ES2309112T3 - Procesos y vestores para producir plantas transgenicas. - Google Patents

Abstract

Un proceso para producir plantas o células de plantas transgénicas capaces de expresar una secuencia codificante transgénica de interés bajo el control transcripcional de un promotor nuclear hospedador mediante la introducción en el genoma nuclear de un vector que comprende en su transcrito una secuencia para la unión a un ribosoma citoplásmico de plantas en una forma funcional para el inicio de la traducción de una secuencia codificante transgénica de interés aguas abajo y, posteriormente, la selección de células de plantas o plantas que expresan dicha secuencia codificante transgénica.

Description

Procesos y vectores para producir plantas transgénicas.

Área de la invención

La presente invención se refiere a procesos y vectores para producir plantas transgénicas así como células de plantas y a plantas obtenidas de tal modo.

Antecedentes de la invención

El logro de un patrón deseable y establemente heredable de expresión transgénica continúa siendo uno de los mayores problemas en biotecnología de plantas. El enfoque estándar es el de introducir un transgén como parte de una unidad de transcripción totalmente independiente utilizando un vector, donde el transgén está bajo el control transcripcional de secuencias promotoras y de terminación de la transcripción homólogas o heterólogas específicas de plantas (por ejemplo, ver US 05.591.605; US 05.977.441; WO 0053762 A2; US 05.352.605, etc.). Sin embargo, después de la integración dentro del ADN genómico, debido a la inserción al azar del ADN exógeno dentro del ADN genómico de la planta, la expresión del gen a partir de tales vectores transcripcionales se ve afectada por muchos factores diferentes del hospedador. Estos factores hacen a la expresión transgénica inestable, impredecible y frecuentemente llevan al silenciamiento del transgén en la progenie (Matzke & Matzke, 2000, Plant Mol Biol., 43, 401-415; S. B. Gelvin, 1998, Curr. Opin. Biotechnol., 9, 227-232; Vaucheret et al., 1998, Plant J., 16, 651-659). Existen casos bien documentados de silenciamiento de transgenes en plantas, que incluyen los procesos de silenciamiento génico transcripcional (TGS) y silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS). Hallazgos recientes revelan una estrecha relación entre la metilación y la estructura de cromatina en TGS e implicación de la ARN polimerasa ARN dependiente y una nucleasa en PTGS (Meyer, P., 2000, Plant Mol. Biol., 43, 221-234, Ding, S. W., 2000, Curr. Opin. Biotechnol., 11, 152-156; Iyer et al. Plant Mol. Biol., 2000, 43, 323-346). Por ejemplo, en TGS, el promotor del transgén puede sufrir frecuentemente metilación en muchos sitios de integración con una estructura de cromatina no favorable para la expresión transgénica estable. Como resultado, poner en práctica los métodos existentes requiere producir y analizar muchas plantas transgénicas independientes durante varias generaciones a fin de encontrar aquellas con el patrón de expresión estable deseado. Más aún, incluso tales plantas que muestran un patrón de expresión transgénica estable a través de las generaciones pueden silenciarse posteriormente bajo condiciones naturales, tales como ataque de estrés o patógenos. Los intentos existentes que tienden a mejorar el control de expresión, tal como el uso de regiones de unión al armazón nuclear (Allen, G. C., 1996, Plant Cell, 8, 899-913; Clapham, D, 1995, J. Exp. Bot., 46, 655-662; Allen G. C., 1993, Plant Cell, 5, 603-613) que flanquean la unidad de transcripción, podrían aumentar potencialmente la independencia y estabilidad de la expresión del transgén disminuyendo la dependencia a partir del denominado "variación del efecto de la posición" (Matzke & Matzke, 1998, Curr. Opin., Plant Biol., 1, 142-148; S. B. Gelvin, 1998, Curr. Opin. Biotechnol., 9, 227-232; WO 9844 139 A1, WO 006757 A1, EP 1 005 560 A1; AU 00.018.331 A1). Sin embargo, ellos sólo proporcionan una solución parcial al problema existente de diseñar plantas con un patrón de expresión de un transgén requerido.

El silenciamiento génico puede desencadenarse como un mecanismo de defensa de una planta mediante virus que infectan la planta (Ratcliff et al., 1997, Science, 276, 1558-1560; Al-Kaff et al., 1998, Science, 279, 2113-2115). En plantas no transgénicas, tal silenciamiento está dirigido contra el patógeno, pero en plantas transgénicas también puede silenciar el transgén, especialmente cuando el transgén comparte homología con un patógeno. Este es un problema, especialmente cuando se usan muchos elementos diferentes de origen viral en el diseño de vectores transcripcionales. Un ejemplo ilustrativo es la reciente publicación por Al-Kaff y colegas (Al-Kaff et al., 2000, Nature Biotech., 18, 995-999) que demostró que la infección por CaMV (virus del mosaico de la coliflor) de una planta transgénica con el gen BAR bajo el control del promotor 35S derivado de CaMV puede silenciar el transgén.

Durante los últimos años, el conjunto de elementos reguladores cis ha aumentado significativamente y actualmente incluye herramientas para un control espacial y temporal sofisticado de la expresión del transgén. Estos incluyen varios elementos transcripcionales tales como diversos promotores y terminadores de la transcripción así como elementos reguladores de la traducción o potenciadores de la expresión génica. En general, los potenciadores de la traducción pueden definirse como elementos de acción en cis que, junto con factores de acción en trans celulares, promueven la traducción del ARNm. La traducción en células eucarióticas se inicia generalmente por el reconocimiento de ribosomas desde el extremo 5' del ARNm con capuchón (capped). Sin embargo, el inicio de la traducción también puede ocurrir mediante un mecanismo que es independiente de la estructura del capuchón (cap). En este caso, los ribosomas se dirigen al codón de inicio de la traducción mediante elementos de sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). Estos elementos, inicialmente descubiertos en picornavirus (Jackson & Kaminski, 1995, RNA, 1, 985-1000), han sido también identificados en otros ARNm virales y de células eucariotas. Los IRES son elementos de acción en cis que, junto con otros factores celulares de acción en trans, promueven el ensamblaje del complejo ribosomal en el codón de inicio interno del ARNm. Esta característica de los elementos IRES ha sido explotada en vectores que permiten la expresión de dos o más proteínas a partir de unidades de transcripción policistrónicas en células de animal o de insecto. En la actualidad, se usan ampliamente en vectores de expresión bicistrónicos para sistemas animales, en los cuales el primer gen se traduce de una forma dependiente del capuchón y el segundo está bajo el control de un elemento IRES (Mountford & Smith, 1995, Trends Genet., 4, 179-184; Martines-Salas, 1999, Curr Opin Biotech., 19, 458-464). Habitualmente la expresión de un gen bajo el control de un IRES varía significativamente y está dentro de un intervalo del 6-100% comparado con la expresión dependiente del capuchón del primero (Mizuguchi et al., 2000, Mol. Ther., 1, 376-382). Estos hallazgos tienen implicaciones importantes para el uso de IRES, por ejemplo, para determinar qué gen deberá usarse como el primero en un vector bicistrónico. La presencia de un IRES en un vector de expresión confiere una traducción selectiva no sólo en condiciones normales, sino también en condiciones donde se inhibe la traducción dependiente del capuchón. Esto ocurre habitualmente en condiciones de estrés (infección viral, golpe de calor, detención del crecimiento, etc.,) normalmente debido a la ausencia de los factores de acción en trans necesarios (Johannes & Sarnow, 1998, RNA, 4, 1500-1513; Sonenberg & Gingras, 1998, Cur. Opin. Cell Biol, 10, 268-275).

Los vectores basados en la traducción han atraído recientemente la atención de los investigadores que trabajan con sistemas de células animales. Existe un informe relacionado con el uso de un cassette de IRES- recombinasa Cre para obtener una expresión específica de tejido de recombinasa cre en ratones. (Michael et al., 1999, Mech. Dev., 85, 35-47). En este trabajo, se introdujo un novedoso cassette IRES-Cre dentro de la secuencia del exón del gen EphA2, codificando un receptor Eph de proteína tirosina quinasa expresada tempranamente en el desarrollo. Este trabajo es de un interés específico en tanto que es la primera demostración del uso de vectores de traducción para la expresión específica de tejido de un transgén en células animales que dependen del control transcripcional del ADN hospedador. Otra importante aplicación para los elementos IRES es su uso en vectores para la mutagénesis insercional. En tales vectores, el gen marcador seleccionable o indicador está bajo el control de un elemento IRES y puede expresarse solamente si se inserta dentro de la región transcrita de un gen activo transcripcionalmente (Zambrowich et al., 1998, Nature, 392, 608-611; Araki et al., 1999, Cell Mol Biol., 45, 737-750). Sin embargo, a pesar de los progresos hechos en la aplicación de IRES en sistemas animales, los elementos IRES de estos sistemas no son funcionales en células de plantas. Más aún, puesto que la recombinación homóloga o dirigida a sitio en células de plantas es extremadamente rara y sin uso práctico, no se contemplaron intentos similares con células de plantas.

