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KR102406610B1 - 혈액-뇌 장벽을 통과이동하는 인간화 항체 및 그의 용도 - Google Patents

혈액-뇌 장벽을 통과이동하는 인간화 항체 및 그의 용도 Download PDF

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KR102406610B1
KR102406610B1 KR1020197003036A KR20197003036A KR102406610B1 KR 102406610 B1 KR102406610 B1 KR 102406610B1 KR 1020197003036 A KR1020197003036 A KR 1020197003036A KR 20197003036 A KR20197003036 A KR 20197003036A KR 102406610 B1 KR102406610 B1 KR 102406610B1
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antibody
isolated
ser
thr
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다니카 스타니미로비치
크리스틴 케메리치
이브 듀로셔
트라이안 술레아
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내셔날 리서치 카운실 오브 캐나다
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Abstract

본 발명은 기존의 항체의 인간화에 의해 유도된 항체 및 그의 단편, 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 인간화 항체는 모 비-인간화 항체에 비해 뇌 내피 항원에의 증진된 결합, 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 개선된 통과이동, 및 증가된 열 안정성을 나타낸다.

Description

혈액-뇌 장벽을 통과이동하는 인간화 항체 및 그의 용도
관련 출원에 대한 상호-참조
이 출원은 2017년 7월 6일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/358,777호에 대한 우선권을 주장하며, 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 혈액-뇌 장벽을 통과이동하는 인간화 항체 및 그의 단편, 및 그의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 기존의 항체의 인간화에 의해 유도된 항체 및 그의 단편에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 뇌 내피 항원에의 증진된 결합 및 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 개선된 통과이동을 나타낸다.
신경퇴행성 질환, 예컨대 알츠하이머병 및 파킨슨병은, 현재 장애를 초래하는 이들 상태에 대한 효과적인 치료가 없기 때문에 우리의 고령화 사회에 대한 증가하는 부담이다. 뇌에서 기원하는 이들 및 다른 질환의 치료 뿐만 아니라 조기 진단은, 대다수의 적합한 치료제 분자 및 진단제가 조밀하고 고도로 제한적인 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 관통할 수 없기 때문에 과제로 남아 있다 (Abbott, 2013). BBB는, 혈관을 둘러싸고, 조밀한 연접부를 통해 서로 연결된 뇌 내피 세포 (BEC)에 의해 형성되는 물리적 방어벽을 구성한다 (Abbott, 2013). BEC 사이에 형성된 조밀한 연접부는 BBB의 통합성에 필수적이며, 500 달톤 (Da) 초과의 친수성 분자의 세포주위 수송을 방지한다. 뇌 내피 세포는 매우 느린 포음작용 속도를 나타내기 때문에 (Abbott, 2013), 보다 큰 분자의 세포횡단 수송은 고도로 특이적인 수용체 매개된 세포통과배출 (RMT) 경로, 및 수동, 전하-기재 흡착 매개된 세포통과배출에 제한된다 (Abbott, 2013; Pardridge, 2002). 추가적으로, 고밀도의 유출 펌프, 예컨대 P-당단백질 또는 다중-약물 저항성 단백질-1 (MDR-1)은 뇌로부터의 원하지 않는 물질의 제거에 기여한다 (Abbott, 2013).
모든 이들 특징은 병원체 및 독소로부터 뇌를 보호하는 반면, 이들은 대부분의 치료제의 진입을 동등하게 방지한다. 사실, 이들이 수송체 분자에 특이적으로 '운송되지', 즉, 커플링되지 않는다면, 5％ 미만의 소분자 치료제가 생리학적 관련 농도 (즉, 중추 신경계 (CNS) 표적을 결속하고, 약물학적/치료적 반응을 유발하는 데 충분한)에서 BBB를 횡단할 수 있으며, 사실상 보다 큰 치료제는 어느 것도 그렇게 할 수 없다. BBB를 가로질러 분자를 수송하는 효과적인 '운반체'의 결여로 인해, 신경퇴행성 질환에 대한 다수의 약물은, 그들이 충분한 양으로 뇌에 전달될 수 없기 때문에 추가의 개발로부터 '보류되거나' 제거된다.
보다 큰 분자를 뇌 내로 전달하는 여러 접근법이 탐구되었다. 예를 들어, BBB의 통합성은 붕괴될 수 있으며, 이는 누출성 BBB를 초래하고, 이는 다시 뇌 내로의 보다 큰 분자의 비제한된, 세포주위 진입을 허용한다. 조밀한 연접부는 다양한 접근법에 의해 성공적으로 느슨해지거나 붕괴될 수 있다. 예를 들어, 삼투적 충격을 유도하는 물질 (예를 들어, 만니톨, 고장성 용액)의 혈류 내로의 주사는 세포 수축을 유발하고, 조밀한 연접부의 붕괴를 초래하며, 따라서, BBB를 심각하게 손상시킨다 (Guillaume, 2010). 조밀한 연접부의 다른 조정제로는 알킬글리세롤, 브라디키닌 및 그의 몇몇 유사체, 뿐만 아니라 조밀한 연접부를 유지하는 데 관여하는 단백질의 발현을 조정하는 바이러스를 들 수 있다 (Erdlenbruch et al., 2003; Preston et al., 2008; Gan et al., 2013). BBB의 보다 국재화된 붕괴는 초음파의 적용을 통해 가능하다 (Nhan et al., 2013). 그러나, BBB가 붕괴되는 기간은 뇌 항상성을 변경시키고, 해로운 화학물질, 독소 및 병원체가 뇌로 진입하는 것을 허용하기에 충분하며; 이는 심각한 부작용, 예를 들어, 발작 및 뇌 종창, 감염 및 가능하게는 영구적인 신경병리학적 변화를 초래할 수 있다. 따라서, 다중 뇌 영역에 영향을 미치는 만성 및 광범위 뇌 질환에 대한 이들 기법으로의 반복된 치료는 실제적이지 않다. 이들 치료의 대부분은 비용이 많이 들고, 입원을 필요로 하며, 일부 접근법은 마취를 요구한다.
BBB를 회피하기 위한 또다른 접근법은 뇌척수액 (CSF), 실질 공간, 또는 뇌의 다른 부분 내로의 치료제 분자의 직접적 주사이다. 주입 또는 대류-증진 확산 (CED) 펌프를 통한 뇌내 (실질내), 뇌실내, 및 경막내 전달을 비롯한 몇몇 전달 방법이 개발되었다. 그러나, 뇌 내로의 직접 주사 또는 뇌내 삽입물 중 임의의 유형은 침습성이며, 그것이 입원, 마취, 및 종종 수술을 요구하기 때문에 비용이 많이 드는 절차이다. 더욱이, 뇌 실질 내의 치료제, 특히 큰 생물제제의 빈약한 확산 속도는 치료제의 관통을 주사/삽입의 부위 주위의 단지 작은 영역에 제한한다. 주사, 카테터, 및 삽입물의 정확한 배치는 과제이지만, 뇌의 표적화된 영역으로의 약물의 확산을 달성하는 데 중요하다. 추가적으로, 카테터 및 삽입물은 외래 물질에 대한 감염 및/또는 면역 반응을 위한 부위를 제공한다.
BBB를 가로지르는 전달을 증가시키기 위한 또다른 시도에서, CNS 약물은 그들의 뇌 흡수를 증가시키도록 변형되었다. 이러한 변형은 그들의 표면 전하의 변화, 분자 크기의 감소, 및 약물의 친지질성에 대한 변화를 포함할 수 있다. 그러나, 뇌 관통을 증가시키는 임의의 변형은 또한 그의 바람직한 활성 및/또는 특이성을 비롯한 약물의 전체적인 약리학을 변경시킬 가능성이 있다. 또한, 친지질성 분자는 P-당단백질 유출 펌프를 통해 뇌로부터 배출되는 경향이 보다 크다.
마지막으로, BBB를 가로지르는 내인성 수송 메커니즘이 개발되었다. BBB를 가로지르는 거대 분자의 수송을 허용하는 생리학적 메커니즘은 고도로 특이적인 수용체 매개된 세포통과배출 (RMT) 및 비-특이적 전하 기재 흡착제 매개된 세포내이입 경로로 나누어질 수 있다. 세포내이입은 각각 그의 수용체에의 특이적 리간드의 결합 시, 또는 뇌 내피 세포 표면 (내강 측) 상의 양이온성 리간드 또는 약물 및 음이온성 관능기 사이의 정전기적 상호작용 시 촉발된다. 이어서, 새롭게 형성된 엔도솜은 비내강 측으로 세포를 가로질러 세포통과배출되어 그의 화물을 방출한다.
흡착제 매개된 세포통과배출은 비-특이적, 전하-매개된 상호작용이기 때문에, 이는 모든 혈관층 및 기관에서 발생하며, 이는 뇌 전달용 약물의 이용가능성을 제한한다. 따라서, RMT 경로를 개발하는 것은 단지 생리학적, 비-침습성, 그러나, 고도로 수용체-특이적 뇌 전달 방법으로 남아 있다.
단지 소수의 수용체만이 BBB에서 RMT를 겪고, 그들의 천연 리간드를 가로질러 '운송하는' 것으로 현재 공지되어 있다: 이들 수용체에 결합하는 널리 연구된 트랜스페린 수용체 (TfR), 인슐린 수용체 (IR), 저-밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질 1 및 2 (LRP-1 및 -2) 및 디프테리아 독소 수용체 펩티드, 천연 리간드, 및 항체 또는 항체 단편이 개발되었으며 (Pardridge et al., 1991; Yu et al., 2011; Muruganandam et al., 2001; Abulrob et al., 2005; Demeule, 2008; Sumbria et al., 2013), 이는 내인성 RMT 경로를 이용하는 뇌로의 약물 수송체로서 기능한다. 최근, 거대 중성 아미노산 수송체 (LAT1)의 성분인 CD98hc에 대한 항체는 BBB를 가로질러 세포통과배출을 겪는 것으로 나타났으며 (Zuchero et al., 2016), 이는 이 수송체가 BBB 운반체를 개발하기 위한 또다른 표적일 수 있음을 시사한다. 그러나, 지금까지 단지 단일 펩티드 (안지오펩 (Angiopep) ANG1005, LRP-1을 표적화함)만이 II상 임상 연구에서 분석된 반면, 다른 후보는 실험실 환경에서 연구되고 있거나, 단지 1상 연구에 들어가 있다. RMT 경로는 뇌 내로의 생물학적 약물의 수송을 위한 가장 유망한 경로인 것으로 보이지만, 현재 접근법은 BBB에서의 표적 수용체의 비-선택적 발현, 운반체 및 천연 리간드 사이의 수용체에 대한 경쟁, 수용체의 비효과적인 세포통과배출, 뿐만 아니라 세포내이입된 운반체의 리소좀적 분해를 비롯한 제한을 갖는다 (Xiao and Gun, 2013).
BBB의 생리학 및 항상성을 붕괴시키지 않는 고-용량 및 고-선택성 BBB 운반체의 결여는 뇌 종양 및 신경퇴행성 질환을 비롯한 뇌에서 기원하는 질환에 대한 새로운 치료제 및 진단제의 개발을 지연시킨다.
