ES2306794T3 - Moleculas de autoensamblaje. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de formación de un complejo multimérico que tiene afinidad por una diana, comprendiendo dicho procedimiento: obtener una pluralidad de AB5 derivado de moléculas de autoensamblaje, incluyendo dichas moléculas de autoensamblaje unidades de autoensamblaje complementarias cada una de las cuales está de manera operativa conectada a un dominio de interacción específico para la diana; combinar dichas moléculas de autoensamblaje de manera que al menos tres de dichas unidades de autoensamblaje sustancial y simultáneamente se unan entre sí y permitan que el dominio de interacción se una a la diana.

Description

Moléculas de autoensamblaje.

Campo de la invención

La invención se refiere a moléculas de autoensamblaje, y particularmente moléculas de autoensamblaje útiles para formar complejos que tienen una afinidad con las dianas de interés.

Antecedentes de la invención

Se conocen una diversidad de moléculas que tienen afinidad para los sitios de unión particulares en células. Por ejemplo, anticuerpos y receptores de superficie celular se pueden unir a dianas específicas, la resistencia de la interacción entre una molécula dada y su diana será en algunos casos baja.

Los esfuerzos para incrementar la afinidad de fragmentos de anticuerpos a sus dianas han dado como resultado la producción de fragmentos de anticuerpos dimerizados, en los que el dímero tiene dos sitios de unión, cada uno de los cuales es específico para la diana de anticuerpo. La dimerización se ha llevado a cabo mediante una diversidad de medios, implicando en general la modificación de una región de "cola" unida al fragmento de anticuerpo. De este modo, estructuras secundarias de autoasociación tales como haces de hélices se han empleado en un esfuerzo para producir unidades dimerizables que retienen su especificidad y capacidad de unirse a una diana de interés. Sin embargo, de dominios de autoasociación conocidos pueden presentar varios problemas, incluyendo agregación no deseada y no funcional de las moléculas, así como dificultades en la obtención de un espaciado óptimo entre las moléculas, que se produce por los límites sobre el control sobre la geometría de la estructura resultante. A menudo es deseable que la región de unión de cada molécula en un dímero se localice sobre la misma cara del dímero, con espaciado suficiente entre las moléculas para permitir el ajuste de sus moléculas diana.

Han sido limitados los esfuerzos exitosos en la formación de oligómeros de más de dos subunidades de autoasociación en asociación con las regiones de unión específicas. En un caso, se produjo un tetrámero de subunidades que comprende una hélice modificada del factor de transcripción GCN4 conjuntamente con un "minianticuerpo". De manera similar, el dominio de ensamblaje enrollado en espiral de la proteína de matriz oligomérica de cartílago condensado a un pequeño péptido se ha usado para formar pentámeros. Sin embargo, la estructura del ensamblaje oligomérico de cartílago se cree que es fino y en forma de barra que lo puede hacer inadecuado para uso con péptidos o proteínas mayores para las que se puede necesitar un espaciado entre unidades mayor.

Una descripción de los esfuerzos para producir las moléculas de autoensamblaje se puede encontrar en Pluckthun et al., 1997, ref. 1, así como en Terskikh et al., 1997 ref. 2.

Sumario de la invención

Avidez, la contribución notable de la multivalencia a la resistencia de las interacciones biomoleculares, es una característica clave de las interacciones antígeno - anticuerpo. En el presente documento se proporciona un procedimiento para mejorar en gran medida las propiedades de unión de los dominios de interacción tales como anticuerpos de un solo dominio (dAbs) mediante la introducción de avidez. Los dominios de interacción se condensan a una unidad de autoensamblaje adecuado tal como la subunidad B de la verotoxina de Escherichia coli ("VTB"). VTB se autoensambla para formar un homopentámero. Cuando VTB se condensa a un dominio de interacción, las moléculas resultantes tienden a pentamerizarse. Tales moléculas pentamerizadas se denominan pentacuerpos.

La introducción de la avidez es una forma muy buena de mejorar las propiedades de unión de antígeno de los fragmentos de anticuerpos. La multimerización es una estrategia particularmente atractiva para la mejora de las propiedades de unión de antígeno dAb.

En una realización de la invención se proporciona un procedimiento de formación de un complejo multimérico de autoensamblaje, comprendiendo dicho procedimiento la obtención de moléculas de autoensamblaje, comprendiendo al menos tres de las moléculas de autoensamblaje una unidad de autoensamblaje complementaria conectada de manera operativa a un dominio de interacción; y combinando las moléculas de autoensamblaje de manera que al menos tres unidades de autoensamblaje se unen de manera simultánea a otra para formar el complejo.

En otra realización de la invención se proporcionan moléculas de autoensamblaje, comprendiendo cada una unidad de autoensamblaje complementaria conectada de manera operativa a un dominio de interacción. Más particularmente, la presente invención proporciona una molécula de autoensamblaje que comprende una pluralidad de partes proteináceas o peptídicas conectadas de manera operativa conjuntamente; comprendiendo dicha una primera parte una región de autoensamblaje capaz de unirse a las regiones de autoensamblaje de al menos otras moléculas de autoensamblaje de la misma o diferente composición, para formar un complejo de al menos tres moléculas de autoensamblaje, y comprendiendo dicha una segunda parte un dominio de interacción adaptado para interactuar de manera específica con una región diana sobre otra molécula diferente.

Breve descripción de los dibujos

Éstas y otras ventajas de la invención serán patentes leyendo la siguiente descripción detallada y tras referencia a los dibujos en los que:

La Figura 1 es una representación de la estructura primaria pensada de una realización de la proteína de fusión VTB-dAb.

La Figura 2 es una representación de tipo banda de la estructura pensada de una realización de los dominios de oligomerización de VTB en complejo con oligosacárido y con dAbs condensados. La superficie de unión a sacárido se muestra en la Figura 2A, la vista lateral es la Figura 2B, la estructura modelada pensada de la realización del pentacuerpo PTH50 es la Figura 2C.

La Figura 3 es una descripción gráfica de los resultados de la cromatografía de Superdex 200 y SDS-PAGE para una realización de PTH50-VTB (Figura 3A), y TH50 (Figura 3B). De aquí en adelante el producto de fusión PTH50-VTB se denomina 1V5, por simplicidad.

La Figura 4 es una representación gráfica del análisis BIACORE de las propiedades de unión de oligosacáridos de una realización de 2 nM 1 V5.

La Figura 5 es una representación gráfica del análisis de BIACORE de las propiedades de unión de antígeno de PTH50 y una realización de 1V5. La Figura 5A se refiere a la unión de 0,25 - 2 \muM PTH50 para inmovilizar el antígeno peptídico; la Figura 5B se refiere a la unión de 2 - 10 \muM péptido a 1V5 inmovilizado; y la Figura 5C se refiere a la unión de 2,5 - 15 nM 1V5 a péptido inmovilizado.

La Figura 6 es una representación de realizaciones de cierto listado de secuencias de interés.

La Figura 7 es la curva de desnaturalización inducida por calor para el pentacuerpo 1V5 - véase el Ejemplo 1, estudios de estabilidad térmica.

La Figura 8 muestra la susceptibilidad de proteasa de sdAB pentámerico - véase el Ejemplo 1, estudios de estabilidad de proteasa.

La Figura 9 es una presentación en diagrama de la estructura primaria del pentacuerpo 1V12, de acuerdo con el Ejemplo 2.

La Figura 10 es el resultado de las mediciones de la cromatografía por exclusión de tamaño sobre iV12.

La Figura 11 es el resultado del análisis de la resonancia de plasmón superficial de la unión de 1V12.

La Figura 12 is es una presentación en diagrama de los productos del Ejemplo 3 en el presente documento.

La Figura 13 muestra la construcción y la cromatografía por exclusión de tamaño del anticuerpo del dominio individual decavalente 1 V13, Ejemplo 3 en el presente documento.

La Figura 14 es una comparación mediante cromatografía por exclusión de tamaño de 1V13 sus variaciones, Ejemplo 4 en el presente documento.

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Descripción detallada de la invención Definiciones

Como se usa en el presente documento los términos "unidades de autoensamblaje" y "unidades de autoensamblaje" se denominan péptidos o proteínas (que pueden estar en asociación con carbohidrato u otras modificaciones), que están adaptados para interactuar con otras de tales regiones sobre moléculas separadas para formar una o más estructuras que tienen una geometría sustancialmente definida y que incluyen tres o más unidades.

Como se usa en el presente documento el término "dominios de interacción" se refiere a péptidos o proteínas (que pueden estar glicosilados o modificados de otra manera) que se adaptan para interactuar de manera específica con regiones diana (o dianas) sobre otras moléculas que difieren entre ellas mismas. Preferiblemente las otras moléculas son unidades de no autoensamblaje.

Como se usa en el presente documento el término "homopentámero" se refiere a una estructura que contiene cinco unidades que interactúan de manera específica con otra para formar una estructura que tiene geometría sustancialmente definidas, siendo cada unidad sustancialmente idéntica a las otras.

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Como se usa en el presente documento el término "multimerización" se refiere a al procedimiento mediante el cual más de dos unidades de autoensamblaje se combinan conjuntamente para formar un complejo mayor de geometría definida.

Como se usa en el presente documento "sdAb", y "dAb" se refiere a fragmentos de anticuerpos de dominio individual.

Como se usa en el presente documento el término "unidades de autoensamblaje complementarias" significa al menos tres unidades de autoensamblaje que se adaptan para asociarse con otra para formar un complejo que tiene geometría definida.

Como se usa en el presente documento la frase "una estructura que tiene geometría sustancialmente definida" significa una estructura cuyo tamaño y forma aproximado es consistente cuando se forma a partir de los mismos componentes en las mismas condiciones.

