ES2313605T3 - Procedimiento para la diagnosis de tumores. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para diagnosticar tumores de los órganos reproductores caracterizado por la determinación del contenido en afamina en una muestra de un fluido corporal o en una muestra de tejido, en el que un tumor se diagnostica si el contenido en afamina en la muestra está disminuida comparado con el contenido en afamina en una muestra de una persona sin un tumor de los órganos reproductores.

Description

Procedimiento para la diagnosis de tumores.

La presente invención se refiere a un procedimiento para diagnosticar tumores de los órganos reproductores.

Los tumores en los órganos reproductores, en particular tumores de ovarios y testiculares, específicamente afectan a las personas jóvenes (también un gran grupo de personas entre 30 y 50). En la mayoría de estos tumores la diagnosis temprana es capital para la supervivencia. El sistema reproductor las gónadas - testículos masculinos y ovarios femeninos y otros conductos y glándulas accesorios (gonos = semilla). Éstos proporcionan los medios para la reproducción, la continuación de las especies, y paso de material genético a las siguientes generaciones.

Los tumores de ovarios son blastomas del ovario. Cada tercio del tumor de ovario es o se desarrolla en un carcinoma. El cáncer de ovario es la 5ª causa más común en mujeres y es responsable del 5% de todos los cánceres y 6% de todas las muertes por cáncer en mujeres. 1 de cada 55 desarrollará cáncer de ovario alguna vez en su vida. Es un problema principal en la medicina rutinaria, debido a que los síntomas de cáncer de ovario son similares a los quistes o tumores no cancerosos. Los tumores de ovarios se diagnostican de manera usual mediante examen con las dos manos, examen ultrasónico, tomografía por ordenador, laparoscopia y laboratorio exploratorio.

El marcador mejor conocido y bien descrito de cáncer de ovario es el antígeno A125 (Whitehouse et al. Gynecol Oncol 88, S152, 2003). Ya que el antígeno CA125 no solamente ese expresa en las células tumorales de ovario sino también mediante un número de diferentes tipos de células, no tienen suficiente especificidad y sensibilidad para detectar cáncer de ovario temprano cuando se usa solo. Las mejoras en la diagnosis temprana y reducción de los resultados falso positivos se pueden lograr si el nivel en suero de CA125 se usa en combinación con otros marcadores.

El cáncer testicular (TC) es responsable de aproximadamente 1% de los neoplasmas en los hombres y puede afectar a los varones desde la infancia hasta la senilidad. El TC es la malignidad más común en varones entre las edades de 15 y 35, el segundo cáncer más común en hombres de edad entre 35 y 39 años, y la tercera malignidad más común en varones de edad entre 15 y 19. La incidencia de TC está actualmente creciendo en aproximadamente 7.000 nuevos casos al año. En un estudio entre 1988 y 1996 de miembros de servicio de funciones activos se ha observado un 78% en TC durante este período de nueve años.

Los neoplasmas testiculares se clasifican en dos grupos histológicos principales: tumores de la línea germinal (95% de todos los tumores testiculares,) y tumores de células no germinales (4% a 5%). Los tumores de células germinales se dividen en seminomas (S) que representan aproximadamente 40% de los tumores de las células germinales, y no seminomas (NS) que suponen hasta un 60% de todos los tumores de las células germinales. Lo no seminomas se dividen además en cuatro categorías: embrionarios (15% a 20%), teratoma (20% a 25%), saco vitelino (10%), y coriocarcinoma (1%) (para las recientes revisiones, véase Mac-Vicar et al., 2004 Curr Opin Oncol 16: 253-256; Parker et al., 1996 CA Cancer J Clin 46: 5-27; y Hellerstedt et al., Curr.Opin.Oncol. 14 (2002), 260-264). Seminomas típicamente se extienden mediante los ganglios linfáticos regionales a supraclavicular, mediastinal, y ganglios retroperitoneales. Los no seminomas se metastatizan preferiblemente al hígado y pulmones mediante las vías linfática y hematogénica. Aunque la tasa de supervivencia para TC generalmente Buena, la supervivencia y posibilidad de curación de los TC depende extremadamente de la detección temprana (Parker et al, 1996). Una vez que se ha extendido el cáncer más allá de los ganglios locales (Fase III) la tasa de supervivencia cae drásticamente, mientras que la tasa de supervivencia de cinco años para las fases I y II de cáncer testicular es mejor que el 95%. En consecuencia, la diagnosis en una fase temprana evoluciona con una mejor prognosis a largo plazo, mientras que la diagnosis retrasada está asociada a la mortalidad del paciente. Esto es debido a que la tasa de respuesta es menor al tratamiento establecido si el desarrollo de tumor ha avanzado.

Ya que no cada hallazgo anormal relacionado con el testículo es un neoplasma testicular, se deben realizar grandes esfuerzos para separar los tumores de otros trastornos del testículo tal como epididimitis. Ya que la biopsia por aguja fina, un procedimiento comúnmente empelado para la confirmación de diagnosis de cáncer está contraindicada en el caso de un TC debido a un incremento en el riesgo de la extensión metastático, eliminación quirúrgica radical del testículo afectado no es solamente la primera etapa en la mayoría de los regímenes de tratamiento sino también a menudo se realiza para la diagnosis definitiva.

El cáncer cervical es el segundo cáncer más común entre las mujeres en todo el mundo, con más de 500.000 nuevos casos y aproximadamente 288.000 de muerte al año (WHO: Human papillomavirus infection and cervical cancer, 2004. A partir de:

http://www.who.int/vaccine_research/diseases/hpv/en/). La situación es incluso peor en muchos países desarrollados donde más de dos tercios de los cánceres cervicales se diagnostican primero en una fase avanzada, que típicamente está combinada con una prognosis pobre para la supervivencia. Por otra parte, si las lesiones precancerosas se identifican de una manera oportuna y se inicia el tratamiento inmediatamente, las muertes por cáncer cervical serían completamente evitables.

