ES2302845T3 - Factor de crecimiento dimerizado y materiales y metodos para producirlo. - Google Patents

Abstract

Una proteína que consta de dos cadenas de polipéptidos, cada una de cuyas cadenas consta, desde el amino terminal hasta el carboxilo terminal, de los siguientes segmentos ligados operablemente: donde: P1-P2-h-CH2-CH3; P1-P2-CH2-CH3; h-CH2-CH3-P2-P1; o CH2-CH3-P2-P1; P1 es un primer segmento polipeptídico como se muestra en la SEC. ID. N.º 2 o la SEC. ID. N.º 4, desde el aminoácido x hasta el aminoácido y, donde x es un número entero del 246 al 258, inclusive; e y es un número entero del 365 al 370, inclusive; P2 es un segundo segmento polipeptídico que consta de entre 4 y 20 residuos de aminoácidos; h es una región bisagra de inmunoglobulina o una porción de la misma, y que opcionalmente comprende un residuo de cisteína; y CH2 y CH3 son dominios CH2 y CH3 de una cadena pesada de inmunoglobulina, respectivamente, donde las citadas dos cadenas de polipéptidos están unidas por una o más uniones disulfuro, donde cada una de las cadenas es opcionalmente glucosilada.

Description

Factor de crecimiento dimerizado y materiales y métodos para producirlo.

Antecedentes de la invención

El PDGF-D es un miembro recientemente descubierto de la familia del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (platelet derived growth factor, PDGF) (Bergsten et al., Nature Cell Biol. 3:512-516, 2001; LaRochelle et al., Nature Cell Biol. 3:517-521, 2001). El PDGF-D también se denomina "zvegf4" (Publicación de la WIPO WO 00/66736).

El polipéptido del PDGF-D posee una estructura multidominio que comprende un dominio CUB amino terminal y un dominio de factor de crecimiento carboxilo terminal unidos por una región interdominio de aproximadamente 70 residuos de aminoácidos. El dominio del factor de crecimiento del PDGF-D, que comprende aproximadamente los residuos 250-370 de la SEC. ID. N.º 2, se caracteriza por un arreglo de residuos de cisteína y cadenas beta que es característico de la estructura "nudo de cisteínas" de la familia del PDGF. El dominio CUB muestra una homología en la secuencia con respecto a los dominios CUB de las neuropilinas (Takagi et al., Neuron 7:295-307, 1991; Soker et al., Cell 92:735-745, 1998), la proteína 1 morfogenética de hueso humano (Wozney et al., Science 242:1528-1534, 1988), la proteína plasmática seminal porcina y la proteína fluida seminal acídica bovina (Romero et al., Nat. Struct. Biol. 4:783-788, 1997), y la proteína similar a un toloide Xenopus laevis (Lin et al., Dev. Growth Differ. 39:43-51, 1997).

El PDGF-D forma una proteína homodimérica (PDGF-DD) segmentada en forma proteolítica para producir especies activas, un dímero con dominio de factor de crecimiento. La proteína activa se une a las isoformas \beta/\beta y \alpha/\beta del receptor del PDGF en la superficie celular y las activa. Los dímeros del PDGF-DD son mitogénicos para diversas células mesenquimales (Bergsten et al. ibid.; LaRochelle et al., ibid.). Además, el PDGF-D ha demostrado tener actividad formadora de huesos en ratones (publicación de la WIPO WO 01/57083).

