelo. Estos incluyen colitis inducida por administración de agentes exógenos o por manipulación de genes (véanse, por ejemplo, Blumberg RS et al. (1999) Curr. Opin. Immunol.; 11 (6):648-56; Strober W et al. (1998), Ann. Intern. Med.; 128 (10):848-56; Strober W et al. (1998), Scand. J .Immunol.; 48 (5):453-8). Usando el modelo de SCID-IBD, los anticuerpos contra TNF\alpha, INF\gamma e IL-12 han mostrado efectos beneficiosos transitorios y parciales (véanse, por ejemplo, Powrie F et al. (1994), Immunity.; 1 (7):553-62; Simpson SJ, et al. (1998), J. Exp. Med.; 187 (8):1225-34; Mackay F et al. (1998), Gastroenterology; 115 (6):1464-75). Más recientemente, también se han presentado efectos beneficiosos con anticuerpos para el ligando CD134 (para OX40L, véase, por ejemplo, Malmstrom V et al. (2001), J. Immunol.; 166 (11):6972-81); para CD154 (véase, por ejemplo, Liu Z. et al. (2000), J. Immunol.; 164 (11):6005-14; De Jong YP et al. (2000), Gastroenterology; 119 (3):715-23) y para la integrina \beta7 o MAdCAM-1 (véase, por ejemplo, Picarella D et al. (1997), J. Immunol.; 158 (5):2099-106). Conjuntamente, estos datos demuestran que la enfermedad puede suprimirse mediante la inhibición bien de los mediadores inflamatorios principales, incluyendo TNF\alpha, y/o citoquinas implicadas en la neutralización de la diferenciación y la función efectora de tipo Th1 o bien interfiriendo con las etapas de presentación de antígeno que se producen en los nódulos linfáticos o con el proceso de retorno leucocítico de estas células.

Una composición farmacéutica que comprende en combinación rapamicina o un derivado de rapamicina y un compuesto de fórmula I se denomina posteriormente en la presente memoria "una composición de (acuerdo con) la presente invención".

En otro aspecto de la presente invención, el compuesto de fórmula I es un compuesto de fórmula

4

El pimecrolimus (recomendado por INN) (ASM981; Elidel^{TM}), es decir, {[1E-(1R,3R,4S)]1R,9S,12S,13R,14S,
17R,18E,21S,23S,24R,25S,27R}-12-[2-(4-cloro-3-metoxiciclohexil)-1-metilvinil]-17-etil-1,14-dihidroxi-23,25-di-
metoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28,dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.0(4,9)]octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona se describe, por ejemplo, en EP 427 680 (33-epi-33-cloro-FR 520 del ejemplo 66a).

En otro aspecto de la presente invención, el derivado de rapamicina es un compuesto de fórmula

5

en la que

R_{1} es CH_{3} o alquinilo(C_{3-6}),

R_{2} es H, -CH_{2}-CH_{2}-OH, 3-hidroxi-2-(hidroximetil)-2-metil-propanoílo o tetrazolilo, y

X es =O, (H,H) o (H,OH),

con tal de que R_{2} sea distinto de H cuando X es =O y R_{1} es CH_{3},

o un profármaco del mismo cuando R_{2} es -CH_{2}CH_{2}-OH, por ejemplo un éter fisiológicamente hidrolizable del mismo.

Derivados de rapamicina representativos de fórmula II incluyen, por ejemplo, rapamicina hidrogenada en 32, por ejemplo, según se describe en WO 96/41807 y US 5 256 790, incorporadas en la presente memoria mediante referencia, tal como, por ejemplo, 32-desoxorrapamicina, 16-pent-2-iniloxi-32-desoxorrapamicina, rapamicina sustituida con O en 16, por ejemplo según se describe en WO 94/02136, WO 95/16691 y WO 96/41807, cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria mediante referencia, tal como, por ejemplo, 16-pent-2-iniloxi-32(S o R)-dihidrorrapamicina, 16-pent-2-iniloxi-32(S o R)-dihidro-40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina, rapamicina sustituida con O en 40, por ejemplo, según se describe en US 5 258 389, WO 94/09010, WO 92/05179, US 5 118 677, US 5 118 678, US 5 100 883, US 5 151 413, US 5 120 842, WO 93/11130, WO 94/02136, WO 94/02485 y WO 95/14023, todas las cuales se incorporan en la presente memoria mediante referencia, tal como, por ejemplo, 40-[3-hidroxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato]-rapamicina (también denominada CCI779) o 40-epi-(tetrazolil)-rapamicina (también denominada ABT578). Un compuesto preferido es, por ejemplo, 40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina (Compuesto A posteriormente en la presente memoria), por ejemplo, descrita en el Ejemplo 8 en WO 94/09010, o 32-deoxorrapamicina, o 16-pent-2-iniloxi-32(S)-dihidro-rapamicina, por ejemplo descrita en WO 96/41807. Los derivados de rapamicina también pueden incluir (epi)rapálogos, por ejemplo como los descritos en WO98/02441 y WO01/14387, por ejemplo los compuestos AP23573, AP23464, AP23675 o AP23841; o derivados tales como biolimus 7 o biolimus 9. Los derivados de rapamicina también pueden incluir profármacos de rapamicina tales como TAF A93.