Los programas de prevención de cáncer se basan en el hallazgo que los desarrollos de cáncer cervical de suave (CIN I) a moderado (CIN II) y grave CIN (CIN III) y finalmente a cáncer. La neoplasia cervical intraepitelial (CIN) describe cambios precancerosos del cuello, es decir, el crecimiento anormal del tejido epitelial sobre la superficie del cuello, CIN progresa a cáncer durante un período prolongado de tiempo (típicamente 5 a 20 años) y es asintomático. De este modo CIN solamente se puede detectar mediante procedimientos de ensayo adecuados. Mientras CIN puede retroceder de manera espontánea, especialmente mujeres jóvenes, es importante para tratar CIN moderado o grave debido a que puede progresar de otra manera a cáncer.

Varios tipos de HPV (virus de papiloma humano), una infección transmitida por vía sexual, se han identificado como el agente causante principal para el desarrollo de lesiones precursoras. Algunos tipos de HPV, especialmente los tipos 16 y 18, pero también otros como 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, y 68 (denominados comúnmente "HPV de alto riesgo") están asociados a neoplasia intraepitelial cervical y más probablemente provocan graves lesiones y cáncer. Aunque las infecciones por HPV están ampliamente extendidas en la población no se pueden encontrar en cada paciente de cáncer cervical. Además, no todas las infecciones con alto riesgo de HPV dan como resultado cáncer cervical. Por lo tanto también se postulan otros agentes causantes del desarrollo de cáncer cervical.

CIN usualmente se produce en la región del cuello cervical donde el epitelio escamoso del ectocuello del útero y el epitelio columnar del endocuello del útero se reúnen. Las células de esta zona se deben muestrear para la selección citocitológica (es decir, la selección de Papanicolau) o necesidad a examinar durante los procedimientos de selección visual (es decir, colposcopia) las dos herramientas de diagnóstico más usadas comúnmente además de la tipificación de HPV-DNA.

La selección de Papanicolaou hace uso de la observación en la que CIN es un cambio celular en el que la relación entre el núcleo celular y el tamaño global de la célula está aumentado. El procedimiento se describió primero en Papanicolau en 1923, como procedimiento de recolección de células del tracto vaginal y frotis de las células sobre un portaobjetos de vidrio para el examen microscópico. Aunque todavía se emplea de manera amplia, la selección de Papanicolaou es una técnica de selección moderadamente eficaz. Los estudios de metástasis recientes han mostrado que la selección de frotis de Papanicolaou tiene una sensibilidad global de solamente aproximadamente 50% para la detección de cualquier grado de CIN, que significa que solamente la mitad de las mujeres con CIN se diagnostican de manera correcta. La tasa de selección de Papanicolaou falso negativo se estima que es tan alta como 25% a 50% (Mandelblatt et al., JAMA 287 (2002), 2372-2381) debido a una pobre recogida de muestras, preparación incorrecta de m portaobjetos, y errores de la interpretación de laboratorio. La interpretación de los cambios citomorfológicos es altamente subjetivo dando como resultado un alto riesgo de clasificación errónea. Para obtener los resultados de selección por frotis de Papanicolaou, son necesarios profesionales muy bien entrenados para obtener células de la zona de transformación en el cuello del útero. Además, un laboratorio de citología bien establecido con citologistas experimentados es otro requisito previo para asegurar no solamente la calidad de muestreo sino también la precisión de la interpretación microscópica de las muestras. Todas estas limitaciones y diferencias muestra a muestra hacen imposible ofrecer una selección de Papanicolaou eficaz.

Aunque se han desarrollado nuevas tecnologías, tal como citología de base líquida y capa fina,, se han desarrollado para mejorar la precisión del muestreo, la interpretación de la morfología celular todavía permanece la fuente principal de interpretación errónea y falsa diagnosis. En la citología de base líquida y capa fina, la muestra e recoge de cuello del útero mecánicamente mediante el uso de un cepillo pequeño (es decir, citocepillo) y se suspende en una solución conservadora de células para la preparación de portaobjetos automatizada. El líquido se pasa a través de un microfiltro y las células remanentes se transfieren en forma de una monocapa desde el microfiltro a un portaobjetos. El propio portaobjetos se procesa después y se interpreta como un procedimiento de selección convencional de Papanicoloau, que en general limita la precisión de este procedimiento. La sensibilidad puede ser incluso menor cuando se seleccionan las mujeres posmenopáusicas, debido a que los cambios el cuello del útero hace difícil obtener muestras adecuadas de la zona de transformación. Además la citología monocapa (es decir, Thin-Prep, Cytyc Corporation, Boxborough, Massachusetts), que aparentemente se puede convertir en el más ampliamente usado en los Estados Unidos, es mucho más cara que la selección farmacéutica. Los datos epidemiológicos sugieren que los procedimientos actuales de selección de Papanicoloau es improbable que prevengan más de un 60% de cánceres cervicales en una población (Sasieni P.D., J Am Med Wom Assoc. 55 (2000), 216-219).

La selección visual (colposcopia) - otro procedimiento usado de manera amplia para la detección de cáncer cervical - es la inspección visual del cuello del útero con el fin de encontrar cambios patológicos en la transformación del cuello del útero. En su comienzo este planteamiento usaba la inspección visual solo y era muy impreciso en la identificación de las lesiones precursoras. La inspección visual después de la "tinción" previa de la zona de la zona de transformación del cuello del útero con ácido acético ha establecido este procedimiento como una técnica de selección sencilla y rentable. Esta inspección visual modificada implica la inserción de un espéculo vaginal y muestreo con hisopo del cuello del útero con 3% a 5% de solución de ácido acético antes de la inspección visual del cuello del útero. El epitelio normal aparece color rosa mientras que las lesiones CIN se volverán blancas durante unos pocos minutes después de la aplicación de ácido acético debido al incremento de la cantidad de proteínas nucleares y citoqueratinas en el epitelio cervical. A pesar de esta mejora, el procedimiento está todavía limitado en la precisión de la detección de las lesiones CIN II y CIN III. Además, la interpretación de los resultados de la colposcopia es, similar a la selección de Papanicolaou, que depende en gran medida de la experiencia de los examinadores.