발명의 요약
본 발명은 혈액-뇌 장벽을 통과이동하는 항체 및 그의 단편, 및 그의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 기존의 항체의 인간화에 의해 유도된 항체 및 그의 단편에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 뇌 내피 항원에의 증진된 결합 및 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 개선된 통과이동을 나타낸다.
본 발명은 서열
X1VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWX2RQAPGKX3X4EX5VSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTX6YLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호 (SEQ ID NO): 9)를 포함하는 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편을 제공하며, 여기서, X1=D 또는 E, X2=F 또는 V, X3=E 또는 G, X4=R 또는 L, X5=F 또는 W, X6=L 또는 V이다.
예를 들어, 본 발명의 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWVRQAPGKGLEWVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 2, 본원에서 FC5-H1로 지칭됨);
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWVRQAPGKGLEWVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 3, 또한 본원에서 FC5-H2로 지칭됨);
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKGLEFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 4, 또한 본원에서 FC5-H3으로 지칭됨);
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKGLEFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 5, 또한 본원에서 FC5-H4로 지칭됨);
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKGREFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 6, 또한 본원에서 FC5-H5로 지칭됨);
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKEREFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 7, 또한 본원에서 FC5-H6으로 지칭됨); 및
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKEREFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 8, 또한 본원에서 FC5-H7로 지칭됨)
중 어느 하나로부터 선택될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명에서, 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 임의의 적합한 다량체화 기술을 사용한 다가 제시 형식(multivalent display format)일 수 있다. 예를 들어, 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 Fc 단편에 연결되고, 따라서 이량체를 형성할 수 있다. 이 실시양태에서, Fc 단편은 임의의 적합한 Fc 단편, 예를 들어 마우스 IgG2b로부터의 또는 인간 IgG1로부터의 Fc일 수 있다. 구체적인 예에서, Fc는 서열식별번호: 20의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 혈액-뇌 장벽을 통과이동할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포괄한다. 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터는 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 표면 상으로 고정화될 수 있다.
또다른 적용에서, 상기 기재된 바와 같은 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 화물 분자에 연결될 수 있다. 임의의 적합한 화물 분자가 사용될 수 있다. 화물 분자는 약 1 kDa 내지 약 200 kDa의 범위의 분자량을 가질 수 있다. 예를 들어, 및 제한적이기를 원하지는 않지만, 화물 분자는 검출제, 치료제, 약물, 펩티드, 성장 인자, 시토카인, 수용체 트랩, 화학 화합물, 탄수화물 모이어티, 효소, 항체 또는 그의 단편, DNA-기재 분자, 바이러스 벡터, 또는 세포독성제; 검출제, 치료제, 약물, 펩티드, 효소, 항체 또는 그의 단편, DNA-기재 분자, 바이러스 벡터, 또는 세포독성제가 로딩된 1종 이상의 리포솜 또는 나노운반체; 또는 1종 이상의 나노입자, 나노와이어, 나노튜브, 또는 양자점일 수 있다. 이러한 구축물에서, 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 혈액-뇌 장벽을 가로질러 화물 분자를 운반한다.
본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 1종 또는 1종 초과의 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편 및 제약학적으로-허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 조성물을 포괄한다.
이제, 혈액-뇌 장벽-횡단 항체 FC5의 인간화 변이체가 제시된다. 항체의 인간화는 VHH 내의 낙타류 기원의 아미노산 잔기로 인한 인간에서의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 목표로 한다. FC5 항체의 CDR 서열은 인간 중쇄 프레임워크 상으로 그래프팅되었을 뿐만 아니라, 복귀-돌연변이 (모 낙타류 서열의 선택된 아미노산 잔기에 대한)도 또한 완전-인간화 프레임워크 서열 내로 도입되었다. 놀랍게도, 일반적으로 인간화 변이체는 모 낙타류 FC5에 비해 용융 온도 (Tm) 값에 의해 반영된 바와 같이 개선된 열 안정성을 나타내었으며, 한 변이체 (FC5-H3)는 모 FC5에 비해 10℃ 초과의 이례적인 Tm-증가를 나타내었음이 밝혀졌다. 더욱이, 대부분의 인간화 FC5 구축물은 SV-ARBEC-발현된 수용체에 대한 개선된 친화도를 나타내었으며, 한 변이체 (FC5-H7)는 모 FC5에 비해 예상외로 유의한 증가를 나타내었다. 중요하게는, 이 경향은 또한 모 낙타류 FC5 대비 인간화 변이체에 의해 제공되는 인간 뇌 내피 세포 (HBEC)-D3에 대한 결합 개선과 일치한다. 마지막으로, 인간화 변이체는 적어도 모 FC5 항체의 수준이며, 인간화 변이체의 일부에 대해 165％만큼 많이 증가된 시험관내 세포 투과성 능력을 나타낸다.
본 발명의 이들 및 다른 특색은 이제 예로서 첨부된 도면을 참조로 설명될 것이다:
도 1은 FC5 VHH 및 그의 인간화 변이체의 서열의 정렬이다.
도 2는 FC5 VHH 및 그의 인간화 변이체 (FC5-H1, FC5-H2, FC5-H3, FC5-H5, FC5-H6, FC5-H7로 표지됨)에 대한 원편광 이색성 (CD)에 의해 측정된 바와 같은 용융 온도 (Tm)를 나타낸다. 단백질을 90℃ 초과로 가열하고, 측정을 CD 기기에서 취하여 용융 곡선 (흑색 또는 채워진 원) 및 Tm을 측정하였다. 이어서, 단백질을 실온으로 냉각시키고, 한 번 더 가열하고, CD에 의해 분석하였다 (회색 곡선 또는 정사각형). 이는 재폴딩된 단백질의 분율의 측정을 허용하였다.
도 3은 미러볼 (Mirrorball) 기기를 사용하여 측정된 현탁액 중에서의 래트 뇌 내피 세포 (SV-ARBEC) 또는 인간 미세혈관 뇌 내피 세포 (HBEC-D3)에 대한 FC5 VHH 및 그의 인간화 변이체의 결합 곡선을 나타낸다. 계열 희석액을 미러볼 384 웰 검정 플레이트 내의 각각의 시험 변이체에 대해 제조하여 7-점 결합 곡선을 생성하였다. Draq 5 핵 염색 (2 uM, 셀 시그널링 (Cell Signaling))으로 보충된 형광 접합체 c-myc 알렉사 (Alexa) 488 검출 항체 (1600 ng/ml, 산타 크루즈 바이오테크놀로지 (Santa Cruz Biotechnology))를 세포-결합된 항체의 검출에 사용하였다. 모든 플레이트를 4℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 판독을 하기 기재된 바와 같이 미러볼 고민감도 마이크로플레이트 세포측정법 (Mirrorball High Sensitivity Microplate Cytometry)을 사용하여 취하였다.
도 4는 FC5 및 그의 인간화 변이체 (H1 내지 H7)의 시험관내 BBB 모델에서의 Papp 값을 나타낸다. 등몰량 (1.25 μM)의 FC5의 각각의 변이체 및 음성 대조군 (A20.1, 클로스트리디움 디피실레 (Clostridium difficile) 독소 A-결합 VHH)을 래트 시험관내 BBB 모델을 횡단하는 그들의 능력에 대해 동시에 시험하였다. 도 4a는 트랜스웰 (Transwell) 시험관내 BBB 모델을 나타낸다. 성체 래트로부터의 SV40-불멸화 뇌 내피 세포 (svARBEC)를 삽입체의 막 상의 단층으로 하부 챔버 중의 래트 별아교세포-조건화 배지 및 상부 챔버 중의 표준 배지의 존재 하에서 성장시킨다. BBB 모델의 내강 측에의 등몰량의 다양한 VHH의 공동-첨가 후, 샘플을 15, 30 및 60분 후에 하부 챔버로부터 취하였다. 그 후, 각각의 VHH의 농도를 이들 샘플에서 질량 분광법 (다중 반응 모니터링 - 동위원소 표지된 내부 표준물; MRM-ILIS)에 의해 정량화하였다. 주어진 식 [Qr/dt = 시간 대비 리시버 구획에서의 누적량; A = 세포 단층의 면적; C0 = 투약 용액의 초기 농도]을 사용하여 계산된 Papp 값을 사용하여 BBB를 횡단하는 분자의 능력을 측정한다. 결과는 5 내지 6회의 트랜스웰 실험에서 얻어진 평균 Papp 값이다. 도 4b는 FC5 및 그의 인간화 변이체 H1 내지 H7에 대한 Papp 값을 나타낸다. 모든 변이체는 음성 대조군 A20.1 VHH에 비해 향상된 BBB 횡단을 나타내었다. FC5-H3 및 FC5-H5는 모 FC5에 비해 통계적으로 (p<0.05; 스튜던트 (Student's) t-검정) 더 높은 Papp 값을 나타내었다.
도 5는 시험관내에서의 FC5 및 FC5-H7의 Fc 융합물의 결합 및 통과이동을 나타낸다. 도 5a는 미러볼 기기를 사용하여 측정된 현탁액 중에서의 래트 뇌 내피 세포 (SV-ARBEC)에의 FC5Fc 및 FC5H7-Fc의 결합을 나타낸다. 계열 희석액을 미러볼 384 웰 검정 플레이트 내의 각각의 시험 변이체에 대해 제조하여 7-점 결합 곡선을 생성하였다. Draq 5 핵 염색 (2 uM, 셀 시그널링)으로 보충된 형광 접합체 c-myc 알렉사 488 검출 항체 (1600 ng/ml, 산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 세포-결합된 항체의 검출에 사용하였다. 모든 플레이트를 4℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 판독을 하기 기재된 바와 같이 미러볼 고민감도 마이크로플레이트 세포측정법을 사용하여 취하였다. 도 5b는 트랜스웰 시험관내 BBB 모델에서의 FC5Fc 및 FC5H7-Fc의 Papp 값을 나타낸다. 실험을 도 4에 기재된 바와 같이 수행하였다.
본 발명은 혈액-뇌 장벽을 통과이동하는 항체 및 그의 단편, 및 그의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 기존의 항체의 인간화에 의해 유도된 항체 및 그의 단편에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 뇌 내피 항원에의 증진된 결합 및 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 개선된 통과이동을 나타낸다.
본 발명은 서열 X1VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWX2RQAPGKX3X4EX5VSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTX6YLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 9)를 포함하는 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편을 제공하며, 여기서, X1=D 또는 E, X2=F 또는 V, X3=E 또는 G, X4=R 또는 L, X5=F 또는 W, X6=L 또는 V이다.
