ES2315495T3

ES2315495T3 - Empleo de fotorreceptores biologicos como canales ionicos controlados directamente por la luz.

Info

Publication number: ES2315495T3
Application number: ES03727297T
Authority: ES
Inventors: Peter Hegemann; Georg Nagel; Ernst Bamberg
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Priority date: 2002-04-11
Filing date: 2003-04-11
Publication date: 2009-04-01
Anticipated expiration: 2023-04-11
Also published as: DE10216005A1; AU2003233968A1; US8647870B2; US8202699B2; EP1492881B1; ATE412063T1; DE50310674D1; US20130017597A1; WO2003084994A3; US20050202398A1; EP2055714B1; US20110086421A1; WO2003084994A2; EP1492881A2; EP2055714A3; EP2055714A2; US7824869B2; DK1492881T3; AU2003233968A8

Abstract

Empleo de un fotorreceptor biológico como canal iónico directamente controlado por la luz para modificar la conductividad iónica de una membrana con ayuda de luz, - presentando el fotorreceptor una apoproteína y un polieno fotosensible combinado covalentemente a la apoproteína, que interactúa con la apoproteína y funciona como puerta fotosensible, y - siendo la apoproteína una opsina que forma un canal iónico o un derivado o un fragmento de opsina que forma un canal iónico.

Description

Empleo de fotorreceptores biológicos como canales iónicos controlados directamente por la luz.

La presente invención se relaciona con el empleo de fotorreceptores biológicos como canales iónicos controlados directamente por la luz.

Se sabe desde hace tiempo, que un gran número de procedimientos centrales en células vegetales y animales se controla total o parcialmente a través de modificaciones de la concentración intracelular de determinados iones, por ejemplo, de la concentración de protones, y modificaciones del potencial de membrana y del gradiente iónico a través de la membrana. Conforme a eso, la aclaración de los mecanismos de regulación intracelular de iones, particularmente de regulación del pH, y de los mecanismos de los canales iónicos y transportadores iónicos dependientes de la tensión es objeto de extensas actividades de investigación. Para estas investigaciones es de gran interés una medición y/o manipulación rápidas y fáciles de las concentraciones intracelulares de iones, particularmente de las concentraciones de protones, así como del gradiente eléctrico y del gradiente iónico, particularmente del gradiente de protones, a través de membranas celulares.

Una vía, en principio, muy favorable para posibilitar estas mediciones y/o manipulaciones era la introducción de un canal iónico controlado por la luz en una membrana de este tipo, para modificar selectivamente el potencial de membrana y/o el flujo de determinados iones, por ejemplo, protones, a través de la membrana.

En el estado actual de la técnica se conoce una serie de sistemas de transporte iónicos controlados por la luz. Se diferencia además entre sistemas de transporte de iones pasivos y activos. En los sistemas pasivos de transporte iónico, las verdaderas moléculas de transporte, los llamados canales iónicos, interactúan con complejos de fotorreceptor independientes y se controlan indirectamente a través de estos fotorreceptores. Son ejemplos de estos complejos de fotorreceptor que interactúan con un canal iónico la rodopsina activadora de la proteína G; ver, por ejemplo, Müller, F., Kaupp, U. B., Transducción de Señales en Células Visuales, Ciencias de la Naturaleza 85 (1998) 49-61. Como estos sistemas pasivos de transporte iónico conocidos requieren la cooperación de varias proteínas y otros componentes, resulta problemático introducirlos en otras células conservando su función, por ejemplo, mediante co-expresión de las proteínas apropiadas en sistemas recombinantes.

Son ejemplos de moléculas de transporte iónico activas dirigidas por la luz en una membrana celular la rodopsina de archaea (archaebacterias). Un representante conocido de rodopsina de archaea es la bacteriorhodopsina, compuesta por un componente proteico, la bacterioopsina, y un retinal combinado a través de una base de Schiff. Después de estimularla con luz de la longitud de onda apropiada, la bacteriorhodopsina transporta protones a través de la membrana desde el interior de la célula hacia fuera. El transporte iónico discurre generalmente lentamente (< 100 H^{+}/segundos) y la dirección de transporte de la bacteriorhodopsina no puede determinarse libremente. En vivo, la bacteriorhodopsina transporta protones también contra un gradiente electroquímico existente, compuesto por un gradiente de pH y un gradiente eléctrico \Delta\psi. Una bomba de protones dirigida por la luz de este tipo representa un sistema comparativamente simple. La bacteriorhodopsina y proteínas afines enlazantes de retinal como la bomba de cloruro halorhodopsina se exprimieron ya heterologamente y eran capaces del transporte activo de iones de membrana impelido por la luz, por ejemplo, H^{+} o Cl^{-}, en el hospedante heterogéneo.

Los sistemas conocidos resultan, sin embargo, inapropiados para muchos propósitos debido a su complejidad y/o a la dirección de transporte predefinida.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar medios y vías, que permitan una medición y/o manipulación rápidas y ligeras de las concentraciones intracelulares de iones, particularmente de las concentraciones de protones, así como del gradiente eléctrico a través de una membrana celular.

Otro objetivo es proporcionar un sistema apropiado para el screening de alto rendimiento de moléculas biológicas, particularmente de proteínas de la membrana reguladoras del pH y proteínas de la membrana dependientes de la tensión.

Los objetivos en los que se basa la invención se resuelven empleando un fotorreceptor biológico conforme a la Reivindicación independiente 1. Los modos de ejecución del empleo conforme a la invención son objeto de las Reivindicaciones dependientes.

La presente invención resuelve estos objetivos mediante el empleo de una nueva clase de fotorreceptores con una función hasta ahora desconocida, que representan sistemas de transporte iónico pasivos controlados directamente por la luz (un canal iónico controlado por la luz). Este fotorreceptor comprende una apoproteína, que proporciona una conductividad iónica, y un polieno fotosensible combinado covalentemente a la apoproteína, que interactúa con la apoproteína y funciona como puerta fotosensible. Sorprendentemente, conforme a la invención se ha logrado compaginar las ventajas de un sistema relativamente sencillo controlado directamente por la luz con las ventajas de un canal iónico pasivo.

La presente invención resuelve los objetivos en los que se basa mediante el empleo de un fotorreceptor biológico como canal iónico directamente controlado por la luz para modificar la conductividad iónica de una membrana con ayuda de la luz, teniendo el fotorreceptor una apoproteína y un polieno fotosensible combinado covalentemente a la apoproteína, que interactúa con la apoproteína y funciona como puerta fotosensible, y siendo la apoproteína una opsina que forma un canal iónico o un derivado o un fragmento de opsina que forma un canal iónico.