Además de éstos, en el sentido más amplio, los procedimientos de selección en base visual, de tipo HPV-DNA se hace más y más importante durante los últimos años. Los recientes avances en la detección de ADN a partir de HPV de alto riesgo (es decir, ensayo II de captura de Híbrida (Digene Corporation, Gaithersburg, Maryland) en combinación con la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)), han permitido que el ensayo de HPV se use como una herramienta de selección para la neoplasia intraepitelial cervical asociada a HPV y cuello del útero. El ensayo de ADN de captura II híbrida usa sondas de ácido ribonucleico no radiactivas en un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para detectar ADN de las especies de HPV de alto riesgo. Aunque el ensayo de HPV es eficaz, su distribución está limitada por el hecho que es más cara que la selección de Papanicolaou. De acuerdo con las directrices de FDA, el ensayo de HPV-ADN no pretende que reemplace la selección de Papanicolaou regular o para seleccionar las mujeres por debajo de los 30 con resultados de Papanicolaou normales. Además, el ensayo HPV-ADN está per se limitado a las lesiones de CIN inducidas por HPV y cánceres cervicales inducidos por HPV.

La determinación de la fase del Cáncer Cervical se ha desarrollado para describir el grado de desarrollo de cáncer. La fase de cáncer cervical describe el tamaño de tumor, profundidad de penetración dentro del cuello del útero y extensión de dentro y más allá del cuello del útero. La determinación de la fase del cáncer cervical se describe usualmente en términos del sistema FIGO, una puesta en escena del esquema desarrollado por la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia. Las clasificaciones de FIGO se agrupan dentro de las fases básicas marcadas fase 0 hasta la fase IV (0-4):

* Fase 0 o carcinoma in situ es cáncer muy temprano. Las células anormales se encuentran solamente en la primera capa de las células del revestimiento del cuello del útero y no invaden los tejidos más profundos del cuello del útero.

* Fase I cáncer implica el cuello del útero pero no se ha extendido en la proximidad.

* Fase IA indica una cantidad muy pequeña de cáncer que es solamente visible con un microscopio se encuentra más profundo en los tejidos del cuello del útero.

* Fase IB indica una mayor cantidad de cáncer que se encuentra en los tejidos del cuello del útero.

* Fase II el cáncer se ha extendido hasta áreas cercanas pero todavía está en el interior del área pélvica.

* Fase IIA el cáncer se ha extendido más allá del cuello del útero hasta los dos tercios superiores de la vagina.

* Fase IIB el cáncer se ha extendido hasta el tejido alrededor del cuello del útero.

* Fase III el cáncer se ha extendido a través del área pélvica. Las células cancerosas se pueden haber extendido hasta la parte inferior de la vagina. Las células también se haber extendido para bloquear los tubos que conectan los riñones a la vejiga.

* Fase IV el cáncer se ha extendido hasta otras partes del cuerpo.

* Fase IVA el cáncer se ha extendido hasta la vejiga o recto (órganos cercanos al cuello del útero).

* Fase IVB el cáncer se ha extendido hasta otros órganos tales como los pulmones.

A pesar de la capacidad de reducir la incidencia del cáncer cervical de manera significativa mediante la detección temprana (especialmente antes de la fase O (prefase 0)), existen todavía limitaciones actualmente en el procedimiento de selección para esta enfermedad. Lo más dominante es el hecho que muchos pacientes no están enterados de los procedimientos de selección disponibles. La detección del cáncer cervical en muestras de suero con análisis de suero realizados de manera rutinaria resolverían este problema. Los procedimientos de selección presentes no son capaces de detectar CIN y/o cáncer cervical en muestras de suero, se diseñan para el análisis de células cervicales. Todos los procedimientos de selección establecidos hasta ahora tienen sus limitaciones específicas y ninguno de estos procedimientos permite la detección de CIN o cáncer cervical en muestras diferentes de las derivadas de la región de transformación del cuello del útero. Además, cada uno de estos programas de selección está más allá de la posibilidad de usarse para una selección de población especialmente en los países desarrollados. Esta situación cambiaría drásticamente con el desarrollo de herramientas de diagnóstico de CIN y/o cáncer cervical precisas, rápidas, y baratas.

Claramente, las mejores herramientas de diagnóstico, con una mayor especificidad y una mayor sensibilidad son una materia de urgente necesidad. Con respecto a esto, los marcadores en suero no solamente serían marcadores de gran ayuda de cánceres del sistema reproductor, especialmente TC, cáncer de ovario, sino también se usaría para la diagnosis, determinación de la fase, y seguimiento de estas formas de tumores.

Actualmente, por ejemplo, se usan varios marcadores de suero para diagnosticar neoplasmas de los testículos:

(1) La subunidad \beta de la gonadotropina coriónica humana (\beta-HCG) se eleva en un 30% a 35% de tumores de células germinales no seminomatosas y 10% a 25% en pacientes con seminoma. Esto se debe lo más probable a la capacidad de algunos tumores de secretar cantidades abundantes de \beta-HCG. (2) Los niveles de Alfa-fetoproteína (AFP) se sabe que están elevados en aproximadamente 55% de los casos de tumores de células germinales no seminomatosas, pero no en seminomas. (3) La lactato deshidrogenasa (LDH) se eleva en aproximadamente 50% de todos los pacientes con neoplasmas testiculares. LDH está elevada de manera usual en proporción al volumen tumoral y no específica a cualquier categoría de tumor. A medida que LDH se expresa en varios tejidos, los niveles anormales de LDH a menudo reflejan otras entidades patológicas. A pesar del hecho que los niveles HCG, AFP, y LDH se deberían deliberar en todos los pacientes antes de que se realice una eliminación quirúrgica radical del testículo afectado (orquiectomía), el valor predictivo muy limitado de los tres marcadores de suero es obvio, debido al gran grupo de pacientes que son negativos para estos marcadores clásicos. De este modo, e la mayoría de los casos los facultativos no pueden tomar la decisión de si o no realizan una orquiectomía sobre estos tres marcadores de diagnóstico. Además, también después de la orquiectomía el valor predictivo de los niveles en suero de HCG, AFP y LDH permaneces críticos cuando se controla el tratamiento de los cánceres respectivos. De este modo, se necesitan de manera urgente nuevos marcadores de tumores para los neoplasmas testiculares o bien como marcadores de posición solos, así como marcadores a combinar con las herramientas de diagnóstico existentes. Desafortunadamente, LDH se expresa en varios tejidos e incrementa las concentraciones de LDH a menudo por lo tanto reflejan otras entidades patológicas.