Como se usa en el presente documento el término "derivado de material genético codificante" se refiere a algo que incluye un péptido o proteína que se puede haber producido sustancialmente mediante la transcripción de ADN y/o traducción de ARN que codifica ese péptido o proteína, o una proteína grande de la cual forma una parte, seguido si es necesario de la escisión (natural o no natural) y/o modificación después de la traducción. Será patente que un péptido o proteína, se derivará de material genético incluso si el material genético real codificante difiere mediante la degeneración del código genético o sustitución conservadora o similares.

Moléculas de autoensamblaje

La invención proporciona moléculas de autoensamblaje novedosas (también llamadas "moléculas de autoensamblaje" o "subunidades") que en una realización puede comprender una unidad de autoensamblaje conectada de manera operativa a un dominio de interacción. Cada molécula de autoensamblaje tiene una parte que en las condiciones correctas se puede unir de manera específica a una diana y una parte que en las condiciones correctas se puede unir a otra molécula de autoensamblaje para formar un complejo de al menos tres moléculas de autoensamblaje. La unidad de autoensamblaje se puede conectar al dominio de interacción mediante una "región de engarce" (también denominada "región de unión", "engarces", "dominio de unión" o "dominio de engarce").

Se entenderá fácilmente que las moléculas de autoensamblaje de la presente invención pueden ser en algunos casos proteínas de fusión. Tales proteínas de fusión se pueden sintetizar mediante una diversidad de medios, incluyendo la síntesis química seguido de la modificación química según se necesite, la síntesis en cultivo bacteriano u otro, o la síntesis en un huésped mamífero, por ejemplo mediante la administración de nucleótidos que codifican la proteína de fusión de interés a un huésped mamífero mediante terapia génica de acuerdo con las técnicas convencionales. Las moléculas de autoensamblaje de la presente invención también se pueden producir mediante cualquier medio adecuado, que incluye la unión química del dominio de interacción a una región de la unidad de autoensamblaje de manera que conserve la unión y especificidad de diana y autoensamblaje.

Unidad de autoensamblaje

La unidad de autoensamblaje se define anteriormente. En algunos casos será una proteína adaptada para formar un oligopolímero de tres o más unidades con proteínas similares, de manera que la estructura resultante tiene una geometría definida.

En algunos casos será deseable seleccionar las unidades de autoensamblaje que se ensamblan así para orientarse o bien a su extremo N o su extremo C sobre una cara única de la estructura. En algunos casos será deseable seleccionar unidades de autoensamblaje que se ensamblan para alinearse sustancialmente a sus extremos N sobre una primera cara y sus extremos C sobre una segunda cara. En algunos casos será deseable usar unidades de autoensamblaje que se ensamblan para alinearse sustancialmente a una mezcla de las regiones N-terminal y C-terminal sobre una sola cara de la molécula.

En algunos casos sera deseable usar unidades de autoensamblaje que no son idénticas entre sí. Por ejemplo, cada subunidad del ensamblaje final no necesita ser idéntica, mientras que la región de unión de cada unidad de autoensamblaje sea complementaria a otras, de manera que tres o más unidades de autoensamblaje puedan formar un complejo que tiene una geometría definida.

En algunos casos será deseable usar unidades de autoensamblaje seleccionadas entre las regiones de autoensamblaje de los miembros de la familia de toxinas AB5, que incluye pero no se limita a verotoxina, toxina shiga, enterotoxina lábil por calor, toxina de cólera, y toxina pertussis. En algunos casos será deseable emplear unidades de autoensamblaje que son, o se derivan, de proteínas codificadas de manera natural por la misma familia de organismos que se usan para expresar las subunidades.

En algunos casos será deseable seleccionar unidades de autoensamblaje que proporcionarán moléculas de autoensamblaje que forman estructuras multiméricas de 4 a 100 moléculas de autoensamblaje. En algunos casos se desearán unidades de autoensamblaje que proporcionan estructuras multiméricas de 5 a 50 moléculas de autoensamblaje, y en algunos casos, se deseará la selección para proporcionar estructuras multiméricas de 5 a 15 moléculas de autoensamblaje.

En general, los complejos multiméricos formados a partir de grandes números de moléculas de autoensamblaje tenderán a unirse más fuertemente de los complejos de menos moléculas. Sin embargo, los complejos multiméricos que son muy grandes pueden ser menos capaces de pasar a través de matrices o tejidos y puede ser menos probable de ser captados por las células.

En algunos casos será deseable usar unidades de autoensamblaje que tienen una constante de disociación ("K_{D}" o "KD") en el intervalo subnanomolar. En algunos casos será deseable usar unidades de autoensamblaje que tienen una constante de disociación en el intervalo picomolar.

En algunos casos será deseable seleccionar unidades de autoensamblaje para proporcionar moléculas de autoensamblaje en las que la K_{D} de la interacción de los dominios de dimerización está entre v 10 \muM y 1 fM. En algunos casos será deseable una K_{D} de entre 100 nM y 100 fM. En algunos casos será deseable una K_{D} de entre 100 nM y 1 pM.

A la luz de la descripción en el presente documento, está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica determinar una K_{D} adecuada y seleccionar una unidad de autoensamblaje adecuada basándose en la aplicación y concentración propuesta a usar.

Algunas unidades de autoensamblaje, tales como la subunidad B de la verotoxina tendrán una tendencia negativa a unirse a un marcador de la superficie celular particular u otra diana. Cuando no se desea la unión a esta diana nativa, se puede interrumpir mediante medios convencionales, tales como mutación del sitio de unión de diana mientras se conserva la afinidad por otras unidades de autoensamblaje.

En una realización, la invención proporciona unidades de autoensamblaje adecuadas para uso con dominios de interacción bastante voluminosos, y particularmente los dominios de interacción que comprenden 15 o más aminoácidos. En otra realización existen unidades de autoensamblaje adecuadas para uso con dominios de interacción que tienen 25 - 500 aminoácidos. En otra realización se proporcionan unidades de autoensamblaje adecuadas para uso con dominios de interacción que tienen 50-300 aminoácidos. En otra realización se proporciona unidades de autoensamblaje adecuadas para uso con dominios de interacción de 75 - 200 aminoácidos.

En otra realización de la invención se proporcionan unidades de autoensamblaje adecuadas para uso con un dominio de interacción voluminoso que comprende una región de péptido o proteína que está glicosilada, o tiene alguna otra modificación además.

En una realización se proporcionan unidades de autoensamblaje adecuadas para uso con un dominio de interacción y un marcador. En una realización se proporcionan unidades de autoensamblaje adecuadas para uso con un dominio de interacción y un material destructivo.

En muchos casos se deseará usar unidades de autoensamblaje que son las más pequeñas que se pueden usar sin superpoblar los dominios de interacción. La superpoblación se puede producir si unidades de autoensamblaje excesivamente pequeñas hacen que los dominios de interacción estén demasiado cerca entre sí. En general, las unidades de autoensamblaje que forman complejos cortos rechonchos serán en general preferidos a aquellos que forman complejos delgados altos, ya que los dominios de interacción en general se condensarán a la misma región de cada molécula de autoensamblaje, y por lo tanto aparecerá frecuentemente en la misma cara. Cuando se usan unidades de autoensamblajes delgadas largas, el espacio limitado disponible para los dominios de interacción en cada cara puede provocar la interferencia entre ellos lo cual puede reducir la disponibilidad de estos dominios de interacción para la unión a la diana, o puede dar como resultado que los dominios de interacción estén demasiado cerca entre sí para unirse de manera óptima a la diana sobre la superficie.

Sin limitar la invención a a cualquier mecanismo particular o región de unión, se cree que la región de VTB responsable de la oligomerización es la hoja beta (AA11-15) y la hoja beta anti paralela (65 - 68). Estas dos regiones parecen asociarse sobre monómeros adyacentes. De manera adicional, el círculo de cinco hélices alfa (una de cada monómero, AA36-46) parece jugar un papel en la asociación selectiva de estas unidades de autoensamblaje selectivas entre sí. El análisis similar de otras unidades de autoensamblaje, seguido del ensayo de rutina para confirmar la localización del sitio de unión son posible a la luz de la presente invención, haciendo por lo tanto posible la identificación de regiones de unión significativas para los expertos en la técnica.

Aunque esto se cree que es la primera descripción de la pentamerización del fragmento del anticuerpo, la proteína de la matriz oligomérica de cartílago homopentamérica se ha empleado para producir péptidos oligoméricos denominados pentacuerpos (Terskikh et al., 1997, ref 2). Sin embargo, con un diámetro de aproximadamente 20\ring{A} (Efimov et. al., 1994, ref 3), la pentamerización de un fragmento de anticuerpo con esta proteína requeriría un engarce largo que podría dar como resultado complicaciones adicionales. Un engarce de 24 aminoácidos se usó para la oligomerización de péptidos. Por el contrario, una masa molecular de 38,5 kDa el pentámero de VT B es similar en tamaño a la proteína de matriz de 31,3 kDa pero tiene una geometría mucho más diferente con un diámetro de aproximadamente 56 \ring{A}. Este diámetro y las posiciones periféricas de los extremos N y C son en general preferibles ya que permiten la presentación de cinco unidades de dAbs sin un requerimiento complicado para las secuencias largas de engarce.

De este modo, las unidades de autoensamblaje se pueden emplear de manera específica para proporcionar la geometría, diámetro, y la orientación N-terminal o C-terminal deseada, con la condición que las regiones responsables de la asociación entre las unidades de autoensamblaje, y la geometría, hidrofobicidad y características de carga necesarias para la asociación están conservadas.