La apoproteína es una proteína de membrana con al menos 5 hélices transmembranarias, idónea para el enlace de un polieno fotosensible. Se prefieren las proteínas transmembranarias con 6 ó 7 hélices transmembranarias. Sin embargo, las proteínas transmembranarias con más de 7 hélices, por ejemplo, 8, 9 ó 10 hélices transmembranarias, están asimismo comprendidas por la invención. La invención abarca, por otra parte, proteínas transmembranarias que, adicionalmente a la proporción transmembranaria, contienen secuencias C- y/o N-terminales, pudiendo introducirse las secuencias C-terminales en el interior del lumen rodeado por la membrana, por ejemplo, el citoplasma de una célula o el interior de un liposoma, o pudiendo disponerse también en la superficie externa de la membrana. Esto mismo es válido para las secuencias N-terminales existentes si fuera necesario, que pueden disponerse asimismo tanto intraluminalmente como también sobre la superficie externa de la membrana. La longitud de las secuencias C- y/o N-terminales no está sujeta, en principio, a ninguna restricción; se prefieren, sin embargo, las apoproteínas con secuencias C-terminales, no embebidas en la membrana, con de 1 a 1000 aminoácidos, preferentemente de 1 a 500, de manera especialmente preferente de 5 a 50 aminoácidos. Independientemente de la longitud de las secuencias C-terminales, las secuencias N-terminales dispuestas, no embebidas en la membrana contienen preferentemente de 1 a 500 aminoácidos, de manera especialmente preferente de 5 a 50 aminoácidos.

El término hélice transmembranaria es conocido por el experto. Se trata generalmente de estructuras proteicas \alpha-helicoidales, que contienen generalmente de 20 a 25 aminoácidos. En función de la naturaleza de la membrana, que puede ser una membrana natural, por ejemplo, una membrana celular o plasmática, o también una membrana sintética, de segmentos transmembranarios pueden ser también más cortos o más largos. Por ejemplo, puede haber contenidos segmentos transmembranarios en membranas artificiales de hasta 30 aminoácidos, aunque, por otro lado, también sólo de menos aminoácidos, por ejemplo, de 12 a 16.

El canal iónico conforme a la invención puede servir, en principio, para el transporte pasivo de todos los iones fisiológicamente importantes. Los sistemas de transporte iónico más conocidos transportan Na^{+}, K^{+}, Ca^{2+}, H^{+} o Cl^{-}. En un modo de ejecución preferente, el canal iónico conforme a la invención es un canal de protones.

En un modo de ejecución especialmente preferente, el canal de protones comprende como proporción apoproteica una proteína opsina o un derivado o fragmento de una proteína opsina naturalmente existente. Como opsinas se designan aquí las apoproteínas enlazadas covalentemente con un cromóforo de retinoide y que tienen conductividad iónica, tan pronto absorben luz. Una molécula, que contiene un cromóforo de retinoide enlazado covalentemente con una opsina, se designa como rodopsina.

Un derivado de una molécula de opsina presente naturalmente y que funciona como canal iónico conectado por la luz está modificado frente al original mediante una sustitución de uno o varios aminoácidos, mediante una inserción y/o una supresión de uno o varios aminoácidos en una o varias posiciones. Tanto las moléculas de opsina presentes naturalmente como también su derivado deberían presentar una identidad de al menos el 15% con la secuencia de la bacteriorhodopsina en la zona de las 5 hélices transmembranarias, correspondientes a las hélices 3 a 7 en la bacteriorhodopsina. Se prefiere además na identidad del 20% o más entre el derivado de una channelopsin y la bacteriorhodopsina, relativo sólo al rango de la hélices 3 a 7 en la bacteriorhodopsina. La identidad en los rangos de los derivados de la opsina, no correspondientes a las hélices 3 a 7, puede ser, en cambio, mucho menor.

Con el término "identidad" se designa además el grado de afinidad entre dos o más secuencias proteicas, determinado por la la coincidencia entre estas secuencias. El porcentaje de identidad se origina a partir del porcentaje de aminoácidos idénticos en dos o más secuencias teniendo en cuenta los huecos y otras particularidades de la secuencia.

La identidad de las moléculas proteicas afines entre ellas puede determinarse con ayuda de procedimientos conocidos. Generalmente se emplean programas especiales de ordenador con algoritmos que tengan en cuenta los requisitos especiales. Los procedimientos preferentes para la determinación de la identidad generan primero la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Los programas de ordenador para la determinación de la identidad entre dos secuencias contienen, aunque no se limitan a ello, el paquete de programas GCG, incluyendo GAP (Devereux et al., 1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (WI)); BLASTP, BLASTN y CASIA (Altschul et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul et al., 1990). También el algoritmo conocido de Smith Waterman puede utilizarse para la determinación de la identidad.

Los parámetros preferentes para la comparación de las secuencias contienen lo siguiente:

: Algoritmo: Altschul et al., 1990 (Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. 215, 403-410) (=BLAST)

: Matriz de comparación: BLOSUM 62 (Henikoff and Henikoff, 1992, Amino acid substitution from protein blocks. PNAS 89, 10915-10919)

: Coincidencia (matches) = variable

: No-coincidencia (mismatch) = variable

: Valor de huecos: open 10

: Valor de longitud de los huecos (gap length penalty): 1

\vskip1.000000\baselineskip

El programa GAP resulta también apropiado para su empleo con los anteriores parámetros. Los anteriores parámetros son los parámetros estándar sind die Estándarparámetros (default parameters) para las comparaciones proteicas.

Pueden utilizarse otros algoritmos ejemplares, valores de abertura de los huecos (gap opening penalties), valores de extensión de los huecos (gap extension penalties), matrices de comparación incluidas las citadas en el manual de programa, paquete Wisconsin, Versión 9, Septiembre 1997. La selección depende de la comparación a ejecutar y, además, de si la comparación se efectúa entre pares de secuencias, prefiriéndose GAP o Best Fit, o entre una secuencia y una extensa base de datos de secuencias, prefiriéndose CASIA o BLAST.