Se han reseñado otros varios nuevos marcadores de tumores (que incluyen factor de crecimiento epidérmico, NES-1 e i(12p)) (Hellerstedt et al., 2002 Curr Opin Oncol 14: 260-264).

Los resultados anormales de marcador usualmente reflejan enfermedad en pacientes con cáncer testicular. Los marcadores falsos positivos (por ejemplo la producción de AFP) son raros pero pueden dar como resultado un tratamiento excesivo significativo (quimioterapia, cirugía). Por otra parte, el control de tratamiento mediante marcadores de tumores es solamente posible en los tumores de células germinales no seminomatoso (NSGCT), mientras en los pacientes de seminoma la respuesta de tratamiento se ha estimado mediante resultados de procedimiento s de formación de imágenes (exploración CT, exploración PET), que obviamente tienen sus limitaciones.

Una investigación de nuevos marcadores de tumores del sistema reproductor, especialmente cánceres testiculares y de ovario, específicamente en el grupo mayor de marcador negativo reseñado anteriormente (1/3 de NSGCT y la mayoría de seminomas) se necesita por lo tanto de manera urgente.

Un objeto de la presente invención es proporcionar estrategias novedosas para la diagnosis de tumores del sistema reproductor, especialmente para los tumores de ovario y testiculares así como cáncer cervical.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para la diagnosis de tumores de los órganos reproductores (es decir, el sistema reproductor) dicho procedimiento se caracteriza por la determinación del contenido de afamina en una muestra de un fluido corporal o en una muestra de tejido, en la que un tumor se diagnostica si el contenido de afamina en la muestra disminuye comparado con el contenido en afamina en una muestra de una persona sin un tumor de los órganos reproductores.

La afamina es una proteína de 87 kDa que pertenece al grupo de albúmina y que tiene muchas cosas en común, estructuralmente en términos de bioquímica, con las proteínas de este grupo, tal como, por ejemplo, con albúmina sérica humana (HSA), [alfa]-fetoproteína humana (AFP) o proteína de unión a la Vitamina D humana. Afamina también se ha clonado y secuenciado y de esta manera también está disponible en forma (documento WO 95/27059). Afamina es una glicoproteína principalmente de origen hepático que se secreta en la circulación. Se ha mostrado que afamina se produce de manera abundante en plasma y otros fluidos corporales como fluido folicular, fluido cerebroespinal y seminal. Aparte de estas homologías de secuencia con la albúmina, se conoce poco sobre la función de afamina. La posibilidad se ha descrito ya que la afamina tiene sitios de unión a esterol, incluso probablemente no se une actina. Debido a la similitud existente, todavía no asumida entre la afamina y albúmina, se duda que estas proteínas se unan a los mismos ligandos (Lichenstein et al., The Journal of Biological Chemistry, 269 (27) (1994), p. 18149-18154). También se ha mostrado in vitro e in vivo que posee las propiedades de unión a la vitamina E (Voegele et al., 2002 Biochemistry 41: 14532-14538). Los ratones en los que el gen de afamina está inactivado mediante la interrupción dirigida, mostraron (entre otros fenotipos) testículos con una reducción significativa de los tamaños de los órganos medios y, en algunos casos, cáncer testicular. Algunos ratones hembra tenían los órganos reproductores aumentados en gran medida (útero y ovario) sugiriendo tumores también en estos órganos. El uso de afamina para determinar la fertilidad de los mamíferos se ha descrito en el documento WO 01/01148 A1.

Para la presente invención, el papel de afamina en el desarrollo de cáncer testicular también en seres humanos se investigó (en un caso/control así como en el control de del diseño después de tratamiento curativo) en pacientes con tumores en el sistema reproductor. La Afamina se ha identificado de manera sorprendente como un marcador de tumores notablemente significativo para estos tumores. Esto además se demostró clínicamente con diversas formas de los tumores de células germinales masculinos.

Preferiblemente los tumores testiculares o de ovarios se diagnostican de cuerdo con la presente invención. En particular, la presente invención es adecuada de manera específica para los tumores de las células germinales.

De acuerdo con una realización preferida, el tumor diagnosticado de acuerdo con la presente invención se selecciona entre seminomas, no seminomas, tumor testicular embrionario, teratoma, saco vitelino o corioncarcinoma, y las mezclas de los tumores anteriormente mencionados.

Los tumores de ovario preferidos a diagnosticar por el procedimiento presente se seleccionan entre tumores de ovario de epitelio primario, especialmente cistadenoma, cistadenomacarcinoma o tumor de Brenner, tumores de ovario de mesenquémica primarios y tumores mixtos, especialmente fibroma o adenofibroma de ovarios, tumores del cordón sexual, especialmente tumor de células granulosa, tumor de células theka, androblastoma o ginandroblastoma, tumores de las células germinales, especialmente disgerminoma, teratoma, dermoide, estroma de ovarios, carcinoma embrionario, poliembrioma, tumor del seno endodérmico o corionepitelioma maligno, o tumores de ovario secundarios generados por metástasis, especialmente de carcinoma de mama, carcinomas gastrointestinales o carcinoma de cuerpo, y las mezclas de los tumores anteriormente mencionados.

