ES2260548T3 - Procedimiento para el ensayo del efecto hormonal de ciertas sustancias. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para ensayar el efecto hormonal, en particular el efecto andrógeno o antiandrógeno, de ciertas sustancias, en el que a) unas células, que son transfectadas con dos vectores, conteniendo uno de los vectores un ADN, que codifica una proteína de receptor nuclear o un fragmento de la misma, que tiene las propiedades funcionales de la proteína de receptor nuclear, y conteniendo el otro vector un ADN, que codifica el co-modulador FOXG1C (Genbank XM_007233) o un fragmento del mismo, que tiene las propiedades funcionales del co-modulador, se someten a la acción de la sustancia, y b) la actividad de transcripción, que desencadena el receptor nuclear o su fragmento, que tiene las propiedades funcionales del receptor, en presencia del co- modulador o de su fragmento, que tiene las propiedades funcionales del co-modulador, y/o la influencia de la sustancia sobre la interacción entre el receptor o su fragmento, que tiene las propiedades funcionales del receptor, y el co-modulador o su fragmento, que tiene las propiedades funcionales del co-modulador, se mide mediante la interacción de una proteína con otra proteína o la interacción de una proteína, otra proteína y un ADN.

Description

Procedimiento para el ensayo del efecto hormonal de ciertas sustancias.

El invento se refiere a un procedimiento para el ensayo del efecto hormonal de ciertas sustancias y a un procedimiento para la determinación de trastornos en el mecanismo de co-modulación de receptores de andrógenos por el co-activador denominado Forkhead Box G1C (FOXG1C).

En la evaluación de ciertas sustancias para una posible aplicación farmacéutica es por lo general usual probar estas sustancias para descubrir un eventual efecto hormonal, en particular para descubrir una actividad andrógena o antiandrógena posiblemente presente. Al realizar la administración de sustancias eficaces farmacológicamente presentan importancia en algunos casos los conocimientos acerca de efectos hormonales, en particular efectos andrógenos o antiandrógenos, de estas sustancias, puesto que éstos pueden provocar efectos colaterales indeseados en el paciente. Para la prueba del efecto hormonal de ciertas sustancias pasan a emplearse en particular unos procedimientos, en los cuales se mide la capacidad de las sustancias para fijarse a los receptores de hormonas y activar su actividad de transcripción.

Sin embargo, los conocimientos acerca de efectos hormonales de ciertas sustancias presentan interés no solamente en el caso de potenciales fármacos sino también en el caso de sustancias no farmacéuticas, puesto que de muchas sustancias presentes en el medio ambiente se supone que pueden tener, en partes de la población, una actividad andrógena o antiandrógena y respectivamente estrógena o antiestrógena. Posiblemente, se provoca de esta manera un indeseado efecto dañino.

Existe, por lo tanto, una necesidad muy considerable de un procedimiento con el que, de una manera confiable, sensible, sencilla, barata y rápida, se pueda efectuar una declaración acerca del efecto hormonal de ciertas sustancias. Los procedimientos conocidos hasta ahora no cumplen este objetivo.

El presente invento se basa por lo tanto en la misión de poner a disposición un procedimiento, con el cual, de un modo confiable, sensible, sencillo, barato y rápido, se pueda efectuar una declaración acerca del efecto hormonal de las sustancias que se han de ensayar.

Conforme al invento, esto se consigue, de una manera sorprendente, mediante un procedimiento para ensayar el efecto hormonal, en particular el efecto andrógeno o antiandrógeno, de ciertas sustancias, en el que

a) unas células, que son transfectadas con dos vectores, conteniendo uno de los vectores un ADN que codifica una proteína de receptor nuclear o un fragmento de la misma, en particular una proteína de receptor nuclear humano o un fragmento de la misma, y conteniendo el otro vector un ADN que codifica el co-modulador FOXG1C o un fragmento del mismo, se someten a la acción de la sustancia, y

b) la actividad de transcripción, que desencadena el receptor nuclear o su fragmento, en presencia del co-modulador o de su fragmento, y/o la influencia de la sustancia sobre la interacción entre el receptor o su fragmento y el co-modulador o su fragmento, se mide mediante la interacción de una proteína con otra proteína o la interacción de una proteína, otra proteína y un ADN.