Para la bomba activa de protones bacteriorhodopsina se sabe que Asp(D)96 es un aminoácido esencial para el funcionamiento de la bomba de protones. Además, los siguientes 16 aminoácidos de la bacteriorhodopsina intervienen en la red de protones:

: F^{42}, T^{46}, Y^{57}, R^{82}, D^{85}, T^{89}, L^{93}, T^{107}, W^{182}, Y^{185}, W^{189}, E^{194}, E^{204}, D^{212}, K^{216}, F^{219}

\vskip1.000000\baselineskip

En el canal iónico conforme a la invención hay un aminoácido diferente de "D" en la posición correspondiente al D^{96} de la secuencia de la bacteriorhodopsina. E^{204} está sustituido preferentemente por S. En un modo de ejecución, sin embargo, de los otros 15 aminoácidos al menos 8 se han mantenido idénticos o se han modificado únicamente mediante sustitución conservativa. Los aminoácidos, que deberían haberse mantenido lo más idénticos posible, son preferentemente T^{46}, Y^{57}, R^{82}, T^{89}, T^{107}, W^{182}, E^{194}, D^{212} y K^{216}. Los aminoácios sustituidos conservativamente son preferentemente F^{42}, D^{85}, L^{93}, Y^{185}, W^{189} y F^{219} el experto sabe además, que para una sustitución conservativa sustitución se selecciona un aminoácido, que sea funcionalmente similar al aminoácido a sustituir. Se efectúan además sustituciones normalmente dentro de los siguientes grupos:

100

Respecto a los aminoácidos indicados anteriormente, son sustituciones preferentes las siguientes: F42Y, D85E, Y185F, W189F y F219W.

En otro modo de ejecución preferente se obtienen una o varias más de las siguientes posiciones, respecto a la bacteriorhodopsina, en el canal iónico conforme a la invención: Y^{83}, W^{86}, P^{91}, G^{122}, P^{186} y G^{195}.

En otro modo de ejecución preferente, un canal pasivo de protones conforme a la invención contiene una apoproteína con la secuencia consensual L(I)DxxxKxxW(F,Y). Los aminoácidos indicados entre paréntesis pueden sustituir en cada caso al aminoácido precedente. Esta secuencia consensual es el motivo que rodea al aminoácido lisina enlazante del retinal. En la bacteriorhodopsina, la "K" en la posición 6 de la secuencia consensual corresponde a la K^{216} en la 7ª hélice de la bacteriorhodopsina.

En un modo de ejecución preferente, el canal iónico comprende una apoproteína de eucariotas menores. El grupo de las eucariotas menores abarca, por ejemplo, algas, protozoos, ciliatos y levaduras.

Se prefieren especialmente además las algas verdes mótiles, particularmente Clorophyceae. Las apoproteínas de las Volvocales resultan además especialmente interesantes. En el modo de ejecución más preferente, la apoproteína es una proteína opsina de Chlamydomonas reinhardtii. Otras algas verdes con modos de ejecución preferentes pueden encontrarse entre las Ulvophyceae como Acetabularia y Ulva. Otros modos de ejecución preferentes son las opsinas de Prasinophyceae, por ejemplo, Pyramimonas y Platymonas (Tetraseimis). Otras formas preferentes proceden del reino de las Dinophytas con la única clase de las Dinophyceas y los representantes ejemplares Gymnodinium splendens, Gyrodinium dorsum, Peridinium balticum y Gonyaulax.

En otro modo de ejecución preferente, la opsina que funciona como canal iónico controlado por la luz deriva de un protozoo, una bacteria o una archaebacteria.

En otro modo de ejecución preferente, la opsina que funciona como canal iónico controlado por la luz deriva de hongos como Neurospora crassa, Fusarium sporotrichioides y Leptosphaeria maculans, o Chytridiomycetes, como por ejemplo, Allomyces reticulatus, o de ciliatos como Fabrea salina o Paramecium bursaria o de foraminíferas como Amphistegina radiata.

Conforme a la invención, de la Chlamydomonas reinhardtii se extrajeron dos proteínas diferentes con secuencia funcional conocida y se identificaron por primera vez como sistemas pasivos de transporte iónico. Se trata además de la channelopsin 1 (= CHOP-1; también denominada chlamiopsina-3 = COP3) y la channelopsin 2 (= CHOP-2; también denominada chlamiopsina-4 =COP4).

La proteína CHOP-1 tiene un peso molecular de 76 kD y una longitud de 712 aminoácidos. Se identificó en base a las secuencias parciales de cADN solapantes en una base de datos EST de C. reinhardtii (Asamizu et al., DNA Research 7, 305-7 (2000)). Su secuencia de aminoácidos se representa en la Fig. 1 de la presente solicitud. La proteína nuclear (aminoácidos 76-309) comprende 7 segmentos transmembranarios hipotéticos con un 15-20% de homología respecto a las rodopsinas de archaea sensibles, los transportadores iónicos bacteriorhodopsina (BR) y halorhodopsina (HR), así como respecto a una rodopsina sólo recién identificada del hongo Neurospora crassa (NOP1). Estos grados de homología son, en realidad, cuantitativamente relativamente bajos, aunque, en comparación con la BR, se conservan especialmente aquellos aminoácidos que definan la posición de enlace del retinal y la red de transporte de H^{+} en la BR. El motivo consensual observado LDxxxKxxW sugiere que en la CHOP-1 K^{296} es el aminoácido enlazante del retinal. 9 de los 22 aminoácidos, en contacto directo con el retinal en la bacteriorhodopsina, se han mantenido idénticos en la CHOP-1 y otros 4 reflejan únicamente modificaciones conservativas ((Fig.1); Nail et al., en preparación).

Investigaciones detalladas de la función de transporte iónico controlado por la luz de la proteína CHOP-1 en oozitos de Xenopus laevis muestran, que los iones transportados son protones (Fig. 3), aparte de que el transporte iónico es de naturaleza puramente pasiva (Fig. 4a-c). La fotocorriente inducida y, por tanto, el transporte iónico depende de la longitud de onda de la luz estimulante y alcanza un máximo a 500 nm (Fig. 4d).

Los ensayos análogos con dos fragmentos más cortos de proteína CHOP-1, que comprenden los aminoácidos 1-346 y/o 1-517, proporcionan resultados esencialmente iguales que aquellos de la proteína CHOP-1 en toda su longitud. Esto demuestra que una mayor parte del rango carboxiterminal de la proteína CHOP-1 no es necesaria para la función de transporte iónico.

La proteína CHOP-1 de la C. reinhardtii representa el primer representante identificado de una nueva proteína de transporte iónico pasiva dirigida directamente por la luz. Proteínas de rodopsina estructuralmente y/o funcionalmente similares aparecen también en otras microalgas, así como en gametos y zoosporas de macroalgas y, posiblemente también, en otros organismos.

La segunda proteína identificada como apoproteína de un canal iónico conectado por la luz es la channelopsin 2 (CHOP-2), cuya secuencia comprendiendo 737 aminoácidos se muestra asimismo en la Figura 1. Tiene una homología de 52.7% respecto a la CHOP-1. Los aminoácidos importantes para el transporte identificados a través de la homología entre BR y CHOP-1, así como cálculos de modelos, se conservan también en la CHOP-2. También para esta rodopsina se ha demostrado por primera vez una conductividad de protones pasiva fotoconectada mediante la expresión en oocitos de Xenopus. El canal iónico formado con CHOP-2 como apoproteína se distingue del formado con CHOP-1 en lo que respecta a su conectividad unitaria, su inactivación en la luz fija y la forma de la curva de corriente-tensión. La channelrhodopsin-2 (ChR2), constituida por proteína channelopsin-2 (CHOP-2) y retinal, es un canal de cationes controlado por la luz, permeable, por ejemplo, al Li^{+}, Na^{+}, K^{+}, Ba^{2+}, Sr^{+} y Ca^{2+}, aunque no al Mg^{2+}. El máximo del la luz estimulante se encuentra a 440-480 nm.

