ES2313018T3

ES2313018T3 - Procedimiento de produccion de insulina en plantas.

Info

Publication number: ES2313018T3
Application number: ES04737835T
Authority: ES
Inventors: Maurice M. Moloney; Joseph Boothe; Richard Keon; Cory Nykiforuk; Gijs Van Rooijen
Original assignee: SemBioSys Genetics Inc
Current assignee: SemBioSys Genetics Inc
Priority date: 2003-06-17
Filing date: 2004-06-17
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2024-06-17
Also published as: EA200600050A1; TW200510529A; EP1959017A1; WO2004111244A2; JP4864701B2; KR101216762B1; CN1836047A; WO2004111244A3; AU2004247762A1; NZ544522A; CY1108477T1; JP2011200251A; ATE405660T1; PL1633876T3; DK1633876T3; IL172469A; KR20060052705A; EP1633876A2; NO20055885L; AR044803A1

Abstract

Procedimiento para la expresión de la insulina en semillas vegetales que comprende: (a) proporcionar un montaje de ácido nucleico híbrido que comprende en la dirección de la transcripción de 5'' a 3'' como componentes unidos de manera funcional: (i) una secuencia de ácido nucleico que comprende un activador de semillas preferidas; (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de insulina; y (iii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es capaz de conservar el polipéptido de insulina en el retículo endoplásmico (ER) o una vesícula de almacenamiento obtenida del ER. (b) introducir el montaje de ácido nucleico híbrido en una célula vegetal; y (c) cultivar la célula vegetal en una planta madura capaz de fijar la semilla en la que la semilla expresa la insulina; en la que el polipéptido de insulina se acumula en el interior del retículo endoplásmico (ER) o en una vesícula de almacenamiento obtenida de ER y en la que por lo menos el 0,1% de la proteína total de la semilla en la semilla es insulina; y (d) obtener insulina sustancialmente pura de dichas semillas.

Description

Procedimiento de producción de insulina en plantas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos de ingeniería genética vegetal y a la producción de insulina. Más específicamente, la presente invención se refiere a procedimientos para la producción de insulina en semillas de plantas.

Antecedentes de la invención

La insulina es una hormona peptídica importante requerida para mantener la homeostasis de la glucosa en la sangre en mamíferos, incluyendo los seres humanos y otros vertebrados. En los individuos sanos un aumento en la concentración de la glucosa en la sangre estimula las células \beta del páncreas a segregar insulina. El polipéptido insulina se une a continuación a receptores específicos en el músculo, hígado y tejido adiposo lo que conduce a un aumento en la absorción de la glucosa por estos tejidos diana, un aumento en el metabolismo y una disminución en la producción de la glucosa hepática. Los efectos acumulados de estas respuestas sirven para mantener las concentraciones de glucosa en la sangre en un nivel constante.

En los individuos que padecen diabetes mellitus, una concentración de insulina anormalmente baja se presenta como hiperglucemia crónica. Las manifestaciones clínicas de la hiperglucemia crónica son múltiples e incluyen la ceguera, la insuficiencia renal y, si se deja sin tratar, producirá por último la muerte. Las estimaciones sitúan a la diabetes mellitus como la tercera causa mayor de muerte en los países industrializados, después de las enfermedades cardiovasculares y el cáncer (Barfoed, H.C., 1987, Chem. Eng. Prog. 83:49-54). Con el objetivo de permitir la absorción eficaz y el metabolismo de la glucosa en la sangre por las células, los individuos diabéticos pueden tratarse mediante la administración rutinaria de insulina. Aproximadamente el 0,7% de la publicación mundial padece diabetes dependiente de insulina (diabetes mellitus tipo I) (Winter, J. et al., 2000, J. of Biotechnol. 84:175-185). Además, se estima que el número de individuos diagnosticados de diabetes se duplicará hasta aproximadamente 300 millones, en los próximos 25 años (Kjeldsen, T. et al., 2001, Biotechnol. Gen. Eng. Rev. 18:89-121). Por consiguiente, es muy deseable la capacidad para calcular el coste de la fabricación eficaz de la insulina humana en cantidades que satisfagan la demanda mundial de crecimiento anticipado para la insulina.

El polipéptido insulina humana es producido in vivo por las células \beta pancreáticas como una sola cadena precursora de polipéptido de 110 aminoácidos, la preproinsulina, que incluye una presecuencia de 24 aminoácidos localizada en el terminal N que se escinde inmediatamente en el momento de la terminación de la biosíntesis de la cadena (Steiner, D.F. 2000, J. Ped. Endocrinol. Metab. 13229-239). La proinsulina está constituida por una cadena B y A, unidas por un péptido conector (péptido C). Durante el encapsulado de la hormona para la secreción, el péptido C se escinde y es eliminado por las convertasas de la prohormona, PC2 y PC1/PC3 (Steiner, D.F. 2000. J. Ped. Endocrinol. Metab. 13:229-239). Lo que queda es la insulina madura humana, una proteína de 51 aminoácidos constituida por dos cadenas polipeptídicas, A (de 21 aminoácidos de longitud) y B (de 30 aminoácidos de longitud), unida por dos enlaces disulfuro entre las cadenas. Además, la cadena A comprende un enlace disulfuro dentro de la cadena.

La insulina humana se ha preparado utilizando una variedad de diferentes metodologías. Microorganismos tales como Escherichia coli (Frank et al., 1981, en Peptides: Proceedings of the 7th American Peptide Chemistry Symposium (Rich & Gross, eds.), Pierce Chemical Co., Rockford, III págs. 729-739; Chan et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 5401-5404). Saccharomyces cerevisiae (Thim et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6766-6770) se emplean de manera rutinaria para producir de manera recombinante insulina. Wang et al. (Biotechnol. Bioeng., 2001, 73:74-79) ha demostrado que los hongos, tales como Pichia pastoris, son también adecuados para la producción de insulina. Las opciones de preparación alternativas incluyen la producción en estirpes celulares de mamíferos no humanos (Yanagita, M., et al., 1992, FEBS Lett 311:55-59), el aislamiento del páncreas humano, la síntesis de péptidos o la conversión semisintética a insulina humana de la insulina porcina y bovina. Sin embargo, todos estos procedimientos adolecen de rendimientos más bajos y costes superiores que los deseados.

La utilización de plantas como biorreactores para la producción a gran escala de proteínas recombinantes es bien conocida, y se han producido numerosas proteínas, incluyendo las proteínas terapéuticas humanas. Por ejemplo, las patentes US nº 4.956.282, nº 5.550.038 y nº 5.629.175 dan a conocer la producción de \gamma-interferón en vegetales; las patentes US nº 5.650.307, nº 5.716.802 y nº 5.763.748 detallan la producción de albúmina de suero humana en plantas y las patentes US nº 5.202.422, nº 5.639.947 y nº 5.959.177 se refieren a la producción de anticuerpos en plantas. Una de las ventajas significativas ofrecidas por los sistemas de producción de proteínas recombinantes basados en plantas es que al aumentar la extensión del cultivo de plantas, la producción de proteínas puede reducirse proporcionalmente para proporcionar grandes cantidades de proteína. Por el contrario, los sistemas de fermentación y de cultivo celular presentan requisitos de gran espacio, equipo y energía, lo que hace que aumenten los costes de producción. Sin embargo, a pesar del hecho de que la utilización de plantas como biorreactores está ampliamente documentada, y a pesar del aumento prodigioso mencionado anteriormente en la necesidad de grandes volúmenes de insulina, la técnica anterior proporciona solamente un número limitado de procedimientos que de manera demostrable dan como resultado la producción de insulina en plantas (véase: Arakawa et al., Nature Biotech., 1998; 16: 934-936; PCT 01/72959).

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Arakawa et al. dan a conocer la producción de una proteína de fusión que comprende insulina en los tubérculos de plantas de patata transgénicas. Sin embargo la insulina representa solamente hasta el 0,05% del contenido en proteína soluble total presente en los tubérculos transgénicos. A un nivel de 0,05% de proteína soluble total, grandes cantidades de biomasa deben someterse a la extracción de proteínas haciendo que los costes de producción estén asociados a la utilización desfavorable de tubérculos de patata. Además, Arakawa et al. no están interesados en el aislamiento de la insulina del tejido del tubérculo de la patata, sino en su lugar sugieren un método que previene del comienzo de la diabetes tipo I al provocar inmunotolerancia lo que conlleva la administración oral de la insulina en la alimentación de los tubérculos de patata transgénicos.

La solicitud de patente PCT 01/72959 da a conocer la producción de una proteína de fusión que comprende insulina en cloroplastos de tabaco transgénico. Sin embargo, aunque estudiando intencionadamente inconvenientes con respecto a las concentraciones de acumulación de proteínas humanas en el tejido vegetal, la invención a la que se refiere el documento WO 01/72959 está limitada porque la producción en cloroplastos da como resultado la acumulación de insulina en el tejido verde, principalmente en las hojas de tabaco. Debido al contenido en agua relativamente alto del tejido verde, debe procesarse una gran cantidad de biomasa. Además la producción de insulina requeriría la extracción inmediata de la biomasa durante la cosecha, ya que el material foliar se deterioraría rápidamente al almacenarse.

Por lo tanto, a la vista de los inconvenientes asociados a los procedimientos para la producción recombinante de la insulina en plantas proporcionados por la técnica anterior, actualmente no está claro si la capacidad de síntesis de las plantas puede ser aprovechada y de qué modo para conseguir la producción comercial de la insulina en plantas. Hay necesidad en la técnica de mejorar los procedimientos para la producción comercial de insulina en plantas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos mejorados para la producción de insulina en plantas. En particular la presente invención se refiere a procedimientos para la producción de insulina en semillas.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento para la expresión de la insulina en semillas vegetales que comprende:

(a): proporcionar un montaje de ácido nucleico híbrido que comprende en la dirección de la transcripción de 5' a 3' como componentes de manera funcional unidos:

(i): una secuencia de ácido nucleico que comprende un activador de semillas preferidas;

(ii): una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de insulina; y

(iii): una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es capaz de conservar el polipéptido de insulina en el retículo endoplásmico (ER) o una vesícula de almacenamiento obtenida de ER.

(b): introducir el montaje de ácido nucleico híbrido en una célula vegetal; y

(c): cultivar la célula vegetal en una planta madura capaz de fijar la semilla en la que la semilla expresa la insulina; en la que el polipéptido de insulina se acumula en el interior del retículo endoplásmico (ER) o en una vesícula de almacenamiento obtenida de ER y en la que por lo menos el 0,1% de la proteína total de la semilla en la semilla es insulina; y

(d): obtener insulina sustancialmente pura de dichas semillas.

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En una forma de realización preferida, el montaje de ácido nucleico híbrido se introduce en la célula vegetal en condiciones de integración genómica. En dichas condiciones la secuencia de ácido nucleico híbrido se integra de manera estable en el genoma de la planta.

Aún en una forma de realización preferida, la secuencia de ácido nucleico que codifica la insulina está optimizada para la utilización del codón de la planta y la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido de conexión (péptido C) está acortada. Las secuencias de ácido nucleico preferidas utilizadas según la presente invención codifican insulina humana, bovina o porcina. Según la presente invención una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de proinsulina se utiliza en la que la proinsulina se modifica porque el péptido C está acortado en longitud.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de recuperación de semillas de plantas que comprende insulina. Por consiguiente, siguiendo la presente invención se proporciona un procedimiento para obtener semillas vegetales que comprende insulina que comprende:

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(b): introducir el montaje de ácido nucleico híbrido en una célula vegetal;

(c): cultivar la célula vegetal en una planta madura capaz de fijar la semilla; y

(d): obtener semillas de dicha plante en la que las semillas comprende insulina, en la que dicho polipéptido de insulina se acumula en el retículo endoplásmico (ER) o en una vesícula de almacenamiento obtenida de ER y en la que por lo menos el 0,1% de la proteína total de la semilla presente en la semilla es insulina.

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Las semillas pueden utilizarse para obtener una población de plantas de la descendencia que cada una comprende una variedad de semillas que expresan la insulina.

La presente invención proporciona también plantas capaces de fijar la semilla que expresa la insulina. En una forma de realización preferida de la invención, se proporciona una planta capaz de fijar la semilla que comprende una secuencia híbrida de ácido nucleico que comprende en la dirección 5' a 3' de transcripción:

(a): una primera secuencia de ácido nucleico que comprende un activador de semillas preferidas de manera funcional unido a;

(b): una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de insulina; y

(c): una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es capaz de conservar el polipéptido de insulina en el retículo endoplásmico (ER) o en una vesícula de almacenamiento obtenida del ER, en la que la semilla contiene insulina, en la que dicho polipéptido de insulina se acumula dentro del retículo endoplásmico (ER) o en una vesícula de almacenamiento obtenida de ER y en la que por lo menos el 0,1% de la proteína soluble total presente en la semilla es insulina.

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En una forma de realización preferida la secuencia de ácido nucleico híbrida está integrada en el genoma nuclear de la planta.

En una forma de realización más preferida de la presente invención la planta que se utiliza es una planta de cárcamo, una planta de lino o una planta de Arabidopsis.

Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona semillas vegetales que expresan insulina. En una forma de realización preferida de la presente invención, se proporciona una semilla vegetal que comprende una secuencia híbrida de ácido nucleico que comprende en la dirección de transcripción de 5' a 3':

(c): una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es capaz de conservar el polipéptido de insulina en el retículo endoplásmico (ER) o en una vesícula de almacenamiento obtenida del ER.

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Preferentemente, por lo menos el 0,1% de la proteína total de la semilla presente en la semilla es insulina. Las semillas son una fuente en la que el polipéptido de insulina deseado, que es sintetizado por las células de la semilla, puede extraerse y la insulina puede utilizarse para tratar pacientes diabéticos.

Otras características y ventajas de la presente invención se pondrán claramente de manifiesto a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos aunque indican formas de realización preferidas de la invención, se proporcionan únicamente a título ilustrativo.

Breve descripción de los dibujos

La invención se describirá a continuación en relación con los dibujos en los que:

La Figura 1 representa la secuencia nucleotídica (SEC. ID. nº: 1) y la secuencia deducida de aminoácidos (SEC. ID. nº: 2) de la proteína de fusión de la insulina (PRS-D9scFv-Klip27-MI-KDEL) de pSBS4404. La secuencia de aminoácidos predicha se presenta en código de una sola letra. La secuencia deducida de aminoácidos del péptido señal PRS está en cursiva, la secuencia deducida de aminoácidos del scFv de D9 está en negrita, la secuencia deducida de aminoácidos de la secuencia KLIP 27 está subrayada, la secuencia deducida de aminoácidos de la secuencia de mini-insulina está en cursiva y negrita y por último la secuencia de KDEL está en negrita y subrayada.

La Figura 2 representa la secuencia nucleotídica (SEC. ID. nº: 3) y la secuencia deducida de aminoácidos (SEC. ID. nº: 4) de la proteína de fusión de la insulina (OLEO-KLIP8-KLIP27-MI) de pSBS4405. La secuencia de aminoácidos predicha se presentan en código de una sola letra. La secuencia deducida de aminoácidos de la oleosina de 18 kDa de Arabidopsis thaliana está en cursiva, la secuencia deducida de aminoácidos de la secuencia de KLIP8 está en negrita, la secuencia deducida de aminoácidos de la secuencia KLIP 27 está subrayada y la secuencia deducida de aminoácidos de la secuencia de mini-insulina está en cursiva y negrita.

La Figura 3 representa la secuencia nucleotídica completa (SEC. ID. nº: 5) y la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. nº: 6) de la proteína de fusión de la insulina 4414 (PRS-MI-enlazador tetrabásico-D9Scfv-KDEL). La secuencia de aminoácidos predicha se presenta en código de una sola letra. La secuencia de aminoácidos deducida del péptido señal PRS está en cursiva, la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de mini-insulina (B30 tetrabásica) está en cursiva, la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia del enlazador tetrabásico está subrayada, la secuencia de aminoácidos del scFv de D9 está en cursiva y negrita y por último la secuencia de KDEL está en negrita y subrayada.

Las Figuras 4 (A-D) representan la expresión recombinante de las proteínas de fusión de insulina en las estirpes transformadas de Arabidopsis thaliana (4404-2, -17, -20 y 4405-4) basándose en los análisis de SDS-PAGE teñido con Coomassie e inmunotransferencia Western. Las flechas indican la posición de la migración de los polipéptidos de fusión de 38,5 kDa y 34,2 kDa, PRS-D9(scfv)-KLIP27-MIw/KDEL y OLEO-KLIP27-MI respectivamente, en condiciones reductoras. Las Figuras 4A (gel teñido con Coomassie) y 4B (correspondiente a la inmunotransferencia Western sondada con anti-insulina E2E3) representa la proteína total de la semilla natural (wt) y las estirpes transgénicas de la semilla que expresan los montajes 4404 y 4405. Las Figuras 4B (gel teñido con Coomassie) y 4D (correspondiente a la inmunotransferencia Western sondada con anti-insulina E2E3) representan la proteína del cuerpo aceitoso preparada a partir de la semilla natural y transgénica que expresa los mismos montajes 4404 y 4405. Las Figuras 4 (E-F) representan la expresión recombinante de las proteínas de fusión de la insulina en las estirpes transformadas de Arabidopsis thaliana (4419-9 y 4414-20) basándose en SDS-PAGE teñido con Coomassie y análisis de inmunotransferencia Western. Los marcadores de peso molecular (M) son de 10, 15, 25, 37, 50, 75, 100 y 150 kDa. Las referencias incluyen, hiN (patrón de insulina humana recombinante) y hProIN (patrón de proinsulina humana recombinante), separados en condiciones no reductoras.

La Figura 5 representa determinados niveles de expresión en las estirpes de la semilla T3 disponibles (4404-2, -17, -20, 4405-4, -13, -19) y las estirpes de la semilla T2 (4414-9 y -20). Los niveles de transgén y de expresión MI molar en % se determinaron basándose en la densimetría.

La Figura 6 representa el análisis por SDS-PAGE (15%) teñido con Coomassie de preparaciones de cuerpo aceitoso antes de la preparación de la elución (-OB), preparación OB después de la elución con ácido fórmico (-OB') y el material eluido concentrado (-E). La flecha indica la posición del polipéptido de fusión que migra. La referencia natural está esencialmente exenta de cualquier proteína principal después de la elución mientras que el material concentrado 4404 contiene la proteína de fusión, algunos productos truncados (proteína de fusión hidrolizada posible) y posiblemente algunas albúminas que eluyen conjuntamente.

La Figura 7 representa los cromatogramas que representan los tiempos de retención característicos del patrón de insulina humana en comparación con la proteína de fusión 4404 eluida y escindida con tripsina en la columna C18. El patrón hIN es el patrón de insulina humana recombinante (0,5 \mug).

La Figura 8 representa el análisis espectral de masas del patrón (A) de la insulina humana en comparación con las fracciones escindidas con tripsina y 4404 (B) purificada por HPLC recogidas entre 17,0 y 17,5 minutos.

La Figura 9 representa el análisis de SDS-PAGE (15%) teñido con Coomassie de la proteína de la semilla total extraíble y la proteína preparada del cuerpo aceitoso (OB) de las estirpes que expresan 4405 en comparación con la semilla natural (no recombinante). La flecha indica la posición del polipéptido de fusión que migra.

La Figura 10 representa los cromatogramas que representan los tiempos de retención característicos del patrón de insulina humana en comparación con las preparaciones 4405 OB escincidas con tripsina por RP-HPLC en la columna C18. El patrón hIN es el patrón de insulina humana recombinante (0,5 \mug).

La Figura 11 representa el análisis espectral de masas del patrón (A) de la insulina humana en comparación con las fracciones escindidas con tripsina y 4405 (B) purificada por HPLC recogidas entre 17,0 y 17,5 minutos.