Derivados de rapamicina adecuados, por ejemplo, también se describen en US 3 929 992 y US 5 258 389. Preferiblemente, las composiciones de la presente invención comprenden rapamicina, también conocida como sirolimus (rapamicina; Rapamune®) y/o el derivado de rapamicina everolimus (Compuesto A, RAD001; 40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina; Certican®).

Toda la bibliografía de patentes citada en la presente memoria se introduce en la misma mediante referencia.

En otro aspecto de la presente invención, la composición farmacéutica que comprende en combinación 40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina y pimecrolimus comprende al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo un portador y/o diluyente apropiado, por ejemplo, incluyendo cargas, aglutinantes, desintegrantes, acondicionadores del flujo, lubricantes, azúcares y edulcorantes, fragancias, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes y/o emulsionantes, solubilizantes, sales para regular la presión osmótica y/o tampones.

Un compuesto de una combinación de acuerdo con la presente invención, es decir un compuesto de fórmula I, por ejemplo pimecrolimus, puede estar en forma libre, en forma de una sal, en forma de solvato o en forma de una sal o un solvato, cuando existen sales y/o solvatos.

En otro aspecto de la presente invención, el compuesto de fórmula I está en forma de sal.

Una composición de la presente invención puede comprender uno o más derivados de rapamicina, preferiblemente rapamicina o un derivado de rapamicina, y uno o más compuestos de fórmula I, preferiblemente uno, por ejemplo pimecrolimus.

Una composición de la presente invención se basa adecuadamente en emulsiones, microemulsiones, preconcentrados para emulsiones o preconcentrados para microemulsiones, o dispersiones sólidas, especialmente preconcentrados para microemulsiones de agua en aceite o microemulsiones de aceite en agua de rapamicina o un derivado de rapamicina, por ejemplo un compuesto de fórmula II, y un compuesto de fórmula I, por ejemplo pimecrolimus.

Una composición de la presente invención puede comprender además compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Tales compuestos activos adicionales incluyen, por ejemplo, agentes antiinflamatorios e inmunomoduladores.

En otro aspecto, la composición farmacéutica de la presente invención comprende además un agente aniinflamatorio y/o inmunomodulador.

Una composición de la presente invención incluye

-: combinaciones fijas, en las que un compuesto de fórmula I, por ejemplo pimecrolimus, y rapamicina o un derivado de rapamicina, por ejemplo un compuesto de fórmula II, tal como el Compuesto A, están en la misma formulación;

-: estuches (= estuche de partes), en los que un compuesto de fórmula I, por ejemplo pimecrolimus, y rapamicina o un derivado de rapamicina, por ejemplo un compuesto de fórmula II, tal como el Compuesto A, en formulaciones separadas se venden en el mismo envase, por ejemplo con instrucciones para la coadministración; y

-: combinaciones libres en las que un compuesto de fórmula I, por ejemplo pimecrolimus, y rapamicina o un derivado de rapamicina, por ejemplo un compuesto de fórmula II, tal como el Compuesto A, se envasan separadamente, pero se dan instrucciones para la administración simultánea o secuencial.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un estuche de partes farmacéutico que comprende rapamicina o un derivado de rapamicina, por ejemplo un derivado de rapamicina de fórmula II, por ejemplo el Compuesto A, y un compuesto de fórmula I, por ejemplo pimecrolimus, además de instrucciones para la administración simultánea o secuencial, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la IBD y enfermedades asociadas con la misma.