De manera similar que en la proteína CHOP-1, aquí podía demostrarse también que una forma abreviada de CHOP-2, que comprende los aminoácidos 1-315, forma asimismo un canal iónico funcional fotoconectado (Fig. 5-7).

CHOP-2 y/o CHOP-2-315 pueden emplearse para la despolarización de las células (ver Fig. 7) o para la incorporación de Ca^{2+} (Fig. 6) o para ambas cosas.

La segunda proteína identificada como apoproteína de un canal iónico conectado por la luz es la channelopsin 2 (CHOP-2), cuya secuencia comprendiendo 737 aminoácidos se muestra asimismo en la Figura 1. Tiene una homología de 52.7 % respecto a la CHOP-1. Los aminoácidos importantes para el transporte identificados a través de la homología entre BR y CHOP-1, así como cálculos de modelos, se conservan también en la CHOP-2. También para esta rodopsina se ha demostrado por primera vez una conductividad de protones pasiva fotoconectada mediante la expresión en oocitos de Xenopus. El canal iónico formado con CHOP-2 como apoproteína se distingue del formado con CHOP-1 en lo que respecta a su conectividad unitaria, su inactivación en la luz fija y la forma de la curva de corriente-tensión. La channelrhodopsin-2 (ChR2), constituida por proteína channelopsin-2 (CHOP-2) y retinal, es un canal de cationes controlado por la luz, permeable, por ejemplo, al Li^{+}, Na^{+}, K^{+}, Ba^{2+}, Sr^{+} y Ca^{2+}, aunque no al Mg^{2+}. El máximo del la luz estimulante se encuentra a 440-480 nm.

Conlleva escala de tensiones conforme a la ecuación de Nerst, es decir, unos 58 mV en el caso de iones monovalentes, unos 29 mV en el caso de iones divalentes.

Investigando las curvas de corriente-tensión puede determinarse, por tanto, para cada canal iónico controlado por la luz, si es un sistema pasivo o activo.

La presente invención se relaciona, por tanto, también con derivados y fragmentos de las proteínas CHOP, que conservan total o parcialmente las propiedades de transporte iónico de la proteína inicial o las exhiben incluso en mayor medida, así como opsinas estructuralmente y funcionalmente similares de otros organismos, de origen natural o modificadas empleando técnicas recombinantes, cuando tengan las propiedades biofísicas citadas y puedan emplearse como CHOP-1 y CHOP-2 para los propósitos citados.

Las extensas series de ensayos para la elaboración e investigación de estos derivados conllevan el sorprendente resultado de que la posición de aminoácido 134 en la proteína CHOP-2 es especialmente importante para la función como canal iónico conectado por la luz. Así puede producirse un mutante especialmente activo de la proteína CHOP-2 completa y/o de la proteína abreviada CHOP-2-315, por ejemplo, sustituyendo la histidina de la posición 134 por arginina. Esta sustitución puede efectuarse por procedimientos estándar, por ejemplo, mediante mutagénesis de oligonucleótidos dirigida a la posición. Otros datos sugieren que Glu123 interviene en una desprotonación fotoinducida, que conlleva una desensibilización del canal iónico. La mutación de Glu123 a Asp (E123D) eleva así claramente la razón de la fotocorriente trasiente respecto a la fotocorriente de equilibrio, mientras que la mutación de Glu123 a Gln (E123Q) puede casi eclipsar el pico de la fotocorriente trasiente, aunque conduce también a una fuerte reducción de la fotocorriente estacionaria.

El sistema pasivo de transporte iónico conforme a la invención contiene un polieno fotosensible. Puede tratarse, por ejemplo, de un ácido p-hidroxicinámico, retinal o un derivado de retinal. Los derivados preferentes de retinal se seleccionan del siguiente grupo: 3,4-dehidroretinal, 13-etilretinal, 9-dm-retinal, 3-hidroxiretinal, 4-hidroxiretinal, naftilretinal; 3,7,11-trimetil-dodeca-2,4,6,8,10-pentaenal; 3,7-dimetil-deca-2,4,6,8-tetraenal; 3,7-dimetil-octa-2,4,6-trienal; así como 6-7-, ó 10-11- retinales rotacionalmente bloqueados con 4-, 5-, 6- ó 7- puentes de anillos. Sin embargo, se prefiere especialmente un retinal con 10-12 puentes de cinco anillos (Takahashi et al. FEBS Lett. 314, 275-279).

Tras la fotoabsorción e isomerización de los polienos tiene lugar en los canales iónicos controlados por la luz conformes a la invención una modificación estructural en la proteína (opsina) y, por tanto, la apertura del canal conuctor de iones, que une la cara intracelular de la membrana con la extracelular. Este hecho se distingue, en principio, de la situación en las bombas iónicas conocidas, en las que el semicanal (EC) extracelular conductor de protones con el semicanal intracelular (IC) no está unido de manera conductora. En la bacteriorhodopsina, la base de Schiff del retinal se une, en el intermediario M anterior del ciclo de reacción (fotociclo), de manera conductora con la cara extracelular, estando en cambio unida con la cara intracelular en el estado M posterior.

Los canales iónicos controlados por la luz que son conformes a la presente invención pueden incorporarse en una membrana, por ejemplo, en la membrana plasmática de una célula, y utilizarse para modificar rápida y definidamente el potencial de membrana mediante exposición, lo que resulta muy útil para aclarar los mecanismos de los canales iónicos y transportadores iónicos dependientes de la tensión. Además, de este modo se origina la posibilidad de modificar rápida y definidamente los niveles intracelulares de estos iones con un transporte iónico selectivo controlado por la luz.

En el caso de la proteína CHOP-1, esto significa una modificación selectiva no-invasiva del valor del pH intracelular, lo que resulta útil para aclarar los mecanismos de regulación intracelular del pH y/o de la influencia de las modificaciones trasientes del pH sobre las proteínas propias de la célula.

