ES2305116T3 - Coactivacion de receptores nucleares. - Google Patents
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Abstract
Una proteína caracterizada porque la proteína se selecciona del grupo constituido por: a) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos como en las SEC ID 7, 8, 11 ó 12 o la secuencia de los aminoácidos número 1 a 234 de la SEC ID 7 u 8; y b) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una similitud de al menos el 90% con la secuencia de los aminoácidos 1 a 234 de la SEC ID 7 u 8, calculada usando la matriz de similitud blosum62 y el algoritmo de Needleman y Wunsch.
Description
Coactivación de receptores nucleares.
Esta invención se refiere a una nueva proteína,
a un ensayo para la unión entre un receptor nuclear sensible y un
coactivador y a un método de modulación de la actividad
transcripcional promovida por un receptor nuclear sensible.
Esta invención está en el campo del uso de
funciones de receptores nucleares en organismos. Los receptores
nucleares tienen un gran intervalo de funciones, pero su papel más
destacado consiste en permitir a las células responder a hormonas,
tales como estradiol, cortisol y progesterona. Mediante los
receptores nucleares, las hormonas influyen en la transcripción de
genes en las células, mediante la cual las células pueden modificar
su función. Además, se sabe que la activación de la transcripción
génica por receptores nucleares está facilitada o incluso permitida
por coactivadores. Se conocen varios de dichos coactivadores. Por
ejemplo, Nishikawa et al (Toxicol. Appl. Pharmacol. 154,
págs. 76-83, 1999) describen métodos de exploración
para químicos con actividades hormonales usando la interacción de
receptores hormonales nucleares con un coactivador. Su método se
basa en el descubrimiento de que la interacción entre el
coactivador y un receptor nuclear, que es sensible a ese
coactivador en particular, puede estabilizarse por un ligando que se
une al receptor nuclear. Dichos ensayos también son importantes
para desenmarañar la acción de hormonas y los mecanismos para el
control de la transcripción de genes en general. Con estas técnicas
pueden desarrollarse nuevas medicinas para influir específicamente
en los procesos fisiológicos relacionados con el funcionamiento de
receptores nucleares para fines terapéuticos, de diagnóstico,
cosméticos y anticonceptivos. Esta invención pone a disposición una
proteína que tiene la secuencia de aminoácidos que se proporciona
en las SEC ID 7, 8, 11 ó 12. Dicha proteína tiene el efecto de
coactivar un receptor nuclear sensible en su función promotora de la
transcripción de ADN. Con el descubrimiento de la función de dicha
proteína como coactivador, esta invención también proporciona un
nuevo método de modulación de la actividad transcripcional
promovida por un receptor nuclear sensible y un coactivador en un
sistema, que comprende la adición de un agente al sistema,
interfiriendo el agente con, o potenciando, la función del
coactivador de esta invención. Este método puede realizarse mediante
la introducción del gen para el coactivador en el sistema para
producir su expresión, así como mediante la identificación y
posterior uso de compuestos que pueden modificar el funcionamiento
del coactivador y/o del complejo
coactivador-receptor nuclear. Por lo tanto, el
término agente se refiere en la presente memoria, por ejemplo, a un
compuesto químico o a un vector, comprendiendo el vector el gen que
codifica la proteína de la invención. Dicha modulación puede usarse
para interferir con, o potenciar, los procesos de transcripción
nuclear con fines terapéuticos, anticonceptivos, de diagnóstico y
cosméticos, y puede usarse en ensayos para la cuantificación de la
modulación. Por lo tanto, el término sistema se refiere a un
entorno definido molecularmente y/o biológicamente y se refiere a
sistemas in vitro así como a sistemas in vivo en los
que puede introducirse el agente modulador. Los sistemas in
vitro son mezclas que permiten la transcripción o traducción de
ADN y/o ARN y los sistemas in vivo son células, que pueden
estar en un cultivo de células o de tejidos o en el interior de un
cuerpo humano o animal. Obviamente, la expresión modulación de la
actividad de un receptor nuclear puede referirse a un aumento o a
una disminución en la actividad transcripcional del receptor,
mientras que el término coactivación se refiere a la potenciación
de la actividad transcripcional del
receptor.
receptor.
Una secuencia, que supuestamente representa una
proteína de este tipo, se ha descrito previamente con el número de
gen KIAA0576 en una publicación por Nagase et al. (DNA
Research vol. 5, págs. 31-39, 1998) con referencia
al número de acceso AB011148 para las bases de datos
EMBL/GenBank/DDBJ, donde está ligada a la id de proteína BAA25502.
El gen KIAA0576 no se ha expresado más allá de la fase de ARN y no
se le ha supuesto ninguna otra función más específica que la
dirección de ácidos nucleicos en base a una homología muy débil
(<30% de nucleótidos idénticos) con una secuencia de ADN
conocida.
Puesto que es obvio que modificaciones
minoritarias en la secuencia de la proteína son igualmente útiles
para el uso descrito anteriormente, la invención también describe
una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al
menos una similitud del 90%, o preferiblemente de al menos el 95%,
más preferiblemente de al menos el 99% y, más preferiblemente, del
100% con la secuencia de las SEC ID 7, 8, 11 ó 12. El término
similitud se refiere a un grado de similitud entre proteína en
vista de diferencias en aminoácidos, pero cuyos aminoácidos
diferentes son funcionalmente similares en vista de un tamaño,
lipofilicidad, acidez, etc. casi iguales. Un porcentaje de
similitud se calcula mediante el alineamiento óptimo de las
secuencias usando una matriz de puntuación de similitud tal como la
matriz blosum62 descrita en Henikoff y Henikoff (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89; 10915-10919 (1991)). El cálculo del
porcentaje de similitud y el alineamiento óptimo de dos secuencias,
usando la matriz de similitud blosum62 y el algoritmo de Needleman y
Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)), puede
realizarse usando el programa GAP del Genetics Computer Group (GCG,
Madison, Wisconsin, Estados Unidos) usando los parámetros por
defecto del programa.
Un aspecto adicional de la invención es que la
función de coactivación descrita anteriormente también puede
obtenerse con una proteína que tiene la secuencia de los aminoácidos
número 1 a 234 en la SEC ID 7 u 8. Se sabe que las proteínas
truncadas pueden tener la misma o parcialmente la misma función que
la proteína de mayor tamaño. Se descubrió que también puede usarse
esta proteína truncada y, por lo tanto, este aspecto de la
invención también proporciona una proteína que tiene una secuencia
que tiene una similitud de al menos el 90%, preferiblemente de al
menos el 95%, más preferiblemente de al menos el 99% y, más
preferiblemente, del 100% con la secuencia de los aminoácidos
número 1 a 234 en la SEC ID 7 u 8.
Además, la invención describe una proteína que
es una variante de origen natural de una proteína que tiene la
secuencia como en las SEC ID 7, 8, 11 ó 12. Proteínas, que tienen
una similitud de al menos el 80%, preferiblemente de al menos el
90%, más preferiblemente de al menos el 95%, aún más preferiblemente
de al menos el 99% y, más preferiblemente, una similitud del 100%
con la proteína definida en las SEC ID 7, 8, 11 ó 12 y que procede
de tejidos humanos o de tejidos de especies no humanas, pueden
usarse igualmente para la coactivación de un receptor nuclear
sensible. Una proteína de origen natural, que pertenece a la clase
definida por cosas en común en la estructura y función indicadas de
la proteína que se define por las SEC ID 7, 8, 11 ó 12, se
denominará mediante la secuencia de letras arbitraria de proteínas
COASTER. En documentos anteriores, al menos en documentos que han
circulado por nuestro organismo de investigación, la secuencia de
letras arbitraria MFC se ha usado para proporcionar un nombre para
las proteínas de acuerdo con esta invención. Por lo tanto, MFC y
COASTER son sinónimos. Otros fragmentos COASTER también aparecen en
tejidos biológicos. Dichos fragmentos están codificados por
variantes de corte y
empalme.
empalme.
Además, habiendo descrito la estructura de la
proteína y la función de una proteína COASTER, la invención también
describe una proteína que es un equivalente funcional homólogo de la
proteína como se ha definido anteriormente. Un equivalente
funcional homólogo es una proteína que no cumple completamente las
características definidas anteriormente porque tiene una similitud
inferior a uno de los porcentajes indicados anteriormente, o porque
no es el fragmento que se ha definido anteriormente, o porque no es
de origen natural, pero que todavía tiene una función
característica en común con las proteínas de la invención definidas
anteriormente. Por ejemplo, un fragmento de una proteína COASTER no
sólo puede usarse en solitario para la coactivación del receptor
nuclear sensible, sino que también puede fusionarse con otras
secuencias proteicas conocidas de otras proteínas para beneficiarse
del efecto activador del receptor nuclear. Dichos fragmentos no
necesitan tener una identidad del 100% con las secuencias de los
fragmentos de proteínas COASTER intactas. Además, pueden generarse
artificialmente proteínas funcionalmente equivalentes a proteínas
COASTER y variantes de corte y empalme de las mismas mediante
mutaciones, inserciones o deleciones deliberadas en la secuencia
polinucleotídica codificante. Un alto grado de similitud de una
proteína con una proteína específicamente caracterizada en esta
descripción hace a una proteína funcionalmente equivalente a una
proteína COASTER.
En vista de la utilidad de las proteínas, un
aspecto de la invención es proporcionar el uso de un polinucleótido
que codifica la proteína de esta invención produciendo la expresión
del polinucleótido en un sistema que también comprenda un receptor
nuclear sensible. El polinucleótido puede ser ADN o ARN puesto que
tanto una secuencia de nucleótidos de ADN como una secuencia de ARN
servirá con el fin de codificar las proteínas de la invención. Son
ADN preferidos para usar en esta invención las secuencias que se
proporcionan en las SEC ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9 ó 10. Puede
obtenerse la expresión incorporando artificialmente el
polinucleótido en células eucariotas, bacterias, plásmidos o
vectores y permitiendo la transcripción del gen por métodos
generalmente conocidos en la técnica. El sistema, que puede ser una
mezcla con componentes para la transcripción y/o traducción de ADN
o ARN o una célula intacta, posiblemente parte de un organismo
completo, también debería contener o generar el receptor nuclear
sensible para ser capaz de usar la interacción entre la proteína de
la invención y el receptor nuclear. Una fuente práctica de
información sobre estas técnicas puede encontrarse en Sambrook et
al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989.