Descripción de la invención

Dentro de un aspecto de la presente invención, se proporciona una proteína que consta de dos cadenas de polipéptidos; cada una de las cadenas de polipéptidos consta, desde el amino terminal hasta el carboxilo terminal, de los siguientes segmentos ligados operablemente: P1-P2-h-C_{H}2-C_{H}3, P1-P2-C_{H}2-C_{H}3, h-C_{H}2-C_{H}3-P2-P1 o C_{H}2-C_{H}3-P2-P1. En estas cadenas de polipéptidos, P1 es un primer segmento polipeptídico como se muestra en la SEC. ID. N.º 2 o la SEC. ID. N.º 4, desde el aminoácido x hasta el aminoácido y, donde x es un número entero del 246 al 258, inclusive; e y es un número entero del 365 al 370, inclusive; P2 es un segundo segmento polipeptídico que consta de entre 4 y 20 residuos de aminoácidos; h es una región bisagra de inmunoglobulina o una porción de esta; y C_{H}2 y C_{H}3 son dominios C_{H}2 y C_{H}3 de una cadena pesada de inmunoglobulina, respectivamente. Dentro de la proteína, las dos cadenas de polipéptidos están unidas por una o más uniones disulfuro, cada una de las cadenas está glucosilada opcionalmente, y la proteína se une a los receptores del PDGF de la superficie celular y los activa. Dentro de una aplicación, y es 370. Dentro de otras aplicaciones, x es 246, 248 ó 250. Dentro de otra aplicación, x es 250 e y es 370. Dentro de aplicaciones adicionales, el segundo segmento polipeptídico consta de entre 5 y 15 residuos de aminoácidos. Dentro de una aplicación adicional, el segundo segmento polipeptídico consta de 10 residuos de aminoácidos. Dentro de otras aplicaciones, el segundo segmento de polipeptídico consta de residuos de glicina y serina. Dentro de aplicaciones relacionadas, el segundo segmento polipeptídico es [Ser-Gly-Ser-Gly-Ser]_{x}, donde x es 1 ó 2. Dentro de otras aplicaciones adicionales, el segundo segmento polipeptídico no contiene Lys ni Arg, el segundo segmento polipeptídico no contiene Cys, o el segundo segmento polipeptídico no contiene Pro. Dentro de otras aplicaciones, el segundo segmento polipeptídico comprende un sitio de segmentación proteolítica, como un sitio de segmentación de plasmina, un sitio de segmentación de trombina o un sitio de segmentación del factor Xa. Dentro de aplicaciones adicionales, cada una de las dos cadenas de polipéptidos consta de P1-P2-h-C_{H}2-C_{H}3, donde h-C_{H}2-C_{H}3 consta de una secuencia de residuos de aminoácidos como se muestra en la SEC. ID. N.º 5.

Dentro de un segundo aspecto de la invención, se proporciona un polinucleótido que codifica una fusión de polipéptidos capaz de unirse a la isoforma \beta/\beta o la isoforma \alpha/\beta del receptor del PDGF de la superficie celular y de activarlos, dicha fusión de polipéptidos consta, desde el amino terminal hasta el carboxilo terminal, de los siguientes segmentos ligados operablemente: P1-P2-h-C_{H}2-C_{H}3, P1-P2-C_{H}2-C_{H}3, h-C_{H}2-C_{H}3-P2-P1 o C_{H}2-C_{H}3-P2-P1, donde P1, P2, h, C_{H}2 y C_{H}3 se definieron anteriormente. Dentro de una aplicación, el polinucleótido también codifica un péptido de secreción ligado operablemente a una fusión de polipéptidos. Dentro de otra aplicación, el polinucleótido es ADN.

Dentro de un tercer aspecto de la invención, se proporciona un vector de expresión que comprende los siguientes elementos ligados operablemente: un promotor de la transcripción; un polinucleótido de ADN, tal como se ha divulgado anteriormente; y un terminador de la transcripción.

Dentro de un cuarto aspecto de la invención, se proporciona una célula cultivada en la que se introdujo un vector de expresión, tal como se ha divulgado anteriormente. Dentro de una aplicación, el segundo segmento polipeptídico comprende un sitio de segmentación proteolítica y la célula produce una proteasa que se segmenta en el sitio de segmentación.

Dentro de un quinto aspecto de la invención, se proporciona un método de elaboración de una proteína, que comprende los pasos de cultivar una célula, como se divulgó anteriormente, en un medio de cultivo mediante el cual se expresa el polinucleótido de ADN y se produce la fusión de polipéptidos, y de recuperar la fusión de polipéptidos. Dentro de una aplicación, la célula es una célula eucariota, el polinucleótido de ADN además codifica un péptido de secreción ligado operablemente a la fusión de polipéptidos, y la fusión de polipéptidos se secreta de la célula como un dímero con uniones disulfuro y se recupera del medio de cultivo. Dentro de otra aplicación, el segundo segmento polipeptídico comprende un sitio de segmentación proteolítica y, después del paso de recuperación, la fusión de polipéptidos se segmenta en forma proteolítica en el sitio de segmentación. Dentro de una aplicación adicional, el segundo segmento polipeptídico comprende un sitio de segmentación proteolítica, la célula produce una proteasa que se segmenta en el sitio de segmentación, la fusión de polipéptidos se produce y es segmentada por la proteasa dentro de la célula, lo que produce una pluralidad de productos de segmentación y, al menos, uno de los productos de segmentación de la fusión de polipéptidos se recupera.