Los tumores testiculares (células germinales) preferidos a diagnosticar de acuerdo con la presente invención se seleccionan entre tumores testiculares derivados de las células germinales, especialmente seminoma, orquioblastoma, teratocarcinoma, corioncarcinoma o tumores mixtos con seminoma parcel, o tumores testiculares derivados de células no germinales, especialmente tumores del estroma testicular, especialmente del estroma testicular, tumor de células Leydig, tumor de células de Sertoli o tumor de células granulosa, y mezclas de los tumores anteriormente mencionados.

Por otra parte, el procedimiento de acuerdo con la presente invención también se ha probado que es eficaz para la diagnosis de cáncer cervical, especialmente en las fases tempranas de este tipo de cáncer (por ejemplo, pre-fase 0, fase 0, I, IA o IB).

El presente procedimiento se puede combinar con cualquier otro procedimiento para diagnosticar tumores en el sistema reproductor, por ejemplo, examen manual, examen histológico o diagnosis de marcador de tumor. Se prefiere particularmente combinar el presente procedimiento con ensayos adicionales para otros marcadores de tumores o combinaciones de tales marcadores, especialmente para tumores del sistema reproductor, en la muestra. Los marcadores adicionales preferidos para los tumores testiculares son alfa- fetoproteína, subunidad beta de gonadotropina coriónica humana, lactato deshidrogenasa, factor de crecimiento epidérmico, NES-1 o i(12p) (Hellerstedt et al., 2002). Los marcadores adicionales preferidos para tumores de ovarios son CA125, ácido lipofosfatídico (LPA), CA130 o receptor alfa-folato. Un marcador adicional preferido para el tumor cervical es SCC (antígeno de carcinoma de células escamosas); Gadducci A et al., Biomed Pharmacother 2004, 58: 24-38).

De acuerdo con la presente invención en el contenido en afamina de la muestra se determina con un procedimiento de determinación de afamina y - debido a comparación con una referencia de afamina - analizado si la afamina en la muestra disminuye o no Esto se puede hacer por ejemplo, comparando el contenido en afamina en la muestra con un patrón de afamina, dicho valor de referencia de afamina de un individuo sano o de un individuo que no tiene un tumor del sistema reproductor. Como alternativa (o además), se proporciona un valor de referencia de un paciente con un tumor en el sistema reproductor individual. El valor de referencia se puede proporcionar por ejemplo, en forma de una o más muestras de referencia, tablas de referencia, curvas de referencia o medios análogos así como sus combinaciones. Cuando se analiza si la cantidad de la muestra ha disminuido, las personas expertas en la técnica tienen numerosas posibilidades. Por ejemplo, una comparación directa con valores de referencia publicados de afamina en el fluido corporal o tejido. De cualquier forma, el procedimiento de acuerdo con la presente invención no proporciona una diagnosis médica final, proporciona un valor de afamina para una muestra de del estado de tumor desconocido o de una persona que está en riesgo de ser sospechosa de tener un tumor en el sistema reproductor comparado con un valor de afamina de una muestra dada o virtual que no tiene un tumor en el sistema reproductor, específicamente un tumor testicular o un tumor de ovario. La diagnosis médica final después se proporciona - independientemente de la diagnosis in vitro o procedimiento de análisis de acuerdo con la presente invención - por la persona educada médicamente titulada para tal diagnosis.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el contenido en afamina en la muestra se considera que disminuye, si al menos es un 10% menor, preferiblemente al menos un 30% menor, especialmente al menos un 50% menor, que el contenido en afamina en una muestra de una persona sin un tumor de los órganos reproductores.

Como alternativa, el contenido afamina se considera que ha disminuido de acuerdo con la presente invención, si al menos es un 20% menor, preferiblemente al menos un 40% menor, especialmente al menos un 60% menor, que el contenido en afamina en una muestra de una persona sin un tumor de los órganos reproductores.

Preferiblemente la persona sin un tumor de los órganos reproductores es una persona sana con un contenido en afamina de 50 a 70 mg, especialmente 60 mg, afamina por litro de suero sanguíneo. Los valores en % anteriormente mencionados se calculan después o bien a partir del valor de 60 mg o del límite inferior de 50 mg (dependiendo también de los valores comparativos del fluido corporal específico (por ejemplo, plasma o suero) o sistema de determinación de afamina).

Las muestras de fluidos corporales o tejido preferidas se seleccionan entre sangre, suero, plasma, fluido cefalorraquídeo, fluido de esperma, fluido folicular, ovario, testículo o epidídimo.

Aunque todos los procedimientos para determinar afamina son adecuados para la presente invención, que permiten la distinción entre un valor de afamina normal uno disminuido, el contenido en afamina se determina preferiblemente con anticuerpos anti-afamina, especialmente anticuerpos monoclonales. Tales anticuerpos pueden comprender un marcador de detección, preferiblemente un marcador cromogénico, fluorogénico o radiactivo. De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de un kit para determinar la cantidad de afamina en una muestra de un fluido corporal o en una muestra de tejido que comprende medios de detección de afamina y una referencia de afamina para diagnosticar tumores de los órganos reproductores. Los kits para la determinación de afamina son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, documentos WO 01/01148 o WO 95/27059). Preferiblemente, el uso de acuerdo con la presente invención se reduce a la práctica mediante la aplicación de un procedimiento de acuerdo con la la presente invención como se ha descrito anteriormente.

Entre los componentes usuales de tales kits de determinación de afamina, se prefiere específicamente el patrón de afamina (por ejemplo, como un pocillo patrón en una ELISA de microvaloración ELISA o como un punto o área patrón sobre un procesador de génico o procesador de microdisposición de proteína (anticuerpo).

La presente invención se describe además en los siguientes ejemplos y las figuras de los dibujos, pero sin estar restringidos a ello.