A la luz de descripción descrita en el presente documento, está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica para identificar las de autoensamblaje adecuadas. Aunque una diversidad de procedimientos son posibles, un planteamiento razonable es mirar la estructura de tres dimensiones formadas cuando se asocian tres o más unidades de autoensamblaje, para determinar si los extremos C- o N- están alineados de una manera deseable, y para identificar el espaciado entre tales extremos. Esta información se puede después comparar con la orientación y requerimientos de espacio del dominio de interacción deseado (y región de engarce, marcador y/o material destructivo si se usa) para seleccionar unidades de autoensamblaje adecuadas. En algunos casos será deseable seleccionar unidades de autoensamblaje que proporcionan buenos niveles de producto soluble cuando se producen a partir de E. coli.

Dominios de interacción

Se contemplan una diversidad de dominios de interacción, y serán patentes para los expertos en la técnica a la luz de la descripción en el presente documento. Por ejemplo, los dominios de interacción tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos de un solo dominio ("dAbs" o "sdAbs"), polipéptidos de una sola cadena que codifican la región V_{H} y la región V_{L} de un anticuerpo ("scFv"), péptidos o proteínas derivadas de la región de unión de un anticuerpo, partes de los receptores de la superficie celular, la región de unión de los receptores de la superficie celular, moléculas o su parte de unión, que se une de manera específica a los receptores de la superficie celular, y otras moléculas que tienen una afinidad por una diana específica.

En algunos casos, tales fragmentos de anticuerpo de dominio individual se pueden producir mediante aislamiento de los fragmentos de anticuerpos a partir de una genoteca que codifica dominios variables de anticuerpos. El tamaño de sdAbs puede variar, y se puede determinar mediante secuenciación del ADN que los codifica.

Los anticuerpos de un solo dominio serán preferibles algunas veces a scFvs para propósitos de oligomerización. Ya que en general son aproximadamente la mitad del tamaño de scFvs, las formas oligoméricas de sdAbs son en general mucho más pequeñas que sus homólogos scFv.

También los rendimientos del producto soluble en E. coli tienden a ser mucho mayores para sdAbs que para scFvs. Sin embargo, de manera más importante, en general sdAbs existen completamente como monómeros mientras que scFvs a menudo forman dímeros, trímeros, etc, en los que la V_{L} de un scFv se asocia con la V_{H} de un segundo scFv y vice versa. Esta propiedad se puede explotar mediante la elección cuidadosa de la longitud del engarce entre la V_{L} y V_{H} de manera que creen scFvs diméricos y triméricos completamente puros, denominados diacuerpos y triacuerpos (Hudson et. al., 1999, ref. 4). Sin embargo, la introducción de otra capa de oligomerización también puede conducir a una complejidad no deseada.

Será patente a la luz de la descripción en el presente documento para los expertos en la técnica que las moléculas de autoensamblaje que reconocen más de una diana también se puede formar sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito en el presente documento mediante la unión de un dominio de un dominio de interacción (tal como un sdAb, o el similar) a la región C-terminal de una unidad de autoensamblaje, y un segundo dominio de interacción a la región N-terminal.

Cuando se seleccionan dominios de interacción, será frecuentemente deseable evitar dominios de interacción que tiendan a asociarse entre sí, con el detrimento de la unión a diana. La unión directa entre los dominios de interacción puede no solamente reducir la unión directa, pero puede cambiar la forma del oligómero global, y reducir la capacidad de otros dominios de interacción dentro del oligómero que se une a su diana.

La constante deseada de disociación entre el dominio de interacción y su diana dependerá de varios factores, incluyendo abundancia de diana, el grado de unión deseado, la media y duración de unión deseados.

En algunos casos, un dominio de interacción se seleccionará para proporcionar una K_{D} (para una sola, no-oligomerizada) molécula de autoensamblaje de entre aproximadamente 1 fM y 100 \muM. En algunos casos se deseará una K_{D} de entre aproximadamente 1 nM y 10 \muM.

En algunos casos será deseable seleccionar un dominio de interacción y una unidad de autoensamblaje para formar moléculas de autoensamblaje que, en forma de monómero formará unión solamente muy débil a la diana (por ejemplo K_{D} de entre aproximadamente 10 \muM y 10 mM, o entre aproximadamente 100 \muM y 1 mM), pero se unirá a la diana fuertemente (por ejemplo, K_{D} de entre aproximadamente 1 fM y 100 nM o entre aproximadamente 1 \muM y 10nM) en forma oligomérica. De esta forma, una toxina unida o radioisótopo se podría dirigir a las células que expresan la diana a altos niveles, mientras que se evitan las que la expresan solamente a bajos niveles. Esto es útil en situaciones tales como algunos cánceres donde la abundancia de un marcador de la superficie celular y no su mera presencia, caracteriza las células no deseadas. Una descripción del uso de un sistema diferente para proporcionar el reconocimiento selectivo de células que sobre- expresan una diana se puede encontrar en Kaminski et al., 1999, ref. 5.

En algunos casos puede ser deseable seleccionar una región de interacción o unidad de autoensamblaje que incluye un "deflector".

Un "deflector" es cualquier cosa presente sobre o adyacente o conectado de manera operativa a la región de unión por el cual la región de unión es inicialmente incapaz de unirse fuertemente y solamente se libera de este estado tras la entrada en un tipo de célula o tejido de interés. Por ejemplo, un cambio en la accesibilidad del sitio de unión se podría efectuar mediante la acción de una fosfatasa específica de tejido, de manera que el sitio de unión desfosforilado era capaz de unirse de manera eficaz mientras en su estado fosforilado no puede.

De manera similar, una región peptídica que de manera ordinaria bloqueaba un sitio de unión se puede escindir de manera selectiva mediante una proteasa específica de tejido para permitir la unión. Por ejemplo, las moléculas de autoensamblaje que tienen dominios de interacción específicos para una diana se encontraron tanto en células de cáncer de próstata como en las células sanas en tejidos remotos se pueden diseñar para incluir un péptido que de manera ordinaria bloquearía el sitio de unión del dominio de interacción para la diana sobre la célula de cáncer de próstata. Este péptido puede incluir una secuencia sensible a la escisión por PSA (una proteasa específica de próstata), de manera que la PSA provoca la liberación del péptido. De este modo, las moléculas de autoensamblaje no se unirían significativamente a la diana en tejido no prostático, pero no se uniría a células de cáncer. Cuando las moléculas de autoensamblaje incluyen material destructivo tales como toxinas o radioisótopos, tal unión específica de tejido puede ayudar a reducir los efectos secundarios de terapia de cáncer.

Región de engarce

Las conexiones entre una unidad de autoensamblaje y un dominio de interacción puede incluir el uso de una "región de engarce" que une la unidad de autoensamblaje y el dominio de interacción. Las regiones de engarce se pueden seleccionar entre cualquier número de secuencias peptídicas u otros materiales adecuados. La longitud de una región de engarce dependerá de varios factores, que incluye la geometría de las unidades de autoensamblajes, el tamaño del dominio de interacción y el tamaño y posición de un marcador o material destructivo, si se usa. En general es deseable proporcionar una región de engarce suficiente para permitir que el dominio de interacción se conecte de manera operativa a cada unidad de autoensamblaje para orientarse hacia su diana, permitiendo la unión de varios dominios de interacción a sus dianas cuando sus unidades de autoensamblaje se engranan
entre sí.

En algunos casos será deseable usar engarces entre cuatro y trescientos aminoácidos de longitud, en algunos casos será deseable usar engarces entre cuatro aminoácidos y doscientos aminoácidos de longitud, y en algunos casos será deseable usar engarces entre cinco aminoácidos y veinte aminoácidos de longitud. Cuando se selecciona un engarce, en algunos casos será deseable seleccionar una secuencia que es resistente a proteasas.

En algunos casos será deseable usar engarces de la fórmula general (GGGGS)n, donde "n" está preferiblemente entre aproximadamente 1 y 50. Será preferible en algunos casos seleccionar "n" para que esté entre 1 y 25, algunas veces entre 1 y 10 y algunas veces entre 1 y 4. En algunos casos será deseable una secuencia de engarce C-terminal GGGGS y una secuencia de engarce N-terminal GGGGSGGGGS.

Las regiones de engarce se seleccionarán preferiblemente para permitir la accesibilidad de Diana máxima a los sitios de unión de los dominios de interacción. Los engarces en general se seleccionarán por resistencia a proteasas donde se contemplan las aplicaciones in vivo. Sin embargo, existen muchos casos en los que se pueden emplear engarces con sensibilidad a la proteasa específica de tejido, por ejemplo cuando se desea en un tejido particular una disociación del dominio de interacción del resto del complejo.

Los engarces también se pueden usar para unir un marcador (tal como biotina, o un resto o compuesto radioactivo o marcado de manera fluorescente) o un material destructivo (tal como una toxina o material radiactivo de suficiente actividad) a una unidad de autoensamblaje. En una realización, el engarce se puede asegurar (por ejemplo como una proteína de fusión) al extremo opuesto de la unidad de autoensamblaje del dominio de interacción.

Tamaño

El tamaño total de las moléculas de autoensamblaje individuales que contienen unidades de autoensamblaje y dominios de interacción, y engarces (y marcadores y/o materiales destructivos) cuando se puede aplicar, será algunas veces de interés. En particular, cuando se desea el paso de la molécula de autoensamblaje a través de una matriz o a través de tejidos, pueden ser preferible moléculas de autoensamblaje más pequeñas.

En algunos casos será deseable seleccionar subunidades que proporcionen un complejo multimérico que tiene un diámetro entre 10 y 200 \ring{A}. En algunos casos será deseable un diámetro de entre 20 y 180 \ring{A}, en algunos casos será deseable un diámetro de entre 50 y 150 \ring{A}. En algunos casos será deseable un diámetro de entre 60 y 100 \ring{A}.