관련 기술분야에서 또한 "이뮤노글로불린" (Ig)으로 지칭되는 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 쌍형성된 중 및 경 폴리펩티드 쇄로부터 구축된 단백질을 지칭하며; IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM을 비롯한 다양한 Ig 이소형이 존재한다. 항체가 정확하게 폴딩되는 경우, 각각의 쇄는 보다 선형 폴리펩티드 서열에 의해 결합된 다수의 별개의 구형 도메인으로 폴딩된다. 예를 들어, 이뮤노글로불린 경쇄는 가변 (VL) 및 불변 (CL) 도메인으로 폴딩되는 반면, 중쇄는 가변 (VH) 및 3개의 불변 (CH, CH2, CH3) 도메인으로 폴딩된다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (VH 및 VL)의 상호작용은 항원 결합 영역 (Fv)의 형성을 초래한다. 각각의 도메인은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 익숙한 널리 확립된 구조를 갖는다.
경쇄 및 중쇄 가변 영역은 표적 항원에 결합하는 것을 담당하며, 따라서, 항체 사이에 유의한 서열 다양성을 나타낸다. 불변 영역은 더 적은 서열 다양성을 나타내며, 중요한 생화학적 사건을 유발하는 다수의 천연 단백질에 결합하는 것을 담당한다. 항체의 가변 영역은 분자의 항원-결합 결정자를 함유하며, 따라서, 그의 표적 항원에 대한 항체의 특이성을 결정한다. 대다수의 서열 가변성은 가변 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 당 각각 3개씩인 6개의 초가변 영역에서 발생하며; 초가변 영역은 조합되어 항원-결합 부위를 형성하고, 항원 결정자의 결합 및 인식에 기여한다. 그의 항원에 대한 항체의 특이성 및 친화도는 초가변 영역의 구조, 뿐만 아니라 그들의 크기, 형상 및 그들이 항원에 제시하는 표면의 화학에 의해 결정된다. 초가변성의 영역의 확인을 위한 다양한 체계가 존재하며, 2가지 가장 통상적인 것은 카바트 (Kabat)의 및 코티아 및 레스크 (Chothia and Lesk)의 것들이다. 문헌 [Kabat et al (1991)]은 VH 및 VL 도메인의 항원-결합 영역에서의 서열 가변성에 기초하여 "상보성-결정 영역" (CDR)을 정의한다. 문헌 [Chothia and Lesk (1987)]은 VH 및 VL 도메인에서의 구조적 루프 영역의 위치에 기초하여 "초가변 루프" (H 또는 L)를 정의한다. 이들 개별적 체계는 인접하거나 중첩하는 CDR 및 초가변 루프 영역을 정의하고, 항체 분야의 통상의 기술자는 종종 호환적으로 용어 "CDR" 및 "초가변 루프"를 이용하며, 이들은 본원에서 그렇게 사용될 수 있다. CDR/루프는 카바트 체계에 따라 본원에서 확인된다.
본원에 지칭된 바와 같은 "항체 단편"은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 항원-결합 항체 단편을 포함할 수 있다. 항체 단편은 천연-발생 항체 단편일 수 있거나, 천연-발생 항체의 조작에 의해 또는 재조합 방법을 사용함으로써 얻어질 수 있다. 예를 들어, 항체 단편으로는 Fv, 단일-쇄 Fv (scFv; 펩티드 링커와 연결된 VL 및 VH로 이루어진 분자), Fab, F(ab')2, 단일-도메인 항체 (sdAb; 단일 VL 또는 VH로 구성된 단편), 및 이들 중 임의의 것의 다가 제시물을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 항체 단편, 예컨대 방금 기재된 것들은 단편의 상이한 부분을 연결시키는 링커 서열, 디술피드 결합, 또는 다른 유형의 공유 결합을 요구할 수 있으며; 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상이한 유형의 단편 및 그들의 구축을 위한 다양한 접근법의 요건에 익숙할 것이다.
비-제한적 예에서, 항체 단편은 천연-발생 공급원으로부터 유래된 sdAb일 수 있다. 낙타류 기원의 중쇄 항체 (Hamers-Casterman et al., 1993)는 경쇄가 결여되며, 따라서, 그들의 항원 결합 부위는 VHH로 용어화된 1개의 도메인으로 이루어진다. sdAb는 또한 상어에서 관찰되었으며, VNAR로 용어화된다 (Nuttall et al., 2003). 다른 sdAb는 인간 Ig 중쇄 및 경쇄 서열에 기초하여 조작될 수 있다 (Jespers et al., 2004; To et al., 2005). 본원에 사용된 바와 같은 용어 "sdAb"는 파지 제시 또는 다른 기술을 통해 임의의 기원의 VH, VHH, VL, 또는 VNAR 저장소로부터 직접적으로 단리된 그러한 sdAb, 상기 언급된 sdAb로부터 유래된 sdAb, 재조합적으로 생성된 sdAb, 뿐만 아니라 인간화, 친화성 성숙, 안정화, 가용화, 낙타화, 또는 항체 조작의 다른 방법에 의한 이러한 sdAb의 추가의 변형을 통해 생성된 그러한 sdAb를 포함한다. 또한, sdAb의 항원-결합 기능 및 특이성을 보유하는 동족체, 유도체, 또는 단편은 본 발명에 의해 포괄된다.
SdAb는 항체 분자에 대한 바람직한 특성, 예컨대 높은 열안정성, 높은 세제 저항성, 프로테아제에 대한 상대적으로 높은 저항성 (Dumoulin et al., 2002) 및 높은 생산 수율 (Arbabi-Ghahroudi et al., 1997)을 가지며; 이들은 또한 면역 라이브러리로부터의 단리에 의해 (Li et al., 2009) 또는 시험관내 친화성 성숙에 의해 (Davies & Riechmann, 1996) 매우 높은 친화도를 갖도록 조작될 수 있다. 안정성을 증가시키기 위한 추가의 변형, 예컨대 비-정준 디술피드 결합의 도입 (Hussack et al., 2011; Kim et al., 2012)은 또한 sdAb에 제공될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 단일-도메인 항체 (예를 들어, 단백질 데이터 뱅크 (Protein Data Bank)에서 3DWT, 2P42)의 구조를 널리 숙지하고 있을 것이다. sdAb는 이뮤노글로불린 폴드를 보유하는 단일 이뮤노글로불린 도메인; 가장 주목할 만 하게는, 항원-결합 부위로부터의 단지 3개의 CDR/초가변 루프를 포함한다. 그러나, 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 모든 CDR이 항원에 결합할 것이 요구되지는 않을 수 있다. 예를 들어, 및 제한적이기를 원하지는 않지만, CDR 중 1개, 2개, 또는 3개는 본 발명의 sdAb에 의한 항원의 결합 및 인식에 기여할 수 있다. sdAb 또는 가변 도메인의 CDR은 본원에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지칭된다.
본 발명은 "인간화된" 항체 단편을 포괄한다. 항체 또는 항체 단편의 인간화는 인간 컨센서스 서열에서 발견된 바와 같이, 항원-결합 능력 또는 특이성의 소실 없이 서열 중의 아미노산을 그의 인간 대응물로 대체하는 것을 포함하며; 이 접근법은 인간 대상체 내로 도입되는 경우 항체 또는 그의 단편의 면역원성을 감소시킨다. CDR 그래프팅의 프로세스에서, 본원에서 정의된 CDR 중 1개 또는 1개 초과는 인간 가변 영역 (VH, 또는 VL)에, 다른 인간 항체 (IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM)에, 항체 단편 프레임워크 영역 (Fv, scFv, Fab)에, 또는 CDR이 그 위로 그래프팅되는 유사한 크기 및 성질의 단백질에 융합되거나 그래프팅될 수 있다 (Nicaise et al., 2004). 이러한 경우, 상기 1개 또는 1개 초과의 초가변 루프의 형태는 보존될 가능성이 있으며, 그의 표적 (즉, 뇌 내피 세포)에 대한 sdAb의 친화도 및 특이성은 최소로 영향을 받을 가능성이 있다. CDR 그래프팅은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며 (예를 들어, 문헌 [Tsurushita et al, 2005]; [Jones et al, 1986]; [Tempest et al, 1991]; [Riechmann et al, 1988]; [Queen et al, 1989] 참조; 문헌 [Gonzales et al, 2005]에서 리뷰됨 - 또한 그 안에 인용된 참고문헌 참조), 따라서, 통상의 기술자는 이러한 인간화 항체 단편을 제조하고, 아미노산 위치를 인간화하는 방법에 충분히 익숙할 것이다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편은 WO 2002/057445에 기재된 FC5 항체의 인간화 버전이다. FC5 (서열식별번호: 1)는 뇌 내피 세포의 표면에 결합하고, 이어서 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 통과이동한다. FC5는 또한 BBB를 가로지르는 다양한 크기의 안내자 분자에 대한 운반체로서 작용하는 것으로 나타났다 (예를 들어, WO 2011/127580 참조). FC5 통과이동을 매개하는 항원은 막횡단 도메인 단백질 30A로서 확인되었으며 (TMEM30A; WO 2007/036021), 이는 뇌 내피 세포의 표면 상에 풍부하다.
예를 들어, 및 어떤 식으로도 제한적이기를 원하지는 않지만, 상기 기재된 바와 같은 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWVRQAPGKGLEWVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 2, 본원에서 FC5-H1로 지칭됨);
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWVRQAPGKGLEWVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 3, 또한 본원에서 FC5-H2로 지칭됨);
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKGLEFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 4, 또한 본원에서 FC5-H3으로 지칭됨);
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKGLEFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 5, 또한 본원에서 FC5-H4로 지칭됨);
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKGREFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 6, 또한 본원에서 FC5-H5로 지칭됨);
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKEREFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 7, 또한 본원에서 FC5-H6으로 지칭됨);
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKEREFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 8, 또한 본원에서 FC5-H7로 지칭됨); 및
그와 실질적으로 동일한 서열
로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
실질적으로 동일한 서열은 1개 이상의 보존적 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 참조 서열에 대한 1개 이상의 보존적 아미노산 돌연변이는 참조 서열에 비해 생리학적, 화학적, 물리-화학적 또는 기능적 특성의 실질적 변화 없이 돌연변이체 펩티드를 생성할 수 있음이 관련 기술분야에 공지되어 있으며; 이러한 경우, 참조 및 돌연변이체 서열은 "실질적으로 동일한" 폴리펩티드로 간주될 것이다. 보존적 아미노산 치환은 본원에서 아미노산 잔기의 유사한 화학적 특성 (예를 들어 크기, 전하, 또는 극성)을 갖는 또다른 아미노산 잔기에 대한 치환으로서 정의된다. 이들 보존적 아미노산 돌연변이는 FC5의 CDR 서열 (서열식별번호: 1 내지 9의 잔기 26 내지 35, 50 내지 66, 99 내지 111) 및 항체 또는 단편의 CDR의 전체적인 구조를 유지하면서 sdAb의 프레임워크 영역에 이루어지며; 따라서, 항체의 특이성 및 결합은 유지된다. 더욱이, sdAb의 인간화에 기여하는 프레임워크 잔기 (서열식별번호: 2 내지 9의 잔기 1, 5, 14, 37, 44, 45, 47, 75, 79, 87, 88, 93, 114, 및 117)는 또한 유지되어야 한다.