Se ha encontrado ahora sorprendentemente una composición farmacéutica, por ejemplo sólida, tal como un comprimido, que comprende una combinación fija de rapamicina o un derivado de rapamicina, incluyendo un compuesto de fórmula II, por ejemplo el compuesto A, y un compuesto de fórmula I, por ejemplo pimecrolimus, como agentes activos, por ejemplo una composición farmacéutica oral.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica, por ejemplo una composición farmacéutica oral como una combinación fija, por ejemplo una composición oral sólida, en la forma de una dispersión sólida que comprende rapamicina o un derivado de rapamicina, por ejemplo el Compuesto A, y un compuesto de fórmula I, por ejemplo pimecrolimus, y un portador, por ejemplo celulosa, opcionalmente en presencia de excipientes como los mencionados anteriormente.

Las composiciones en forma de una dispersión sólida pueden administrarse de cualquier forma conveniente, por ejemplo en forma de comprimido, cápsula, gránulo o polvo.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención, incluyendo una composición farmacéutica oral, pueden prepararse según sea apropiado, por ejemplo, de acuerdo con, tal como análogamente a, un método que es convencional, o según se describe en la presente memoria.

Para la preparación de una composición o combinación oral fija, por ejemplo un comprimido, de la presente invención, puede usarse una dispersión sólida que comprende un compuesto de fórmula I, por ejemplo pimecrolimus, y rapamicina o un derivado de rapamicina, por ejemplo un compuesto de fórmula II, y un portador, tal como celulosa, por ejemplo hidroxipropilmetilcelulosa. Las dispersiones sólidas son conocidas o pueden obtenerse según sea apropiado. Un comprimido puede obtenerse, por ejemplo, mediante mezcladura de los agentes activos con un portador y opcionalmente un excipiente adicional, granulación en seco antes o después de añadir el excipiente adicional y compresión de la mezcla obtenida. Excipientes adicionales incluyen, por ejemplo

-: lubricantes, tales como estearato de Mg,

-: cargas, por ejemplo azúcares, tales como lactosa,

-: agentes de fluencia, tales como dióxido de silicio, por ejemplo Aerosils,

-: desintegrantes, tales como polivinilpirrolidona, por ejemplo povidonas, crospovidonas (homo- o co-polímeros de N-vinilpirrolidona).

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La relación en peso de un compuesto de fórmula I, por ejemplo pimecrolimus, y rapamicina o un derivado de rapamicina, por ejemplo un compuesto de fórmula II, en una composición oral de la presente invención no es crítica, incluyendo, por ejemplo, una relación en peso de, por ejemplo, aproximadamente 1:10 a 800:1. Si se usan el compuesto pimecrolimus y el Compuesto A como agentes activos, el pimecrolimus se usa preferiblemente en un exceso, por ejemplo una relación en peso apropiada de pimecrolimus: Compuesto A incluye una relación de, por ejemplo, aproximadamente 10:1 a 800:1.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un comprimido para administración oral, que comprende

-: Compuesto A y pimecrolimus como agentes activos, por ejemplo en forma de una dispersión sólida,

-: una celulosa como un portador, por ejemplo hidroxipropilmetilcelulosa,

-: opcionalmente desintegrantes, por ejemplo polivinilpirrolidona,

-: opcionalmente agentes de fluencia, por ejemplo un Aerosil,

-: opcionalmente lubricantes, por ejemplo estearato de Mg,

-: opcionalmente cargas, por ejemplo azúcares tales como lactosa, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la IBD y enfermedades asociadas con la misma.

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En otro aspecto, la presente invención proporciona un comprimido de la presente invención que comprende en % en peso

-: pimecrolimus: de 2 a 8%, por ejemplo 4%;

-: Compuesto A: de 0,05 a 0,25%, por ejemplo 0,13%;

-: hidroxipropilmetilcelulosa (por ejemplo 3 cps): de 10 a 30%, por ejemplo 21,4%;

-: lactosa (por ejemplo malla 200): de 0,6 a 2,0%, por ejemplo 1,2%;

-: hidroxitolueno butilado: de 0,005 a 0,025%, por ejemplo 0,013%

-: lactosa secada por pulverización: de 25,0 a 70,0%, por ejemplo 50,8%;

-: crospovidona: de 10,0 a 40,0%, por ejemplo 20,0%;

-: dióxido de silicio coloidal (Aerosil 200®): de 0,5 a 2,5%; por ejemplo 1,5%

-: estearato magnésico: de 0,5 a 2,0%, por ejemplo 1,0%.

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Tal comprimido, por ejemplo, puede contener, por ejemplo, de aproximadamente 10 a 60 mg de pimecrolimus, por ejemplo 30 mg, y de 0,1 a 2 mg de Compuesto A, por ejemplo 1 mg.