Será fácilmente patente que las realizaciones específicas descritas en detalle en el presente documento se pueden modificar de manera conveniente para satisfacer otras circunstancias. Por ejemplo, la secuencia de cinco aminoácidos presente en el extremo N de la construcción de la Fig. 1, presente solamente por conveniencia de clonación, se puede retirar cuando se desee. La secuencia de ompA se retira durante la secreción de la proteína madura al periplasma de E. coli. Las colas Hiss no se requerirán siempre como una purificación mediante procedimiento de afinidad basándose en la retención de las proteínas de fusión de la unión del trisacárido Pk de VTB (Fig. 4) se puede aplicar en su lugar. Dada la disponibilidad de los anticuerpos monoclonales anti-VTB (véase Soltyk et. al., 2002, ref. 6), las marcas de detección c-myc no siempre serán necesarias. (Conjuntamente estas modificaciones reducirán el tamaño de la pentavalente en 13,5 kDa.)

Se contemplan específicamente variaciones, modificaciones y realizaciones alternativas y serán patentes para los expertos en la técnica a la luz de la descripción en el presente documento.

Internalización

En algunos casos será deseable seleccionar unidades de autoensamblaje, dominios de interacción (y cuando se necesite engarces, marcadores y/o material destructivo) para proporcionar moléculas de autoensamblaje que son capaces de internalizarse en las células en su forma de monómero. En algunos casos será deseable diseñar moléculas de autoensamblaje de manera que los complejos multiméricos se internalicen fácilmente en las células.

Se conocen los accionadores específicos para la internalización de las moléculas unidas. Por ejemplo, se conocen los mecanismos para la internalización de los materiales unidos a ciertos receptores de la superficie celular. De este modo, a la luz de la descripción en el presente documento, está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica producir una subunidad adecuada para la internalización en un tipo de célula particular en forma de monómero u oligómero. Puede ser deseable la internalización, por ejemplo, cuando las subunidades incluyen tipos de toxinas o radioisótopos que actúan preferiblemente desde dentro de la célula.

Uso diagnóstico

Las moléculas de autoensamblaje y complejos multiméricos de la presente invención son útiles para la diagnosis de afecciones, así como para la identificación de proteínas y otros materiales de interés en material biológico. Por ejemplo, un dominio de interacción específico para un antígeno tumoral s puede condensar a una unidad de autoensamblaje adecuada y a una subunidad de marcador radiactivo o reconocible químicamente para proporcionar las moléculas de autoensamblaje que tienen aplicaciones de diagnóstico. Por ejemplo, las moléculas de autoensamblaje de este tipo tenderán a formar regiones complejas multiméricas donde el antígeno se encuentra a alto nivel sobre una superficie, tal como una célula tumoral. La presencia del complejo multimérico se puede determinar mediante la identificación del marcador y se puede usar para diagnosticar la presencia de células tumorales o bien en cultivo, o dentrote un individuo. De manera similar, las subunidades que contienen dominios de interacción específicos para los patógenos conocidos en alimento, agua, o materiales similares se pueden usar para ensayar la seguridad de las muestras de estos productos.

La formación del complejo multimérico puede mejorar la avidez de unión a diana, mejorando por lo tanto la sensibilidad de estos ensayos, así como proporcionar una intensidad de señal más fuerte, haciendo la identificación de productos contaminados más fácil.

Uso terapéutico

Las moléculas de autoensamblaje y complejos multiméricos de la presente invención se pueden usar en la terapia de un número de infecciones en sujetos mamíferos. Las moléculas de autoensamblaje que tienen un dominio de interacción específico para un marcador de un tipo de célula de interés particular (o específico para un marcador que se expresa en mayor medida sobre un tipo de célula de interés particular, de manera que la unión de la subunidad al tipo de célula de interés producirá preferentemente que se una a otro tipos de células) se pueden emplear para uso terapéutico.

Cuando se desee destruir un tipo particular de célula, se puede añadir una "carga útil" tóxica o destructiva de otra manera a la subunidad. Por ejemplo, cuando la unidad de autoensamblaje es la subunidad B de verotoxina, o su variante, puede ser deseable incluir la subunidad A de verotoxina también. La subunidad B de verotoxina se modificará de manera ordinaria para eliminar o reducir sustancialmente su unión inherente al antígeno de P_{K}. La subunidad A de verotoxina es tóxica, y cuando se añade a una subunidad específica para el tipo de célula no deseado, se puede usar para eliminar las células de ese tipo en un paciente, o en un cultivo de células de paciente que se destina para la readministración al paciente.

Por ejemplo, el receptor VEGF se sobreexpresa en la vasculatura de muchos tipos de tumores. De este modo, la destrucción de células se que este receptor se puede usar para comprometer el flujo de sangre a los tumores, reduciendo por lo tanto potencialmente la carga tumoral y mejorando el resultado terapéutico. De manera similar, HER-2 se sobreexpresa en muchos cánceres de mama y sería una diana adecuada con el fin de reducir la carga de células tumorales de cáncer de mama en un sujeto. Los dominios de interacción específicos para dianas de superficie celular particulares se pueden identificar fácilmente, una vez que se conozca la propia diana. En muchos casos un sdAb específico para dianas de la superficie celular será el dominio de interacción prefe-
rido.

En algunos casos será deseable usar complejos multiméricos que llevan dos tipos de células diferentes en estrecha proximidad. Por ejemplo, puede ser deseable llevar una célula asesina a un tipo de célula no deseado, tal como cáncer de célula. Esto se puede llevar a cabo fácilmente a la luz de la descripción presente formando una molécula multivalente que muestra un dominio de interacción específico para el tipo de célula no deseado en una cara y un dominio de interacción específico para la célula asesina en la otra cara. Por ejemplo, una molécula decavalente que muestra un sdAb que reconoce la célula cancerosa sobre la cara C-terminal de VTB y que tiene un segundo sdAb que reconoce la célula asesina sobre la cara N-terminal de VTB permitiría que la célula asesina y la célula tumoral estén juntas, facilitando la destrucción de la célula cancerosa.

A la luz de la descripción en el presente documento y la posición del extremo N y del extremo C (Fig. 2A y 2B), está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica generar tales estructuras decavalentes.

Cuando se usa con respecto a los tratamientos y composiciones terapéuticos, el término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad que, cuando se administra al paciente durante un período de dos semanas provoca una reducción significativa en el número o viabilidad de la célula no deseada o sobre expresada o sustancia.

En algunos casos, los anticuerpos biespecíficos multivalentes tendrán ventajas sobre los anticuerpos biespecíficos bivalentes, particularmente cuando hay presentación antigénica multivalente, tal como sobre superficies celulares.

La estrategia de oligomerización descrita en el presente documento, particularmente cuando se usa junto con las técnicas de despliegue en fago, proporciona un medio relativamente rápido de aislar reactivos de anticuerpos para uso en proteómicos. Además, las inmunotoxinas en las que los dominios de interacción están condensados a un material destructivo o toxina tal como la subunidad VTA altamente tóxica o se incorporan o se unen a un radioisótopo se puede producir a la luz de la descripción en el presente documento, y tales inmunotoxinas pueden proporcionar usos terapéuticos y diagnósticos de amplia gama.

En algunos casos será deseable usar moléculas de autoensamblaje no idénticas. Las unidades de autoensamblaje individuales reconocerán preferiblemente de manera específica otra, que permite la formación de un multímero de geometría y tamaño predecible. Sin embargo, uno o ambos de los dominios de interacción o la unidad de autoensamblaje diferirán de las moléculas.

Por ejemplo, puede ser deseable expresar varios dominios de interacción diferentes y tenerlas conjuntamente en complejos multiméricos. Esto se podría llevar a cabo produciendo diversas proteínas de fusión que tienen la misma unidad de autoensamblaje y un diferente dominio de interacción. Como alternativa, y particularmente cuando se desee mantener una cierta estequiometría entre los diferentes dominios de interacción, puede ser deseable usar diferentes unidades de autoensamblaje que no obstante se ensamblan conjuntamente para formar un complejo multimérico de geometrías y tamaño conocido. Por ejemplo, la toxina pertussis es un producto heteropentamérico, que contiene cuatro subunidades B diferentes, una de las cuales está presente por duplicado. De este modo, era deseable formar un pentámero que tiene cuatro dominios de interacción diferentes, uno de los cuales estaba presente en dos copias en el pentámero mientras la otra estaba solamente presente en una sola copia., esto se podría llevar a cabo formando cuatro proteínas de fusión diferentes correspondiente a las cuatro subunidades B diferentes de la pertussis, estando cada subunidad condensada (mediante un dominio de engarce adecuado si se necesita) a un dominio de interacción diferente. Tal ensamblaje puede ser particularmente útil en los casos en los que se expresan varias moléculas diana diferentes en estrecha proximidad entre sí, y su coexpresión, o su estrecha relación con otra que es particularmente indicadora del tipo de célula de interés.

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Ejemplo 1

Sumario

En una realización de la invención se proporciona un procedimiento novedosos para mejorar la avidez de los dominios de interacción mediante la condensación del fragmento de anticuerpo al extremo C de la subunidad B verotoxina. Esto genera sdAbs pentaméricos, llamados pentacuerpos. El pentacuerpo descrito en el presente documento se une a antígeno inmovilizado 7.000 veces más fuertemente que el sdAb monomérico. Esta tecnología se puede aplicar fácilmente a otros sdAbs, los fragmentos variables de una sola cadena, así como otros dominios de interacción adecuados. Las afinidades de unión a antígeno también se pueden mejorar mediante maduración de afinidad in vitro (refs. 7 y 8) aunque esto es un procedimiento que requiere mucho tiempo que implica la construcción de y cribado de subgenotecas. En algunos casos la mejora de afinidad in vitro puede modificar la buena especificidad o introducir la reactividad cruzad no deseada (ref. 9).