En el contexto de nucleótidos también se puede
hacer referencia a grados de similitud, en los que tripletes de
nucleótidos que codifican el mismo aminoácido pueden reemplazar a
tripletes en las secuencias anteriores. Es más habitual referirse a
secuencias de nucleótidos homólogas:
La homología de un polinucleótido se define
como:
\text{Homología}\ (%) =
\frac{\text{Número de restos idénticos entre dos
secuencias}}{\text{Longitud de secuencias alineadas} -
\text{Longitud de todos los
huecos}}
después del alineamiento óptimo de
las secuencias. Puede realizarse un alineamiento óptimo usando el
algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48;
443-453 (1970)) que maximiza el número de
emparejamientos y minimiza el número de huecos. De hecho, puede
definirse un intervalo más reducido de proteínas mediante el
reemplazo del término similitud por homología, que tiene la
definición análoga a la de homología de un polinucleótido. Dicho
uso del término homología para una proteína de la invención se basa
en el porcentaje de identidad de restos aminoacídicos en la
proteína. Como alternativa, la expresión grado de homología de una
proteína, definida de esta forma, también puede reemplazarse por la
expresión grado de identidad de una
proteína.
Para adaptar la variabilidad de codones, la
invención también incluye secuencias polinucleotídicas que codifican
para las mismas secuencias de aminoácidos que las secuencias
descritas en la presente memoria. La información de secuencias,
como se proporciona en la presente memoria, no debería interpretarse
tan limitadamente como para que sea necesaria la exclusión de bases
identificadas erróneamente. La secuencia específica descrita en la
presente memoria puede usarse fácilmente para aislar los genes
completos de varias otras especies o variantes alélicas. Por
ejemplo, la secuencia puede usarse para preparar sondas o como una
fuente para preparar oligonucleótidos sintéticos para usarlos como
cebadores en reacciones de amplificación de ADN que permiten el
aislamiento y la identificación de los genes variantes completos. La
secuencia genética completa puede usarse en la preparación de
moléculas de vector para la expresión de la proteína en células
hospedadoras adecuadas.
La presente invención se refiere además a
polinucleótidos que tienen ligeras variaciones o que tienen sitios
polimórficos. Los polinucleótidos que tienen ligeras variaciones
pueden codificar polipéptidos variantes que conserven la misma
función o actividad biológica que la proteína madura natural. Los
sitios polimórficos son útiles con fines de diagnóstico. En otro
aspecto, la invención proporciona un método para aislar un
polinucleótido que comprende las etapas de: a) hibridar un ADN de
acuerdo con la presente invención en condiciones rigurosas frente a
ácidos nucleicos que sean ARN, ADN (genómico) o ADNc aislados
preferiblemente a partir de tejidos que expresen un nivel elevado
del polinucleótido de interés; y b) aislar dichos ácidos nucleicos
por métodos conocidos por un especialista en la técnica. Los
tejidos son preferiblemente de origen humano. Preferiblemente, se
aíslan ácidos ribonucleicos de oocitos, ovarios o testículos. Las
condiciones de hibridación son preferiblemente muy rigurosas. De
acuerdo con la presente invención, el término "rigurosa" se
refiere a condiciones de lavado de SSC 1x, SDS al 0,1% a una
temperatura de 65ºC; las condiciones muy rigurosas se refieren a una
reducción de SSC hasta SSC 0,3x, más preferiblemente hasta SSC
0,1x. Preferiblemente, los dos primeros lavados se llevan a cabo
posteriormente dos veces, cada una durante 15-30
minutos. Si existe la necesidad de lavar en condiciones muy
rigurosas se realiza un lavado adicional con SSC 0,1x una vez
durante 15 minutos. La hibridación puede realizarse, por ejemplo,
durante una noche en tampón fosfato 0,5 M a pH 7,5/SDS al 7% a 65ºC.
Como una alternativa el método para aislar el gen puede comprender
metodología de amplificación de genes usando cebadores obtenidos a
partir del ácido nucleico de acuerdo con la invención. También
pueden obtenerse ADNc completos mediante la combinación de clones
obtenidos, por ejemplo, por hibridación con clones de ADNc de RACE,
por ejemplo.
Para usar la modulación de la transcripción el
sistema también debería comprender genes para receptores nucleares
sensibles y elementos promotores sensibles para estos receptores
nucleares. El polinucleótido que codifica una proteína de esta
invención puede usarse para la producción de una proteína COASTER
recombinante para servir, junto con una proteína receptora nuclear
recombinante, en un ensayo para la unión de la proteína con el
receptor nuclear sensible.
La expresión receptor nuclear sensible se usa en
esta descripción para referirse a cualquier receptor nuclear que
puede activarse por una proteína COASTER. Preferiblemente, el
receptor nuclear en el sistema del ensayo es un receptor de
esteroides o, más preferiblemente, un receptor de progestágenos, un
receptor de estrógenos o un receptor de glucocorticoides. Un método
de modulación de la actividad transcripcional promovida por un
receptor nuclear sensible y un coactivador de acuerdo con esta
invención puede ser un ensayo in vitro para la determinación
del grado de modulación, y comprende cuantificar el grado de
modulación. Las condiciones para la cuantificación del grado de
modulación o de unión pueden comprender un ensayo de doble híbrido
en levaduras, como se describe en la presente memoria, o un ensayo
de doble híbrido análogo en un sistema de células de mamíferos.
Como alternativa, la eficacia de unión puede medirse usando
proteínas recombinantes aisladas de COASTER y el receptor nuclear
que estén convenientemente marcados para permitir la detección de
la eficacia de unión. El marcaje de las proteínas puede implicar
moléculas radiactivas o fluorescentes o moléculas con propiedades
enzimáticas que estén directa o indirectamente unidas a las
proteínas recombinantes. Como alternativa, la eficacia de unión
puede medirse mediante un sistema biodetector basado en afinidad tal
como el BIACORE. Como alternativa, la eficacia de unión puede
medirse mediante ensayos de complementación in vivo o in
vitro que usan la interacción de la proteína COASTER y del
receptor nuclear para dirigir la complementación de una proteína
funcional, tal como \beta-galactosidasa o
dihidrofolato reductasa, mediante la cual la función de la proteína
complementada se usa como una medida para la eficacia de unión.
El método de modulación de la actividad
transcripcional promovida por un receptor nuclear sensible y un
coactivador de acuerdo con esta invención también puede ser un
tratamiento del cuerpo humano o animal que comprenda la
administración del agente al ser humano o animal. Dicho agente puede
ser un vector que inserte el gen para el coactivador en células del
organismo, permitiendo de este modo la producción de más coactivador
para la activación del receptor nuclear, o puede ser un vector que
inserte un gen para un coactivador defectuoso en células del
organismo, permitiendo de este modo la producción de una proteína de
acuerdo con la invención que interfiera con la acción de la
proteína COASTER endógena, dando como resultado una acción
disminuida del receptor nuclear. El agente también puede ser un
compuesto químico que influya en la interacción entre el
coactivador y el receptor nuclear sensible. Dicho compuesto puede
obtenerse mediante una exploración de rutina en un ensayo para la
unión entre el coactivador y el receptor nuclear sensible, o en un
ensayo para la cuantificación de la modulación de la acción del
receptor nuclear sensible. Por lo tanto, un aspecto adicional de la
invención es que el ensayo o método de acuerdo con la invención
puede usarse para seleccionar compuestos que modulen la unión entre
una proteína COASTER y un receptor nuclear sensible, o que modulen
la actividad de un complejo receptor
nuclear-COASTER. En dicho ensayo, se ensayan
compuestos para determinar su capacidad para inducir o alterar una
interacción entre COASTER y un receptor nuclear sensible o, como
alternativa, sobre su capacidad para modular la transcripción
mediante un receptor nuclear sensible y en presencia de COASTER y de
un ADN indicador. Un ADN indicador consiste en un promotor que es
sensible al receptor nuclear bajo estudio y un gen indicador cuya
actividad transcripcional puede controlarse. El promotor puede ser
un promotor natural aislado de un gen respuesta de un receptor
nuclear o un casete sintético de (múltiples copias de) un elemento
de respuesta de un receptor nuclear consenso fusionado a un promotor
de núcleo basal (por ejemplo, una caja TATA). Los genes indicadores
adecuados incluyen genes que codifican enzimas cuya actividad puede
controlarse mediante un ensayo enzimático (por ejemplo, luciferasa
o \beta-galactosidasa), genes que codifican
proteínas con propiedades fluorescentes
\hbox{(por ejemplo,
proteína verde fluorescente) o genes cuyos niveles de transcritos
pueden controlarse.}
El último ensayo es particularmente ventajoso
porque COASTER potencia la acción de un promotor que contiene un
elemento de respuesta del receptor de estrógenos (ERE) en presencia
del receptor de estrógenos alfa y de un agonista parcial,
permitiendo de este modo la identificación de nuevos agonistas
parciales. Conocidos ensayos basados en ERE no son capaces de
reconocer todos los agonistas parciales (por ejemplo,
raloxifeno).