Se encontró, de modo sorprendente, que con el procedimiento conforme al invento se puede ensayar, de un modo confiable, sensible, sencillo, rápido y barato, si ciertas sustancias, que pueden ser por ejemplo relevantes para el medio ambiente o de interés farmacológico, ejercen un efecto hormonal, en particular un efecto andrógeno o antiandrógeno.

En el procedimiento conforme al invento, se emplean células transformadas con un vector, teniendo los vectores un ADN que codifica una proteína de receptor nuclear o un fragmento de la misma.

La superfamilia de los receptores nucleares (NRs, de Nuclear Receptors), a la que pertenecen más de 50 diferentes proteínas, es un grupo de factores de transcripción afines que controlan la transcripción de respectivo gen diana como reacción a ligandos específicos, p.ej. hormonas. La familia se puede subdividir, de acuerdo con determinadas características, tales como, p.ej., el estado de dimerización, el tipo del ligando o la estructura del elemento de reacción al ADN, en varias subfamilias (Beato y colaboradores, 2000, Human Reproduct. Update, 6, 225-236). Una particularidad característica de los NRs es la estructura coincidente de los dominios funcionales (con las denominaciones A hasta F) con una región terminal en N fuertemente variable, sólo débilmente conservada, con una función de activación constitutiva autónoma (AF-1), con un dominio de fijación a ADN (DBD de DNA Bindung Domäne) fuertemente conservado, que es responsable del reconocimiento de elementos especiales de reacción a ADN y que consiste en dos motivos de dedo de zinc, en un dominio de bisagra variable y en un dominio de fijación a ligando (LBD de Ligand Bindung Domäne) terminal en C, multifuncional y conservado, con una función de transactivación (AF-2) dependiente de la dimerización y del ligando. A continuación de esto, sigue la región situada más lejana en el terminal de C, cuya función no es conocida y que falta en el caso de receptores tales como p.ej. el PR (de Progesteron Receptor = receptor de progesterona), el PPAR (de Peroxisom Proliferator aktivierter receptor = receptor activado por proliferadores de peroxisomas) y RXR (de Retinoid X Receptor = receptor X de retinoides) (Mangelsdorf & Evans, 1995; Cell, 83, 841-850; Robyr y colaboradores, 2000, Mol. Endocrinol., 14, 329-347). Para algunos NRs (p.ej. el receptor de andrógenos (AR de Androgen Rezeptor) se comprobó que la región terminal de N está en situación de interactuar con la región terminal de C (Brinkmann y colaboradores, 1999, J. Steroid Biochem. and Mol. Biol., 69, 307-313). Los receptores de hormonas esteroides, tales como p.ej. los receptores de estrógenos (ER), de progesterona (PR), glucocorticoides (GR), mineralocorticoides (MR) y andrógenos (AR), fijan a ligandos esteroideos, que se derivan de pregnenolona, tales como las progestinas, los estrógenos, los glucocorticoides y los mineralocorticoides, así como a andrógenos. La fijación a un ligando activa al receptor y controla la expresión de correspondientes genes
dianas.

Tal como se expuso precedentemente, en la etapa a) del procedimiento conforme al invento se utilizan unas células, que además contienen un vector, el cual contiene un ADN que codifica el co-modulador FOXG1C o un fragmento del mismo.

Los denominados co-moduladores son una clase de proteínas que, al realizar la activación (co-activadores) y respectivamente la represión (co-represores) de la transcripción de genes sirven como moléculas de puente entre el complejo de iniciación de la transcripción y los NRs (McKenna y colaboradores, 1999, Endocr. Rev., 20, 321-347). Un co-activador debe ser capaz de reforzar la función de los receptores y, en presencia de un agonista, de interactuar directamente con el dominio de activación de los NRs. Éste debe interactuar también con el aparato de transcripción basal, y finalmente no debe reforzar por sí mismo la actividad de transcripción basal. La mayor parte de los co-moduladores interactúan con ayuda de uno o varios motivo(s) LXXLL (cajas de NR) con el dominio AF-2 de los NRs, pero se describieron también algunos co-moduladores, que interactúan con otras regiones de NR (Ding y colaboradores, 1998, Mol. Endocrinol., 12, 302-313). Además, se identificaron muchos co-moduladores, que interactúan de una manera similar con varios diferentes NRs, por lo que de una manera más favorable se debería ensayar el grado de especificidad de cada co-modulador.