En el caso de un sdAb específico para un antígeno peptídico, la pentamerización dio como resultado un incremento de 7.000 veces en la afinidad funcional para el antígeno inmovilizado. El sdAb pentavalente se expresó con alto rendimiento en Escherichia coli y mostró excelentes propiedades físicas. Esta tecnología junto con las técnicas de despliegue en fago proporciona un medio rápido de generar moléculas de unión a antígeno novedosas con afinidades subnanomolar para el antígeno inmovilizado. Mientras el despliegue de fago ofrece frecuentemente un medio más eficaz de aislamiento de anticuerpos monoclonales que las tecnologías de hibridoma (ref. 10), las constantes de disociación de de fragmentos de anticuerpo aisladas mediante técnicas de fago están habitualmente en el intervalo 10^{-5} y 10^{-7} M^{-1} (referencias. 11 y 12) y puede ser demasiado bajo para muchas aplicaciones.

Los anticuerpos de un solo dominio están habitualmente basados en los dominios variables de anticuerpos de cadena pesada cuyos dominios variables tienen excelentes propiedades físicas que se relacionan con su existencia natural en ausencia de un homólogo de la cadena ligera. Una fuente útil de anticuerpos es una genoteca de anticuerpo de un solo dominio, derivada del repertorios de anticuerpos de cadena pesada de la llama sobre fago [Tanha (2001), ref. 13]. Esta genoteca era la fuente del anticuerpo que se selecciona para la evaluación de la estrategia de oligomerización descrita en el presente documento.

El monómero de la subunidad B de verotoxina ("VTB") se eligió como un ejemplo no limitante de un dominio de autoensamblaje debido a su tamaño relativamente pequeño y la estructura del homopentámero que se forma mediante autoensamblaje. El pentámero B de verotoxina tiene una estructura en forma de rosquilla con los extremos N- y C-expuestos en lados opuestos y en la periferia de la molécula.

La Verotoxina, o toxina de tipo shiga, es una toxina AB_{5} en la que la subunidad A es la entidad tóxica y la subunidad B pentamérica media la unión al glicolípido globotriaosilceramida, abreviadamente Gb3, (Gal\alpha1 \rightarrow 4Gal\beta1 \rightarrow 4Glc\beta1 \rightarrow ceramida). La subunidad B de verotoxina de E. coli nativa se une a las membranas de células eucarióticas mediante los Gb_{3} de glicolípidos. La verotoxina tiene varias variedades. El trabajo específico reseñado en el presente documento se llevó a cabo con VT-1, aunque el procedimiento se cree igualmente aplicable a otras variedades, y tales están dentro del alcance de la invención.

Es posible superar la unión de Gb3 mediante mutación de VTB. Por ejemplo, la mutación W \rightarrow A del aminoácido 34, combinada con o bien una mutación D17E o una abolición de la mutación A56Y detectable que se une al glicolípido (Soltyk, et al., Ref. 6). De este modo, está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica a la luz de la descripción en el presente documento preparar mutantes VTB que no se unen de manera significativa a Gb3.

A objeto de ilustración, el potencial completo de un sdAb pentavalente en términos de unión a un antígeno inmovilizado o de la superficie celular, se eligió un sdAb que reconoce un antígeno relativamente pequeño que se puede inmovilizar a una densidad bastante alta. De acuerdo con lo anterior, un sdAb específico para una secuencia de péptidos modificado de 31 aminoácidos de la hormona paratiroides humana ("PTH50") se aisló a partir la genoteca sdAb de llama (ref. 13) mediante despliegue en fago. El péptido tiene la secuencia ^{1}SVSEIOLMHNLGKHLNSMERVEWLRKLLO
DV^{31} (SEQ. ID. NO. 1) con un enlace \beta-lactama que une las cadenas laterales de ^{22}E y ^{26}K (se muestra en negrita). El sdAb anti-PTH (PTH50) se expresa extremadamente bien en E. coli (aproximadamente 200 mg/l) y no se agregaron.

El sdAb anti-PTH se condensó al monómero de la subunidad B de VT como se indica en el diagrama de la Fig. 1. El dAb se fusionó con el C-terminal de VTB con el fin de situar el sdAbs alejado de los sitios de unión a oligosacárido del pentámero B puesto que la retención de la actividad de unión a carbohidratos proporciona un medio conveniente de la purificación de la proteína de fusión mediante cromatografía de afinidad (Fig. 2A). Para la conveniencia de la clonación que surge de la presencia de un sitio de restricción Pstl cerca del extremo 5' del gen de sdAb, el gen VTB se insertó después del resto 5 de sdAb, que colocó extensiones N-terminal de cinco aminoácidos sobre el pentámero B. Los cinco aminoácidos de sdAb desplazados se reemplazaron en el sdAb, que se condensó al VTB mediante un espaciador de cinco aminoácidos y seguido de las marcas de detección y purificación.

Una estructura modelada del pentacuerpo (Fig. 2C) muestra los cinco sdAbs que se difunden fuera del lado C-terminal y periferia del núcleo de VTB. La representación altamente simétrica del pentacuerpo se considera que es una instantánea altamente dinámica. Los sdAbs se cree que son altamente flexibles ya que el modelado de la fusión de PTH50 a VTB mediante el engarce 2 sin solapamientos moleculares en espacio era relativamente fácil.

Los análisis de cromatografía por exclusión mostraron que tanto PTH50 como 1V5 eran muy homogéneos con respecto al estado de oligomerización. Esto se muestra en la Fig. 3, cromatografía SPERDEX 200 y SDS PAGE (12%) de una realización de 1V5 (A) y PTH50 (B). Basándose en los marcadores de la masa molecular que se separaron en las mismas condiciones, la masa de 1V5 se estimó que era 128 kDa, que está muy cerca de del tamaño predicho de 114,5 kDa para la proteína de fusión pentamérica.

La retención de la actividad de unión de sacárido completa de VTB por 1 V5 confirmó que la proteína de fusión era pentamérica. La estructura de cristal de VTB en complejo con una Globotriaosilceramida, análogo de Gal-alfa(1-4) Gal-beta(1-4) Glc-betal-ceramida ("Gb3") (ref. 14) muestra la presencia de quince trisacáridos de Gb3, también conocido como el trisacárido P^{k}, por pentámero de VTB (Fig. 2A). SDS-PAGE mostró que mientras 5 \muM PTH50 no se unía a la resina Synsorb P^{k}, la gran mayoría de 1V5 no se unía a esta concentración. A esta concentración se requiere la estructura pentamérica para la unión de oligosacárido eficaz (ref. 6). En cierto modo sorprendentemente, los datos de resonancia de plasmón superficial ("SPR") mostraron que la K_{D} de la interacción de trisacáridos de 1V5 era aproximadamente 1,7 nM comparado con 6,6 nM para la interacción del sacárido de VTB. Posiblemente la extensión N-terminal de cinco aminoácidos sobre 1 V5 (Fig. 1) interactúa con el espaciador sobre el neoglicoconjugado, dando como resultado la unión mejorada de la proteína de fusión a trisacáridos, con relación a VTB. En cualquier caso, los datos son consistentes con la formación de una molécula pentamérica completamente funcional. La Fig. 4 presenta el análisis BIACORE de una realización de las propiedades de unión a oligosacárido de 2 nM VTB y 2 nM 1 V5. el ajuste de los datos a un modelo de interacción 1:1 proporcionó valores de k_{a} del 2,6 x 10^{6} M^{-1}s^{-1} y 5,1 x 10^{5} M-^{1}S^{-1} para VTB y 1V5, respectivamente, y valores de k_{d} de 1 x 10^{-2} y 8,8 x 10^{-4} para VTB y 1V5, respectivamente.

Los perfiles de unión a antígeno de PTH50 y 1V5 confirmaron que la proteína de fusión de VTB se unía a péptido inmovilizado mucho más eficazmente que el sdAb monomérico (Fig. 5 y Tabla 1). La unión de PTH50 a péptido inmovilizado (Fig. 5A) mostró una cinética rápida pero analizable. El valor de K_{D} de la interacción se determinó que era 2,5 \muM (Tabla 1). Aunque las constantes de de velocidad no se podían derivar para la interacción de péptido con el pentacuerpo inmovilizado (Fig. 5B), el valor de K_{D} se determinó que era 3,6 \muM (Tabla 1) indicando que la pentamerización pentamno alteraba significativamente la accesibilidad de sitio de unión a dAb. La unión de 1V5 a péptido inmovilizado se analizó a bajas concentraciones con el fin de maximizar la Valencia de unión y determinar la ganancia de avidez conferida por la pentavalencia de dAb (Fig 5C). En estas condiciones de excedente de antígeno, la pentavalencia confería una ganancia de avidez de aproximadamente 7.000 (Tabla 1). La Fig. 5 presenta el análisis de BIACORE de una realización de las propiedades de unión a antígeno de una realización de PTH50 y 1 V5. (A) - unión de 0,25 - 2 \muM PTH50 a antígeno peptídico inmovilizado; (B) - unión de 2 - 10 \muM péptido a 1 V5 inmovilizado y (c) - unión de 2,5 - 15 nM 1V5 a péptido inmovilizado.

El análisis de BIACORE se llevó a cabo de acuerdo a los procedimientos que usan procesadores de sensores CM5. Los resultados como se muestran en las Figuras 4 y 5 muestran unidades de respuesta (RU) sobre el eje y. 1 RU es un resultado de pg/mm^{2} de unión de proteína a ligando inmovilizado.