비-제한적 예에서, 보존적 돌연변이는 아미노산 치환일 수 있다. 이러한 보존적 아미노산 치환은 염기성, 중성, 소수성, 또는 산성 아미노산을 동일한 기의 또다른 것에 대해 치환할 수 있다. 용어 "염기성 아미노산"은 7 초과의 측쇄 pKa 값을 갖는 친수성 아미노산을 의미하며, 이는 전형적으로 생리학적 pH에서 양으로 하전된다. 염기성 아미노산으로는 아르기닌 (Arg 또는 R), 및 리신 (Lys 또는 K)을 들 수 있다. 용어 "중성 아미노산" (또한 "극성 아미노산")은 생리학적 pH에서 비하전되지만, 2개의 원자에 의해 공통적으로 공유되는 전자의 쌍이 원자 중 하나에 의해 보다 더 가깝게 유지되는 적어도 1개의 결합을 갖는 측쇄를 갖는 친수성 아미노산, 예를 히스티딘 (His 또는 H)을 의미한다. 극성 아미노산으로는 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 시스테인 (Cys 또는 C), 티로신 (Tyr 또는 Y), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 및 글루타민 (Gln 또는 Q)을 들 수 있다. 용어 "소수성 아미노산" (또한 "비-극성 아미노산")은 문헌 [Eisenberg (1984)]의 정규화된 컨센서스 소수성 스케일에 따라 0 초과의 소수성을 나타내는 아미노산을 포함하는 것을 의미한다. 소수성 아미노산으로는 프롤린 (Pro 또는 P), 이소류신 (Ile 또는 I), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 발린 (Val 또는 V), 류신 (Leu 또는 L), 트립토판 (Trp 또는 W), 메티오닌 (Met 또는 M), 알라닌 (Ala 또는 A), 및 글리신 (Gly 또는 G)을 들 수 있다. "산성 아미노산"은 7 미만의 측쇄 pK 값을 갖는 친수성 아미노산을 지칭하며, 이는 전형적으로 생리학적 pH에서 음으로 하전된다. 산성 아미노산으로는 글루타메이트 (Glu 또는 E), 및 아스파르테이트 (Asp 또는 D)를 들 수 있다.
서열 동일성은 2개의 서열의 유사성을 평가하는 데 사용되며; 이는 2개의 서열을 잔기 위치 사이의 최대 상응성에 대해 정렬한 경우 동일한 잔기의 퍼센트를 계산함으로써 측정된다. 임의의 공지된 방법은 서열 동일성을 계산하는 데 사용될 수 있으며; 예를 들어, 컴퓨터 소프트웨어는 서열 동일성을 계산하는 데 이용가능하다. 제한적이기를 원하지는 않지만, 서열 동일성은 스위스 인스티튜트 오브 바이오인포매틱스 (Swiss Institute of Bioinformatics) (및 ca.expasy.org/tools/blast/에서 발견된 바와 같음)에 의해 유지되는 소프트웨어, 예컨대 NCBI BLAST2 서비스, BLAST-P, Blast-N, 또는 FASTA-N, 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 적절한 소프트웨어에 의해 계산될 수 있다.
본 발명의 실질적으로 동일한 서열은 적어도 90％ 동일할 수 있으며; 또다른 예에서, 실질적으로 동일한 서열은 본원에 기재된 서열에 대한 아미노산 수준에서, 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100％, 또는 그 사이의 임의의 백분율로 동일할 수 있다. 중요하게는, 실질적으로 동일한 서열은 참조 서열의 활성 및 특이성을 보유한다. 비-제한적 실시양태에서, 서열 동일성의 차이는 보존적 아미노산 돌연변이(들)에 기인할 수 있다. 비-제한적 예에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체의 그것과 적어도 95％, 98％, 또는 99％ 동일한 서열을 포함하는 항체 또는 그의 단편에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편은 또한 재조합 항체 또는 그의 단편의 발현, 검출 또는 정제에 있어서 도움을 주는 추가의 서열을 포함할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 이러한 서열 또는 태그가 사용될 수 있다. 예를 들어, 및 제한적이기를 원하지는 않지만, 항체 또는 그의 단편은 표적화 또는 신호 서열 (예를 들어, ompA (그러나 이에 제한되지는 않음)), 검출/정제 태그 (예를 들어, c-Myc, His5, 또는 His6 (그러나 이에 제한되지는 않음)), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또다른 예에서, 추가의 서열은 비오틴 인식 부위, 예컨대 크로난 (Cronan) 등에 의해 WO 95/04069에 또는 포게스 (Voges) 등에 의해 WO/2004/076670에 기재된 것일 수 있다. 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 링커 서열은 추가의 서열 또는 태그와 함께 사용될 수 있거나, 검출/정제 태그로서 기능할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편은 또한 본원에서 또한 다가 제시물로 지칭되는 다가 제시 형식일 수 있다. 다량체화는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 및 어떤 식으로도 제한적이기를 원하지는 않지만, 다량체화는 자기-어셈블리 분자, 예컨대 WO2003/046560에 기재된 것들을 사용하여 달성될 수 있으며, 여기서, 펜타바디는 본 발명의 항체 또는 그의 단편 및 AB5 독소 족의 B-서브유닛의 오량체화 도메인을 포함하는 융합 단백질을 발현시킴으로써 생성된다 (Merritt & Hol, 1995). 다량체는 또한 문헌 [Zhu et al. (2010)]에 의해 기재된 다량체화 도메인을 사용하여 형성될 수 있으며; 본원에서 "콤바디 (combody)"로 지칭되는 이 형태는 본 발명의 항체 또는 단편과 다량체성 분자를 초래하는 코일화된-코일 펩티드의 융합물이다. 다가 제시의 다른 형태는 또한 본 발명에 의해 포괄된다. 예를 들어, 및 제한적이기를 원하지는 않지만, 항체 또는 그의 단편은 이량체, 삼량체, 또는 임의의 다른 적합한 올리고머로서 제시될 수 있다. 이는 관련 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어 직접 연결 커넥션 (Nielson et al., 2000), c-jun/Fos 상호작용 (de Kruif & Logtenberg, 1996), "구멍 내로의 손잡이 (Knob into holes)" 상호작용 (Ridgway et al., 1996)에 의해, 또는 비대칭 플랫폼 (Von Kreudenstein et al., 2014)을 사용하여 달성될 수 있다.
다량체화를 위한 관련 기술분야에 공지된 또다른 방법은 항체 또는 그의 단편을 Fc 도메인, 예를 들어, 마우스 또는 인간 Fc 도메인 (그러나 이에 제한되지는 않음)을 사용하여 이량체화시키는 것이다. 인간 Fc 도메인은 IgG, IgM을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 부류, 또는 IgG1, IgG2 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 하위부류로부터 선택될 수 있다. 이 접근법에서, Fc 유전자는 sdAb 유전자와 함께 벡터 내로 삽입되어 sdAb-Fc 융합 단백질을 생성하며 (Bell et al., 2010; Iqbal et al., 2010); 융합 단백질은 재조합적으로 발현된 후, 정제된다. 예를 들어, 및 어떤 식으로도 제한적이기를 원하지는 않지만, 다가 제시 형식은 Fc 도메인에 연결된 FC5-H7 및 그의 돌연변이적 변이체의 키메라 형식을 포괄할 수 있다. 이러한 항체는 조작하기에 및 생산하기에 용이하고, sdAb의 혈청 반감기를 크게 연장시킬 수 있으며, 우수한 종양 영상화 시약일 수 있다 (Bell et al., 2010).
방금 기재된 바와 같은 다량체성 복합체에서의 Fc 도메인은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 Fc 단편일 수 있다. Fc 단편은 임의의 적합한 공급원으로부터의 것일 수 있으며; 예를 들어, Fc는 마우스 또는 인간 기원의 것일 수 있다. 구체적인, 비-제한적 예에서, Fc는 마우스 IgG2b 이소형으로부터의 또는 인간 IgG1 이소형으로부터의 것일 수 있다 (Bell et al., 2010; Iqbal et al., 2010). 구체적인, 비-제한적 예에서, 방금 기재된 바와 같은 다량체화된 단리 또는 정제된 항체 또는 단편은 서열식별번호: 20의 서열을 포함하는 Fc를 포함할 수 있다.
상기 기재된 다량체의 각각의 서브유닛은 동일하거나 상이한 특이성을 가질 수 있는 본 발명의 동일하거나 상이한 항체 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 추가적으로, 다량체화 도메인은 요구에 따라, 링커를 사용하여 항체 또는 항체 단편에 연결될 수 있으며; 이러한 링커는 2개의 분자의 유연성 부착을 제공하기에 충분한 길이 및 적절한 조성의 것이어야 하지만, 항체의 항원-결합 특성을 방해하지 않아야 한다.
본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 단편은 혈액-뇌 장벽을 가로질러 통과이동할 수 있다. 뇌는 혈액-뇌 장벽 (BBB)으로 공지된 특수화된 내피 조직에 의해 신체의 나머지로부터 분리된다. BBB의 내피 세포는 조밀한 연접부에 의해 연결되며, 많은 치료제 화합물이 뇌로 진입하는 것을 효과적으로 방지한다. 소포 수송의 낮은 속도 외에도, BBB의 한 가지 특이적인 특색은 뇌로부터의 다양한 분자를 혈류 내로 능동적으로 수송하는 (Samuels, 1993) P-당단백질 (Gottesman et al., 1993; Watanabe, 1995)을 비롯한, BBB의 비내강 (뇌) 측 상의 효소적 장벽(들)의 존재 및 ATP-의존적 수송체의 발현의 높은 수준(들)이다. 단지 작은 (<500 달톤) 및 소수성 (Pardridge, 1995) 분자만이 BBB를 보다 용이하게 횡단할 수 있다. 따라서, 표면 수송체에 특이적으로 결합하고, 뇌 내피 세포 내로 내재화하고, 리소좀 분해를 모면함으로써 BBB를 가로질러 세포통과배출을 겪는 상기 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 단편의 능력은 신경학 분야에 유용하다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포괄한다. 유전 암호의 축퇴성을 고려하면, 다수의 뉴클레오티드 서열은 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해될 것인 바와 같이 폴리펩티드를 코딩하는 효과를 가질 것이다. 핵산 서열은 다양한 미생물에서 발현에 대해 코돈-최적화될 수 있다. 본 발명은 또한 방금 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터를 포괄한다. 더욱이, 본 발명은 기재된 바와 같은 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 세포를 포괄한다.
