ES2315438T3

ES2315438T3 - Composicion de inhibidor de metaloproteinasa de tejido quimicamente modificado de tipo tres (timp-3) y procedimientos.

Info

Publication number: ES2315438T3
Application number: ES03005363T
Authority: ES
Inventors: Scott M. Silbiger; Raymond A. Koski
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1993-10-06
Filing date: 1994-10-04
Publication date: 2009-04-01
Anticipated expiration: 2014-10-04
Also published as: US20030143693A1; ATE412749T1; EP0648838B1; EP1319669B1; IL162152A0; IL111171A; DK1319669T3; EP0648838A1; SI0648838T1; US7435719B2; ES2194852T3; HK1009287A1; EP2011875A1; US6562596B1; DE69432581D1; IL111171A0; ZA947781B; US20060286085A1; DK0648838T3; US7071317B2

Abstract

Polipéptido humano recombinante que presenta parte o la totalidad de la estructura primaria del polipéptido como se ha expuesto en la figura 1 y que presenta la propiedad biológica que consiste en inhibir una metaloproteinasa, en el que dicho polipéptido recombinante está sustancialmente exento de otras proteínas humanas o agentes patológicos, y en el que el polipéptido está modificado químicamente.

Description

Composición de inhibidor de metaloproteinasa de tejido químicamente modificado de tipo tres (TIMP-3) y procedimientos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a inhibidores de metaloproteinasa. En particular, la invención se refiere a los inhibidores de metaloproteinasa de tejido de mamífero químicamente modificados (denominados en la presente memoria de tipo tres o "TIMP-3"), y a los fragmentos.

Antecedentes de la invención

Los tejidos conectivos se mantienen en equilibrio dinámico mediante los efectos opuestos de síntesis y degradación de la matriz extracelular. La matriz extracelular del tejido conectivo está constituida fundamentalmente por colágenos, con proteoglucanos, fibronectina, laminina y otros componentes minoritarios que constituyen el resto.

La degradación de la matriz es producida por la liberación de las metaloproteinasas neutras procedentes de las células de tejido conectivo residentes y de las células inflamatorias invasoras que son capaces de degradar a pH fisiológico la mayoría de las macromoléculas de la matriz. Véase la Tabla 1, a continuación. Las proteinasas incluyen las colagenasas, las gelatinasas y las proteoglucanasas del tejido de mamífero; la leucocito-colagenasas y las gelatinasas (Murphy et al., Biochem. J. 283: 289-221 (1982); Hibbs et al., J. Biol. Chem. 260: 2493-2500 (1985)); macrófago-colagenasas y elastasas (Werb et al. J. Exp. Med. 142: 346-360 (1975); Banda et al., Biochem. J. 193: 589-605 (1981)); colagenasas tumorales (Liotta et al., PNAS-USA 76: 2268-2272 (1979); Liotta et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 98: 124-198 (1981); y Salo et al; J. Biol. Chem. 258: 3058-3063 (1983)). Para un examen general de las colagenasas y de su papel en el metabolismo normal y patológico del tejido conectivo véase Collagenase in Normal and Pathological Connective Tissues, David E. Woolley y John M. Evanson, eds., John Wiley & Sons Ltd. (1988).

Existen más de cinco tipos diferentes de colágeno (I, II, III, IV, V, etc.) que están distribuidos de forma diferente entre los tejidos. Existe una homología considerable y una similitud estructural entre los diversos tipos de colágeno. Determinadas cologenasas presentan alguna especificidad para determinados tipos de colágeno. Véase la Tabla 1, a continuación; Matrisian, Trends In Genetics 6: 121-125 (1990). Con respecto a la inhibición de las colagenasas y de otras metaloproteinasas que degradan la matriz, es posible que, dependiendo de las enzimas, sustratos y mecanismos inhibidores existentes, un inhibidor pueda actuar en solo una, en varias, o en todas las colagenasas y metaloproteinasas.

TABLA 1 Metaloproteinasas que degradan la matriz

1

Las metaloproteinasas de matriz se dividen en tres subclases principales, indicadas con números árabes, basándose en sus especificidades del sustrato.

Las enzimas de cada clase están en negrita y las denominaciones alternativas se muestran entre paréntesis. MMP, metaloproteinasa de matriz; PMN, leucocito polimorfonuclear.

Las bases fundamentales de las enfermedades degenerativas de los puntos del tejido conectivo con las metaloproteinasas específicas de la matriz desempeñan un papel fundamental en la etiología de estas enfermedades. Dichas enfermedades incluyen epidermólisis vesicular distrófica; artritis reumatoide; úlcera corneal, epidérmica o gástrica; periodontopatía; enfisema; osteopatía y metástasis o invasión tumoral.

La mayoría de los estudios sobre degradación del tejido conectivo y de las enfermedades que implican dicha degradación han limitado la determinación de las metaloproteinasas a la colagenasa (la más ampliamente estudiada de este grupo de metaloproteinasas). Se comprende sin embargo, que los efectos simultáneos de la colagenasa y de las demás metaloproteinasas que degradan la matriz agravarán la degradación del tejido conectivo más de lo que se consigue mediante la colagenasa sola.

Se descubrieron inhibidores naturales específicos de la colagenasa en medio bruto a partir de tejidos conectivos cultivados. Se ha estudiado un inhibidor de metaloproteinasa conocido como TIMP (inhibidor de tejido de metaloproteinasas) con respecto a las propiedades fisicoquímicas y a la bioquímica de su interacción con la colagenasa, Murphy et al., J. Biochem. 195: 167-170 (1981); Cawston et al., J. Biochem. 211: 313-318 (1983); Stricklin et al., J. Biol. Chem. 258: 12252-12258 (1983) y se ha aislado el ADN que lo codifica, Docherty et al., Nature 318: 65-69 (1985); Carmichael et al., PNAS-USA 83: 2407-2411 (1986). En un modelo de cultivo celular in vitro de migración de la célula tumoral a través de una membrana basal natural, el TIMP fue capaz de detener la migración de una línea celular tumoral que segrega colagenasa, Thorgeirsson et al., J. Natl. Canc. Inst. 69: 1049-1054 (1982). La colonización in vivo del pulmón de ratón por las células del melanoma B16-F10 murino se inhibió mediante inyecciones de TIMP, Schultz et al., Cancer Research 48: 5539-5545 (1988). La publicación de la patente europea nº EP 0 189 784 también se refiere al TIMP.

McCartney et al., Eur. J. Biochem. 130: 79-83 (1983) describe la purificación de un inhibidor de metaloproteinasa procedente de leucocitos humanos.

DeClerck et al., Cancer Research 46: 3580-3586 (1986) describe la presencia de dos inhibidores de colagenasa en el medio acondicionado procedente de células bovinas endoteliales de aorta.

Murray et al., J. Biol. Chem. 261: 4154-4159 (1986) describe la purificación y la secuencia parcial de aminoácidos de un inhibidor de colagenasa procedente del cartílago bovino.

Langley et al., patente EP 0 398 753 ("Metalloproteinase Inhibitor", publicada el 22 de noviembre de 1990) da a conocer un nuevo inhibidor de metaloproteinasa y análogos, los polinucleótidos que codifican los mismos, los procedimientos de producción, las composiciones farmacéuticas y los procedimientos de tratamiento. El polipéptido de la Figura 2 en la presente memoria se denomina TIMP-2, el cual designa una molécula distinta de TIMP-1, supra. La patente EP 0 398 753 describe tanto el TIMP-2 recombinante como el humano.

Staskus et al., J. Biol. Chem. 266: 449-454 (1991) describe un inhibidor de metaloproteinasa aviar de 21 kDa obtenido a partir de fibroblastos de pollo. Los autores indican las similitudes bioquímicas con otros componentes del grupo TIMP y TIMP-2 de proteínas y el estado en que puede estar una variante de TIMP en el material aviar o puede representar una tercera proteína dentro de la familia de inhibidores de metaloproteinasa. (Este material se denomina en la presente memoria "ChIMP-3").

Pavloff et al., J. Biol. Chem. 267: 17321-17326 (1992) da a conocer el ADNc y la estructura primaria de un inhibidor de proteinasa procedente de los fibroblastos del embrión de pollo.

Yang et al., PNAS-USA 89: 10676-10680 (1992) describe el papel de un TIMP-3 de pollo con una proteína de 21 kDa.

El presente trabajo se refiere a un tercer tipo de polipéptidos inhibidores de metaloproteinasa.

Sumario de la invención

Según la presente invención, se proporciona una clase de inhibidores de metaloproteinasa para el tejido. Por comodidad, los presentes polipéptidos se denominan "TIMP-3", estos polipéptidos representan una nueva clase de compuestos de los inhibidores de metaloproteinasas para el tejido.

Específicamente, la presente invención proporciona un polipéptido humano recombinante que presenta parte o la totalidad de la estructura primaria del polipéptido como se ha expuesto en la figura 1 y que presenta la propiedad biológica que consiste en inhibir una metaloproteinasa, en el que dicho polipéptido recombinante está sustancialmente exento de otras proteínas humanas o agentes patológicos, y en el que el polipéptido se encuentra químicamente modificado. La presente invención proporciona asimismo un kit de diagnóstico para detectar una correlación entre la ausencia de producción de TIMP-3 en un espécimen tumoral y su potencial metastásico que comprende un polipéptido humano recombinante de la invención y un material de acondicionamiento. Además, está previsto el Arn antisentido que es complementario a una parte de la secuencia de ADN que se ha expuesto en la figura 1.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia del ADNc y la secuencia de aminoácidos de un inhibidor de metaloproteinasa de tipo 3 ("TMIP-3") recombinante del tejido humano. Se presenta la secuencia completa de 1.240 pares de bases que codifica un polipéptido completo de 211 aminoácidos. Una secuencia principal hidrófoba se encuentra en la posición -23 a -1. La cisteína inicial de la proteína madura se encuentra en la posición +1. Los aminoácidos correspondientes a los oligonucleótidos degenerados que identifican los productos originales de PCR están subrayados, excepto que se utilice analíticamente el oligo correspondiente a YTIK para confirmar la identidad de los productos de PCR antes del secuenciado. Una zona de glucosilación potencial está en cursiva. Una secuencia variante con señales de poliadenilación se marca con asteriscos. (Las abreviaturas utilizadas en la presente memoria para los aminoácidos, las abreviaturas de una sola letra o de tres letras y las de los ácidos nucleicos son las utilizadas normalmente, como en Stryer, Biochemistry, 3ª ed. 1988, W.H. Freeman, N.Y., en la contraportada).

La Figura 2 es una fotografía de un gel de agarosa de los productos de PCR de la primera cadena del ADNc, que demuestra la ampliación del ácido nucleico humano. La vía 1 presenta los productos por PCR de la primera cadena del ADNc del riñón del feto humano cebada con los cebadores 449-15 (SEC ID nº 1) y 480-27 (SEC ID nº 2). La vía 2 presenta los resultados de la ampliación por PCR de la primera cadena del ADNc del riñón del feto cebada con cebadores 449-15 (SEC ID nº 1) y 480-28 (SEC ID nº 3). La vía 3 es la referencia con el equipo de PCR (Perkin-Elmer-Cetus). La vía 4 es el ADN de TIMP-2 cebado con los cebadores 449-15 (SEC ID nº 1) y 480-27 (SEC ID nº 2). La vía 5 son los marcadores del peso molecular.

La Figura 3 es una fotografía del material que contiene gel SDS-PAGE teñido con plata como sigue: vía 1, marcadores del peso molecular; vía 2, TIMP-2, reducido; vía 3, blanco; vía 4, E. coli procedente del TIMP-3 de la Figura 1, reducido, antes de la diálisis; vía 5, E. coli procedente del TIMP-3 de la Figura 1, reducido, después de la diálisis, vías 6, 7, 8, blanco; vía 9, E. coli procedente del TIMP-3 de la Figura 1, sin reducir, antes de la diálisis; vía 10, E. coli procedente del TIMP-3 de la Figura 1, sin reducir, después de la diálisis.

La Figura 4 es una Tabla de comparación de la secuencia de aminoácidos del TIMP-3 humano de la Figura 1 con otros componentes de la familia TIMP. La numeración empieza en la primera cisteína de la proteína madura. Como se puede observar, la alineación contiene huecos para algunos componentes de la familia TIMP. La numeración utilizada en la presente memoria está de acuerdo con la numeración utilizada para el TIMP-3 recombinante humano de la Figura 1. Las letras en negrita indican los aminoácidos conservados; los asteriscos representan las zonas de glucosilación potencial de TIMP-1; las letras subrayadas indican las zonas de glucosilación potencial de TIMP-3; el corchete izquierdo indica el comienzo de las proteínas maduras. El punto (\bullet) indica los aminoácidos que son exclusivos para el TIMP-3 recombinante humano. Las secuencias de aminoácidos se encuentran en la bibliografía como sigue: TIMP-1 bovino, Freudenstein et al., Biochem. Physic. Res. Comm. 171: 250-256 (1990); TIMP-1 humano, Docherty et al., Nature 318: 65-69 (1985); TIMP-1 de conejo, Horowitz et al., J. Biol. Chem. 264: 7092-7095 (1989); TIMP-1 de ratón, Edwards et al., Nucleic Acid. Res. 14: 8863-8878 (1986); Johnson et al., Mol. Cell. Biol. 7: 2821-2829 (1978); Gewert et al., EMBO 6: 651-657 (1987); TIMP-2 bovino, Boone et al., PNAS-USA 87: 2800-2804 (1990); TIMP-2 humano, Boone et al., PNAS-USA 87: 2800-2804 (1990); TIMP-2 de ratón, Shimizu et al., Gene 114: 291-292 (1992); TIMP-3 de pollo, Pavloff et al., J. Biol. Chem. 267: 17321-17326 (1992). Excepto que se indique de otra manera, estas secuencias referidas de vez en cuando en la presente memoria se encontraron en estas referencias.