La Fig. 1 muestra la concentración media de afamina [mg/l] en S = Seminoma, NS = No seminoma, MT = Tumor mixto, NTT = Tumor No Testicular;

La Fig. 2 muestra la concentración media de AFP [ng/ml] en S = Seminoma, NS = No seminoma, MT = Tumor mixto, NTT = Tumor No Testicular;

La Fig. 3 muestra la concentración media de HCG [mIU/ml] en S = Seminoma, NS = No seminoma, MT = Tumor mixto, NTT = Tumor No Testicular;

La Fig. 4 muestra el desarrollo de concentración en suero de afamina [mg/l] y HCG concentración en suero [mIU/ml] durante el tiempo (en días) de un paciente representativo con un seminoma. El momento 0 indica el valor en suero de la muestra tomada el día antes de la operación del tumor; otros momentos varían hasta 70 días después de la operación y muestran un incremento de los valores de afamina a valores normales en las dos primeras semanas después de la operación. La segunda curva muestra los valores respectivos de las concentraciones de HCG en suero.

La Fig. 5 muestra el desarrollo de concentración en suero de afamina [mg/l] y concentración en suero de HCG [mIU/ml] durante el tiempo (en días) de un paciente representativo con un seminoma. El momento 0 indica el valor en suero de la muestra tomada el día antes de la operación del tumor; otros momentos varían hasta 135 días después de la operación y muestran un nuevo incremento de valores de afamina a valores normales dentro de las primeras 2 semanas después de la operación. La segunda curva muestra los valores respectivos de las concentraciones de HCG en suero.

La Fig. 6 muestra el desarrollo de concentración en suero de afamina [mg/l] y concentración en suero de AFP [ng/ml] durante el tiempo (en meses) de un paciente representativo con un no seminoma. El momento 0 indica el valor en suero de la muestra tomada el día antes de la operación del tumor; otros momentos varían hasta 34 meses después de la operación y muestran un incremento de los valores de afamina a valores normales en las 2 primeras semanas después de la operación. La segunda curva muestra los valores respectivos de las concentraciones de HCG en suero.

La Fig. 7 muestra que las concentraciones en plasma de Afamina están significativamente reducidas en pacientes que sufren de cáncer testicular en el momento de la primera diagnosis de cáncer y se incrementan hasta niveles fisiológicos después de la extirpación quirúrgica exitosa de tumor/órgano y se incrementan hasta niveles normales típicamente en un mes (n=15).

La Fig. 8 muestra las concentraciones en plasma de Afamina (media + desviación estándar) de un grupo de control de mujeres basado en la población (n = 410, IC al 95% 60,7-63,3) y las pacientes con cáncer de ovario (n = 111, IC al 95% 29,9-35,0) el día de la extirpación quirúrgica del tumor (preoperativo).

La Fig. 9 muestra la correlación de concentraciones en plasma de Afamina y el marcador de tumor convencional CA125 en 111 pacientes con cáncer de ovario el día de la extirpación quirúrgica del tumor (preoperativo).

La Fig. 10 muestra las concentraciones en plasma de Afamina y el marcador de tumor convencional CA125 de un paciente representativo con cáncer de ovario el día de la extirpación quirúrgica del tumor (día 0) y aproximadamente 80 semanas más tarde de la reaparición del tumor. Las concentraciones en plasma reducidas de Afamina se incrementan hasta niveles de 60 \mug/ml y disminuyen de nuevo en el caso de la reaparición del tumor (indicado por la flecha).

La Fig. 11 muestra las concentraciones en plasma de Afamina y el marcador de tumor convencional CA125 de un paciente representativo con cáncer de ovario el día de la extirpación quirúrgica del tumor (día 0) y aproximadamente 80 semanas después de la reaparición del tumor. Las concentraciones en plasma reducidas de Afamina se incrementan hasta niveles de 60 \mug/ml y disminuyen de nuevo en el caso de la reaparición del tumor (indicado por la flecha). En comparación con CA125, Afamina es altamente específica para los cánceres gonadotróficos.

La Fig. 12 muestra las concentraciones en plasma de Afamina (media + desviación estándar) de un grupo de control de mujeres basado en la población (n = 410) y pacientes con cáncer cervical (n = 18) en el estado IV FIGO el día de la extirpación quirúrgica del tumor (preoperativo).

La Fig. 13 muestra las concentraciones en plasma de Afamina (diamantes) y el marcador de tumor convencional SCC (cuadrados) de 4 pacientes representativos con cáncer cervical en las fases FIGO I-IV el día de la extirpación quirúrgica del tumor (día 0, preoperativo) y después de tiempos variables de observación hasta la reaparición del tumor (flecha). Las concentraciones reducidas de Afamina se incrementan hasta niveles normales y disminuyen de Nuevo en el caso de la reaparición del tumor.

Ejemplos Pacientes y Metodología

Desde enero de 2004 a enero de 2005, 16 pacientes con cáncer testicular (seminoma, n = 11, NSCGT, n = 1, tumores mixtos, n = 4) se diagnosticaron y se trataron en el departamento de Urología. Los tumores testiculares se clasificaron basándose en la histología después de la orquiectomía inguinal. Los tumores testiculares se clasificaron basándose en la histología después de la orquiectomía inguinal. 4 pacientes se diagnosticaron falsos positivos en la base de niveles elevados de AFP o HCG, 2 de los cuales se diagnosticaron de manera histológica que tenían cáncer de vejiga.

Los análisis de HCG y AFP inmunométricos de suero se llevaron a cabo usando el Sistema de Inmunoensayo ADVIA® Centaur (Bayer Diagnostics, Alemania) con la tecnología de quimioluminiscencia directa. Un valor >10 ng/ml y >10 mIU/ml se consideró patológico para AFP y hCG, respectivamente. La proteína total se midió con un ensayo colorimétrico (Folin-CieuCalteau, Merck-Chemicals, Darmstadt, Alemania).