Hay significativamente menos datos sobre elementos IRES específicos de plantas. Recientemente, sin embargo, se descubrieron varios IRES que también son activos en plantas en tobamovirus crTMV (un virus TMV que infecta plantas Cruciferae) (Ivanov et al., 1997, Virology, 232, 32-43; Skulachev et al., 1999, Virology, 263, 139-154; WO 98/54342) y hay indicaciones de control de traducción de IRES en otros virus de plantas (Hefferon et al., 1997, J. Gen Virol., 78, 3051-3059; Niepel & Gallie, 1999, J. Virol., 73, 9080-9088). La tecnología IRES tiene un gran potencial para el uso en plantas transgénicas y vectores virales de plantas proporcionando una alternativa conveniente a los vectores existentes. Hasta la fecha, la única aplicación conocida de elementos IRES de plantas para la transformación nuclear estable está relacionada con el uso de IRES para expresar un gen de interés en constructos bicistrónicos (WO 98/54342). El constructo en cuestión comprende, en dirección 5' a 3', un promotor de la transcripción, el primer gen ligado a dicho promotor de la transcripción, un elemento IRES ubicado 3' al primer gen y el segundo gen ubicado 3' al elemento IRES, por ej., aún contiene un conjunto completo de elementos de control de la transcripción.

Sorprendentemente, hemos descubierto que los vectores de traducción que carecen de sus propios elementos de control de la transcripción y dependen enteramente de la inserción en un ADN genómico transcripcionalmente activo de un hospedador vegetal, permiten la recuperación de numerosos transformantes que expresan el gen de interés. Incluso más sorprendentemente, tales transformantes pueden detectarse fácilmente incluso en plantas hospedadoras con una proporción muy baja de ADN transcripcionalmente activo en sus genomas, tal como trigo. Esta invención es la base del proceso propuesto que permite el diseño de una expresión transgénica que está enteramente controlada por la maquinaria transcripcional del hospedador, minimizando así la cantidad de elementos de ADN regulador xenogenéticos conocidos por desencadenar el silenciamiento transgénico. También permite controlar la expresión del transgén de un modo novedoso, mediante la modulación de la relación de traducción dependiente del capuchón frente a traducción independiente del capuchón.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra la expresión del transgén a partir de cuatro de muchas variantes de vector de traducción posibles.

A - el vector contiene un potenciador de la traducción y un codón de terminación de la traducción;

B - el vector contiene un IRES como potenciador de la traducción y una región de terminación de la transcripción;

C - como en B, excepto que el IRES está precedido por codones de terminación de la traducción para los tres marcos de lectura;

D - como en C, excepto que el vector está flanqueado por regiones límite intrón/exón (3'I-5'E y 3'E-5'I) para proveer las características de un exón y facilitar su incorporación en el ARNm empalmado (spliced).

La Fig. 2 muestra el vector pIC1301 que contiene IRES_{MP,75}^{CR}, BAR y el terminador 35S.

La Fig. 3 muestra el vector pIC1521 que contiene una "horquilla", IRES_{CP,148}^{CR}, BAR y el terminador 35S. La estructura de "horquilla" sirve como una alternativa al codón de terminación de la traducción, evitando la formación de los productos de fusión de la traducción.

La Fig. 4 muestra el vector pIC1451 que contiene un gen BAR sin promotor y el terminador 35S.

La Fig. 5 muestra el vector pIC052 que contiene loxP, HPT y terminador nos.

La Fig. 6 muestra el vector pIC06-IRES que contiene IRES_{MP,75}^{CR}, el gen AHAS, en donde AHAS es la versión mutada del gen de acetohidroxiácido sintasa de Arabidopsis que confiere resistencia a herbicidas de imidazolina.

La Fig. 7 muestra los vectores pIC-DOG y pIC-CRE que contienen la secuencia codificante de la 2-desoxiglucosa-6-fosfato (2-DOG-6-P) fosfatasa y de la recombinasa cre de levadura bajo el control del promotor de actina de arroz, respectivamente.

La Fig. 8 muestra el vector de traducción con transposón incorporado pIC-dSpm y el vector pIC1491 que contiene una transposasa. El PHBT es un promotor quimérico que consiste en potenciadores p35S fusionados a la parte basal del gen C4PPDK de trigo.

La Fig. 9 muestra vectores de traducción basados en ADN-T.

A - los vectores contienen el gen BAR bajo el control de IRESmp^{75} (pICH3853) e IREScp^{148} (pICH4021), respectivamente;

B - los vectores contienen el gen HPT bajo control de IRESmp^{75} (pICH4661) y IREScp^{148} (pICH4673).

SA representa un sitio aceptor de empalme.

La Fig. 10 muestra los vectores de traducción basados en ADN-T pICH5410-UPI y pICH5410-CUPI diseñados para expresar proinsulina en plantas. LB: borde izquierdo, RB: borde derecho.

SA representa un sitio aceptor de empalme; C indica el péptido señal de la calreticulina del tabaco.

La Fig. 11 muestra los vectores binarios pICBV10 y pICBV2 (Ejemplo 9).

La Fig. 12 muestra el vector binario pICH5410 (Ejemplo 10).

Descripción detallada de la invención

Un objetivo primario de esta invención es proporcionar un proceso o vector novedoso para producir plantas transgénicas para la expresión estable de material transgénico integrado en un genoma de planta.

Este objeto se alcanza mediante un proceso para producir plantas o células de plantas transgénicas capaces de expresar una secuencia codificante transgénica de interés bajo el control transcripcional de un promotor nuclear del hospedador, mediante la introducción dentro del genoma nuclear de un vector que comprende en su transcrito una secuencia para unión a un ribosoma citoplásmico de plantas en una forma funcional para el inicio de la traducción y, aguas abajo de la misma, dicha secuencia codificante transgénica, y posteriormente la selección de células de plantas o plantas que expresan dicha secuencia codificante transgénica. El gen de interés está bajo el control de una señal de traducción, tal como pero no limitada a, un elemento IRES, y el vector no tiene un promotor ligado operativamente a él. Tales vectores dependen de inserciones transgénicas dentro del ADN transcripcionalmente activo del genoma hospedador.

Adicionalmente, se proporciona un novedoso vector para transformar células de plantas que, opcionalmente después del procesamiento en la célula hospedadora, comprende en su transcrito una secuencia para unión a un ribosoma citoplásmico de plantas en una forma funcional para el inicio de la traducción y, aguas abajo de la misma, una secuencia codificante, careciendo dicho vector de un promotor funcional para la transcripción de dicha secuencia codificante.

Las realizaciones preferidas se definen en las reivindicaciones secundarias.

La construcción de vectores para la transformación estable de plantas ha sido descrita por numerosos autores (para una revisión, ver Hansen & Wright, 1999, Trends in Plant Science, 4, 226-231; Gelvin, S. B., 1998, Curr. Opin. Biotech., 9, 227-232). El principio básico de todos estos constructos es idéntico -una unidad de transcripción completamente funcional que consiste en, en dirección 5' a 3', un promotor específico de planta, una parte estructural de un gen de interés y un terminador transcripcional, debe introducirse en la célula de la planta e integrarse establemente dentro del genoma con el fin de lograr la expresión de un gen de interés.

Hemos desarrollado una tecnología diferente para obtener transformantes nucleares estables de plantas. Nuestra invención se basa en el sorprendente hallazgo de que la maquinaria de transcripción de la planta hospedadora es capaz de conducir la formación de ARNm a partir de un transgén de interés en una célula de planta transformada. El proceso propuesto utiliza vectores que tienen un gen de interés que no está ligado operativamente a un promotor en dicho vector. En cambio, comprenden la región codificante de un gen de interés bajo el control solamente de elementos de traducción. Dicho elemento de traducción puede ser una secuencia para la unión, preferiblemente después de la transcripción, a un ribosoma citoplásmico de planta permitiendo así la traducción de una secuencia de codificación aguas abajo del mismo. Preferiblemente, dicho elemento de traducción es un sitio de entrada al ribosoma funcional en plantas y, más preferiblemente, un elemento IRES específico de plantas, en particular un elemento IRES de origen viral de plantas, de origen de plantas, de origen distinto de plantas o un elemento IRES diseñado artificialmente.

Tal ADN vector, después de la integración dentro de la región transcrita de un gen de planta residente, proporciona un ARNm quimérico y posteriormente se traduce en la proteína de interés a través del inicio de la traducción a partir de dicha secuencia para la unión a un ribosoma citoplásmico de planta (Fig. 1). Hasta donde conocemos, no existe técnica anterior que contemple este enfoque para generar transformantes nucleares estables de plantas. Toda la técnica anterior de utilización de vectores trampa de genes o trampa de potenciadores en plantas se centraron en tareas genómicas funcionales, por ej., en la identificación y aislamiento de secuencias codificantes de plantas y elementos reguladores. No se contempló la introducción y expresión de nuevas y útiles cualidades.