Midiendo el potencial de inversión de la conductividad de protones fotoinducida mediada por CHOP-1 puede medirse rápida y precisamente el valor intracelular del pH directamente por debajo de la membrana, y/o un gradiente de pH a través de la membrana conociendo el pH extracelular. Para ello se determina el potencial de inversión con la medición "Voltage Clamp" aplicada en la Fig. 2-4 y se calibran, por tanto, las células. A continuación puede realizarse la modulación del potencial de membrana y/o del valor intracelular del pH con luz a través del canal iónico controlado por la luz conforme a la invención, no-invasivamente. Las mediciones apropiadas se realizan rápida y definidamente y resultan así apropiadas idealmente para aparatos de HTS (High-Throughput-Screening) modernos, con los que pueden analizarse, por ejemplo, las proteínas de membrana dependientes de la tensión, reguladas por el pH, como canales iónicos en aplicaciones de screening con alto rendimiento. Los saltos de tensión o de pH pueden fotoinducirse en las líneas celulares, que contengan ChR1 o rodopsina afín.

Una aplicación especialmente interesante es el acoplamiento optoeléctrico por modulación dirigida por la luz del potencial de membrana. Esta aplicación se basa en una combinación del canal iónico pasivo controlado por la luz con un sistema de transporte iónico activo controlado por la luz, por ejemplo, una bomba de iones, empleándose para el fotocontrol del canal iónico pasivo preferentemente un longitud de onda diferente que para el fotocontrol de los sistemas activos de transporte iónico. En un modo de ejecución preferente se emplea luz de una longitud de onda de 650 nm para la activación de la bomba de protones bacteriorhodopsina y para la generación de un potencial de membrana y, a continuación, luz de una longitud de onda de 440 nm, que actúa inhibiendo la bacteriorhodopsina, para la activación del sistema de transporte de protones de CHOP-1 y para la rápida disipación del potencial.

Los canales iónicos fotoregulados pueden emplearse también en la transmisión de señales de las redes neuronales a las redes de microelectrodos. En este contexto se intentan transmitir los impulsos eléctricos de las neuronas a microordenadores ("Interconexión de Células Nerviosas y Semiconductores": Fromherz (2001), pliegos de datos físicos 57, 43-48). Las neuronas se han estimulado hasta ahora o bien a través de neurotransmisores o directamente con micropipetas. Las neuronas, que exprimen ChR1, ChR2 o canales iónicos afines controlados por la luz, podrían controlarse por medio de luz.

Otra aplicación es la terapia de animales ciegos o, finalmente, de personas. Existen algunas enfermedades, en las que las células visuales naturales dejan de funcionar, pero todas las conexiones nerviosas pueden seguir operando. Hoy en día se intenta, en diferentes centros de investigación, implantar películas delgadas con fotocélulas cerámicas artificiales sobre la retina (E. Zrenner (2002) Science 295, 1022-1025.) Estas fotocélulas deberían servir para despolarizar las células secundarias aún intactas de la retina y, por tanto, activar un impulso nervioso (ojos biónicos). La expresión selectiva de las rodopsinas dirigidas por la luz como ChR1 o ChR2 en estas células gangliales, células amacrinas o células bipolares representaría una solución mucho más elegante y posibilitaría una mayor resolución visual espacial.

La incorporación de los sistemas de transporte iónico de rodopsina conformes a la invención a la membrana de las células, que no exprimen la proteína opsina apropiada en la naturaleza, puede realizarse simplemente, por ejemplo, incorporando en primer lugar el ADN codificante para esta opsina, empleando procedimientos conocidos de la tecnología recombinante del ADN, en un vector de expresión apropiado, por ejemplo, un plásmido, un cósmico o un virus, para que, a continuación, se transformen las células objetivo y se extraiga la proteína en este huésped. Finalmente se tratan las células de manera apropiada, por ejemplo, con retinal, para hacer posible la conexión de una base de Schiff entre la proteína y el retinal.

En un modo de ejecución preferente, lo mencionado se lleva a cabo con éxito en diferentes levaduras como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, como para rodopsinas ya activas como la bacteriorhodopsina y/o rinderrhodopsina (Hildebbordet V. et al. (1989)), Genetic transfer of the pigment bacteriorhodopsin into the eukaryote Schizosaccharomyces pombe, FEBS Lett. 243(2):137-40; Najmoutin G. et al., Heterologous expression of bovine opsins in Pichia pastoris, Meth. Enzimaol. (2000) 315, 3-11).

La expresión puede realizarse también en determinados sistemas de células mamarias. Esto tienen lugar o bien con vectores episomales como expresión trasiente, preferentemente en células COS (generadas por infección de células de "African green monkey kidney CV1") (Oprian et al. (1987) Porc Natl. Acad. Sci USA 84, 8874 ff.) o células HEK ("human embyonic kidney cells", por ejemplo, células HEK293, Reeves et al. (1996) Porc. Natl. Acad. Sci USA 84, 11487 ff.) o células BHK ("baby hamster kidney cells"), o en forma de una expresión estable (mediante integración en el genoma) en células CHO ("chinese hamster ovary cells"), células de mieloma o células MDCK ("Madine-Darby canine kidney cells") (panorámica en: Makrides SC (1999) Prot. Expr. Purif. 17, 183-202) o en células Sf9 de insectos infectadas por baculovirus (Jansen et al. (1988) Mol Biol. Rep. 13, 65 ff.).

Para garantizar u optimizar la expresión puede modificarse también el ADN codificante de manera apropiada, por ejemplo, enlazando con las secuencias regulatorias apropiadas y/o mediante adaptación de la secuencia de ADN codificante al empleo de codones preferente del sistema de expresión seleccionado.

Descripción de las Figuras

Fig. 1

\quad: Fig. 1A: secuencia de aminoácidos de la channelopsin 1 (Chop1) SEQ ID NO: AF385748

\quad: Fig. 1B: secuencia de aminoácidos de la channelopsin 2 (Chop2) SEQ ID NO: AF461397

\quad: Fig. 1C: secuencia de aminoácidos de la bacterioopsina (Bop) de la Halobacterium salinarium (BR). En minúsculas se indica la secuencia líder, que se separa en vivo y no se tiene en cuenta, por motivos históricos, en la enumeración de los aminoácidos. En negrita se indican los aminoácidos esenciales para la transferencia de protones.

\quad: Fig. 1D: comparación de la secuencia de aminoácidos de la CHOP-1 (SEQ ID NO: AF461397) y la CHOP-2 (SEQ ID NO: AF461397) de la Chlamydomonas reinhardtii con la de la bacteriorhodopsina de la Halobacteria salinarum. Los aminoácidos, de los que para la BR (Lücke et al. (1999) Science 286, 255-260 y literatura allí citada) se sabe que interactúan directamente con el retinal, se indican con estrellas. Las posiciones de aminoácidos, que sean iguales en al menos dos secuencias, se resaltan en gris oscuro. Los aminoácidos, que contribuyen a la red conductora de H^{+} en la BR y los aminoácidos apropiados a estos en las otras opsinas se indican en letra eb blanco sobre fondo negro. Para esta His 173 de la CHOP-1 se ha demostrado, en el contexto de la invención, que interviene en la conducción de protones. # indica la posición de la lisina enlazante del retinal. Los aminoácidos subrayados indican las 7 hélices transmembranarias de la proteína nuclear.