La Figura 12 representa el cromatograma de las preparaciones del cuerpo aceitoso 4405 escindido con tripsina (línea discontinua) en comparación con el patrón de insulina humana (línea continua). Las fracciones en la insulina escindida eluida se recogieron entre 7 y 35 mS/cm y se concentraron por liofilización para el bioanálisis de la
insulina.

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La Figura 13 representa los cambios en las concentraciones de glucosa en el suero en ratones B6 macho tras la inyección de referencias negativas (círculos blancos = placebo en solución salina, círculos negros = cuerpos de aceite naturales escindidos con tripsina), referencias positivas (cuadrados blancos = Humulina R, triángulos blancos = hIN de Roche) en comparación con la insulina obtenida de plantas preparada a partir de cuerpos aceitosos 4405 (rombos negros = SBS INn DesB_{30}).

La Figura 14 representa un gel teñido con Coomassie de las proteínas del cuerpo aceitoso de dos estirpes representativas (4409-6 y 4409-8) comparando la migración de la proteína de fusión oleosina-hPIN (indicada por la flecha negra) con Arabidopsis sin transformar (wt). El nivel de expresión se determinó por densimetría para medir una media de aproximadamente 0,10% de proteína de la semilla total. Este nivel se calculó antes y después de la migración conjunta de la proteína endógena del mismo peso molecular en la semilla no transformada (wt) que constituía aproximadamente el 0,04% de la proteína de la semilla total.

Descripción detallada de la invención

Como se mencionó en la presente memoria anteriormente, la presente invención se refiere a procedimientos mejorados para la producción de insulina en plantas transgénicas. Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que concentraciones de acumulación de insulina que exceden del 0,1% de proteína celular total pueden conseguirse en plantas produciendo insulina en las semillas de las plantas por técnicas de recombinación. Estos niveles de expresión, que son por lo menos diez veces superiores a los conseguidos hasta ahora, hacen viable la producción comercial de insulina en plantas. La producción de semillas ofrece flexibilidad en el almacenamiento y transporte de la insulina como materia prima, ya que la insulina conserva su actividad en el momento de la extracción de la semilla almacenada. Además, la cantidad de biomasa que necesita ser sometida a extracción es limitada debido al contenido relativamente bajo en agua presente en las semillas vegetales.

Por consiguiente, siguiendo la presente invención se proporciona un procedimiento para la expresión de la insulina en semillas vegetales que comprende:

(iii): una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es capaz de conservar el polipéptido de insulina en el retículo endoplásmico (ER) o una vesícula de almacenamiento obtenida del ER.

(c): cultivar la célula vegetal en una planta madura capaz de fijar la semilla; en la semilla expresa la insulina; en la que el polipéptido de insulina se acumula en el retículo endoplásmico (ER) o en una vesícula de almacenamiento obtenida del ER y en la que por lo menos el 0,1% de la proteína total en la semilla es insulina; y

(d): obtener sustancialmente insulina pura de dichas semillas.

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Según la presente invención se ha descubierto sorprendentemente que la insulina se acumula en concentraciones en las semillas vegetales no conseguidas hasta ahora si la insulina se expresa en la semilla de manera que permite el secuestro del polipéptido de insulina dentro de las células de la semilla en el interior del retículo endoplásmico (ER) o en una vesícula de almacenamiento obtenida del ER.

Términos y definiciones

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tendrán el mismo significado que entiende normalmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Cuando se permita, todas las patentes, solicitudes, solicitudes publicadas y otras publicaciones, incluyendo las secuencias de ácido nucleico y de polipéptido procedentes del GenBank, SwissPro y otras bases de datos mencionadas en la descripción se incorporan como referencia en su totalidad.

La expresión "secuencia de ácido nucleico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una secuencia de monómeros nucleosídicos o nucleotídicos constituida por bases naturales, azúcares y enlaces entre azúcares (eje central). La expresión incluye también secuencias modificadas o sustituidas que comprenden monómeros artificiales o porciones de los mismos. Las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden ser secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN) o secuencias de ácido ribonucleico (ARN) y pueden incluir bases naturales que incluyen adenina, guanina, citosina, timidina y uracilo. Las secuencias pueden contener también bases modificadas. Ejemplos de dichas bases modificadas incluyen aza y deaza adenina, guanina, citosina, timidina y uracilo; y xantina e hipoxantina.

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Las expresiones "secuencia de ácido nucleico que codifica la insulina" y "secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de insulina", que pueden utilizarse indistintamente en la presente memoria, se refieren a cualquier secuencia de ácido nucleico y a todas que codifican un polipéptido de insulina, incluyendo los polipéptidos de insulina relacionados en la Tabla 1 (SEC. ID. nº: 7 a nº 145) así como algún polipéptido de insulina de mamífero y algunas secuencias de ácido nucleico que codifican la proinsulina y la preproinsulina. Tal como se utiliza en la presente memoria "proinsulina" se refiere a un polipéptido de insulina que incluye el péptido de conexión o "péptido C" que se une a las cadenas B y A del polipéptido insulina. En la insulina natural humana el péptido C es la cadena de polipéptido del resto de 31 aminoácidos que conecta el resto B30 con el resto A1. El término "preproinsulina" se refiere a una molécula de proinsulina que comprende además una secuencia señal en el terminal N que dirige la traducción para que se produzca en los ribosomas del ER. Las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de insulina incluyen además alguna y todas las secuencias de ácido nucleico que (i) codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos a las secuencias de polipétidos de insulina establecidos en la presente memoria; hibridan a cualquier secuencia de ácido nucleico publicada en la presente memoria en condiciones de hibridación por lo menos moderadamente severas o que hibridarían a éstas en condiciones por lo menos moderadamente severas menos para la utilización de codones sinónimos.

La expresión "sustancialmente idéntica" significa que dos secuencias polipeptídicas preferentemente son por lo menos 75% idénticas, y más preferentemente son por lo menos 85% idénticas y aún más preferentemente por lo menos 95% idénticas, por ejemplo 96%, 97%, 98% o 99% idénticas. Con objeto de determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias polipeptídicas las secuencias de aminoácidos de dichas dos secuencias se alinean, utilizando preferentemente el algoritmo Clustal W (Thompson, JD, Higgins DG, Gibson TJ, 1994, Nucleic Acids Res. 22(22):4673-4680, junto con la matriz de puntuación BLOSUM 62 (Henikoff S. y Henikoff J.G., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) y una penalización por apertura de hueco de 10 y una penalización por extensión del hueco de 0,1, de modo que se obtiene la igualdad de orden superior entre dos secuencias en las que por lo menos el 50% de la longitud total de una de las secuencias está implicada en la alineación. Otros procedimientos que pueden utilizarse para alinear las secuencias son el procedimiento de alineación de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol., 1970, 48: 443), revisado por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2: 482) de modo que se obtiene la igualdad de orden superior entre las dos secuencias y el número de aminoácidos idéntico se determina entre las dos secuencias. Otros procedimientos para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos están reconocidos en la técnica generalmente e incluyen, por ejemplo, los descritos por Carillo y Lipton (SIAM J. Applied Math., 1988, 48:1073) y los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, e.d. Oxford University Press, Nueva York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projects. En general, se emplearán programas informáticos para dichos cálculos. Los programas informáticos que pueden utilizarse a este respecto incluyen, pero no se limitan a, GCG (Devereux et al., Nucleic Acids Res., 1984, 12: 387) BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul et al., J. Molec. Biol., 1990: 215: 403).

Las expresiones "Condiciones de hibridación por lo menos moderadamente severas" significa que se seleccionan condiciones que favorecen la hibridación selectiva entre dos moléculas de ácido nucleico complementarias en solución. La hibridación puede producirse en toda o una parte de una molécula de la secuencia del ácido nucleico. La parte de hibridación es por lo general por lo menos de 15 (por ejemplo, 20, 25, 30, 40 ó 50) nucleótidos de longitud. Los expertos en la materia reconocerán que la estabilidad de un ácido nucleico bicatenario, o los híbridos, se determina mediante la T_{m}, que en los tampones que contienen sodio es una función de la concentración de ión sodio y de la temperatura (T_{m} = 81,5ºC - 16,6 (log_{10}[Na^{+}]) + 0,41 (%(G+C) - 600/1) o ecuación similar). Por consiguiente, los parámetros en condiciones de lavado que determinan la estabilidad del híbrido son la concentración del ión sodio y la temperatura. Con el objetivo de identificar moléculas que son similares, pero no idénticas, a una molécula de ácido nucleico conocida puede suponerse que una incompatibilidad del 1% se produce en aproximadamente una disminución de 1ºC en T_{m}, por ejemplo si se pretende que las moléculas de ácido nucleico tengan una identidad >95%, la temperatura final del lavado se reducirá en aproximadamente 5ºC. Basándose en estas consideraciones los expertos en la materia podrán seleccionar fácilmente condiciones de hibridación apropiadas. En las formas de realización preferidas, se seleccionan condiciones de hibridación severas. A título de ejemplo pueden emplearse las condiciones siguientes para conseguir la hibridación severa: hibridación a 5x cloruro sódico/citrato sódico (SSC)/5 \times solución Denhardt/SDS al 1,0% a T_{m} -5ºC basándose en la ecuación anterior, seguido de un lavado de 0,2 \times SSC/SDS al 0,1% a 60ºC. Las condiciones de hibridación moderadamente severas incluyen una etapa de lavado en 3 \times SSC a 42ºC. Se entiende sin embargo que pueden conseguirse severidades equivalentes utilizando tampones, sales y temperaturas alternativos. Las directrices adicionales con respecto a las condiciones de hibridación pueden encontrarse en: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1-6.3.6 y en: Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, vol. 3.

Tal como se utiliza en la presente memoria la terminología "insulina" y "polipéptido de insulina", que puede utilizarse indistintamente en la presente memoria, se refiere a cualquier y a todos los polipéptidos de insulina incluyendo los polipéptidos de insulina relacionados en la Tabla 1 (SEC. ID. nº: 7 a nº 145) así como a una molécula de polipéptido que comprende una secuencia de restos de aminoácidos que es (i) sustancialmente idéntica a las secuencias de aminoácidos que constituyen cualquiera de los polipéptidos de indulina publicados en la presente memoria o (ii) codificados por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse en por lo menos las condiciones moderadamente severas para cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica la insulina publicada en la presente memoria pero para la utilización de codones sinónimos. La terminología insulina y polipéptido de insulina incluye los polipéptidos proinsulina y los polipéptidos mini-insulina. El polipéptido insulina es preferentemente de origen humano, porcino o bovino.

La expresión "polipéptido capaz de conservar el polipéptido de insulina dentro de un compartimento intracelular contenido en la membrana" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier polipéptido, que cuando se une a un polipéptido de insulina, es capaz de secuestrar el polipéptido de insulina en una estructura subcelular rodeada por una membrana y situada dentro del espacio intracelular de la célula vegetal tal como está definido por la membrana plasmática de la célula vegetal.

La expresión "polipéptido capaz de conservar el polipéptido de insulina en el ER o en una vesícula de almacenamiento obtenida del ER" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier polipéptido, que cuando se une a un polipéptido de insulina es capaz de secuestrar el polipéptido de insulina en el retículo endoplásmico o en el compartimento de almacenamiento que procede de un retículo endoplásmico, tal como por ejemplo un cuerpo aceitoso, dentro de una célula vegetal.

La expresión "cuerpo aceitoso" o "cuerpos aceitosos" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier aceite u orgánulo de almacenamiento de grasa en una célula de la semilla de la planta (descrita en, por ejemplo: Huang (1992) Ann. Rev. Plant Mol. Biol. 43: 177-200).

El término "híbrido" tal como se utiliza en la presente memoria en el contexto de las secuencias de ácido nucleico se refiere a por lo menos dos secuencias de ácido nucleico unidas que no están conectadas de manera natural. Las secuencias de ácido nucleico híbrido incluyen secuencias de ácido nucleico unidas de diferentes orígenes naturales. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que constituye un activador vegetal unido a una secuencia de ácido nucleico que codifica una insulina humana se considera híbrida. Las secuencias de ácido nucleico híbridas también pueden comprender secuencias de ácido nucleico del mismo origen natural, con la condición de que no estén unidas de manera natural. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que constituye un activador obtenido de un tipo de célula determinado puede estar unida a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido obtenido del mismo tipo de célula, pero no unido normalmente a la secuencia de ácido nucleico que constituye el activador. Las secuencias de ácido nucleico híbridas incluyen también secuencias de ácido nucleico que comprenden cualquier secuencia de ácido nucleico natural unida a cualquier secuencia de ácido nucleico artificial.

Preparación de vectores de expresión recombinante que comprenden secuencias de ácido nucleico híbridas que codifican la insulina y un activador capaz de controlar la expresión en una célula de semilla vegetal

Las secuencias de ácido nucleico que codifican la insulina que pueden utilizarse según los procedimientos y las composiciones proporcionadas en la presente memoria pueden ser cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique un polipéptido de insulina, incluyendo cualquier proinsulina y preproinsulina.

Las secuencias de ácido nucleico a título de ejemplo que codifican la insulina son bien conocidos en la técnica y generalmente están disponibles fácilmente en una diversa variedad de fuentes de mamífero incluyendo la humana (Bell, G.I. et al., 1980, Nature 284:26-32), la porcina (Chance, R.E. et al., 1968, Science 161:165-167), la bovina (D'Agostino, J. et al., 1987, Mol. Endocrinol. 1:327-331), la ovina (Peterson, J.D. et al., 1972, Biol. Chem. 247:4866-4871) y similares, así como de fuentes vegetales (Oliveira, A.E.A. et al., 1999, Protein Pept. Lett. 6:15-21). Las secuencias que codifican la insulina que pueden utilizarse incluyen aquellas que codifican cadenas de polipéptido publicadas como SEC. ID. nº: 7 a SEC. ID. nº: 145. Las respectivas secuencias de ácido nucleico correspondientes que codifican las cadenas del polipéptido insulina pueden identificarse fácilmente mediante numerosos identificadores de Swiss Protein proporcionados en la Tabla 1. Utilizando estas secuencias de ácido nucleico, la nueva insulina adicional que codifica secuencias de ácido nucleico puede identificarse fácilmente utilizando técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo pueden cribarse bancos, tal como bancos de expresión, bancos de ADNc y genómicos, y pueden investigarse secuencias similares en las bases de datos que contienen la información de la secuencia de proyectos de secuenciado. Pueden utilizarse procedimientos alternativos para aislar secuencias de ácido nucleico adicionales que codifican polipéptidos de insulina, y pueden descubrirse nuevas secuencias y utilizarse según la presente invención. En las formas de realización preferidas las secuencias de ácido nucleico que codifican la insulina son de insulina humana, porcina y bovina.

Se conocen numerosos análogos de insulina en la técnica anterior (véase por ejemplo las patente US nº 5.461.031; nº 5.474.978; nº 5.164.366 y nº 5.008.241) y pueden utilizarse según la presente invención. Los análogos que pueden utilizarse en la presente invención incluyen moléculas de insulina humana en las que el resto 28 de aminoácido de la cadena B (B28) se ha cambiado en su resto de prolina natural en aspartato, lisina o isoleucina. En otra forma de realización el resto de lisina en B29 se modifica por una prolina. Además, la asparagina en A21 puede cambiarse con alanina, glutamina, glutamato, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, serina, treonina, triptófano, tirosina o valina. Asimismo, la asparagina en B3 puede modificarse a lisina. Ejemplos adicional de análogos de insulina que pueden utilizarse en la presente memoria incluyen: la insulina humana que carece del resto B30, también denominado frecuentemente "desB30" o "B(1-29)"; aquellos que carecen de los últimos 3 restos de aminoácidos de insulina "B(1-27)"; moléculas de insulina que carecen del resto de fenilalanina en B1; y análogos en los que la cadena A o la cadena B tiene una prolongación del terminal N o del terminal C, por ejemplo la cadena B puede extenderse en el terminal N mediante la adición de dos restos de arginina.

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En las formas de realización preferidas, la secuencia de ácido nucleico que codifica la insulina que se utiliza es la proinsulina. En más formas de realización preferidas se utilizan moléculas de la secuencia de ácido nucleico que codifica la insulina en las que el péptido C ha sido modificado con respecto a su forma natural. Los restos de aminoácido en el péptido C pueden sustituirse y el péptido C puede alargarse o acortarse. A este respecto, tal como se utiliza en la presente memoria el término "mini-insulina" se refiere a un polipéptido de insulina que se ha modificado de modo que el péptido C se ha cortado en longitud con respecto a su forma natural. En las formas de realización preferidas se utiliza una mini-insulina. Preferentemente el péptido C de una molécula de mini-insulina será más corto que los restos de 20 aminoácidos, más preferentemente más corto que los restos de 15 aminoácidos y aún más preferentemente más corto que los restos de 9 aminoácidos, por ejemplo 7, 5 ó 3 restos. Preferentemente, como es el caso con las moléculas de insulina natural, el péptido C de mini-insulina comprenderá un punto de escisión en sus terminales C y N. Dichos puntos de escisión pueden ser cualquier punto conveniente conocido en la técnica, por ejemplo metionina, escindible por bromuro de cianógeno, un resto básico individual o un par de restos básicos, escindibles por tripsina o tripsinas similares a proteasas o por una carboxi-peptidasa. Por ejemplo, el péptido C puede comprender una lisina con terminal C, por ejemplo Ala-Ala-Lys (SEC. ID. nº: 146), o un punto de tratamiento dibásico inmediatamente antes del resto GlyA1, por ejemplo Asn-Lys-Arg (SEC. ID. nº: 147), o Arg-Arg-Lys-Gln-Lys-Arg (SEC. ID. nº: 148) o un punto de tratamiento tetrabásico inmediatamente antes del resto Gly A1, por ejemplo Arg-Arg-Lys-Arg (SEC. ID. nº: 149). Por consiguiente las moléculas de mini-insulina que pueden utilizarse según la presente invención incluyen:

B(1-29/30)-X_{1}-X_{2}-X_{3}-Y_{1} A(1-21)

en la que

X_{1} es cualquier aminoácido;

X_{2} es cualquier aminoácido;

X_{3} es Lys o Arg;

Y_{1} es un enlace peptídico o restos de 1 a 17 aminoácidos;

B(1-29/30) es la cadena B de la insulina humana, cadena B que contiene los restos de aminoácido 1 a 29 ó 1 a 30; y

A(1-21) es la cadena A de la insulina humana, cadena A que contiene los restos de aminoácidos 1 a 21.

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En una forma de realización preferida, X_{1} es un resto de aminoácido básico (Lys o Arg) e Y_{1} es un enlace peptídico o los restos de aminoácidos 1 a 17 donde el resto del terminal C es un resto de aminoácido básico (Lys o Arg).

Además, las moléculas de mini-insulina que pueden utilizarse en la presente memoria comprenden aquellas que pueden estar representadas por la fórmula:

B(1-27)-X_{2}-X_{3}-X_{1}-Y-A(1-21)

en la que

X_{1} es un péptido de los restos de aminoácidos 1 a 8 que comprende por lo menos un resto de aminoácido aromático;

X_{2} es uno de entre Pro, Asp, Lys o Ile en la posición 28 de la cadena B;

X_{3} es uno de entre Pro, Lys, Ala, Arg o Pro-Thr en la posición 29 de la cadena B;

Y es Lys o Arg;

B(1-27) es la cadena B de la insulina humana, cadena B que contiene los restos de aminoácido 1 a 27; y

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Ejemplos adicionales de las moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de mini-insulina que pueden utilizarse según la presente invención incluyen los descritos en: Markussen et al., Walter de Gruyter & Co. 1987, en: Peptide págs. 189-194; Thim et al., 1989, en: Genetics and molecular biology of industrial microorganisms, American Society for Microbiology págs. 322-328; y los publicados en las patentes US nº 4.916.212; nº 5.324.641 y nº 6.521.738. Las alteraciones a la secuencia de ácido nucleico que codifica la insulina para preparar análogos de insulina pueden hacerse utilizando una variedad de técnicas de modificación de ácido nucleico conocidos por los expertos en la materia. Incluyendo por ejemplo la mutagénesis dirigida al sitio, la mutagénesis dirigida, la mutagénesis aleatoria, la adición de disolventes orgánicos, la recomposición génica o una combinación de éstas y otras técnicas conocidas por los expertos en la materia (Shraishi et al., 1988, Arch. Biochem. Biophys. 358: 104-115; Galkin et al., 1997, Protein Eng. 10: 687-690; Carugo et al., 1997, Proteins 28: 10-28; Hurley et al., 1996, Biochem. 35: 5670-5678; Holmberg et al., 1999, Protein Eng. 12: 851-856).