Fue muy sorprendente que, dada la baja proporción de ADN transcripcionalmente activo en la mayoría de los genomas de plantas, los experimentos de transformación utilizando vectores de traducción descritos en la presente invención, produjeran numerosos transformantes que expresan el gen de interés. Esto se observó tanto para el suministro de ADN mediado por Agrobacterium como para el suministro de ADN directo dentro de las células de plantas.

Nuestra invención aborda problemas inminentes de expresión fiable de transgenes. El transgén integrado dentro del genoma hospedador utilizando nuestro procedimiento inventado se basa en la maquinaria de transcripción incluyendo todos o la mayoría de los elementos reguladores transcripcionales del gen residente del hospedador, minimizando así el silenciamiento transgénico desencadenado habitualmente por elementos de ADN xenogenéticos. Los elementos IRES contemplados en esta invención son mucho menos elementos heterólogos que promotores; en muchos casos, puede utilizarse un IRES derivado de plantas.

Los vectores para suministro de transgenes pueden construirse de muchas maneras diferentes. Las versiones más simples consisten solamente en la región codificante de un gen de interés o una porción del mismo con una señal de traducción (vector de traducción básico). En un vector preferido, una señal de terminación de la traducción se proporciona aguas arriba de dichas secuencias para la unión a un ribosoma citoplásmico de planta. La señal de terminación puede ser, por ejemplo, al menos un codón de terminación y/o una estructura secundaria de horquilla de ARN o similar. Esta señal de terminación ocasiona el aborto de la traducción aguas arriba. Versiones más avanzadas pueden incluir un elemento IRES específico de planta seguido de la región codificante (de un gen) de interés. Versiones avanzadas del vector de traducción pueden incluir secuencias para la recombinación específica de sitio (para una revisión, ver Corman & Bullock, 2000, Curr Biotechnol., 11, 455-460) permitiendo bien el reemplazo posterior de un transgén existente o la integración de cualquier gen adicional de interés dentro de la región transcrita del ADN hospedador. Las recombinasas/integrasas específicas de sitio de bacteriófagos y levaduras se usan ampliamente para manipular ADN in vitro y en plantas. Los ejemplos de recombinasa-sitio de recombinación para el uso en esta invención incluyen los siguientes: recombinasa cre-sitio de recombinación LoxP, recombinasa FLP-sitio de recombinación FRT, recombinasa R-sitios de recombinación RS, integrasa phiC31-sitios de recombinación attP/attB, etc.

La introducción de sitios de empalme dentro del vector de traducción puede usarse para aumentar la probabilidad de incorporación del transgén dentro del transcrito procesado.

El vector puede además comprender una secuencia que codifica para un péptido señal de dirección entre dicha secuencia para unir un ribosoma citoplásmico de planta y dicha secuencia codificante. Los ejemplos preferibles de dichos péptidos señal incluyen un péptido de tránsito a plastos, un péptido de tránsito mitocondrial, un péptido señal de dirección nuclear, un péptido de dirección a vacuolas y un péptido señal de secreción.

Pueden usarse diversos métodos para suministrar vectores de traducción dentro de células de plantas, que incluyen la introducción directa de dicho vector dentro de una célula de planta mediante bombardeo de microproyectiles, electroporación o tratamiento de protoplastos mediado por PEG. La transformación de plantas mediada por Agrobacterium también representa una forma eficaz y preferida del suministro de vector de traducción. La mutagénesis insercional de ADN-T en Arabidopsis y Nicotiana con el gen indicador APH(3')II sin promotor estrechamente unido al borde derecho del ADN-T mostró que al menos el 30% de todos los insertos indujeron fusiones génicas transcripcionales y traduccionales (Koncz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 8467-8471).

También puede clonarse un vector de traducción dentro de elementos transponibles, facilitando la búsqueda de regiones transcritas adecuadas y proporcionando un patrón constitutivo o específico de tejido/órgano de expresión del transgén. Los elementos transponibles se usan ampliamente en plantas con el propósito del marcado de genes basado en la inactivación (Pereira & Aarts, 1998, Methods Mol Bio., 82, 329-338; Long & Coupland, 82, 315-328; Martín GB., 1998, Curr Opin Biotechnol., 9, 220-226). Se han desarrollado diferentes versiones de los sistemas de marcado por transposón. En la versión más simple, se usan transposones para mutagénesis insercional sin ninguna modificación excepto, posiblemente, para deleciones o mutaciones de cambio del marco de lectura a fin de generar elementos transponibles no autónomos. En versiones más sofisticadas, se insertan genes adicionales dentro de los elementos transponibles, por ej., marcadores de reinserción, genes indicadores, vectores de rescate de plásmidos (Carroll et al., 1995, Genetics, 13, 407-420; Tisier et al., 1999, Plant Cell, 11, 1841-1852). Existen los llamados sistemas trampa de potenciadores y trampa de genes (Sundaresan et al., 1995, Genes Dev., 9, 1797-810; Federov & Smith, 1993, Plant J. 3, 273-89). Los elementos transponibles en tales sistemas están equipados con un gen indicador sin promotor o un gen indicador bajo el control de un promotor mínimo. En el primer caso, el gen indicador puede expresarse después de la inserción dentro de la región transcrita del ADN hospedador, justo después del promotor del hospedador, o después de la inserción dentro de la región codificante del gen hospedador y de la creación de una fusión "en el marco de lectura" con el transcrito del gen hospedador.

La posibilidad de fusión "en el marco de lectura" exitosa puede incrementarse significativamente colocando en frente del gen indicador un conjunto de sitios donadores y aceptores de empalme para los tres marcos de lectura (Nussaume et al., 1995, Mol Gen Genet., 249, 91-101). En el segundo caso, la transcripción de un gen indicador se activará a partir del promotor mínimo siguiendo la inserción cerca del promotor del hospedador activo (Klimyuk et al., 1995, Mol Gen Genet., 249, 357-65). El éxito de tales enfoques para marcado por transposón favorece el uso de un enfoque similar para los vectores de traducción con elementos IRES en frente del gen de interés.

Todos los enfoques descritos anteriormente se dirigen a diseñar un sistema que coloque un transgén bajo el control de expresión del gen residente en el cual ocurre la inserción. Esto puede ser ventajoso para tareas y casos específicos. En muchos otros casos, puede ser preferible un patrón modificado de expresión del transgén. Para tales propósitos, el vector de traducción puede estar equipado con elementos transcripcionalmente activos, tales como potenciadores o regiones de unión la matriz o andamiaje (MAR) (para una revisión ver Allen G.C. et al., 2000, Plant Mol Biol., 43 361-376) o elementos aislantes (Geyer PK, 1997, Curr. Opin. Genet. Dev., 2, 242-248; Nagaya et al., 2001, Mol. Genet. Genomics, 265, 405-413), que pueden modular el patrón de expresión de un transgén. Cuando las MAR o elementos aislantes están situados en cualquier lado de un transgén su presencia habitualmente da como resultado una expresión mayor y más estable en plantas o líneas celulares transgénicas. Es también conocido que las secuencias potenciadoras pueden afectar a la potencia de promotores situados tan lejos como a varios miles de pares de bases de distancia (Müller, J., 2000, Current Biology, 10, R241-R244). La viabilidad de tal enfoque se demostró en experimentos con marcado por activación en Arabidopsis (Weigel et al., 2000, Plant Physiol., 122, 1003-1013), en donde los elementos potenciadores 35S situados en el ADN-T cambiaron el patrón de expresión de los genes residentes, y en el marcado por transposón de trampa de potenciador descrito anteriormente. En el último ejemplo, los potenciadores de genes residentes determinaron el patrón de expresión del transgén indicador. Este enfoque puede ser útil, por ejemplo, en las etapas iniciales de la transformación de plantas, o cuando es necesaria la modulación del patrón de expresión del transgén después de la transformación. Las secuencias potenciadoras pueden manipularse fácilmente por medio de sistemas de recombinación específicos de secuencia (insertarse, reemplazarse o eliminarse) dependiendo de las necesidades de la aplicación. Todos estos enfoques están contemplados como componentes útiles de la presente invención.