La Figura 5 es una Tabla de comparación de la secuencia de aminoácidos para el inhibidor de metaloproteinasa de pollo de Staskus et al., J. Biol. Chem. 266: 449-554 (1991) y el TIMP-3 recombinante humano de la Figura 1. Una línea continua entre los aminoácidos indica identidad, dos puntos indican similitud. Un solo punto indica un grado menor de similitud y no indica diferencia total, como describe Grivskov et al., Nucl. Aud. Res. 14: 6745-6763 (1986).

La Figura 6 muestra la homología general entre la secuencia del ácido nucleico de la Figura 1 que codifica a TIMP-3 y la que codifica a ChIMP-3.

La Figura 7 muestra la homología máxima entre la secuencia del ácido nucleico de la Figura 1 que codifica a TIMP-3 y la que codifica a ChIMP-3.

La Figura 8 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos del TIMP-3 recombinante humano de la Figura 1 y la del TIMP-2 humano.

La Figura 9 muestra la homología general de la secuencia del ácido nucleico de la Figura 1 del TIMP-3 recombinante humano y la que codifica el TIMP-2 humano.

La Figura 10 muestra las zonas de homología máxima de la secuencia del ácido nucleico de la Figura 1 que codifica el TIMP-3 recombinante humano y la que codifica el TIMP-2 humano.

La Figura 11 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos del TIMP-3 recombinante humano de la Figura 1 y la del TIMP-1 humano.

La Figura 12 muestra la homología general de la secuencia del ácido nucleico de la Figura 1 que codifica el TIMP-3 recombinante humano y la que codifica el TIMP-1 humano.

La Figura 13 muestra las zonas de homología máxima de la secuencia del ácido nucleico de la Figura 1 que codifica el TIMP-3 recombinante humano y la que codifica el TIMP-1 humano.

Las Figuras 14 A y B muestran los análisis por transferencia de Northern realizados en el ARNs de una variedad de células, utilizando un fragmento de ADN del TIMP-3 como sonda.

La Figura 15 muestra un cimograma modificado. La vía 1 (desde el lado izquierdo) contiene un patrón de peso molecular de proteína (véase la Figura 3). La vía 2 es una vía de referencia que contiene medio acondicionado con colagenasas (colagenasas de 72 kDa e intersticiales, activadas con pAPMA). ("Coll" se refiere a la colagenasa intersticial). La vía 3 contiene TIMP-2. La vía 4 contiene un análogo de TIMP-2 que carece de las seis cisteínas C-terminales. Las vías 5, 6 y 7 contienen E. coli procedente del TIMP-3 de la Figura 1, estando la vía 5 sin dividir y siendo las vías 6 y 7 diluciones dobles en serie consecutivas. Como se puede apreciar, la falta de una zona clara en la posición en la que la referencia (vía 2) presenta eliminación indica que TIMP-3 inhibe la actividad de la colagenasa.

La Figura 16 muestra la secuencia de ADNc y de aminoácidos de las variantes obtenidas utilizando el presente procedimiento.

La Figura 17 muestra una ilustración de una estructura secundaria propuesta de los componentes de la familia TIMP de proteínas.

Numerosos aspectos y ventajas de la invención se pondrán de manifiesto para los expertos en la materia considerando la descripción detallada siguiente que proporciona ilustraciones de la práctica de la invención en sus formas de realización preferidas actualmente.

Descripción detallada de la invención

Según la presente invención, son descritos nuevos inhibidores de metaloproteinasa (denominados en la presente memoria, en conjunto, TIMP-3) y secuencias de ADN que codifican todos o parte de dichos TIMP-3. Dichas secuencias incluyen la incorporación de codones "preferidos" para la expresión por huéspedes no mamíferos seleccionados; la provisión de zonas de escisión por los enzimas de restricción endonucleasas; y la provisión de secuencias adicionales iniciales, terminales o intermedias de ADN que facilitan la construcción de vectores expresados fácilmente. Las secuencias de ADN pueden asimismo codificar análogos de polipéptidos o derivados de TIMP-3 que se diferencian de las formas naturales desde el punto de vista de la identidad o de la posición de uno o más residuos de aminoácido (es decir, análogos de deleción que no contienen todos los residuos especificados para TIMP-3; análogos de sustitución, en los que uno o más residuos especificados están sustituidos por otros residuos; y análogos de adición en los que se añaden uno o más residuos de aminoácido a una parte terminal o media del polipéptido) y que comparten alguna o todas las propiedades biológicas del TIMP-3 del mamífero.

Las secuencias de ácido nucleico incluyen secuencias útiles para asegurar la expresión en las células huésped procarióticas o eucarióticas de los productos del polipéptido que poseen por lo menos una parte de la conformación estructural primaria y una o más propiedades biológicas del TIMP-3 recombinante humano. Los ácidos nucleicos se pueden purificar y aislar, de modo que la zona de codificación deseada sea útil, por ejemplo, para producir los presentes polipéptidos o con fines de diagnóstico, como se describe con más detalle más adelante. Estas secuencias de ADN comprenden específicamente: (a) la secuencia de ADN indicada en la Figura 1 (y las cadenas complementarias); (b) una secuencia de ADN que se hibrida (en las condiciones de hibridación descritas en el apartado de identificación del banco de ADNc, en condiciones equivalentes o en condiciones más limitadas) con la secuencia de ADN de la Figura 1 o con fragmentos de la misma; y (c) una secuencia que se hibridaría, sólo para la degeneración del código genético, con la secuencia de ADN de la Figura 1. También se contemplan fragmentos de (a), (b) ó (c) anteriores que son por lo menos de longitud suficiente para hibridarse selectivamente con el ADN genómico humano que codifica TIMP-3, en las condiciones descritas más adelante para la identificación del banco de ADNc. Las secuencias del ADN genómico están comprendidas específicamente en las partes (b) y (c) que codifican formas variantes alelas del TIMP-3 humano y/o que codifican el TIMP-3 de otras especies de mamíferos y secuencias de ADN producidas que codifican el TIMP-3, fragmentos de TIMP-3 y análogos de TIMP-3 cuyas secuencias de ADN pueden incorporar codones que facilitan la transcripción y la traducción del ARN mensajero en huéspedes microbianos. Dichas secuencias producidas pueden ser construidas fácilmente según los procedimientos de Alton et al., solicitud WO 83/04053 publicada por PCT.

El ADN genómico que codifica los presentes TIMP-3 puede contener bases adicionales no codificadoras, o intrones, y dichos ADN genómicos se obtienen hibridando todo o parte del ADNc, ilustrado en las Figuras 1 y 16, con una fuente de ADN genómico, tal como un banco de ADN genómico humano. Dicho ADN genómico codificará el polipéptido funcional del TIMP-3; sin embargo, la utilización de los ADNc puede ser más práctica porque, como solamente está implicada la zona de codificación, se facilita la manipulación recombinante.

Las secuencias de ADN descritas en la presente memoria que codifican los polipéptidos de TIMP-3 son válidas para la información que proporcionan concerniente a la secuencia de aminoácidos de la proteína del mamífero que no ha estado disponible anteriormente. Dicho de otra manera, estas secuencias de ADN son útiles para generar nuevos y útiles vectores víricos y circulares del ADN del plásmido, nuevas y útiles células huésped procarióticas y eucarióticas transfectadas (incluyendo células bacterianas y de levaduras y células de mamíferos desarrolladas en cultivo) y nuevos y útiles procedimientos para el desarrollo en cultivo de dichas células huésped capaces de expresión del TIMP-3 y sus productos relacionados.

El ADN descrito en la presente memoria (o los ARN correspondientes) se pueden también utilizar para la terapia génica para, por ejemplo, el tratamiento del enfisema. Por ejemplo, el ratón transgénico que sobreexpresa la colagenasa presenta síntomas de enfisema pulmonar, D'Armiento et al., Cell 71: 955-961 (1992), lo que indica que la inhibición de la colagenasa puede mejorar alguno de los síntomas del enfisema. Actualmente, los vectores adecuados para la terapia génica (tales como los vectores retrovíricos o adenovíricos modificados para los fines de la terapia génica y de pureza y aceptabilidad farmacéutica) se pueden administrar en el interior del pulmón. Dichos vectores pueden incorporar el ácido nucleico que codifica los presentes polipéptidos para la expresión en el pulmón. Además, se puede utilizar una mezcla de dichos vectores, tal como la que contiene genes para uno o más TIMP, inhibidores de elastasa u otras proteínas que mejoren los síntomas del enfisema. La terapia génica puede implicar un vector que contiene más de un gen para una proteína deseada.

Por otra parte, no se puede utilizar ningún vector para facilitar la presencia relativamente estable en el huésped. Por ejemplo, la recombinación homóloga puede facilitar la integración dentro de un genoma del huésped. El ácido nucleico se puede situar dentro de un excipiente farmacéuticamente aceptable para facilitar la absorción celular, tal como un excipiente de solución de lípidos (p. ej.: un lípido cargado), un liposoma, o un excipiente de polipéptido (p. ej.: polilisina). Scientific American, noviembre de 1990, páginas 68-84, de Verma, es un artículo de revista sobre terapia génica.

Como se mencionó anteriormente, las células objetivo pueden estar dentro de los pulmones del receptor, pero otras células objetivo pueden ser células de la médula ósea, células de la sangre, células del hígado (o de otros órganos), células musculares, fibroblastos u otras células. El ácido nucleico deseado se puede situar en primer lugar dentro de una célula y la célula se puede administrar a un paciente (tal como un tejido trasplantado) o se puede administrar el ácido nucleico deseado directamente al paciente para su absorción in vivo.

Las células que se han de transfectar para el receptor se pueden cultivar utilizando uno o más factores que afectan el crecimiento o la proliferación de dichas células, como por ejemplo, SCF.

La administración del ADN en el pulmón se puede realizar mediante formación de una dispersión de partículas, o un aerosol. Típicamente, estará implicado algún tipo de agente de carga y un excipiente, tal como un lípido o un polipéptido. Estos materiales deben ser farmacéuticamente aceptables. Se puede utilizar un nebulizador para dicho suministro, tal como un nebulizador ultrasónico o de nieve carbónica. Como alternativa, se puede utilizar un sistema basado en un propelente, tal como un inhalador de dosificación, que puede suministrar líquido o una suspensión de partículas.

Para las dosis de terapia génica, se utilizará generalmente entre una copia y varios centenares de copias del presente ácido nucleico por célula, dependiendo del vector, del sistema de expresión, de la edad, del peso y de la enfermedad del receptor y de otros factores que son evidentes para los expertos en la materia.

Las secuencias de ADN descritas en la presente memoria son también materiales adecuados para utilizar como sondas marcadas en el aislamiento del ADN genómico humano que codifica a TIMP-3, como se mencionó anteriormente, y las proteínas relacionadas además de las secuencias del ADNc y del ADN genómico de otra especie de mamífero. Las secuencias de ADN también pueden ser útiles en varios procedimientos alternativos de síntesis de proteínas (p. ej.: en las células de insectos) o, como se describió anteriormente, en la terapia génica en pacientes humanos y otros mamíferos. Es de esperar que estas secuencias del ADN sean útiles para desarrollar especies transgénicas de mamíferos que puedan servir como "huéspedes" eucarióticos para la producción de TIMP-3 y de productos de TIMP-3 en cantidad. Véase, en general, Palmiter et al., Sciencie 222: 809-814 (1983).

Asimismo, se pueden preparar ácidos nucleicos con cadena complementaria frente a los ADN descritos en la presente memoria. Compare, Khokho et al., Science 243: 947-950 (1989), de modo que el inhibidor del ARN cadena complementaria del TIMP otorgue oncogenicidad en las células Swiss 3T3. Los ácidos nucleicos con cadena complementaria se pueden utilizar para modular o evitar la expresión de los ácidos nucleicos endógenos del TIMP-3.

Los productos de polipéptido de la presente invención que presentan parte o la totalidad de la conformación estructural primaria (es decir, la secuencia continua de residuos de aminoácido) del polipéptido como se ha expuesto en la figura 1 pueden estar purificados y aislados y pueden presentar una o más de las propiedades biológicas (p. ej.: las propiedades inmunológicas y la actividad biológica in vitro) y de las propiedades físicas (p. ej.: el peso molecular) de las variantes alelas de los mismos que comprenden el TIMP-3 natural del mamífero. El término "purificado y aislado" en la presente memoria significa fundamentalmente exento de sustancias superfluas, de modo que los presentes polipéptidos sean útiles para el fin pretendido. En particular, se puede tener un TIMP-3 recombinante humano exento fundamentalmente de otras proteínas humanas o de agentes patológicos. Estos polipéptidos se caracterizan además por ser el producto de las células del mamífero, o el producto de procedimientos químicos de síntesis o de la expresión del huésped procariótico o eucariótico (p. ej.: mediante células en cultivo bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos) de secuencias de ADN exógeno obtenidas por clonación genómica o de ADNc o por síntesis génica. Los productos de la expresión en la levadura típica (p. ej.: Saccharomyces cerevisiae) o en las células huésped procarióticas (p. ej.: E. coli) están exentos de asociación con cualquiera de las proteínas de mamífero. Los productos de la expresión en las células de vertebrados (p. ej.: mamíferos no humanos (p. ej.: COS ó CHO) y aves de corral) están exentos de asociación con cualquiera de las proteínas humanas. Dependiendo del huésped empleado, y de otros factores, los polipéptidos de la invención pueden estar glucosilados con carbohidratos de mamíferos o de otros eucariotas o pueden estar sin glucosilar. Los polipéptidos de la invención pueden incluir un residuo inicial del aminoácido metionina (en la posición -1 con respecto al primer residuo de aminoácido del polipéptido).