En el procedimiento conforme al invento, se emplea el co-modulador designado por FOXG1C o el fragmento de FOXG1C que tiene los aminoácidos 175 hasta 489. Se describió la secuencia de ADNc (ADN cromosómico) (Genbank (banco de genes) XM_007233) y ésta codifica 489 aminoácidos (Li & Vogl, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 4490-4494). Un clon DH5 alfa de E. coli, que contiene un plásmido que codifica los aminoácidos 175-489 de FOXG1C, se depositó bajo el número DSM 15043 el 5 de Junio de 2002 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección alemana para microorganismos y cultivos celulares).

En el caso de utilizarse estas proteínas, el procedimiento conforme al invento se puede llevar a cabo de una manera especialmente confiable, sensible, sencilla, barata y rápida. Además, los fragmentos de FOXG1C, en particular el fragmento de FOXG1C que tiene los aminoácidos 175 a 489, presentan la ventaja de que son manipulables y clonables con mayor facilidad, pero todavía presentan las propiedades funcionales del FOXG1C.

En el caso del FOXG1C se trata de un co-activador para el receptor humano de andrógenos y para otros receptores nucleares, que refuerza la interacción entre un andrógeno y el receptor. La secuencia de FOXG1C ya ha sido descrita en el Genbank XM_007233; no obstante, no se indica allí ninguna interacción con receptores nucleares, en particular con el AR. El presente invento se basa en el sorprendente reconocimiento de que se presenta una interacción entre receptores nucleares, en particular el AR, por una parte, y el FOXG1C, por otra parte, así como se pudo comprobar un refuerzo de la transactivación mediada por el AR. El FOXG1C es una proteína que funciona como co-mediadora, al reforzar o reprimir el efecto de transcripción después de una fijación de esteroides al receptor nuclear, y además de ello favorece la fijación y la activación del receptor nuclear a moléculas, a las que con anterioridad no se atribuía ningún efecto hormonal.

La proteína FOXG1C constituye un co-activador para el receptor de andrógenos y para otros receptores nucleares, tales como el receptor \alpha de estrógenos, el receptor \beta de estrógenos, el receptor A de progesterona, el receptor B de progesterona, el receptor de glucocorticoides, el receptor de mineralocorticoides, el receptor de la hormona tiroidea, el receptor de vitamina D, el receptor activado por proliferadores de peroxisomas, el receptor de ácido retínico, el receptor X de retinoides y receptores huérfanos; en el procedimiento conforme al invento, estos receptores se emplean de una manera preferente, puesto que con ellos se pueden conseguir de una manera especialmente favorable las precedentes ventajas del procedimiento conforme al invento.

En el procedimiento conforme al invento se pueden emplear también vectores, que codifican fragmentos de las precedentes proteínas. Bajo la expresión de "fragmentos" en conexión con las precedentes proteínas se entienden los que tienen un aminoácido o varios aminoácidos menos que las proteínas en su plena longitud, y que presentan todavía las propiedades funcionales de un receptor nuclear o de un co-modulador.

Tal como ya se ha señalado precedentemente, en el procedimiento conforme al invento se emplean, en la etapa a), unas células que son transfectadas con dos vectores, que contienen un ADN que codifica proteínas especiales. Estas células están por lo tanto en situación de expresar estas dos proteínas diferentes.

Preferiblemente, las células son linajes celulares establecidos y/o células eucarióticas, en particular células de próstata, células nerviosas, células de glia, fibroblastos, células sanguíneas (glóbulos), osteoblastos, osteoclastos, hepatocitos, células epiteliales o células musculares. Con los linajes celulares consagrados, el procedimiento conforme al invento se puede llevar a cabo de una manera especialmente barata y rápida. En el caso de utilizarse células eucarióticas, en particular las células eucarióticas precedentemente expuestas, se pueden obtener con el procedimiento conforme al invento, de una manera ventajosa, resultados de valor informativo especialmente grande.