Detalle del Ejemplo 1

Aislamiento de PTH50. El sdAb de PTH50 se aisló a partir de una genoteca de dAb de llama no inmunizada construida como se describe en otra parte (ref. 13). El cribado se realizó con 100 \mug de partículas paramagnéticas revestidas de estreptavidina (SA-PMPs) (Promega, Madison, WI) que se había lavado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se agitaron los tubos frecuentemente para mantener las SA-PMPs en suspensión durante todas las etapas que implican SA-PMPs. Para reducir la unión de fondo, los fago de la genoteca se incubaron previamente en la ausencia de antígeno con SA-PMPs que se habían bloqueado con 100 \mul de leche al 2% en solución salina tamponada con fosfato (MPBS) durante 1 hr a temperatura ambiente. También, las SA-PMPs usadas en el cribado se bloquearon en 400 \mul MPBS a 37ºC durante 2 hr. Las mezclas de cribado contenían el fago adsorbido previamente (10^{12} tu en la primera ronda y 10^{11} tu en rondas siguientes), 20 mg/ml de BSA, 0,05% de TWEEN^{TM} 20 y 1 \mug/ml de antígeno biotinilado en un volumen total de 150 \mul de MPBS. Los complejos de antígeno biotinilado de fago se capturaron mediante transferencia de las mezclas a tubos que contenían SA-PMPs bloqueadas seguido de la incubación a temperatura ambiente durante 30 min. Las SA-PMPs se lavaron cinco veces con PBS que contenía 0,05% de Tween-20 y después cinco veces con PBS. Los fagos unidos se eluyeron y se propagaron sobre placas con la parte superior de agarosa como se ha descrito (ref. 13). Después de la incubación durante toda una noche a 37ºC las partículas de fago se fluyeron de las placas, se purificaron y se filtraron (ref. 13).

La selección de los clones de fago para determinar la actividad de unión a antígeno se realizó mediante ELISA como se ha descrito por Tanha et al. (ref. 13). El péptido biotinilado, 1 \mug/ml, se capturó a temperatura ambiente durante 30 min en pocillos que se habían bloqueado durante 2 h con MPBS a 37ºC seguido de revestimiento durante toda una noche con 5 \mug/ml de estreptavidina a 4ºC. En los experimentos de control el antígeno biotinilado se volvió a colocar con tampón apropiado. Se identificaron^{4} varios anticuerpos específicos de péptidos 4, uno de los cuales, PTH50, se seleccionó para este estudio.

Construcción de VTB-PTH50. Se usaron técnicas de clonación convencionales (ref. 15) para generar el gen VTB-PTH50 o 1V5 (Figura 1). El gen VTB (Acceso EMBL M16625) se amplificó mediante PCR con cebadores que introdujeron sitios Pstl en ambos extremos y se añadió una secuencia que codifica DVQLQ (SEQ. ID. NO. 3) en el extremo C de VTB. El producto de PCR Se digirió mediante Pstl y se ligaron en el gen PTH50 (GenBank AF447918) linealizado con la misma enzima. El sitio Pstl codifica los restos 5 y 6 de PTH50 (Fig. 1) y por lo tanto la extensión C-terminal de DVQLQ (SEQ. ID. NO. 3) sobre el producto PCR de VTB. Un clon en el que VTB se insertaba en la orientación correcta y se denominó clon pJR1V5.

Modelado Molecular. La estructura de 1V5 (SEQ. ID. NO. 2) se modeló usando los módulos BIOPOLYMER^{TM} y DISCOVERY 3^{TM} de INSIGHT II^{TM} sobre un puesto de trabajo R10,000 SGI. El modelo PTH50 es la SEQ. ID. NO. 4 (proteína) y la SEQ. ID. NO. 5 (ADN). Los espaciadores se construyeron usando la base de datos de aminoácidos Insight II. Los potenciales se fijaron usando el campo de fuerza AMBER y se realizaron las minimizaciones de energía en todas las etapas de la construcción del modelo.

Expresión y purificación. Escherichia coli TG1 y ER2537 (New England Biolabs) que albergan plásmidos que codifican PTH50, y PTH50-VTB se cultivaron y se indujeron con 1 mM isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido. Se extrajeron proteínas periplásmicas mediante choque osmótico sustancialmente de acuerdo con el procedimiento de Skerra et al. 1991 - ref. 16 y las proteínas recombinantes se purificaron mediante cromatografía de afinidad por metal inmovilizado (IMAC) (HI-TRAP^{TM}, Amersham Pharmacia). Las purificaciones se controlaron mediante transferencia de Western con un anticuerpo monoclonal anti-c-myc y un conjugado de IgG/fosfatasa alcalina. Las proteínas purificadas se concentraron mediante ultrafiltración por CENTRICON 10^{TM} (AMICON ^{TM}), se dializaron contra 10 mM HEPES, pH 7,4, que contenía 150 mM NaCl y 3,4 mM EDTA y se analizaron mediante SDSPAGE.

Cromatografía de exclusión por tamaño. Los estados de oligomerización de of PTH50 y 1V5 se ensayaron mediante la cromatografía por exclusión de tamaño SUPERDEX 200^{TM} (Amersham Pharmacia). En ambos casos las separaciones se llevaron a cabo en 10 mM HEPES, pH 7,4, que contenía 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA y 0,05% de TWEEN 20^{TM}.

Actividades de unión a oligosacárido y a antígeno. Para determinar si 1V5 retenía la actividad de unión a oligosacárido de VTB y si esta actividad se puede explotar para la purificación de proteína de fusión dAb-VTB 5 \muM PTH50-VTB, así como 5 \muM PTH50, se mezclaron con SYNSORB Pk^{TM}, una resina constituida por el trisacárido P^{k} inmovilizado sobre CHROMOSORB P^{TM}. La unión de las dos proteínas a la resina se controló mediante SDS-PAGE. Las actividades de unión a oligosacárido de VTB y PTH50-VTB se compararon mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). Se realizaron los análisis con un sistema biosensor BIACORE 3000^{TM} (Johnson) (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) sobre proteínas que se purificaron mediante cromatografía por exclusión de tamaño como se ha descrito anteriormente. Se inmovilizó un neoglicoconjugado, BSA-(espaciador-O-Gala1-4Gal\beta1-4Glc\beta)_{n} (Glycorex AB), a una densidad de superficie de 13.000 RUs, sobre procesadores sensores CM5^{TM} de calidad investigación (Biacore, Inc.) a una concentración de 100 \mug/ml en 10 mM acetato, pH 4,5, mediante acoplamiento de amina de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los análisis se llevaron a cabo a 25ºC en 10 mM HEPES, pH 7,4, que contiene 150 mM NaCl, 3 mM EDTA y 0,005% de P-20 a un caudal de 10 \mul por minuto. La superficie se regeneró mediante contacto con 100 mM HCl durante 3 s.

Los perfiles de unión a antígeno PTH50 y 1V5 se analizaron mediante SPR. El antígeno de péptido y 1V5 se inmovilizaron a a densidades de superficie de 1.300 RU y 6.000 RU, respectivamente, sobre procesadores sensores CM5 de calidad investigación mediante acoplamiento de amina y de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las inmovilizaciones se llevaron a cabo a concentraciones de proteína o péptido de 50 \mug/ml en 10 mM acetato, pH 4,5. Se realizaron los análisis y análisis de datos como se ha descrito anteriormente. No se requería regeneración con la superficie de 1V5. La superficie del péptido se regeneró mediante contacto con 10 mM borato, pH 8,5, que contenía 1 M NaCl y 0,1% de P-20 durante 30 s. Los datos se evaluaron con el software BIAEVALUATION 3.0^{TM} de Biacore, Inc. La cinética y resultados de afinidad se muestran en la siguiente Tabla 1.

1

Estabilidad térmica de VTB-PTH 50 y sus bloques de construcción

Para la determinación de la estabilidad térmica del pentacuerpo 1 V5, los espectros de dicroísmo circular (CD) de 1V5 así como sus bloque de construcción, PTH50 sdAb y el pentámero VT1B, se midieron a diversas temperaturas Los espectros de dicroísmo circular (CD) se registraron con un espectrómetro. Jasco J-600 conectado a un baño de agua Neslab RTE-110. Los experimentos se realizaron en 10 mM tampón fosfato sódico pH 7,0 usando cubetas circulares con longitud de trayectoria de 5 cm (para PTH50 y VT1 B a concentraciones de 1,8 y 3 \mug/ml, respectivamente) y 1 cm (para 1 V5 a una concentración de 9 \mug/ml). Los espectros se registraron desde 215 - 260 nm a intervalos de 0,2 nm, una velocidad de barrido de 20 nm por min, una anchura de banda de 2 nm y un tiempo de integración de 1 s. Los espectros de proteínas se sustrajeron de un espectro de blanco y posteriormente se igualaron mediante el software Jasco. Para determinar los valores de T_{m}, las temperaturas de las muestras se incrementaron gradualmente desde 30ºC a 82ºC. Los espectros se registraron a diversas temperaturas después de un tiempo de equilibrio de temperatura de 10 min. Una media de cinco valores de elepticidad a 235, 234,8, 234,6, 234,4 y 234,2 nm se usó para representar gráficamente el gráfico sigmoide de elepticidad frente a la temperatura y los valores de T_{m} se determinaron a la temperatura correspondiente al 50% de no plegamiento - véase la Fig. 7.