본 발명은 또한 다양한 방법론을 사용하여 표면 상으로 고정화된 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편을 포괄하며; 예를 들어, 및 제한적이기를 원하지는 않지만, 항체 또는 단편은 His-태그 커플링, 비오틴 결합, 공유 결합, 흡착 등을 통해 표면에 연결되거나 커플링될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 고정화는 단백질을 포획하거나, 정제하거나 단리하기 위한 다양한 적용에 유용할 수 있다. 고체 표면은 임의의 적합한 표면, 예를 들어, 미세역가 플레이트의 웰 표면, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 센서칩의 채널, 막, 비드 (예컨대 자기-기재 또는 세파로스-기재 비드 또는 다른 크로마토그래피 수지), 유리, 플라스틱, 스테인리스 강, 필름, 또는 임의의 다른 유용한 표면, 예컨대 나노입자, 나노와이어 및 캔틸레버 표면일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또한 화물 분자에 연결된 상기 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 단편을 포괄한다. 화물 분자는 항체 또는 그의 단편에 의해 BBB를 가로질러 전달되는 임의의 적합한 분자일 수 있다. 화물 분자는 약 1 kDa 내지 약 200 kDa의 범위의 분자량을 가질 수 있으며; 예를 들어, 화물 분자는 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 또는 200 kDa, 또는 그 사이의 임의의 중량, 또는 임의의 2개의 상기 언급된 중량에 의해 한정되는 중량의 임의의 범위의 분자량을 가질 수 있다. 구체적인, 비-제한적 예에서, 화물 분자는 1 kDa (예를 들어, 소분자, 예컨대 Cy5.5 (그러나 이에 제한되지는 않음)), 1 내지 10 kDa (예를 들어, 펩티드, 예컨대 갈라닌, 3 kDa (그러나 이에 제한되지는 않음)), 약 80 kDa (예를 들어, Fc 단편, 효소, 단백질, 항체 등 (그러나 이에 제한되지는 않음)), 또는 약 180 kDa (예를 들어, 모노클로날 항체 (그러나 이에 제한되지는 않음))의 분자량을 가질 수 있다.
예를 들어, 및 어떤 식으로도 제한적이기를 원하지는 않지만, 화물 분자는 검출제, 치료제, 약물, 펩티드, 효소, 성장 인자, 시토카인, 수용체 트랩, 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, IgG, scFv, Fab, VHH 등), 화학 화합물, 탄수화물 모이어티, DNA-기재 분자 (안티-센스 올리고뉴클레오티드, 마이크로RNA, siRNA, 플라스미드), 세포독성제, 바이러스 벡터 (아데노-, 렌티-, 레트로), 이전에 인용된 유형의 화물 분자 중 임의의 것으로 로딩된 1종 이상의 리포솜, 또는 1종 이상의 나노입자, 나노와이어, 나노튜브, 또는 양자점일 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 화물 분자는 검출제일 수 있다. 예를 들어, FC5 항체 변이체 또는 그의 단편은 방사성동위원소, 상자성 표지, 형광단, 형광제, 근적외선 (NIR; 예를 들어 Cy5.5) 형광색소 또는 염료, 에코발생 미세버블, 친화성 표지, 검출가능한 단백질-기재 분자, 뉴클레오티드, 양자점, 나노입자, 나노와이어, 또는 나노튜브 또는 영상화 방법에 의해 검출될 수 있는 임의의 다른 적합한 작용제에 연결될 수 있다. 항체 또는 그의 단편은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법 (재조합 기술, 화학적 접합 등)을 사용하여 화물 분자에 연결될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 화물 분자는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 항체 또는 그의 단편에 연결될 수 있으며, 이는 또한 본원에서 "접합될"로 지칭된다. 예를 들어, 및 제한적이기를 원하지는 않지만, 화물 분자는 공유 결합 또는 이온성 상호작용에 의해 펩티드에 연결될 수 있다. 연결은 화학적 가교 반응을 통해, 또는 임의의 펩티드 발현 시스템, 예컨대 박테리아, 효모 또는 포유동물 세포-기재 시스템과 조합된 재조합 DNA 방법론을 사용한 융합을 통해 달성될 수 있다. 화물 분자를 항체 또는 그의 단편에 접합시키는 경우, 적합한 링커가 사용될 수 있다. 항체 또는 그의 단편을 화물 분자, 예컨대 치료제 또는 검출제에 연결시키는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있을 것이다.
한 비-제한적 예에서, 화물 분자는 검출가능한 표지, 방사성동위원소, 상자성 표지, 예컨대 가돌리늄 또는 산화철, 형광단, 근적외선 (NIR) 형광색소 또는 염료, 에코발생 미세버블, 친화성 표지 (예를 들어 비오틴, 아비딘 등), 효소, 또는 진단 영상화 방법에 의해 검출될 수 있는 임의의 다른 적합한 작용제일 수 있다. 구체적인, 비-제한적 예에서, 항-IGF1R-5 또는 그의 단편은 근적외선 형광 (NIRF) 영상화 염료, 예를 들어 및 제한적이기를 원하지는 않지만 Cy5.5, 알렉사680, 딜라이트 (Dylight)680, 또는 딜라이트800에 연결될 수 있다.
상기 기재된 방법에서 생체내 검출 단계는 질환의 진행 또는 치료 처방에 대한 숙주 반응을 평가하는 정량적 방식으로, 진단 목적을 위한 전신 영상화 또는 특이적 부위, 예컨대 뇌 맥관 또는 뇌 종양 맥관 (그러나 이에 제한되지는 않음)에서의 국소 영상화일 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 방법에서 검출 단계는 면역조직화학, 또는 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는 비-침습성 (분자) 진단 영상화 기술일 수 있다:
· 광학 영상화;
· 양전자 방출 단층촬영술 (PET), 여기서, 검출제는 동위원소, 예컨대 11C, 13N, 15O, 18F, 64Cu, 62Cu, 124I, 76Br, 82Rb 및 68Ga이며, 18F가 가장 임상적으로 이용된다;
· 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영술 (SPECT), 여기서, 검출제는 구체적인 적용에 따라 방사선추적자, 예컨대 99mTc, 111In, 123I, 201Tl, 133Xe이다;
· 자기 공명 영상화 (MRI), 여기서, 검출제는 예를 들어 가돌리늄, 산화철 나노입자 및 탄소-코팅된 철-코발트 나노입자 (및 이에 제한되지는 않음)일 수 있으며, 그에 의해 플라크의 검출을 위한 MRI의 민감도를 증가시킨다;
· 조영-증강 초음파검사법 (Contrast-Enhanced Ultrasonography) (CEUS) 또는 초음파, 여기서, 검출제는 적어도 1종의 음향학적으로 활성이고 기체-충전된 미세버블이다. 초음파는 인간 질환의 스크리닝 및 조기 검출을 위한 널리 퍼진 기술이다. 이는 MRI 또는 섬광조영술보다 덜 비싸고, 그것이 방사선을 포함하지 않기 때문에 분자 영상화 방식, 예컨대 방사성핵종 영상화보다 더 안전하다.
본 발명은 또한 혈액-뇌 장벽을 가로질러 관심의 분자를 수송하는 방법을 제공한다. 방법은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 단편에 연결된 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 분자는 이전에 기재된 바와 같은 화물 분자를 비롯한 임의의 바람직한 분자일 수 있으며; 분자는 융합 단백질에서의 접합 또는 발현을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 방법을 사용하여 항체 또는 그의 단편에 "연결될" 수 있다. 투여는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 정맥내 (iv), 피하 (sc), 및 근육내 (im) 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는 비경구 투여에 의할 수 있다. 이 방법에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 관심의 분자를 BBB를 가로질러 그의 뇌 표적에 '운송한다'.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 1종 또는 1종 초과의 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편을 포함하는 조성물을 포괄한다. 조성물은 상기 기재된 바와 같은 단일 항체 또는 단편을 포함할 수 있거나, 항체 또는 단편의 혼합물일 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체 또는 단편의 혼합물을 포함하는 조성물에서, 항체는 동일한 특이성을 가질 수 있거나, 그들의 특이성에 있어서 상이할 수 있다.
조성물은 또한 제약학적으로 허용되는 희석제, 부형제, 또는 담체를 포함할 수 있다. 희석제, 부형제, 또는 담체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 희석제, 부형제, 또는 담체일 수 있으며, 조성물 중의 다른 성분과, 조성물의 전달의 방법과 혼화성이어야 하고, 조성물의 수용자에게 유해하지 않다. 조성물은 임의의 적합한 형태일 수 있으며; 예를 들어, 조성물은 현탁액 형태, 분말 형태 (예를 들어, 동결건조된 또는 캡슐화된 (그러나 이에 제한됨)), 캡슐 또는 정제 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 및 제한적이기를 원하지는 않지만, 조성물이 현탁액 형태로 제공되는 경우, 담체는 물, 염수, 적합한 완충제, 또는 용해도 및/또는 안정성을 개선시키는 첨가제를 포함할 수 있으며; 현탁액을 제조하기 위한 재구성은 완충제에서 적합한 pH에서 항체 또는 그의 단편의 생육가능성을 보장하기 위해 시행된다. 건조 분말은 또한 안정성을 개선시키는 첨가제 및/또는 벌크/부피를 증가시키는 담체를 포함할 수 있으며; 예를 들어, 및 제한적이기를 원하지는 않지만, 건조 분말 조성물은 수크로스 또는 트레할로스를 포함할 수 있다. 구체적인, 비-제한적 예에서, 조성물은 항체 또는 그의 단편을 대상체의 위장관에 전달하도록 제제화될 수 있다. 따라서, 조성물은 항체 또는 그의 단편의 전달을 위한 캡슐화, 시간-방출, 또는 다른 적합한 기술을 포함할 수 있다. 본 화합물을 포함하는 적합한 조성물을 제조하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 수행능력 내에 있을 것이다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단지 예시적 목적을 위한 것이며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로도 제한하는 데 사용되지 않아야 한다.
실시예 1: FC5의 인간화
인간에서의 잠재적 면역원성을 회피하기 위해, 라마-유래된 FC5 (서열식별번호: 1)를 VHH에서의 "낙타류" 잔기의 돌연변이에 의해 인간화하였다. 인간화의 목적을 위해, 카바트 넘버링 (Kabat et al., 1991)을 CDR 잔기의 확인을 위해 사용하였음을 유념해야 한다.
낙타류 V H H의 3D-구조 모델링. FC5 VHH와 유사한 주형 구조를 단백질 데이터 뱅크 (PDB)에 대한 BLAST 검색을 사용하여 확인하였다. FC5 VHH의 3D 구조를 주형으로서 2X1O|A (PDB 코드 | 쇄 ID) 구조에 기초한 상동성 모델링을 사용하여 대략화하였다. 그 후, FC5 VHH 구조를 FC5 서열에 대한 주형 구조를 돌연변이시킴으로써 수립하였으며; 이는 다양한 위치에서 32개의 돌연변이 (CDR에서 26개 및 프레임워크 영역에서 6개)를 포함하였다. 그 후, FC5 VHH 모델을 AMBER 역장을 갖는 에너지 최소화 및 제약(constraints)의 단계식 해제에 의해 정밀화하였으며, 이는 최초로 완화된 CDR 루프로부터, 단지 최후 단계에서 완전히 완화된 프레임워크 영역의 골격 중원소까지의 범위이다. 그 후, VHH 모델의 CDR-H3 루프를 몬테-카를로-최소화 (Monte-Carlo-minimization) (MCM) 형태적 샘플링에 의해 정밀화하였으며, 여기서, CDR-H3 영역에서의 2면각을 샘플링한 후, 에너지 최소화하였다.