La invención también proporciona una composición
farmacéutica como una medicina para el método mencionado de
modulación de la actividad transcripcional promovida por un receptor
nuclear sensible y un coactivador en un sistema, que comprende la
administración de un agente a un cuerpo humano o animal,
interfiriendo el agente con, o potenciando, la función del
coactivador de esta invención. Esta invención también proporciona
una composición farmacéutica para usar en lo mencionado,
comprendiendo la composición farmacéutica el agente que interfiere
con, o que potencia, la función del coactivador. Como se ha
explicado anteriormente, un compuesto identificado con los ensayos
proporcionados por la invención puede interferir con, o potenciar,
la función como coactivador de la proteína de la invención. Como
alternativa, puede formularse para uso medicinal un vector que
comprenda el gen para una proteína de acuerdo con la invención. Es
bien conocido en la técnica un método de preparación de una
medicina por mezcla del agente con uno o más coadyuvantes
farmacéuticamente aceptables, tales como los que se describen en la
bibliografía de referencia Gennaro et al., Remmington's
Pharmaceutical Sciences, (18ª ed., Mack publishing Company,
1990, véase especialmente la Parte 8: Pharmaceutical Preparations
and Their Manufacture). Se describen coadyuvantes adecuados, por
ejemplo, en Handbook of Pharmaceutical Excipients (2ª Edición,
Editores A. Wade y P. J. Weller; American Pharmaceutical
Association; Washington; The Pharmaceutical Press; Londres, 1994).
La mezcla del agente y del coadyuvante farmacéuticamente aceptable
puede comprimirse en unidades de dosificación sólidas, tales como
píldoras y comprimidos, o procesarse en cápsulas o supositorios.
Por medio de líquidos farmacéuticamente adecuados, el agente también
puede aplicarse como una preparación para inyección en forma de una
solución, suspensión, emulsión o como una pulverización, por
ejemplo, una pulverización nasal. Para preparar unidades de
dosificación, por ejemplo, comprimidos, se contempla el uso de
aditivos convencionales tales como cargas, colorantes, aglutinantes
poliméricos y similares. Dichas composiciones farmacéuticas pueden
usarse en un tratamiento relacionado con un receptor nuclear
activado por COASTER, más específicamente, contra el desarrollo de
tumores estimulados por hormonas, para la anticoncepción masculina
o femenina, para el tratamiento de dolencias menopáusicas y
trastornos postmenopáusicos en mujeres, para el tratamiento con
fármaco anabolizantes, para enfermedades cardíacas y para el
tratamiento del envejecimiento debido a una actividad hormonal
reducida. Puesto que la proteína COASTER presenta un perfil de
expresión específico de tejido, dichas medicinas pueden contribuir
a tratamientos específicos de tejido. Además, la presencia o la
modulación de COASTER pueden alterar la farmacología de ligandos de
receptores nucleares. Por ejemplo, habitualmente el raloxifeno es
un antagonista, pero cuando se expresa claramente COASTER en la
célula, el raloxifeno presenta propiedades agonistas. También se
ponen a disposición por esta invención polinucleótidos marcados
adecuadamente que tienen una secuencia que codifica proteínas para
la invención o fragmentos de las mismas. Éstos pueden usarse en
métodos de diagnóstico mediante hibridación cuantitativa rigurosa de
ARN para identificar enfermedades relacionadas con una expresión
anormal de ARN de COASTER en un organismo. Estos métodos pueden
implicar, ventajosamente, el uso de dichos polinucleótidos marcados,
que tienen una longitud de al menos 500 nucleótidos, para realizar
una identificación precisa del ARN con hibridación. Sin embargo,
también puede preferirse una longitud de entre 20 y 50 nucleótidos,
siendo más práctica y todavía eficaz para este fin. Con fines de
diagnóstico, también puede detectarse la expresión de ARNm de
COASTER mediante una reacción en cadena de nucleótidos, tal como
una reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa
(RT-PCR). Para este fin, se sintetiza ADNc a partir
de ARN aislado de un espécimen de muestra usando una enzima
transcriptasa inversa. El ADNc se usa posteriormente como un molde
en una reacción en cadena de la polimerasa en presencia de un
cebador oligonucleotídico directo e inverso de COASTER. La cantidad
de producto de PCR amplificado, que puede determinarse mediante
marcaje isotópico o no isotópico junto con métodos de detección
apropiados o mediante métodos espectrofotométricos o colorimétricos
directos, refleja el nivel de expresión relativo del ARNm de
COASTER.
COASTER.
El marcaje puede realizarse de diversas formas.
En el caso de marcaje radiactivo, la hibridación de polinucleótidos
puede medirse mediante la cuantificación del número de
desintegraciones por segundo del híbrido radiomarcado. Como
alternativa, los fragmentos radiomarcados hibridados pueden
visualizarse mediante autorradiografía o métodos similares. Los
métodos de marcaje no isotópicos con frecuencia hacen uso de
nucleótidos biotinilados que se incorporan durante el marcaje del
fragmento. Posteriormente, el fragmento hibridado con éxito puede
detectarse en virtud de la biotina incorporada. El resto de biotina
puede detectarse usando una molécula de avidina conjugada con una
molécula con propiedades fluorescentes o enzimáticas. La cantidad de
actividad fluorescente o enzimática se usa como una medida para la
eficacia de hibridación. El método de diagnóstico será
particularmente útil para enfermedades que implican desarrollo
tumoral. Es sorprendente que el gen de COASTER está muy expresado
en líneas celulares tumorales. El método de diagnóstico puede
realizarse mediante exploración o toma de biopsias del organismo
que se va a diagnosticar, pero el método puede limitarse
estrictamente a un método que no se practique en el cuerpo humano o
anima. En esa situación, el método comprende el ensayo in
vitro del material biológico disponible para hibridación. En
vista de la sensibilidad de los receptores nucleares para COASTER,
el método se usa preferiblemente cuando la enfermedad que se
sospecha está relacionada con un mal funcionamiento de un receptor
de esteroides o, más preferiblemente, con un receptor de
progestágenos, un receptor de estrógenos o un receptor de
glucocorticoides.
Las proteínas para la invención también pueden
usarse para producir anticuerpos dirigidos contra estas proteínas,
pudiendo usarse los anticuerpos en métodos de diagnóstico de
trastornos que implican cambios en el proceso de coactivación
descrito en esta invención. Pueden encontrarse métodos para la
producción de anticuerpos monoclonales y policlonales en un manual
de laboratorio habitual tal como Current Protocols in Molecular
Biology (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.
G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl eds., John Wiley y Sons Inc.).
Puede llevarse a cabo la inmunización usando preparaciones en bruto
o purificadas de proteína COASTER o mediante vacunación de ADN
usando un vector de expresión de mamíferos para COASTER que se usa
directamente para inmunizar el organismo donante de
anticuerpos.
Pueden obtenerse polinucleótidos que codifican
COASTER incorporados artificialmente en células eucariotas,
bacterias, plásmidos o vectores y proteína COASTER por amplificación
mediante una reacción en cadena de la polimerasa sobre un molde de
ADNc que se haya obtenido mediante la transcripción inversa de ARN
de testículo humano. La reacción en cadena de la polimerasa debería
hacer uso de un cebador directo que comprende el codón de inicio
del ADNc de COASTER (por ejemplo, ATGGGAGACCCGGGGTCGGA; SEC ID 13) y
un cebador inverso que comprende el codón de terminación del ADNc
de COASTER (por ejemplo, TTACATTTCCTCAAGACTTC; SEC ID 14). La
clonación del ADNc obtenido de este modo en un vector de expresión
adecuado permitirá la producción de la proteína COASTER. Mediante
deleciones e inserciones de nucleótidos parcialmente idénticos
pueden obtenerse proteínas COASTER artificiales con métodos bien
conocidos por los especialistas, por ejemplo, como se describe en
Sambrook (en la obra citada).
La proteína COASTER puede introducirse en un
organismo mediante la transfección de un vector de expresión que
contiene el ADNc de COASTER. El vector debería contener un promotor
que sea capaz de dirigir la expresión génica en el organismo
transfectado, y el ADNc de COASTER cadena abajo de este promotor.
Además, el vector debería contener señales para un inicio y una
terminación adecuadas de la transcripción y de la traducción, y
señales para un procesamiento adecuado del transcrito. Para la
introducción de COASTER en células de mamífero son adecuados
promotores virales tales como el Virus de los Simios 40, de la
repetición terminal larga del Sarcoma de Rous o los promotores
tempranos inmediatos de Citomegalovirus, para dirigir la
transcripción del ADNc de COASTER. Los ejemplos de vectores
plasmídicos que contienen promotores virales incluyen pCDNA3.1,
pRSV y pNGV1. Además de la introducción de COASTER en células de
mamífero con la ayuda de plásmidos, COASTER puede introducirse en
células de mamífero mediante transducción usando vehículos virales
para el suministro y expresión de COASTER. Los virus adecuados
incluyen retrovirus, adenovirus y baculovirus. Para la introducción
de COASTER en células bacterianas, son adecuados vectores que
contienen promotores bacterianos tales como el promotor de T7. Los
ejemplos de vectores de expresión bacterianos incluyen pRSET y pET.
Para la introducción de COASTER en levaduras, los vectores
adecuados
\hbox{incluyen pYES para la introducción en
Saccharomyces cerevisiae y pPIC para la introducción en
Pichia pastoris .}
Está disponible un método sencillo para
seleccionar un receptor nuclear sensible para el ensayo. Por
ejemplo, puede ensayarse si un receptor nuclear se coactiva
mediante una proteína COASTER en un ensayo de transfección
transitoria. Cuando existe coactivación, el receptor nuclear es
sensible. La acción de un receptor nuclear es la inducción de la
transcripción de un gen unido cadena abajo a un promotor. Con un
ensayo de doble híbrido, por ejemplo, puede ensayarse si el
receptor nuclear interacciona con la proteína COASTER. Asimismo,
puede ensayarse de forma rutinaria la equivalencia funcional con la
proteína COASTER de
\hbox{una proteína artificial en un ensayo
como se describe en los ejemplos.}
La siguiente descripción de variantes y uso de
la invención pretende posibilitar adicionalmente la invención y el
uso de la misma.