Los datos recogidos a 234,2, 234,4, 234,6, 234,8 y 235 nm se usaron para obtener curvas de desnaturalización para las proteínas: No se observó ningún cambio en los espectros de CD de VT1B, incluso a temperaturas tan altas como 70ºC. Por encima de 72ºC, se observó un incremento agudo en la señal debido a la precipitación de proteínas (datos no mostrados). Este resultado indica que el pentámero VT1 B es una estructura muy estable aunque un valor de T_{m} no se podía determinar. La pérdida brusca de de solubilidad a temperatura alta sin ninguna indicación de desnaturalización sugiere que el mantenimiento de la estructura depende de la formación de pentámero. La temperatura de fusión de PTH50 se extiende sobre un intervalo relativamente amplio de temperatura, que es típico del cambio de conformación no cooperativo y se observa frecuentemente con péptidos pequeños. La temperatura de fusión se calculó que era 59,7ºC, indicando que la proteína tiene muy buena termoestabilidad. La proteína de fusión hecha de dos bloques de construcción tiene una curva típica de desnaturalización por calor con un valor de T_{m} de 52ºC (Figura 7, la curva de desnaturalización inducida por calor) para el pentacuerpo 1V5). Aunque este número es menor que el valor de T_{m} de PTH50 la proteína de fusión es menos termoestable que VT1 B, 1 V5 es no obstante una molécula muy estable al calor.

La estabilidad térmica del pentacuerpo descrito en el presente documento es un buen indicador para uso de estas moléculas en diversas aplicaciones. Mientras que una alta termoestabilidad es siempre una propiedad útil y es muy importante para las aplicaciones médicas in vivo. A pesar de la alta afinidad de unión a antígeno, un scFv específico de tumor no se localizaba en los heterotransplantes debido a su insuficiente estabilidad térmica (Willuda et al., 1999, ref 17). El injerto de bucles de unión a antígeno del scFv específico de tumores sobre la estructura de un scFv altamente estable produjo una molécula con buena estabilidad en suero y localización en tumor.

Estabilidad a la proteasa de pentacuerpos

Los experimentos de digestión tríptica y quimotrípticas se llevaron a cabo a una relación enzima: sdAb pentamérico de 1:200 durante 1 h a 37ºC usando tripsina y quiciotripsina de calidad secuenciación de Boehringer Mannheim. Las mezclas de digestión contenían aproximadamente 2 \mug/ml de 1V5 en tampón 100 mM Tris-HCI, pH 7,8. La mezcla de digestión por quimiotripsina se suplementó con 50 mM CaCl_{2}. Se terminaron las reacciones mediante la adición de 10 \mul de 0,1 \mug/ml inhibidor de tripsina - quimiotripsina (Sigma). Para la determinación de los pesos moleculares mediante espectrometría de masas, se añadió DTT hasta una concentración final de 200 mM y se procesaron las muestras como se ha descrito anteriormente por Tanha, J. et al, ref 18).

La Fig. 8 muestra la susceptibilidad a proteasa de sdAb pentamérico. 1V5 se analizó mediante SDS-PAGE después de la digestión con tripsina durante 0 y 2 horas (A y B respectivamente) y quimiotripsina durante 0 y 2 h (C y D respectivamente).

1 V5 mostró Buena resistencia a la digestión por tripsina y quimiotripsina. Se observó que la tripsina rápidamente convertía 1 V5 en un producto con con tamaño molecular ligeramente menor sin evidencia de digestión adicional en las condiciones empleadas (Fig. 8A y 8B). Los análisis de espectrometría de masas indicaron que las marcas C-terminal se habían eliminado. El tratamiento con tripsina disminuyó el tamaño del monómero de 1 V5 en 1602 Da que corresponde a la eliminación de la secuencia LISEEDLNHHHHH C-terminal (Fig. 8C) de 1V5. No se observó ningún producto de escisión después de 1 hora de incubación con quimiotripsina (Fig. 8C y 8D). Los análisis de espectrometría de masas confirmaron que las bandas mostradas en las Fig. 8C y 8D corresponden al monómero 1 V5.

El sdAb pentamérico descrito en el presente documento mostró una resistencia sorprendente a tripsina y quimiotripsina. Aunque existen múltiples sitios para ambas enzimas en el pentámero, no existía ninguna evidencia de degradación mediante cualquier enzima en las condiciones empleadas en el presente documento. Esta observación resalta una de las ventajas de los anticuerpos de un solo dominio, los fragmentos de unión de antígenos más pequeños de anticuerpos convencionales, a saber scFvs que contiene engarces sensibles a proteasa. La resistencia a proteasas es altamente deseable para las aplicaciones in vivo, tal como formación de imágenes de tumores. En términos de conferir resistencia a proteasa, VT1 B es una elección lógica como un dominio de oligomerización debido a su existencia natural en ambientes digestivos.

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Ejemplo 2

Pentacuerpos en los que el sdAbs están condensados al extremo N de VT1 B

Para determinar si la estrategia descrita en el presente documento es una estrategia en general adecuada para la pentamerización de sdAb, se puede examinar si los anticuerpos pentaméricos se pueden formar cuando 1) los anticuerpos se condensan al extremo N de VTB, 2) moléculas de anticuerpos distintas de PTH50 se condensan a VTB y 3) si las versiones mutantes de VTB se pueden usar como dominios de pentamerización.

Para este propósito:

(a) se construyó la proteína 1V12, que es la fusión de otra molécula de sdAb (PTH61), al extremo N de una versión mutante de VTB, (la Fig. 9 ilustra la estructura primaria. La secuencia de ompA se retira durante la secreción de la proteína madura al periplasma de E. Coli). PTH61 es un sdAb de unión a la hormona paratiroidea aislado a partir del mismo experimento de cribado como PTH50. La proteína 1V12 se aisló a partir de células de E. coli TG1 que albergan el gen que codifica 1V12 como se describe para el aislamiento de 1V5. La cromatografía de exclusión por tamaño se desarrolló sobre una columna Superdex 200, y se indica que, como para 1V5, 1V12 forma un pentámero muy homogéneo (Fig. 10). Los marcadores de proteína (en kDa) se desarrollaron sobre la misma columna y en las mismas condiciones. Data Los datos obtenidos del análisis de SPR muestran que la proteína 1V12, la forma pentamérica de PTH61, se une más fuertemente que PTH61 a su antígeno (Fig. 11, análisis de resonancia de plasmón superficial de la unión monovalente y pentavalente (1V12) a antígeno inmovilizado).

(b) un total de ocho pentacuerpos (1V5, 1V11, 1V12, 1V14, PES1, PVTGL10, PJS5, PSJ6) se prepararon usando versiones de tipo salvaje como mutantes de VTB y con diferentes moléculas de sdAb condensados al extremo N- o C- de VT1 B. Todos los pentacuerpos formados que se expresan bien en células de E. coli TG1, tenían poso o ningún signo de agregación y que se unen a sus antígenos con una afinidad funcional mucho más alta que la observada para sus homólogos monoméricos.

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Ejemplo 3

Construcción de decacuerpos

El hecho de que muchos, si no todos, los sdAbs se pueden pentamerizar condensándolos al extreme N- o bien C de diferentes versiones de VTB permite la construcción de anticuerpos decavalentes mediante la fusión de un sdAb al extremo N y otro sdAb al extremo C- de VT1 B. Este concepto se ilustra mediante diagrama en la Fig. 12, una representación en diagrama de los pentacuerpos N-terminal, C-terminal pentacuerpos y un decacuerpo biespecífico. Para explotar esto, 1V13, se construyó un anticuerpo decavalente, llamado un decacuerpo. Esto se ilustra en la Fig. 13; que muestra la estructura primaria y la secuencia de 1V13 la cromatografía por exclusión de tamaño (columna Superdex 200, Amersham Pharmacia) de 1V12. Los marcadores de proteína (en kDa) se desarrollaron sobre la misma columna y en las mismas condiciones. 1V13 tiene sdAb PTH22 condensado al extremo C y sdAb PTH61 condensado al extremo N de un mutante D17E/W34A de VT1B (Fig 13A). PTH22 es otro sdAb de unión a hormona paratiroidea aislado a partir del mismo experimento de cribado como PTH50 y PTH61. 1V13 se aisló a partir de células de E. coli TG1 que albergan el gen que codifica 1V13. La cromatografía por exclusión de tamaño mostró que 1V13 forma un pentámero, que sin embargo no es muy homogéneo (Fig. 13B),

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Ejemplo 4

Homogeneidad mejorada de pentacuerpos

Debido a que sdAbs y VT1 B, las dos unidades de construcción para la construcción del decacuerpo, son muy homogéneas y se expresan bien en células de E. coli, los cambios se realizan principalmente a engarces que conecten los bloques de construcción. Cuatro nuevos decacuerpos, PJR9, PJR10, PJR13 y PJR14, se construyeron usando diferentes engarces, cuyas secuencias se muestran en la Fig. 14. La Fig. 14 presenta una comparación mediante cromatografía por exclusión de tamaño de 1V13 decavalente y sus variaciones. Las secuencias de engarces que conectan los sdAbs y VTB se indican por encima de cada cromatograma. Como se muestra en la Fig. 14, las cuatro proteínas forman pentámeros muy homogéneos con o sin poco signo de agregación. La proteína 1V9, con el engarce GPGGGGS que conecta PTH61 y VTB y un engarce AKRVAPELLGGPSG que conecta VTB y PTH22, tiene el mejor perfil de exclusión.

El concepto de preparación y uso de anticuerpos decavalentes (decacuerpos) se pueden extender, de acuerdo con otra realización de la presente invención, mediante el uso de análogos de ligandos de carbohidratos solubles en agua, oligovalentes al receptor de carbohidrato de VT1B y que forma complejos con VT1 B, por ejemplo, STARFISH - véase Kitov, Pavel I. et. al.; 2000, ref. 19. ya que STARFISH se reticula con dos VT1 Bs pentaméricos, proporciona otro medio de preparar decacuerpos.