En una forma preferida de realización del procedimiento conforme al invento, se emplean vectores de expresión eucarióticos, p.ej. pCMX o pSG5. En el caso de la utilización de estos vectores, en particular en vinculación con los precedentes linajes celulares consagrados y/o las precedentes células eucarióticas, el procedimiento conforme al invento se puede llevar a cabo de una manera especialmente favorable y rápida, y se obtienen resultados de valor informativo especialmente grande.

Un experto en la especialidad conoce procedimientos, y materiales necesarios para ellos, a fin de introducir el ADN que codifica las precedentes proteínas dentro de un vector, luego incorporar éste en las células y cultivar las células así obtenidas en apropiadas condiciones de cultivo, para que éstas puedan expresar estas proteínas.

De acuerdo con la etapa b) del procedimiento conforme al invento, se puede medir la actividad de transcripción, que el receptor nuclear o su fragmento desencadena en presencia del co-modulador o de su fragmento. Esto puede efectuarse por ejemplo por medio de la detección de un gen reportero.

Los genes reporteros son genes o fragmentos de genes, que se acoplan con otros genes o con secuencias reguladoras, a fin de hacer detectable la actividad de estas secuencias. Los genes reporteros generan productos génicos, que son detectables de una manera lo más sencilla posible, p.ej. fotométricamente mediante reacciones cromáticas. Genes reporteros frecuentemente utilizados son el gen para la \beta-galactosidasa, el gen para la fosfatasa alcalina, el gen para la acetil-transferasa de cloramfenicol, el gen para la dioxigenasa de catecol, el gen para la proteína fluorescente verde ("green fluorescent protein"), así como diferentes genes de luciferasas, que pueden hacer que las células se iluminen.

Tales genes reporteros se pueden incorporar en las células asimismo mediante vectores, en particular vectores de expresión eucarióticos. Un ejemplo de un vector, que contiene un ADN que codifica un gen reportero, es el vector de la luciferasa del MMTV (virus de tumor mamario murino), que se emplea para la medición del efecto andrógeno de ciertas sustancias.

Las sustancias con un efecto hormonal, en particular con un efecto andrógeno o antiandrógeno, son reconocibles entonces por la actividad aumentada o respectivamente disminuida del gen reportero.

La medición de la influencia de la sustancia en ensayo sobre la interacción entre el receptor o su fragmento y el co-modulador o su fragmento se puede efectuar también por medio de una determinación de la interacción entre una proteína y otra proteína, p.ej. mediante sistemas doblemente híbridos, mediante precipitación inmunitaria, mediante ensayos de GST-Pull-down (de degradación del GST), mediante el análisis FRET y mediante el análisis ABCD, así como mediante determinación de la interacción entre una proteína, otra proteína y un ADN, tal como mediante ensayos de retardación en gel.

Se encontró, además, que el FOXG1C se puede utilizar muy bien como indicador de enfermedades debidas a andrógenos. Enfermedades relevantes debidas a andrógenos, tales como p.ej. cáncer de próstata, disfunción eréctil, infertilidad, formación de calvas, acné o hipogonadismo, así como el síndrome de resistencia a andrógenos, tal como p.ej. la feminización testicular, se basan en defectos en el mecanismo de co-modulación entre un AR y el FOXG1C, al igual que trastornos de la libido, de la situación de la sensibilidad y en el caso de trastornos cognitivos. Una posibilidad en el caso de pacientes con tales trastornos consiste por consiguiente en la medición de las concentraciones relativas de AR y de FOXG1C, efectuándose esta medición de una manera favorable extracorporalmente en líquidos corporales, células corporales o tejidos corporales. Esto es posible mediante aplicación de procedimientos cuantitativos para la medición de las cantidades relativas de ambas moléculas en el respectivo paciente, en los cuales se pueden emplear por ejemplo anticuerpos tanto contra AR como también contra FOXG1C, o sondas de ácidos nucleicos contra el ARNm (ARN mensajero) de éstos. Existen varios procedimientos para la medición de estas tasas comparativas, que son conocidos para un experto en la especialidad; también, éste conoce materiales y dispositivos apropiados para ello, tales como un radioinmunoensayo, un ensayo de ELISA, una tinción inmunitaria, una RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa), una transferencia de borrón Western, una transferencia de borrón Northern, un chip de ADN o un chip de proteína. Además de ello, es posible, con ayuda del ADNc del FOXG1C, construir de un modo usual sondas para un ensayo de PCR, con el que, en el caso de determinados pacientes, se pueden detectar mutaciones de la secuencia normal de un ADN o se pueden generar transcritos para el ensayo de transferencia de borrón Northern, o respectivamente un ADN para ensayos de hibridación in situ.