Nuestro enfoque fue preparar preferiblemente un conjunto de constructos basados en diferentes elementos IRES funcionales en células de plantas. Los constructos contienen elementos IRES seguidos por un gen marcador seleccionable de plantas y una señal de terminación de la transcripción o traducción. Estos constructos pueden usarse directamente para la transformación de células de plantas luego de linealizarse a partir del extremo 5' en frente de las secuencias IRES o puede clonarse dentro del ADN-T para transferencia de ADN mediada por Agrobacterium. Otro conjunto de constructos, que sirven como controles, contenían un gen seleccionable sin promotor (un control negativo) o un gen seleccionable bajo el control de un promotor constitutivo funcional en células monocotiledóneas y/o dicotiledóneas (un control positivo). Se transformó ADN dentro de células de plantas utilizando diferentes tecnologías adecuadas, tales como vector plasmídico Ti portado por Agrobacterium (US 5.591.616; US 4.940.838; US 5.464.763), bombardeo de partículas o microproyectiles (US 5.100.792; EP 444882 B1; EP 434616 B1). En principio, podrían usarse otros métodos de transformación de plantas, tales como, pero no limitados a, microinyección (WO 09209696; WO 09400583 A1; EP 175966 B1), electroporación (EP 00564595 B1; EP 00290395 B1; WO 08706614 A1).

El método de transformación depende de la especie de planta que se va a transformar. Nuestra ejemplificación incluye datos de la eficiencia de transformación para representantes de especies de plantas monocotiledóneas (por ej. Triticum monococcum, Pennisetum glaucum) y dicotiledóneas (por ej. Brassica napus, Orichophragmus violaceous, Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum), demostrando de este modo la viabilidad de nuestro enfoque para especies de plantas de diferente origen fitogenético y con diferentes densidades y organización de regiones transcritas dentro del genoma de una especie.

La secuencia codificante transgénica en el vector puede representar sólo una parte de un gen de interés, cuyo gen se reconstruye hasta una longitud funcional como resultado de la recombinación dirigida a sitio u homóloga u otros procesos de recombinación específicos. La traducción de la secuencia de interés es preferiblemente independiente del capuchón. El hospedador puede modificarse para inhibir (o potenciar) la traducción dependiente del capuchón o para potenciar (o inhibir) la traducción independiente del capuchón. Esto puede lograrse por tratamiento con agentes exógenos o incluyendo una secuencia en el vector o en dicha planta, cuya expresión tiene el efecto deseado.

En una realización de nuestra invención demostramos la transformación de especies monocotiledóneas y dicotiledóneas utilizando vectores de traducción. Hemos hallado que la frecuencia de transformación con suministro de ADN directo (bombardeo con microproyectiles, transformación de protoplastos mediada por PEG) puede ser aproximadamente el 1-5% de la de un vector de transcripción dependiendo de la especie de planta involucrada. Esta es habitualmente más baja para plantas con grandes genomas y una alta proporción de secuencias no codificantes repetitivas, por ej. monocotiledóneas (Triticum monococcum, Pennisetum glaucum), que para plantas con genomas más pequeños ricos en regiones codificantes (O. violaceous, Brassica napus, N. tabacum). El uso de un protocolo de transformación mediado por Agrobacterium proporciona una mayor eficiencia de suministro de transgenes en diferentes especies de plantas y la frecuencia de transformación de un vector de traducción puede variar aproximadamente en el intervalo del 3-10% con respecto a la de un vector de transcripción. Es importante mencionar aquí que la frecuencia de transformación no es un factor limitante en la tecnología de la ingeniería genética. En consecuencia, estas frecuencias comparativamente bajas no afectan de ningún modo ni la eficiencia de la transformación genética de plantas ni la duración del proceso.

Nuestra invención puede usarse para introducir cualidades útiles en las plantas, en particular con el objeto de mejorar la resistencia contra agresiones abióticas (tolerancia a estrés salino, por frío, sequía o fotooxidativo) y bióticas (resistencia a patógenos), modificar el metabolismo, incrementar el rendimiento, mejorar la calidad del alimento, etc. Los vectores de traducción son especialmente adecuados para tales propósitos, ya que proporcionan la flexibilidad necesaria para obtener un patrón de expresión requerido. El enfoque es de extremo valor para la genómica funcional, ya que proporciona la muy necesaria flexibilidad y sofisticación al muy limitado conjunto existente actualmente de sistemas de expresión de genes, los cuales están restringidos al uso de unos pocos promotores constitutivos, inducibles y específicos de tejidos y órganos. Estos promotores representan sólo una pequeña fracción de los elementos reguladores existentes in planta y no representan una elección adecuada para muchas aplicaciones diferentes. Los vectores de traducción con cualidades útiles pueden usarse directamente con el propósito de obtener plantas transgénicas con características fenotípicas requeridas y/o para identificar los elementos reguladores de plantas necesarios para proporcionar tales características regulando el patrón de expresión de dicha cualidad útil. Este enfoque es estratégicamente diferente de la tecnología existente de trampas de potenciadores, que permite sólo la identificación de elementos reguladores con la ayuda de genes indicadores, pero no la evaluación de la utilidad in situ de tales elementos para regular la expresión de un gen de interés.

Los genes de interés, o fragmentos de los mismos, que pueden introducirse, en una orientación con sentido o anti-sentido, utilizando nuestra invención, incluyen, pero no están limitados a: enzimas que modifican el almidón (almidón sintasa, enzima de fosforilación del almidón, enzima desramificante, enzima ramificante del almidón, enzima ramificante del almidón II, sintasa del almidón ligada a gránulos), sacarosa fosfato sintasa, sacarosa fosforilasa, poligalacturonasa, polifructano sucrasa, ADP glucosa pirofosforilasa, ciclodextrin glicosiltransferasa, fructosil transferasa, glucógeno sintasa, pectina esterasa, aprotinina, avidina, levansucrasa bacteriana, proteína glgA de E. coli, MAPK4 y ortólogos, enzima de asimilación/metabolismo del nitrógeno, glutamina sintasa, osmotina de plantas, 2S albúmina, taumatina, recombinasa/integrasa específica de sitio (FLP, Cre, R recombinasa, Int, SSVI Integrasa R, Integrasa phiC31, o un fragmento activo o variante de las mismas), isopentenil transferasa, Sca M5 (calmodulina de soja), toxina de tipo coleóptero o un fragmento insecticidamente activo, proteínas de fusión de la enzima conjugante de ubiquitina (E2), enzimas que metabolizan lípidos, aminoácidos, azúcares, ácidos nucleicos y polisacáridos, superóxido dismutasa, la forma de proenzima inactiva de una proteasa; toxinas de proteínas de plantas, fibra que altera cualidades en plantas productoras de fibras, toxina activa de coleópteros de Bacillus thuringiensis (toxina Bt2, proteína cristal insecticida (ICP), toxina CryIC, endotoxina delta, toxina de poliopéptido, protoxina, etc.), toxina específica de insectos AaIT, enzimas que degradan celulosa, celulasa E1 de Acidothermus celluloticus, enzimas modificadoras de lignina, alcohol cinamoílico deshidrogenasa, trehalosa-6-fosfato sintasa, enzimas de la ruta metabólica de la citoquinina, HMG-CoA reductasa, pirofosfatasa inorgánica de E. coli, proteína de almacenamiento de semillas, licopeno sintasa de Erwinia herbicola, ACC oxidasa, proteína codificada de pTOM36, fitasa, cetohidrolasa, acetoacetil CoA reductasa, PHB (polihidroxibutanoato) sintasa, proteína transportadora de acilo, napina, EA9, fitoeno sintasa de plantas no superiores, proteína codificada de pTOM5, ETR (receptor de etileno), piruvato fosfato diquinasa de plastos, proteína de poro transmembrana inducible por nematodos, función fotosintética o de plastos potenciadora de cualidades de la célula de plantas, estilbeno sintasa, una enzima capaz de hidroxilar fenoles, catecol dioxigenasa, catecol 2,3-dioxigenasa, cloromuconato cicloisomerasa, antranilato sintasa, proteína AGL15 de Brassica, fructosa 1,6-bifosfatasa (FBPasa), AMV RNA3, PVY replicasa, PLRV replicasa, proteína de cubierta de potivirus, proteína de cubierta de CMV, proteína de cubierta de TMV, replicasa de luteovirus, ARN mensajero de MDMV, replicasa geminiviral mutante, acil-ACP tioesterasa que prefiere C12:0 de Umbellularia californica, acil-ACP tioesterasa que prefiere C10 o C12:0 de planta, acil-ACP tioesterasa que prefiere C14:0 (luxD), factor A de sintasa de planta, factor B de sintasa de planta, 6-desaturasa, proteínas que tienen una actividad enzimática en la oxidación peroxisomal de ácidos grasos en células de plantas, acil-Coa oxidasa, 3-cetoacil-CoA tiolasa, lipasa, acetil-CoA-carboxilasa de maíz, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSP), fosfinotricin acetil transferasa (BAR, PAT), proteína CP4, ACC desaminasa, ribozima, proteína que tiene un sitio de escisión postraduccional, fusión de proteína que consiste en un dominio de unión a ADN de un activador transcripcional GaI4 y un dominio de activación transcripcional, una fusión traduccional de proteína oleosina con proteína de interés capaz de dirigir la proteína de fusión hacia la fase lipídica, gen DHPS que confiere resistencia a sulfonamida, nitrilasa bacteriana, 2,4-D monooxigenasa, acetolactato sintasa o acetohidroxiácido sintasa (ALS, AHAS), poligalacturonasa, nitrilasa bacteriana, fusión de la región hidrófoba amino terminal de una proteína translocadora de fosfato madura que reside en la membrana interna de envoltura del plasto con proteína de interés que se va a dirigir hacia dicha membrana, etc.