La Figura 4 muestra que COASTER es un
coactivador para el ER\alpha unido a ligando de
4OH-tamoxifeno pero no para el ER\beta unido a
ligando de 4OH-tamoxifeno. Estos resultados están
muy en concordancia con observaciones anteriores de que el SERM
4OH-tamoxifeno produce una señal mediante la función
AF1 del ER\alpha. La función AF1 reside en el dominio AB del
ER\alpha y no está ni estructuralmente ni funcionalmente
conservada en ER\beta (McInerney et al., 1998,
Endocrinology 139, 4513-4522). Para confirmar esta
idea, se ensayó el potencial de coactivación de COASTER sobre dos
receptores quimera. La quimera ER\beta/\alpha contiene el
dominio AB de ER\beta fusionado con los dominios CDEF de
ER\alpha, como se ha descrito anteriormente (McInerney et
al., 1998, Endocrinology 139, 4513-4522). En
experimentos de transfección, el receptor ER\beta/\alpha
permite la coactivación mediante COASTER en presencia de
17\beta-estradiol pero no en presencia de los SERM
4OH-tamoxifeno y raloxifeno (Figura 8). Esta
observación indica que la coactivación mediante COASTER del receptor
unido a un ligando SERM es distinta de la coactivación del receptor
unido a ligando de 17\beta-estradiol. Conforme a
la observación anterior de que la señalización mediante
4OH-tamoxifeno requiere el AF1 de ER\alpha, los
resultados demuestran que el 4OH-tamoxifeno no
presenta agonismo sobre la quimera ER\beta/\alpha. Además, los
datos demuestran que el aumento de los niveles de COASTER en la
célula no pueden superar este bloqueo en la actividad, indicando
que la coactivación del receptor unido a un ligando SERM requiere la
AF1 de ER\alpha. La situación en la quimera ER\alpha/\beta,
que contiene la AF1 de ER\alpha fusionada con los dominios CDEF
de ER\beta, es más compleja. Se ha demostrado anteriormente que la
quimera ER\alpha/\beta muestra agonismo de
4OH-tamoxifeno y una actividad en presencia de
17\beta-estradiol que está reducida en
comparación con los receptores ER\alpha o ER\beta de tipo
silvestre (McInerney et al., 1998, Endocrinology 139,
4513-4522). Los datos confirman y amplían estos
resultados y demuestran que, además del
4OH-tamoxifeno y del
17\beta-estradiol, el raloxifeno también es capaz
de producir una señal a través de la quimera ER\alpha/\beta.
Sin embargo, la quimera ER\alpha/\beta es insensible a la
coactivación por COASTER. Los resultados combinados indican que la
quimera ER\alpha/\beta adopta una conformación única y sugieren
que la coactivación, como se observa en el ER\beta de tipo
silvestre unido a ligando de 17\beta-estradiol,
depende tanto de la función de AF2 como de las secuencias en el
extremo N-terminal de ER\beta.
Los resultados que se presentan en la Figura 4 y
5 muestran que en ausencia de COASTER, el
4OH-tamoxifeno puede funcionar como un agonista
sobre ER\alpha, mientras que el raloxifeno no puede hacerlo. La
elevación de los niveles de COASTER en la célula permite la
identificación de raloxifeno como un ligando con potencial
agonista. Se planteó si COASTER podría permitir la identificación de
nuevos SERM potenciales en una combinación de compuestos que se
hubieran identificado previamente como antiestrógenos. Para este
fin, se ensayó la actividad de los compuestos ORG 43143, ORG 39660
y ORG 39669, que se identificaron como nuevos antiestrógenos en un
ensayo de exploración de alto rendimiento (Method in Dechering et
al., 2000, Current Medicinal Chemistry 7,
561-576). La Figura 9 muestra que estos compuestos
se comportan todos como antiestrógenos. En particular, el compuesto
ORG 39669 muestra una actividad parcial en el ensayo de
antiestrógenos. Cuando se ensayaba en un ensayo de coactivación de
COASTER, este grupo de antiestrógenos se clasificaba en tres clases
funcionales diferentes (Figura 10). La primera clase comprende
4OH-tamoxifeno y ORG 39669 y representa un grupo de
compuestos que muestran cierto agonismo sobre ER\alpha y un
agonismo potenciado en presencia de COASTER. La segunda clase es un
grupo de antiestrógenos que están silentes en la trascripción
mediada por ER\alpha de un indicador de ERE en ausencia de
COASTER. Sin embargo, cuando los niveles de COASTER están elevados,
estos compuestos se vuelven agonistas. Los compuestos raloxifeno y
el nuevo antiestrógeno ORG 43143 son representativos de esta
segunda clase. La última clase de antiestrógenos incluye ICI 164.384
y ORG 39660 y representa un grupo de compuestos que no muestran
agonismo sobre un indicador de ERE y permanecen silentes en
presencia de COASTER.
La distribución tisular de ARNm de COASTER se
investigó mediante análisis de transferencia de Northern y
RT-PCR. Se hibridaron transferencias de Northern de
múltiples tejidos humanos con un fragmento de ADNc de COASTER de
794 pb. Casi todos los tejidos examinados muestran hibridación con
una especie de ARNm de aproximadamente 5 kb de tamaño, con mayor
nivel de señal en testículo, ovario, corazón, placenta y músculo
esquelético y señales de inferiores a nulas en los otros tejidos
(Figura 6). Además, se observa una señal de hibridación muy intensa
con un transcrito de 4 kb que sólo está presente en el testículo. El
tamaño del transcrito de 5 kb está en buena concordancia con el
tamaño del ADNc que se ha aislado. El transcrito de 4 kb puede
representar una variante de corte y empalme. El patrón de expresión
específico del testículo de este transcrito es sorprendente y
sugiere un papel funcional en la fisiología testicular. También se
investigó la expresión de ARNm de COASTER mediante análisis de
RT-PCR en diferentes líneas celulares humanas
procedentes de tumores y en muestras de ARN de tejidos humanos y de
Macaca fasciculata (mono Cynomolgus). Los resultados
semicuantitativos de la RT-PCR se muestran en las
Figuras 7 y 11. Los resultados muestran una elevada expresión en las
líneas celulares de carcinoma epitelial de mama
MCF-7 y T-47 y en la línea de
células epiteliales vaginales SW954. Se observó una expresión
moderada en las líneas celulares de osteosarcoma U-2
OS y HOS, en la línea celular de carcinoma epitelial endometrial
Ishikawa, en la línea de células endoteliales vasculares
VE103ER\alpha y en la línea celular endotelial HS760T. No se
detectó expresión en la línea celular de osteosarcoma MG63 ni en la
línea celular de carcinoma epitelial endometrial
ECC-1. Se ha descrito que las líneas celulares que
muestran una elevada expresión de COASTER (MCF-7,
T-47D y SW954) contienen elevados niveles de
ER\alpha (Dechering et al., Curr. Med. Chem. 7,
561-576), sugiriendo que COASTER puede contribuir al
desarrollo de células tumorales mediado por ER\alpha. Los
resultados de RT-PCR sobre ARN procedente de tejidos
se presentan en la Figura 11. El método de RT-PCR
confirma la elevada expresión en testículo que reveló la
transferencia de Northern (Figura 6). Además, se observa una
elevada expresión en tejido óseo. Esto indica que los ligandos que
permiten la interacción receptor nuclear-COASTER
podrían influir en el metabolismo del
hueso.
hueso.
Los ejemplos y figuras adicionales sirven para
ilustrar y clarificar o especificar la invención. La descripción se
ilustra con las siguientes figuras:
Figura 1. Ejemplo de una secuencia de
nucleótidos y de aminoácidos de COASTER. Esta secuencia de ADNc de
COASTER tiene una longitud de 4999 pares de bases con una fase de
lectura abierta de 3039 pares de bases (1013 aminoácidos). Una
secuencia previamente publicada del ADNc que codifica KIAA0576
(número de acceso AB011148) con una homología casi total (99%)
muestra una inserción de 144 nucleótidos en la posición 2832 que da
como resultado una fase de lectura abierta de 1061 aminoácidos. Se
muestran en negrita los motivos de dedos de cinc y se subraya un
motivo LXXLL. La secuencia de aminoácidos de una señal de
localización nuclear consenso se muestra en cursiva y subrayada. El
codón de inicio ATG y los codones de terminación de la traducción en
la fase de lectura abierta se muestran en negrita y cursiva.
Figura 2. La secuencia de ADNc de COASTER
codifica una proteína de aproximadamente 115 kiloDaltons. El molde
pCDNA3.1HISC.COASTER que contiene la fase de lectura abierta
completa de COASTER se transcribió y se tradujo in vitro en
presencia de [^{35}S]-metionina. Como control, se
transcribió y se tradujo pBK-SRC-1
(Onate et al., Science 270, 1354-1357) en
paralelo. Se analizaron las proteínas marcadas mediante
SDS-PAGE. La Figura muestra una autorradiografía
del patrón de electroforesis. Carril 1: producto de traducción de
pBK-SRC-1. Carril 2: producto de
traducción de pCDNA3.1HISC.COASTER. La posición de la proteína
COASTER se indica con una
flecha.
flecha.
Figura 3. Interacción dependiente de hormonas
entre ER\beta y COASTER. Se realizó un ensayo de doble híbrido en
levaduras en la cepa hospedadora de levaduras AH109, que se
transformó con plásmido pGBT9.ER\beta y con un plásmido que
codifica una fusión entre un dominio de activación GAL4 y los
aminoácidos 1 a 234 de COASTER. La Figura muestra la actividad
\beta-galactosidasa de las células de levadura
transformadas en respuesta a 17\beta-estradiol
10^{-8} M (barra sombreada) y raloxifeno 10^{-5} M (barra
negra). La actividad \beta-galactosidasa de fondo
de las células de levadura transformadas se indica con una barra
blanca.
Figura 4. Coactivación diferencial de ER\alpha
y ER\beta en presencia de 4OH-tamoxifeno y
raloxifeno. Se transfectaron de forma transitoria células
U-2 OS con
p4ERE-TATA-LUC y pNGV1.ER\alpha o
pNGV1ER\beta como se indica. Cuando se indica, las células se
cotransfectaron con las construcciones de expresión de COASTER
pCDNA3.1HISA.COASTER\Delta o pCDNA3.1HISC.COASTER, o con la
construcción de expresión pCDNA3.1HISC.GRIP1. La figura muestra la
actividad luciferasa (a. l.) después de la incubación de las células
sin hormona (barras blancas), con raloxifeno 10^{-7} M (barras
sombreadas) o con 4OH-tamoxifeno 10^{-7} M (barras
negras). Las barras de error indican las desviaciones típicas en un
experimento triplicado.