La relación medida de AR a FOXG1C puede ser en tal caso mayor o menor que en el caso de personas sanas. El valor normal existente en personas sanas, se puede determinar de una manera sencilla, por ejemplo mediante el recurso de que se promedia la relación de AR a FOXG1C en un gran número de voluntarios sanos. Mediante la comparación del valor normal con la relación determinada de AR a FOXG1C en el paciente que se ha de investigar, se puede comprobar si el valor para la relación determinada es mayor o menor que el valor normal.

Puesto que la concentración de FOXG1C y/o AR en un tejido puede ser diversa, p.ej. la concentración de FOXG1C en el cerebro y en los testículos es muy grande, al contrario de lo cual es muy pequeña en otros órganos, tales como el hígado, el corazón, el timo y la próstata, han de tomarse en cuenta para la evaluación las diferentes concentraciones de tejidos, es decir que el valor de ensayo y el valor normal deben proceder del mismo tejido. Puesto que en el caso de la concentración también pueden presentarse diferencias entre especies, éstas han de tomarse en consideración también al realizar la evaluación.

Otra posibilidad para la determinación de defectos en el mecanismo de co-modulación entre un AR y el FOXG1C puede consistir en medir solamente la concentración de FOXG1C, partiéndose en tal caso del hecho de que la concentración de FOXG1C es por lo menos aproximadamente constante. Si en el presente caso se ha medido una concentración de FOXG1C menor que la normal, esto quiere decir que se ha desplazado la relación de AR a FOXG1C, lo cual a su vez apunta como indicio a una perturbación en el mecanismo de co-modulación.

Es por lo tanto posible, con una sonda específica para FOXG1C, determinar modificaciones en la expresión de FOXG1C y por consiguiente en la relación con AR. Tales modificaciones pueden estar implicadas causalmente en el caso de diferentes cuadros morbosos o pueden aparecer como un fenómeno de secuela.

Tales mediciones de la relación de AR/FOXG1C se basan en el reconocimiento, sorprendente y que se basa en el hallazgo y la caracterización de FOXG1C, de que por ejemplo un síndrome de resistencia a andrógenos puede ser debido a un trastorno del equilibrio entre la prevalencia de AR y la de FOXG1C en las células dianas. Una cantidad demasiado grande de FOXG1C podría conducir a una hipersensibilidad del sistema de AR, de manera tal que éste reacciona a moléculas, que normalmente no tienen ningún efecto andrógeno. A la inversa, la falta, o una función ausente, de FOXG1C conduce en todos los planos a la resistencia a andrógenos. La detección de una cantidad demasiado grande de FOXG1C en el caso de un paciente hablaría en favor de la utilización de medios para la regulación en sentido descendente, tal como p.ej. medicamentos antisentido o similares, con el fin de reducir en condiciones clínicas el título de FOXG1C en el respectivo paciente. Lo mismo se puede conseguir mediante moléculas que están en situación de inhibir la interacción entre AR y FOXG1C. Si un paciente tiene demasiado poca cantidad de FOXG1C, se le puede aportar el ADNc, la proteína o el ADN de FOXG1C a través de diferentes mecanismos de por sí conocidos, con el fin de elevar de esta manera el título del FOXG1C activo. Es posible también una elevación de la concentración o de la actividad de FOXG1C mediante medicamentos de bajo peso molecular o mediante estimulación de la síntesis propia con ayuda de específicas proteínas de promotores de FOXG1C.