Siguiendo los procedimientos de la solicitud publicada indicada anteriormente de Alton et al., (documento WO 83/04053), se puede diseñar y producir fácilmente genes que codifiquen la expresión microbiana de polipéptidos con conformaciones primarias que se diferencien de las especificadas en la presente memoria desde el punto de vista de la identidad o de la posición de uno o más residuos (p. ej.: sustituciones, adiciones terminales o intermedias y deleciones). Como alternativa, se pueden realizar fácilmente modificaciones del ADNc y de los genes genómicos mediante técnicas bien conocidas de mutagénesis dirigida y empleadas para generar análogos y derivados de TIMP-3. Tales productos compartirían por lo menos una de las propiedades biológicas del TIMP-3 del mamífero pero se pueden diferenciar en otros. Como ejemplos, los productos proyectados comprenden los que están reducidos mediante p. ej.: deleciones; o los que son más estables a la hidrólisis (y, por consiguiente, pueden tener efectos más pronunciados o de mayor duración que los naturales); o los que se han alterado al eliminar una o más zonas potenciales para la glucosilación (que pueden producir mayores actividades para los productos producidos por levaduras); o que poseen uno o más residuos de cisteína eliminados o sustituidos por, p. ej.: residuos de alanina o serina y se aíslan potencialmente con más facilidad en forma activa a partir de los sistemas microbianos; o que poseen uno o más residuos de tirosina sustituidos por fenilalanina o que se unen por lo menos más fácilmente para dirigirse a proteínas o a receptores en las células diana. Además están comprendidos los fragmentos de polipéptido que duplican únicamente una parte de la secuencia continua de aminoácidos o las conformaciones secundarias dentro del TIMP-3, cuyos fragmentos pueden poseer una actividad de TIMP-3 del mamífero (p. ej.: actividad inmunológica) y no otras (p. ej.: actividad inhibidora de la metaloproteinasa).

El presente TIMP-3 puede unirse a la matriz extracelular, característica no compartida por TIMP-1 y TIMP-2. Por lo tanto, los polipéptidos que presentan solamente una parte de la secuencia continua de aminoácidos o de las conformaciones secundarias dentro del TIMP-3, que poseen la capacidad de unirse a la matriz extracelular están además contempladas específicamente en la presente memoria.

Es de destacar que esta actividad no es necesaria para cualquiera de los productos de la invención u otros que tengan utilidad terapéutica (véase, Weiland et al., Blut 44: 173-175 (1982) o utilidad en otros contextos, tales como en pruebas de antagonismo de TIMP-3. Los antagonistas competitivos pueden ser bastante útiles, por ejemplo, en casos de sobreproducción de TIMP-3.

De aplicación para los fragmentos de TIMP-3 y los análogos de la invención son los informes de actividad inmunológica de los péptidos sintéticos que duplican sustancialmente la secuencia aminoácidos existente en las proteínas naturales, glucoproteínas y nucleoproteínas. Más específicamente, se ha demostrado que los polipéptidos de peso molecular relativamente bajo participan en reacciones inmunitarias que son similares en duración y alcance a las reacciones inmunitarias de las proteínas fisiológicamente importantes tales como los antígenos víricos, las hormonas de polipéptido y similares. La provocación de la formación de anticuerpos específicos en animales inmunológicamente activos está incluida entre las reacciones inmunitarias de dichos polipéptidos. Véase, p. ej.: Lerner et al., Cell 23: 309-310 (1981); Ross et al., Nature 294: 654-656 (1981); Walter et al., PNAS-USA 77: 5197-5200 (1980); Lerner et al., PNAS-USA 78: 3403-3407 (1981); Walter et al., PNAS-USA 78: 4882-4886 (1981); Wong et al., PNAS-USA 79: 5322-5326 (1982); Baron et al., Cell 28: 395-404 (1982); Dressman et al., Nature 295: 185-160 (1982); y Lener, Scientific American 248: 66-74 (1983). Véase, además, Kaiser et al., Sciencie 223: 249-255 (1984) que se refiere a las actividades biológicas e inmunológicas de péptidos sintéticos que comparten poco más o menos estructuras secundarias de hormonas peptídicas pero pueden no compartir su conformación estructural primaria.

Un tipo de análogo es un TIMP-3 truncado con capacidad para unirse al dominio de unión al cinc de la colagenasa. Por ejemplo, el dominio de unión al cinc en la colagenasa intersticial está situado en los aminoácidos 218, 222 y 228 en el proenzima. Goldberg, G.I., J. Biol. Chem. 261: 660-6605 (1986). El dominio de unión al cinc de la especie de procolagenasa de 72 kDa está situado en los aminoácidos 403 a 407. Collier et al., Genomics 9: 429-434 (1991). El dominio de unión al cinc de la especie de procolagenasa de 92 kDa se encuentra en los aminoácidos 401 a 405. Van Ranst et al., Cytokene 3: 231-239 (1991). De modo interesante, el dominio de unión al cinc se conserva bastante bien entre las enzimas: H E F G H (colagenasa de 92 kDa), H E F G H (colagenasa de 72 kDa) y H E L G H (colagenasa intersticial). Por consiguiente, el motivo para la unión del cinc es H E X G H en el que X es F ó L. Una molécula de unión selectiva, tal como un anticuerpo o una molécula pequeña bloqueraría dicha unión al cinc y por lo tanto inhibiría la actividad enzimática. (El término "molécula con unión selectiva" tal como se utiliza en la presente memoria indica una composición que se une selectivamente a su objetivo). Se puede preparar, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo recombinante.

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Se han preparado análogos de deleción de TIMP-2 que han conservado la capacidad de inhibir la actividad de la metaloproteinasa. Willenbrock et al., Biochemistry 32: 4330-4337 (1993). Para TIMP-2, se acortó el terminal C al eliminar las cisteínas C-terminales (tres bucles unidos al disulfuro). Por lo tanto, en vista de la homología entre los diversos dominios de unión al cinc, se podrían preparar análogos de TIMP-3 similares con secuencias C-terminales igualmente acortadas. El análogo 1-121 de TIMP-3 (que utiliza la numeración de la Figura 1 de la presente memoria) incluye los seis primeros residuos de cisteína, pero no los seis últimos. Se puede prolongar opcionalmente el terminal C hasta la molécula completa de 188 aminoácidos. Dichos análogos también se pueden preparar para cualquier especie, tal como ChIMP-3.

Esto se demuestra además más adelante en los ejemplos, como una variante de deleción de TIMP-2 se demuestra que inhibe la colagenasa intersticial. (Ejemplo 3 más adelante). El dominio de unión al cinc de la colagenasa intersticial se sitúa de igual forma que el de la colagenasa de la especie de 72 kDa (lo que fue demostrado por Willenbrock et al., supra, que está afectado por los análogos truncados de TIMP-2).

Además, puesto que es evidente que el terminal C no es necesario para la actividad de inhibición del enzima, se puede modificar químicamente el terminal C. Se puede desear, por ejemplo, una preparación de liberación lenta mediante la cual se unan una o más moléculas de polímero tales como las moléculas de polietilenglicol. Otras modificaciones químicas incluyen la unión de un polipéptido adicional para la creación de una molécula de fusión. Por lo tanto, la presente invención se refiere al TIMP-3 químicamente modificado.

Los polipéptidos pueden asimismo ser codificados por partes del ADN complementario con la cadena de codificación de la proteína de las secuencias del ADNc humano o del ADN genómico del TIMP-3 es decir, "proteínas complementarias invertidas" tal como describe Tramontano et al., Nucleic Acid Res. >-> 12: 5049-5059 (1984). Los polipéptidos o sus análogos pueden también contener uno o más análogos de aminoácido, tales como los peptidomiméticos.

Asimismo están comprendidos en la invención las composiciones farmacéuticas que se componen de cantidades eficaces de productos de polipéptidos de la invención junto con diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables útiles en la terapia de TIMP-3. Dichas composiciones comprenden diluyentes con varios contenidos de tampón (p. ej.: Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica; aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (p. ej.: Tween 80, Polisorbato 80), antioxidantes (p. ej.: ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservantes (p. ej.: Thimersol, alcohol bencílico) y cargas (p. ej.: lactosa, manitol); enlace covalente de polímeros, tal como polietilenglicol, con la proteína (tal como se expuso supra, véase, por ejemplo la patente U.S. nº 4.179.337); incorporación del material en las preparaciones en forma de partículas de los compuestos poliméricos tales como el ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc. o en los liposomas. Dichas composiciones influyen en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de eliminación in vivo de TIMP-3. Véase, p.
ej.: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas

\hbox{1435-1712.}

Generalmente, una cantidad eficaz de los presentes polipéptidos de TIMP-3 estará determinada por la edad, peso y estado o gravedad de la enfermedad del receptor. Véase, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra, en las páginas 697-773. Se puede utilizar típicamente una dosis comprendida entre aproximadamente 0,001 g/kg de peso corporal y aproximadamente 1 g/kg de peso corporal, pero se puede utilizar más o menos, como reconocerá un especialista experto. Para aplicaciones locales (es decir, no generalizadas), tal como las aplicaciones tópicas, la dosificación puede estar comprendida entre aproximadamente 0,001 g/cm^{2} y aproximadamente 1 g/cm^{2}. La dosificación puede hacerse una o más veces al día, o con menos frecuencia y puede hacerse junto con otras composiciones como se describe en la presente memoria. Se debe indicar que la presente invención no se limita a las dosis referidas en la presente memoria.

Una variedad de agentes actúa conjuntamente para mantener el equilibrio dinámico de la matriz extracelular y los tejidos. En el tratamiento de enfermedades en la que el equilibrio está desviado, se pueden utilizar uno o más de los demás agentes junto con el presente TIMP-3. Estos otros agentes se pueden administrar conjuntamente o administrar en serie, o una combinación de los mismos. En general, estos otros agentes se pueden seleccionar de entre la lista constituida por las metaloproteinasas, serina-proteasas, inhibidores de los enzimas que degradan la matriz, enzimas intracelulares, moduladores de adhesión celular y factores que regulan la expresión de las proteinasas que degradan la matriz extracelular y sus inhibidores. Aunque los ejemplos específicos están relacionados más adelante, un experto en la materia reconocerá otros agentes que realizan funciones equivalentes (tales como los producidos sintéticamente, por técnicas de ADN recombinante y sus análogos y derivados).

Las metaloproteinasas y las serina-proteasas degradan la matriz extracelular, tal como se expuso anteriormente. Por lo tanto, la utilización de enzimas en terapia puede ser que contrarreste los efectos del presente TIMP-3 que inhibe dicha degradación. Las enzimas comprenden colagenasas, PMN (leucocito polimorfonuclear) colagenasa, estromelisina I, II/transina, matrilisina, invadolisina, supuesta metaloproteinasa (PUMP-1), activador de plasminógeno de tipo urocinasa (UPA), activador de plasminógeno para el tejido (TPA) y plasmina. Se puede utilizar también PD-ECGF.

Otros inhibidores de degradación se pueden también utilizar si se desea un aumento o una prevención más específica de la degradación de la matriz extracelular. Los inhibidores se pueden seleccionar de entre el grupo constituido por \alpha_{2}-macroglobulina, proteína de la zona del embarazo, ovostatina, inhibidor de la \alpha_{1}-proteinasa, \alpha_{2}-antiplasmina, aprotinina, nexin-1 proteasa, inhibidor del activador del plasminógeno (PAI)-1, PAI-2, TIMP-1 y TIMP-2. Se pueden utilizar otros, como reconocerá un experto en la materia.

Además se pueden utilizar enzimas intracelulares junto con el presente TIMP-3. Los enzimas intracelulares pueden afectar la degradación de la matriz extracelular y comprenden enzimas lisosómicas, glucosidasas y catepsinas.

También se pueden utilizar moduladores de adhesión celular en combinación con el presente TIMP-3. Por ejemplo, se puede querer modular la adhesión celular a la matriz extracelular antes, durante o después de la inhibición de la degradación de la matriz extracelular utilizando el presente TIMP-3. Las células que han presentado adhesión celular a la matriz extracelular comprenden osteoclastos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, linfocitos T destructores y mastocitos. Los moduladores de adhesión celular comprenden los péptidos que contienen un motivo "RGD", análogo, antagonistas miméticos o agonistas.

Los factores que regulan la expresión de las prteinasas que degradan la matriz extracelular y sus inhibidores comprenden las citocinas, tales como IL-1 y TNF-\alpha, TGF-\beta, glucocorticoides y retinoides. Además se pueden utilizar otros factores de crecimiento que efectúan la proliferación celular y/o la diferenciación si el efecto deseado es inhibir la degradación de la matriz extracelular utilizando el presente TIMP-3, junto con dichos efectos celulares. Por ejemplo, durante la inflamación, se puede desear el mantenimiento de la matriz extracelular (mediante inhibición de la actividad enzimática) todavía desear la producción de neutrófilos; por lo tanto se puede administrar G-CSF. Otros factores comprenden la eritropoyetina, componentes de la familia de la interleucina, componentes de las familias SCF, M-CSF, IGF-I, IGF-II, EGF, FGF, tales como KGF, PDGF y otros. Se puede desear además la actividad de los interferones, tales como los interferones alfa, beta, gamma o el interferón de consenso. Los agentes intracelulares comprenden las G-proteínas, la proteín-cinasa C y las inositol fosfatasas. Aunque el campo de investigación de la inflamación está actualmente en desarrollo, y las interacciones exactas de las composiciones in vivo descritas no se comprenden en toda su extensión, la utilización de los presentes polipéptidos puede proporcionar beneficios terapéuticos con uno o más agentes implicados en la terapia de la inflamación.

Se pueden utilizar además agentes de tráfico celular. Por ejemplo, la inflamación implica la degradación de la matriz extracelular y el movimiento o tráfico de las células a la zona de la lesión. La prevención de la degradación de la matriz extracelular puede evitar dicho tráfico celular. La utilización del presente TIMP-3 junto con agonistas o antagonistas de los agentes de la modulación del tráfico celular puede ser, por consiguiente, deseada en el tratamiento de la inflamación. Los agentes de modulación de tráfico celular se pueden seleccionar de entre la lista constituida por receptores de la superficie de la célula endotelial (tales como las E-selectinas y las integrinas); los receptores de la superficie del leucocito (L-selectinas); quimiocinas y quimioatrayentes. Para un examen de las composiciones implicadas en la inflamación, véase Carlos et al., Immunol. Rev. 114: 5-28 (1990).