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Según la presente invención se ha descubierto sorprendentemente que la insulina se acumula en niveles en las semillas de la planta hasta ahora no conseguido si la insulina se expresa en semillas, de tal manera que el polipéptido de insulina en el interior de las células de la semilla está secuestrado en el ER o en una vesícula de almacenamiento obtenida del ER. Para conseguir dicho secuestro de insulina en el ER o en una vesícula de almacenamiento obtenida del ER, según la presente invención, el polipéptido que codifica la insulina se une a un polipéptido que produce el polipéptido de insulina que ha de retenerse en el ER o una vesícula de almacenamiento obtenida de ER en lugar de ser transportado fuera del ER, por ejemplo, al apoplasto. Los polipéptidos que pueden utilizarse según la presente invención para conservar el polipéptido de insulina en el ER incluyen cualquier polipéptido capaz de secuestrar la insulina en el ER. Tales polipéptidos pueden sintetizarse u obtenerse de cualquier fuente biológica. En una forma de realización preferida de la presente invención, el polipéptido que es capaz de conservar la insulina es un polipéptido que comprende un motivo de retención de ER en el terminal C. Ejemplos de dichos motivos de retención del ER en el terminal C incluyen las secuencias KDEL, HDEL, DDEL, ADEL y SDEL (SEC. ID. nº: 150 a 154 respectivamente). Otros ejemplos incluyen HDEF (SEC. ID. nº: 155) (Lehmann et al., 2001, Plant Physiol. 127(2): 436-49), o dos restos de arginina cierran el terminal N situado en las posiciones 2 y 3, 3 y 4 ó 4 y 5 (resumen de Plant Biology 2001 Program, ASPB, julio de 2001, Providence, Rhode Island, US). Las secuencias de ácido nucleico que codifican un motivo de retención de ER en el terminal C están unidas preferentemente a las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de insulina de tal manera que el polipéptido capaz de conservar la insulina en el ER está unido al extremo del terminal C del polipéptido de insulina.

Para conseguir el secuestro del polipéptido de insulina en una vesícula de almacenamiento obtenida del ER, el polipéptido de insulina se une a un polipéptido que es capaz de conservar el polipéptido de insulina en una vesícula de almacenamiento obtenida del ER. El polipéptido capaz de retomar el polipéptido de insulina en una vesícula de almacenamiento obtenida de ER que puede utilizarse según los procedimientos en la presente memoria puede ser cualquier polipéptido capaz de secuestrar el polipéptido de insulina en una vesícula de almacenamiento obtenida del ER. Los polipéptidos capaces de conservar la insulina en una vesícula de almacenamiento obtenida del ER pueden sintetizarse u obtenerse de cualquier fuente biológica. En una forma de realización preferida la vesícula de almacenamiento obtenida del ER es un cuerpo aceitoso y el polipéptido de insulina está unido a una proteína de cuerpo aceitoso o a una porción suficiente de la misma capaz de conservar el polipéptido de insulina en la vesícula de almacenamiento obtenida del ER. Las proteínas del cuerpo aceitoso que pueden utilizarse a este respecto incluyen cualquier proteína que se asocie de forma natural con un cuerpo aceitoso. Las proteínas del cuerpo aceitoso que son especialmente preferidas son las oleosinas, por ejemplo una oleosina de Arabidopsis (van Rooijen et al. (1991) Plant Mol. Biol. 18: 1177-1179), la oleosina del maíz (Bowman-Vance et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 11275-11279; Qu et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 2238-2243), la oleosina de la zanahoria (Hatzopoulos et al. (1990) Plant Cell 2: 457-457) o la oleosina de hortalizas del género Brassica (Lee et al., 1991, Plant Physiol. 96: 1395-1397), las caleosinas, véase por ejemplo el número de registro del Genbank AF067857) y las esteroleosinas (Lin et al., 2002 Plant Physiol. 128(4):1200-11). En una forma de realización más preferida, la proteína del cuerpo aceitoso es una oleosina vegetal y comparte similitud de secuencia con otras oleosinas vegetales tales como la oleosina aislada de Arabidopsis thaliana (SEC. ID. nº: 156) o Brassica napus (SEC. ID. nº: 157). En otra forma de realización, la proteína del cuerpo aceitoso es una caleosina o una proteína que se une al calcio procedente de plantas, hongos u otras fuentes y comparte homología de secuencia con las caleosinas vegetales tal como la caleosina aislada de Arabidopsis thaliana (SEC. ID. nº: 158 y SEC. ID. nº: 159). En otra forma de realización la proteína del cuerpo aceitoso es una esteroleosina (SEC. ID. nº: 160), un esterol que se une a la deshidrogenasa (Lin L-J et al. (2002) Plant. Physiol. 128: 1200-1211). El polipéptido que codifica la insulina puede estar unido a la proteína del cuerpo aceitoso en el terminal N así como al terminal C y a fragmentos de una proteína de cuerpo aceitoso, tal como por ejemplo el dominio central de una oleosina. Pueden descubrirse nuevas proteínas de cuerpo aceitoso por ejemplo preparando aceites corporales (para metodologías para preparar aceites corporales véase por ejemplo la patente US nº 6.650.554) e identificar proteínas en preparaciones de cuerpo aceitoso mediante por ejemplo electroforesis en gel SDS. Pueden construirse anticuerpos policlonales contra estas proteínas y utilizarse para cribar bancos de ADNc con objeto de identificar secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de cuerpo aceitoso. Pueden descubrirse además nuevas proteínas de cuerpo aceitoso utilizando secuencias conocidas de ácido nucleico que codifican proteínas de cuerpo aceitoso, utilizando por ejemplo las secuencias de proteína de cuerpo aceitoso mencionadas anteriormente en la presente memoria que codifican proteínas de cuerpo aceitoso, sondar por ejemplo ADNc o la presencia de proteínas de cuerpo aceitoso en bancos genómicos.

Los polipéptidos capaces de conservar la insulina en el ER o en un orgánulo de almacenamiento obtenido del ER no están por lo general escindidos y la insulina puede acumularse en forma de una proteína de fusión, que es, por ejemplo, por lo general el caso cuando se utiliza una señal de retención de KDEL para conservar el polipéptido en el ER o cuando se utiliza una proteína de cuerpo aceitoso para conservar el polipéptido en un orgánulo de almacenamiento obtenido de ER.

La secuencia de ácido nucleico híbrida puede contener además una secuencia nucleica que dirige la secuencia de ácido nucleico al sistema endomembranario ("péptido señal"). En las formas de realización de la presente invención en las que el polipéptido de insulina se conserva en el ER utilizando una secuencia capaz de conservar el polipéptido en el ER, tal como el polipéptido KDEL, HDEL o SDEL, es particularmente deseable que incluya una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal. Los péptidos señal a título de ejemplo que pueden utilizarse en la presente memoria incluyen la secuencia señal de la proteína relacionada con la patogénesis del tabaco (PR-S) (SEC. ID. nº: 161) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8:217-221), la secuencia señal de lectinas (Boehn et al., 2000, Transgenic Res., 9(6):477-86), la secuencia señal de la glucoproteína rica en hidroxiprolina de Phaseolus vulgaris (Yan et al., 1997, Plant Physiol. 115(3):915-24 y Corbin et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7(12):4337-44), la secuencia señal de la patatina de la patata (Iturriaga, G. et al., 1989, Plant Cell 1:381-390 y Bevan et al., 1986, Nucleic Acids Res. 41:4625-4638) y la secuencia señal de la alfa amilasa de la cebada (Rasmussen y Johansson, 1992, Plant Mol. Biol. 18(2):423-7). Dichas señales de dirección pueden escindirse in vivo de la secuencia de insulina, por ejemplo es por lo general el caso cuando se utiliza una señal de dirección del apoplasto, tal como la secuencia señal de la proteína S relacionada con la patogénesis del tabaco (PR-S) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8:217-221). Pueden predecirse otros péptidos señal utilizando el servidor SignalP World Wide Web (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) que predice la presencia y posición de las zonas de escisión del péptido señal en las secuencias de aminoácidos de diferentes organismos. En general existe poca conservación de la secuencia de aminoácidos primaria aunque las propiedades fisicoquímicas generales se conservan en alguna medida. La estructura genérica de los péptidos señal tiene 3 zonas, la "zona n" del terminal amino corta contiene restos con carga positiva, la "zona h" hidrófoba central oscila en tamaño de 7 a 15 aminoácidos y la "zona c" del terminal carboxi contiene aminoácidos polares y una zona de escisión que es reconocida por las enzimas peptidasa con señal unida a la membrana (Nakai K., 2000, Advances in Protein Chem. 54: 277-344). Una señal de dirección que también puede utilizarse según la presente memoria incluye la secuencia señal de insulina natural (24 aminoácidos de longitud en el caso de la secuencia humana). En formas de realización preferidas de la presente memoria una secuencia de dirección de apoplasto situada en el terminal N, tal como la secuencia PR-S del tabaco mencionada anteriormente en la presente memoria se utiliza combinada con una secuencia de retención de ER situada en el terminal C tal como la secuencia KDEL.

En una forma de realización más preferida, una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia principal del factor \alpha de levadura está unida al extremo del terminal N de la secuencia de ácido nucleico que codifica la insulina. Las secuencias principales de levadura o las secuencias obtenidas a partir de las secuencias principales de levadura que pueden utilizarse según la presente invención incluyen las listadas en la SEC. ID. nº: 162 a la SEC. ID. nº: 171 (Kjeldsen et al., 2001, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 18: 89-121). Dichas secuencias principales pueden comprender además un péptido espaciador situado en el terminal C del ácido nucleico que codifica la secuencia líder y el terminal N de la secuencia que codifica la insulina. Según la presente memoria dichas secuencias espaciadoras por lo general tienen entre 2 y 20 aminoácidos de longitud. Por lo tanto pueden utilizarse, por ejemplo, las secuencias espaciadoras SEC. ID. nº: 172 y SEC. ID. nº: 173 (Kjeldsen et al., 2001, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 18: 89-121). En las formas de realización de la presente invención en las que se utiliza una secuencia principal de levadura, la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de insulina es preferentemente un polipéptido de mini-insulina. Según la presente memoria, en una forma de realización especialmente preferida se utiliza una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo monocatenario unido a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido principal de secreción de levadura, como se describe con más detalle en el Ejemplo 1 de la presente memoria.

La secuencia de ácido nucleico híbrido puede también comprender polipéptidos que producen extensiones de la proteína estabilizada con terminal N y/o C. dichas extensiones pueden utilizarse para estabilizar y/o ayudar al plegamiento de la cadena polipeptídica de insulina y además pueden utilizarse para facilitar la purificación de la insulina. Las extensiones del polipéptido que pueden utilizarse a este respecto incluyen por ejemplo una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo monocatenario, un ácido nucleico que codifica una molécula Affibody® (Affibody AB), una secuencia de ácido nucleico que codifica la subunidad B no tóxica de la toxina del cólera (CTB) (Arakawa, T. et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16:938) o combinaciones de dichos polipéptidos. En una forma de realización particularmente preferida, el polipéptido de insulina se conserva en un compartimento contenido en la membrana, tal como el ER, utilizando por ejemplo una secuencia de KDEL como se describió anteriormente en la presente memoria, combinada con un polipéptido estabilizador que permite la asociación del polipéptido de insulina con un cuerpo aceitoso en el momento de la rotura de la integridad de la célula vegetal tal como ocurrirá cuando el polipéptido de insulina se recupere de la célula vegetal. Un ejemplo de dicho polipéptido estabilizador es un anticuerpo monocatenario con especificidad para un cuerpo aceitoso. Las secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos monocatenarios con especificidad para un cuerpo aceitoso pueden prepararse a partir de estirpes celulares de hibridoma que expresan anticuerpos monoclonales construidos contra una proteína del cuerpo aceitoso. En una forma de realización, el anticuerpo monocatenario se une específicamente a una oleosina, tal como describe Alting-Mees et al. (2000) IBC's International Conference on Antibody Engineering, poster nº 1. Esta forma de realización de la presente invención se detalla más en el Ejemplo 1 de la presente memoria.

En una forma de realización adicional, una zona de escisión puede estar situada corriente arriba del terminal N y corriente abajo del terminal C de la insulina que permite al polipéptido de insulina escindirse del acompañante de la fusión, obteniendo de este modo insulina aislada. Ejemplos de dichas zonas de escisión pueden encontrarse en el documento WO 98/49326 (procedimiento para la escisión de proteínas de fusión) y las aplicaciones relacionadas y LaVallie et al. (1994) Enzymatic and Chemicals cleavage of fusion proteins in Current Protocols in Molecular Biology págs. 16.4.5-16.4.17, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York NY. En una forma de realización preferida, la zona de escisión es un enlazador tetrabásico (por ejemplo Arg-Arg-Lys-Arg- SEC. ID. nº: 149) que es escindible por la tripsina. En una forma de realización más preferida, la zona de escisión es KLLP 8 (SEC. ID. nº: 174) que es escindible por las proteasas aspárticas incluyendo la quimiosina.

La invención proporciona además procedimientos para la separación de proteínas heterólogas de componentes de la célula hospedadora por partición de la fracción del cuerpo aceitoso y posterior liberación de la proteína heteróloga por escisión específica de la fusión de la proteína heteróloga con la proteína del cuerpo aceitoso. Opcionalmente puede localizarse una zona de escisión corriente arriba del terminal N y corriente abajo del terminal C del polipéptido heterólogo que permite escindirse al polipéptido de fusión y separarse por separación de fases en sus péptidos componentes.

La secuencia de ácido nucleico que codifica la insulina puede alterarse, para mejorar más los niveles de expresión, por ejemplo, optimizando la secuencia de ácido nucleico según la utilización del código preferida para un determinado tipo de célula vegetal que se selecciona para la expresión del polipéptido de insulina o alterando los motivos conocidos para estabilizar los ARNm (véase por ejemplo: la solicitud de patente PCT 97/02352). La comparación de la utilización del código de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de insulina con la utilización del codón del tipo de célula vegetal permitirá la identificación de codones que pueden cambiarse. La construcción de genes sintéticos alterando la utilización del codón se describe por ejemplo en la Solicitud de Patente PCT 93/07278.

En una forma de realización preferida, la secuencia de ácido nucleico que codifica la insulina que se utiliza está representada por la SEC. ID. nº: 1, SEC. ID. nº: 3, SEC. ID. nº: 5 o SEC. ID. nº: 195.

En la presente memoria se dan a conocer activadores obtenidos de plantas capaces de controlar la expresión de los polipéptidos en plantas. Generalmente, los activadores obtenidos de especies de plantas dicotiledóneas se utilizarán cuando una planta dicotiledónea se seleccione según la presente invención, mientras que un activador de planta monocotiledónea se utilizará cuando se seleccione una especie de planta monocotiledónea. Los activadores constitutivos que incluyen, por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor 35S (CaMV) (Rothstein et al., 1987 Gene 53: 153-161), el activador de la actina del arroz (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2: 163-171; patente US nº 6.429.357), un activador de ubiquitina, tal como el activador de la ubiquitina del maíz (patente US nº 5.879.903; nº 5.273.894) y el activador de la ubiquitina de la cebada (Kawalleck, P. et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21:673-684 se dan a conocer en la presente memoria.

El activador que se utiliza en el procedimiento de la presente invención es un activador que produce la expresión preferencial del polipéptido de insulina en el tejido de la semilla. "Activadores de la semilla preferida" a este respecto son los activadores que controlan la expresión de una proteína recombinante (es decir, la insulina) de modo que preferentemente por lo menos el 80% de la cantidad total de proteína recombinante presente en la planta madura está presente en la semilla. Más preferentemente por lo menos el 90% de la cantidad total de proteína recombinante presente en la planta madura está presente en la semilla. Aún más preferentemente por lo menos el 95% de la cantidad total de proteína recombinante presente en la planta madura está presente en la semilla. Los activadores de la semilla preferida que pueden utilizarse a este respecto incluyen, por ejemplo, el activador de la faseolina de la alubia (Sengupta-Gopalan et al. 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3320-3324); el activador de la oleosina de Arabidopsis de 18 kDa (patente US nº 5.792.922) o el activador de la oleosina del lino (documento WO 01/16340); el activador de la proteína (linina) de almacenamiento de la semilla semejante a la leguminina del lino (documento WO 01/16340); el activador de la proteína de almacenamiento 2S del lino (documento WO 01/16340); un activador preferido de endosperma tal como el activador Amy32b (Rogers y Milliman, J. Biol. Chem., 1984, 259: 12234-12240, el activador de Amy6-4 (Kursheed y Rogers, J. Biol. Chem., 1988, 263: 18953-18960 o el activador de aleuraína (Whittier et al., 1987, Nucleic Acids Res., 15: 2515-2535) o el activador de la arcelina de la alubia (Jaeger GD, et al., 2002, Nat. Biotechnol. Dec., 20: 1265-8). Nuevos activadores útiles en varias plantas están descubriéndose constantemente. Numerosos ejemplos de activadores vegetales pueden encontrarse en Ohamuro et al. (Biochem. Of Plnts., 1989,
15: 1-82).

Determinados elementos genéticos capaces de aumentar la expresión del polipéptido de insulina pueden utilizarse en la presente memoria. Estos elementos incluyen las secuencias principales no traducidas de determinados virus, tal como la secuencia principal de AMV (Jobling y Gehrke, 1987, Nature, 325: 622-625) y el intrón asociado al activador de ubiquitina del maíz (patente US nº 5.504.200). Generalmente la secuencia híbrida de ácido nucleico puede prepararse de modo que los elementos genéticos capaces de aumentar la expresión estarán situados 5' de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido insulina.

Según la presente invención las secuencias de ácido nucleico híbrido que comprenden un activador capaz de controlar la expresión en semillas de plantas, unidas a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de insulina pueden integrarse en un vector de expresión recombinante que asegura buena expresión en la célula de la semilla. Un vector de expresión recombinante que comprende en la dirección 5' a 3' de transcripción como componentes unidos de manera funcional:

(i): una secuencia de ácido nucleico capaz de controlar la expresión en células de semilla vegetales; y

(ii): una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de insulina;

en la que el vector de expresión es adecuado para la expresión en una célula de semilla se da a conocer en la presente memoria.

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La expresión "adecuada para la expresión en una célula de semilla" significa que el vector de expresión recombinante comprende la secuencia de ácido nucleico híbrido de la presente invención unida a los elementos genéticos requeridos para conseguir la expresión en una célula de semilla. Los elementos genéticos que pueden incluirse en el vector de expresión a este respecto incluyen una zona de terminación de la transcripción, una o más secuencias de ácido nucleico que codifican los genes marcadores, uno o más orígenes de replicación y similares. En las formas de realización preferidas, el vector de expresión comprende además elementos genéticos requeridos para la integración del vector o una porción de los mismos en el genoma nuclear de la célula vegetal, por ejemplo el T-ADN izquierdo y las secuencias del límite derecho que facilitan la integración en el genoma nuclear de la planta en las formas de realización de la invención en la que las células vegetales se transforman utilizando Agrobacterium.