El invento se explica con más detalle haciendo referencia a las siguientes Figuras, en las que

la Figura 1 es una representación esquemática del receptor de andrógenos con caracterización del dominio de receptor de andrógenos (AR 2) que se extiende desde los aminoácidos 325 hasta 919, el cual está capacitado para la interacción con FOXG1C en presencia de un andrógeno;

la Figura 2 representa la distribución en tejidos del FOXG1C, en 2a en diferentes tejidos (seres humanos y roedores), en 2b en diferentes regiones del cerebro humano y en 2c en el cerebro de ratas, de animales jóvenes y ancianos; y

la Figura 3 muestra la interacción del FOXG1C o del SRC-1a con el receptor de andrógenos en células PC3-ARwt.

Los siguientes Ejemplos ilustran con mayor detalle el invento, pero sin limitarlo a él.

Ejemplo 1

Mediando utilización de una biblioteca de ADNc procedente de un cerebro fetal (Clontech MATCHMAKER), y de un fragmento de AR humano, que codifica los aminoácidos desde 325 hasta 919, como una sonda (Figura 1), se llevó a cabo un escrutinio mediante un usual sistema de dos levaduras híbridas, en presencia del andrógeno DHT 10^{-6} M. En coincidencia con las instrucciones del fabricante (Clontech) el número de los clones escrutados fue de 2 x 10^{7}. El número de los clones independientes fue de 3,5 x 10^{6} según los datos del fabricante. De éstos se escogieron 300 clones positivos y se ensayaron mediante un ensayo con \beta-galactosidasa, confirmándose que 40 de ellos eran positivos para lacZ. Los insertos de estos clones fueron amplificados mediante una PCR. Mediante unos análisis con fragmentos de restricción y por secuenciación, se identificaron por lo menos 39 diferentes clones. Uno de ellos era un clon con un inserto que comprendía 1.553 pb (pares de bases) (739 pb - 2.292 pb) que codifica una parte del ORF (Open reading frame = marco de lectura abierto) del FOXG1C (número de acceso al Genbank, XM_007233).

El fragmento que consistía en 1.255 pb (963 pb - 2.218 pb) de la secuencia de ADNc del FOXG1C sirvió como sonda para borrones Northern humanos. Sendos transcritos (3,2 kb) se descubrieron en diferentes tejidos (Figura 2). Los borrones Northern se hibridaron eventualmente con una muestra de \beta-actina, con el fin de confirmar la carga eléctrica uniforme del gel.

La Figura 2 muestra la distribución en tejidos de FOXG1C, que se había investigado de una manera en sí conocida mediante un análisis por transferencia de borrones Northern. Un ARN poli-A+, aislado a partir de diferentes tejidos humanos (2 \mug), se separó con un gel de agarosa que contenía formaldehído, se transfirió un borrón a una membrana de nylon y se hibridó con un fragmento de ADNc de FOXG1C marcado (963 - 2.218 pb). Después del lavado, la membrana se colocó sobre una película y después de una iluminación se reveló. Tal como se puede deducir de la Figura 2a, en el cerebro y en los testículos de un ser humano se comprobó una expresión muy fuerte de FOXG1C, mientras que en roedores (una rata y un ratón) la expresión de FOXG1C está limitada en gran medida al cerebro. Además, la expresión de FOXG1C está disminuida o aumentada en segmentos de cerebros humanos (Figura 2b). En la Figura 2c, 10 \mug de un ARN (banda 1-3) o 0,2 \mug de un ARN poliA+ (banda 4-6) procedente de cerebros de ratas, se separaron sobre un gel, se transfirieron a una membrana y se hibridaron con un fragmento (963 - 2.218 pb) marcado de ADNc de FOXG1C. Los cerebros de ratas procedían de animales con una edad de 3 semanas (bandas 1 y 4), con una edad de 6 semanas (bandas 2 y 5) y con una edad de 2 años (bandas 3 y 6). De este modo se encontró una dependencia de la edad con la expresión del gen de FOXG1C.

El fragmento de ADNc de FOXG1C, de 739 pb hasta 2.218 pb (aminoácidos 175 - 489), cambiado de clon (transclonado) desde el vector de levadura, se clonó con las endonucleasas EcoRI y XbaI de un modo usual dentro del vector CMX-Vp16 y se transfectó, asimismo de un modo usual, con una luciferasa del MMTV en células PC3-ARwt, que expresan el AR.