Figura 5. Activación dependiente de la dosis de
un elemento de respuesta a estrógenos en presencia de ER\alpha o
ER\beta junto con COASTER. Se transfectaron de forma transitoria
células U-2 OS con
p4ERE-TATA-LUC y pNGV1.ER\alpha.
Los experimentos de transfección indicados con marcadores negros se
suplementaron con la construcción de expresión de COASTER
pCDNA3.1HISC.COASTER. La figura muestra la actividad luciferasa (a.
l.) después de la incubación de las células con una concentración
creciente de raloxifeno (indicada con cuadrados) o
4OH-tamoxifeno (indicada con triángulos). Las
barras de error indican las desviaciones típicas en un experimento
triplicado.
Figura 6. Distribución tisular de transcritos de
COASTER. Se hibridaron transferencias de Northern de múltiples
tejidos humanos con una sonda de ADNc de COASTER marcada con
[^{32}P]. La figura muestra una autorradiografía de las
transferencias. La sonda de COASTER hibrida con dos especies de ARNm
de aproximadamente 5 kb y 4 kb de tamaño, señaladas con flechas.
Los tejidos que se representan en las transferencias incluyen bazo
(a), timo (b), próstata (c), testículo (d), ovario (e), intestino
delgado (f), colon (g), leucocitos de sangre periférica (h),
corazón (i), cerebro (j), placenta (k), pulmón (l), hígado (m),
músculo esquelético (n), riñón (o) y páncreas (p). El patrón de
migración de un patrón de tamaños se indica en el lado izquierdo de
la figura (tamaño en kilobases).
Figura 7. Expresión de COASTER en líneas
celulares tumorales. Los niveles de expresión relativos de COASTER
se determinaron mediante RT-PCR. La figura muestra
la intensidad relativa de los productos de PCR medidos mediante
exploración de imágenes de electroforesis en gel de agarosa de los
productos de PCR. Las líneas celulares que se representan incluyen:
MCF-7 (a), T-47D (b),
U-2 OS (c), MG63 (d), HOS (e), ECC-1
(f), Ishikawa (g), VE103 (h), HS760T (i) y SW 954 (j).
Figura 8. Expresión de luciferasa cuantificada
con recuentos de luz por segundo (cps) en células transfectadas con
un receptor quimérico ER\beta/\alpha y COASTER en respuesta a la
adición de estradiol (E2), raloxifeno o
4-hidroxi-tamoxifeno (4OHT).
Figura 9. Porcentaje de actividad estrogénica en
respuesta a la adición de una dosis patrón de estradiol en
presencia de diversas concentraciones, expresadas como logaritmo de
la concentración, de raloxifeno,
4-hidroxi-tamoxifeno (4OHT), ICI
164.384, ORG 43143, ORG 39660 y ORG 39669, respectivamente.
Figura 10. Efecto de compuestos en un ensayo de
coactivación de COASTER.
Figura 11. Expresión de COASTER en tejidos
humanos y de M. fasciculata. Los niveles de expresión
relativa de COASTER se determinaron mediante
RT-PCR. La figura muestra la intensidad relativa de
los productos de PCR medidos mediante un método de PCR cuantitativa
a tiempo real Taqman. Los tejidos que sirvieron como la fuente para
el material de ARN se indican en la parte inferior de la figura.
Todos los tejidos eran de origen humano, excepto por el tejido óseo
que procedía de M. fasciculata.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la identificación de COASTER como proteína
que interacciona con ER\beta de una forma dependiente de
hormonas, se realizó una exploración de doble híbrido en levaduras
usando ER\beta como cebo. El sistema de doble híbrido consistía
en una cepa de levaduras (AH109) que expresaba los genes indicadores
HIS3, MEL1, ADE2 y lacZ de un promotor
sensible a GAL. ER\beta se expresaba en esta cepa en una fusión
con un dominio de unión al ADN de GAL4. En este sistema, ER\beta
solo no es capaz de activar los genes indicadores en presencia de
17\beta-estradiol (no se muestran los resultados).
La cepa hospedadora que expresaba ER\beta se transformó con una
genoteca de ADNc de osteosarcoma humano. Esta genoteca expresa ADNc
como una fusión traduccional con un dominio transactivador GAL4. La
interacción entre ER\beta y una proteína codificada por una
genoteca permite la activación de los genes indicadores y el
crecimiento en medios que carecen de histidina y/o adenina. Se
exploraron un total de 3,5 x 10^{6} colonias. Las células de
levadura transformadas se seleccionaron por su crecimiento en
medios que carecían de histidina y en presencia de
17-\beta estradiol. Se seleccionaron 560 colonias
HIS^{+} y se exploraron mediante réplica en placa sobre su
fenotipo ADE^{+} en ausencia o presencia de
17-\beta estradiol. Se seleccionaron 27
transformantes de levaduras que mostraban un fenotipo
HIS^{+} y ADE^{+} dependiente de hormonas. El ADN
plasmídico procedente de la genoteca se aisló de estos 27 clones y
se reintrodujo en la cepa de levadura hospedadora
AH109.pGBT9.ER\beta para verificar que los fenotipos observados
eran dependientes del ADN transformado. En un ensayo de
transactivación de \beta-galactosidasa
(lacZ) en levaduras, 21 de los 27 positivos que se volvieron
a ensayar mostraron un fenotipo lacZ^{+} inducible por
hormonas. El análisis de la secuencia de estos positivos identificó
dos coactivadores bien conocidos para receptores de esteroides, UBC9
(enzima de conjugación de ubiquitina) y SUG1. Además, se identificó
una secuencia de ADNc que se predijo que codificaba una proteína
nuclear con varios motivos de dedos de cinc y con un dominio LXXLL,
que aparentemente estaban implicados en la interacción entre
receptores de esteroides y coactivadores. Este ADNc se seleccionó
para un estudio adicional y se demostró que codificaba un
coactivador funcional para receptores de esteroides. Por lo tanto,
se ha denominado COASTER a este nuevo
coactivador.
coactivador.
Se secuenció el inserto del plásmido
pACT2.COASTER\Delta que se aisló en la exploración de doble
híbrido y esta secuencia se comparó con las bases de datos Incyte
Lifeseq Gold y Genbank usando el algoritmo BLAST. Se identificaron
un total de 270 secuencias de EST Incyte. Se obtuvo el clon 2905757,
que contenía el extremo 3' del ADNc de COASTER, de Incyte Genomics
(Palo Alto, Estados Unidos) y se secuenció en su totalidad. Además,
la búsqueda en la base de datos Genbank reveló que la secuencia de
COASTER comparte una homología casi total (99%) con el gen que
codifica KIAA0576, una supuesta proteína de función desconocida
(Nagase et al., DNA Res. 5, 31-39). La
secuencia de KIAA0576 representa una variante de corte y empalme de
COASTER y contiene una inserción en la fase de lectura abierta de
144 pares de bases. Se empleó RACE PCR para identificar el extremo
5' de la secuencia de ADNc de COASTER. Se identificaron dos
fragmentos diferentes que se diferenciaban en sus regiones 5' no
traducidas. La Figura 1 muestra una visión de conjunto de la
secuencia completa de ADNc de COASTER. El ADNc que se corresponde
con el fragmento de RACE más largo tiene una longitud de 4099
nucleótidos y contiene una fase de lectura abierta de 3039
nucleótidos (1013 aminoácidos). El KIAA0576 muestra una inserción de
144 nucleótidos en la posición 2832 que da como resultado una fase
de lectura abierta de 1061 aminoácidos. Tanto para COASTER como
para KIAA0576, la secuencia de aminoácidos deducida a partir del
ADNc predice una proteína que contiene 9 dominios de dedos de cinc
(de tipo C_{2}H_{2}), un sitio de localización nuclear y un
motivo de interacción con receptores nucleares LXXLL.
Para ensayar si el ADNc de COASTER codificaba de
hecho una proteína, se transcribió y se tradujo in vitro el
plásmido pCDNA3.1HISC.COASTER que contiene la fase de lectura
abierta completa de COASTER (aminoácidos 1-1013).
La Figura 2 muestra que una proteína de aproximadamente 115
kiloDaltons está codificada por el ADNc de COASTER. El tamaño
observado de la proteína está en perfecta concordancia con la
longitud de la secuencia de ADNc que se presenta en la Figura 1.
Los resultados muestran además que el ADNc de COASTER codifica una
proteína, que es diferente de la proteína codificada por
pBK-SRC-1, y que contiene la fase de
lectura abierta para el coactivador SRC-1
conocido.
El plásmido pACT2.COASTER\Delta se aisló
originariamente en la exploración de doble híbrido en levaduras.
Para verificar que la proteína codificada por este plásmido
interacciona de hecho con ER\beta en levaduras, se reintrodujo el
plásmido pACT2.COASTER\Delta en la cepa receptora
AH109.pGBT9.ER\beta. La Figura 3 muestra los resultados de un
ensayo de doble híbrido posterior. Los resultados muestran que la
adición de 17\beta-estradiol al medio de cultivo
da como resultado una inducción dependiente de la dosis de la
actividad indicadora de \beta-galactosidasa. Por
el contrario, el antiestrógeno raloxifeno no es capaz de inducir la
actividad del indicador. Esta incapacidad puede estar relacionada
con la resistencia de células de levaduras a antiestrógenos, como
se ha publicado anteriormente (Lyttle et al., J Steroid
Biochem. Biol. 42, 677-685; IH, resultados no
publicados). Como alternativa, puede indicar que la conformación
inducida por antiestrógenos de ER\beta no permite una interacción
con COASTER. La transformación de la cepa de levadura con el
plásmido de expresión de ER\beta o con el plásmido de expresión
de COASTER en solitario no dio como resultado un fenotipo
lacZ^{+} inducible por 17\beta-estradiol
(no se muestran los datos). En su conjunto, los resultados indican
que ER\beta y COASTER interacción de una forma dependiente de
17\beta-estradiol en levaduras. La interacción es
independiente del motivo LXXLL de COASTER, puesto que este motivo
no está codificado por el plásmido pACT2.COASTER\Delta que se usó
en el ensayo de doble híbrido en levaduras.