Un compuesto de la presente invención puede administrarse mediante cualquier ruta apropiada, por ejemplo análogamente a la administración de un compuesto de fórmula I, por ejemplo pimecrolimus, y rapamicina o un derivado de rapamicina, por ejemplo un compuesto de fórmula II.

Las composiciones de la presente invención pueden prepararse según sea apropiado, por ejemplo análogamente a un método que es convencional, por ejemplo mezclando un compuesto de fórmula I, por ejemplo pimecrolimus, y rapamicina o un derivado de rapamicina, en combinación o cada uno separadamente, además de al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

También se ha encontrado que una clase de compuestos que incluye FK506 en combinación con rapamicina o un derivado de rapamicina es útil en el tratamiento de enfermedades inflamatorias y mediadas inmunológicamente.

La utilidad de los derivados de rapamicina de fórmula II y de combinaciones de la invención como las descritas anteriormente para tratar enfermedades y estados como los especificados anteriormente en la presente memoria puede demostrarse en pruebas animales o clínicas estándar, por ejemplo según se describe posteriormente en la presente memoria.

Las dosificaciones diarias requeridas para poner en práctica los métodos de la presente invención variarán dependiendo de, por ejemplo, la naturaleza química y los datos farmacocinéticos de un compuesto de la presente invención empleado, el paciente individual, el modo de administración y la naturaleza y la gravedad de los estados que se tratan. Sin embargo, en general, para resultados satisfactorios en mamíferos superiores, por ejemplo seres humanos, una dosis diaria indicada está en un intervalo similar, pero inferior, que el intervalo en el que se administra generalmente un compuesto de fórmula I, por ejemplo pimecrolimus, y rapamicina o un derivado de rapamicina. Un intervalo de dosificación diaria preferido es aproximadamente de 0,1 a 25 mg de rapamicina o un derivado de rapamicina de fórmula II, por ejemplo el Compuesto A, como una sola dosis o en dosis divididas. Dosificaciones diarias adecuadas para los pacientes son del orden de, por ejemplo, 0,1 a 25 mg por vía oral de rapamicina o un derivado de rapamicina de fórmula II, por ejemplo el Compuesto A.

Una composición de la presente invención puede administrarse mediante cualquier ruta apropiada, por ejemplo análogamente a la administración de un compuesto de fórmula I, por ejemplo pimecrolimus, y rapamicina o un derivado de rapamicina, por ejemplo un compuesto de fórmula II. Por ejemplo, rapamicina o un derivado de rapamicina de fórmula II, por ejemplo el Compuesto A, puede administrarse mediante cualquier ruta convencional, en particular enteralmente, por ejemplo oralmente, por ejemplo en forma de comprimidos, cápsulas, soluciones bebibles, nasalmente, pulmonarmente (mediante inhalación) o parenteralmente, por ejemplo en forma de soluciones o suspensiones inyectables. Formas de dosificación unitaria adecuadas para administración oral comprenden de alrededor de 0,05 a 12,5 mg, habitualmente de 0,25 a 10 mg de rapamicina o un derivado de rapamicina de fórmula II, por ejemplo el Compuesto A, junto con uno o más diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables para el mismo.

En la presente descripción, los términos "tratamiento" o "tratar" se refieren a tratamiento tanto profiláctico como preventivo así como tratamiento curativo o modificador de la enfermedad, incluyendo el tratamiento de pacientes con riesgo de contraer enfermedad o que se sospecha que han contraído enfermedad así como pacientes que están enfermos o se ha diagnosticado que sufren una enfermedad o estado médico.

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Descripción de las figuras

Figura 1 a Figura 3

Muestran el peso corporal de los ratones SCID-IBD después de haberse reconstituido con 2x10^{5} células T CD_{4}^{+}
CD45RB^{Hi}, tratados y no tratados con pimecrolimus (ASM), Compuesto A y una combinación de ASM + Compuesto A. Los ratones PBS son ratones no transfectados. El tratamiento se iniciaba el día 1 después de la transferencia y continuaba diariamente. Los datos se expresan como el % de peso corporal medio (con relación al peso el día 0) \pm s.e.m. para n=8 (con pocas excepciones, en las que n=5, 6 ó 7) ratones por grupo **p<0,01, *p<0,05 con relación al grupo tratado con vehículo, se muestra la pérdida de peso corporal.