Las concentraciones en suero de afamina se determinaron un ELISA de sándwich descrito recientemente (Voegele et al., 2002) usando un anticuerpo de conejo de afamina antihumano policlonal purificado por afinidad para revestir placas de microvaloración y el anticuerpo N13 de ratón antihumano monoclonal conjugado a POX para detección. La Afamina que se purificó de plasma humano y se cuantificó mediante análisis de composición de aminoácidos que sirven para calibrar una muestra de plasma secundario.

AFP y HCG se analizaron en el momento de diagnosis y antes de la orquiectomía, frecuentemente (al menos bisemanalmente) durante la terapia posterior (quimioterapia, cirugía retroperitoneal) y al menos tres meses de seguimiento. La Afamina se midió a partir de muestras congeladas al final del período del estudio.

Resultados

La Afamina disminuyó de manera significativa en pacientes con las tres formas investigadas de cáncer testicular cuando se compara con un grupo de control basado en la población al azar (Tabla 1, datos detallados en las Tablas 2 y 3 y en las figuras). Los valores aumentaban hasta niveles normales en unas pocas semanas muy comparables a la normalización de los niveles de HCG/AFP. Los niveles en plasma de proteína total eran normales en pacientes y no cambiaban durante el tratamiento y observación. De manera más interesante los niveles de afamina normales se encontraron en 4 pacientes que tenían los niveles elevados de o bien HCG o AFP pero no mostraban ningún signo de tumor testicular mediante examen histológico. Sin embargo, dos de ellos, se diagnosticaron positivos para cáncer de vejiga.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

1

\vskip1.000000\baselineskip

Discusión

Los resultados presentes son la primera reseña de un nuevo marcador de tumor de plasma humano que identifica el tumor testicular independiente de su subtipo (S, NS, MT) mediante la disminución significativa de los niveles en plasma y un incremento a valores normales después de la extirpación quirúrgica del tumor. En el pequeño grupo de estudio presente se proporciona de esta manera, por el contrario a los marcadores de tumores usados de manera rutinaria, un marcador confiable para todos los grupos de cáncer.

Se han detectado cuatro pacientes mediante los niveles reducidos de afamina que no muestran anormalidades de los parámetros usados de manera rutinaria (reduciendo de este modo los falsos negativos). Se descubrieron cuatro casos en los que los niveles de afamina eran normales, los valores de HCG y/o AFP estaban elevados. Estos hallazgos ayudaron a reducir los resultados falsos positivos y negativos debido a las no especificidades de los marcadores clásicos.

Tomados conjuntamente, la diagnosis de afamina en pacientes testiculares, como una forma representativa de tumores del sistema reproductor, incrementa la especificidad de detección comparada con marcadores específicos conocidos y aplicados en la técnica. La segunda cuestión importante es la aplicabilidad general de los valores disminuidos de afamina para todas las formas de cáncer testicular. La presente observación longitudinal de normalización de valores después de tratamiento curativo confirma en gran medida la significación de afemina como un marcador valiosos de tumor para el cáncer testicular.

Los factores patológicos, expresados en el tumor testicular podría suprimir la producción y secreción de afamina en el hígado. Como alternativa, el tumor de crecimiento podría de manera creciente privar al plasma de ligandos que están llevados por la afamina. A la vitamina E que es hasta ahora el único ligando fisiológico conocido de la afamina (Voegele et al., 2002 Biochemistry 41: 14532-14538) se la han asignado varios papeles en la carcogénesis (Sigounas et al., 1997 Nutr Cancer 28: 30-35).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

2

\vskip1.000000\baselineskip

Significación de afamina entre grupo de seminoma y de control: p = 0,003

Significación de afamina entre grupo de no seminoma y de control: p = 0,000 2 x falso neg 2 x falso neg 10 x falso neg 3 x falso pos 8 x falso neg 3 x falso neg 8 x decr 1 x decr 1 x decr 4 x normal 1 x normal 1 x incr 1 x incr 1 x incr 3 x incr 3 x incr 1 x incr 3 x incr 1 x incr Normal Afa intervalo 50-70 mg/l AFA = Afamina, AFP = Alfafetoproteína, HCG = gonadotropina coriónica humana

S = Seminoma, NS = No seminoma, MT = Tumor mixto, NTT = Tumor NoTesticular AFP: >10 ng/ml = patológico CG = grupo de control, basado en población, n = 360 HCG: >10 mlU/ml = patológico

TABLA 3

4

\vskip1.000000\baselineskip

Investigaciones clínicas adicionales Cáncer Testicular

Con el fin de establecer la afamina como marcador de tumor también para controlar el desarrollo de la enfermedad (desaparición y reaparición de tumor) y de este modo confirmar los resultados del estudio piloto mostrado en las Figs. 1-3, 15 pacientes con cáncer testicular diagnosticado se midieron antes de la extirpación quirúrgica del tumor y aproximadamente 1 mes después. La disminución de los niveles de afamina en plasma volvieron a los valores típicos para la población sana (véase la Tabla 2). Los valores de Afamina permanecían dentro del intervalo normal incluso después de la observación prolongada (hasta varios años) lo que indica que no reaparecía el tumor. Esto está de acuerdo con la experiencia clínica de una reaparición muy rara de tumor testicular.

\vskip1.000000\baselineskip

Cáncer de ovario

Basándose en la analogía y en los hallazgos preliminares de los tumores sugeridos en los órganos reproductores en los ratones hembra con la eliminación genética de afamina los niveles de Afamina también se investigaron en pacientes humanos con cáncer de ovario. La situación diagnóstica es de manera similar insatisfactoria en esta enfermedad también ya que el marcador CA125 de tumor usado de manera convencional es muy inespecífico para el cáncer de ovario y por lo tanto solamente adecuado para el control de tumor.