낙타류 CDR에 대한 인간 중쇄 프레임워크의 선별. 인간 중쇄 프레임워크를 표준 서열 상동성 비교에 의해 인간 생식계열 데이터베이스 (VBASE)에 대해, 다른 서열 데이터베이스 (진뱅크 (Genbank) 및 스위스프로트 (SwissProt))에 대해, 및 인간 프레임워크 컨센서스 서열에 대해 선별하였다. BLAST 검색을 수행하여 CDR의 길이를 매칭시키면서 단지 프레임워크 영역에서 (즉, CDR을 제외함) 최고 상동성을 갖는 서열 매치를 검색하였다. FC5 VHH에 대해 확인된 가장 가까운 인간 프레임워크는 인간 VH-3 하위군에 상응하였다. FC5 VHH와 가장 유사한 몇몇 인간 생식계열 VH-3 프레임워크 서열은 또한 인간 VH-3 컨센서스 서열에 추가로 보유되었다. FC5 VHH 프레임워크 서열은 100％ 프레임워크 인간화를 위한 컨센서스 인간 VH-3 서열에 도달하기 위해 16개의 돌연변이를 요구하였다.
복귀-돌연변이를 위한 프레임워크 잔기의 확인. FC5 VHH 모델 및 그의 완전-인간화 대응물을 특징화하여 인간성 지수, 항원 접촉 경향성 지수를 추정하고, CDR, 정준 잔기, 비통상적 프레임워크 잔기, 잠재적 글리코실화 부위, 매몰된 잔기, 버니어 (Vernier) 구역 잔기, 및 CDR에 대한 근접성을 기술하였다. 이들 데이터의 분석은 항-IGF1R VHH에 대한 몇몇 인간화 변이체의 설계를 시사하였으며, 각각의 변이체는 다양한 위치에서 모 낙타류 잔기에 대한 다양한 수의 복귀-돌연변이를 갖는다. 총 7개의 인간화 변이체를 FC5 VHH에 대해 설계하였으며 (FC5-H1, FC5-H2, FC5-H3, FC5-H4, FC5-H5, FC5-H6, FC5-H7), 여기서, 변이체는 7개 이하의 복귀-돌연변이를 함유하였다 (도 1). 이들 낙타류 복귀-돌연변이 잔기의 일부는 VHH 도메인 코어 내부에 매몰되었으며, 따라서, B-세포 매개된 면역 반응을 유도할 것으로 예상되지 않았다.
실시예 2: FC5 및 그의 인간화 변이체의 클로닝, 발현 및 정제
실시예 1에 기재된 바와 같은 FC5 단일 도메인 항체 (sdAb) 또는 그의 인간화 변이체 (FC5-H1, FC5-H2, FC5-H3, FC5-H4, FC5-H5, FC5-H6, FC5-H7)를 시험관내 시험을 위한 제조에서 클로닝하고, 형질전환시키고, 발현시키고, 정제하였다. 모든 변이체를 His5 및 c-myc 태그와의 융합물에서 발현시켜, 각각 하이트랩 킬레이팅 (HiTrap Chelating)™ 칼럼을 사용한 고정화 금속 친화도 크로마토그래피에 의한 정제 및 면역화학에 의한 검출을 허용하였다.
간략하게, sdAb FC5 (서열식별번호: 1) 또는 인간화 변이체를 코딩하는 DNA를 플라스미드 pSJF2H의 BbsI/BamHI 부위 내로 클로닝하여 FC5용 발현 벡터를 생성하였다 (Muruganandam et al., 2001). DNA 구축물을 프라이머 fdTGIII, 5'-GTGAAAAAATTATTATTATTCGCAATTCCT-3' (서열식별번호: 10) 및 96GIII, 5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3' (서열식별번호: 11)를 사용하여 373A DNA 시??서 스트레치 (Sequencer Stretch) (PE 어플라이드 바이오시스템즈 (PE Applied Biosystems)) 상에서 뉴클레오티드 시퀀싱에 의해 확인하였다.
구축물을 이. 콜라이 (E. coli) 균주 TG1 내로 형질전환시키고, 단일 콜로니를 사용하여 100 μg/ml의 암피실린을 함유하는 100 ml의 M9 배지를 접종하고, 배양물을 200 rpm에서 37℃에서 밤새 진탕하였다. 성장된 세포 (25 ml)를 5 μg/ml의 비타민 B1, 0.4％ 카스아미노산, 및 100 μg/ml의 암피실린으로 보충된 1 L의 M9 배지 (0.2％ 글루코스, 0.6％ Na2HPO4, 0.3％ KH2PO4, 0.1％ NH4Cl, 0.05％ NaCl, 1 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2) 내로 옮겼다. 세포 배양물을 실온에서 24시간 동안 200 rpm에서 진탕하고, 이어서 12％ 트립톤 (Tryptone), 24％ 효모 추출물, 및 4％ 글리세롤을 함유하는 100 ml의 10X 유도 배지 테리픽 브로쓰 (Terrific Broth)로 보충하였다. 단백질 발현을 이소프로필-μ-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG; 1 mM)를 첨가함으로써 유도하였다. 유도 후, 배양물을 25℃에서 추가의 72시간 동안 진탕하고, 주변세포질 분획을 삼투적 충격 방법에 의해 추출하였다.
FC5 및 그의 인간화 변이체를 하이트랩 킬레이팅™ 칼럼 (아머샴 파마시아 바이오테크 (Amersham Pharmacia Biotech); 미국 뉴저지주 피스캐터웨이)을 사용한 고정화 금속-친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 결합된 FC5 또는 변이체를 10 mM HEPES 완충제, 500 mM NaCl, pH 7.0에, 10 내지 500 mM 이미다졸 구배로 용리하고, 피크 분획을 10 mM HEPES 완충제, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, pH 7.4에 대해 대규모로 투석하였다. 단백질 농도를 또한 측정하였다.
실시예 3: 인간화 FC5 변이체의 생물물리학적 특징화
실시예 2에서 제조된 FC5 VHH 및 인간화 변이체를 용융 온도 분석을 사용하여 특징화하였다.
용융 온도: FC5 VHH 및 인간화 변이체의 열 안정성을 용융 온도 (Tm) 측정을 사용하여 CD 분광법에 의해 평가하였다. 펠티어 (Peltier) 열전기 유형 온도 제어 시스템 (자스코 (Jasco), 미국 메릴랜드주 이스턴)을 구비한 자스코 J-815 분광편광계를 사용하여 실험을 수행하였다. 1 mm의 통로 길이를 갖는 CD 큐벳을 사용하였다. 스펙트럼을 180 내지 260 nm의 파장 범위에 걸쳐, 50 nm/분의 스캐닝 속도, 4초의 디지털 통합 시간 (DIT), 1 nm의 밴드폭, 1 nm의 데이터 피치, 및 1초의 통합 시간으로 기록하였다. 용융 온도 또는 Tm을 측정하기 위해 (Greenfield, 2006), CD 스펙트럼을 30℃ 내지 96℃의 온도 범위에 걸쳐 기록하였다. 모든 CD 스펙트럼을 완충제 스펙트럼에 상응하는 블랭크로부터 빼었다. 측정을 100 mM 인산나트륨 완충제, pH 7.4 중 50 μg/mL VHH로 수행하였다. 열-유도된 단백질 변성을 210 nm에서 모든 변이체에 대해 모니터링하였다. 폴딩 분율 (ff)을 기재된 바와 같은 식에 의해 얻었다 (Greenfield, 2006a; 2006b):
ff = ([θ]T - [θ]U)/([θ]F - [θ]U) 식 I
상기 식에서, [θ]T는 임의의 온도에서의 몰 타원율이고, [θ]F는 30℃에서 완전히 폴딩된 단백질의 몰 타원율이고, [θ]U는 90℃에서 언폴딩된 단백질의 몰 타원율이다. 용융 온도 (Tm)를 그래핑 소프트웨어 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism) (윈도우용 버전 4.02)을 사용하여 비선형 회귀 곡선 핏 (볼츠만 시그모이달 방정식)에 의해 언폴딩 곡선의 중간점 (폴딩 분율, ff, 온도 대비)으로서 얻었다. VHH의 용융 온도 (Tm)를 2-상태 시스템을 가정한 타원율 데이터에 기초하여 측정하였으며, 이는 변성으로의 샤프한 전이에 상응하는 관찰된 변성 곡선과 일치한다. Tm 값을 온도 대비 폴딩 분율 (ff)의 시그모이달 변성 곡선의 중간점에서 취하였다.
결과를 도 2에 나타낸다. 인간화 변이체 FC5-H1, FC5-H3, FC5-H4, FC5-H5, FC5-H6, 및 FC5-H7은 모 낙타류 FC5 (<65℃)에 비해 개선된 Tm 값 (>65℃) - 그것이 변이체의 설계에서 표적화된 목표가 아니었기 때문에 놀라운 결과 - 을 나타내었다. 인간화 변이체 중에서, FC5-H7은 가장 양호한 재-폴딩 능력을 나타낸 반면, FC5-H3은 FC5에 비해 Tm의 11℃ 증가를 나타내었다.
실시예 4: 뇌 내피 세포에의 FC5 돌연변이적 변이체의 결합
그들의 세포 항원에의 항체의 결합에 대한 인간화의 효과를 평가하기 위해, SV-ARBEC 세포 또는 인간 미세혈관 뇌 내피 세포 (HBEC-D3)에의 FC5 및 그의 인간화 변이체의 결합을 측정하였다.