Se muestran, en la Figura 1, los resultados de usar una Dosificación 1 (Compuesto A: 0,1 mg/kg/d, ASM: 60 mg/kg/d), en la Figura 2 los resultados de usar una Dosificación 2: (Compuesto A: 0,1 mg/kg/d, ASM: 30 mg/kg/d) y en la Figura 3 los resultados de usar una Dosificación 3: (Compuesto A: 0,05 mg/kg/d, ASM: 10 mg/kg/d).

Figura 4

Muestra la gravedad de la inflamación de colon en ratones SCIB-IBD después de diversos tratamientos, las evaluaciones de gravedad se dan como se describe en el Ejemplo 1.

Las temperaturas se dan en grados Celsius (º) y están sin corregir.

Las siguientes abreviaturas se usan en la presente memoria:

ASM: pimecrolimus

AUC: Área bajo la Curva

ANOVA: Análisis de varianza

BW: Peso corporal

CD: Enfermedad de Crohn

CyA: Ciclosporina A

FACS: Clasificador de Células Activado por Fluorescencia

H & E: Hematoxilina y eosina

HTAB: Bromuro de hexadeciltrimetilamonio

IBD: Enfermedad Inflamatoria del Intestino

IFN: Interferón

IL-: Interleuquina

i.p.: Intraperitoneal

MPO: Mieloperoxidasa

MLN: Nódulo linfático mesentérico

MTOR: Diana mamífera de rapamicina

PBS: Solución salina tamponada con fosfato

ratones PBS: Ratones SCID que reciben PBS i.p. en lugar de células T que provocan enfermedad

p.o.: Por vía oral

RAD: Compuesto A, everolimus

SCID: Inmunodeficiente Combinado Grave

s.e.m.: Error estándar de la media

SD: Desviación estándar

TMB: 3,3',5,5'-Tetrametilbencidina

TNF: Factor de necrosis tumoral

UC: Colitis ulcerativa

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Ejemplo 1 Métodos de prueba Modelo de Ratones SCID-IBD

Ratones scid/scid BALB/cJ y C.B.17 hembra (Fox Chase SCID®, Bomholtgaard, Dinamarca) se mantienen en jaulas ventiladas (Micro-vent tipo 84-II, Allentown Caging Equipment Co., Allentown, New Jersey, EE.UU. de A.) bajo condiciones libres de patógenos específicas. Los procedimientos experimentales realizados sobre los ratones están autorizados bajo la licencia número MA 1048/00 (Magistratabteilung Nº 58, Amt der Wiener Landesregierung).

Brevemente, linfocitos T CD4^{+}CD45RB^{Hi} se aíslan de bazos de ratones BALB/c mediante clasificación con FACS bicromática a través de una barrera vivos/muertos y se inyectan (2 x 10^{5} células/ratón, i.p.) en ratones SCID hembra de 6-9 semanas de edad. Los ratones de control negativo reciben PBS i.p. y uno de tales ratones está en cada jaula como un avisador para controlar posibles infecciones en esta colonia inmunodeficiente (ratones PBS).

Los ratones SCID se reconstituyen en primer lugar con las células T CD4^{+}C1745RB^{Hi} y a continuación se tratan con compuestos de prueba o vehículo como controles. Como compuestos de prueba, se usan Compuesto A (RAD) y pimecrolimus (ASM). Se llevan a cabo 3 estudios separados usando diferente dosificación. En cada estudio, ambos compuestos se administran solos y se combinan. Los 3 estudios siguen el mismo protocolo básico de 4 grupos de ratones con un grupo que recibe, mediante sonda oral diaria, ambos vehículos (placebo), un grupo Compuesto A solo, un grupo ASM solo y un grupo o una combinación de Compuesto A y pimecrolimus, desde el día 1 al día 29 después de la transferencia celular. Dosificaciones administradas:

Estudio 1: Dosificación 1: Compuesto A: 0,1 mg/kg/d, ASM: 60 mg/kg/d,

Estudio 2: Dosificación 2: Compuesto A: 0,1 mg/kg/d, ASM: 30 mg/kg/d, y

Estudio 3: Dosificación 3: Compuesto A: 0,05 mg/kg/d, ASM: 10 mg/kg/d.

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El peso corporal de cada ratón se verifica entretanto y al final del estudio los ratones se pesan.

Los ratones son anestesiados al final del estudio y se extrae sangre a través de punción cardíaca para la separación en suero que se congela y se almacena a -80º.

También se extrae sangre en EDTA 10 mM para la preparación para análisis en FACS.