Además, las composiciones pueden incluir un nuevo factor de diferenciación, "NDF", y los procedimientos de tratamiento pueden incluir la administración de NDF antes, simultáneamente con, o después de la administración de TIMP-3. Se ha descubierto que NDF estimula la producción de TIMP-2, y la combinación de NDF, TIMP-1, -2 y/o -3 puede proporcionar beneficios en el tratamiento de los tumores.

Los productos de polipéptido de la invención pueden estar "marcados" mediante asociación con una sustancia marcadora detectable (p. ej.: radiomarcada con ^{125}I) para proporcionar reactivos útiles para la detección y cuantificación de TIMP-3 en el tejido sólido y en muestras líquidas tales como sangre u orina. Los productos de ácido nucleico también pueden estar marcados con marcadores detectables (tales como radiomarcadores y marcadores no isotópicos tal como la biotina) y ser empleados en procesos de hibridación para localizar la posición del gen TIMP-3 humano y/o la posición de cualquier familia de genes relacionada en un mapa cromosómico. Las secuencias de ácido nucleico que se unen selectivamente al gen TIMP-3 humano son útiles para este fin. También se pueden utilizar para identificar trastornos por el gen TIMP-3 humano al nivel del ADN y ser utilizados para identificar los genes del entorno y sus trastornos. En la presente memoria se contemplan los equipos que contienen dichos materiales marcados.

Las composiciones de TIMP-3 descritas en la presente memoria modifican la patogénesis y proporcionan una terapia beneficiosa para las enfermedades de los tejidos conectivos caracterizadas por la degradación de la matriz. Además, las presentes composiciones de TIMP-3 pueden ser útiles en el tratamiento de cualquier trastorno en el que la actividad de la metaloproteinasa produce la pérdida excesiva de la matriz. Las composiciones de TIMP-3 se pueden utilizar solas o junto con uno o más de los agentes expuestos en la presente memoria.

Los productos de polipéptido de la presente invención son útiles, solos o en combinación con otros fármacos, para el tratamiento de varios trastornos tal como la epidermólisis vesicular distrófica en la que la enfermedad está ligada a la sobreproducción de colagenasa, Bauer et al., J. Exp. Med. 148: 1378-1387 (1978). Los productos de la presente invención también pueden ser útiles para el tratamiento de la artritis reumatoide. Evanson et al., J. Clin. Invest. 47: 2639-2651 (1968) indicaron que el tejido sinovial reumatoide extirpado produce grandes cantidades de colagenasa, en cultivo, esto conduce a los estudios de inmunolocalización de Woolley et al., Arthritis and Rheumatism 20: 1231-1239 (1977), con anticuerpos monoespecíficos dirigidos contra la colagenasa sinovial reumatoide humana que detecta grandes cantidades de colagenasa inmunorreactiva en las zonas de erosión de la articulación (uniones del panículo cartilaginoso) pero no en el cartílago de los condrocitos asociados y tampoco en el líquido sinovial en las zonas alejadas del frente reabsorbente. Las colagenasas también se han manifestado utilizando muchas otras preparaciones diferentes procedentes de las articulaciones reumatoides humanas y utilizando tejidos caracterizados por otros tipos de artritis tales como la osteoartritis, síndrome de Reiter, pseudogota, artritis reumatoide juvenil y esclerodermia.

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En la periodontopatía que afecta el aparato de soporte del diente, la elevación de los enzimas colagenolíticos es evidente, así como la destrucción del colágeno y del tejido conectivo. Véase V.J. Uitto, págs. 211-213 en Proteinases in Inflammation and Tumor Invasion, H. Tschesche, ed., Walter de Gruyter & Co., Berlín, N.Y. (1988).

Las colagenasas han estado implicadas en la úlcera incluyendo la úlcera corneal, epidérmica o gástrica, Brown et al., American J. of Ophthalmology 72: 1139-1142 (1971), y, realmente, los inhibidores de metaloproteinasa se utilizan en el tratamiento de la úlcera corneal. Slansky et al., Annals of Ophthalmology 2: 488-491 (1970).

En la cicatrización de la herida después de la intervención quirúrgica, TIMP-3 puede presentar una aplicación particular para la restenosis. Las metaloproteinasas contribuyen a la reorganización de las células arteriales, incluyendo el bloqueo de la arteria. La utilización del presente TIMP-3 puede inhibir dicha reorganización de la pared arterial. La administración de ácido nucleico del TIMP-3 de cadena complementaria puede también proporcionar beneficios.

En el campo de la invasión y metástasis tumoral, el potencial metastásico de determinados tumores se correlaciona con el aumento de capacidad para sintetizar y segregar colagenasas, Liotta et al., Nature 284: 67-68 (1980) y con la incapacidad para sintetizar y segregar cantidades importantes de un inhibidor de metaloproteinasa, Hicks et al., Int. J. Cancer 33: 835-844 (1984). Estos procesos están relacionados con el paso de las células tumorales a través de las capas de tejido conectivo (membrana basal) desde las zonas del tejido a la circulación y viceversa, que podrían estar retardadas por el TIMP-3. El TIMP-3 tiene igualmente aplicación terapéutica para inhibir la diseminación durante la eliminación de los tumores primarios, durante la quimioterapia y la terapia de radiación, durante la recolección de la médula ósea contaminada y durante la derivación de las ascitis carcinomatosa.

Un factor limitativo en la utilización del trasplante de médula ósea en muchos cánceres avanzados con implicación de la médula ósea es la ausencia de técnicas adecuadas de purga. Por ejemplo, se ha indicado la neumonía intersticial metastásica seguida de la infusión de las células de médula ósea purgadas impropiamente, Glorieux et al., Cancer 58: 2136-2139 (1986); Graeve et al., Cancer 62: 2125-2127 (1988). El TIMP-3 administrado durante la infusión de células de médula ósea sin purgar aliviará la necesidad de desarrollar técnicas costosas de purga.

Desde el punto de vista del diagnóstico, la correlación entre la ausencia de producción de TIMP-3 en una muestra de tumor y su potencial metastásico sirve como indicador de pronóstico además de un indicador para la posible terapia de prevención.

Los tumores pueden llegar a estar también más o menos encapsulados o fibróticos debido al aumento de deposición de colágeno (o inhibición de la degradación) tanto por las células cancerosas como por las células normales circundantes. El aumento de encapsulación favorecido por el TIMP-3 ayuda a la escisión limpia del tumor.

Otras enfermedades patológicas en las que la degradación excesiva de colágeno puede desempeñar un papel y por lo tanto en las que se puede aplicar TIMP-3, comprenden el enfisema, la osteopatía de Paget, osteoroposis, esclerodermia, la atrofia ósea o de los tejidos por presión como en las úlceras, colesteatoma y cicatrización anormal de la herida. TIMP-3 se puede aplicar además como complemento a otros promotores de la cicatrización de la herida, p. ej.: para modular el metabolismo del colágeno durante el proceso de cicatrización.

TIMP-3 puede presentar además actividad potenciadora eritroide (es decir, estimulación de la diferenciación de los primeros progenitores eritroides) y por lo tanto, TIMP-3 puede servir para el tratamiento de diversas anemias.

Además TIMP-3 puede tener aplicación en el tratamiento de trastornos inmunológicos tales como las enfermedades autoinmunitarias (p. ej.: artritis reumatoide, esclerosis múltiple) basadas en la capacidad potencial para suprimir la diferenciación del linfocito B según se determina por el procedimiento de Pisko et al., J. Inmunol. 136: 2141-2150 (1986).

Basándose en su capacidad para inhibir la degradación del tejido conectivo, TIMP-3 y/o otras moléculas de TIMP tienen aplicación en los casos en que la inhibición de la angiogénesis es útil, p. ej.: al prevenir o retardar el desarrollo tumoral y en la prevención de la invasión de parásitos. Además, las presentes composiciones y procedimientos se pueden aplicar con fines cosméticos, en esta inhibición localizada de la degradación del tejido conectivo pueden alterar el aspecto del tejido.

Las presentes composiciones y procedimientos también pueden servir para el control de la natalidad o en la modulación de la fertilización ya que se ha demostrado que los TIMP evitan o retardan la ruptura folicular, Branstrom et al., Endocrinology 122: 1715-1721 (1988), e interfieren en el desarrolo de la preimplantación del embrión.

Las presentes composiciones y procedimientos pueden ser útiles en el tratamiento de los trastornos de la célula nerviosa en los que TIMP-3 puede proteger las células nerviosas del daño evitando que la membrana basal rodee las células nerviosas. Por consiguiente, las utilizaciones pueden implicar a BDNF, NT-3, NGF, CNTF, NDF, SCF, u otros factores de modulación de crecimiento o de proliferación de la célula nerviosa.

Como se describió anteriormente, el presente TIMP-3 tiene amplia aplicación en una diversidad de trastornos. Por lo tanto, otra forma de realización contemplada en la presente memoria es un equipo que incluye los presentes polipéptidos y opcionalmente una o más de las composiciones adicionales descritas anteriormente para el tratamiento de un trastorno que implica la degradación de la matriz extracelular. Una forma de realización adicional es un artículo manufacturado que comprende un material envasado y un agente farmacéutico dentro de dicho material envasado, en el que dicho agente farmacéutico contiene el/los presente(s) polipéptido(s) y en el que dicho material envasado comprende una etiqueta que indica que dicho agente farmacéutico se puede utilizar para una indicación seleccionada de entre el grupo constituido por: cáncer, inflamación, artritis, epidermólisis vesicular distrófica, periodontopatía, úlcera, enfisema, osteopatías, escleroderma, cicatrización de la herida, insuficiencias de eritrocitos, reparación del tejido cosmético, fertilización o modulación del implante del embrión y trastornos de las neuronas. Este artículo manufacturado puede incluir opcionalmente otras composiciones o descripciones en la etiqueta de otras composiciones.

Los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria pueden también ser incorporados como parte de un equipo o artículo manufacturado. Se contempla un artículo manufacturado que comprende un material envasado y un agente farmacéutico, en el que dicho agente farmacéutico contiene dichos ácidos nucleicos y en los que dicho material envasado se compone de una etiqueta que indica que dicha composición farmacéutica se puede utilizar para una indicación que se aprovecha de la modulación de dicha expresión del ADN, tal como una indicación de la terapia génica. Tales indicaciones de la terapia génica, expuestas anteriormente, incluyen el tratamiento del enfisema. Un equipo que contiene el/los ácido(s) nucleico(s) puede incluir, opcionalmente, factores adicionales que afectan el crecimiento ex vivo de las células receptoras, tal como SCF. Véase, p. ej.: Zsebo et al., PCT WO 91/05795.

Las moléculas de unión selectiva pueden ser TIMP-3 que se une específicamente a los anticuerpos monoclonales. La técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976) ha sido ampliamente aplicada para producir líneas celulares híbridas que segregan grandes cantidades de anticuerpos monoclonales contra muchos antígenos específicos. También se pueden preparar anticuerpos recombinantes, (véase Huse et al., Sciencie 246: 1275 (1989)). Dichos anticuerpos se pueden incorporar, por ejemplo, en un equipo con fines de diagnóstico.

Los ejemplos siguientes se ofrecen para ilustrar más completamente la invención, pero no se han de considerar como limitativos del alcance de la misma.

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Ejemplo 1 Clonación y expresión del ADNc del TIMP-3 humano

La estrategia global de clonación implicaba dos etapas, la primera, obteniendo un fragmento que utiliza PCR procedente de un banco de ADNc de riñón fetal humano, y la segunda, utilizando este clon parcial para identificar dos bancos diferentes de ADNc para las secuencias del ADNc completas.

Los cebadores degenerados por PCR procedente de zonas muy conservadas de la familia del gen de TIMP se utilizaron para amplificar el ADNc del TIMP-3 a partir del ADNc del riñón fetal humano. Este producto se utilizó a continuación como sonda para aislar los clones procedentes de un banco de ADNc del riñón fetal humano y un banco del ADNc de la mucosa del colon humano normal. Los clones de 1.240, 963 y 827 bp se han aislado y secuenciado. El clon más largo codifica el polipéptido completo de 211 aminoácidos, que tiene un polipéptido maduro de 188 aminoácidos. El clon de tamaño intermedio está truncado pero codifica la proteína madura completa. El clon más pequeño está perdiendo la zona que codifica los 24 primeros aminoácidos del polipéptido maduro. Además se demostró la expresión y purificación del polipéptido maduro.

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Materiales y procedimientos Cebadores y fuente inicial de ADN de TIMP-3 utilizados

Se utilizaron cebadores degenerados por PCR en una primera ronda de identificación de la primera cadena del ADNc para obtener un clon parcial de ADNc del TIMP-3. Se seleccionaron los cebadores degenerados por PCR derivados de zonas muy conservadas de la familia TIMP de proteínas, (véase Figura 4). Además se escogieron debido a la degeneración relativamente baja de sus codones.

El cebador delantero procedía de una secuencia (VIRA) que es ubicua por todas partes de la familia TIMP y se encuentra en las posiciones 18 a 21 de las proteínas maduras. Este cebador delantero degenerado 96 veces poseía 11 bases que codificaron la secuencia de TIMP más 6 bases para una zona EcoRI y 2 bases extras (subrayadas): SEC ID nº 1 5'-CGG AAT TCG TNA THM GNG C-3'.

Un cebador inverso correspondiente a la zona ChIMP-3 (CIWTDM) ha sido sintetizado. Este primero, 480-27, incluye una zona BamHI y dos bases extra (subrayadas): SEC ID nº 2 5'-CGG GAT CCC ATR TCN GTC CAD ATR CA-3'.

Se utilizó también un cebador inverso alternativo:

SEC ID nº 3 480-28 CGG GAT CCR TCN GTC CAD ATR CA

La zona correspondiente es algo variable. Los aminoácidos 163 a 168 de ChIMP-3 se codificaron mediante la versión utilizada en la presente memoria y estos se seleccionaron debido a que M e I distinguían el ChIMP-3 de otros TIMP. No se supo al principio si estas diferencias estarían también presentes en el TIMP-3 humano (si dicho TIMP existe realmente), no obstante, se utilizó un sesgo aparte de TIMP-1 y TIMP-2 para limitar las amplificaciones superfluas. El M en la posición 168 fue especialmente útil. Como resultado de esta posición en el extremo 5' del cebador inverso, si esta selección fuera correcta no debería interferir con el proceso PCR si estuvieran mal emparejados y ello favorecería la ampliación de TIMP-3 sobre otros ADN.