Tal como se mencionó anteriormente en la presente memoria, el vector de expresión recombinante comprende generalmente un terminador de la transcripción que sirve además como señal para la terminación de la transcripción puede servir además como elemento protector capaz de ampliar la vida media del ARNm (Guarneros et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 238-242). El terminador de la transcripción tiene generalmente desde aproximadamente 200 nucleótidos a aproximadamente 1.000 nucleótidos y el vector de expresión se prepara de modo que el terminador de la transcripción esté situado en 3' de la secuencia de ácido nucleico que codifica la insulina. Las secuencias de terminación que pueden utilizarse en la presente memoria incluyen, por ejemplo, la zona de terminación de la nopalina (Bevan et al., 1983, Nucleic Acids Res., 11: 369-385), el terminador de la faseolina (van der Geest et al., 1994, Plant J. 6: 413-423), el terminador de la arcelina ((Jaeger GD, et al., 2002, Nat. Biotechnol. Dec., 20: 1265-8)), el terminador de los genes de la síntesis de octopina de Agrobacterium tumefaciens o de otros elementos que funcionan de manera similar. Los terminadores de la transcripción pueden obtenerse tal como describe An (An, 1987, Methods in Enzym. 153: 292).

Siguiendo la presente invención el vector de expresión puede contener además un gen marcador. Los genes marcadores que pueden utilizarse según la presente invención incluyen todos los genes que permiten la distinción de las células transformadas a partir de las células no transformadas, incluyendo todos los genes seleccionables y marcadores identificables. Un gen marcador puede ser un marcador con resistencia tal como un marcador con resistencia a antibióticos contra, por ejemplo, kanamicina (patente US nº 6.174.724), ampicilina, G418, bleomicina, higromicina que permite la selección de un rasgo por medios químicos o un marcador de tolerancia contra un agente químico, tal como el azúcar manosa normalmente citotóxico (Negrotto et al., 2000, Plant Cell Rep. 19: 798-803). Otros marcadores convenientes que pueden utilizarse en la presente memoria incluyen los marcadores capaces de transportar resistencia contra herbicidas tal como glifosato (patentes US nº 4.940.935; nº 5.188.642), fosfinotricina (patente US nº 5.879.903) o sulfonilureas (patente US nº 5.633.437). Los marcadores con resistencia, cuando se unen en íntima proximidad a una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido insulina, pueden utilizarse para mantener la presión de selección en una población de células vegetales o plantas que no han perdido la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido insulina. Los marcadores identificables que pueden emplearse para identificar transformantes por inspección visual incluyen la \beta-glucuronidasa (GUS) (patentes US nº 5.268.463 y nº 5.599.670) y la proteína verde fluorescente (GFP) (Niedz et al., 1995, Plant Cell Rep., 14: 403).

Los vectores recombinantes adecuados para la introducción de secuencias de ácido nucleico en plantas incluyen los vectores a base de Agrobacterium y Rhizobium, tal como los plásmidos Ti y Ri, incluyendo por ejemplo pBIN19 (Bevan, Nucleic Acids Res., 1984, 22: 8711-8721), pGKB5 (Bouchez et al., 1993, C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences, 316:1188-1193), la serie pCGN de vectores binarios (McBride y Summerfelt, 1990, Plant Mol. Biol., 14:269-276) y otros vectores binarios (por ejemplo la patente US nº 4.940.838).

Los vectores de expresión recombinante, las secuencias de ácido nucleico y las secuencias de ácido nucleico híbrido de la presente invención pueden prepararse según metodologías bien conocidas por los expertos en la técnica de biológica molecular. Dicha preparación implicará por lo general la especie bacteriana Escherichia coli como hospedador intermedio de clonación. La preparación de los vectores de E. coli así como los vectores de transformación de la planta pueden llevarse a cabo utilizando técnicas conocidas comúnmente tal como la digestión con restricción, ligadura, electroforesis en gel, secuenciado de ADN, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y otras metodologías. Estas metodologías permiten el enlace de secuencias de ácido nucleico y polipéptidos a los que pertenece la presente invención. Una amplia variedad de vectores de clonación está disponible para llevar a cabo las etapas necesarias requeridas para preparar un vector de expresión recombinante. Entre los vectores con un sistema de replicación funcional en E. coli, están los vectores tales como pBR322, la serie pUC de vectores, la serie M13mp de vectores, pBluescript, etc. Por lo general, estos vectores de clonación contienen un marcador que permite la selección de células transformadas. Las secuencias de ácido nucleico pueden introducirse en estos vectores, y los vectores pueden introducirse en el cultivo de E. coli en un medio apropiado. Los vectores de expresión recombinante pueden recuperarse fácilmente de las células durante la recogida y lisado de las células. Además, las directrices generales con respecto a la preparación de vectores recombinantes pueden encontrarse, por ejemplo, en: Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, vol. 3.

Preparación de plantas que comprenden semillas capaces de expresar la insulina

Según la presente invención se introduce la secuencia de ácido nucleico híbrido en una célula vegetal y las células se cultivan en plantas maduras capaces de fijar la semilla, en la que la semilla expresa el polipéptido insulina.

Según la presente memoria puede seleccionarse cualquier especie vegetal o célula vegetal. Las células específicas utilizadas en la presente memoria incluyen las células obtenibles a partir de Arabidopsis thaliana, nuez del Brasil (Betholettia excelsa); alubia de ricino (Riccinus communis); nuez de coco (Cocus nucifera); cilantro (Coriandrum sativum); algodón (Gossypium spp.); cacahuete (Arachis Hypogaea); jojoba (Simmondsia chinensis); semilla de lino/lino (Linum usitatissimum); maíz (Zea mays); mostaza (Brassica spp. y Sinapis alba); palma de aceite (Elaeis guineeis); aceituna (Olea eurpaea); colza (Brassica spp.); arroz (Oryza sativa); cártamo (Carthamus tinctorius); soja (Glycine max); calabaza (Cucurbita maxima); cebada (Hordeum vulgare), trigo (Traeticum aestivum); y girasol (Helianthus annuus).

Según esto en una forma de realización preferida se utilizan especies vegetales o células vegetales de plantas de semillas con aceite. Las plantas de semillas con aceite que pueden utilizarse en la presente memoria incluyen el cacahuete (Arachis Hypogaea); la mostaza (Brassica spp. y Sinapis alba); colza (Brassica spp.); el garbanzo (Cicer arietinum); la soja (Glycine max); el algodón (Gossypium hirsutum.); el girasol (Helianthus annuus); la lenteja (Lentil Lens culinaris); semilla de lino/lino (Linum usitatissimum); trébol blanco (Trifolium repens); aceituna (Olea eurpaea); palma de aceite (Elaeis guineesis); cártamo (Carthamus tinctorius) y los alberjones (Vicia
narbonensis).

Según la presente invención en una forma de realización particularmente preferida se utiliza cártamo, Arabidopsis o lino.

Las metodologías para introducir los vectores de expresión recombinante de la planta en una célula vegetal, denominadas también en la presente memoria "transformación", son bien conocidas en la técnica y por lo general varían dependiendo de la célula vegetal que se seleccione. Las técnicas generales para introducir vectores de expresión recombinante en las células incluyen, la electroporación; técnicas mediadas químicamente, por ejemplo la absorción de ácido nucleico mediada por CaCl_{2}; el bombardeo con partículas (biolística); la utilización de secuencias de ácido nucleico naturales infecciosas, por ejemplo las secuencias de ácido nucleico obtenidas de virus, o las secuencias obtenidas de Agrobacterium o Rhizobium, la absorción de ácido nucleico mediada por polietilenglicol (PEG), la microinyección y la utilización de barbas de carburo de silicona.

En las formas de realización preferidas, se selecciona una metodología de transformación que permitirá la integración de la secuencia del ácido nucleico híbrido en el genoma de la célula vegetal y preferentemente en el genoma nuclear de la célula vegetal. Según la presente memoria esto se considera especialmente deseable ya que la utilización de dicha metodología dará como resultado la transferencia de la secuencia de ácido nucleico híbrido en plantas con descendencia durante la reproducción sexual. Los procedimientos de transformación que pueden utilizarse a este respecto incluyen procedimientos biolísticos y mediados por Agrobacterium.

Las metodologías de transformación para las especies de plantas dicotiledóneas son bien conocidas. Generalmente, se utiliza transformación mediada por Agrobacterium debido a su gran eficacia, así como la susceptibilidad general por muchas, si no todas, especies de plantas dicotiledóneas. La transformación de Agrobacterium implica generalmente la transferencia de un vector binario, tal como uno de los vectores binarios mencionados anteriormente en la presente memoria, que comprende la secuencia de ácido nucleico híbrido de la presente invención de E. coli en una cepa adecuada de Agrobacterium (por ejemplo EHA101 y LBA4404), por ejemplo, por emparejamiento triparental con una cepa de E. coli que lleva el vector recombinante binario y una cepa de E. coli que lleva un plásmido cooperador capaz de movilizar el vector binario a la cepa diana de Agrobacterium o por transformación del ADN de la cepa de Agrobacterium (Hofgen et al., Nucleic Acids Res., 1988, 16:9877). Otras técnicas que pueden utilizarse para transformar las células de la planta dicotiledónea incluyen la biolística (Sanford, 1988, Trends in Biotech. 6:299-302); la electroporación (Fromm et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5824-5828); la absorción de ADN mediada por PEG (Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genetics, 199:169-177); la microinyección (Reich et al., Bio/Techn., 1986, 4:1001-1004); y las barbas de carburo de silicona (Kaeppler et al., 1990, Plant Cell Rep., 9:415-418) o la transformación en planta utilizando, por ejemplo, una metodología de inmersión de la flor (Clough y Bent, 1998, Plant. J.,
16:735-743).

Las especies de plantas monocotiledóneas pueden transformarse utilizando una variedad de metodologías que incluyen el bombardeo de partículas (Christou et al., 1991, Biotechn. 9:957-962; Weeks et al., Plant Physiol., 1993, 102:1077-1084; Gordon-Kamm et al., Plant Cell. 1990, 2:5603-618); la absorción de ADN mediada por PEG (patentes europeas nº 0292 435; nº 0392 225) o la transformación mediada por Agrobacterium (Goto-Fumiyuki et al., 1999 Nature-Biotech. 17:282-286).

La metodología exacta de transformación de la planta puede variar algo dependiendo de la especie vegetal y del tipo de célula vegetal (por ejemplo tipos de células obtenidas de semilleros tales como hipocótilos y cotiledones o tejido embrionario) que se selecciona como célula diana para transformación. Como se mencionó anteriormente en la presente memoria en una forma de realización particularmente preferida se utiliza cártamo, Arabidopsis o lino. Una metodología para obtener transformantes de cártamo está disponible en Baker y Dyer (Plant Cell Rep., 1996, 16:106-110). Los protocolos de la transformación específica de especies vegetales adicionales pueden encontrarse en: Biotechnology in Agriculture and Forestry 46: Transgenic Crops I (Y.P.S. Bajaj ed.), Springer-Verlag, Nueva York (1999) y Biotechnology in Agriculture and Forestry 47: Transgenic Crops II (Y.P.S. Bajaj ed.), Springer-Verlag, Nueva York (2001).

Después de la transformación, se cultivan células vegetales y durante el brote de tejido diferenciador, tales como vástagos y raíces, se regeneran las plantas maduras. Por lo general, se regenera una diversidad de plantas. Las metodologías para regenerar las plantas son generalmente especies vegetales y tipos de células dependientes y serán conocidos por los expertos en la materia. Las directrices adicionales con respecto al cultivo del tejido vegetal pueden encontrarse en, por ejemplo: Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil y Thorpe eds., Kluwer Academic Publishers; y en: Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111), 1999, Hall Eds., Humana Press.

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En un aspecto la presente invención proporciona un procedimiento de recuperación de las semillas vegetales que comprende insulina. Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento para obtener semillas vegetales que comprende insulina que comprende:

(d): obtener las semillas de dicha planta en las que la semilla comprende insulina, en la que dicho polipéptido de insulina se acumula dentro del retículo endoplásmico (ER) o en una vesícula de almacenamiento obtenida de ER y en la que por lo menos el 0,1% de la proteína total de la semilla presente en la semilla es insulina.

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En formas de realización preferidas, se obtiene una variedad de plantas transformadas, se cultiva y se identifica en una variedad de plantas transformadas la presencia de la secuencia de ácido nucleico híbrido deseada, cuya presencia en los supuestos transformantes puede ser analizada, por ejemplo, por cultivo en un medio selectivo, donde se utilizan marcadores con resistencia al herbicida, por aplicación directa del herbicida a la planta o por inmunotransferencia Southern. Si se detecta la presencia de la secuencia de ácido nucleico híbrido, pueden seleccionarse plantas transformadas para generar descendencia y por último plantas maduras que comprenden una variedad de semillas que comprenden la secuencia de ácido nucleico híbrido deseada. Dichas semillas pueden utilizarse para aislar la insulina o pueden plantarse para generar dos o más generaciones posteriores. Generalmente será deseable plantar una variedad de semillas transgénicas para obtener una población de plantas transgénicas, comprendiendo cada una semillas que comprenden una secuencia de ácido nucleico híbrido que codifica la insulina. Además, generalmente será deseable asegurar las características homocigóticas en las plantas para asegurar la herencia continuada del polipéptido recombinante. Los procedimientos para seleccionar plantas homocigóticas son bien conocidos por los expertos en la materia. Los procedimientos para obtener plantas homocigóticas que pueden utilizarse incluyen la preparación y transformación de células o tejidos haploides seguida de la regeneración de los plantones haploides y la posterior conversión a plantones diploides, por ejemplo mediante el tratamiento con colquicina u otros agentes de destrucción del microtúbulos. Las plantas pueden cultivarse según otras prácticas agrícolas convencionales.

En otro aspecto, la presente invención proporciona plantas capaces de fijar la semilla que expresa la insulina. En una forma de realización preferida de la invención, se proporciona una planta capaz de fijar la semilla que comprende una secuencia de ácido nucleico híbrido que comprende en la dirección de 5' a 3' de la transcripción:

(a): una primera secuencia de ácido nucleico que comprende un activador preferido de la semilla de manera funcional unido a;

(c): una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es capaz de conservar el polipéptido de insulina en el retículo endoplásmico (ER) o en una vesícula de almacenamiento obtenida del ER, en la que la semilla contiene insulina, en la que dicho polipéptido de insulina se acumula dentro del retículo endoplásmico (ER) o en la vesícula de almacenamiento obtenida de ER, y en la que por lo menos el 0,1% de la proteína total soluble presente en la semilla es insulina.

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En una forma de realización preferida la secuencia de ácido nucleico híbrido está integrada de forma estable en el genoma nuclear de la planta.

Incluso en otro aspecto la presente invención proporciona semillas vegetales que expresan la insulina. En una forma de realización preferida de la invención, se proporciona una semilla vegetal que comprende una secuencia de ácido nucleico híbrida que comprende en la dirección 5' a 3' de transcripción:

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Según la presente invención, se obtiene una semilla en la que preferentemente por lo menos el 0,1% de la proteína soluble total presente en la semilla es insulina. En más formas de realización preferidas de la presente invención, se obtiene una semilla en la que por lo menos el 0,2%, 0,3%, 0,5% o 1,0% de la proteína soluble total presente en la semilla es insulina. El polipéptido de insulina puede estar presente en varios tipos diferentes de células de semilla incluyendo, por ejemplo, los hipocótilos y los ejes embrionarios, incluyendo las raíces embrionarias y las hojas embrionarias, y donde las especies de plantas monocotiledóneas incluyendo cereales y maíz, se utilizan en el tejido de endosperma.

Preparación de insulina a partir de semillas vegetales

Una vez se han obtenido las semillas de la planta puede purificarse la proteína de insulina de la semilla utilizando cualquiera de las metodologías de purificación de proteínas conocidas en la técnica. Por consiguiente, un procedimiento de purificación de insulina de semillas de plantas en el que el procedimiento comprende:

(a): proporcionar un montaje de ácido nucleico híbrido que comprende la dirección 5' a 3' de la transcripción como componentes de manera funcional unidos:

(i): una secuencia de ácido nucleico capaz de controlar la expresión en las células de la semilla vegetal; y

(c): cultivar la célula vegetal en una planta madura capaz de fijar la semilla en la que la la semilla expresa la insulina;

(d): obtener la semilla que expresa la insulina; y

(e): purificar dicha insulina de la semilla, se da a conocer en la presente memoria.

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Las semillas vegetales pueden molerse utilizando cualquier procedimiento de desmenuzamiento que produzca una destrucción sustancial de la membrana celular de la semilla y de las paredes celulares. Pueden utilizarse las condiciones de la molienda tanto en seco como en húmedo (patente US nº 3.971.856; Lawhon et al., 1977, J. Am. Oil Chem. Soc., 63:533-534). El equipo de molienda adecuado a este respecto incluye molinos de coloides, molinos de disco, molinos IKA, homogeneizadores a escala industrial y similares. La selección del equipo de molienda dependerá del tipo de semilla y de los requisitos de rendimiento. El contaminante sólido de la semilla tales como cáscaras de semillas, materiales fibrosos, carbohidratos sin disolver, proteínas y otros contaminantes insolubles en agua pueden separarse de la fracción de la semilla utilizando por ejemplo metodologías basadas en la exclusión por tamaño, tales procedimientos basados en filtración o gravedad tales como la centrifugación. En las formas de realización preferidas se evita la utilización de disolventes orgánicos utilizados frecuentemente en la extracción de aceite, tal como hexano, porque dichos disolventes pueden dañar el polipéptido de insulina. Sustancialmente la insulina pura puede recuperarse de la semilla utilizando una variedad de metodologías de purificación adicionales tales como las técnicas basadas en la centrifugación; metodologías basadas en la exclusión por tamaño, incluyendo por ejemplo la ultrafiltración en membrana y la ultrafiltración en flujo cruzado; y técnicas cromatográficas incluyendo por ejemplo la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía por exclusión de tamaño, la cromatografía por afinidad, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), la cromatografía rápida líquida de proteína (FPLC), la cromatografía de interacción hidrófoba y similares. Generalmente, se utilizará una combinación de dichas técnicas para obtener insulina sustancialmente pura.

En una forma de realización particularmente preferida de la presente invención el polipéptido insulina se aísla de los contaminantes de la semilla poniendo en contacto el polipéptido insulina con cuerpos aceitosos. Este procedimiento se considera que presenta particularmente ventajas ya que permite la eliminación de los contaminantes de la semilla incluyendo las proteínas de la semilla de manera especialmente eficaz y económica. Como se mencionó en la presente memoria anteriormente dicha puesta en contacto del polipéptido insulina con los cuerpos aceitosos puede conseguirse uniendo el polipéptido insulina a una proteína de cuerpo aceitoso o uniendo el polipéptido insulina a un polipéptido con afinidad para un cuerpo aceitoso, tal como un anticuerpo monocatenario con afinidad para un cuerpo aceitoso. En la forma de realización anterior, el polipéptido insulina será secuestrado dentro de la célula en los cuerpos aceitosos y por consiguiente se purificará conjuntamente con los cuerpos aceitosos. En esta última forma de realización, en el momento en que se expresa en un compartimento intracelular contenido en la membrana tal como el ER, el polipéptido insulina se asociará al cuerpo aceitoso en el momento de la rotura de las células de la semilla durante el proceso de trituración. En la patente US nº 5.650.554 se describe un procedimiento para aislar los cuerpos aceitosos.