미러볼 ® 고민감도 마이크로플레이트 세포측정법 (TTP 랩테크 (TTP Labtech)): 모든 완충제 및 시약을 4℃로 예비-냉각시켰다. 각각의 VHH 단일 도메인 항체를 1000 nM의 출발 농도로 0.5 x PBS/2.5 mM EDTA 및 미러볼 검정 완충제 - 라이브 세포 영상화 용액 (Live Cell Imaging Solution), LCIB (인비트로젠 (Invitrogen), 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 1.0 mM MgCl2, 20 mM Hepes, pH 7.4, mOsm = 300)의 1:1 완충제 믹스에서 희석하였다. LCIB 및 0.5 x PBS/2.5 mM EDTA의 1:1 믹스의 20 μl 부피를 각각의 384 웰 미러볼 검정 플레이트 (코닝 (Corning) 3712)의 모든 웰에; 40 μl의 1000 nM 시험 VHH 항체를 받은 행 A를 제외하고 첨가하였다. 계열 희석액을 미러볼 384 웰 검정 플레이트 내의 각각의 시험 변이체에 대해 제조하였다. 16-채널 핀 (Finn) 피펫 (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific))을 사용하여 20 μl의 VHH 항체를 행 A-열 1 내지 24로부터 행 B-열 1 내지 24 내로 8 x 혼합하면서 옮긴 후, 20 μl의 VHH 항체를 행 B-열 1 내지 24로부터 행 C-열 1 내지 24 내로 8 x 혼합하면서 옮겼다. 희석을 행 G-열 1 내지 24까지 반복하여 각각의 VHH 항체 변이체에 대한 7 점 곡선을 생성하였다. 제2 세트의 시험 VHH 항체 변이체 (1000 nM)를 행 I-열 1 내지 24에 첨가하고, 희석 프로토콜을 행 O-열 1 내지 24까지 반복하였다. 행 H-열 1 내지 24를 참조 FC5-H7 VHH 단일 도메인 항체에 대해 각각의 플레이트 상에 남겨 두었다. 행 P-열 1 내지 24는 항체를 받지 않았고; 이는 관심의 세포에 대한 부차물 비-특이적 결합에 대한 배경 대조군이었으며; 따라서, 48개의 변이체를 각각의 384 웰 미러볼 검정 플레이트 상에서 시험할 수 있었다. 불멸화 성체 래트 뇌 미세혈관 내피 세포 (SV-ARBEC) 및/또는 인간 미세혈관 뇌 내피 세포 (HBEC-D3)를 아쿠타제 (Accutase) 용액 (시그마 알드리치 (Sigma Aldrich))에서 해리시켜 단일 세포 집단을 생성하였다. 세포를 LCIB에서 세척한 후, 200 x g에서, 5분 원심분리하여 펠릿화하였다. 세척 완충제를 제거하고, 세포 펠릿을 1 mL의 LCIB 내로 재-현탁시켰다. 세포 수를 트리판 블루 (Trypan Blue) 염료를 갖는 바이오-래드 (Bio-Rad) TC20 자동화 세포 카운터를 사용하여 계산하여 생존율을 평가하였다. 세포를 LCIB를 사용하여 350,000 라이브 세포/ml로 희석하였다. Draq 5 핵 염색 (2 uM, 셀 시그널링)으로 보충된 형광 접합체 c-myc 알렉사 488 검출 항체 (1600 ng/ml, 산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 LCIB 검정 완충제에서 제조하였다. 세포 및 검출 부차물/Draq 5 용액을 1:1 혼합하고, 3500 세포를 함유하는 20 μl의 용액을 미러볼 384 웰 검정 플레이트의 각각의 웰 내로 첨가하였으며; 이는 이미 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63 및 7.81 nM의 최종 농도를 초래하는 7 점 희석 계열에서의 각각의 VHH 항체 변이체를 함유하였다. 모든 플레이트를 4℃에서 2시간 및 20시간 동안 인큐베이션하였다. 판독을 각각의 시점에서 하기 설정을 갖는 미러볼 고민감도 마이크로플레이트 세포측정법을 사용하여 취하였다:
레이저 설정: 488 및 640 가능화됨, 6.0mW;
채널 설정: FL-2 (488 내지 540 nm) 전압 600, 민감도 4, Tiff 파일 저장됨 및 FL-4 (650 내지 690 nm) 전압 600, 민감도 4, 트리거 4, Tiff 파일 저장됨;
객체 특징: FL-2 (피크 강도, 평균 강도, 총 강도, 및 기준선) 및 FL-4 (피크 강도, 평균 강도, 총 강도 및 기준선);
집단 정의: 객체 - 셀 필터 (FL-4 둘레 범위 0 내지 500 nm 및 FL-2 평균 강도 범위 0 내지 15000);
집단 통계학: 객체: 객체의 수, 객체: 평균 (FL-2 피크, 평균, 총 강도 및 둘레) 및 객체: 평균 FL-2 기준선. 객체: 중위 (FL-2 피크, 평균, 및 총 강도) 객체: 평균 (FL-4 피크, 평균, 총 강도 및 둘레) 및 객체: 평균 FL-4 기준선. 객체: 중위 (FL-4 피크, 평균, 및 총 강도) 셀: 객체의 수, 셀: 평균 (FL-2 피크, 평균, 및 총 강도) 및 셀: 평균 FL-2 기준선. 셀: 중위 (FL-2 피크, 평균, 및 총 강도) 셀: 평균 (FL-4 피크, 평균, 및 총 강도) 및 셀: 평균 FL-4 기준선. 셀: 중위 (FL-4 피크, 평균, 및 총 강도).
잔류하는 라이브 세포 물질을 검정 플레이트에 인접하여 4℃에서 인큐베이션하여 2시간 및 20시간 시점에서의 세포 생존율을 모니터링하였다. 미러볼 검정 절차를 FC5 및 모든 인간화 변이체에 대해 관심의 SV-ARBEC 및 HBEC-D3 세포주 둘 다에서 반복하였다. 데이터를 셀리스타 (Cellista) 소프트웨어 (TTP 랩테크) 및 그래프패드 프리즘 6 소프트웨어 프로그램으로 분석하였다.
SV-ARBEC 세포에의 및 HBEC-D3 세포에의 FC5 및 인간화 변이체 결합의 결과를 도 3에 나타낸다 (일부 결과는 도시하지 않음). 이 검정에서 SV-ARBEC 세포에의 또는 HBEC-D3 세포에의 FC5의 매우 약한 결합에 비해, 인간화 FC5 변이체 FC5-H1, FC5-H3, FC5-H4, FC5-H5, FC5-H6 및 FC5-H7은 모두 SV-ARBEC 세포에의 개선된 결합을 나타내며; 인간화 변이체 FC5-H3, FC5-H2 및 FC5-H7은 또한 HBEC-D3에의 개선된 결합을 나타낸다. 주목할 만 하게는, FC5-H7은 SV-ARBEC 세포에의 및 또한 HBEC-D3 세포에의 매우 개선된 결합을 나타내며, 이는 이들 세포 상의 그의 수용체(들)에 대한 이 변이체의 유의하게 개선된 친화도를 지시한다.
실시예 5: 시험관내 혈액 뇌 장벽 모델을 가로지르는 FC5 및 FC5 인간화 변이체의 수송
실시예 2의 인간화 FC5 변이체가 혈액-뇌 장벽을 통과이동하는지 여부를 평가하기 위해, 시험관내 검정을 하기 기재된 바와 같이 사용하였다.
SV40-불멸화 성체 래트 뇌 내피 세포 (SV-ARBEC)를 사용하여 기재된 바와 같이 시험관내 혈액-뇌 장벽 (BBB) 모델을 생성하였다 (Garberg et al., 2005; Haqqani et al., 2012). SV-ARBEC (80,000 세포/막)를 1 ml의 성장 배지 중 0.1 mg/mL 래트 꼬리 콜라겐 유형 I-코팅된 조직 배양 삽입체 (기공 크기 1 μm; 표면적 0.9 cm2, 팔콘 (Falcon)) 상에 시딩하였다. 삽입체 어셈블리의 하부 챔버는 불멸화 신생아 래트 별아교세포-조건화 배지로 1:1 (v/v) 비로 보충된 2 ml의 성장 배지를 함유하였다.
등몰량 (5.6 μM)의 양성 (FC5) 또는 음성 대조군 (A20.1, 클로스트리디움 디피실레 독소 A 결합 VHH;), 및 실시예 2의 인간화 변이체를 이 래트 시험관내 BBB 모델을 횡단하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. BBB의 내강 측에의 등몰량의 sdAb의 노출 후, 샘플을 비내강 측으로부터 15, 30 및 60분 후에 취하였다. 그 후, 각각의 샘플의 sdAb 함량을 질량 분광법에 의해 정량화하였다 (다중 반응 모니터링 - 동위원소 표지된 내부 표준물; MRM - ILIS), 하기 참조.
MRM-ILIS: 방법은 모두 문헌 [Haqqani et al. (2012)]에 기재된 바와 같다. 간략하게, VHH에 대한 SRM (다중 반응 모니터링, MRM으로도 공지된 선택된 반응 모니터링) 검정을 개발하기 위해, 각각의 VHH를 먼저 나노LC-MS/MS에 의해 데이터-의존적 취득을 사용하여 분석하여 모든 이온화가능한 펩티드를 확인하였다. 각각의 펩티드에 대해, 3 내지 5개의 가장 강한 단편 이온을 선택하였다. 초기 SRM 검정을 개발하여 이들 단편을 아토몰량의 소화물 (약 100 내지 300 amol)에서 모니터링하였다. 낮은 양에서 재현가능한 강도 비를 나타낸 (즉, 보다 높은 양에 비해 피어슨 (Pearson) r2 ≥ 0.95를 가진) 단편을 안정한 것으로 간주하고, 최종 SRM 검정을 위해 선택하였다. 검정을 추가로 최적화하기 위해, 각각의 펩티드에 대한 용리 시간이 또한 가까운 m/z (질량-대-전하 비) 및 용리 시간을 갖는 펩티드를 선택하지 않도록 주의하면서 포함되었다.
세포 배지 중의 VHH의 전형적인 다중화 SRM 분석은 공지된 양의 ILIS (0.1 내지 10 nM)를 스파이킹한 후, 100 내지 400 ng의 배양된 배지 단백질 (0.3 내지 1 μL)을 나노LC-MS 시스템 내로 주사하는 것을 포함하였다. 각각의 표적 펩티드 이온의 전구체 m/z를 표적에 대한 특정화된 용리 시간에서 이온 트랩에서 선택한 (및 잔류하는 비관련된 이온을 버린) 후, 충돌 유도 해리 (CID) 단편화, 및 검출기에 의한 모니터링을 위한 이온 트랩에서의 단지 바람직한 단편 이온의 선별을 하였다. 정량화 분석을 위해, LTQ (써모피셔 (ThermoFisher))에 의해 생성된 원 파일을 표준 질량 분광법 데이터 포맷 mzXML로 전환시키고, 강도를 MatchRx 소프트웨어의 변형된 버전인 Q-MRM (정량적-MRM; 문헌 [Haqqani et al. 2012] 참조)으로 지칭되는 인-하우스 소프트웨어를 사용하여 추출하였다. 각각의 VHH에 대해, 추출된-이온 크로마토그램을 전체 용리 시간에 걸쳐 0.25 Da의 단편 m/z 내의 조합된 강도로 이루어진 그의 단편 이온의 각각에 대해 생성하였다. 각각의 단편에 대한 최종 강도 값을 얻기 위해, 예상된 체류 시간의 0.5분 내의 모든 강도를 합계하였다. VHH는 그의 펩티드 중 적어도 1종의 단편이 예상된 강도 비를 나타낸 경우, 즉, 최종 강도 값이 그의 상응하는 순수한 VHH의 최종 강도 값에 비해 강한 피어슨 상관 r2 ≥ 0.95 및 p < 0.05를 나타낸 경우, 샘플에서 검출가능한 것으로 정의되었다.