Similar a los pacientes con cáncer testicular, las concentraciones en plasma reducidas de manera significativa de afamina se encontraron en 111 pacientes con cáncer de ovario cuando se compara con los basados en la población y de edad coincidente (n = 410). La diferencia era igual más pronunciada (32 frente a 62 mg/l; Fig. 8) como en los pacientes con cáncer testicular.

Cuando las concentraciones de afamina y CA 125 en plasma estaban correlacionadas entre sí, se observó una correlación muy débil, no significativa (Fig. 9). Esto indica que no existe virtualmente ninguna asociación entre estos 2 marcadores.

Con el fin de confirmar la idoneidad de la afamina como marcador de tumor de cáncer de ovario también en el diseño de del control 10 pacientes se investigaron longitudinalmente del día preoperatorio en la diagnosis del cáncer hasta la reaparición del tumor. La disminución significativa de los valores de afamina en el momento de la diagnosis se incrementó hasta valores de controles sanos (una investigación representativa se observa en la Fig. 10). En algunos casos, la reducción de concentraciones de afamina en la diagnosis de tumor se observó también en la ausencia del aumento de marcadores CA125 (Fig. 11) indicando una mayor especificidad de tumor de la afamina cuando se compara con CA125.

\vskip1.000000\baselineskip

Cáncer cervical

Finalmente, también se investigó un grupo de pacientes con otro tumor de órganos reproductores, el cáncer cervical que es el segundo cáncer más frecuente en mujeres. No existe ningún marcador en absoluto de tumor en suero para la identificación de este cáncer frecuente. El marcador SCC en plasma usado de manera convencional (antígeno de carcinoma de células escamosas) no es una vez más bastante específico para el cáncer cervical.

Mediante la presente invención se puede demostrar no solamente la concentraciones en plasma reducidas de manera significativa en 18 pacientes con cáncer cervical, sino también la idoneidad de la afamina como marcador de tumor de control en el diseño longitudinal (n = 16). La Afamina disminuyó en todas las fases FIGO investigadas del cáncer, aumentó hasta valores normales de controles sanos después de la extirpación de tumor y disminuyó de nuevo en la reaparición del tumor (Figs. 12 y 13).

Claims (18)

1. Procedimiento para diagnosticar tumores de los órganos reproductores caracterizado por la determinación del contenido en afamina en una muestra de un fluido corporal o en una muestra de tejido, en el que un tumor se diagnostica si el contenido en afamina en la muestra está disminuida comparado con el contenido en afamina en una muestra de una persona sin un tumor de los órganos reproductores.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor es un tumor testicular o de ovario.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el tumor es un tumor de las células germinales.

4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho tumor se selecciona entre seminomas, no seminomas, tumor testicular embrionario, teratoma, saco vitelino o corioncarcinoma, y las mezclas de los tumores anteriormente mencionados.

5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho tumor se selecciona entre tumores de ovario epiteliales primarios, especialmente cistadenoma, cistadenomacarcinoma o tumor de Brenner, tumores de ovario mesenquimales primarios, y tumores mixtos, especialmente fibroma o adenofibroma de ovario, tumores del cordón sexual, especialmente tumor de células de la granulosa tumor de células de la teca, androblastoma o ginandroblastoma, tumores de células germinales, especialmente disgerminoma, teratoma, dermoide, estroma de los ovarios, carcinoma embrionario, poliembrioma, tumor del seno endodérmicos o corionepitelioma maligno, tumores de ovario secundarios generados por metástasis, especialmente de carcinoma de mama, carcinomas gastrointestinales o carcinoma del corpus, y las mezclas de los tumores anteriormente mencionados.

6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicho tumor se selecciona entre tumores testiculares derivados de las células germinales, especialmente seminoma, orquioblastoma, teratocarcinoma, coorioncarcinoma o tumores mixtos con seminoma parcial, inactivo, o tumores testiculares derivados de las células germinales, especialmente tumores del estroma testicular, tumor de células de Leydig, tumor de células de Sertoli o tumor de células de la granulosa, y mezclas de los tumores anteriormente mencionados.

7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicho tumor es cáncer cervical.

8. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque se determinan en la muestra marcadores adicionales para marcadores, preferiblemente para tumores del sistema reproductor, especialmente alfa-fetoproteína, subunidad beta de la gonadotropina coriónica humana, lactato deshidrogenasa, factor de crecimiento epidérmico, NES-1, i(12p), fase PAP, antígeno de carcinomas de células escamosas (SCC) o sus combinaciones.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque dicho marcador adicional es CA125, ácido lisofosfatidílico (LPA), CA130 o receptor alfa-folato.

10. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el contenido en afamina en la muestra se considera que ha disminuido, si es al menos un 10% menor, preferiblemente al menos un 30% menor, especialmente al menos un 50% menor, que el contenido en afamina en una persona sin un tumor de los órganos reproductores.

11. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el contenido en afamina en la muestra se considera que ha disminuido, si es al menos un 20% menor, preferiblemente al menos un 40% menor, especialmente al menos un 60% menor, que el contenido en afamina en una persona sin un tumor de los órganos reproductores.

12. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la persona sin un tumor de los órganos reproductores en una persona sana con un contenido en afamina de 50 a 70 mg, especialmente 60 mg, de afamina por litro de suero sanguíneo.

13. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la muestra de fluido corporal o tejido se selecciona entre sangre, suero, plasma, fluido cefalorraquídeo, fluido de esperma, fluido folicular, ovario, testículo o epidídimo.

14. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el contenido en afamina se determina con anticuerpos antiafamina, especialmente anticuerpos monoclonales.

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende un marcador de detección, preferiblemente un marcador cromogénico, fluorogénico o radiactivo.

16. Uso de un kit para determinar la cantidad de afamina in en una muestra de una muestra de fluido corporal o de tejido que comprende medios de detección de afemina y una referencia de afamina, para diagnosticar tumores de los órganos reproductores.

17. Uso de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado porque el kit se usa en un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

18. Uso de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17, caracterizado porque dicho kit contiene una cantidad normalizada de afamina.