Tal como se puede deducir de la Figura 3, la transfección transitoria de ADNc de FOXG1C se fusionó dentro del marco con el dominio de transactivación de Vp16 en células PC3-ARwt para dar una fuerte co-activación de la actividad de las señales de AR. Para esto, en una cubeta de cultivo de células, provista de cavidades con 3 x 10^{5} células por cavidad, se transfectó 1,0 \mug de plásmido de luciferasa MMTV con 0,43 \mug de la construcción artificial anterior en CMX-Vp16 o respectivamente, como testigo negativo, con 0,32 \mug de CMX-Vp16 o, como testigo positivo, 0,5 \mug de SRC1a-Vp16 como plásmido testigo, y después de 24 horas se trató con dihidroxi-testosterona (DHT) como andrógeno en las concentraciones indicadas. Las células transfectadas se cosecharon después de 24 horas adicionales y se midió la actividad de luciferasa en el gen reportero. Adicionalmente, para la normalización, se determinó la cantidad total de proteínas celulares. Por cada tanda de transfección y para cada concentración de sustancia, se llevaron a cabo dos experimentos y cada vez tres mediciones. La desviación de error se indicó como SD. La actividad se indica en unidades relativas.

Claims (8)

1. Procedimiento para ensayar el efecto hormonal, en particular el efecto andrógeno o antiandrógeno, de ciertas sustancias, en el que

a) unas células, que son transfectadas con dos vectores, conteniendo uno de los vectores un ADN, que codifica una proteína de receptor nuclear o un fragmento de la misma, que tiene las propiedades funcionales de la proteína de receptor nuclear, y conteniendo el otro vector un ADN, que codifica el co-modulador FOXG1C (Genbank XM_007233) o un fragmento del mismo, que tiene las propiedades funcionales del co-modulador, se someten a la acción de la sustancia, y

b) la actividad de transcripción, que desencadena el receptor nuclear o su fragmento, que tiene las propiedades funcionales del receptor, en presencia del co-modulador o de su fragmento, que tiene las propiedades funcionales del co-modulador, y/o la influencia de la sustancia sobre la interacción entre el receptor o su fragmento, que tiene las propiedades funcionales del receptor, y el co-modulador o su fragmento, que tiene las propiedades funcionales del co-modulador, se mide mediante la interacción de una proteína con otra proteína o la interacción de una proteína, otra proteína y un ADN.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, teniendo el fragmento del co-modulador, que tiene las propiedades funcionales del co-modulador, los aminoácidos 175 a 489 de FOXG1C (Genbank XM_007233).

3. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, seleccionándose el receptor nuclear entre un receptor de andrógeno, un receptor \alpha de estrógenos, un receptor \beta de estrógenos, un receptor A de progesterona, un receptor B de progesterona, un receptor de glucocorticoides, un receptor de mineralocorticoides, un receptor de hormona tiroidea, un receptor de vitamina D, un receptor activado por proliferadores de peroxisomas, un receptor de ácido retínico, un receptor X de retinoides X y receptores huérfanos.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, siendo las células linajes celulares consagrados y/o células eucarióticas.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, seleccionándose las células eucarióticas entre células de próstata, células nerviosas, células de glia, fibroblastos, células sanguíneas, osteoblastos, osteoclastos, hepatocitos, células epiteliales o células musculares.

6. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, siendo el vector un vector de expresión eucariótico.

7. Procedimiento para la determinación de trastornos en el mecanismo de co-modulación entre receptores de andrógenos y el FOXG1C (Genbank XM_007233), midiéndose las concentraciones del FOXG1C o de un fragmento del mismo, que tiene las propiedades funcionales del FOXG1C, y/o de un receptor de andrógenos o un fragmento del mismo, que tiene las propiedades funcionales del receptor de andrógenos.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, efectuándose la medición de la concentración mediante un radioinmunoensayo, ensayos de ELISA, una tinción inmunitaria, una RT-PCR, una transferencia de borrón Western, una transferencia de borrón Northern, un chip de ADN o un chip de proteína.