Para ensayar el papel funcional de COASTER en un
entorno de mamíferos, se clonó el ADNc de longitud completa de
COASTER (aminoácidos 1-1013) en un vector de
expresión de células de mamíferos. El papel funcional de COASTER se
analizó mediante la cotransfección de células U-2 OS
con el plásmido de expresión de COASTER junto con un plásmido que
expresaba un receptor de esteroides y un plásmido que contenía un
gen indicador de luciferasa bajo el control de un elemento de
respuesta a hormonas. Después de la transfección, las células se
estimularon con la hormona apropiada para el receptor bajo estudio.
Los resultados se presentan en la Tabla 1.
Leyenda de la Tabla 1: COASTER es un coactivador
para receptores de esteroides. Se transfectaron de forma
transitoria células U-2 OS con pNGV1.ER\beta y
p4ERE-TATA-LUC (1), pNGV1.ER\alpha
y p4ERE-TATA-LUC (2), pKCRE.PR y
pMMTV-LUC (3) o pNGV1.GR y pMMTV-LUC
(4). Donde se indica, se añadió la construcción de expresión de
COASTER pCDNA3.1HISC.COASTER a la mezcla de transfección. Después de
la transfección, las células se incubaron con las hormonas que se
indican en la fila superior. La tabla muestra actividades de
luciferasa \pm desviaciones típicas a partir de un experimento
triplicado. Org 2058 =
16\alpha-etil-21-hidroxi-19-norpregn-4-eno-3,20-diona.
Como puede observarse en la Tabla 1, COASTER es
un coactivador para el receptor de progesterona (PR), para el
receptor de glucocorticoides (GR) y para los receptores de
estrógenos \alpha y \beta (ER\alpha y ER\beta). En todos
los casos, la actividad del receptor unido a ligando con un agonista
se potencia adicionalmente por la coexpresión de COASTER. Cuando
ER\alpha o ER\beta están unidos a ligando con el antagonista
ICI164.384, la coexpresión de COASTER no potencia la actividad
transcripcional, indicando que el antagonista induce una
conformación que no permite a COASTER funcionar como un coactivador.
La actividad del gen indicador no se indujo cuando COASTER se
transfectó en ausencia de un receptor de esteroides (no se muestran
los datos), indicando que tanto el receptor de esteroides como
COASTER son necesarios para la actividad potenciada.
El potencial coactivador de COASTER sobre
ER\alpha y ER\beta se estudió adicionalmente en presencia de
los antiestrógenos raloxifeno y 4OH-tamoxifeno. Para
una comparación, se analizó en paralelo la actividad del
coactivador GRIP1, que es un ortólogo de ratón de
TIF2/SRC-2 humano. Los experimentos de transfección
mostraron que en células U-2 OS, el
4OH-tamoxifeno actúa como un agonista sobre la
actividad transcripcional de ER\alpha, pero no de ER\beta,
cuando se usa un indicador de ERE como lectura (Figura 4). La
cotransfección de COASTER o GRIP1 da como resultado una actividad
potenciada del ER\alpha unido a ligando de
4OH-tamoxifeno. Curiosamente, COASTER es capaz de
activar la transcripción en presencia de raloxifeno, compuesto que
de otro modo no es un agonista en este sistema. Este fenómeno se
observó en la transcripción mediada por ER\alpha, pero no cuando
estaba presente ER\beta como el receptor de estrógenos. Además, el
coactivador GRIP1 no es capaz de activar la expresión del gen
indicador en presencia de raloxifeno y ER\alpha. Los datos
muestran que la actividad de la forma truncada de COASTER,
COASTER\Delta, es idéntica a la de COASTER de longitud completa.
Este indica que los aminoácidos 1 a 234 son suficientes para el
potencial coactivador de COASTER sobre el ER\alpha unido a
ligando de raloxifeno o 4OH-tamoxifeno. Los efectos
de COASTER sobre la transcripción mediada por ER\alpha se
estudiaron adicionalmente haciendo curvas de
dosis-respuesta para los ligandos raloxifeno y
4OH-tamoxifeno en presencia y ausencia de COASTER.
Los datos que se presentan en la Figura 5 confirman la observación
de que el raloxifeno actúa como un agonista en la transcripción
génica dirigida por ERE en presencia de ER\alpha y COASTER.
Cuando se omite COASTER, el raloxifeno no es capaz de activar el gen
indicador, incluso a concentraciones elevadas del ligando. El
antiestrógeno 4OH-tamoxifeno es un agonista en este
sistema. Sin embargo, la expresión de COASTER aumenta la magnitud
de la respuesta transcripcional. Para ambos compuestos, la
actividad del indicador en presencia de ER\alpha y COASTER es
dependiente de la concentración usada en el ensayo. Los resultados
que se presentan en la presente memoria muestran que COASTER puede
influir en el equilibrio agonista/antagonista de antiestrógenos de
perfil mixto tales como raloxifeno y 4OH-tamoxifeno.
Las publicaciones anteriores han demostrado que el raloxifeno puede
actuar como un agonista a través de rutas no clásicas (no ERE)
sobre ER\beta (Zou et al., Mol Endrocrinol. 13,
418-430; Paech et al., Science 277,
1508-1510). Hasta donde sabemos, estos datos
proporcionan las primeras observaciones de agonismo de raloxifeno
sobre la ruta clásica del elemento de respuesta a estrógenos (ERE).
Además, éstas son las primeras indicaciones de que el raloxifeno
puede actuar como un agonista sobre ER\alpha. Estas observaciones
son importantes para el entendimiento de los mecanismos de acción
de los antiestrógenos. La propiedad de COASTER de activar el
ER\alpha unido a ligando de raloxifeno diferencia a COASTER de los
coactivadores, tales como GRIP1, descritos hasta la fecha. Además,
el ensayo que se describe en la presente memoria puede usarse con
una ventaja particular para la exploración farmacológica de nuevos
ligandos de receptores de estrógenos, puesto que COASTER es capaz
de identificar propiedades agonistas parciales de compuestos.
Se investigó la distribución tisular del ARNm de
COASTER mediante análisis de transferencia de Northern y
RT-PCR. Se hibridaron transferencias de Northern de
múltiples tejidos humanos con un fragmento de ADNc de COASTER de
794 pb. Casi todos los tejidos examinados muestran hibridación con
una especie de ARNm de aproximadamente 5 kb de tamaño, con mayor
nivel de señal en testículo, ovario, corazón, placenta y músculo
esquelético, y señales de inferiores a inexistentes en los otros
tejidos (Figura 6). Además, se observó una señal de hibridación muy
intensa con un transcrito de 4 kb que sólo está presente en el
testículo. El tamaño del transcrito de 5 kb está en buena
concordancia con el tamaño del ADNc que se había aislado. El
transcrito de 4 kb puede representar una variante de corte y
empalme de la que aún se desconoce la estructura detallada. Sin
embargo, el patrón de expresión específico de testículo de este
transcrito es sorprendente y sugiere un papel funcional en la
fisiología testicular. También se investigó la expresión de ARNm de
COASTER mediante análisis de RT-PCR en diferentes
líneas celulares humanas procedentes de tumores. Los resultados
semicuantitativos de la RT-PCR se muestran en la
Figura 7. Los resultados muestran una elevada expresión en las
líneas celulares de carcinoma epitelial de mama
MCF-7 y T-47 y en la línea de
células epiteliales vaginales SW954. Se observó una expresión
moderada en las líneas celulares de osteosarcoma U-2
OS y HOS, en la línea celular de carcinoma epitelial endometrial
Ishikawa, en la línea de células endoteliales vasculares
VE103ER\alpha y en la línea celular endotelial HS760T. No se
detectó expresión en la línea celular de osteosarcoma MG63 ni en la
línea celular de carcinoma epitelial endometrial
ECC-1. Se ha descrito que las líneas celulares que
muestran una elevada expresión de COASTER (MCF-7,
T-47D y SW954) contienen elevados niveles de
ER\alpha (Dechering et al. Curr. Med. Chem. 7,
561-576), indicando que COASTER puede contribuir al
crecimiento mediando por ER\alpha de células tumorales.
Se cultivaron cepas hospedadoras de levaduras y
transformantes en medio completo (YPD) o en medio Synthetic Dropout
(SD) mínimo. El medio completo es una mezcla de peptona, extracto de
levadura y dextrosa en proporciones óptimas para el cultivo de
cepas de levaduras (véanse los protocolos de levaduras del manual de
Clontech, Palo Alto, Estados Unidos, protocolo
PT3024-1). El medio SD mínimo contiene dextrosa al
2%, bases nitrogenadas de levaduras al 0,67% y una mezcla
específica de aminoácidos y nucleósidos (por ejemplo,
SD-His-Leu-Trp es
un medio que carece de histidina, leucina y triptófano). Todos estos
medios se adquirieron de BIO101 (Berverly, Estados Unidos).