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Ampliación de la primera cadena de ADNc utilizando cebadores

En primer lugar, se utilizaron cebadores degenerados para ampliar productos de PCR procedentes de las 2 primeras cadenas de ADNc. Después de segunda ronda de ampliación los productos de PCR de éstas se subclonaron y se seleccionó una que se utilizó como sonda para los bancos de ADNc, tal como se describe a continuación.

Síntesis del oligonucleótido. Se sintetizaron oligonucleótidos en sintetizadores Applied Biosystems 394 automatizados utilizando la química estándar de la fosforamidita. Se purificaron por extracción con butanol los oligonucleótidos degenerados, que se sintetizaron en cantidades mayores de 200 nmoles. Los oligonucleótidos no degenerados se sintetizaron en cantidades más pequeñas y se purificaron en tritilo utilizando cartuchos Poly-pak (Glen Research Corp., Sterling, VA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La purificación en tritilo se realizó utilizando columnas de cromatografía Sephadex G-50 de 1 \times 25 cm y TEAB como tampón de elución.

Reacción en cadena de polimerasa. Todas las PCR se realizaron en instrumentos Perkin Elmer modelo 9600 utilizando equipos GeneAmp de Perkin Elmer Cetus (Norwalk, CT) según las instrucciones del fabricante que se incorporan a la presente memoria como referencia.

La primera ronda de PCR consistió en 5 ciclos a 94ºC durante 20 segundos, a 50ºC durante 20 segundos y a 72ºC durante 30 segundos. Esto fue seguido por 30 ciclos a 94ºC durante 20 segundos, a 50ºC durante 20 segundos y a 72ºC durante 30 segundos. Los productos de PCR se introdujeron en gel de agarosa al 2% (SeaKem GTG, FMC, Rockland, ME), teñidos previamente con bromuro de etidio (Sigma, St. Louis, MO), y se perforaron las bandas en el intervalo de tamaño predicho del gel utilizando una pipeta Pasteur. Los productos de PCR se volvieron a ampliar a continuación directamente a partir de los fragmentos de gel utilizando los mismos cebadores de PCR y el programa siguiente: 1 ciclo de 5 minutos a 95ºC seguido de 25 ciclos a 94ºC durante 20 segundos, a 50ºC durante 20 segundos y 72ºC durante 30 segundos. Este proceso se realizó una segunda vez en un intento de obtener grandes cantidades de material relativamente puro para los análisis de subclonación y de restricción.

Fuentes de la primera cadena del ADNc. La primera cadena del ADNc cebada con oligo dT de la mucosa del colon humano (Dr. Gene Finley, Pittsburgh VA Medical Center) así como la primera cadena del ADNc cebada con oligo dT procedente del riñón fetal humano de 22 semanas (Clontech, Palo Alto, CA) se utilizaron como fuentes en primera ronda del ADNc del TIMP-3. Cuando se utilizó la fuente de ADNc de la mucosa del colon, se observó el mismo modelo de bandas que las observadas con los ADNc de riñón fetal, lo que confirmaba aquellos resultados. Estos productos de PCR de riñón fetal se utilizaron a continuación para la subclonación.

Purificación y subclonación de productos de PCR. Los productos de PCR se pasaron a través de columnas Centricon-100 (Amicon, Beverly, MA) para facilitar que el ADN se escinda con las endonucleasas de restricción. El ADN se cortó a continuación con EcoRI y BamHI para asegurar que no se escindirían internamente durante el proceso de clonación. Los productos de PCR se clonaron en pUC19 después del tratamiento con proteinasa K (Crowe et al., 1991) para aumentar la eficacia de clonación. Las colonias se detectaron rápidamente mediante amplificación por PCR con cebadores 382-3 del vector SEC ID nº 4 (5'-GTT TTC CCA GTC ACG ACG-3') y 382-4 SEC ID nº 5 (5'-GAA TTG TGA GCG GAT AAC-3'). Estos productos se purificaron utilizando concentradores Centricon-100 y se secuenciaron.

Resultados. Como se muestra en la Figura 2 resultaron tres bandas de la ampliación con los cebadores degenerados. Se secuenció el ADN clonado a partir de dos de las bandas; la tercera banda no se pudo purificar suficientemente para permitir la subclonación y el secuenciado.

La más pequeñas de las dos bandas secuenciadas fue el fragmento de 402 bp deseado y la banda mayor procedía supuestamente del falso cebado de la zona que codifica CSWYRG (aminoácidos 169 a 174 del polipéptido maduro de la Figura 1) y fue de 489 bp. El fragmento de 402 bp corresponde al ácido nucleico que codifica la zona que abarca ValIleArgAla (Lys) a CysLeuTrpThrAspMet de la Figura 1, con un EcoRI en el lado 5' y un BamHI en el lado 3'. Además, el codón para la isoleucina en el extremo 3' se sustituyó por el codón para la leucina.

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Cribado del banco del ADNc Cribado de un primer banco de ADNc

Banco. El primer banco cribado fue un banco de ADNc del riñón fetal humano de 20 y 24 semanas (Clontech) la Clontech \lambdagt11 cebada con oligo (dT).

Sondas. La primera ronda de cribado del ADNc se realizó con la inserción de uno de los productos clonados de PCR degenerados descritos anteriormente, la inserción de 402 bp. Se observó un nivel más bajo de fondo como resultado de la contaminación con el ADN del vector pUC19. Por consiguiente, se utilizó como plantilla de PCR el fago sobrenadante procedente de un clon \lambdagt11 purificado parcialmente obtenido a partir de la primera ronda de cribado del ADN. Friedman et al., Nucl. Acids Res. 17: 8718 (1988). Esto proporcionó una sonda de gran calidad y pureza. El cebador 495-21, SEC ID nº 6 5'-CGG AAT TCT GGT CTA CAC CAT CAA GC-3' correspondió aproximadamente al dominio YTIK e incluía una zona EcoRI y dos bases adicionales. El cebador 496-16, SEC ID nº 7 5'-CAT GTC GGT CCA GAG ACA CTC G-3', corresponde a la zona CLWTDM y no incluía ninguna zona de restrición. Esto produjo un fragmento de 333 bp. La secuencia del fragmento de 333 bp fue una parte de la secuencia del fragmento de 402 bp. El fragmento de 333 bp se utilizó como sonda para todos los análisis de transferencia de Northern y para todo el cribado adicional del banco de ADNc. El fragmento de 333 bp corresponde a la zona de la Figura 1 que codifica TyrThrIleLys a través de CysLeuTrpThrAspMet y de la zona EcoRI mencionada anteriormente.

Hibridación en placa. Se colocaron en placas aproximadamente 200.000 fagos en 10 placas de 150 mm, recogidas por duplicado en membranas soportadas de nitrocelulosa de Schleicher & Schuell y sondadas con un fragmento de 402 bp cebado al azar marcado con ^{32}P (Stratagene) descrito anteriormente. Se realizaron prehibridaciones e hibridaciones durante toda la noche a 42ºC utilizando los siguientes reactivos (para 50 ml de solución):

12,5 ml: SSPE 20X

5 ml: NaHPO_{4} 0,5 N pH 6,8

0,1 ml: EDTA 0,50 M pH 8,0

25 ml: formamida

2,5 ml: Denhardt 50X

0,25 ml: SDS al 20%

0,5 ml: 10 mg/ml de ARNt (hígado de ternera)

1 ml: 10 mg/ml de ADN de esperma de salmón (no utilizado en la solución de prehibridación)

4,15 ml: H_{2}O (3,15 ml utilizados en la solución de hibridación).

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Se lavaron los filtros en SSC 0,25X a 42ºC. se purificaron positivamente las placas de hibridación, produciendo 2 clones independientes denominados aquí Timp3clone7 y Timp3clone2. El ADN del bacteriófago lambda se purificó utilizando un equipo de purificación de ADN Qiagen Lambda (Chatsworth, CA). Se agruparon para cada muestra los lisados en placa procedentes de 10 placas Petri confluentes de 135 mm. Se añadieron 300 \mul de una solución que contenía 20 mg/ml de RNasa, 6 mg/ml de DNasa I, 0,2 mg/ml de BSA, EDTA 10 mM, Tris-HCl 100 mM, NaCl 300 mM, pH 7,5 y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Se mezclaron en NaCl 3 M, 10 ml de polietilenglicol (PEG 6000)al 30% en hielo frío y se incubaron en hielo durante 60 minutos.

Después de la centrifugación a 10.000 \times g durante 10 minutos, se descargó el sobrenadante. El sedimento se volvió a poner en suspensión en 10 ml de una solución que contenía Tris-HCl 100 mM, NaCl 100 mM y EDTA 25 mM, pH 7,5. Se añadió poco a poco 10 ml de una solución que contenía SDS al 4% y se calentó la mezcla a 70ºC durante 10 minutos y a continuación se enfrió en hielo. Se mezcló rápidamente 10 ml de acetato de potasio 2,55 M, pH 4,8 y la solución se centrifugó a 4ºC a 15.000 \times g durante 30 minutos. El sobrenadante se introdujo en una columna Qiagen tip-500 que se había equilibrado con 10 ml de NaCl 750 mM, MOPS 50 mM, etanol al 15%, pH 7,0. Se lavó a continuación la columna con 30 ml de NaCl 1,0 M, MOPS 50 mM, etanol al 15%, pH 7,0. por último, se eluyó la columna con 15 ml de NaCl 1,25 M, MOPS 50 mM, etanol al 15%, pH 8,2. Se precipitó el eluido en 0,7 volúmenes de isopropanol y se centrifugó a 4ºC durante 30 minutos. El sedimento se secó con aire durante 5 minutos y se cortó con EcoRI de alta concentración de Boehringer Mannheim (Mannheim, Alemania).

La inserciones que se han hibridado con la sonda de 333 bp se purificaron en secciones de gel de agarosa utilizando un equipo de extracción de ADN Qiaex (Qiagen, Chatsworth, CA). Se añadió una solución de NaI 3 M, NaClO_{4} 4 M, Tris-H 5 mM, pH 7,5 con tres veces el volumen de gel de sílice, junto con 0,1 vez el volumen de la sección de gel de manitol 1 M y 10 ml de resina Qiaex en un tubo de microcentrifuga de 1,5 ml. Se calentó a 50ºC esta mezcla durante 10 minutos o hasta que se disolvió completamente la agarosa. Se dejó adsorber el ADN a temperatura ambiente durante 5 minutos y a continuación se centrifugaron los tubos brevemente (6 segundos). Después de descargar los sobrenadantes, se lavó la resina Qiaex en una solución que contenía NaClO_{4} 8 M y se centrifugó (6 segundos). Este lavado y centrifugación se repitió y se continuó con 2 lavados (cada uno seguido de centrifugaciones de 6 segundos) en una solución que contenía etanol al 70%, NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5. Se secó la resina con aire y se eluyó en 20 \mul de agua.

Las inserciones purificadas se clonaron en pUC19 (New England Biolabs) utilizando T4 ADN polimerasa de Boehringer Mannheim. Existía una relación (molar) inserción a vector de aproximadamente 5:1. Se realizaron ligaduras toda la noche a 14ºC. El material ligado de precipitó en etanol en presencia de glucógeno para aumentar la recuperación. Este material se electroporó a continuación en células DH10B competentes de electroporación de BRL (Gibco-BRL, Gathersburg, MD).

Se realizaron preparaciones de ADN de plásmido utilizando el equipo de purificación de ADN de plásmido de Qiagen. 10 ml de un cultivo de toda la noche de una sola colonia bacteriana se cultivó en caldo estupendo [Tartoff y Hobbs, Bethesda Res. Lab. Focus 9: 12 (1987). Por cada litro: 12 g de bacto-triptona, 24 g de estracto de bacto-levadura, 4 ml de glicerol] con 50 \mug/ml de ampicilina. El cultivo de toda la noche se utilizó para inocular 250 ml de cultivo en un matraz separador de 1 litro que contenía caldo estupendo con 50 \mug/ml de ampicilina. Después de esto se cultivó a saturación, se centrifugó el medio a 5.000 rpm durante 10 minutos. El sedimento bacteriano se volvió a poner en suspensión en 10 ml de 100 \mug/ml de RNasaA, Tris-HCl 50 mM. Se añadió 10 ml de NaOH 200 mM, SDS al 1% al sedimento resuspendido y se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadió 10 ml de KAc 2,55 M, pH 4,8 y se mezcló poco a poco. Se centrifugó a 10.000 rpm inmediatamente el material durante 10 minutos. Se filtró el sobrenadante a través de una torunda de gasa de algodón y el lisado que estaba exento de partículas se añadió a una columna Qiagen tip-500 siguiendo el mismo procedimiento que para el procedimiento de preparación del ADN lambda.

Cribado de un segundo banco de ADNc. Un banco de ADNc procedente de la mucosa del colon humano, gentilmente cedida por Jim Pipas de la Universidad de Pittsburgh, fue el segundo banco cribado para el ADNc del TIMP-3. Este banco utilizó Uni-Zap (Stratagene, La Jolla, CA) como vector y presentó un resultado de la valoración de 2,4 \times 10^{10} pfu/ml. La hibridación se realizó como para el banco del riñón, utilizando la sonda de 333 bp. El vector Uni-Zap presenta un fago de tamaño medio pBluescript que fue escindido del fago con el que se hibridaron las sondas y se secuenció directamente.