Pueden prepararse formulaciones farmacéuticas de insulina a partir de la insulina purificada y dichas formulaciones pueden utilizarse para tratar la diabetes. Generalmente la insulina purificada se mezclará con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en cantidades suficientes para ejercer un efecto terapéuticamente útil en ausencia de efectos secundarios indeseables en el paciente tratado. Para formular una composición de insulina, la fracción en peso de insulina se disuelve, se pone en suspensión, se dispersa o si no se mezcla en un vehículo o diluyente seleccionado a una concentración eficaz de modo que mejora la enfermedad tratada. Las formulaciones farmacéuticas de insulina se formulan preferentemente para la administración en una sola dosis. Las dosis terapéuticamente eficaces para la administración parenteral de la insulina humana son bien conocidas en la técnica. Cuando se utilizan análogos de insulina o se utilizan otros modos de administración los expertos en la materia pueden determinar en teoría fácilmente las dosis terapéuticamente eficaces utilizando protocolos de identificación conocidos o por extrapolación de los datos de ensayo in vivo o in vitro. Se entiende sin embargo que las concentraciones y dosis pueden variar según la gravedad de la enfermedad aliviada. Se entiende además que para cualquier paciente concreto, los regímenes de dosis específicos pueden ajustarse a lo largo del tiempo según el criterio individual de la persona que administra o supervisa la administración de las formulaciones.

Las soluciones o suspensiones farmacéuticas pueden incluir por ejemplo un diluyente estéril tal como, por ejemplo, agua, lactosa, sacarosa, fosfato dicálcico o carboximetilcelulosa. Los vehículos que pueden utilizarse incluyen agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, glicoles, etanol y similares, para formar de este modo una solución o suspensión. Si se desea las composiciones farmacéuticas pueden contener también sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes; agentes emulsionantes; agentes disolventes; agentes antimicrobianos, tales como el alcohol bencílico y los metil-parabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico y bisulfito sódico; agentes quelantes, tales como el ácido etilendiamintetraacético (EDTA); agentes de tamponación de pH tales como tampones de acetato, citrato o fosfato y combinaciones de los mismos.

La formulación final de preparación de la insulina dependerá generalmente del modo de administración de la insulina. La insulina preparada según la presente invención puede administrarse de cualquier manera deseada; sin embargo las formas de administración parenteral, oral, pulmonar, bucal y nasal se consideran los modos de administración utilizados más probablemente. Las preparaciones parenterales pueden estar contenidas en ampollas, jeringuillas de usar y tirar o viales de una sola o múltiples dosis de vidrio, plástico u otros materiales adecuados.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se ofrecen a título de ilustración y no de limitación.

Ejemplo 1 Preparación de una proteína de insulina expresada como proteína de fusión mini-insulina (MI) con un propéptido escindible con tripsina Construcción de pSBS404: proteína de fusión PRS-D9scFv-Klip27-MI-KDEL

Una de las proteínas de fusión estudiadas comenzó con la secuencia relacionada con el patógeno del tabaco (PRS) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8:217-221) que sirvió como péptido señal para la expresión de la diana en el ER en una manera de traducción conjunta. Inmediatamente corriente abajo estaba una secuencia que codifica un anticuerpo Fv monocatenario (scFv) con afinidad específica para la especie contra la oleosina de 18 kDa procedente de Arabidopsis thaliana denominada D9scFv, seguida de un propéptido escindible con tripsina (KLIP27) derivado del propéptido TA57 de levadura (Kjeldsen et al., 2001, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 18:89-121). Esto fue seguido por la mini-insulina (MI) descrita por Kjeldsen et al. (2001) con adición de una señal de retención del ER de KDEL en el extremo del terminal C del polipéptido.

El eje central de este plásmido, pSBS4055, estaba basado en el vector binario vegetal, pPZP200, descrito por Hajdukiewicz et al. (Plant Molecular Biology, 1994, 25:989-994). En lugar de la secuencia de clonación múltiple descrita, un gen pat que proporciona resistencia a la fosfinotricina de la planta hospedadora (Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)) conducida por el activador/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684), se insertó entre las secuencias de los límites izquierdo y derecho. Además de este casete, se subclonó el activador/terminador de \beta-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1897-1901) que dirige PRS. Se utilizó PCR convencional (Horton et al., 1989, Gene 77:61-68) para fusionar la secuencia de codificación sintética PRS con las secuencias de endonucleasa de restricción SphI/HindIII acopladas al extremo 3' del activador de faseolina para dar pSBS4011. Se generó la secuencia de inserción SphI-D9scFv-XhoI, SwaI, HindIII se generó por ampliación por PCR de un clon de ADNc de D9scFv (Sean Hemmingsen lab, no publicado) con los cebadores 1325 (GCATGCTGACATTGTGATGACACAGTC) - SEC. ID. nº: 175 y 1326 (AAGCTTGCATTTAAATACTCGAGTACGTGAGAGTGGTGCCTG) - SEC. ID. nº: 176). La ligadura posterior de este fragmento en las secuencias SphI/HindIII de pSBS4011 dió como resultado el plásmido pSBS4055.

Se sintetizó la secuencia Klip27-MI a partir de cuatro oligonucleótidos parcialmente solapantes que incorporaban la utilización del codón de Arabidopsis thaliana para aumentar la consecución de la traducción eficaz en un sistema de expresión a base de plantas. Los oligonucleótidos 1324 (GAAGAAGGAGAGCCTAAGTTTGTTAATCAA
CATCTTTGTGGATCTCATCTTGTTGAGGCTCTCTACCTTG) - SEC. ID. nº: 177 y nº 1323 (CCTTAGGAGTG
TAGAAAAATCCTCTTTCTCCACACACAAGGTAGAGAGCCTCAACA) - SEC. ID. nº: 178 se hibridaron en su nucleótido 20 complementario solapado y extendido para formar el extremo 5' de la fusión Klip27-MI mientras se hizo lo mismo con los oligonucleótidos 1322 (CTAAGGCTGCTAAGGGAATTG) - SEC. ID. nº: 179 y nº 1321 (AAGCTT
CAGTTGCAATAGTTCTCCAATTGGTAAAGTGAGCAAATAGAAGTGCAACATTGTTCAACAATTCCCTTAGC
AGCCTT) - SEC. ID. nº: 180 para formar el extremo 3'. Las dos mitades se ligaron tras la digestión con restricción con Bsu36I, para dar la secuencia de codificación completa Klip27-MI. La PCR de esta fusión génica que utiliza los cebadores 1364 (CTCGAGTCAACCAATTGATGACACTGAATC) - SEC. ID. nº: 181 y nº 1334 (AAGCTTCAAAGTTCATCCTTGTTGCAATAGTTCTCCAATTG) SEC. ID. nº: 182 acopladas a una secuencia de escisión de endonucleasa de restricción 5' XhoI y la secuencia de ADN 3' KDEL más la secuencia de escisión HindIII para la ligadura ulterior en XhoI/HindIII-cut pSBS4055. El resultado fue el plásmido pSBS4404: una secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión PRS-D9scFv-Klip27-MI-KDEL que se coloca en un vector binario bajo control de exposición del activador/terminador de faseolina. El activador de faseolina controla la expresión temporal específica y específica para el tejido del transgén durante el desarrollo de la semilla. La secuencia de ácido nucleico completa (SEC. ID. nº: 1) y la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. nº: 2) de la proteína de fusión de insulina 4404 (PRS-D9ScFv-Klip27-MI-KDEL) se muestra en la Figura 1.

Construcción de pSBS4405: proteína de fusión OLE0-Klip8-Klip27-MI

La segunda proteína de fusión estudiada comenzaba con la oleosina de 18 kDa de Arabidopsis thaliana seguida en el marco por un propéptido (Klip8) escindible por la quimiosina - SEC. ID. nº: 175. Inmediatamente corriente abajo había una secuencia que codifica el propéptido (Klip27) escindible por tripsina obtenido a partir del propéptido TA57 de levadura como se describió anteriormente (Kjeldsen et al., 2001, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 18:89-121). Éste se fusionó con la mini-insulina (MI) descrita anteriormente (Kjeldsen et al., 2001). La expresión de esta proteína de fusión fue dirigida a los cuerpos aceitosos nacientes formados durante el desarrollo del embrión.

El eje central de este plásmido, pSBS4055, estaba basado en el vector binario vegetal, pPZP200, descrito por Hajdukiewicz et al. (Plant Molecular Biology, 1994, 25:989-994). En lugar de la secuencia de clonación múltiple descrita, un gen pat que proporciona resistencia a la fosfinotricina de la planta hospedadora (Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)) conducido por el activador/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684), se insertó entre las secuencias de los límites izquierdo y derecho. Además de este casete, se subclonó el activador/terminador de \beta-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1897-1901) que dirige la fusión de la secuencia genómica de oleosina de 18 kDa de Arabidopsis con Klip8. Se utilizó PCR convencional (Horton et al., 1989, Gene 77:61-68) para fusionar la secuencia del gen de oleosina con Klip8 con las secuencias de endonucleasa de restricción XhoI/HindIII acopladas al extremo 3' del activador de faseolina para dar pSBS4010.

Se sintetizó la secuencia Klip27-MI a partir de cuatro oligonucleótidos parcialmente solapantes que incorporaban la utilización del codón de Arabidopsis thaliana para aumentar la consecución de la traducción eficaz en un sistema de expresión a base de plantas. Los oligonucleótidos 1324 (GAAGAAGGAGAGCCTAAGTTTGTTAATCAA
CATCTTTGTGGATCTCATCTTGTTGAGGCTCTCTACCTTG) - SEC. ID. nº: 177 y nº 1323 (CCTTAGGAGTG
TAGAAAAATCCTCTTTCTCCACACACAAGGTAGAGAGCCTCAACA) - SEC. ID. nº: 178 se hibridaron en su nucleótido 20 complementario solapado y extendido para formar el extremo 5' de la fusión Klip27-MI mientras se hizo lo mismo con los oligonucleótidos 1322 (CTAAGGCTGCTAAGGGAATTG) - SEC. ID. nº: 179 y nº 1321 (AAGCTT
CAGTTGCAATAGTTCTCCAATTGGTAAAGTGAGCAAATAGAAGTGCAACATTGTTCAACAATTCCCTTAGC
AGCCTT) - SEC. ID. nº: 180 para formar el extremo 3'. Las dos mitades se ligaron tras la digestión con restricción con Bsu36I, para dar la secuencia de codificación completa Klip27-MI. La PCR de esta fusión génica que utiliza los cebadores 1364 (CTCGAGTCAACCAATTGATGACACTGAATC) - SEC. ID. nº: 181 y 1329 (AAGCTTCAGTTG
CAATAGTTC) SEC. ID. nº: 183 acopladas a una secuencia de escisión de endonucleasa de restricción 5' XhoI y a una secuencia de escisión 3' HindIII, respectivamente, para la ligadura ulterior en pSBS4055 cortado con XhoI/HindIII. El resultado fue el plásmido pSBS4405: una secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión oleosina-Klip8-Klip27-MI que está situada en un vector binario bajo control de exposición del activador/terminador de faseolina. El activador de faseolina controla la expresión temporal específica y específica para el tejido del transgén durante el desarrollo de la semilla. La secuencia SEC. ID. nº: 3 completa de ácido nucleico y la secuencia SEC. ID. nº: 4 de aminoácidos de la proteína de fusión de insulina 4405 (OLEO-Klip8-Klip27-MI) se muestra en la Figura 2.

Construcción de pSBS4414: proteína de fusión PRS-MI-enlazador tetrabásico- D9Scfv-KDEL

Otra proteína de fusión estudiada comenzó con la secuencia relacionada con el patógeno del tabaco (PRS) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8:217-221) que sirvió como péptido señal para la expresión de la diana al ER en una manera de traducción conjunta. Inmediatamente corriente abajo estaba la secuencia que codifica la mini-insulina (MI) descrita por Kjeldsen et al., (2001) con la excepción de que la zona del propéptido mini-C (AAK - SEC. ID. nº: 146) se sustituyó por una secuencia intrón de la zona tetrabásica B_{30} treonina (B_{30}T-RRKR) (SEC. ID. nº: 149) entre las cadenas B_{(1-29)} y A_{(1-21)} de insulina humana. Ésta era seguida inmediatamente por una secuencia que codifica un segundo enlazador tetrabásico seguido de un anticuerpo Fv monocatenario (scFv) con afinidad específica para la especie frente a la oleosina de 18 kDa de Arabidopsis thaliana denominada D9scFv. En el extremo terminal C del polipéptido estaba la adición de una señal de retención de ER KDEL.

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El eje central de este plásmido, pSBS4055, estaba basado en el vector binario vegetal, pPZP200, descrito por Hajdukiewicz et al. (Plant Molecular Biology, 1994, 25:989-994). En lugar de la secuencia de clonación múltiple descrita, un gen pat que proporciona resistencia a la fosfinotricina de la planta hospedadora (Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)) conducido por el activador/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684), se insertó entre las secuencias de los límites izquierdo y derecho. Además de este casete, se subclonó el activador/terminador de \beta-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1897-1901) que dirige PRS. Se utilizó PCR convencional (Horton et al., 1989, Gene 77:61-68) para fusionar la secuencia que codifica PRS sintético con las secuencias de endonucleasa de restricción SphI/HindIII acopladas al extremo 3' del activador de faseolina para dar pSBS4011.

Se sintetizó la secuencia Klip27-MI a partir de cuatro oligonucleótidos parcialmente solapantes que incorporaban la utilización del codón de Arabidopsis thaliana para aumentar la consecución de la traducción eficaz en un sistema de expresión a base de plantas. Los oligonucleótidos 1324 (GAAGAAGGAGAGCCTAAGTTTGTTAATCAACATC
TTTGTGGATCTCATCT TGTTGAGGCTCTCTACCTTG) - SEC. ID. nº: 177 y nº 1323 (CCTTAGGAGTGTAGA
AAAATCCTCTTTCTCCACACACAAGGTAGAGAGCCTCAAC A) - SEC. ID. nº: 178 se hibridaron en su nucleótido 20 complementario solapado y extendido para formar el extremo 5' de la fusión Klip27-MI mientras se hizo lo mismo con los oligonucleótidos 1322 (CTAAGGCTGCTAAGGGAATTG) - SEC. ID. nº: 179 y nº 1321 (AAGCTT
CAGTTGCAATAGTTCTCCAATTGGTAAAGTGAGCAAATAGAAGTGCAACATTGTTCAACAATTCCCTTAGC
AGCCTT) - SEC. ID. nº: 180 para formar el extremo 3'. Las dos mitades se ligaron tras la digestión con restricción con Bsu36I, para dar la secuencia de codificación completa Klip27-MI. La PCR de esta fusión génica que utiliza los cebadores 1363 (GCATGCCCAACCAATTGATGACACTG) - SEC. ID. nº: 184 y nº 1334 (AAGCTT
CAAAGTTCATCCTTGTTGCAATAGTTCTCCAATTG) SEC. ID. nº: 182 acopladas a una secuencia de escisión de endonucleasa de restricción 5' SphI y a la secuencia de ADN 3' KDEL más la secuencia de escisión 3' HindIII para la ligadura ulterior en pSBS4011 cortado con SphI/HindIII. El resultado fue el plásmido pSBS4402: una secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión PRS-Klip27-MI-KDEL que está situada en un vector binario bajo control de exposición del activador/terminador de faseolina. El activador de faseolina controla la expresión temporal específica y específica para el tejido del transgén durante el desarrollo de la semilla. El vector de expresión vegetal, pSBS4402, sirve como plantilla para introducir secuencias tetrabásicas entre las cadenas B y A de insulina y entre MI y D9 Scfv.

Una secuencia intrón (intravening) tetrabásica (B_{30}-T-RRKR) se colocó entre las cadenas auténticas B_{(1-19)} y A_{(1-21)} de la insulina humana por PCR utilizando los cebadores 1515 (GCATGCATGCCTTTGTTAATCAACATCTTTGTGG) SEC. ID. nº: 185 y nº 1518 (ACATTGTTCAACAATTCCTCTCTTTCTTCTAGTCTTAGGAGTGTAG AAAAATCC) SEC. ID. nº: 186 utilizando pSBS4402 como plantilla. Se utilizó el fragmento de 124 bp resultante en comparación con el cebador 1517 (GCATAAGCTTCAAAGCTCATCC-TTTGAGC) SEC. ID. nº: 187 utilizando pSBS3400 como plantilla. Obsérvese que pSBS3400 es un plásmido que contiene el fragmento D9 scFv-KDEL con una secuencia de restricción HindIII. La reacción de PCR produjo un producto de 955 bp que se introdujo en una (RRKR)-D9 Scfv-KDEL-HindIII tetrabásica en un fragmento SphI-MI de 124 bp. El fragmento de 955 bp se ligó a continuación y se subclonó en pGEM-T (Promega) para producir pSBS3403. El fragmento completo SphI-MI (con el propéptido C modificado por B_{30}T-RRKR)-RRKR-D9 Scfv-KDEL-HindIII se insertó en el precorte (SphII HindIII) pSBS4402 para generar pSBS4414. La secuencia SEC. ID. nº: 5 del ácido nucleico completo y la secuencia de aminoácidos SEC. ID. nº: 6 de la proteína de fusión insulina 4414 (PRS-MI-enlazador tetrabásico-D9Scfv-KDEL) se presenta en la Figura 3.

Transformación y crecimiento de E. coli recombinante y Agrobacterium con pSBS4404, pSBS4405 o pSBS4414

Una vez confirmada la integridad del ADNc que codifica la proteína de fusión por análisis de la secuencia, los plásmidos pSBS4404, pSBS4405 y pSBS4414 se transformaron en la cepa DH5\alpha de E. coli para permitir un alto nivel de expresión. Se mezcló el ADN plásmido (100 ng) aislado en hielo con 100 \mul de células competitivas DH5\alpha durante 20 min. Las células se sometieron a choque térmico a 42ºC durante 45 segundos y se devolvieron al hielo durante 2 min. A continuación se añadió 1 ml de medio SOC y se incubaron las células a 37ºC en un enviro-agitador a 225 rpm durante 1 h. antes de colocar las células transformadas en placas con LB-espectinomicina (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl, 15 g/l de agar-agar) e incubando toda la noche a 37ºC. Se utilizó una sola colonia para inocular 5 ml de caldo de cultivo LB-espectinomicina. Estos cultivos se cultivaron toda la noche a 37ºC. El plásmido recombinante se inoculó en 1 ml del cultivo de toda la noche según el kit QIAprep®Spin Miniprep Kit (Qiagen)'. El plásmido aislado se utilizó a continuación para transformar la cepa EH101 competente de Agrobacterium (Hood et al., 1986; J. Bacteriol. 144: 732-743) por electroporación (25 \muF, 2,5 kV, 200 \Omega). El Agrobacterium recombinante se colocó en AB-espectinomicina/kanamicina (20\times sales AB, glucosa 2 M, FeSo_{4}\cdot7 H_{2}O 0,25 mg/ml, MgSO_{4} 1 M, CaCl_{2} 1 M) y se utilizó una sola colonia para inocular 5 ml de caldo de cultivo AB-espectinomicina/kanamicina. Estos cultivos se desarrollaron durante la noche a 28ºC. Se utilizó a continuación Agrobacterium recombinante para transformar plantas de Arabidopsis thaliana por el procedimiento de inmersión de la flor (Clough et al., 1998, Plant J., 16:735-743) se utiliza Arabidopsis thaliana cv. (C24) en todos los experimentos. Las semillas se plantan en la superficie de una mezcla de suelos (dos tercios de tierra Redi y un tercio de perlita con un pH = 6,7) o una mezcla de suelo de Arabidopsis suministrada por Lehle Seeds (perlita, vermiculita, turba, tierra verde, con un pH = 5,5) en tiestos de 4 pulgadas. Los plantones se dejan crecer hasta una etapa de rosetón de 6 a 8 hojas hasta un diámetro de aproximadamente 2,5 cm. Las macetas se colocan dentro de una campana a 4ºC durante cuatro días para un tratamiento en frío y posteriormente se desplazan a una sala de cultivo a 24ºC con luz constante a aproximadamente 150 \muE y 60 a 70% de humedad relativa. Las plantas se riegan en un intervalo de 2 a 3 días y se abonan semanalmente con 1% de Peters 20-19-18. Cada maceta contiene cinco a seis plantas. Cuando las plantas alcanzan aproximadamente 2 cm de altura, se cortan los leños primarios para estimular el crecimiento de los leños secundarios y terciarios. 4 a 5 días después de cortar los leños primarios, las plantas están listas para ser infectadas con Agrobacterium. Las macetas con plantas de Arabidopsis se invierten para permitir que las plantas de Arabidopsis se infecten con 500 ml de una resuspensión de cultivo de Agrobacterium de toda la noche que contiene el vector de transformación de la planta de interés durante 20 segundos. Es importante que el cultivo de Agrobacterium contenga 5% de sacarosa y 0,05% del tensioactivo Silwet L-77 (Lehle Seeds). Las macetas se cubren posteriormente con una campana de plástico transparente durante 24 horas para mantener la humedad más alta. Se dejan crecer las plantas hasta la madurez y se recoge una mezcla de semillas, sin transformar y transformadas. Para la selección de las estirpes transgénicas, se esterilizan supuestas semillas transformadas en un lavado rápido de 70% de etanol, a continuación un 20% de blanqueador comercial durante 15 min. y a continuación se enjuagan por lo menos cuatro veces con dd H_{2}O. Aproximadamente 1.000 semillas esterilizadas se mezclan con agar-agar de cabeza fundido al 0,6% y se dispersan uniformemente en una placa MS de media concentración (Murashige y Skoog, 1962, Physiologia Plantarum 15: 473-497) que contiene sacarosa al 0,3% y 80 \muM del herbicida fosfinotricina (PPT) DL. Se colocan a continuación las placas en una sala de cultivo con un régimen de luz de 8 h. de oscuridad y 16 h. de luz a 24ºC. Después de 7 a 10 días, los supuestos plantones transgénicos están verdes y creciendo mientras los plantones sin transformar se blanquean. Una vez el establecidas de las raíces los supuestos plantones transgénicos se transfieren individualmente a macetas (las plantas individualmente se riegan en un intervalo de 3 días y se abonan con 1% de Peters 20-19-18 en un intervalo de 7 días) y se dejan crecer hasta la madurez. Las macetas se cubren con una campana de plástico transparente durante 3 días para proteger los plantones sensibles. Después de 7 días los plantones se cubren con un sistema colector de semillas de Lehle Seeds para impedir la pérdida de semillas debido al barrido. Las semillas de estas plantas transgénicas se cosechan una a una y están listas para su análisis.