El bazo y MLN se toman de cada ratón, se pesan y se procesan para el análisis en FACS de suspensiones monocelulares. Se toma una fotografía de la cavidad abdominal abierta y a continuación un trozo de 1 cm de largo del colon, justo por encima del recto, se fija en formalina para histología.

Los especímenes se embeben en parafina, se cortan secciones (3 \mum de grosor) y se tiñen con H & E.

Un análisis de FACS de cuatro colores se realiza sobre las suspensiones celulares preparadas a partir de la sangre, el bazo y los nódulos linfáticos mesentéricos (MLN) de cada ratón.

Los anticuerpos se obtienen de Pharmingen. Las células que son doblemente positivas para CD3 y CD4 se cuentan como linfocitos. Las células positivas para Ly-6G (antígeno de diferenciación mieloide) y negativas para CD3 o CD4 son neutrófilos (además, sus características celulares (dispersión directa y lateral) las distinguen de las otras células).

El número de células por muestra se calcula a partir del número de células total en cada suspensión celular y el % de células identificadas positivamente (muestras analizadas en un FACS Calibur® usando software CeliQuest Pro®) por muestra.

Puede calcularse así la media de estos valores para un grupo de ratones. Para procesar algunos de los datos adicionalmente, los valores determinados se ajustan mediante el valor de fondo encontrado en ratones no transferidos y calculando el % de reducción, o en efecto de incremento, en el número de células medio, con relación al grupo tratado con placebo.

Todos los datos presentados como valores medios se califican mediante un valor de s.e.m. Los datos del peso corporal se analizan bien mediante análisis de medidas repetidas o bien encontrando en primer lugar la AUC media y a continuación aplicando una prueba de comparación múltiple de ANOVA con corrección retrospectiva de Tukey. Las evaluaciones histológicas se representan como la evaluación de gravedad media y se comparan con una prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney con valores p exactos (software StatXact-5) y factor de corrección retrospectivo de Bonferroni. Todos los otros datos se analizan en primer lugar con respecto a la distribución normal y a continuación se aplica la prueba de ANOVA para una comparación múltiple. La significación estadística se toma como p<0,05.

La reacción de desarrollo en los ratones SCID a la transferencia de células T CD4^{+}CD45RB^{Hi} muestra que la expansión de células T es el primer episodio y siguen las secuelas inflamatorias, lo que puede medirse como una pérdida crítica de peso corporal, una grave inflamación de colon y signos sistémicos tales como niveles de haptoglobina sérica incrementados y neutrofilia. La población de células T creciente con el tiempo también da como resultado un incremento en el tamaño de órganos linfoides que por lo demás son comparativamente pequeños en los ratones SCID no transferidos. Para el día 28 después de la transferencia de células T, la inflamación es relativamente coherente dentro de un grupo de ratones y esto se ha adoptado como el tiempo más corto en el que pueden medirse los efectos exactos del tratamiento con compuestos de prueba. Se encuentra que los efectos de un intervalo de dosis de Compuesto A y ASM como compuestos preventivos simples son, en resumen, intervalos de dosis eficaz comparativa y son de 30 a 100 mg/kg/d de administración de ASM y de 0,1 a 1 mg/kg/d de Compuesto A. En las presentes pruebas, se usan dosis submáximas de cada compuesto y se determina el efecto del tratamiento simple y combinado en el mismo estudio.

Resultados Efecto sinérgico del tratamiento combinado de ratones SCID-IBD con Compuesto A y ASM sobre la pérdida de peso corporal

El primer síntoma visible resultante de la transferencia de células T CD4^{+}CD45RB^{Hi} que provocan enfermedad a ratones SCID es una pérdida intensa de peso corporal, habitualmente significativa 21 días después de la transferencia. Estos ratones (denominados placebo en estos estudios, por ejemplo, en las Figuras) continúan perdiendo peso corporal hasta que se produce la muerte, generalmente de 4 a 8 semanas después de la transferencia celular. Los ratones no transferidos (denominados "ratón PBS" en las Figuras) permanecen estables o ganan peso en el transcurso del estudio. En los tres estudios individuales descritos en la presente memoria, se calcula que el % de diferencia medio en el peso corporal entre los ratones no transferidos y tratados con vehículo es 16,3 \pm 1,8%.