Se obtuvo la cepa AH109 de Saccharomyces
cerevisiae (MATa, trp1-901,
leu2-3, 112, ura3-52,
his3-200, gal4\Delta, gal80\Delta,
LYS2::GAL1_{UAS}-GAL1_{TATA}-HIS3,
GAL2_{UAS}-GAL2_{TATA}-ADE2,
URA3::MEL1_{TATA}-lacZ) de Clontech, Palo Alto
Estados Unidos. Para expresar la proteína ER\beta como un cebo en
la cepa de levaduras AH109, se usó plásmido pGBT9.ER\beta (por
cortesía de W. Kruijer, Rijksuniversiteit Groningen, Holanda). Este
plásmido contiene la secuencia codificante de ER\beta (aminoácidos
1 a 530) fusionada a una secuencia que codifica un dominio de unión
al ADN de GAL4 y contiene el gen TRP1 como un marcador de
selección. La cepa de levadura AH109 se transformó con
pGBT9.ER\beta usando un método de acetato de litio convencional
siguiendo el manual de instrucciones de Clontech (Palo Alto, Estados
Unidos, protocolo Nº PT3247-1) y se seleccionaron
transformantes en placas de SD-triptófano
(SD-Trp). De esta placa se seleccionaron colonias
individuales y se guardaron como clones parentales. Posteriormente,
la expresión de fondo de HIS3 de estos clones se determinó
mediante siembra en las placas de selección apropiadas. Se
descartaron los clones que crecieron en medios deficientes en
histidina en presencia de 17\beta-estradiol.
Posteriormente, los clones con baja expresión de fondo de
HIS3 se transformaron con un control positivo pGRIP1 (por
cortesía de M. Stallcup, Universidad del Sur de California, Estados
Unidos), un plásmido que codifica el coactivador GRIP1 que se ha
demostrado que interacciona con el receptor de estrógenos en
levaduras (Hong et al., Mol. Cell. Biol. 17,
2735-2744). Posteriormente, se seleccionó el clon
parenteral (AH109.ER\beta), que mostraba una elevada expresión de
HIS3 en presencia de pGRIP1 y 17\beta estradiol, como el
clon receptor para la exploración de la genoteca. Se obtuvo de
Clontech (Clontech, Palo Alto, Estados Unidos, nº de cat.: HL4026AH)
una genoteca de ADNc Matchmaker de osteosarcoma humano. Esta
genoteca se construyó en vector pACT2, que contiene un gen
LEU2 como marcador de selección y que expresa los insertos
clonados en fusión con un dominio de activación GAL4 (AD). El clon
receptor AH109.ER\beta se transformó con 100 \mug de ADN
plasmídico de la genoteca de ADNc de osteosarcoma. Se seleccionaron
transformantes en placas
SD-Trp-Leu-His que
contenían 17\beta-estradiol 10^{-8} M y se
identificaron colonias HIS^{+}. Las colonias HIS^{+} se
volvieron a explorar mediante réplica en placa en medios
SD-Trp-Leu-His-Ade
en ausencia y presencia de 17\beta-estradiol
10^{-8} M. Los transformantes de levadura que mostraron un
fenotipo HIS^{+}/ADE^{+} dependiente de hormonas se
seleccionaron para los estudios posteriores. A partir de estos
transformantes, se aisló el ADN siguiendo un protocolo para
aislamiento de minipreparaciones en bruto (véanse los protocolos
básicos Y1.4). Las minipreparaciones en bruto se usaron para
transformar E. coli KC8 mediante electroporación y se
seleccionaron los transformantes que contenían el plásmido
procedente de la genoteca en medio deficiente en leucina. Los
insertos de la genoteca se secuenciaron en un secuenciador ABI de
Perkin Elmer (Norwalk, Estados Unidos). Se realizaron búsquedas de
similitud de Blast contra la base de datos Incyte.
Se cultivó una colonia individual en medio
líquido SD-Trp-Leu durante una noche
a 30ºC. Estos cultivos de una noche se diluyeron hasta una
DO_{600} de 0,1 en 90 \mul de medio
SD-Trp-Leu en una placa de cultivo
de 96 pocillos. Se añadieron 10 \mul de una solución madre de
hormonas concentrada 10 veces y las placas se incubaron durante 5
horas a 30ºC y bajo agitación vigorosa a 200 rpm. Posteriormente, se
midió la actividad \beta-galactosidasa usando el
tampón One-Step Yeast Lysis y el sistema de
detección quimioluminiscente Galacton Plus de Tropix (Tropix, Inc.,
Avenue, Bedford, Estados Unidos). Se controló la emisión de luz
usando un Victor Instrument (Perkin Elmer, Norwalk, Estados
Unidos).
RACE 5' (Amplificación rápida de extremos de
ADNc) de COASTER: para aislar el extremo 5' del ADNc de COASTER, se
realizaron experimentos de 5' RACE-PCR usando ADNc
Marathon-Ready de testículo humano (Clontech, Palo
Alto, Estados Unidos, Nº Cat. 7414-1). Se realizó
una RACE PCR usando un kit de amplificación de ADNc Marathon
(Clontech, Palo Alto, Estados Unidos) junto con un cebador
específico de gen CCAGACACC
CACGTGTGGCC, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se obtuvieron dos fragmentos diferentes (de \sim650 pb y \sim 800 pb). Los fragmentos se aislaron a partir de un gel de agarosa, se purificaron usando una columna de centrifugación Quaquick (Qiagen, Valencia, Estados Unidos) y se clonaron usando el kit pCR2.1TOPO (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos). Las colonias que contenían insertos se identificaron mediante PCR de colonias usando los cebadores específicos de gen CCAGACACCCACGTGTGGCC y AAGCCACCATGGACAGCAGGAGCAGTGGTG. Se realizó el análisis de secuencia de los clones positivos en un secuenciador ABI (Perkin Elmer, Norwalk, Estados Unidos).
CACGTGTGGCC, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se obtuvieron dos fragmentos diferentes (de \sim650 pb y \sim 800 pb). Los fragmentos se aislaron a partir de un gel de agarosa, se purificaron usando una columna de centrifugación Quaquick (Qiagen, Valencia, Estados Unidos) y se clonaron usando el kit pCR2.1TOPO (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos). Las colonias que contenían insertos se identificaron mediante PCR de colonias usando los cebadores específicos de gen CCAGACACCCACGTGTGGCC y AAGCCACCATGGACAGCAGGAGCAGTGGTG. Se realizó el análisis de secuencia de los clones positivos en un secuenciador ABI (Perkin Elmer, Norwalk, Estados Unidos).
Inicialmente, se aisló un plásmido que
codificaba una forma truncada de COASTER (pACT2.COASTER\Delta,
aminoácidos 1-234) en la exploración de doble
híbrido en levaduras. El inserto de este plásmido se clonó en el
vector de expresión de células de mamíferos pCDNA3.1HISA
(Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) para dar el plásmido
pCDNA3.1HISA.COASTER\Delta. Se obtuvo un plásmido que contenía el
extremo 3' del ADNc de COASTER de Incyte Genomics (Palo Alto,
Estados Unidos). Este plásmido (Incyte clon ID 2905757) se digirió
con SacI/NotI. El extremo 5' del COASTER (aminoácidos 1 a
332) se amplificó por PCR sobre ADNc Marathon Ready de testículo
humano (Clontech, Palo Alto, Estados Unidos, nº cat.
7414-1) usando los cebadores
CTAGGTACCGGACAGCAGGAGCAGTGGT
GC (SEC ID 15) y GGCAGTGAGCTCCATGTGGG (SEC ID 16) (los sitios de restricción están subrayados). El producto de PCR resultante se digirió con KpnI y SacI y se ligó junto con el fragmento de restricción Sacl-NotI en el vector pCDNA3.1HISC digerido con KpnI-NotI (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos). El último plásmido se denominó pCDNA3.1HIS.COASTER. Para los estudios de transfección, las regiones codificantes de proteína de los ADNc para los receptores de estrógenos \alpha y \beta humanos y para el receptor de glucocorticoides se insertaron en el vector de expresión de mamíferos pNGV1 (número de acceso X99274). La región codificante de proteína del receptor de progesterona se insertó en el vector de expresión de mamíferos pKCRE (Stam et al., Eur. J. Pharmacol. 227, 153). El plásmido indicador pMMTV-LUC se construyó por modificación del vector pManMneoLUC (Clontech, Palo Alto, Estados Unidos). El casete de neomicina se eliminó por digestión con endonucleasas de restricción HindIII/BamHI, seguido de generación de extremos romos con polimerasa Klenow y ligación mediante ADN ligasa T4. El vector indicador 4ERE.TATALuc contiene un gen de luciferasa bajo el control de cuatro elementos de respuesta a estrógenos (ERE) y se obtuvo por cortesía de P. v. d. Saag (Nederlands Instituut voor Ontwikkelingsbiologie, Utrecht, Holanda). Se construyó un plásmido de expresión de mamíferos para GRIP1 mediante digestión de restricción de pGRIP1 (por cortesía de M. Stallcup, Universidad del Sur de California, Estados Unidos) con EcoRI y BamHI. El fragmento resultante se ligó en el vector pCDNA3.1HISC digerido con EcoRI/BamHI para dar el plásmido pCDNA3.1HIS.GRIP1.
GC (SEC ID 15) y GGCAGTGAGCTCCATGTGGG (SEC ID 16) (los sitios de restricción están subrayados). El producto de PCR resultante se digirió con KpnI y SacI y se ligó junto con el fragmento de restricción Sacl-NotI en el vector pCDNA3.1HISC digerido con KpnI-NotI (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos). El último plásmido se denominó pCDNA3.1HIS.COASTER. Para los estudios de transfección, las regiones codificantes de proteína de los ADNc para los receptores de estrógenos \alpha y \beta humanos y para el receptor de glucocorticoides se insertaron en el vector de expresión de mamíferos pNGV1 (número de acceso X99274). La región codificante de proteína del receptor de progesterona se insertó en el vector de expresión de mamíferos pKCRE (Stam et al., Eur. J. Pharmacol. 227, 153). El plásmido indicador pMMTV-LUC se construyó por modificación del vector pManMneoLUC (Clontech, Palo Alto, Estados Unidos). El casete de neomicina se eliminó por digestión con endonucleasas de restricción HindIII/BamHI, seguido de generación de extremos romos con polimerasa Klenow y ligación mediante ADN ligasa T4. El vector indicador 4ERE.TATALuc contiene un gen de luciferasa bajo el control de cuatro elementos de respuesta a estrógenos (ERE) y se obtuvo por cortesía de P. v. d. Saag (Nederlands Instituut voor Ontwikkelingsbiologie, Utrecht, Holanda). Se construyó un plásmido de expresión de mamíferos para GRIP1 mediante digestión de restricción de pGRIP1 (por cortesía de M. Stallcup, Universidad del Sur de California, Estados Unidos) con EcoRI y BamHI. El fragmento resultante se ligó en el vector pCDNA3.1HISC digerido con EcoRI/BamHI para dar el plásmido pCDNA3.1HIS.GRIP1.