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Ejemplo 2 Niveles de expresión de la insulina en Arabidopsis thaliana

En el segundo ejemplo, se determinaron los niveles de expresión de la proteína de fusión D9scfv-KLIP27-MI-KDEL (4404), OLEO-KLIP8-LIP27-MI (4405) y PRS-MI-RRKR-D9Scfv-KDEL (4414) en la semilla madura transgénica de Arabidopsis thaliana. El producto transgénico se demostró que estaba presente en los extractos celulares de la semilla madura. Se molieron en un mortero aproximadamente 40 semillas transgénicas de Arabidopsis thaliana en 50 \mul de Tris-HCl 50 mM pH 8,0. A continuación, un tampón de muestra SDS-PAGE reductor (6\times tampón de muestra SDS, Tris-HCl 0,35 M pH 6,8, glicerol al 30%, 10% de SDS, bromofenol azul al 0,012%, \beta-mercaptoetanol al 5%) se añadió a la suspensión y se mezcló mediante fuerte agitación brevemente. La muestra se centrifugó a continuación brevemente y se colocó a 99ºC durante 10 minutos. Después de enfriar en hielo durante 2 minutos la muestra se centrifugó brevemente. Se cargaron las muestras (10 \mul equivalentes a aproximadamente 7 semillas) en condiciones reductoras.

Para las muestras preparadas con cuerpos aceitosos se molió la semilla transgénica y natural (20 mg) en 250 \mul de tampón de extracción de cuerpo aceitoso (sacarosa 0,4 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0). Se microcentrifugaron las muestras a 10.000 g durante 10 min. Se eliminó la fracción acuosa soluble con una jeringuilla de 1 ml 26 G 5/8 y la almohadilla de grasa se volvió a poner en suspensión en 100 \mul de tampón fosfato enriquecido con sal (Na_{2}HPO_{4} 20 mM pH 8,0, NaCl 0,5 M). La almohadilla de grasa resuspendida se transfirió a un tubo de microcentrifugadora limpio y se centrifugó otra vez a 10.000 g durante 10 min. Se repitió el procedimiento 3 veces más con una resuspensión final de la almohadilla de grasa en 100 \mul de tampón fosfato sin sal (Na_{2}HPO_{4} 20 mM pH 8,0). Dos lavados adicionales más en tampón fosfato sin sal se realizaron con etapas de centrifugación intermitentes como se esbozó anteriormente. El se sedimento de grasa final se volvió a poner en suspensión 10 \mul (Na_{2}HPO_{4} 20 mM pH 8,0). Se tomó una alícuota de 5 \mul y la proteína del cuerpo aceitoso se disolvió por ebullición en Tris-HCl 50 mM 1/10 (v/v) pH 8,0 con SDS al 2%. Se enfrió la muestra en hielo durante 2 min. y se centrifugó a 10.000 g durante 5 min. El contenido en proteína del sobrenadante se determinó mediante el ensayo de la proteína BCA (Pierce, Rockford, IL). Para los geles teñidos con Coomassie y el análisis de inmunotransferencia Western, se separaron 20 \mug de proteína completa en geles SDS-PAGE al 15% en condiciones reductoras utilizando el tampón de muestra SDS-PAGE.

La(s) muestra(s) se cargaron a continuación en geles discontinuos SDS-PAGE al 15% y se separaron a 150 voltios durante aproximadamente 1,5 horas. Los geles se tiñeron con Coomassie a continuación o se inmunotransfirieron a una membrana PVDF (Immobilon-P, Millipore Corporation, Bedford, MA) para el análisis de inmunotransferencia Western. Se sondaron las muestras inmunotransferidas con anticuerpo monoclonal dirigido contra la insulina (Clon E2-E3; Roth et al., 1992) adquirida en Abcam (Cambridge, UK). Se detectaron bandas de insulina utilizando un conjugado secundario de IgG de oveja X ratón F(ab')2 AP (Chemicon International, Temecula, CA) y se desarrollaron utilizando NBT-BCIP en tampón GARAP (Tris-HCl pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM). La banda inmunorreactiva correspondía a una banda de polipéptido, que migra al peso molecular previsto de la proteína de fusión, como se muestra en las Figuras 4A a 4F. Las Figuras 4(A-F), muestran la expresión recombinante de las proteínas de fusión de insulina en las estirpes transformadas de Arabidopsis thaliana (4404-2, -17, -20, 4405-4, 4414-19 y 4414-20) sobre la base de análisis con SDS-PAGE teñido con Coomassie y de inmunotransferencia Western. Las flechas indican la posición de los polipéptidos de fusión que emigran de 38,5 kDa, 34,2 kDa y 34,2 kDa, PRS-D9(scfv)-KLIP27-Mlw/KDEL (4404), OLEO-KLIP8-KLIP27-MI (4405) y PRS-MI-RRKR-D9Scfv-KDEL (4414) respectivamente, en condiciones reductoras. Debe indicarse que la proteína de fusión 4414 cabe esperar un peso molecular de 34,2 kDa pero tiene un peso molecular aparente superior en un gel de SDS-PAGE). Las Figuras 4A (gel teñido con Coomassie) y 4B (inmunotransferencia Western correspondiente sondada con anti-insulina E2E3) presentan la proteína total de la semilla de estirpes celulares naturales (wt) y transgénicas que expresan los montajes 4404 y 4405. Las Figuras 4C (gel teñido con Coomassie) y 4D (inmunotransferencia Western correspondiente sondada con antiinsulina E2E3) presentan proteína de cuerpo aceitoso preparada a partir de la semilla natural y transgénica que expresa los mismos montajes 4404 y 4405. Las Figuras 4D (gel teñido con Coomassie) y 4E (inmunotransferencia Western correspondiente sondada con anti-insulina E2E3) presentan la proteína del cuerpo aceitoso preparada a partir de la semilla natural y transgénica que expresa los mismos montajes 4414. Los marcadores de peso molecular (M) son 10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150, 250 kDa. Las referencias incluyen hIN (patrón de insulina humana recombinante) y ProhIN (patrón de proinsulina humana recombinante), separados en condiciones no reductoras. Las diferencias en los niveles de expresión son el resultado de la variación clonal entre transformantes. Las concentraciones de proteína aproximadas del transgén y de la expresión de MI se presentan en la Figura 5. Los niveles de expresión se determinaron utilizando la oleosina de 18 kDa como patrón interno (equivalente a 1,5% de proteína total en la semilla) por densimetría de la banda transgénica. El nivel medio de expresión para los montajes PRS-D9(scfv)-KLIP27-Mlw/KDEL (4404), OLEO-KLIPB-KLIP27-MI (4405) y PRS-MI-RRKR-D9Scfv-KDEL (4414) fueron de 0,21% de proteína total en la semilla, 0,12% de proteína total en la semilla y 0,79% de proteína total en la semilla respectivamente.

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Ejemplo 3 Escisión de pSBS4404 y purificación por HPLC Elución del cuerpo aceitoso

En el tercer ejemplo, se homogeneizó 1 g de semilla transgénica en 12 ml de tampón de extracción (sacarosa 0,4 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8,0) y se centrifugó a 10.000 g durante 10 min., se retiraron las almohadillas de grasa y se colocaron en 1 ml de Na_{2}HPO_{4} 20 mM, NaCl 0,5 M y se volvió a centrifugar como anteriormente. Esto se repitió dos veces, antes de lavar y centrifugar la almohadilla de grasa dos veces en 750 \mul de Na_{2}HPO_{4} 20 mM. Se eluyó la proteína de fusión 4404 procedente del cuerpo aceitoso en el sobrenadante lavando la almohadilla de grasa final 5 veces en 750 \mul de ácido fórmico 20 mM pH 4,1, con etapas de centrifugación de 10.000 g entre cada lavado. Las fracciones de elución recogidas (sobrenadantes) se mezclaron y se neutralizaron con NaOH 2 N a pH 8,0. Se colocó a continuación la solución completa a -80ºC para congelar, y se liofilizó toda la noche para concentrar la proteína de fusión. La muestra liofilizada se volvió a poner en suspensión en 500 \mul de Tris-HCl 50 mM pH 8,0. La proteína de fusión 4404 resuspendida se desaló a continuación en una columna NAP-5 (Amersham Pharmacia Biotech Ab, Uppsala, Suecia) y se volvió a intercambiar con tampón (Tris-HCl 50 mM pH 8,0). La fracción desalada se congeló a continuación otra vez y se liofilizó toda la noche para concentrar. La muestra concentrada se volvió a poner en suspensión en un volumen final de 105 \mul de H_{2}O doble destilada. Los resultados de la elución se presentan en la Figura 6. La Figura 6 es un análisis de SDS-PAGE (15%) teñido con Coomassie de las preparaciones del cuerpo aceitoso antes de la elución (-OB), la preparación OB de la elución con ácido fórmico (-OB') y el material concentrado eluido (-E). La flecha indica la posición del polipéptido de fusión que migra. La referencia natural esencialmente exenta de cualquier proteína principal después de la elución mientras que el material 4404 concentrado contiene la proteína de fusión, algunos productos truncados (proteína de fusión hidrolizada posible) y posiblemente algunas albúminas que eluyen conjuntamente.

Escisión de análisis por HPLC de la semilla de Arabidopsis que expresa 4404

Se volvió a poner en suspensión la muestra concentrada en 105 \mul de agua doblemente destilada y se evaluó el contenido de proteína mediante el ensayo con proteína BCA según el fabricante (Pierce, Rockford, IL, US). Se escindieron a continuación las muestras con tripsina (relación tripsina:proteína total 1:300, en Tris-HCl 50 mM pH 8,0, en hielo durante 90 min.). Se interrumpieron las reacciones con un exceso molar de 10 veces de TLCK (N-p-tosil-L-lisina clorometilcetona). Los sobrenadantes de las reacciones completas se filtraron a continuación a través de filtros de 0,2 \mum (filtro para jeringuilla de 13 mm Aerodisc® con membrana Supof® de 0,2 \mum, Pall Corporation, Ann Arbor, MI, US) y se analizaron por (RP)-HPLC en fase inversa utilizando una columna C18 (Zorbax 300SB-C18, Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania). Se cargaron las muestras en la columna y se eluyeron a 1,0 ml/min. utilizando un gradiente lineal de 19 min. de acetonitrilo 5 a 50% (v/v) en TFA al 0,1% (v/v). La cromatografía resultante de este análisis se aprecia en la Figura 7. La línea pone de manifiesto un producto escindido con tripsina procedente de la proteína de fusión 4404, con propiedades casi idénticas en la columna a las del patrón de insulina humana (tiempos de retención de 17,011 min. y 17,179 min., respectivamente). La fracción de HPLC se recogió entre 17,0 y 17,5 min. y se analizó por espectrometría de masas PSD MALDI/TOF utilizando un espectrómetro de masas DE STR de Voyager (Applied Biosystems). El análisis de MS fue realizado por el servicio BioAnalytical Spectroscopy proporcionado por NRC-Plant Biotechnology Institute, Saskatoon, Saskatchewan, Canadá. La resolución del producto 4404 escindido purificado por HPLC como se describió anteriormente se presenta en la Figura 8B en comparación con el patrón de insulina humana mostrado en la Figura 8A. La masa observada de la proteína de fusión 4404 escindida con tripsina fue 6191,51 Da. La discrepancia entre el patrón de insulina humana (Figura 8A) y el producto 4404 escindido (Figura 8B) corresponde a una Des-B_{30} insulina con la señal de KDEL conservada en la cadena A del producto escindido (Des-B_{30} Insulin-KDEL).

Ejemplo 4 Escisión de pSBS4405 y purificación por HPLC Preparación del cuerpo aceitoso

La proteína de fusión (OLEO-KLIP8-KLIP27-MI) puede purificarse parcialmente realizando las preparaciones del cuerpo aceitoso como se describe a continuación. Aproximadamente, 1 g de semilla transgénica se homogeneizó en 12 ml de tampón de extracción (sacarosa 0,4 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8,0) y se centrifugó a 10.000 g durante 10 min., se retiraron las almohadillas de grasa y se colocaron en 1 ml de Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 0,5 M y se volvieron a centrifugar como anteriormente. Esto se repitió dos veces, antes de lavar y centrifugar la almohadilla de grasa dos veces en 750 \mul de Tris-HCl 50 mM pH 8,0. La preparación del cuerpo aceitoso produce la eliminación de la mayoría de las proteínas de fondo. El perfil de la proteína típica de una preparación de cuerpo aceitoso a partir de la semilla de Arabidopsis transgénica que expresa el montaje 4405 se demuestra en la Figura 9.

Escisión y análisis por HPLC de la semilla de Arabidopsis que expresa a 4405

Se evaluó el contenido total en proteína procedente de los cuerpos aceitosos resuspendidos disolviendo una fracción de la preparación (5 \mul) diluida 10 veces en SDS al 2%, Tris-HCl 50 mM pH 8,0, se hirvió durante 5 minutos y se centrifugó durante 3 min. a 10.000 g. Después, se determinó el contenido en proteína por el ensayo con proteína BCA según el fabricante (Pierce, Rockford, IL, US). Se escindieron a continuación las muestras con tripsina (relación tripsina:proteína total 1:300, en Tris-HCl 50 mM pH 8,0, en hielo durante 90 min.) para liberar el fragmento Klip27-MI de la proteína de fusión. Se interrumpieron las reacciones con un exceso molar de 10 veces de TLCK (N-p-tosil-L-lisina clorometilcetona). Las muestras se centrifugaron a 10.000 g durante 10 min. y los sobrenadantes de las reacciones completas se filtraron a continuación a través de filtros de 0,2 \mum (filtro para jeringuilla de 13 mm Aerodisc® con membrana Supof® de 0,2 \mum, Pall Corporation, Ann Arbor, MI, US). La Figura 9 representa el análisis de SDS-PAGE (15%) teñida con Coomassie de la proteína total de la semilla extraíble y la proteína preparada del cuerpo aceitoso (OB) a partir de las líneas que expresan a 4405 en comparación con la semilla natural (no recombinante). La flecha indica la posición del polipéptido de fusión migratorio. Los sobrenadantes se analizaron más por (RP)-HPLC en fase inversa utilizando una columna C18 (Zorbax 300SB-C18, Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania). Se cargaron las muestras en la columna y se eluyeron a 1,0 ml/min. utilizando un gradiente lineal de 19 min. de acetonitrilo 5 a 50% (v/v) en TFA al 0,1% (v/v). La cromatografía resultante de este análisis se aprecia en la Figura 10. La línea pone de manifiesto un producto escindido con tripsina procedente de la proteína de fusión 4405, con propiedades casi idénticas en la columna a las del patrón de insulina humana (tiempos de retención de 17,220 min. y 17,179 min., respectivamente). La fracción de HPLC se recogió entre 17,0 y 17,5 min. y se analizó por espectrometría de masas PSD MALDI/TOF utilizando un espectrómetro de masas DE STR de Voyager (Applied Biosystems). El análisis de MS fue realizado por el servicio BioAnalytical Spectroscopy proporcionado por NRC-Plant Biotechnology Institute, Saskatoon, Saskatchewan, Canadá. Tal como se muestra en la Figura 11, la masa observada de la proteína de fusión 4404 escindida con tripsina fue 5706,30 Da. La discrepancia entre el patrón de insulina humana (Figura 8A) y el producto 4405 escindido (Figura 11) corresponde a un producto de Des-B_{30} insulina (Des-B_{30} Insulin-KDEL). La Des-B_{30} insulina es el producto esperado de la maduración correcta con tripsina de la fusión de 4405.

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Ejemplo 5 Purificación de MI escindida con tripsina utilizando el explorador AKTA (FPLC)

La purificación de MI escindida de 4405 se purificó también parcialmente a partir de las reacciones de escisión a gran escala por intercambio aniónico (1 ml de Mono Q FF, Amersham Pharmacia) en un explorador AKTA (Amersham Pharmacia). Se llevaron a cabo reacciones de escisión en el cuerpo aceitoso 4405 tal como se describió anteriormente preparado a partir de hasta 30 g de semilla transgénica. El sobrenadante de la reacciones de escisión se filtró a través de filtros de 0,2 \mum o se concentró por liofilización en un Savant Speed Vac. Las reacciones de la muestra filtradas podrían aplicarse a la columna directamente, pero las muestras concentradas requerían la eliminación de sales para unirse eficazmente a la columna. Las muestras concentradas pudieron desalarse pasando el material escindido a través de una columna PD-10 (Amersham Pharmacia), por diálisis o dilución a una concentración salina equivalente o inferior a 5 mS/cm. Se equilibraron las muestras desaladas con Tris-HCl 20 mM pH 6,5. Se separaron las muestras utilizando un gradiente de etapa con NaCl de NaCl 0 a 40% con un caudal de 1 ml/min. Se realizó la detección a 214 nm (la detección a 280 nm es relativamente pobre a causa del bajo contenido de aminoácidos aromáticos en la insulina). El disolvente A fue Tris-HCl 20 mM pH 6,5 mientras que el disolvente B fue Tris-HCl 20 mM pH 6,5, NaCl 1,0 M. Se recogieron las fracciones (1 ml) que eluyen a la misma conductividad que el patrón insulina de Roche, entre 7 y 35 mS/cm, (referirse a la Figura 12). La Figura 12 presenta el cromatograma de las preparaciones del cuerpo aceitoso 4405 escindido con tripsina (línea discontinua) en comparación con el patrón de insulina humana (línea continua). La presencia de insulina se verificó en las fracciones recogidas por HPLC, ELISA o análisis Western (datos no mostrados). Las muestras recogidas se concentraron a continuación por liofilización y se utilizaron en el bioanálisis de insulina descrito en el ejemplo 6.