Se aislaron las partículas de fago y se ampliaron de la forma siguiente. Las partículas de fago se liberaron en el tampón SM incubando durante 2 horas a temperatura ambiente. En un tubo de ensayo de 50 ml, se mezclaron 200 \mul de células XL1-Blue D.O._{600} = 1,0 y 200 \mul del fago lambda Zap con 1 ml del fago cooperador R 408 que tenía un resultado de valoración de 10^{10} pfu/ml. Esta mezcla se incubó a 37ºC durante 15 minutos. Se añadieron 3 ml de medio 2xYT (por cada litro: 16 g de bacto-triptona, 10 g de extracto de bacto-levadura, 5 g de NaCl) y la mezcla se incubó a continuación durante 2,5 horas a 37ºC en agitación. Se calentó el tubo a 70ºC durante 20 minutos y a continuación se centrifugó a 4.000 \times g durante 5 minutos.

Para rescatar el fago de tamaño medio, se incubaron 50 \mul de la existencia del fago disgregado por calor con 200 \mul de células XL1-Blue de D.O._{600} = 1,0 en un tubo de 1,5 ml. Además, se incubaron 10 \mul de una dilución al 10^{-2} de fago disgregado por calor con 200 \mul de células XL1-Blue de D.O._{600} = 1,0 en un tubo de 1,5 ml por separado. Los tubos se incubaron a 37ºC durante 15 minutos y a continuación se colocaron en placas con ampicilina LB y se incubaron toda la noche a 37ºC. Las colonias que aparecieron en la placa contenían el fago de tamaño medo de doble cadena pBluescript SK con la inserción del ADN clonada.

Esto dio como resultado la detección de un clon, denominado en esta memoria "TIMP3HCM3" (véase la Figura 16), que carece de una parte que codifica el terminal N del polipéptido maduro.

Secuenciado del ADN

Todo el secuenciado se realizó con secuenciadores automatizados 373A de Applied Biosystems, Inc. (ABI). Los productos de PCR se secuenciaron utilizando cebadores coloreados con el vector pUC anidados y catalizador de ABI para realizar las reacciones.

Se secuenciaron los ADNc de doble cadena clonados en pUC19 utilizando el equipo Prism Ready Reaction Dye-Deoxy Terminator Cycle Sequencing de ABI utilizando el protocolo que venía con el equipo. Para las áreas con alto contenido de GC que conducen a bucles de horquilla, las reacciones se realizaron con los siguientes cambios en el protocolo del equipo estándar: desnaturalización a 98ºC durante 30 segundos, Amplitaq 12 U, sustitución del tampón Vent Polimerasa de New England Biolabs (NEB) por el tampón TACS de ABI y 30 ciclos en lugar de 25 ciclos.

Análisis de la secuencia

Los análisis de ADN y de aminoácidos deducidos utilizaron el paquete de software para análisis de secuencias Genetics Computer Group (GCG) del Departamento de Genética de la Universidad de Wisconsin, Genetic Computer Group, Inc., University Research Park, 575 Science Drive, Suite B, Madison, Wisconsin 53711.

Expresión de TIMP-3 recombinante humano en E. coli

Se amplió la secuencia de codificación de Timp3clone7 mediante PCR utilizando el protocolo del equipo estándar. El cebador 544-29 SEC ID nº 8 (5'-AAC AAA CAT ATG TGC ACA TGC TCG CCC AGC C-3') consta de los nucleótidos 351 a 369, que codifica los aminoácidos 24 a 29 de TIMP-3 (1 a 6 de la proteína madura de la Figura 1). Se incluyeron una zona NdeI y 6 bases más (subrayadas) para facilitar la subclonación en un vector de expresión bacteriano. Se añadió el codón iniciador de metionina (en cursiva) para facilitar la expresión. El cebador corriente abajo, 532-13, SEC ID nº 9 (5'-CGG GAT CCT ATT AGG GGT CTG TGG CAT TGA TG-3') corresponde a los nucleótidos 896 a 914 (de la Figura 1) con una zona BamHI añadida y 2 bases adicionales (subrayadas) además de dos codones de terminación (en cursiva). Se cambió el codón de terminación natural, TGA (TCA en la cadena complementaria opuesta), ya que es una terminación más eficaz en E. coli. El segundo codón de terminación, TAG, (CTA en la cadena complementaria opuesta), se añadió como copia de reserva.

El vector pCFM3102, tal como se describe más adelante, se digirió toda la noche con NdeI y BamHI aunque era el fragmento de PCR de 589 bp que codifica TIMP-3. Se detuvo la reacción mediante extracción con fenol/cloroformo seguida de extracción con cloroformo solo. La capa acuosa se pasó a continuación a través de una columna rotativa Sephadex G-50 de 1 ml (en una jeringuilla de 1 ml) que estaba equilibrada con 200 \mul de Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0. El flujo a través de la columna se recogió y se precipitó con 0,1 volúmenes de NaAc 3 M, pH 5,4 y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Después de la centrifugación se lavó el sedimento en etanol al 70% y se secó en un Speed-Vac (Savant). Los sedimentos se volvieron a poner en suspensión en 20 \mul de agua Super-Q.

Se realizó una falsa ligadura que contenía pCFM3102 cortado sin inserción además de la ligadura TIMP-3::
pCFM3102. Se realizaron ligaduras toda la noche a 14ºC, utilizando T4 ADN ligasa de Boehringer Mannheim. A continuación se precipitaron, se lavaron y se secaron como anteriormente. Los sedimentos se volvieron a poner en suspensión a continuación en 5 \mul de agua Super-Q. Se utilizaron 2,5 \mul de cada ligadura para electroporar 40 \mul células competentes de electroporación.

La electroporación del plásmido en E. coli tuvo lugar en cubetas de 0,1 cm (Bio-Rad) a 1,9 kV, 200 ohmios, 25 \muF utilizando Gen Pulser de Bio-Rad y con recuperación inmediata en 5 ml de medio SOC. Se recuperaron las células a 28ºC durante 11,3 horas y se colocaron sobre placas LB que contenían kanamicina. Las placas se incubaron a 28ºC toda la noche. Se detectaron las inserciones en las colonias mediante PCR utilizando cebadores específicos del vector 315-21 SEC ID nº 10 (5'-ACC ACT GGC GGT GAT ACT GAG-3') y 315-22 SEC ID nº 11 (5'-GGT CAT TAC TGG ACC GGA TC-3'). Las colonias con inserciones proporcionaron productos por PCR procedentes del vector originalsin inserción.

Construcción del plásmido de expresión pCFM3102

La expresión de la proteína madura se realizó en E. coli utilizando un vector del plásmido. Un cultivo de este E. coli, que contiene plásmido que codifica a un polipéptido maduro tal como se presenta en la Figura 1, se deposita en el ATCC, nº de registro 69454.

El plásmido utilizado procedía de pCFM836, que está descrito totalmente en la patente nº 4.710.473.

La construcción para el presente plásmido (denominada pCFM3102) procedente del plásmido pCFM836 descrito (patente U.S. nº 4.710.473) era para destruir las dos zonas de restricción NdeI endógenas, completando el extremo con enzima T4 polimerasa, seguido de ligadura del extremo romo, sustituyendo la secuencia del ADN entre las únicas zonas de restricción AatII y ClaI que contienen el promotor P_{L} sintético, sustituyendo la secuencia pequeña del ADN entre las únicas zonas de restricción ClaI y KpnI por un oligonucleótido que contiene numerosas zonas de restricción y realizando una serie de cambios de base dirigida por mutagénesis de oligonucleótido con solape por PCR a través de del vector intermedio pCFM1656 (4799 pares de bases).

Fermentación

El inóculo para la fermentación se inició transfiriendo 0,1 ml de una existencia de glicerol a 1 D.O./ml en LB + glicerol al 17% del registro ATCC nº 69455 (células huésped de E. coli conteniendo el pCFM3102 con secuencias de codificación insertadas de TIMP-3) en un matraz de cuello alto de 2 l conteniendo 500 ml de Luria Broth (10 g/l de tripticasa-peptona, 10 g/l de extracto de levadura y y 5 g/l de cloruro de sodio). El cultivo se colocó en un incubador con plataforma de agitación a 30ºC durante 16 horas a 250 rpm. A continuación se transfirió el cultivo a 8 litros de medio estérilen un fermentador BioLafitte de 15 l.

Los 8 litros del medio que se esterilizaron en su lugar en el fermentador constaban de lo siguiente:

10 g/l: extracto de levadura

5,25 g/l: sulfato de amonio

3,5 g/l: fosfato dibásico de potasio

4,0 g/l: fosfato monobásico de potasio

1,25 g/l: cloruro de sodio

\newpage

Después de esterilizar el medio enfriado a 30ºC, se añadió lo siguiente:

40 g: glucosa

8 g: sulfato de magnesio heptahidratado

16 ml: solución vestigios de metales^{1}

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Se ajustó el pH del medio a pH 7,0 utilizando ácido fosfórico concentrado. Los demás parámetros de la fermentación durante esta fase discontinua se ajustaron como sigue:

caudal de aire = 31,0 l/min

agitación = 350 rpm

indicación de oxígeno disuelto fijada en el 60%

caudal de oxígeno = 0

contrapresión = 0,5 bar

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Una vez el cultivo en el recipiente de fermentación alcanzó una D.O. 600 de 6,0, se puso en marcha una solución concentrada de glucosa y nitrógeno orgánico utilizando un programa que aumenta el caudal de alimentación según la D.O. del cultivo. Esta alimentación concentrada (Alimentación 1) consistía en lo siguiente:

50 g/l: tripticasa-peptona

50 g/l: extracto de levadura

450 g/l: glucosa

8,5 g/l: magnesio heptahidratado

10 ml: vestigios de solución de metales^{1}

10 m/l: solución de vitaminas^{2}

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En el momento de introducir la primera alimentación en el fermentador, se realizaron los siguientes cambios:

se aumentó la agitación a 850 rpm

se aumentó la contrapresión a 0,8 bar

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Utilizando la alimentación concentrada, se aumentó la D.O. a 30. En este punto se produjo el cultivo subiendo la temperatura a 42ºC. Se hicieron otros cambios como sigue:

se disminuyó el caudal de aire a 24 l/min

se aumentó el caudal de oxígeno a 3 l/min

se redujo la alimentación 1 a 0

se inició la alimentación 2 a 300 ml/h

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la alimentación 2 consistió en lo siguiente:

200 g/l de tripticasa-peptona

100 g/l de extracto de levadura

110 g/l de glucosa

\newpage

Después de 4 horas a 42ºC se detuvo la fermentación y se recogieron las células por centrifugación en bolsas de plástico que contenían en su interior un frasco de centrifugadora de 1 litro. La centrifugación fue a 400 rpm durante 60 minutos. Al final de este periodo se separó el sobrenadante y la pasta de células restante se congeló a -90ºC.

^{1}Solución de vestigios de metales:

27 g/l: FeCl_{3}\cdot6H_{2}O

2 g/l: ZnCl_{2}\cdot4H_{2}O

2 g/l: CaCl_{2}\cdot6H_{2}O

2 g/l: Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O

1,9 g/l: CuSO_{4}\cdot5H_{2}O

0,5 g/l: H_{3}BO_{3}

100 ml/l: HCl concentrado

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^{2}Solución de vitaminas:

0,42 g/l: riboflavina

5,4 g/l: ácido pantoténico

6 g/l: niacina

1,4 g/l: hidrocloruro de piridoxina

0,06 g/l: biotina

0,04 g/l: ácido fólico

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Secuenciado de aminoácidos con terminal NH_{2}

La secuencia de aminoácidos con terminal NH_{2} de la proteína de TIMP-3 recombinante procedente de E. coli se determinó que era idéntica a la secuencia deducida actuación prolongada de los clones de ADNc. Se escindió el iniciador de metionina procedente de la construcción. No existió ningún otro tratamiento proteolítico detectado en el terminal NH_{2} de TIMP-3. No se realizó ninguna asignación para cys-1 y cys-2 ya que la muestra de proteína se redujo y las cisteínas reducidas no se pueden detectar fácilmente por este procedimiento. Por lo tanto, la lectura de la secuencia es la siguiente: X-T-X-S-P-S-H-P-Q-D-A-F-.

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Procedimientos

El TIMP-3 recombinante purificado parcialmente presente en cuerpos de inclusión de E. coli se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida SDS y se transfirió eléctricamente sobre una membrana de PVDF para el análisis de la secuencia. Se realizó el análisis de los aminoácidos con terminal NH_{2} en un secuenciador en fase gas (modelo 477, Applied Biosystems, Foster City, CA) según los protocolos publicados. Hewick et al., J. Biol. Chem., 256: 2814-2818 (1981). El secuenciador se equipó con un analizador del aminoácido feniltiohidantoína (PTH) en línea y un sistema de análisis de datos modelo 900 (Hunkapiller et al., Methods of Protein Microcharacterization, Clifton, NJ: págs. 223-247 (1986)). El análisis del aminoácido PTH se realizaron con un sistema de microcromatografía líquida (modelo 120) utilizando bombas de doble émbolo y fase inversa (C-18) columnas de diámetro reducido (Applied Biosystems, Inc.), con las dimensiones de 2,1 mm \times 240 mm.

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Purificación de proteínas

Se volvió a poner en suspensión aproximadamente 435 g de peso húmedo de pasta de células de E. coli, recogidas de la fermentación realizada, en un volumen de 1.760 ml de agua y y se interrumpió mediante dos pases por un microfluidizador. El lisado celular se centrifugó a 17.700 \times g durante 30 min, y la fracción de sedimento se lavó una vez con agua (mediante resuspensión y recentrifugación). Un parte del material del sedimento lavado (3,1% del total) se volvió a poner en suspensión en 10 ml de Tris-HCl 50 mM/ditiotreitol 50 mM/N-lauroilsarcosina de sodio al 2% (p/v), pH 8,5. Después de la incubación a 50ºC durante 5 min y a temperatura ambiente durante 3 h, se centrifugó la mezcla a 20.000 \times g durante 60 min. El sobrenadante se aplicó a una columna de filtración con gel Sephacryl S-200 (Pharmacia; 2 \times 23 cm) equilibrada en Tris-HCl 20 mM/ditiotreitol 50 mM/N-lauroilsarcosina de sodio al 1% pH 8,0 a temperatura ambiente. Se recogieron fracciones de 1 ml a un caudal de 5 ml/h y se analizaron por A_{280} y por SDS/electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Se agruparon las fracciones 43 a 53 y el conjunto se dializó durante un periodo de 3 días frente a Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), azida de sodio al 0,02% (p/v), a 4ºC.