Las plantas pueden someterse a ingeniería genética utilizando nuestra invención para el propósito del cultivo molecular de proteínas comercialmente valiosas o farmacéuticamente importantes. En otra realización de esta invención, describimos la expresión de proinsulina como fusión de ubiquitina-proinsulina o como fusión de péptido señal de calreticulina-ubiquitina-proinsulina (Fig. 10). Las fusiones de ubiquitina (UBQ) permiten producir la proteína de interés con cualquier primer resto aminoacídico N-terminal incluyendo metionina en células eucarióticas, en tanto estas fusiones se procesan rápidamente y de forma precisa in vivo para liberar los grupos moleculares de proteínas fusionadas en formas libres (Hondred et al., 1999, Plant Physiol., 119, 713-724). También la síntesis de una proteína como una fusión de UBQ puede aumentar significativamente su acumulación.

Cualquier proteína humana o animal puede expresarse utilizando un vector de traducción. Ejemplos de tales proteínas de interés incluyen inter alia proteínas de respuesta inmune (anticuerpos monoclonales, anticuerpos de cadena única, receptores de célula T, etc.), antígenos, factores estimulantes de colonias, relaxinas, hormonas polipeptídicas, citoquinas y sus receptores, interferones, factores de crecimiento y factores de coagulación, enzima lisosomal enzimáticamente activa, polipéptidos fibrinolíticos, factores de coagulación sanguínea, tripsinógeno, \alpha-1-antitripsina (AAT), así como proteínas conservativas de función como fusiones, versiones mutantes y derivados sintéticos de las proteínas anteriormente mencionadas.

El proceso de la invención puede comprender además la introducción de un gen que codifica una proteína supresora de silenciamiento génico post-transcripcional o una variante o fragmento conservador de la función de la misma en una planta para suprimir el PTGS de dicha secuencia codificante transgénica. Dicho gen de proteína supresora de PTGS o variante o fragmento conservador de la función del mismo pueden proporcionarse a una planta en el mismo vector que lleva dicha secuencia codificante transgénica o en un vector extra. Dicho gen de proteína supresora de PTGS puede expresarse bajo el control traduccional de una secuencia para la unión a un ribosoma citoplásmico de plantas. Como alternativa, puede expresarse bajo el control transcripcional de un promotor. Dicha proteína supresora de PTGS es preferiblemente de origen viral o vegetal. Son ejemplos de proteínas supresoras de PTGS la proteína p25 del virus X de la patata, la proteína AC2 del virus del mosaico de la mandioca africana, la proteína P1 del virus moteado amarillo del arroz, la proteína 19K del virus del enanismo ramificado del tomate, rgs CAM o una variante o fragmento conservador de la función de una de estas proteínas. Dicha variante o fragmento conservador de la función tiene preferiblemente una identidad de secuencia del 75% con una de las proteínas anteriores. Pueden encontrarse detalles sobre proteínas supresoras de PTGS y su uso en el documento WO0138512.

Utilizando nuestra invención, el transgén de interés puede expresarse junto con un marcador seleccionable/regis-
trable a partir del mismo transcrito, permitiendo así la selección directa del mejor productor de proteína recombinante. Ejemplos de tales marcadores seleccionables/registrables incluyen inter alia genes o fragmentos de: neomicina fosfotransferasa II (NPTII), higromicina fosfotransferasa, aminoglicósido 6'-N-acetiltransferasa, 5-enoilpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa, fosfinotricin acetil transferasa (BAR), betaína aldehído deshidrogenasa (BADH), dihidrofolato reductasa (DFR1), 6'gentamicin acetiltransferasa (6'GAT), acetolactato sintasa (ALS), fosfomanosa-isomerasa (PMI), glifosato oxidorreductasa, acetohidroxiácido sintasa (AHAS), 2-desoxiglucosa-6-fosfato fosfatasa (2-DOG-6-P), luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP) y fusiones de genes marcadores seleccionables y elegibles. Opcionalmente, el marcador seleccionable puede unirse con un marcador contra-seleccionable (por ej. gen codA bacteriano que codifica la citosina desaminasa o el gen de la citocromo P450 monooxigenasa bacteriana, etc.) y puede estar flanqueado por sitios de recombinación reconocidos por una recombinasa o recombinasas específicas de sitio. Esto permite la eliminación del marcador seleccionable cuando se desea y facilita la selección de tales acontecimientos.

Cualquier especie de planta puede transformarse rutinariamente con protocolos de transformación establecidos utilizando el enfoque de vector de traducción aquí descrito, incluyendo especies leñosas como álamos y coníferas, cultivos agrícolamente importantes como algodón, Brassica, así como especies de plantas decorativas, como Chrysanthemum, etc.

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de vectores que contienen IRES

Se construyeron series de vectores de expresión mediada por IRES utilizando técnicas de biología molecular estándar (Maniatis et al., 1982, Molecular cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York). El vector pIC1301 (Fig. 2) se preparó por digestión del plásmido pIC501 (p35S-GFP-IRES_{MP,75}^{CR}-BAR-terminador 35S en pUC120) con HindIII y religando grandes fragmentos purificados en gel. La secuencia del IRES_{MP,75}^{CR} representa las 75 bases 3' terminales de la secuencia líder 5' no traducida del ARN subgenómico de la proteína de movimiento (MP) de un tobamovirus que infecta crucíferas (CR).

El vector pIC1521 (Fig. 3) se preparó siguiendo tres etapas de clonación. En la primera etapa, el pIC1311 se construyó ligando el gran fragmento HindIII-PstI de pIC031 con el pequeño fragmento HindIII-Ncol de pIC032 y el pequeño fragmento BspHI-PstI de pIC018. El constructo resultante pIC1311 (no mostrado) que contiene el gen BAR bajo el control del promotor 35S se usó como el control comparativo en los experimentos de transformación. El plásmido pIC1311 se digirió con HindIII-NruI y sus extremos se hicieron romos por tratamiento con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I. El gran fragmento de restricción se purificó en gel y se religó produciendo pIC1451 (BAR-terminador 35S sin promotor; ver Fig. 4). La ligación del gran fragmento Sac1-Pst1 de pIC1451 con el pequeño fragmento SacI-NcoI de pIC033 y el pequeño fragmento BspHI-PstI de pIC018 produjo pIC1521 (Fig. 3). Este constructo contiene una "horquilla" en frente del elemento IRES_{CP,148}^{CR} (CP significa proteína de cubierta). La estructura de horquilla se forma por la presencia de una repetición en tándem invertida formada por fragmentos KpnI-EcoRI y ClaI-KpnI de la secuencia polienlazadora de Bluescript II SK+.

Todos los vectores se linealizaron para el uso en los experimentos de transformación mediante digestión con enzima de restricción SacI (pIC1521; pIC1451) o HindIII (pIC1311; pIC1301) y se purificaron en gel para separarlos de los vectores no digeridos.

Ejemplo 2 Transformación de protoplastos mediada por PEG de Brassica napus Aislamiento de protoplastos

El aislamiento de protoplastos de Brassica se basó en protocolos previamente descritos (Glimelius K., 1984, Physiol. Plant., 61, 38-44; Sundberg & Glimelius, 1986, Plant Science, 43, 155-162 y Sundberg et al., 1987, Theor. Appl. Genet., 75, 96-104).

Se germinaron semillas esterilizadas (ver Apéndice) en placas de Petri de 90 mm que contenían ½ de medio MS con 0,3% de Gelrite. Las semillas se colocaron en filas levemente separadas una de otra. Las placas de Petri se sellaron, se inclinaron en un ángulo de 45º y se mantuvieron en la oscuridad durante 6 días a 28ºC. Los hipocótilos se cortaron en largos trozos de 1-3 mm con una hoja de afeitar afilada. Las hojas se reemplazaron a menudo para evitar la maceración del material. Los trozos de hipocótilos se colocaron en la solución TVL (ver Apéndice) para plasmolisar las células. El material se trató durante 1-3 horas a temperatura ambiente. Este pre-tratamiento mejora significativamente el rendimiento de protoplastos intactos. La solución de preplasmolisis se reemplazó con 8-10 ml de solución de enzima (ver Apéndice). La solución de enzima debe cubrir todo el material pero no debe utilizarse en exceso. El material se incubó a 20-25ºC en la oscuridad durante al menos 15 horas. Las placas de Petri se mantuvieron en un agitador rotatorio con agitación muy suave.