Ejemplo 6 Ensayo de tolerancia a la insulina: bioanálisis en ratones macho C57BI/6 (B6)

Se llevó a cabo el bioanálisis para determinar el efecto in vivo de la planta recombinante derivada (DesB_{30} IN) de 4405 escindida con tripsina en comparación con la insulina humana. Se determinaron las concentraciones de glucosa en el plasma en ratones B6 antes y después de la inyección intraperitoneal de patrones de insulina, referencias negativas e insulina SBS. Se adquirieron quince ratones macho C57BI/6 (B6) de aproximadamente 2 meses de vida en Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Se determinaron las concentraciones de glucosa en el plasma con un glucómetro automático (OneTouch Ultra, Lifescan, Johnson y Johnson). Las referencias positivas incluían HumulinR® (Eli Lilly) y el patrón de insulina humana recombinante de levadura de Roche. Una solución salina sirvió como placebo. Se incluyó referencia negativa que representaba los cuerpos aceitosos escindidos con tripsina de semillas de Arabidopsis natural (no recombinantes) que se procesó de manera idéntica a las preparaciones del cuerpo aceitoso escindido con tripsina 4405 recombinante.

Se enjaularon ratones B6 y se alimentaron a discreción en un ciclo oscuridad-luz de 12 horas.

Para los ensayos de tolerancia a la insulina se inyectó insulina (UI/kg de peso corporal) a los ratones por vía intraperitoneal (IP) y se determinaron las concentraciones de glucosa a 0, 15, 30 y 60 minutos utilizando el glucómetro automático. Todas las pruebas de tolerancia a la insulina se llevaron a cabo en el mismo intervalo cada día (9:00 a.m.). Se realizaron pruebas de tolerancia a la insulina por lo menos 2 días entre la tarde y la administración en la prueba siguiente. Los resultados de las pruebas de tolerancia a la insulina se representan en la Figura 13. La insulina SBS DesB_{30} obtenida a partir de las semillas de 4405 (rombos negros) se comportaron casi idénticamente (no era estadísticamente diferente, p<0,05) a la HumulinR® (cuadrados blancos) y la insulina de Roche (patrones de triángulos blancos) después de la inyección a lo largo del transcurso del estudio. Toda(s) la(s) insulina(s) demostraron de manera significativa concentraciones reducidas de glucosa en el plasma (p<0,05) en comparación con el placebo salino (círculos blancos) y los cuerpos aceitosos de Arabidopsis natural escindidos con tripsina (círculos negros) (referencia negativa).

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Ejemplo 7 Construcción de la proteína de fusión pSBS4401: PRS-Klip27-MI

Una de las proteínas de fusión estudiadas comenzó en la secuencia relacionada con el patógeno del tabaco (PRS) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8:217-221) que servía como péptido señal para la expresión de la diana al ER de manera de traducción conjunta. Inmediatamente corriente abajo había un propéptido escindible con tripsina (KLIP27) obtenido a partir del propéptido TA57 de levadura (Kjeldsen et al., 2001, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 18:89-121). Esto fue seguido por la miniinsulina (MI) descrita por Kjeldsen et al. (2001).

El eje central de este plásmido, pSBS4055, estaba basado en el vector binario de la planta, pPZP200, descrito por Hajdukiewicz et al. (Plant Molecular Biology, 1994, 25:989-994). En lugar de la secuencia de clonación múltiple descrita, un gen pat que proporciona resistencia a la fosfinotricina a la planta hospedadora (Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37) dirigido por el activador/terminador ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684) se insertó entre las secuencias de los límites izquierdo y derecho. Además de este casete, se subclonó el activador/terminador de \beta-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1897-1901) que dirige PRS. Se utilizó PCR convencional (Horton et al., 1989, Gene 77:61-68) para fusionar la secuencia de codificación de PRS sintético que unió las secuencias de la endonucleasa de restricción SphI/HindIII al extremo 3' del activador de faseolina para dar pSBS4011.

Se sintetizó la secuencia de Klip27-MI a partir de cuatro oligonucleótidos parcialmente solapantes que incorporaban la utilización del codón de Arabidopsis thaliana para aumentar la consecución de la traducción eficaz en un sistema de expresión vegetal. Los oligonucleótidos 1324 (GAAGAAGGAGAGCCTAAGTTTGTTAATCAACATCTTTGTG
GATCTCATCTTGTTGAGGCTCTCTACCTTG) - SEC. ID. nº: 177 y 1323 (CCTTAGGAGTGTAGAAAAATCCTC
TTTCTCCACACACAAGGTAGAGAGCCTCAACA) - SEC. ID. nº: 178 se hibridaron en su solapamiento de 20 nucleótidos complementarios y se ampliaron para formar el extremo 5' de la fusión Klip27-MI mientras que lo mismo se realizó con los oligonucleótidos 1322 (CTAAGGCTGCTAAGGGAATTG) - SEC. ID. nº: 179 y nº 1321 (AAGCTT
CAGTTGCAATAGTTCTCCAATTGGTAAAGTGAGCAAATAGAAGTGCAACATTGTTCAACAATTCCCTTAGC
AGCCTT) - SEC. ID. nº: 180 para formar el extremo 3'. Se ligaron las dos mitades después de la digestión con restricción con Bsu36I, para dar la secuencia de codificación completa Klip27-MI. La PCR de esta fusión génica que utiliza los cebadores 1363 (GCATGCCCAACCAATTGATGACACTG) - SEC. ID. nº: 184 y el cebador 1329 (AAGCTTCAGTTGCAATAGTTC) - SEC. ID. nº: 183 se unió a la secuencia de escisión de la endonucleasa de restricción 5' SphI y 3' HindIII para la ligadura posterior en pSBS4011 cortada con SphI/HindIII (como se mencionó anteriormente). El resultado fue el plásmido pSBS4401: una secuencia de ADN (SEC. ID. nº: 188) que codifica la proteína de fusión PRS-Klip27-MI (SEC. ID. nº: 189) situándose en un vector binario bajo el control de expresión del activador/terminador de faseolina. El activador de faseolina controla la expresión temporal específica y específica para el tejido del transgén durante el desarrollo de la semilla.

Transformación y crecimiento de E. coli recombinante y Agrobacterium con pSBS4401

Una vez confirmada la totalidad del ADNc que codifica la proteína de fusión mediante el análisis de la secuencia, el plásmido pSBS4401 se transformó dentro de la cepa DH5\alpha de E. coli para permitir un nivel elevado de expresión. El ADN plásmido aislado (100 ng) se mezcló en hielo con 100 \mul de células competentes de DH5\alpha durante 20 min. Las células se sometieron a continuación a choque térmico a 42ºC durante 45 segundos y se retornaron al hielo durante 2 min. A continuación se añadió 1 ml de medio SOC y las células se incubaron a 37ºC en un enviro-agitador a 225 rpm durante 1 h. antes de colocar las células transformadas en placas con LB-espectinomicina (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl y 15 g/l de agar-agar) e incubando toda la noche a 37ºC. Se utilizó una sola colonia para inocular 5 ml de caldo de cultivo LB-espectinomicina. Estos cultivos se desarrollaron durante la noche a 37ºC. Se aisló el plásmido recombinante en 1 ml de cultivo de toda la noche según la minipreparación de Qiagen. El plásmido aislado se utilizó a continuación para transformar la cepa EH101 competente de Agrobacterium (Hood et al., 1986; J. Bacteriol. 144: 732-743) por electroporación (25 \muF, 2,5 kV, 200 \Omega). Se colocó en placas Agrobacterium recombinante en AB-espectinomicina/kanamicina (20\times sales AB, glucosa 2 M, 0,25 mg/ml de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, MgSO_{4} 1 M, CaCl_{2} 1 M) y se utilizó una sola colonia para inocular 5 ml de caldo de cultivo de AB-espectinomicina/kanamicina. Estos cultivos se desarrollaron durante la noche a 28ºC. El Agrobacterium recombinante se utilizó a continuación para transformar plantas de Arabidopsis thaliana por el procedimiento de inmersión de la flor (Clough et al., 1998, Plant. J., 16:735-743) como se describe en el Ejemplo 1.

Niveles de expresión de insulina en Arabidopsis thaliana

Se determinaron los niveles de expresión de la proteína de fusión KLIP27-MI (4401) en la semilla madura transgénica de Arabidopsis thaliana utilizando el procedimiento esbozado en el Ejemplo 2 anteriormente. El producto transgénico no se encontraba presente en los extractos celulares de la semilla madura.

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Ejemplo 8 Construcción de pSBS4409: proteína de fusión OLEO-proinsulina humana (OLEO-PhIN)

Esta proteína de fusión comenzó con la oleosina de 18 kDa de Arabidopsis thaliana seguido en el marco por el gen que codifica la proinsulina humana (PhIN). La expresión de esta proteína de fusión fue dirigida a los cuerpos aceitosos nacientes formados durante el desarrollo del embrión.

El eje central de este plásmido, pSBS4008, estaba basado en el vector binario de la planta, pPZP200, descrito por Hajdukiewicz et al. (Plant Molecular Biology, 1994, 25:989-994). En lugar de la secuencia de clonación múltiple descrita, un gen pat que proporciona resistencia a la fosfinotricina a la planta hospedadora (Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37) dirigido por el activador/terminador ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684) se insertó entre las secuencias de los límites izquierdo y derecho. Además de este casete, se subclonó el activador/terminador \beta-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1897-1901) que dirige la secuencia genómica de oleosina de 18 kDa de Arabidopsis. Se utilizó PCR convencional (Horton et al., 1989, Gene 77:61-68) para fusionar la secuencia génica de oleosina (menos el codón de terminación) que unió las secuencias de la endonucleasa de restricción SphI/HindIII al extremo 3' del activador de faseolina para dar pSBS4008.

Se sintetizó un NcoI-gen de preproinsulina humana-HindIII como una pieza única de 335 bp mediante Aptagen utilizando el tratamiento del codón de la planta preferido. La ligadura posterior en pSBS4008 cortado con NcoI/HindIII dio como resultado el plásmido pSBS4400: una secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión oleosina-fluman preproinsulina que está situada en un vector binario bajo el control de expresión del activador/terminador de faseolina. El plásmido pSBS4400 sirvió como plantilla para generar la proinsulina humana (PhIN) por PCR convencional utilizando pfu ADN polimerasa con cebadores dirigidos contra el extremo 5' (1457 oligo TTCGTGAACCAACACTTG - SEC. ID. nº: 190) y el extremo 3' (1458 oligo AAGCTTTCAGTTACAGTAGT - SEC. ID. nº: 191) incluyendo la secuencia HindIII de la zona existente de proinsulina del vector. Se amplió un segundo fragmento utilizando pfu ADN polimerasa con el cebador dirigido contra la secuencia SphI disponible (oligo 1455 GCATGCATGTGTTGACG - SEC. ID. nº: 192) hasta el extremo 3' del gen de oleosina de Arabidopsis (oligo 1456 GGTAGTGTGCTGGCCA -SEC. ID. nº: 193) dentro del vector pSBS4400. Después de la PCR, se separaron los productos en un gel de agarosa y las bandas correspondientes a un fragmento de 267 bp (PhIN-HindIII) y de 360 bp (SphI-OLEO(extremo 3') se purificaron en gel utilizando un kit para extracción en gel (Qiagen). Se fusionaron los dos fragmentos mediante una segunda ronda de ampliación por PCR utilizando la Taq ADN polimerasa con los cebadores 1455 (SEC. ID. nº: 192) y 1458 (SEC. ID. nº: 193) en combinación con 0,001 \muM de un cebador de PCR que forma puente solapante (oligo 1459 GGTGGCCAGCACACTACCTTCGTGAACCAACACTTGTG - SEC. ID. nº: 194) durante dos ciclos con una temperatura de hibridación de 58ºC seguido de 31 ciclos a 52ºC con objeto de ampliar un fragmento de 627 bp SphI-OLEO(extremo 3')-PhIN-fragmento HindIII. El fragmento SphI-OLEO(extremo 3')-PhIN-fragmento HindIII de 627 bp se ligó a continuación en un saliente T/A del pGEMT Easy Vector System^{TM} (Promega) y se utilizó para transformar la bacteria DH5\alpha para producir pSBS3409 (pGEMT-SphI-OLEO(extremo 3')-PhIN-HindIII).

El fragmento SphI/HindIII de pSBS3409 se intercambió con el fragmento SphI/HindIII de pSBS4400. Los digestos de restricción convencionales tanto en pSBS3409 como en pSBS4404 se realizaron utilizando SphI/HindIII (New England Biolabs). Se separaron los fragmentos en geles de agarosa al 1,5% y se purificaron utilizando un kit de extracción en gel (Qiagen). El fragmento SphI/HindIII de 617 bp liberado de pSBS3409 se ligó a continuación en la secuencia aceptora SphI/HindIII en el eje central del vector pSBS4400 cortado previamente (fragmento SphI/HindIII interno eliminado) utilizando T4 ADN ligasa (NEB) durante la noche a 15ºC.

El resultado fue el plásmido pSBS4409: una secuencia de ADN (SEC. ID. nº: 195) que codifica la proteína de fusión OLEOSIN-PhIN (SEC. ID. nº: 196) que está situada en un vector binario bajo el control de expresión del activador/terminador de faseolina. El activador de faseolina controla la expresión temporal específica y la específica para el tejido del transgén durante el desarrollo de la semilla.

Transformación y crecimiento de E. coli recombinante y Agrobacterium con pSBS4409

Una vez confirmada la totalidad del ADNc que codifica la proteína de fusión mediante el análisis de la secuencia, el plásmido pSBS4409 se transformó dentro de la cepa DH5\alpha de E. coli para permitir un nivel elevado de expresión. El ADN plásmido aislado (100 ng) se mezcló en hielo con 100 \mul de células competentes de DH5\alpha durante 20 min. Las células se sometieron a continuación a choque térmico a 42ºC durante 45 segundos y se retornaron al hielo durante 2 min. A continuación se añadió 1 ml de medio SOC y las células se incubaron a 37ºC en un enviro-agitador a 225 rpm durante 1 h. antes de colocar las células transformadas en placas con LB-espectinomicina (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl y 15 g/l de agar-agar) e incubando toda la noche a 37ºC. Se utilizó una sola colonia para inocular 5 ml de caldo de cultivo LB-espectinomicina. Estos cultivos se desarrollaron durante la noche a 37ºC. Se aisló el plásmido recombinante en 1 ml de cultivo de toda la noche según la minipreparación de Qiagen. El plásmido aislado se utilizó a continuación para transformar la cepa EH101 competente de Agrobacterium (Hood et al., 1986; J. Bacteriol. 144: 732-743) por electroporación (25 \muF, 2,5 kV, 200 \Omega). Se colocó en placas Agrobacterium recombinante en AB-espectinomicina/kanamicina (20\times sales AB, glucosa 2 M, 0,25 mg/ml de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, MgSO_{4} 1 M, CaCl_{2} 1 M) y se utilizó una sola colonia para inocular 5 ml de caldo de cultivo de AB-espectinomicina/kanamicina. Estos cultivos se desarrollaron durante la noche a 28ºC. El Agrobacterium recombinante se utilizó a continuación para transformar plantas de Arabidopsis thaliana por el procedimiento de inmersión de la flor (Clough et al., 1998, Plant. J., 16:735-743) como se describe en el Ejemplo 1.

Niveles de expresión de insulina en Arabidopsis thaliana

Se determinaron los niveles de expresión de la proteína de fusión OLEO-PhIN (4409) en la semilla madura transgénica de Arabidopsis thaliana utilizando el procedimiento esbozado en el Ejemplo 2 anteriormente. El gel teñido con Coomassie de las proteínas del cuerpo aceitoso procedentes de dos estirpes representativas (4409-6 y 4409-8) que comparan la migración de la proteína de fusión oleosina-PhIN (indicada por la flecha negra) con Arabidopsis no transformada (wt) (Figura 14). Se determinó el nivel de expresión por densimetría para medir un promedio de aproximadamente 0,10% de la proteína total de la semilla. Este nivel se calculó antes y después de la migración conjunta de una proteína endógena del mismo peso molecular en la semilla no transformada (wt) que constituía aproximadamente el 0,04% de la proteína total de la semilla.

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Ejemplo 9 Transformación del cártamo

Este protocolo de transformación es similar al esbozado por Orlilcowska T.K. et al. ((1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 40: 85-91), pero con modificaciones y mejoras tanto para el S317 transformante como para la utilización de fosfinotricina como marcador seleccionable. Las semillas descontaminadas de la variedad S-317 California de cártamo, que no están dañadas, se fragmentaron o enfermaron, en HCl al 0,1% durante 12 minutos seguido de 4 a 5 enjuagues con agua destilada esterilizada. Las semillas estériles germinadas en la oscuridad en medio MS (Murashige T. & Skoog F. (1962) Physiol. Plant. 15: 473-497) con sacarosa 1% y Gelrite al 0,25%. Se inician los cultivos de Agrobacterium en soluciones madre congeladas de glicerol en 5 ml de medio líquido mínimo AB con selección de antibiótico y se cultivan durante 48 horas a 28ºC. Se cultiva una alícuota de este cultivo desarrollado durante la noche en 5 ml de caldo de cultivo Luria con selección para transformación. Se lavan 6 a 8 ml de células bacterianas dos veces con medio AB y se preparan hasta una densidad final de las células de 0,4 a 0,5 (D.O. 600).

Se retiran los cotiledones de dos días de vida de los plantones germinados, se mojan en las células preparadas de Agrobacterium y se colocan en placas en medio MS con sacarosa al 3%, N6-benciladenina 4 \muM (BA) y ácido naftalenacético (NAA) 0,8 \muM. Se incuban las placas a 21ºC a la oscuridad. Después de 3 días, se transfiere el mismo medio con 300 mg/l de timentina. Después de 4 días más, se desplazan todos los cultivos a la luz. Después de 3 días, se colocan los explantes en medio de selección con fosfinotricina añadida a 0,5 mg/l. Para el alargamiento continuado del brote, se transfieren los explantes cada semana a un medio MS sin fitohormonas pero con el doble de la cantidad basal de KNO_{3}. Se escinden los retoños que se habían alargado más de 10 mm en el explante inicial y se desarrollan individualmente en selección. Para enraizamiento, se colocan los brotes verdes, que representan el supuesto tejido transgénico, en medio MS con sacarosa al 2%, ácido indolbutílico 10 \muM y NAA 0,5 \muM. Se transfieren los retoños enraizados a una mezcla sin suelo bien drenada y se cultivan bajo humedad alta y 12 horas de luz.

Ejemplo 10 Protocolo de transformación del lino

Este procedimiento de transformación es similar al esbozado por Dong J. y McHughen A. (Plant Cell Reports (1991) 10:555-560), Dong J. y McHughen A. (Plant Sciences (1993) 88:61-71) y Mlynarova et al. (Plant Cell Reports (1994) 13: 282-285). Se descontaminan semillas de lino, que no están dañadas, rotas o enfermas, en una solución de etanol al 70% durante 5 a 7 minutos, seguido de 25 minutos en una solución de blanqueo al 50% con Tween 20 (3 a 4 gotas por cada 100 ml) con agitación continua. Se enjuagan las semillas 5 a 7 veces con agua destilada esterilizada. Se germinan las semillas descontaminadas a la luz en medio MS (Murashige T. & Skoog F. (1962) Physiol. Plant. 15: 473-497) con sacarosa al 2% y Gelrite® al 0,3% en jarras Magenta. Durante la transformación, se desarrollan cultivos de Agrobacterium durante la noche en caldo de cultivo AB más el antibiótico para selección apropiada. Se lavan 6 a 8 ml de células durante la noche dos veces y se vuelven a poner en suspensión en 5 ml de caldo de cultivo AB; se añaden 2 ml de esta solución madre a 98 ml de medio de inducción (medio basal MS con sacarosa al 3%, 6-bencilaminopurina 5 \muM (BA) y ácido alfa-naftalenacético (NAA) 0,25 \muM y se ajusta hasta una D.O._{600} final de 1,0.