La Figura 3 presenta un gel de SDS-PAGE teñido con plata del producto de expresión parcialmente purificada procedente de esta fermentación. Las vías 4 y 5 contienen TIMP-3 reducido procedente de E. coli, antes y después de la diálisis. Las entradas 9 y 10 contienen TIMP-3 no reducido procedente de E. coli, antes y después de la diálisis. Como se puede apreciar, el peso molecular aparente para el material reducido es aproximadamente de 22 kDa.

Como se puede ver en la Figura 3, el rendimiento después de la diálisis se redujo; el polipéptido parece ser algo incapaz para la solubilización. En el presente procedimiento, la presencia de cuerpos de inclusión que contienen material relativamente insoluble dio como resultado un rendimiento reducido de TIMP-3 purificado y aislado. Aunque esto dio como resultado un producto parcialmente purificado, un experto reconocerá en el acto procedimientos para obtener un polipéptido purificado y aislado. Por ejemplo, se pueden utilizar diferentes detergentes como agentes solubilizantes o utilizar un sistema de expresión diferente, por ejemplo, uno que permita la secreción del polipéptido (y por lo tanto la eliminación de los cuerpos de inclusión).

Se intentó también la expresión y purificación utilizando células eucarióticas (células COS-7), sin embargo no se observó ningún polipéptido de TIMP-3 recombinante activo. Esto puede haber sido debido a la adherencia del polipéptido TIMP-3 recombinante para el material con matriz extracelular producido por las células COS-7. Una manera posible de obtener la proteína activa a partir de una célula huésped de mamífero puede ser utilizar células que sean no adherentes y no producir, por consiguiente, ninguna cantidad significativa de material con matriz extracelular. El polipéptido recombinante se encontraría entonces en el medio de cultivo acondicionado. Por ejemplo, se pueden utilizar células de Jurkat o células U937 para la expresión del péptido recombinante y otras células huésped no adherentes y sistemas de expresión serán evidentes para los expertos en la materia.

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Resultados del cribado de dos bancos de ADNc y de la expresión de TIMP-3 recombinante humano

El trabajo de la presente memoria presenta la clonación y expresión de una tercera clase de componentes de la familia TIMP de mamífero, denominada en la presente memoria en conjunto "TIMP-3". En la Figura 1 se presenta a secuencia de nucleótido obtenida a partir de un banco de ADNc de riñón fetal humano. Como se puede observar, la SEC ID nº 12, secuencia de ácido nucleico obtenida contiene 1240 pares de bases. Se presenta también la secuencia de aminoácidos predicha. La SEC ID nº 13 (secuencia de aminoácidos predicha, ya que no se obtuvo la secuencia completa del propio polipéptido. Un experto en la materia puede secuenciar el producto de la expresión de E. coli depositado en el ATCC, nº de registro 69455). La cisteína inicial predicha de la proteína madura es el número +1. Esta predicción se basa en la comparación con otros componentes de la familia TIMP.

La Figura 4 presenta esta comparación entre los componentes de l familia TIMP. Los puntos (\bullet) indican los residuos de aminoácido que son únicos para el TIMP-3 de la Figura 1 obtenida a partir de la expresión del ADNc humano y el tipo en negrita indica los residuos conservados.

Como se puede apreciar, el presente TIMP-3 recombinante humano de la Figura 1 es distinto de los demás componentes de la familia TIMP. Mientras posean los residuos de cisteína conservados y otros aminoácidos conservados dentro de la familia (39 en total), por lo menos 23 residuos de aminoácido son exclusivos del TIMP-3 recombinante humano ilustrado.

Las Figuras 5 a 13 ilustran las diferencias entre el presente TIMP-3 recombinante humano de la Figura 1 y el TIMP-3 del pollo ("ChIMP-3", Figuras 5 a 7), el TIMP-2 humano (Figuras 8 a 10) y TIMP-1 humano (Figuras 11 a 13), tanto en las concentraciones de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Las Figura contienen una línea continua entre los residuos de aminoácido que son idénticos y puntos que indican el grado de distancia evolutiva. (Para las Figuras 5, 8 y 11, que ilustran el alineamiento de aminoácidos, la numeración de la posición "1" es para el polipéptido maduro).

Al nivel de aminoácidos, TIMP-3 y ChIMP-3 son aproximadamente el 80% idénticos, estando los aminoácidos más o memos dispersados continuamente (Figura 5). La Figura 6 demuestra que, al nivel del ácido nucleico, en ADN del TIMP-3 de la Figura 1 es aproximadamente el 74% homóloga con el ADN del ChIMP-3 entre los ácidos nucleicos 151 a 1087 (TIMP-3) y entre 1 a 886 (ChIMP-3). La Figura 7 demuestra que aún analizando la zona de máxima analogía, los pares de bases 282 a 1040 del TIMP-3 de la Figura 1 y 113 a 884 para ChIMP-3, existe aproximadamente el 78% de identidad.

Las Figuras 8 a 10 ilustran una comparación entre el TIMP-3 recombinante humano de la Figura 1 y el TIMP-2 humano. Tanto al nivel de aminoácido como al nivel del ácido nucleico existen mayores distinciones que con ChIMP-3. La Figura 8 demuestra que existe aproximadamente el 46% de identidad al nivel de aminoácido. La Figura 9 demuestra que, al nivel de ácido nucleico, la homología global es aproximadamente el 52% del total y aproximadamente el 60% en la zona de máxima homología (Figura 10).

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Las Figuras 11 a 13 ilustran una comparación entre el TIMP-3 recombinante humano de la Figura 1 y el TIMP-1 humano. Al nivel de aminoácido, existe aproximadamente el 39% de identidad (Figura 11) y aproximadamente el 47% de la homología total al nivel del ácido nucleico. Existe aproximadamente el 65% de identidad en la zona de máxima homología.

Bioquímicamente, los puntos isoeléctricos calculados (pI) del polipéptido TIMP-3 maduro y su precursor son 9,16 y 8,80, respectivamente. Existe una zona de glucosilación potencial en la secuencia terminal carboxi (184:NAT). Mientras que el ChIMP-3 natural se señala que no está glucosilado (Pavloff et al., supra, J. Biol. Chem. 267: en 17323), no se sabe actualmente si el TIMP-3 humano natural está glucosilado. A pesar de todo, la presente invención incluye polipéptidos con grupos químicos adicionales, tales como hidratos de carbono. El principal material hidrófobo de la Figura 1 tiene una longitud de 23 aminoácidos. El secuenciado del N-terminal confirmó la identidad de los primeros 12 aminoácidos del polipéptido recombinante maduro.

La clonación y expresión descrita en la presente memoria demuestra que los presentes polipéptidos de TIMP-3 representan nuevos componentes en la familia TIMP.

Ejemplo 2 Expresión de TIMP-3 en varios tipos de células

Se probó la expresión del ARN del TIMP-3 en una variedad de células (lo que indicaría la expresión del polipéptido). Los resultados demuestran que entre las células normales (es decir, no cancerosas), la expresión se observa en células asociadas a la actividad de kla matriz extracelular (es decir, crecimiento o degradación). Las células (o tejidos) normales en los que se observa la expresión del ARN de TIMP-3 (Figuras 14A y B) son las de la placenta, célula del estroma, pulmón del embrión, prepucio del recién nacido (siendo una de cada dos muestras ligeramente positiva) y pulmón del adulto (ligeramente positiva). Entre las células de cáncer probadas, algunas fueron positivas, otras fueron negativas. Por ejemplo, varias líneas celulares de adenocarcinoma de mama dieron resultados disparatados; uno fue positivo, otro fue negativo, otro fue ligeramente positivo. Esto puede indicar expresión temporal, porque la expresión de TIMP-3 puede variar durante el curso de la evolución de la enfermedad, aunque el significado no está claro. La Tabla 2, a conti-
nuación, presenta una descripción de las células probadas y de los resultados. A continuación están los procedimientos.

En muchas de las líneas celulares positivas se detectaron tres bandas de ARNm de un tamaño aproximado de 2,2, 2,5 y 4,4 kb. Se desconoce el significado de las diferentes bandas de ARNm pero puede representar corte y empalme alternativo o extendido a las zonas 3' y 5' no traducidas. Estas pueden ser ARN que codifican diferentes variantes naturales.

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TABLA 2 Números de ATCC más descripción

2

Procedimientos

Se realizaron dos tipos de transferencia de Northern, una en transcripciones de ARN y otra utilizando transcripciones con cola de poli A+.

Preparación de ARN total. Se extrajo de las células ARN total para la northern de ARN total utilizando una modificación de un protocolo publicado. (Chomczynski y Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987).

Se cultivaron las células en cápsulas de Petri de 2 \times 10 cm (aproximadamente 2 \times 10^{6} células), se lavaron dos veces con 1\times PBS frío. Después de aspirar todo el PBS, se añadieron 500 \mul de una solución acuosa que contenía lo siguiente en cada placa: tiocianato de guanidinio 4 M (Fluka), citrato de sodio 25 mM pH 7,0 (Mallinckrodt), sarcosyl 0,5% (Sigma, St. Louis, MO), \beta-mercaptoetanol 0,1 M (Sigma, St. Louis, MO). Se pipeteó el lisado celular en un tubo de microcentrífuga Eppendorf de 1,5 ml y se distribuyó con una aguja de calibre 25.

Se añadió acetato de sodio (pH 4) a los 500 \mul de lisado para preparar una concentración final de 0,2 M. La mezcla se agitó fuertemente a mano. Se añadió 1/5 de volumen de cloroformo y se mezcló completamente. Se centrifugaron los tubos a 15.000 rpm durante 5 minutos a 20ºC en una centrífuga Tomy MTX-100. Se invirtieron los tubos para dejar que la capa de precipitado blanco se separase de la capa acuosa en lugar de volver a centrifugar. Se volvió a extraer el ARN con fenol y cloroformo dos veces más y se se extrajo una última vez con cloroformo. Se añadió 1 ml de isopropanol al tubo de microcentrífuga y se precipitó la mezcla a -20ºC toda la noche. Al día siguiente se centrifugó a 15.000 rpm durante 15 minutos. Se lavó el precipitado con 1 volumen de etanol al 80%, se volvió a centrifugar y se secó en un Speed Vac (Savant, Farmingdale, NY).

Se volvió a poner en suspensión el sedimento en 400 \mul de la solución d guanidinio que contenía \beta-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO). Se añadieron a la mezcla 800 \mul de etanol, que se centrifugó a continuación a 15.000 rpm durante 15 minutos y se lavó con etanol al 80%. Este sedimento se volvió a poner en suspensión en 20 \mul de agua y se determinó la D.O.

Preparación de ARN de Poli A+. Se preparó ARN de poli A+ utilizando columnas de fibra de celulosa con oligo dT de Clontech (Palo Alto, CA). Se lavó a través de las columnas con 2 \times 1 ml de un tampón de alta salinidad (Tris-HCl 10 mM [pH 7,4], EDTA 1 mM, NaCl 0,5 M) y se drenó por gravedad. Se volvió a poner en suspensión el ARN total, aislado como se describió anteriormente, en 1 ml de tampón de elución (Tris-HCl 10 mM [pH 7,4], EDTA 1 mM) y se calentó a 68ºC durante 3 minutos. Se añadieron 0,2 ml de tampón de muestra (Tris-HCl 10 mM [pH 7,4], EDTA 1 mM, NaCl 3 M) a la solución de ARN, que se colocó a continuación en hielo.

Se cargaron las muestras en columnas equilibradas recientemente y se dejó empapar por gravedad. Las columnas se colocaron dentro de tubos de 50 ml y se centrifugaron a 350 \times g durante 2 minutos. Se descargaron los eluídos. Se añadió 0,25 ml del tampón de alta salinidad (véase anteriormente) a cada columna y las columnas se centrifugaron a 350 \times g durante 2 minutos. Este lavado se repitió una vez. En cada caso se descargaron los eluídos. Se lavaron a continuación las columnas 3 veces con tampón de baja salinidad (Tris-HCl 10 mM [pH 7,4], EDTA 1 mM, NaCl 0,1 M) y se centrifugaron cada vez a 350 \times g durante 2 minutos. Se descargaron los eluídos en cada caso. Los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml estériles se colocaron dentro de los tubos de 50 ml para recoger las eluciones posteriores. Se aplico a las columnas 0,25 ml de tampón de elución (Tris-HCl 10 mM [pH 7,4], EDTA 1 mM) calentado a 65ºC, los cuales se centrifugaron a continuación a 350 \times g durante 2 minutos. Este procedimiento se repitió 3 veces durante un total de 4 eluciones por columna. Se recogieron todas las eluciones de cada columna en un tubo de microcentrífuga. Los eluyentes se precipitaron con etanol como anteriormente.

Transferencia de Northern. Se cargó 10 \mug de ARN total en cada vía. El tampón de muestra incluía 10 \mul de formamida, 3,5 \mul de formaldehído, 2 \mul de 10\times MOPS, 2 \mul de colorante de carga, 0,2 \mul de bromuro de etidio y 6,5 \mul de muestra de ARN en agua. La mancha de ARN con poli A+ tenía 3 \mug de ARNm cargado en cada vía.

Los geles para las transferencias de Northern consistían en 1,5 g de agarosa mezclada en 95 ml de agua y a continuación enfriada a 60ºC. Se añadieron 30 ml de 5 x MOPS y 25 ml de formaldehído (pH 4,7) a la solución de agarosa enfriada. Antes de transferirlos, los geles se ajustaron para eliminar el exceso de gel. Se remojaron a continuación en agua destilada durante 5 minutos, seguido de un remojado de 10 minutos en NaOH 50mM, NaCl 10 mM a temperatura ambiente. Se neutralizaron los geles en Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5 durante 45 minutos y a continuación se remojaron con 20X SSC durante 1 hora. La transferencia tuvo lugar durante toda la noche en 10X SSC. Se transfirieron los geles sobre membranas de nitrocelulosa de Schleicher & Scheull (Keene, NH). El gel de ARN total se transfirió sobre nitrocelulosa pura y se fijó por reticulación UV utilizando un Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA). El gel de poli A+ se transfirió sobre un soporte de nitrocelulosa y se coció al vacío en un horno durante 2 horas a 80ºC.