Se obtuvieron células U-2 OS de
ATTC (HTB-96) y se mantuvieron a 37ºC en una
atmósfera humidificada (CO_{2} al 5%) como un cultivo en monocapa
en medio M505 sin rojo fenol. El último medio consiste en una mezcla
de medio de Eagle modificado por Dulbecco (1:1) (DMEM, Gibco BRL,
Breda, Holanda) y medio de nutrientes F12 (F12 de Ham, Gibco BRL,
Breda, Holanda) suplementados con carbonato sódico 2,5 mg/ml,
piruvato sódico 55 \mug/ml,
\beta-mercaptoetanol 2,3 \mug/ml, etanolamina
1,2 \mug/ml, L-glutamina 360 \mug/ml, selenito
sódico 0,45 \mug/ml, estreptomicina 62,5 \mug/ml y suero de
ternero bovino tratado con carbón vegetal al 5% (Hyclone). Se
sembraron 1\cdot10^{5} células en placas de cultivo de tejidos
de 24 pocillos y se introdujo ADN mediante el uso de lipofectina
(Gibco BRL, Breda, Holanda). Con este fin, se mezclaron ADN
plasmídicos en 62,5 \mul de Optimen (Gibco BRL, Breda, Holanda)
con un volumen igual de reactivo de lipofectina diluido (1,75 \mul
de lipofectina en 62,5 \mul de Optimem) y se dejaron reposar a
temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavar las
células una vez con medio M505 sin suero, se añadieron 250 \mul de
Optimem junto con la mezcla de ADN-lipofectina a
las células. Después de la incubación durante un periodo de 5 horas
a 37ºC (CO_{2} al 5%) las células se lavaron una vez con medio
M505 suplementado con suero de ternero bovino tratado con carbón
vegetal al 5% y se añadieron hormonas al medio. Las células se
incubaron durante una noche a 37ºC. Al día siguiente, las células
se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y
se prepararon extractos celulares por adición de 75 \mul de
tampón de lisis (tampón fosfato 0,1 M a pH 7,8, Triton
X-100 al 0,2%). Después de la incubación durante 5
min a temperatura ambiente, se añadió una alícuota de 30 \mul a
50 \mul de reactivo de ensayo luciferasa (Promega; Wisconsin,
Estados Unidos). Se midió la emisión de luz usando un Victor
Instrument (Perkin Elmer, Norwalk, Estados Unidos).
Se digirió el plásmido
pCDNA3.1HISA.COASTER\Delta con EcoRI y XbaI para
generar una sonda (nucleótidos 183-928). El
fragmento de ADN se marcó con [\alpha^{32}P]dCTP con
perlas de marcaje de ADN Ready-To Go siguiendo las
instrucciones del fabricante (Pharmacia). Se hibridaron
transferencias de Northern de múltiples tejidos humanos (Clontech,
Palo Alto, Estados Unidos, nº cat. 7760-1 y
7759-1) con el fragmento de ADN marcado con
\alpha^{32}PdCTP (véanse los protocolos básicos R1.5). Las
transferencias de Northern se lavaron usando las siguientes
condiciones de lavado: SSC 2X/SDS al 0,1% a 65ºC dos veces durante
30 min y SSC 1x/SDS al 0,1% a 65ºC una vez durante 15 min.
Se preparó ADNc usando 2 \mug del ARN total
aislado a partir de varias líneas celulares humanas usando RNAzol B
(Cinna/Biotecx), usando el kit SuperscriptII (BRL). Se usó una
porción de ADNc para la amplificación específica por PCR de COASTER
(cebadores directo TGAGGCATCTGAGTCAACA e inverso
CGAGCCAGAGTTAAAGCA). Se tomaron muestras después de 20, 25, 30 y 35
ciclos de PCR. Las muestras de PCR se analizaron en geles de agarosa
al 1,5%. Las imágenes en gel se cuantificaron con Imagequant 5.0
(Molecular dynamics).
Se usó un TnT Coupled Reticulocyte Lysate
Systems (Promega, Madison, Estados Unidos, nº cat. L5020) para la
transcripción y traducción in vitro de COASTER a partir de un
molde de pCDNA3.1HISC.COASTER en presencia de
[^{35}S]-metionina, siguiendo las instrucciones
que se proporcionan con el lisado. Se analizó un fragmento de
SRC-1 codificado por el plásmido
pBK-SRC-1 (Onate et al.,
Science 270, 1354-1357) en paralelo como control.
Se separaron las proteínas marcadas mediante
SDS-PAGE y se visualizaron mediante
autorradiografía.
<110> Akzo Nobel N.V.
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<120> COACTIVACIÓN DE RECEPTORES
NUCLEARES
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<130> 2000, 569WO
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<140>
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<141>
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP202905.6
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<151>
21-08-2000
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP1201771.1
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<151>
14-05-2001
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<160> 16
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 4999
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 4999
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 5144
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 5144
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 3042
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 3042
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 1013
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 1013
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 3183
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\newpage
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 3183
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 1061
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 1061
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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<210> 14
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador
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<400> 15
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<210> 16
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador
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<400> 16
Claims (10)
1. Una proteína caracterizada porque la
proteína se selecciona del grupo constituido por:
a) una proteína que consiste en una secuencia de
aminoácidos como en las SEC ID 7, 8, 11 ó 12 o la secuencia de los
aminoácidos número 1 a 234 de la SEC ID 7 u 8; y
b) una proteína que consiste en una secuencia de
aminoácidos que tiene una similitud de al menos el 90% con la
secuencia de los aminoácidos 1 a 234 de la SEC ID 7 u 8, calculada
usando la matriz de similitud blosum62 y el algoritmo de Needleman
y Wunsch.
2. Uso de un polinucleótido que codifica una
proteína seleccionada del grupo constituido por:
a) una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos como en las SEC ID 7, 8, 11 ó 12 o la secuencia de los
aminoácidos número 1 a 234 de la SEC ID 7 u 8;
b) una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos que tiene una similitud de al menos el 90% con la
secuencia de las SEC ID 7, 8, 11 ó 12; y
c) una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos que tiene una similitud de al menos el 90% con la
secuencia de los aminoácidos número 1 a 234 de la SEC ID 7 u 8;
produciendo la expresión del
polinucleótido en un sistema que también comprende un receptor
nuclear
sensible.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en
un ensayo para la unión de la proteína con el receptor nuclear
sensible.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 2 ó
3, caracterizado porque el receptor nuclear sensible es un
receptor de progestágenos, un receptor de estrógenos o un receptor
de glucocorticoides.
5. Un sistema, que no sea humano, en el que se
introduce un polinucleótido y puede producirse su expresión y que
además comprende un receptor nuclear sensible, caracterizado
porque el polinucleótido codifica una proteína selecciona del grupo
constituido por:
a) una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos como en las SEC ID 7, 8, 11 ó 12 o la secuencia de los
aminoácidos número 1 a 234 de la SEC ID 7 u 8;
b) una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos que tiene una similitud de al menos el 90% con la
secuencia de las SEC ID 7, 8, 11 ó 12; y
c) una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos que tiene una similitud de al menos el 90% con la
secuencia de los aminoácidos número 1 a 234 en la SEC ID 7 u 8.
6. Un método in vitro para determinar el
grado de modulación de la actividad transcripcional promovida por
un receptor nuclear sensible y un coactivador seleccionado del grupo
constituido por:
a) una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos como en las SEC ID 7, 8, 11 ó 12 o la secuencia de los
aminoácidos número 1 a 234 en la SEC ID 7 u 8;
b) una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos que tiene una similitud de al menos el 90% con la
secuencia de las SEC ID 7, 8, 11 ó 12; y
c) una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos que tiene una similitud de al menos el 90% con la
secuencia de los aminoácidos número 1 a 234 de la SEC ID 7 u 8;
en un sistema de acuerdo con la
reivindicación 5, que
comprende:
a) la adición de un agente al sistema;
b) cuantificar el grado de modulación.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6,
caracterizado porque el receptor nuclear sensible es un
receptor de progestágenos, un receptor de estrógenos o un receptor
de glucocorticoides.
8. Un método para la exploración in vitro
de agentes para influir en la unión entre un receptor nuclear
sensible y un coactivador seleccionado del grupo constituido
por:
a) una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos como en las SEC ID 7, 8, 11 ó 12 o la secuencia de los
aminoácidos número 1 a 234 en la SEC ID 7 u 8;
b) una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos que tiene una similitud de al menos el 90% con la
secuencia en las SEC ID 7, 8, 11 ó 12; y
c) una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos que tiene una similitud de al menos el 90% con la
secuencia de los aminoácidos número 1 a 234 en la SEC ID 7 u 8;
que comprende comparar la unión
entre el receptor nuclear sensible y el coactivador en presencia y
en ausencia del
agente.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8,
caracterizado porque el receptor nuclear sensible es un
receptor de progestágenos, un receptor de estrógenos o un receptor
de glucocorticoides.
10. Un método in vitro para el
diagnóstico de enfermedades relacionadas con receptores nucleares
sensibles que comprende realizar un ensayo para determinar la
hibridación cuantitativa con ARN con un polinucleótido marcado o
con fragmentos del mismo, caracterizado porque el
polinucleótido tiene una secuencia que tiene una similitud de al
menos el 90% con una o más de las secuencias de la lista que
consiste en las SEC ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9 y 10, y en la que el
porcentaje de homología se define, después del alineamiento óptimo
de las secuencias usando el algoritmo de Needleman y Wunsch, como
el número de restos idénticos entre las dos secuencias dividido por
la resta de la longitud de secuencia alineada menos la longitud de
todos los huecos.
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