Se seccionan explantes de hipocótilo y se inoculan en la solución celular preparada de Agrobacterium durante 4 h. (se agitan las placas suavemente 1 a 2 veces durante este periodo). Después del periodo de infección, se retiran los explantes del medio de inoculación líquido y se inmunotransfieren a un papel de filtro estéril. Se colocan en placas 15 a 20 explantes en medio de inducción con agar-agar solidificado al 0,7% en placas de cultivo tisular. Se sellan las placas con cinta plástica y se cultivan conjuntamente los explantes durante 48 horas a la luz (23 a 24ºC). Después de 2 días, se transfieren los explantes verdes y meristemáticos al mismo medio que contiene 300 mg/l de Timentina (medio de preselección) y se envuelven con cinta plástica. Después de 3 días, se transfieren los cultivos al medio anterior que contiene 10 mg/l de DL Polipéptido (Selección 1). Se envuelven las placas con Parafilm® y se incuban a 24ºC a la luz. Se transfieren los cultivos cada dos semanas y se mantienen en este medio durante un mes. Para el alargamiento de los retoños, se transfieren los cultivos cada dos semanas al medio II de selección (medio basal MS que contiene sacarosa al 2%, 500 mg/l de tampón MES, 300 mg/l de Timentina y 10 mg/l de DL PPT) en jarras magenta. Los supuestos retoños transformados, que sobrevivieron a la selección, son de color verde oscuro y forman raíces vigorosas a los 7 a 10 días cuando se plantan individualmente en el medio de selección II. Se transfieren los retoños enraizados a una mezcla de suelo de invernadero esterilizado en macetas pequeñas y se cubren los plantones con copas de plástico claro para su aclimatación. Para la maduración, se transfieren las plantas que crecen activamente a unas macetas de un galón con una mezcla de suelo bien drenado y se cultivan en condiciones de invernadero.

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TABLA 1 Ejemplos de secuencias conocidas de insulina

1

TABLA 1 (continuación)

2

TABLA 1 (continuación)

3

TABLA 1 (continuación)

4

TABLA 1 (continuación)

5

TABLA 1 (continuación)

6

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Sumario de secuencias

Las SEC. ID. nº: 1 y nº 2 dan a conocer la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida, respectivamente, de la proteína de fusión PRS-D9scFv-KLIP27-MI-KDEL en el plásmido pSBS4404.

Las SEC. ID. nº: 3 y nº 4 dan a conocer la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida, respectivamente, de la proteína de fusión Oleo-KLIP8-KLIP27-MI-KDEL en el plásmido pSBS4405.

Las SEC. ID. nº: 5 y nº 6 dan a conocer la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida, respectivamente, de la proteína de fusión PRS-MI-enlazador tetrabásico-D9Scfv-KDEL en el plásmido pSBS4414.

Las SEC. ID. nº: 7 a la nº 145 dan a conocer secuencias de insulina conocidas que se describen en la Tabla 1.

Las SEC. ID. nº: 146 a la nº 148 dan a conocer las secuencias de aminoácido de los fragmentos del péptido C de la insulina.

La SEC. ID. nº: 149 da a conocer la secuencia de aminoácidos del péptido tetrabásico de tratamiento.

Las SEC. ID. nº: 150 a la nº 155 da a conocer la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos capaces de conservar el polipéptido de insulina en el ER.

Las SEC. ID. nº: 156 a nº 160 da a conocer las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos capaces de conservar el polipéptido de insulina en un orgánulo de almacenamiento derivado del ER.

La SEC. ID. nº: 161 da a conocer la secuencia de aminoácidos de una secuencia señal de PRS.

Las SEC. ID. nº: 162 a nº 171 dan a conocer las secuencias de aminoácidos de las secuencias principales de levadura y las secuencias obtenidas de éstas.

La SEC. ID. nº: 172 a nº 173 dan a conocer las secuencias de aminoácidos de péptidos espaciadores.

La SEC. ID. nº: 174 da a conocer la secuencia de aminoácidos de la secuencia KLIP8.

La SEC. ID. nº: 175 da a conocer la secuencia de nucleótidos del cebador transcrito 1325 que es complementaria con la zona 5' del clon D9ScFv del ADNc y se diseña para añadir una secuencia SphI a la zona 5' para facilitar la ligadura posterior.

La SEC. ID. nº: 176 da a conocer la secuencia de nucleótidos del cebador complementario 1326 que es complementaria con la zona 3' del clon D9ScFv del ADNc y se diseña para añadir una secuencia XhoI a la zona 3' para facilitar la ligadura posterior.

La SEC. ID. nº: 177 da a conocer la secuencia de nucleótidos del cebador transcrito 1323 que es complementario con una zona de 20 nucleótidos del cebador complementario 1323 y se diseña para formar el extremo 5' de la fusión Klip27-MI.

La SEC. ID. nº: 178 da a conocer la secuencia de nucleótidos del cebador complementario 1323 que es complementario con una zona de 20 nucleótidos del cebador complementario 1324 y se diseña para formar el extremo 5' de la fusión Klip27-MI.

La SEC. ID. nº: 179 da a conocer la secuencia de nucleótidos del cebador transcrito 1322 que es complementario con una zona de 19 nucleótidos del cebador complementario 1321 y se diseña para formar el extremo 3' de la fusión Klip27-MI.

La SEC. ID. nº: 180 da a conocer la secuencia de nucleótidos del cebador complementario 1321 que es complementario con una zona de 19 nucleótidos del cebador transcrito 1322 y se diseña para formar el extremo 3' de la fusión Klip27-MI.

La SEC. ID. nº: 181 da a conocer la secuencia de nucleótidos del cebador transcrito 1364 que es complementaria con la zona 5' de la secuencia Klip27-MI y se diseña para añadir una secuencia XhoI a la zona 5' para facilitar la ligadura posterior.

La SEC. ID. nº: 182 da a conocer la secuencia de nucleótidos del cebador complementario 1334 que es complementaria con la zona 3' de la secuencia Klip27-MI y se diseña para añadir una secuencia HindIII a la zona 3' para facilitar la ligadura posterior y una secuencia 3' KDEL.

La SEC. ID. nº: 183 da a conocer la secuencia de nucleótidos del cebador complementario 1329 que es complementaria con la zona 3' de la secuencia Klip27-MI y se diseña para añadir una secuencia HindIII a la zona 3' para facilitar la ligadura posterior.

La SEC. ID. nº: 184 da a conocer la secuencia de nucleótidos del cebador transcrito 1363 que es complementaria con la zona 5' de la secuencia Klip27-MI y se diseña para añadir una secuencia SphI a la zona 5' para facilitar la ligadura posterior.

La SEC. ID. nº: 185 da a conocer la secuencia nucleotídica del cebador transcrito 1515 que es complementaria con la zona 5' de la secuencia de la cadena B de insulina y se diseña para insertar la zona intrón tetrabásica entre las cadenas A y B auténticas de insulina humana junto con el cebador complementario 1518.

La SEC. ID. nº: 186 da a conocer la secuencia nucleotídica del cebador complementario 1518 que es complementaria con la zona 3' de la cadena B de insulina y la zona 5' de la cadena B de insulina con la secuencia intrón de mini-c-péptido tetrabásica y se diseña para insertar la zona intrón tetrabásica entre las cadenas A y B auténticas de insulina humana.

La SEC. ID. nº: 187 da a conocer la secuencia nucleotídica del cebador inverso 1517 que es complementario con la zona 3' de la secuencia D9ScFv-KDEL y se diseña para ampliar el MI-enlazador tetrabásico-D9Scfv-KDEL para crear la inserción pSBS4414.

Las SEC. ID. nº: 188 y nº 189 dan a conocer la secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos reducida, respectivamente, de la proteína de fusión PRS-Klip27-MI en el plásmido pSBS4401.

La SEC. ID. nº: 190 da a conocer la secuencia nucleotídica del cebador transcrito 1457 que es complementaria con la zona 5' de la secuencia de la cadena B de insulina y se diseña para generar el fragmento de proinsulina humana (PhIN) junto con el cebador inverso 1591.

La SEC. ID. nº: 191 da a conocer la secuencia nucleotídica del cebador inverso 1458 que es complementaria de la zona 3' de la proinsulina humana (PhIN) diseñada para generar la pro(PhIN) humana y añadir una secuencia de clonación 3' HindIII.

La SEC. ID. nº: 192 da a conocer la secuencia nucleotídica del cebador transcrito 1455 que es complementaria con la zona 5' de la secuencia SphI de pSBS4404 y se diseña para ampliar el gen de oleosina de Arabidopsis junto con el cebador complementario 1456.

La SEC. ID. nº: 193 da a conocer la secuencia nucleotídica del cebador transcrito 1456 que es complementaria con la zona 3' del gen de oleosina de Arabidopsis y se diseña para ampliar el gen de oleosina de Arabidopsis junto con el cebador transcrito 1455.

La SEC. ID. nº: 194 da a conocer la secuencia nucleotídica del cebador PCR solapante en puente que es complementaria con la zona 3' del gen de oleosina de Arabidopsis y el extremo 5' del gen de la proinsulina humana y se diseña para crear la inserción pSBS4409 junto con el cebador transcrito 1455 y el cebador complementario 1456.

Las SEC. ID. nº: 195 y nº 196 dan a conocer la secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos deducida, respectivamente, de la proteína de fusión OLEO-PhIN en el plásmido pSBS4409.

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<110> SemByoSys Genetics Inc.

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Moloney, Maurice M.

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Boothe, Joseph

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Keon, Richard

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Nykiforuk, Cory

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Van Rooijen, Gijs

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<120> Procedimiento de producción de insulina en plantas

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<130> 9369-296

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<150> 60/478.818

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<151> 2004-06-17

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<150> 60/549.539

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<151> 2004-03-04

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<160> 196

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<170> PatentIn Versión 3.1

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<210> 1

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<211> 1143

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia de ácido nucleico de la proteína de infusión de insulina

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<400> 1

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25

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26

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<210> 2

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<211> 380

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Proteína de infusión de insulina

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<400> 2

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28

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<210> 3

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<211> 945

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia de ácido nucleico de la proteína de infusión de insulina

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<400> 3

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29

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30

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<210> 4

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<211> 314

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Proteína de infusión de insulina

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<400> 4

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31

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<210> 5

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<211> 1011

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia de ácido nucleico de la proteína de infusión de insulina

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<400> 5

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34

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<210> 6

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<211> 336

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de infusión de insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

35

\hskip1cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Equs przewalskii

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Equs caballus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)...(32)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (64)...(65)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryctolagus cuniculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

40

\hskip1cm

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Balaenoptera physalus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Balaenoptera borealis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

44

\hskip1cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Elephas maximus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ovis aries

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Camelus dromedaries

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

50

\hskip1cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hystirix cristata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aotus trivirgatus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Macaca fasicularis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cercopithecus aethiops

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pan troglodytes

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ornithorhynchus anatinus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pongo pygmaeus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

58

\hskip1cm

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Gorilla gorilla

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Simiri sciureus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cricetulus longicaudatus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Acomys cahirinus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

66

\hskip1cm

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Chinchilla brevicaudata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cavia porcellus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Octodon degus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Didelphis virginiana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rodentia sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Psammomys obsesus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

74

\hskip1cm

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Spermophilus tridecemlineatus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cavia porcellus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ballus gallus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anas platyrhynchos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)...(32)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (59)...(60)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anser anser

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Selasphorus rufus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Danio rerio

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

82

\hskip1cm

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cyprinus carpio

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Batrachoididae gen. sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thunnus thynnus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Katsuwonus pelamis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lophius piscatorius

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Myxine glutinosa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus keta

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

90

\hskip1cm

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Myoxocephalus scorpius

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lepisosteus spatula

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Platichthys flesus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hydrolagus colliei

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

95

\hskip0.85cm

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Squalus acanthias

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Torpedo marmorata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Callorhinchus milii

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Petromyzon marinus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus gorbuscha

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Amia calva

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anguilla rostrata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oreochromis niloticus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Acipenser gueldenstaedti

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Piaractus mesopotamicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Verasper moseri

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anguilla anguilla

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenopus laevis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenopus laevis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trachemys scripta

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Alligator mississippiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zaocys dhumnades

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Crotalus atrox

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Preproinsulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Producto de proteína sin nombre con homología de insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proinsulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Preproinsulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proinsulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Análogo de insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Análogo de insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)...(26)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

136

\hskip1cm

137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

143

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)...(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

145

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)...(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

147

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)...(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X = cualquier aminoácido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

148

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

149

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

150

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

151

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Análogo de insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)...(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

152

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Análogo de insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

153

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Análogo de insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)...(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

154

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Análogo de insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

155

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

156

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

157

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Mutante de la insulina de homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X = cualquier aminoácido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

158

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Mutante de la insulina de homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

159

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Mutante de la insulina de homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

160

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Mutante de la insulina de homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

161

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina de homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

162

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina de homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

163

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\hskip1cm

164

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\hskip1cm

165

\hskip1cm

166

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de infusión de insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)...(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)...(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

167

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Escherichia coli

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)...(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)...(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

168

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Brevibacillus brevis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

169

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de infusión de insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

170

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de infusión de insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de infusión de insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

172

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de infusión de insulina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

173

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de infusión de insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Mini-proinsulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

174

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

175

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

176

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

177

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

178

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina de homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

179

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEAURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

180

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina de homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

181

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina de homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)...(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

182

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Insulina de homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

183

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Mutante de mini-proinsulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

184

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Mutante de mini-proinsulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

185

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Mutante de mini-proinsulina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

186

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido de insulina C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

187

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido de insulina C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

188

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido de insulina C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

189

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Punto de escisión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

190

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de retención de ER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

191

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de retención de ER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

192

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de retención de ER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

193

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de retención de ER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

194

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de retención de ER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

195

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lycopersicon esculentum Mill.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

196

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400>

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

197

\hskip1cm

198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 187

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Brassica napus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

199

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 748

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 158

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

200

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 738

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 159

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

201

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1047

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sesamum indicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 160

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

202

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Tabaco, secuencia señal de la proteína relacionada con la patogénesis del tabaco (PR-S)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 161

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

203

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia principal del factor alfa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 162

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

204

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia principal del factor alfa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 163

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

205

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia principal del factor alfa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 164

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

206

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia principal del factor alfa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 165

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

207

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia principal del factor alfa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 166

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

208

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 167

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia principal del factor alfa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 167

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

209

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia principal del factor alfa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 168

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

210

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia principal del factor alfa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 169

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

211

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia principal del factor alfa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 170

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

212

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia principal del factor alfa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 171

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

213

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Péptido espaciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 172

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

214

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<213> PRT

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido espaciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 173

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

215

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Punto de escisión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 174

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

216

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 175

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

217

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 176

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

218

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 177

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

219

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 178

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

220

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 179

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

221

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 180

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

222

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 181

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 181

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

223

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 182

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

224

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 183

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

225

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 184

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

226

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 185

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

227

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 186

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

228

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 187

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 187

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

229

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 387

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de ácido nucleico de la proteína de infusión de insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 188

\hskip1cm

230

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína del factor de insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 189

\hskip1cm

231

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 190

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 190

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

232

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 191

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 191

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

233

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 192

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

234

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 193

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

235

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 194

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 194

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

236

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1020

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de ácido nucleico de la proteína de infusión de la insulina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 195

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

237

\hskip1cm

238

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de fusión de la insulina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 196

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\hskip1cm

239

\hskip1cm

240

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Claims

1. Procedimiento para la expresión de la insulina en semillas vegetales que comprende:

(a): proporcionar un montaje de ácido nucleico híbrido que comprende en la dirección de la transcripción de 5' a 3' como componentes unidos de manera funcional:

(d): obtener insulina sustancialmente pura de dichas semillas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido que conserva el polipéptido de insulina en el ER se selecciona de entre el grupo constituido por KDEL, HDEL, DDEL, ADEL y SDEL.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho polipéptido que conserva el polipéptido de insulina en el ER se selecciona de entre el grupo constituido por la SEC. ID. nº: 150, la SEC. ID. nº: 151, SEC. ID. nº: 152, SEC. ID. nº: 153 y la SEC. ID. nº: 154.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha vesícula de almacenamiento obtenida del ER es un cuerpo aceitoso.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido que conserva el polipéptido de insulina en una vesícula de almacenamiento obtenida del ER es una proteína del cuerpo aceitoso.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha proteína del cuerpo aceitoso se selecciona de entre el grupo constituido por proteínas del cuerpo aceitoso constituidas por la oleosina, la caleosina y la esteroleosina.

7. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha proteína del cuerpo aceitoso se selecciona de entre el grupo constituido por la SEC. ID. nº: 156, la SEC. ID. nº: 157, SEC. ID. nº: 158, la SEC. ID. nº: 159 y la SEC. ID. nº: 160.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico híbrido contiene asimismo una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína estabilizadora fusionada en el marco de lectura a la secuencia de ácido nucleico que codifica la insulina.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicho ácido nucleico híbrido contiene asimismo una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia del péptido señal fusionada en el marco de lectura a la secuencia de ácido nucleico que codifica la insulina.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho péptido señal es una secuencia señal de la proteína relacionada con la patogénesis del tabaco (PR-S).

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho péptido señal es la SEC. ID. nº: 161.

12. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicho ácido nucleico que codifica dicha proteína estabilizadora permite la asociación del polipéptido de insulina con el cuerpo aceitoso en el momento de la cosecha y de la molienda de la semilla.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicha proteína estabilizadora codifica un anticuerpo monocatenario con especificidad para un cuerpo aceitoso.

14. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína estabilizadora fusionada en el marco de lectura a la secuencia de ácido nucleico que codifica la insulina se selecciona de entre el grupo de polipéptidos constituido por un solo anticuerpo monocatenario y una subunidad de la toxina B del cólera.

15. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácido nucleico se introduce en la célula vegetal en condiciones de integración genómica nuclear.

16. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el activador de la semilla preferida es un activador de faseolina.

17. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 16, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica la insulina se selecciona de entre el grupo de secuencias de ácido nucleico constituido por insulina humana, insulina porcina e insulina bovina.

18. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 17, en el que la insulina que codifica el ácido nucleico es una mini-insulina.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que la insulina que codifica la secuencia de ácido nucleico está optimizada para la utilización del codón de la planta.

20. Procedimiento para la obtención de semillas vegetales que comprenden insulina que comprende:

(d): obtener semillas de dicha planta en la que la semilla comprende insulina,

en el que dicho polipéptido de insulina se acumula dentro del retículo endoplásmico (ER) o en una vesícula de almacenamiento obtenida de ER, y en el que por lo menos el 0,1% de la proteína soluble total presente en la semilla es insulina.

21. Planta capaz de fijar la semilla que comprende una secuencia híbrida de ácido nucleico que comprende en la dirección 5' a 3' de transcripción:

(a): una primera secuencia de ácido nucleico que comprende un activador de semillas preferidas unido de manera funcional a la misma;

22. Semilla vegetal que comprende una secuencia híbrida de ácido nucleico que comprende en la dirección de transcripción de 5' a 3':

(a): una primera secuencia de ácido nucleico que comprende un activador preferido de semillas unido de manera funcional a la misma;

23. Secuencia de ácido nucleico que codifica insulina unida a una secuencia de ácido nucleico que comprende un activador preferido de la semilla unido a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es capaz de conservar el polipéptido de insulina en el retículo endoplásmico (ER) o una vesícula de almacenamiento obtenida del ER.