\quad: Fig. 1E: secuencia de aminoácidos del mutante de la proteína nuclear de CHOP-2 CHOP2-315/- H134R), en la que la histidina de la posición 134 se sustituye por arginina.

Fig. 2 fotocorrientes, registradas durante la exposición de oocitos a la luz verde o roja (500 25 nm y/o 700 25 nm, 1022 fotones, m^{-2} s^{-1}). Potencial de parada (V_{h}) = -100 mV, pulso luminoso indicado por la barra. Disolución del baño = 96 mM de NaCl, 5 mM de KCI, 2 mM de CaCl_{2}, 1 mM de MgCl_{2}, 5 mM de MOPS, pH 7,5. A) Un oocito, al que no se le haya inyectado ningún ARN de CHOP-1, irradiado con luz verde B) un oocito de CHOP-1, irradiado con luz verde; C) el mismo oocito de B), irradiado con luz roja.

Fig. 3 dependencia de la corriente interior fotoinducida de las condiciones iónicas y de la tensión.

a:: resultados con uno (de cinco) oocitos característicos de CHOP-1, en la secuencia de la medición (intervalo de aprox. 150 s), representados, V_{h} = -100 mV, luz verde como en la Fig. 2. Las disoluciones se tamponan con 5 mM de MOPS (pH 7,5) o MES (pH 6) o citrato (pH 5 y 4). Concentración en mM:

1. 100 NaCl, 2 CaCl_{2}, pH 7,5: 2: 100 NaCl, 2 CaCl_{2}, pH 6,0 (ref.)

3: 100 aspartato de Na, 2 CaCl_{2}, pH 6,0: 4: 100 NMG-CI, 2 CaCl_{2}, pH 6,0

5: como 2: 6: 100 NaCl, 2 EGTA, 2 MgCl_{2}, pH 6,0

7: 200 Sorbita, 5 EGTA, pH 5,0: 8: 200 Sorbita, 5 EGTA, pH 4,0

b:: razones corriente-tensión de las fotocorrientes de la Fig. 3a, concentraciones ver arriba.

Fig. 4 fotocorrientes, apuntadas con variación del valor externo y externo del pH, y su dependencia de la longitud de onda

a:: fotocorriente a V_{h} = +40 mV. resultados de uno (de cinco) oocitos característicos CHOP-1- en einer disolución de baño de NaCl (100 mM, traza A: luz roja; traza B: luz verde; 1022 fotones, m^{-2} s^{-1}) o butirato sódico (40 mM, +60 mM de NaCl, traza C: luz verde) de pH 7,4

b:: razones corriente-tensión de las fotocorrientes en diferentes disoluciones de baño, que contuvieron siempre 100 \muM de ácido butírico no disociado:

\quad: \blacksquare 60 mM de NaCl + 40 mM de butirato de Na, pH 7,4; \ding{115}, 84 mM de NaCl + 16 mM de butirato de Na, pH 7,0; \ding{116}, 93,6 mM de NaCl + 6,4 mM de butirato de Na, pH 6,6; \blacklozenge, 97,4 mM de NaCl + 2,6 mM de butirato de Na, pH 6,2;

c:: dependencia del pH de los potenciales de inversión de b. Las líneas de puntos muestran la relación teórica para un pH_{i} constante de 6,6 y/o 6,8 y -58 mV/pH. La línea discontinua muestra la relación esperada para un aumento de -48 mV/diferencia de pH y pH_{i} = 6,8 a pH_{o} = 7,4. El aumento de -48 mV/pH corresponde a un pH_{i} lentamente decreciente (unas 0,17 unidades por disminución del pH_{o} de una unidad). \blacksquare, dependencia del pH de los potenciales de inversión de los ensayos con 5,4 mM de ácido acético no disociado (n =3). La línea de puntos muestra la relación teórica para un pH_{i} constante de 5,5 y -58 mV/pH.

d:: dependencia de la longitud de onda de la corriente entrante fotoinducida a pH_{o} 5,5 y - 40 mV. Las fotocorrientes se estandarizaron para una misma corriente de fotones.

Fig. 5 fotocorrientes, registradas durante la exposición (longitud de onda 450 25 nm) de oocitos extraídos de CHOP2-315 en disolución de Ringer (110 mM de NaCl, 5 mM de KCI, 2 mM de CaCl_{2}, 1mM de MgCl_{2}, 5 mM de MOPS, pH 7,6) a +40 mV y -80 mV.

Fig. 6 tamaño de la corriente entrante de equilibrio fotoinducida a -100 mV, pH 9, para 115 mM de Li, Na, Cs, TMA, TEA o NMG y para 80 mM de Mg^{2+}, Ca^{2+}, Sr^{2+} o Ba^{2+} (para ambas variantes CHOP2 y CHOP2-315, idénticamente).

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Fig. 7 Despolarización de una membrana plasmática de oocito, que exprime CHOP2-315, mediante un destello de 200 ms.

Los siguientes ejemplos explican la presente invención, aunque sin limitarla.

Ejemplo I Amplificación del ADN de la CHOP-1 y Expresión de los Fotorreceptores Funcionales de CHOP-1 en Xenopus laevis

Un ADN de CHOP-1 de longitud completa, que codifica para los aminoácidos 1-712, y dos ADNs de CHOP-1 más cortos, que codifican para los aminoácidos 1-346 y/o 1-517 de CHOP-1, se amplificaron de una matriz de ADNc de longitud completa por medio de la PCR con empleo de una polimerasa con función correctora (pfu, promega) y dos oligonucleótidos iniciales (primers), que contenían puntos restrictivos de BamHI y HindIII. Los productos se insertaron en el vector pGEMHE (Liman et al., Neuron 9, 861-71 (1992)) y se clonaron en E. coli. Tras la verificación de las secuencias se transcribieron in vitro los ADNs de CHOP-1 (Ambion) y se inyectaron de 20 a 30 ng de ARNc en oocitos de Xenopus laevis, tal y como se ha descrito ya para la bacteriorhodopsina (Nagel et al., FEBS Letters, 377, 263-266 (1995). Los oocitos, que exprimieron la proteína CHOP-1, se incubaron con un all-trans-retinal (1 \muM) en disolución de Ringer durante de dos a cinco días.