VHH의 혼합물을 함유하는 배지 샘플을 이전에 기재된 바와 같이 환원시키고, 알킬화시키고, 트립신-소화시켰다 (Haqqani et al., 2012; Gergov et al., 2003). 소화물 (트립틱 펩티드)을 아세트산 (5％ 최종 농도)으로 산성화시키고, LTQ XL ETD 또는 LTQ 오비트랩 (Orbitrap) ETD 질량 분광계 (써모피셔, 미국 매사추세츠주 월텀)에 커플링된 역상 나노애퀴티 (nanoAcquity) UPLC (와터스 (Waters), 미국 매사추세츠주 밀포드) 상에서 분석하였다. 샘플의 바람직한 분취액을 주사하고, 300 μm I.D. x 0.5 mm 3 μm 펩맵스 (PepMaps) C18 트랩 (써모피셔) 상으로 로딩한 후, 0％ 내지 20％ 아세토니트릴 (0.1％ 포르믹 중), 1분, 20％ 내지 46％, 16분, 및 46％ 내지 95％, 1분의 구배를 사용하여 400 nL/분의 유속에서 100 μm I.D. x 10 cm 1.7 μm BEH130C18 나노LC 칼럼 (와터스) 상으로 용리하였다. 용리된 펩티드를 MS/MS를 위한 전기분사 이온화 (ESI) 및 펩티드 이온의 단편화를 위한 CID를 사용한 SRM 분석에 의해 질량 분광계 내로 이온화하였다. CID를 충돌 기체로서 헬륨으로 35％의 정규화된 충돌 에너지 및 30 ms의 활성화 시간에서 수행하였다. 선형 이온 트랩 내로의 이온 주사 시간은 기기에 의해 6 x 103의 자동 획득 대조군 (AGC) 표적 값 및 200 ms의 최대 축적 시간을 사용하여 조정하였다.
다중화 검정에서 FC5 및 그의 인간화 변이체, 및 대조군 VHH A20.1의 검출 및 정량화에 사용된 특이적 펩티드를 표 1에 나타낸다.
<표 1>
FC5, FC5-ILIS, A20.1 및 FC5 인간화 변이체의 나노LC-SRM 검출에 사용된 펩티드. 기재된 다양한 연구에서, 검정을 동일한 샘플에서의 동시 모니터링을 위해 상이한 조합으로 다중화하였다; (a) 중-표지된 펩티드; 각각의 펩티드에 대한 SRM 검정의 검출 및 정량화의 한계는 1.5 내지 2.5 ng/ml의 범위였다. 1 ng/mL는 약 60 내지 70 pM의 VHH에 상응한다. A20.1은 문헌 [Hussack et al., 2011b]에 기재된 바와 같음.
Figure 112019010749410-pct00001
겉보기 투과 계수의 측정: 정량화된 값을 직접적으로 플롯팅할 수 있거나, Papp (겉보기 투과 계수) 값을 도 4a에 주어진 식 [Qr/dt = 시간 대비 리시버 구획에서의 누적량; A = 세포 단층의 면적; C0 = 투약 용액의 초기 농도]을 사용하여 측정하고, 플롯팅할 수 있다. Papp 값은 통상적으로 BBB를 횡단하는 분자의 능력을 측정하는 데 사용된다. Papp 값은 뇌 내피 단층을 가로지르는 화합물의 비투과율의 척도이다.
결과를 도 4b 및 c에 나타낸다. 주어진 결과는 몇몇 독립적 실험으로부터 얻어진 평균 Papp 값이다. 음성 대조군 A20.1 항체는 매우 낮은 Papp 값을 가지며, 이는 BBB 모델을 가로지르는 이 VHH의 비-특이적 수송 또는 세포주위 수송이 최소임을 지시한다. FC5 VHH는 약 100x10-6 cm/분의 Papp 값을 나타내는 반면, 그의 인간화 변이체 FC5-H3의 Papp 값은 45％ 더 높고, 인간화 변이체 FC5-H5의 Papp 값은 28％ 더 높다.
각각의 인간화 변이체의 특징의 요약을 표 2에 나타낸다. 변이체 FC5-H1, FC5-H3, FC5-H4, FC5-H5, FC5-H6 및 FC5-H7은 낙타류 FC5에 비해 더 높은 용융 온도를 나타낸다. 변이체 FC5-H1, FC5-H3 및 FC5-H7은 낙타류 FC5에 비해 래트 및 인간 뇌 내피 세포 둘 다에의 개선된 결합을 나타낸다. 변이체 FC5-H3 및 FC5-H5는 낙타류 FC5에 비해 유의하게 개선된 시험관내 혈액-뇌 장벽 횡단을 나타낸다.
<표 2>
모 낙타류 FC5 항체에 비한 인간화 FC5 변이체의 용융 온도 (Tm), 세포 결합 (SV-ARBEC 및 HBEC-D3), 및 시험관내 BBB 투과율 (PAPP) 값의 요약. SV-ARBEC 및 HBEC-D3 결합은 1.3 μM의 항체 농도에서 MMFI 단위로 표현된다. n.d. - 측정되지 않음
Figure 112019010749410-pct00002
실시예 6: 인간화 FC5-Fc 구축물의 발현 및 정제
IgG1의 인간 항체 Fc 단편의 N-말단에 융합된 FC5 또는 FC5-H7을 포함하는 구축물을 제조하고, 발현시키고, 정제하였다.
FC5 또는 FC5-H7 cDNA를 인간 Fc 단편을 함유하는 포유동물 발현 벡터 pTT5 (Durocher 2002) 내로 클로닝하였다. 생성된 벡터의 폴리플렉스를 187.5 μg pTT5-IR5mFc2b, 56.25 μg pTT-AKTdd (단백질 키나제 B의 활성화된 돌연변이체), 18.75 μg pTTo-GFP (형질감염 효율을 모니터링하기 위해), 및 112.5 μg의 연어 고환 DNA (시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich))를 함유하는 25 ml의 플라스미드 DNA 용액; 및 1.125 mg의 PEI프로TM (폴리플러스 트랜스펙션 (PolyPlus Transfection))을 함유하는 25 ml의 PEI 용액 (둘 다 F17 배지에서 제조됨)을 혼합함으로써 예비-형성하였다. 혼합물을 10분 동안 인큐베이션한 후, 세포 배양물에 첨가하였다. 말단절단된 EBNA1 단백질 (CHO-3E7)을 안정하게 발현하고, F17 배지 (인비트로젠)에서 성장된 CHO 세포의 450 ml 배양물을 50 ml의 폴리플렉스로 형질감염시켰다. 형질감염후 24시간에, 배양물을 12.5 ml의 40％ (w/v) 트립톤 N1 (오르가노테크니 (Organotechnie)) 용액 및 1.25 ml의 200 mM 발프로산 용액으로 공급하였다. 배양물을 형질감염후 8일에 수확하고, 원심분리에 의해 정화시켰다. 정화된 배지를 0.22 μm 막을 통해 여과한 후, 5 ml의 단백질-A 맙셀렉트 (MabSelect) SuRe 수지 (GE 헬스케어 (GE Healthcare))로 패킹된 칼럼 상에 이를 적용하였다. 로딩 후, 칼럼을 5 부피의 포스페이트-완충 염수 pH 7.1 (PBS)로 세척하고, 항체를 100 mM 시트르산나트륨 완충제 pH 3.0으로 용리하였다. 용리된 항체를 함유하는 분획을 풀링하고, 완충제 교환을 PBS에서 평형화된 탈염 에코노-팩 (Econo-Pac) 칼럼 (바이오래드) 상에 로딩함으로써 수행하였다. 그 후, 탈염된 항체를 밀렉스 (Millex) GP (밀리포어 (Millipore)) 필터 단위 (0.22 μm)를 통해 통과시킴으로써 멸균-여과하고, 분취하였다.
실시예 7: 인간화 FC5-Fc 구축물의 특징화
SV-ARBEC 세포에의 Fc-융합된 FC5 및 FC5-H7 (실시예 6)의 결합을 실시예 4에 기재된 바와 같이 미러볼 ® 고민감도 마이크로플레이트 세포측정법 (TTP 랩테크)을 사용하여 평가하였다. 결과는 FC5-H7-Fc가 FC5-Fc에 비해 SV-ARBEC에의 약간 개선된 결합을 가짐을 지시한다 (도 5a).
실시예 6으로부터의 Fc-융합된 FC5-H7이 혈액-뇌 장벽을 통과이동하는지 여부를 평가하기 위해, 실시예 5에 기재된 바와 같은 시험관내 검정 및 정량화 방법을 사용하였다. 결과는 FC5-Fc에 비해 FC5-H7-Fc 융합물에 대한 유사한 Papp를 지시하며 (도 5b), 이는 FC5에 비해 FC5H7의 증가된 친화도가 2-가 형식에서 BBB를 가로질러 통과이동하는 그의 능력에 영향을 미치지 않았음을 시사한다.
본원에 기재된 실시양태 및 실시예는 예시적이며, 청구된 바와 같은 본 발명의 범위를 제한하는 것을 의미하지 않는다. 대안, 변형, 및 등가물을 비롯한 상기 실시양태의 변형은 본 발명자들에 의해 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다. 더욱이, 특색의 논의된 조합은 발명적 해법을 위해 필요하지 않을 수 있다.
서열의 목록
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참고문헌
본원에 및 본 출원 전반에 걸쳐 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 본원에 참조로 포함된다.
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Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Ser Thr Ser Thr Ala Thr Pro Leu Arg Val Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FC5-H6 <400> 7 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Ile Thr His Tyr 20 25 30 Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Arg Ile Thr Trp Gly Gly Asp Asn Thr Phe Tyr Ser Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Ser Thr Ser Thr Ala Thr Pro Leu Arg Val Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FC5-H7 <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 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Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 165 170 175 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 195 200 205 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr Gln 210 215 220 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 225 230

Claims (14)

  1. 하기 서열을 포함하는 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편이며,
    X1VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWX2RQAPGKX3X4EX5VSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTX6YLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호 (SEQ ID NO): 9), 여기서 X1=D 또는 E, X2=F 또는 V, X3=E 또는 G, X4=R 또는 L, X5=F 또는 W, X6=L 또는 V이고,
    여기서 서열은 서열식별번호: 2 내지 8 중 어느 하나로부터 선택되는 것인 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 다가 제시 형식인 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 Fc 단편에 연결된 것인 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  4. 제3항에 있어서, Fc 단편이 마우스 Fc2b 또는 인간 Fc1인 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  5. 제4항에 있어서, Fc가 서열식별번호: 20의 서열을 포함하는 것인 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편이 혈액-뇌 장벽을 통과이동하는 것인 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  7. 제1항 또는 제2항의 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 분자.
  8. 제7항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 표면 상으로 고정화된 것인 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 화물 분자에 연결된 것인 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  11. 제10항에 있어서, 화물 분자가 1 kDa 내지 200 kDa의 범위의 분자량을 갖는 것인 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  12. 제10항에 있어서, 화물 분자가 검출제, 치료제, 약물, 펩티드, 성장 인자, 시토카인, 수용체 트랩, 화학 화합물, 탄수화물 모이어티, 효소, 항체 또는 그의 단편, DNA-기재 분자, 바이러스 벡터, 또는 세포독성제; 검출제, 치료제, 약물, 펩티드, 효소, 항체 또는 그의 단편, DNA-기재 분자, 바이러스 벡터, 또는 세포독성제가 로딩된 1종 이상의 리포솜 또는 나노운반체; 또는 1종 이상의 나노입자, 나노와이어, 나노튜브, 또는 양자점인 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편.
  13. 1종 또는 1종 초과의 제1항 또는 제2항의 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편 및 제약학적으로-허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 조성물.
  14. 삭제
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