La mezcla de protoplastos y residuos celulares se filtró a través de un filtro de tamaño de malla de 70 mm. Las placas Petri se enjuagaron con 5-10 ml de solución W5 (Menczel et al., 1981, Theor. Appl. Genet., 59, 191-195) (ver también el Apéndice) que también se filtró y se combinó con el resto de la suspensión. La suspensión de protoplastos se transfirió a tubos Falcon estériles de 40 ml y los protoplastos se sedimentaron por centrifugación a 120 g durante 7 minutos. El sobrenadante se retiró y el sedimento de protoplastos se resuspendió en sacarosa 0,5 M. La suspensión se colocó en tubos de centrífuga estériles de 10 ml (8 ml por tubo) y cargados con 2 ml de solución W5. Después de 10 minutos de centrifugación a 190 g los protoplastos intactos se recogieron de la interfase con una pipeta Pasteur. Se transfirieron a nuevos tubos de centrífuga, se resuspendieron en manitol 0,5 M con CaCl_{2} 10 mM y se sedimentaron a 120 g durante 5 minutos.

Tratamiento con PEG

Los protoplastos fueron resuspendidos en el tampón de transformación (ver Apéndice). La concentración de protoplastos se determinó utilizando la cámara de recuento y luego se ajustó a 1-1,5 x 10^{6} protoplastos/ml. La gota de 100 \mul de esta suspensión se colocó en el borde inferior de la placa de Petri de 6 cm inclinada y se dejó durante unos pocos minutos permitiendo que los protoplastos sedimenten. Los protoplastos se mezclaron entonces suavemente con 50-100 \mul de solución de ADN (purificado por Qiagen, disuelto en TE a la concentración de 1 mg/ml). Luego se agregaron 200 \mul de solución de PEG (ver Apéndice) gota a gota a la mezcla de protoplastos/ADN. Después de 15-30 minutos el tampón de transformación (o solución W5) se agregó en pequeñas alícuotas (gota a gota) hasta que la placa estuvo casi llena (\sim6 ml). La suspensión se dejó sedimentar durante 1-5 horas. Luego los protoplastos se transfirieron a tubos de centrífuga, se resuspendieron en solución W5 y se sedimentaron a 120 g durante 5-7 minutos.

Cultivo y selección de protoplastos para transformantes

Los protoplastos se transfirieron a los medios de cultivo 8 pM (Kao & Michayluk, 1975, Planta, 126, 105-110; ver también Apéndice) y se incubaron a 25ºC, con baja densidad de luz, en placas de Petri de 2,5 cm o 5 cm con 0,5 ml o 1,5 ml de medio, respectivamente. La densidad de protoplastos era de 2,5 x 10^{4} protoplastos/ml. Los tres volúmenes de medio 8 pM fresco sin ninguna hormona se agregaron inmediatamente después de la primera división de los protoplastos. Las células se incubaron a alta intensidad de luz, 16 horas por día.

Después de 10-14 días, las células se transfirieron a medios K3 (Nagy & Maliga, 1976, Z. Pflanzenphysiol., 78, 453-455) con sacarosa 0,1 M, agarosa 0,13%, 5-15 mg/l de PPT y la concentración de hormona cuatro veces menor que en el medio 8 pM. Para facilitar la transferencia al medio fresco, las células se colocaron en la parte superior de papel de filtro estéril distribuyéndolas cuidadosamente en una fina capa. Las células se mantuvieron a alta intensidad de luz, 16 horas por día. Las colonias de células se transfirieron a placas Petri con medio K3 de diferenciación después de que su tamaño hubiera alcanzado aproximadamente 0,5 cm de diámetro.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Transformación de Triticum monococcum por bombardeo de microproyectiles Cultivo de células de plantas

Se hizo crecer una línea celular en suspensión de T. monococcum L. en medio MS2 (sales MS (Murashige & Skoog, 1962 Physiol. Plant., 15, 473-497), 0,5 mg/l de HCl de tiamina, 100 mg/l de inosit, 30 g/l de sacarosa, 200 mg/l de Bacto-Tryptone, 2 mg/l de 2,4-D) en matraces de 250 ml en un agitador rotatorio a 160 rpm a 25ºC y se subcultivó semanalmente. Cuatro días después de un subcultivo las células se dispersaron sobre discos de papel de filtro estériles de 50 mm en un MS2 (4 g/l) solidificado con gelrite con sacarosa 0,5 M.

Bombardeo de microproyectiles

Se llevó a cabo un bombardeo de microproyectiles utilizando el Sistema de Suministro de Partículas Biolistic PDS-1000/He (Bio-Rad). Las células se bombardearon a 900-1100 psi, con una distancia de 15 mm desde un punto de lanzamiento de macroportador hasta la pantalla de detención y una distancia de 60 mm desde la pantalla de detención hasta el tejido diana. La distancia entre el disco de ruptura y un punto de lanzamiento del macroportador era de 12 mm. Las células se bombardearon después de 4 horas de pretratamiento osmótico.

Se preparó un recubrimiento de ADN con oro de acuerdo con el protocolo original de Bio-Rad (Sanford et al., 1993, En: Methods in Enzymology, ed. R. Wu, 217, 483-509) como sigue: se mezclaron 25 \mul de polvo de oro (0,6, 1,0 mm) en glicerol al 50% (60 mg/ml) con 5 \mul de ADN plasmídico a 0,2 \mug/\mul, 25 \mul de CaCl_{2} (2,5 M) y 10 \mul de espermidina 0,1 M. La mezcla se agitó en vórtice durante 2 minutos seguido por incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, centrifugación (2000 rpm, 1 minuto), lavado con etanol al 70% y al 99,5%. Finalmente, el sedimento se resuspendió en 30 \mul de etanol al 99,5% (6 \mul/dosis).

Se llevó a cabo un nuevo procedimiento (PEG/Mg) de recubrimiento de ADN con oro como sigue: 25 \mul de una suspensión de oro (60 mg/ml en glicerol al 50%) se mezclaron con 5 \mul de ADN plasmídico en un tubo Eppendorf y posteriormente se suplementaron con 30 \mul de PEG al 40% en MgCl_{2} 1,0 M. La mezcla se agitó con vórtice durante 2 minutos y luego se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente sin mezclar. Después de la centrifugación (2000 rpm, 1 minuto) el sedimento se lavó dos veces con 1 ml de etanol al 70%, una vez con 1 ml de etanol al 99,5% y se dispersó finalmente en 30 \mul de etanol al 99,5%. Se cargaron alícuotas (6 \mul) de suspensión de ADN con oro en etanol sobre discos macroportadores y se permitió que secaran durante 5-10 minutos.

Preparación de ADN plasmídico

Se transformaron plásmidos en E. coli cepa DH10B, se dejaron crecer maxipreparaciones en medio LB y se purificó el ADN utilizando el kit de Qiagen.

Selección

Para experimentos de transformación estable, los filtrados con las células tratadas se transfirieron sobre el medio sólido MS2 con el agente selectivo apropiado esterilizado por filtración (150 mg/l de higromicina D (Duchefa); 10 mg/l de bialafos (Duchefa). Las placas se incubaron en la oscuridad a 26ºC.

Ejemplo 4 Transformación de Orychophragmus violaceus por bombardeo de microproyectiles Preparación del cultivo en suspensión

Se hicieron crecer plantas de O. violaceus in vitro en medio MS, Gelrite al 0,3% (alternativamente, ½ MS, sacarosa al 2% y agar al 0,8%) a 24ºC y un fotoperiodo de 16/8 horas día/noche durante 3-4 semanas. Se cortaron cuatro-seis hojas (dependiendo del tamaño) en pequeños trozos y se transfirieron a la caja Magenta con 30 ml de Medio Inductor de Callos (CIM) (ver Apéndice). El material se mantuvo durante 4-5 semanas en luz tenue (o en la oscuridad) a 24ºC y con agitación vigorosa. Durante este periodo se agregó medio CIM fresco para mantener el tejido de plantas en la caja Magenta cubierto con líquido. Las células adheridas a la pared de la caja Magenta se liberaron al medio invirtiendo y agitando vigorosamente la caja.

Preparación de material de plantas para bombardeos de microproyectiles

La alícuota de suspensión de células se colocó cuidadosamente sobre el papel de filtro estéril soportado por medio CIM sólido en una placa de Petri. La placa de Petri con el material de plantas se mantuvo en la oscuridad durante 5-7 días. Cuatro horas antes del procedimiento, el papel de filtro con células se trasladó a CIM fresco con 10% de sacarosa. El bombardeo de microproyectiles se llevó a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 3. Catorce horas después del bombardeo, el material se transfirió a CIM con 3% de sacarosa y se mantuvo en la oscuridad.