Se hibridaron las transferencias de forma similar al cribado del banco de ADNc. La única diferencia es que para el análisis de la transferencia de Northern, se utilizaron reactivos exentos de RNasa dondequiera que fue posible.

Ejemplo 3 Actividad in vitro del TIMP-3 recombinante humano Cimograma modificado

DeClerck et al., J. Biol. Chem. 266: 17455-17453 (1991) demostraron que TIMP-2 se unirá a la colagenasa intersticial p-APMA activada del fibroblasto de conejo en complejos que son estables en SDS. El precursor inactivo de 52 kDa se escindió en una proteína de 42 kDa mediante el organomercurial. Aunque la proteína activa degrada principalmente el colágeno de los tipos I, II y III, también degradará la gelatina en menor grado.

El medio acondicionado (CM) de fibroblastos sinoviales de conejo contiene colagenasa intersticial además de gelatinasa de tipo IV de 72 kDa. Se incubó el CM en 5 \mul de Tris-HCl 50 mM, NaCl 200 mM, CaCl_{2} 10 mM, pH 7,5 durante 15 minutos en presencia o ausencia de TIMP-2 (según el documento EP 0 398 753), TIMP-2\Delta ó TIMP-3 de la Figura de 1. Obsérvese que TIMP-2\Delta se refiere a una forma biológicamente activa truncada de TIMP-2 con 128 a 194 aminoácidos de la proteína madura eliminada. Tolley et al., J. Mol. Biol. 229: 1163-1164 (1993); Willenbrock et al., Biochemistry 32: 4430-4437 (1993). Se ha demostrado anteriormente que TIMP-2 interactúa preferentemente con la procolagenasa de 72 kDa aunque estos complejos no eran estables en SDS al 0,1% (p/v). Stetler-Stevenson, J. Biol. Chem., 264: 17374-17378 (1989). El TIMP-3 probado fue el TIMP-3 dializado de la Figura 3.

En ausencia de los TIMP, son visibles 2 zonas de eliminación cuando se pasan fibroblastos sinoviales de conejo sobre acrilamida al 10%, gel de gelatina al 0,1%. Figura 15. Una de las bandas corresponde a la colagenasa intersticialde 42 kDa activada por pAPMA. Esta eliminación estuvo ausente en presencia de CM incubado con TIMP-2, TIMP-2\Delta o el TIMP-3 dela Figura 1. La otra zona de eliminación no fue afectada, lo que significa que no formó un complejo estable de SDS con el TIMP. En un experimento aparte utilizando los presentes procedimientos (datos no mostrados), una zona de eliminación generada por la colagenasa en medio acondicionado por células COS-7 no se inhibió por la presencia de TIMP-2, TIMP-2\Delta ó TIMP-3.

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Ejemplo 4 Preparación de análogos del polipéptido TIMP-3 y de variantes de ácido nucleico

En la Figura 1 se presenta la secuencia de aminoácidos del TIMP-3 completo. Utilizando la numeración de la Figura 1, la secuencia completa tiene una longitud de 188 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos comprendida entre -23 y -1 es la secuencia principal, y por lo tanto la versión previa del polipéptido tiene una longitud de 211 aminoácidos.

La zona de codificación del ADN del TIMP-3 está comprendida entre la posición 1-69 y 564 de la secuencia de ácido nucleico ilustrada.

Por otra parte, para ambas variantes, se puede construir una secuencia de péptido con señal para la expresión en la célula eucariótica. Como se puede observar en la Figura 16, se han aislado dos clones de ADNc adicionales, TIMP3clone2. SEC ID nº 14 y nº 15 (de registro de ATCC nº 69456) y TIMP3HCM-3 Sec. ID nº 16, 17 (de registro ATCC nº 69453).Estos clones representan variantes naturales. TIMP3clone2 carece de parte de la zona que codifica el terminal N de la secuencia principal de TIMP3clone7. Propiamente dicho, esto se expresaría preferentemente en un procariota, tal como E. coli. TIMP3HCM-3 carece de una parte de la zona que codifica el terminal NH_{2} de la proteína madura. Como este clon carece de la secuencia principal hidrófoba, se expresaría preferentemente en un procariota, tal como E. coli.

La Figura 16 muestra que existen algunas diferencias entre los tres clones de ADNc. En el nucleótido 320, existe una A en TIMP3clone 2 y una T en TIMP3clone 7. Esto produciría un cambio en la secuencia de aminoácido comprendida entre trp y arg en la posición 14 de la secuencia hidrófoba principal. Esta diferencia puede ser un artefacto de clonación debido a su posición en el extremo 5' de este clon. ChIMP-3 también presenta un trp en esta posición. Se puede hallar otra divergencia en la base 529, en la que el clon 2 tiene una C y los clones 7 y HCM-3 tienen una T. Este polimorfismo no produce un cambio de aminoácidos porque tanto CAT como CAC codifican a his. Otros polimorfismos se encuentran en o cerca de la cola de poli A. La cola de poli A de HCM-3 está precedida por una única G, mientras que en los otros 2 clones está precedida por GG. La cola poli A del clon 7 tiene una longitud de 15 bases y la cola del HCM-3 tiene una longitud de 18 bases. La cola poli A del clon 2 de 17 bases de longitud, está interrumpida por otras 3 bases y está seguida de 32 nucleótidos de la secuencia no traducida 5' adicional.

El producto 29 de PCR (TIMP3PCR29 SEC ID nº 18 y nº 19, véase la Figura 16) se obtuvo también a partir del cribado del ADNc del riñón fetal humano, utilizando un cebador específico de inserción y un cebador específico del vector como sigue:

\newpage

SEC ID nº 21 (496-16) (CLWTMD delantero):

5'-CGG AAT TCT GTC TCT GGA CCG ACA TGC TCT CC 3'

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SEC ID nº 20 (489-23)(gt\mu lambda inversa):

5' GAC ACC AGA CCA ACT GGT AAT G 3'

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Como se puede apreciar en la Figura 16, esta puede representar una variante con terminal C natural. En la Figura 16B, abajo, a 16C, arriba, se indican las diferencias en la secuencia de aminoácidos entre el TIMP3clone 7 y el TIMP3PCR29. El TIMP3PCR29, clonado en pUC19 y colocado en E. coli se ha depositado en el ATCC con el nº de registro 69532. Sin embargo, no se ha encontrado un clon de ADNc completo que abarca este producto de PCR en el banco de ADNc de riñón fetal. Se desconoce si TIMP3PCR29 representa una variante total o parcial o un artefacto de PCR.

Se pueden preparar otros análogos de TIMP-3. Un tipo de análogo es una forma truncada que presenta una unión a la parte de una metaloproteinasa que se une al cinc. Como se indicó anteriormente, la zona conservada para este dominio de unión al cinc puede estar representada por H E X G H, en la que X es F ó L. Por analogía a los análogos de deleción de TIMP-2 que se han preparado, se pueden preparar también los análogos de TIMP-3 que mantienen la actividad de inhibición del enzima.

La Figura 17 es una ilustración de la estructura secundaria propuesta para la familia TIMP de proteínas. Véase Alexander et al., Extracellular Matrix Degradation, en Cell Biology of Extracellular Matix, (2ª ed., Hay, ed.), Plenum Press, Nueva York, págs, 255-302. Como se puede observar, las seis cisteínas con terminal C forman una estructura secundaria que está algo separada de la estructura formada por la zona que abarca las seis primeras cisteínas. Anteriormente, se ha demostrado que los análogos de TIMP-2 que carecen del terminal Cualquier comprenden hasta e incluyen la 6ª cisteína desde el terminal C, presentan actividad. Willenbrock et al., Biochenistry 32: 4330-4337 (1993). Los análogos de TIMP-3 que carecen de una o más cisteinas con terminal C son las que presentan la secuencia (referida a la numeración de la Figura 1) de 1 a 121 y cualquiera comprendida entre 1 a 122 y 1 a 188. Se pueden también realizar adiciones, deleciones y sustituciones en los aminoácidos 122 a 188, además de la unión a grupos químicos, tales como polímeros.

Mientras que la presente invención se ha descrito desde el punto de vista de las formas de realización preferidas, se entiende que las variaciones y modificaciones resultarán evidentes para los expertos en la materia.

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INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Amgen Inc.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Composición de inhibidor de metaloproteinasa de tejido de tipo tres (TIMP-3) y procedimientos

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 21

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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: DESTINATARIO: Amgen Inc./Patent Operations/KMP

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: CALLE: 1840 Dehavilland Drive

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: CIUDAD: Thousand Oaks

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: ESTADO: California

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: PAÍS: USA

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: CÓDIGO POSTAL: 91320-1789

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(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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: TIPO DE MEDIO: Disquete

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: ORDENADOR: IBM PC compatible

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: SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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: SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25

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(vi): DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

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: NÚMERO DE SOLICITUD:

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: FECHA DE SOLICITUD:

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: CLASIFICACIÓN:

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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: LONGITUD: 19 pares de bases

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: TIPO: ácido nucleico

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: NÚMERO DE CADENAS: una

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: TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:

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3

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

: LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.800000\baselineskip

: TIPO: ácido nucleico

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: NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.800000\baselineskip

: TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:

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4

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

: LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.800000\baselineskip

: TIPO: ácido nucleico

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: NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.800000\baselineskip

: TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:

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5

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

: LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.800000\baselineskip

: TIPO: ácido nucleico

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: NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.800000\baselineskip

: TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:

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6

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 5:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

: LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.800000\baselineskip

: TIPO: ácido nucleico

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: NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.800000\baselineskip

: TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:

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7

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 6

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

: LONGITUD: 26 pares de bases

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: TIPO: ácido nucleico

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: NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.800000\baselineskip

: TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:

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8

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 7

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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: LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.800000\baselineskip

: TIPO: ácido nucleico

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: NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.800000\baselineskip

: TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:

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9

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 8

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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: LONGITUD: 31 pares de bases

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: TIPO: ácido nucleico

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: NÚMERO DE CADENAS: una

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: TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:

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10

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 9:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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: LONGITUD: 32 pares de bases

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: TIPO: ácido nucleico

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: NÚMERO DE CADENAS: una

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: TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:

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11

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 10:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

: LONGITUD: 21 pares de bases

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: TIPO: ácido nucleico

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: NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.800000\baselineskip

: TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

: LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.800000\baselineskip

: TIPO: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

: NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.800000\baselineskip

: TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

: LONGITUD: 1240 pares de bases

\vskip0.800000\baselineskip

: TIPO: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

: NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.800000\baselineskip

: TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

14

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

: LONGITUD: 211 aminoácidos

\vskip0.800000\baselineskip

: TIPO: aminoácido

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: NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.800000\baselineskip

: TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:

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16

17

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

: LONGITUD: 963 pares de bases

\vskip0.800000\baselineskip

: TIPO: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

: NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.800000\baselineskip

: TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

: LONGITUD: 198 aminoácidos

\vskip0.800000\baselineskip

: TIPO: aminoácido

\vskip0.800000\baselineskip

: NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.800000\baselineskip

: TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 15:

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20

21

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

: LONGITUD: 820 pares de bases

\vskip0.800000\baselineskip

: TIPO: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

: NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.800000\baselineskip

: TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

22

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

: LONGITUD: 164 aminoácidos

\vskip0.800000\baselineskip

: TIPO: aminoácido

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: NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.800000\baselineskip

: TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 17:

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23

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

: LONGITUD: 92 pares de bases

\vskip0.800000\baselineskip

: TIPO: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

: NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.800000\baselineskip

: TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 18:

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24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

: LONGITUD: 164 aminoácidos

\vskip0.800000\baselineskip

: TIPO: aminoácido

\vskip0.800000\baselineskip

: NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.800000\baselineskip

: TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 19:

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25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

: LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.800000\baselineskip

: TIPO: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

: NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.800000\baselineskip

: TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 20:

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26

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

: LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.800000\baselineskip

: TIPO: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

: NÚMERO DE CADENAS: una

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: TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 21:

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27

Claims

1. Polipéptido humano recombinante que presenta parte o la totalidad de la estructura primaria del polipéptido como se ha expuesto en la figura 1 y que presenta la propiedad biológica que consiste en inhibir una metaloproteinasa, en el que dicho polipéptido recombinante está sustancialmente exento de otras proteínas humanas o agentes patológicos, y en el que el polipéptido está modificado químicamente.

2. Polipéptido recombinante según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido recombinante es el producto de la expresión eucariótica o procariótica de una secuencia de ADN exógeno.

3. Polipéptido recombinante según la reivindicación 2, en el que dicha secuencia de ADN exógeno es portada sobre un vector plásmido de ADN que se replica de manera autónoma.

4. Polipéptido recombinante según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido recombinante se une a la secuencia de aminoácidos H E X G X H, en la que X es F ó L.

5. ARN antisentido que es complementario a una parte de la secuencia de ADN expuesta en la figura 1 y que presenta la propiedad que consiste en modular o prevenir la expresión de una metaloproteinasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Polipéptido según la reivindicación 1, en el que están fijadas una o más moléculas de polímero.

7. Polipéptido según la reivindicación 6, en el que una o más de las moléculas de polímero son polietilenglicol.

8. Polipéptido según la reivindicación 1, modificado químicamente por la fijación de un polipéptido adicional para la creación de una molécula de fusión.

9. Polipéptido humano recombinante según la reivindicación 1, para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de los cánceres avanzados, en el dicho polipéptido debe ser administrado durante la infusión de las células de médula ósea no purgadas.

10. Kit de diagnóstico para detectar una correlación entre la falta de producción de TIMP-3 en un espécimen tumoral y su potencial metastásico que comprende un polipéptido humano recombinante según la reivindicación 1 y un material de acondicionamiento.