Ejemplo II Caracterización del Fotorreceptor de CHOP-1

Para la investigación de la función de transporte iónico adoptada se sometieron los oocitos exprimidores de CHOP-1 a diferentes experimentos con empleo de una técnica de bornes de tensión de dos electrodos, empleada ya para la bacteriorhodopsina (Nagel et al. FEBS Letters, 377, 263-266 (1995); Nagel et al., Biophysical Journal 74, 403-412 (1998)). La luz verde, aunque no la luz roja, indujo corrientes orientadas hacia dentro en los oocitos, que exprimieron uno de los ARNs de CHOP-1 (Fig. 2). La aparición de fotocorrientes también en los ARNs de CHOP-1 más cortos demostró que una mayor parte del rango carboxiterminal de la CHOP-1 no es necesaria para esta función. A pH 6 y una tensión transmembranaria entre -100 y + 40 mV, las fotocorrientes se orientaron siempre hacia dentro (Fig. 3b). La sustitución de cloruro por aspartato en la disolución no tuvo ningún efecto verificable sobre la amplitud de la fotocorriente (Fig. 3a) o su razón corriente-tensión (Fig. 3b), un resultado, que descarta al Cl^{-} como ión transportado. La sustitución del sodio por N-metil-D-glucamina (o de NaCl por sorbita, datos no mostrados) conlleva una corriente orientada de manera similar hacia dentro (Fig. 3a) sin modificación de la razón corriente-tensión (Fig. 3b), lo que indica, que la CHOP-1 no transporta al Na^{+}. Igualmente, la sustitución de Ca^{2+} por Mg^{2+} no produjo ninguna modificación de las fotocorrientes, un resultado, que demuestra que el Ca^{2+} no era asimismo el ión transportado (Fig. 3a,b).

En cambio, un aumento de la concentración de protones en la disolución de baño, [H^{+}]_{o}, a valores de pH de 5 y/o 4, a potenciales entre -100 y +40 mV, conlleva claros aumentos de las fotocorrientes orientadas hacia dentro (Fig. 3a,b).

Los resultados obtenidos hasta ahora remiten, por tanto, a iones H^{+} como soportes de carga de las corrientes fotoinducidas. Debido a la homología de secuencia citada inicialmente entre la proteína CHOP-1 y la bomba de protones bacteriorhodopsina, se insinúa primero la suposición de que también la proteína CHOP-1 sería componente de un sistema activo de transporte iónico, o sea, de una bomba de protones como la bacteriorhodopsina.

Mientras que la bacteriorhodopsina transporta, sin embargo, para todos los potenciales de membrana analizados de - 60 mV a + 40 mV (ver por ejemplo, Nagel et al., Biophysical Joumal 74, 403-412 (1998)), protones siempre hacia fuera, también contra un gradiente de pH, la dirección de transporte de sistema CHOP-1 depende del gradiente de pH existente a través de la membrana y del potencial de membrana (Fig. 4a,b,c). Los potenciales de inversión medidos a diferentes gradientes finales de pH (Fig. 4b,c) ponen de manifiesto que las corrientes fotoinducidas son de naturaleza puramente pasiva. A partir de las altas fotocorrientes observadas puede concluirse, que el transporte de protones no sólo se efectúa mediante una difusión simplificada de los protones a través de la membrana, sino que la proteína CHOP es un canal de protones.

La dependencia de la fotocorriente fotoinducida orientada hacia dentro a pH 5,5 y -40 mV de la longitud de onda de la luz se representa en la Fig. 4d. El máximo cerca de 500 nm corresponde a los espectros de acción para corrientes de fotorreceptor, para reacciones de fototaxia y fotoshoc de células intactas de C. reinhardtii.

Ejemplo III Amplificación de ADNs de CHOP-2 y Expresión de Fotorreceptores Funcionales de CHOP-2 en Xenopus laevis

Un ADN de CHOP-2 de longitud completa, que codifica para los aminoácidos 1-737, y un ADN abreviado C-terminal de CHOP-2, que codifica para los aminoácidos 1-315 de CHOP-2, se amplificaron de una matriz de ADNc de longitud completa por medio de la PCR con empleo de una polimerasa con función correctora (pfu, promega) y primers, que contenían puntos restrictivos de BamHI y HindIII. Los productos se insertaron en el vector pGEMHE (Liman et al., Neuron 9, 861-71 (1992)) y se clonaron en E. coli. Tras la verificación de las secuencias se transcribieron in vitro los ADNs de CHOP-2 (Ambion) y se inyectaron de 20 a 30 ng de ARNc en oocitos de Xenopus laevis, tal y como se ha descrito ya para la bacteriorhodopsina (Nagel et al., FEBS Letters, 377, 263-266 (1995). Los oocitos, que exprimieron la proteína CHOP-2, se incubaron con un all-trans-retinal (1 \muM) en disolución de Ringer durante de dos a cinco días.

Ejemplo IV Caracterización de los Fotorreceptores de CHOP-2

Para la investigación de la función de transporte iónico se sometieron los oocitos exprimidores de CHOP-2, incubados para la formación del canal iónico de ChR2 (channelrhodopsin2) en disolución de Ringer con retinal, a diferentes experimentos (Fig. 5-7) con empleo de una técnica de bornes de tensión de dos electrodos, como la empleada ya para CHOP-1 y/o ChR1.

La Fig. 5 muestra que la fotocorriente fotoinducida disminuye, al irradiar con luz permanente (longitud de onda 450 25 nm; corresponde aprox. al máximo del espectro de acción) a un nivel de equilibrio. Esto significa que el de canal iónico ChR2 se desensibiliza con la luz permanente de esta longitud de onda, posiblemente mediante una inactivación de una parte de las moléculas de ChR2.

La Fig. 6 demuestra que el canal iónico formado con CHOP-2 representa, en comparación con el canal iónico formado con CHOP-1, un canal no-selectivo de cationes, que, además de los protones, deja pasar también diferentes cationes mono- y bivalentes.

La conductividad para los cationes monovalentes analizados disminuye además en la secuencia Li^{+} > Na^{+} > K^{+} > Cs^{+} » TMA^{+} (tetrametilamonio) = TEA^{+} (tetraetilamonio), es decir, con radio iónico creciente. En el caso de los cationes bivalentes, la conductividad disminuye asimismo con radio iónico creciente. Aquí representa Mg^{2+}, sin embargo, la excepción. ChR2 no es permeable al Mg^{2+}, probablemente debido a la alta energía de hidratación de este ión (Diebler et al., Pure Appl. Chem. 20, S. 93, 1969). Las respectivas fotocorrientes para el canal iónico de longitud completa formado con CHOP-2 no se distinguen además de las fotocorrientes apropiadas para el canal iónico, que incluye el fragmento de CHOP-2 con los aminoácidos aminoterminales 1-315, lo que permite sacar la conclusión de que la conductividad catiónica se determina con la proporción aminoterminal de la proteína ChOP-2, que contiene los siete dominios transmembranarios supuestos.