Si los ratones SCID transferidos se tratan con Compuesto A solo o con ASM solo, solamente se encuentra una inhibición significativa, pero baja, de peso corporal para ratones tratados con ASM con una dosificación de 60 mg/kg/d. Mientras que, así, las dosificaciones usadas de compuesto solo solamente tienen pequeños efectos sobre la pérdida de peso corporal, una administración combinada de Compuesto A y ASM tiene un efecto protector significativo, incluso a las dosis más bajas de ASM (10 mg/kg/d) y Compuesto A (0,05 mg/kg/d), véase, por ejemplo, la Figura 3. Puesto que la dosificación administrada de Compuesto A y ASM solos no tiene o solamente tiene un pequeño efecto significativo sobre la pérdida de peso, el efecto protector de una administración combinada no puede ser aditivo, sino que es sinérgico.

Se han obtenido datos adicionales (no mostrados) que confirman el efecto sinérgico de una combinación de acuerdo con la presente invención.

En resumen, se ha encontrado un efecto sinérgico de una combinación de ASM y Compuesto A en el modelo SCID-IBD, cuando se usan dosis submáximas de 60, 30 y 10 mg/kg/d de ASM y 0,1, 0,1 y 0,05 mg/kg/d de Compuesto A, respectivamente. La dosis de 60 mg/kg/d de ASM solo todavía provocaba efectos significativos por sí misma pero todos los otros grupos de tratamiento simple daban como resultado una inhibición de la enfermedad solamente leve.

Significativamente, se han obtenido los siguientes resultados:

-: Ninguna de las tres combinaciones, lo más sorprendentemente tampoco las dosis más bajas de 10 mg/kg/d de ASM y 0,05 mg/kg/d de Compuesto A, da como resultado pérdida de peso (datos mostrados, véanse las Figuras 1 a 3)

-: A las combinaciones de dosis bajas de 10 y 0,05 mg/kg/d, se muestra un efecto sinérgico sobre la inflamación de colon. Cualquier compuesto solo tenía muy poco efecto, mientras que las evaluaciones de gravedad en el grupo de tratamiento combinado son en gran parte leves (datos no mostrados).

-: ASM reduce potentemente los niveles de haptoglobina sérica a 60 y 30 mg/kg/d mientras que el Compuesto A es muy débilmente activo a 0,1 ó 0,05 mg/kg/d. De nuevo la sinergia es evidente en el estudio a dosis bajas en el que el % de reducción de cada compuesto solo era 32,7% (ASM 10 mg/kg/d) ó 27,4% (Compuesto A, 0,05 mg/kg/d) mientras que el grupo de tratamiento combinado se inhibe significativamente en 81,0% (datos no mostrados).

-: En el estudio con dosis bajas no hay una reducción significativa en los números de linfocitos en ninguno de los grupos de tratamiento, aunque los números en el grupo combinado se reducen (46,5, 19,0 y 48,0% en sangre, bazo y MLN, respectivamente) con relación a los ratones tratados con vehículo. En el estudio en el que se administran ASM y Compuesto A en dosis superiores (30 mg/kg/d y 0,01 mg/kg/d, respectivamente; estudio 2) hay reducciones significativas en los números de linfocitos (76,0, 80,3 y 90,7% en sangre, bazo y MLN, respectivamente), mientras que los números en los grupos de tratamiento simple (ASM o Compuesto A, respectivamente, administrados solos) no se reducen. De forma similar, con la dosis superior de ASM (60 mg/kg/d; estudio 1), que solo disminuye los números de linfocitos específicamente en los MLN (73,5%), la combinación con Compuesto A (0,1 mg/kg/d) da como resultado reducciones significativas tanto en sangre (65,4%) como bazo (64,8%) además de una reducción potenciada (93,2%) en los MLN. La dosis de 0,1 mg/kg/d de Compuesto A solo tiene solamente efectos débiles, si los tiene, sobre los números de linfocitos.

ASM981 combinado con Compuesto A actúa sinérgicamente para reducir la inflamación de colon en ratones SCID-IBD

La inflamación en el colon de ratones SCID-IBD comparte muchas características observadas en tejido lesionado de un colon con enfermedad de Crohn. Para examinar el daño mucosal intestinal en ratones SCID-IBD, se realizó un examen histológico de las secciones de colon de acuerdo con parámetros morfológicos definidos. La colitis grave asociada con este modelo de IBD se caracteriza por un infiltrado celular masivo que en algunas zonas implica casi toda la submucosa. El infiltrado es mixto y está comprendido por linfocitos, macrófagos, neutrófilos y algunos eosinófilos. También es evidente la pérdida de una arquitectura de criptas, elongación prolongada e hiperplasia epitelial. Una sección de colon intensamente inflamada también tendrá abscesos en forma de cripta. Se dan evaluaciones numéricas según el siguiente esquema: una evaluación de 0 a 3 se da para el infiltrado leucocítico en el que 1 es suave, 2 es moderado y 3 es un infiltrado intenso que incluye la capa submucosal. Una evaluación de 0 a 2 se da para el agotamiento de células de Goblet donde 2 se da para una falta completa de la tinción con azul alcián, 0 se da para una cantidad normal de tinción y 1 es intermedia. Una evaluación de 0 a 3 se da para hiperplasia mucosal y cambios degenerativos que incluyen elongación de las criptas, hiperplasia epitelial, presencia de abscesos en forma de cripta, erosiones y necrosis epitelial. La evaluación posible máxima es 8 y los ratones PBS se evalúan 0.