STARFISH se unirá a los pentacuerpos de la presente invención, pero no a las unidades individuales. De acuerdo con lo anterior, una versión marcada de STARFISH se puede usar para detectar los pentacuerpos descritos en el presente documento. Los pentacuerpos unidos a una Diana tal como un tipo de célula cancerosa, un patógeno bacteriano, una espora de ántrax, etc., formará un complejo conSTARFISH marcado, añadido que permite la detección del complejo STARFISH-pentacuerpo-diana. Después de la adición y unión de STARFISH, STARFISH unido residual se lava del sistema, y el STARFISH unido detectado por medio de etiqueta (fluorescencia, radioactividad, etc.), para medir pentacuerpos unidos. Además, los ligandos de tipo STARFISH también se pueden usar junto con pentacuerpos de la presente invención en aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, se pueden separar dos tipos separados y distintos de moléculas de autoensamblaje de acuerdo con la invención, uno para reconocer y para unirse a la diana y otro para reconocer y para unirse a una célula asesina o compuesto para la diana. Ambos tipos forman pentacuerpos, para la unión fuerte. La adición de STARFISH para provocar la unión conjuntamente con los dos tipos de pentacuerpos pondrán a la diana y las células asesinas en estrecha proximidad, para interacción entre ellas.

De este modo, es patente que se ha proporcionado de acuerdo con la invención unas Moléculas de Autoensamblajes novedosas que satisfacen completamente los propósitos, objetivos y ventajas establecidas anteriormente. Aunque la invención se ha descrito en conjunción con sus realizaciones específicas, es patente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones serán patentes para los expertos en la técnica a la luz de la descripción anterior. De acuerdo con lo anterior, se pretende que abarque todas estas alternativas, modificaciones y variaciones que caen dentro del espíritu y amplio alcance de la invención.

Referencias

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3. Efimov, V.P., Lustig, A. & Engel, J. The thrombospondin-like chains of cartilage oligomeric matrix protein are assembled by a five-stranded alpha-helical bundle between residues 20 and 83. FEBS Lett. 341, 54 - 58 (1994).

4. Hudson, P.J. & Kortt, A.A. High avidity scFv multimers; diabodies and triabodies. J. Immunol. Methods 231, 177 - 189 (1999).

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7. Yang, W.P. et al. CDR walking mutagenesis for the affinity maturation of a potent human anti-HIV-1 antibody into the picomolar range. J. Mol. Biol. 254, 392 - 403 (1995).

8. Schier, R. et al. Isolation of picomolar affinity anti-c-erbB-2 single-chain Fv by molecular evolution of the complementarity determining regions in the center of the antibody binding site. J. Mol. Biol. 263, 551 - 567 (1996).

9. Ohlin, M., Owman, H., Mach, M. & Borrebaeck, C.A. Light chain shuffling of a high affinity antibody results in a drift in epitope recognition. Mol. Immunol. 33, 47 - 56 (1996).

10. McCafferty, J., Griffiths, A.D., Winter, G. & Chiswell, D.J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature 348, 552 - 554 (1990).

11. Griffiths, A.D. et al. Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires. EMBO J. 13, 3245 - 3260 (1994).

12. Hoogenboom, H.R. & Chames, P. Natural and designer binding sites made by phage display technology. Immunol. Today 21, 371 - 378 (2000).

13. Tanha, J., Dubuc, G., Hirama, T. Narang, S.A. & MacKenzie, C.R. Selection by phage display of Ilama conventional VH fragments with heavy chain antibody VHH properties. J. Immunol. Methods 263, 97 - 109 (2002).

14. Ling, H. et al. Structure of the shiga-like toxin IB-pentamer complexed with an analogue of its receptor Gb3. Biochemistry 37, 1777 - 1788 (1998).

15. Sambrook, J. & Russel, D.W. Molecular Cloning, a laboratory manual.

16. Skerra, A., Pfitzinger, I. & Pluckthun, A. The functional expression of antibody Fv fragments in Escherichia coli: improved vectors and a generally applicable purification technique. Biotechnology (N. Y.) 9, 273 - 278 (1991).

17. Willuda et. al., High Thermal Stability is Essential for Tumor Targeting of Antibody fragments: engineering of a humanized anti-epithelial glycoprotein-2 (epithelial cell adhesion molcule) single-chain Fv Fragment, 1999 Cancer Research 59, 5758 - 5767.

18. Tanha et. al., Optimal Design Features of Camelized Human Single-Domain antibody Libraries, J. Biol. Chem. 276, 24774 - 24780.

19. Kitov, Pavel I. et. al., Nature, 403, febrero 2000, 669 - 672.

Claims (27)

1. Un procedimiento de formación de un complejo multimérico que tiene afinidad por una diana, comprendiendo dicho procedimiento:

obtener una pluralidad de AB5 derivado de moléculas de autoensamblaje, incluyendo dichas moléculas de autoensamblaje unidades de autoensamblaje complementarias cada una de las cuales está de manera operativa conectada a un dominio de interacción específico para la diana;

combinar dichas moléculas de autoensamblaje de manera que al menos tres de dichas unidades de autoensamblaje sustancial y simultáneamente se unan entre sí y permitan que el dominio de interacción se una a la diana.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el dominio de interacción se deriva de un material genético que codifica una región de anticuerpo o un receptor de superficie celular.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o reivindicación 2 en el que la unidad de autoensamblaje se deriva de un medio de la familia de toxinas de AB5.

4. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que los dominios de interacción en dichas unidades reconocen al menos dos dianas diferentes.

5. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que en cada molécula de autoensamblaje la unidad de autoensambaje está conectada de manera operativa al anticuerpo de un solo dominio en o bien el extremo C- o el extremo N- de la unidad de autoensamblaje.

6. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que el complejo multimérico es un pentámero.

7. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que el complejo multimérico es un homopentámero.

8. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que el dominio de interacción es una región de unión de la superficie celular.

9. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que el dominio de interacción es un anticuerpo de un solo dominio específico para la diana.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8 en el que el dominio de interacción es un polipéptido de una sola cadena que codifica las regiones V_{H} y V_{L} de un anticuerpo.

11. Una molécula de autoensamblaje que tiene afinidad por una o más dianas conocida y adecuada para uso en la formación de un complejo multimérico, comprendiendo dicha subunidad:

una unidad de autoensamblaje derivada de ABS, y

un dominio de interacción conectado de manera operativa a una unidad de autoensamblaje de manera que permita la unión de dicho dominio de interacción a la diana y que permite la unión de dicha unidad de autoensamblaje a otra unidad de autoensamblaje.

12. Una molécula de autoensamblaje que comprende una pluralidad de partes proteináceas o peptídicas conectadas de manera conjuntamente, comprendiendo dicha una primera parte una región de autoensamblaje derivada de AB5 capaz de unirse a las regiones de autoensamblaje de al menos otras dos moléculas de autoensamblaje de la misma o diferente composición, para formar un complejo de al menos tres moléculas de autoensamblaje, y comprendiendo dicha una segunda parte un dominio de interacción adaptado para interactuar de manera específica con una región diana sobre otra, molécula diferente.

13. La molécula de autoensamblaje de la reivindicación 11 o reivindicación 12 en la que el dominio de interacción está conectado de manera operativa a uno de los extremos N- o el extremo C- de la molécula de autoensamblaje.

14. La molécula de autoensamblaje de cualquiera de las reivindicaciones 11 - 13 en el que la unidad de autoensamblaje se deriva de verotoxina.

15. La molécula de autoensamblaje de cualquiera de las reivindicaciones 11 - 13 en la que la unidad de autoensamblaje se deriva de toxina de pertussis.

16. La molécula de autoensamblaje de cualquiera de las reivindicaciones 11 - 15 en el que el dominio de interacción es un sdAB.

17. La molécula de autoensamblaje de cualquiera de las reivindicaciones 11 - 15 en la que el dominio de interacción es un péptido de unión de superficie celular.

18. La molécula de autoensamblaje de cualquiera de las reivindicaciones 11 -17 que incluye además un engarce que une dicho dominio de interacción a dicha unidad de autoensamblaje.

19. La molécula de autoensamblaje de cualquiera de las reivindicaciones 11 - 18 que incluye además un segundo dominio de interacción conectado de manera operativa a dicha unidad de autoensamblaje de manera que permita la unión de cada dominio de interacción a una diana.

20. La molécula de autoensamblaje de la reivindicación 19 en la que un dominio de interacción se condensa al extremo N- y el otro dominio de interacción se condensa al extremo C- de la unidad de autoensamblaje.

21. Moléculas de autoensamblaje de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 - 20 en forma pentamérica.

22. Pentámeros de acuerdo con la reivindicación 21, dimerizados para formar decacuerpos.

23. Decacuerpos de acuerdo con la reivindicación 22 en el que la dimerización es mediante un intermedio que se une a los pentámeros pero no se une a las unidades de autoensamblaje.

24. un procedimiento de diagnosis de la presencia de una pluralidad de moléculas sobre una superficie, comprendiendo dicho procedimiento:

obtener una pluralidad de ABS derivado de moléculas de autoensamblaje, incluyendo cada molécula de autoensamblaje una unidad de autoensamblaje complementaria, un dominio de interacción específico para la molécula y conectado a la unidad de autoensamblaje y un marcador;

exponer dicha superficie a las moléculas de autoensamblaje,

permitir que dichas subunidades se autoensamblen en un complejo multimérico; y

ensayar para el marcador.

25. El procedimiento de la reivindicación 24 en el que el marcador es un radiosiótopo.

26. El procedimiento de la reivindicación 24 en el que el marcador es biotina.

27. Un kit que comprende:

una diversidad de moléculas de autoensamblaje derivadas de AB5 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 - 19; e

instrucciones para el uso de dichas moléculas de autoensamblaje en el reconocimiento específico de un marcador, para los propósitos de diagnosis terapéutica.