<110> Peter, Hegemann y la Sociedad Max Planck para el Avance de la Ciencia e.V.

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<120> Empleo de fotorreceptores biológicos como canales iónicos controlados directamente por la luz

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<130> PCT1797-01938/GRI

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<140>

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<141>

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<150> DE 102 16 005.8-41

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<151> 2002-04-11

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<160> 6

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<170> Patente versión 3.1

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<210> 1

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<211> 712

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<212> PRT

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<213> Chlamydomonas reinhardtii

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<220>

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<223> Secuencia de aminoácidos de CHOP-1 (AF385748) de la Chlamydomonas reinhardtii

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<400> 1

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1

2

3

4

5

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<210> 2

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<211> 737

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<212> PRT

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<213> Chlamydomonas reinhardtii

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<220>

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<223> Secuencia de aminoácidos de CHOP-2 (AF461397) de la Chlamydomonas reinhardtii

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<400> 2

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6

7

8

9

10

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<210> 3

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<211> 259

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<212> PRT

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<213> Halobacterium salinarum

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<220>

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<223> Secuencia de aminoácidos de bacteriorhodopsina de la Halobacterium salinarum

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<400> 3

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11

12

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<210> 4

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<211> 737

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<212> PRT

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<213> Halobacterium salinarum

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<220>

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<400> 4

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13

15

16

17

18

19

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<210> 5

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<211> 315

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<212> PRT

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<213> Halobacterium salinarum

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<220>

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<223> Secuencia de aminoácidos de CHOP-2-315 de la Chlamydomonas reinhardtii

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<400> 5

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20

21

22

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<210> 6

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<211> 315

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<212> PRT

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<213> Halobacterium salinarum

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<220>

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<223> H134R-mutante de la secuencia de aminoácidos de CHOP-2-315 de la Chlamydomonas reinhardtii

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<400> 6

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23

24

25

Claims

1. Empleo de un fotorreceptor biológico como canal iónico directamente controlado por la luz para modificar la conductividad iónica de una membrana con ayuda de luz,

-: presentando el fotorreceptor una apoproteína y un polieno fotosensible combinado covalentemente a la apoproteína, que interactúa con la apoproteína y funciona como puerta fotosensible, y

-: siendo la apoproteína una opsina que forma un canal iónico o un derivado o un fragmento de opsina que forma un canal iónico.

2. Empleo acorde a la Reivindicación 1, siendo la apoproteína una proteína transmembranaria con cinco hélices transmembranarias o más.

3. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, siendo la apoproteína una channelopsin 1 (CHOP-1) o una channelopsin 2 (CHOP-2) o un derivado o un fragmento de una channelopsin 1 (CHOP-1) o de una channelopsin 2 (CHOP-2).

4. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, siendo el sistema de transporte iónico un sistema de transporte de protones.

5. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, siendo el derivado de opsina o fragmento de opsina el resultado de una sustitución, una inserción y/o supresión de un aminoácido o de varios aminoácidos en la secuencia natural de aminoácidos de la proteína opsina.

6. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, siendo el aminoácido correspondiente a la bacteriorhodopsina-Asp96 un aminoácido diferente de Asp y manteniéndose en la apoproteína al menos ocho de los otros sesenta aminoácidos, involucrados en la red de transporte de protones en la bacteriorhodopsina, idénticos o modificándose mediante sustitución conservativa.

7. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, habiéndose mantenido al menos los aminoácidos, que corresponden en la bacteriorhodopsina a los aminoácidos T46, Y57, R82, T89, T107, W182, D212, K216, idénticamente en la posición apropiada.

8. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, conteniendo la apoproteína la secuencia consensual L(I)DxxxKxxW(F,Y).

9. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, derivando la apoproteína de plantas inferiores.

10. Empleo acorde a la Reivindicación 9, siendo las plantas inferiores algas.

11. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, siendo la apoproteína una proteína opsina de la Chlamydomonas reinhardtii.

12. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, comprendiendo la apoproteína al menos los aminoácidos 61 a 310 de la channelopsin 1 (CHOP-1) conforme a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A.

13. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones 1 a 11, comprendiendo la apoproteína al menos los aminoácidos 24 a 268 de la channelopsin 2 (CHOP-2) conforme a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1B.

14. Empleo acorde a la Reivindicación 13, sustituyéndose el aminoácido histidina en la posición 134 de la channelopsin 2 (CHOP-2) por otro aminoácido.

15. Empleo acorde a la Reivindicación 14, sustituyéndose el aminoácido histidina en la posición 134 de la channelopsin 2 (CHOP-2) por arginina.

16. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones 1 a 9, derivando la proteína opsina de los protozoos.

17. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones 1 a 9, derivando la proteína opsina de bacterias o archaea.

18. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones 1 a 9, derivando la proteína opsina de hongos.

19. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, siendo el polieno fotosensible un retinal o un derivado de retinal.

20. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, seleccionándose el derivado de retinal del siguiente grupo: 3,4-dehidroretinal, 13-etilretinal, 9-dm-retinal, 3-hidroxiretinal, 4-hidroxiretinal, naftilretinal; 3,7,11-trimetil-dodeca-2,4,6,8,10-pentaenal; 3,7-dimetil-deca-2,4,6,8-tetraenal; 3,7-dimetil-octa-2,4,6-trienal; así como 6-7- u 8-9- o 10-11-retinales bloqueados contra la rotación.

21. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, para la modificación dirigida por la luz de la conductividad de protones de la membrana.

22. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, para la modificación dirigida por la luz del potencial de membrana de una célula.

23. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones 20 a 22, siendo la membrana celular de una levadura, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris.

24. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones 20 a 22, siendo la membrana celular de una célula de mamífero o célula de insecto, por ejemplo, COS, BHK, HEK293, CHO, célula de mieloma, MDCK, célula sf9 infectada por baculovirus.

25. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, para el aumento o disminución controlados por la luz de la concentración intracelular de iones.

26. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, para el aumento o disminución controlados por la luz de la concentración intracelular de protones.

27. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, para la medición de la concentración intracelular de protones directamente en la membrana plasmática o de un gradiente de concentraciones de protones a través de la membrana plasmática con ayuda de las curvas de corriente-tensión, pudiendo determinarse el gradiente de concentraciones de protones directamente a partir de la diferencia de las curvas de corriente-tensión con y sin exposición del potencial de inversión.

28. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, para el screening de alto rendimiento de moléculas biológicas.

29. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, para el screening de alto rendimiento de proteínas de la membrana reguladas por el pH.

30. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, para el screening de alto rendimiento de proteínas de la membrana dependientes de la tensión.

31. Empleo conforme a una de las anteriores Reivindicaciones, empleándose el canal iónico controlado por la luz en combinación con un sistema de transporte iónico activo controlado por la luz.