Se encontró que la dosis de 60 mg/kg/d de ASM 981 solo tenía un efecto significativo. Dosis de Compuesto A por debajo de 0,5 mg/kg/d no son significativamente activas y tampoco en este modelo. Sin embargo, los dos compuestos juntos reducen la inflamación (Figura 5) hasta niveles suaves (evaluaciones por debajo de 4) que no podían alcanzarse mediante los efectos aditivos de cada uno solo.

En conclusión, en el modelo de SCID-IBD, con dosificaciones que solas tienen efectos mínimos, el tratamiento combinado con pimecrolimus y Compuesto A da como resultado una prevención altamente significativa de la enfermedad. El fuerte efecto que se observa sobre el peso corporal y la inflamación de colon no se correlaciona solamente con los números de linfocitos. El efecto sinérgico no es exclusivo de los números de linfocitos sino que puede estar afectando a la actividad o la función de los linfocitos así como otras células implicadas en la enfermedad. Estos datos confirman que una combinación de pimecrolimus y Compuesto A actúa sinérgicamente en el modelo de ratón SCID-IBD.

Ejemplo 2 Preparación de un comprimido que contiene Compuesto A y pimecrolimus

Para una tableta que tiene un peso total de alrededor de 750 mg, una dispersión sólida de 30 mg de pimecrolimus y una dispersión sólida de 1,00 mg de Compuesto A con 160 mg de hidroxipropilmetilcelulosa (3 cps) como un portador se mezclan con 8,90 g de lactosa (malla 200), 0,10 mg de hidroxitolueno butilado, 381,25 mg de lactosa secada por pulverización, 150,00 mg de crospovidona, 11,25 mg de dióxido de silicio coloidal (Aerosil 200®) y 7,50 mg de estearato magnésico, la mezcla obtenida se somete a granulación en seco y la mezcla granulada obtenida se comprime en comprimidos de 750 mg (+/- 10%) de peso total.

Se obtiene un comprimido para uso oral.

Claims

1. El uso de una combinación de rapamicina o un derivado de rapamicina y un compuesto de fórmula

6

en la que bien

R_{1} es un grupo (a) de fórmula

7

en la que

R_{5} es cloro, bromo, yodo o azido,

R_{6} es hidroxi o metoxi, y

R_{4} es hidroxi y existe un enlace sencillo en la posición 10,11; o R_{4} está ausente y existe un doble enlace en la posición 10,11, o bien

R_{1} es un grupo (b) o (c) de fórmula

8

en las que

R_{6} es como se define anteriormente, y

R_{4} es hidroxi y existe un enlace sencillo en la posición 10,11,

R_{2} es oxo y existe un enlace sencillo en la posición 23,24; o

R_{2} es hidroxi opcionalmente protegido y existe un enlace sencillo o doble en la posición 23,24; o

R_{2} está ausente y existe un doble enlace en la posición 23,24; y

R_{3} es metilo, etilo, propilo o alilo,

para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino y enfermedades asociadas con la misma.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que un compuesto de fórmula I es un compuesto de fórmula

9

3. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el derivado de rapamicina es un compuesto de fórmula

\vskip1.000000\baselineskip

10

en la que

R_{1} es CH_{3} o alquinilo(C_{3-6}),

R_{2} es H, -CH_{2}-CH_{2}-OH, 3-hidroxi-2-(hidroximetil)-2-metil-propanoílo o tetrazolilo,

X is =O, (H,H) o (H,OH),

con tal de que R_{2} sea distinto de H cuando X es =O y R_{1} is CH_{3},

o un profármaco del mismo cuando R_{2} es -CH_{2}-CH_{2}-OH.

4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, en el que el derivado de rapamicina es 40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina.

5. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 4, en el que un compuesto de fórmula I es pimecrolimus.