Selección de transformantes

Dos-cuatro días después del bombardeo, el papel de filtro con células se transfirió a la placa con CIM suplementado con el agente de selección apropiado (10-15 \mug/ml de PPT). Cada siete días el material se transfirió a medio de selección fresco. Las placas se mantuvieron en la oscuridad y después de aproximadamente 6 semanas el material de plantas se transfirió a las placas de Petri con Medio Inductor de la Morfogénesis (MIM) (ver Apéndice) suplementado con el agente de selección apropiado (10-15 \mug/ml de PPT). Las placas se incubaron a alta intensidad de luz, duración del día de 16 horas.

Ejemplo 5 Transformación de Triticum monococcum con loxP-gen HPT sin promotor

Se linealizó el constructo pIC052 (Fig. 6) por digestión con enzima de restricción HindIII, se purificó en gel para separar el material no digerido y se utilizó para el bombardeo de microproyectiles como se ha descrito anteriormente (ver Ejemplo 3). El vector linealizado contiene el polienlazador de pUC19 (57 pb) seguido por un sitio loxP a partir del extremo 5' del gen HPT. En general, se localizan aproximadamente 100 pb en el extremo 5' del codón de inicio de la traducción del gen HPT. Se transformaron treinta y cuatro placas y después de 1,5 meses de selección sobre medio que contenía higromicina (Ejemplo 3), se recuperaron tres colonias resistentes a higromicina. La secuencia de los sitios de integración recuperados por IPCR confirmó la independencia de los tres transformantes.

Ejemplo 6 Transformación de hojas de Orychophragmus con IRES_{MP,75}^{CR}-AHAS sin promotor

La acetohidroxiácido sintasa (AHAS) de plantas es una proteína nuclear codificada, dirigida a cloroplastos, que cataliza la primera etapa en la biosíntesis de los aminoácidos de cadena ramificada. Se halla bajo control alostérico por estos aminoácidos y puede inhibirse por diversas clases de herbicidas.

Se preparó el constructo pIC06-IRES reemplazando el promotor del gen AHAS(Ser653-Asn) de Arabidopsis (fragmento PstI-NcoI de 1,3 Kb) en pIC06 con la secuencia IRES_{MP,75}^{CR}. El constructo final (Fig. 6) contenía la versión mutada del gen de la acetohidroxiácido sintasa (AHAS) de Arabidopsis con una única sustitución de aminoácido (Ser653Asn) que confiere resistencia a la familia de herbicidas de imidazolina (Sathasivan, Haughn & Murai, 1991, Plant Physiol., 97, 1044-1050). El plásmido se linealizó por tratamiento con la enzima de restricción SaII y se usó para el bombardeo de microproyectiles de un cultivo en suspensión de O. violaceous recientemente inducido. Se cortaron hojas de plantas O. violaceous estériles en pequeños trozos y se colocaron en el Medio de Alta Auxina (HAM) líquido (ver Apéndice) en cajas Magenta en un agitador rotatorio para inducir un cultivo en suspensión. Después de 7-14 días el cultivo en suspensión se transfirió a las placas de Petri con Medio para Verdeo (GM) cubiertas con papel de filtro estéril (ver Apéndice). Después de 3 días el papel de filtro con las células se transfirió a GM suplementado con sacarosa 0,4 M. Después de cuatro horas las células se utilizaron para bombardeo de microproyectiles con ADN linealizado de pIC06-IRES, como se ha descrito en el Ejemplo 3. Después de 14 horas, el papel de filtro con células se transfirió a GM, sacarosa al 3%. Dos días después, las células se transfirieron a GM con imazetapir 0,7 \muM (AC263, 499 o Pursuit, American Cyanamid). Las células se cultivaron cada 7-10 días. Se identificaron supuestos acontecimientos después de aproximadamente cuatro-seis semanas y los transformantes se seleccionaron bajo alta intensidad de luz, 16 horas por día, sobre el medio de regeneración (RM) con imazetapir 1-2 \muM.

Ejemplo 7 Expresión del gen 2-DOG-6-P utilizando un vector de traducción

El objetivo de este ejemplo es demostrar la posibilidad de manipulación con células de plantas transgénicas que ya contienen secuencias de vectores de traducción con los sitios de recombinación específicos de secuencia.

Las células de T. monococcum resistentes a higromicina transformadas con el vector pIC052 (Ejemplo 5) se usaron para co-bombardeo de microproyectiles con dos plásmidos, pIC-DOG y pIC-CRE (Fig. 7). El plásmido pIC-DOG contiene ADNc de 2-desoxiglucosa-6-fosfato (2-DOG-6P) fosfatasa sin promotor (patente WO 98/45456) flanqueado por dos sitios loxP. La integración mediada por Cre del gen 2-DOG-6-P en el sitio loxP de transformantes que contienen pIC052 conduce a la expresión de 2-DOG-6-P a partir de un promotor residente. Tal expresión confiere resistencia a la 2-desoxiglucosa (2-DOG). Las colonias resistentes se seleccionaron como se ha descrito en el Ejemplo 3, pero utilizando 0,075-0,1% de 2-DOG como el agente selectivo.

Ejemplo 8 Vector de traducción incorporado por transposón

El objetivo de este ejemplo es mostrar una vía alternativa para la transformación directa de un vector de traducción de dirección a un sitio de transcripción deseado en un genoma hospedador.

La co-transformación de células de O. violaceous con los constructos mostrados en la Fig. 8 y la selección de transformantes se llevó a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 4. El elemento dSpm transponible no autónomo contiene un gen BAR sin promotor precedido por su IRES_{MP,75}^{CR} del extremo 5'. La transposición inducida por transposasa Spm facilita la búsqueda de regiones transcripcionalmente activas con un patrón de expresión deseado (en este caso -constitutivo) en dicho genoma hospedador, incrementando así el número de transformantes primarios recuperados. De hecho, el número de transformantes fue 3-4 veces más alto que con el gen BAR-IRES_{MP,75}^{CR} (pIC1301, Fig. 2).

Ejemplo 9 Vectores de traducción basados en ADN-T

El objetivo de este ejemplo es demostrar un suministro de vectores de traducción en células de plantas mediado por Agrobacterium.

Los constructos pICH3853, pICH4021, pICH4661 y pICH4673 (Fig. 9A y B) se prepararon en base a vectores binarios pICBV10 y pICBV2 (ver Fig. 11). Los constructos pICH3853 y pICH4021 contienen IRES-BAR precedido por tres sitios aceptores de empalme (SA) de modo que facilitan la incorporación del vector de traducción que codifica para BAR en los transcritos. Una estrategia idéntica se usó para pICH4661 y pICH4673 que contienen fusiones de IRES-HPT que confieren resistencia frente a higromicina. Para comparar la eficiencia de vectores de traducción versus vectores de transcripción, se incorporó también el gen NPTII bajo control del promotor NOS en pICH3853 y pICH4021. Los ADN-T de pICH3853 y pICH4021 se introdujeron en plantas de Arabidopsis thaliana (Col-0) como se describe en Bent et al., (1994, Science, 285, 1856-1860). Se cosecharon las semillas tres semanas después de la infiltración al vacío y se dividieron en dos grupos iguales. Un grupo se esterilizó y se seleccionó para transformantes en medio GM + glucosa al 1% (Valvekens et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5536-5540.) que contenía 50 mg l^{-1} de kanamicina. El otro grupo se hizo germinar en tierra y se roció varias veces con solución de fosfinotricina (50 \mug/ml). Se contó el número de transformantes de cada experimento de selección. La relación del número de transformantes obtenidos con vectores de traducción con respecto al obtenido con vectores de transcripción (ppt^{R}:Km^{R}) estaba aproximadamente en el rango de 1:10-1:25 dependiendo del constructo utilizado.

Todos los constructos descritos aquí se usaron también para transformaciones de discos de hojas de Nicotiana tabaccum mediadas por Agrobacterium (Horsh et al., 1985, Science, 227, 1229-1231) e hipocótilo de Brassica napus (cv. Westar) (Radke et al., 1988, Theor. Appl. Genet., 75, 685-694). A pesar de la diferencia de 10-20 veces en el tamaño del genoma de Arabidopsis comparado con Brassica napus y tabaco, respectivamente, la frecuencia de transformantes de Brassica y tabaco obtenida con vectores de traducción, era comparable a la de Arabidopsis (10-15 veces más baja comparada con vectores de transcripción).

Ejemplo 10 Producción de compuestos farmacéuticos en plantas

El objetivo de este ejemplo es demostrar la posibilidad de producir proteínas farmacéuticas en plantas utilizando un vector de traducción como un cassette de expresión.

El reclonado de fusiones de traducción de ubiquitina 11 de Arabidopsis (Gene Bank L05362) - proinsulina humana (Gene Bank NM000207) y péptido señal de la calreticulina del tabaco (Borisjuk et al., 1999, Nat Biotechnol., 17, 466-469) - ubiqutina11-proinsulina humana como fragmentos NcoI-BamHI en el sitio NcoI-BamHI de vector binario pICH5410 basado en pCBV (ver Fig. 12), produciendo los constructos pICH5410-UPI y pICH5410-CUPI, respectivamente (Fig. 10).

Transformación de Pennisetum glaucum

Semillas inmaduras de las líneas PEN3, PEN5, HGM100 de Pennisetum glaucum (10-15 días post-antesis) fueron esterilizadas en la superficie por inmersión en etanol al 70% durante 5 minutos, seguido por la incubación en solución de hipoclorito de sodio al 1% con agitación a 125 rpm durante 20 minutos y finalmente por 3 lavados en agua destilada estéril. Se aislaron asépticamente embriones inmaduros (1,0 mm de longitud, transparentes) y se colocaron, con un escutelo hacia arriba, en un medio MS sólido (Murashige y Skoog 1962) con 2 mg/l de 2,4-D (MS2). Se seleccionaron los callos nodulares compactos utilizando un estereomicroscopio y se subcultivaron cada mes en MS2 fresco. Los cultivos se mantuvieron en la oscuridad a 25ºC.

Se llevó a cabo la preparación del plásmido y el bombardeo de microproyectiles como se describe en el Ejemplo 3.

Siete días después del bombardeo, los callos tratados se transfirieron al medio de selección MS con 2 mg/l de 2,4-D y 150 mg/l de Higromicina B y se cultivaron en la oscuridad. Dos a cuatro meses más tarde, los tejidos de callos en crecimiento se subcultivaron en el medio de regeneración MS suplementado con 5 mg/l de zeatina, 1 mg/l de quinetina, 0,1 mg/l de 2,4-D y 100 mg/l de Higromicina B. Las plántulas en regeneración se transfirieron a tarros con el medio MS sin hormonas, de fuerza media, con 50 mg/l de Higromicina B. Las plántulas totalmente desarrolladas se aclimataron durante 5-7 días en un medio líquido que contenía las sales MS diluidas cuatro veces. Las plantas con raíces fuertes se transplantaron a tierra y se cultivaron en condiciones de invernadero hasta la madurez.

Para ensayar la presencia de proinsulina en plantas transgénicas, la proteína soluble total se extrajo del tejido de hojas homogeneizado, se separó mediante SDS/PAGE y las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa en un celda Trans-Blot de BioRad (Tzen et al., 1990, Plant Physiol., 94, 1282-1289). Se llevó a cabo un análisis de inmunotransferencia con anticuerpos monoclonales contra proinsulina.

Apéndice Esterilización de semillas

Remojar las semillas en solución de PPM al 1% durante al menos 2 horas (es preferible durante una noche). Lavar las semillas en EtOH al 70% durante 1 minuto, luego esterilizar en solución de cloro al 10% con SDS al 0,01% o Tween 20) en matraz de 250 ml colocado en el agitador rotatorio. Lavar las semillas en 0,5 l de agua estéril.

1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

5

6

Las soluciones de hormona se esterilizaron por filtración y se agregaron a medios autoclavados.

Claims (34)

1. Un proceso para producir plantas o células de plantas transgénicas capaces de expresar una secuencia codificante transgénica de interés bajo el control transcripcional de un promotor nuclear hospedador mediante la introducción en el genoma nuclear de un vector que comprende en su transcrito una secuencia para la unión a un ribosoma citoplásmico de plantas en una forma funcional para el inicio de la traducción de una secuencia codificante transgénica de interés aguas abajo y, posteriormente, la selección de células de plantas o plantas que expresan dicha secuencia codificante transgénica.

2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho vector comprende adicionalmente una secuencia que codifica un péptido señal de dirección entre dicha secuencia para la unión a un ribosoma citoplásmico de plantas y dicha secuencia codificante transgénica.

3. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde dicho vector comprende adicionalmente una señal de terminación de la traducción aguas arriba de dicha secuencia para la unión a un ribosoma citoplásmico de plantas.

4. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho vector comprende adicionalmente un sitio o sitios donadores o aceptores de empalme aguas arriba de dicha secuencia para la unión a un ribosoma citoplásmico de plantas y/o aguas abajo de dicha secuencia codificante transgénica.

5. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho vector comprende adicionalmente potenciadores de la traducción.

6. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho vector comprende adicionalmente potenciadores de la transcripción.

7. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho vector comprende adicionalmente regiones de unión a la matriz.

8. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho vector comprende adicionalmente elementos aislantes.

9. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho vector comprende adicionalmente uno o más cistrones aguas abajo de dicha secuencia codificante transgénica, en donde dichos cistrones adicionales están operativamente unidos a secuencias adicionales para la unión a un ribosoma citoplásmico de plantas o están bajo control de uno o más promotores.

10. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho vector comprende adicionalmente uno o más sitios de recombinación reconocidos por recombinasas.

11. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha secuencia para la unión a un ribosoma citoplásmico de plantas es un sitio interno de entrada al ribosoma.

12. El proceso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicho sitio interno de entrada al ribosoma es de origen viral de plantas.

13. El proceso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicho sitio interno de entrada al ribosoma es de origen de plantas.

14. El proceso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicho sitio interno de entrada al ribosoma es de origen distinto de plantas.

15. El proceso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicho sitio interno de entrada al ribosoma es un sitio interno de entrada al ribosoma diseñado artificialmente.

16. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 a 15, en donde dicho péptido señal de dirección se selecciona del grupo que consiste en un péptido de tránsito a plastos, un péptido de tránsito mitocondrial, un péptido señal de dirección nuclear, un péptido de dirección a vacuolas y un péptido señal de secreción.

17. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16, en donde dicha secuencia codificante transgénica confiere una cualidad útil.

18. El proceso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde dicha cualidad útil es de origen de plantas.

19. El proceso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde dicha cualidad útil es de origen distinto de plantas.

20. El proceso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde dicha cualidad útil se diseña artificialmente.

21. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 17 a 20, en donde dicha secuencia codificante transgénica que codifica dicha cualidad útil es un gen o un fragmento del mismo en una orientación antisentido.

22. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 21, en donde dicho vector se incorpora adicionalmente en un transposón de tal modo que se dirige el vector a un sitio de transcripción deseado en dicho genoma nuclear hospedador.

23. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 22, en donde dicho proceso se usa en combinación con cualquier método de transformación dirigido a sitio u homólogo que permite dirigir el vector al sitio de inserción deseado.

24. El proceso de acuerdo con la reivindicación 23, en donde dicha secuencia codificante transgénica presente en dicho vector representa sólo una parte de un gen de interés cuyo gen se reconstruye hasta una longitud funcional como resultado de una recombinación dirigida a sitio u homóloga u otra recombinación específica.

25. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 24, en donde la traducción de una o varias de dicha secuencia o secuencias codificantes de dicho vector es dependiente del capuchón.

26. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 25, en donde la traducción de uno o varios genes introducidos en dicho genoma nuclear mediante dicho proceso se controla modificando el hospedador de tal modo que se potencia o inhibe la traducción independiente de capuchón (cap) o se potencia o inhibe la traducción dependiente del capuchón.

27. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 26, en donde dicho vector comprende adicionalmente una región de terminación de la traducción y/o una región de terminación de la transcripción funcional en dicha planta y/o dicha célula.

28. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 27, en donde dicha planta o células de plantas transgénicas expresan un gen de proteína supresora de silenciamiento génico post-transcripcional transgénico.

29. El proceso de la reivindicación 28, en donde dicho gen de proteína supresora de silenciamiento génico post-transcripcional se introduce en dicho genoma nuclear con dicho vector.

30. El proceso de la reivindicación 28, en donde dicho gen de proteína supresora de silenciamiento génico post-transcripcional se introduce en un vector adicional.

31. El proceso de una de las reivindicaciones 28 a 30, en donde dicho gen de proteína supresora de silenciamiento génico post-transcripcional se expresa bajo el control traduccional de una secuencia para la unión a un ribosoma citoplásmico de plantas.

32. El proceso de una de las reivindicaciones 28 a 30, en donde dicho gen de proteína supresora de silenciamiento génico post-transcripcional se expresa bajo el control traduccional de un promotor.

33. Un vector para transformar células de plantas que comprende, opcionalmente después de la transcripción en una célula hospedadora, una secuencia para la unión a un ribosoma citoplásmico de plantas para el inicio de la traducción y, aguas abajo de la misma, una secuencia codificante de interés, estando dicho vector carente de un promotor funcional para la transcripción de dicha secuencia codificante.

34. Células de plantas o plantas que expresan una secuencia codificante transgénica de interés bajo el control transcripcional de un promotor nuclear hospedador, teniendo dichas células de plantas o plantas introducido en el genoma nuclear un constructo que comprende en su transcrito una secuencia para la unión a un ribosoma citoplásmico de plantas de una forma funcional para el inicio de la traducción de la secuencia codificante transgénica de interés aguas debajo de dicha secuencia para la unión a un ribosoma citoplásmico de plantas.