Dentro de un sexto aspecto de la divulgación, se proporciona una proteína producida por uno de los métodos divulgados anteriormente.

Estos y otros aspectos de la invención se ejemplifican con la descripción detallada a continuación y el gráfico que se adjunta.

El gráfico (Fig. 1A-1C) ejemplifica las secuencias de aminoácidos de ciertos polipéptidos de Fc de inmunoglobulina (SEC. ID. N.º 5). Los números de la secuencia de aminoácidos se basan en el índice de la UE (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., NIH, Bethesda, 1991). Las secuencias ejemplificadas incluyen una secuencia humana genéticamente intacta (wild-type, "wt") y cinco variantes de secuencias denominadas Fc-488, Fc4, Fc5, Fc6 y Fc7. Se indican los residuos de Cys que, por lo general, están involucrados en las uniones disulfuro a la región constante de la cadena liviana (light chain, LC) y la región constante de la cadena pesada (heavy chain, HC). Un "." indica la identidad de una secuencia genéticamente intacta en esa posición. *** indica el amino terminal; el residuo de Lys C terminal se eliminó del Fc6. Se muestran los límites de la región bisagra, los dominios C_{H}2 y C_{H}3.

Como se utiliza en la presente, la frase "una célula cultivada en la que se introdujo un vector de expresión" incluye las células que han sido manipuladas físicamente para incluir el vector, así como la progenie de las células manipuladas, cuando la progenie también contiene el vector.

Los términos "amino terminal" y "carboxilo terminal" se utilizan en la presente para denotar posiciones dentro de los polipéptidos. Donde el contexto lo permite, dichos términos se usan con referencia a una secuencia o porción en particular de un polipéptido para denotar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una determinada secuencia en posición carboxilo terminal con respecto a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido está ubicada en posición proximal al carboxilo terminal de la secuencia de referencia, pero no necesariamente se encuentra en el carboxilo terminal del polipéptido completo.

El término "vector de expresión" se utiliza para denotar una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés ligado operablemente a segmentos adicionales que permiten su transcripción. Dichos segmentos adicionales incluyen secuencias de promotores y terminadores, y también pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación, etc. Generalmente, los vectores de expresión provienen de ADN plasmídico o viral, o pueden contener elementos de ambos.

Un fragmento "Fc" (o dominio Fc) de inmunoglobulina es la porción de un anticuerpo que es responsable de unirse a los receptores de anticuerpos de las células y el componente C1q de complemento. Fc significa "fragmento cristalino", el fragmento de un anticuerpo que formará fácilmente un cristal de proteína. Los diferentes fragmentos de proteína, que originalmente se describieron por digestión proteolítica, pueden definir la estructura general de una proteína inmunoglobulina. Como se definió originalmente en la bibliografía, el fragmento Fc consta de las regiones bisagra de una cadena pesada con enlace disulfuro, los dominios C_{H}2 y C_{H}3. No obstante, el término se ha aplicado más recientemente a una cadena simple que consta de C_{H}3, C_{H}2 y, al menos, una porción de la región bisagra suficiente para formar un dímero con enlace disulfuro con una segunda cadena de este tipo. Para una revisión completa de la estructura y el funcionamiento de la inmunoglobulina, véase: Putnam, The Plasma Proteins, Vol. V, Academic Press, Inc., 49-140, 1987; y Padlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994. Como se lo utiliza en la presente, el término Fc también incluye determinada variante de secuencias naturales, como se divulga más detalladamente a continuación.

El término "aislado", cuando se aplica a un polinucleótido, denota que el polinucleótido ha sido extraído de su medio genético natural y, por lo tanto, no contiene otras secuencias codificantes extrañas o indeseadas, y está en una forma adecuada para su uso dentro de sistemas de producción de proteínas mediante genomanipulación. Dichas moléculas aisladas son aquellas separadas de su medio natural, e incluyen los clones de ADNc y genómicos. Las moléculas de polinucleótidos aisladas de la presente invención no contienen otros genes con los que se las asocia comúnmente, pero pueden incluir las regiones naturales 5' y 3' no traducidas, como los promotores y los terminadores. La identificación de las regiones asociadas será evidente para una persona con conocimientos generales de la materia (véase, por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316:774-778, 1985).

Un polipéptido o proteína "aislado" es un polipéptido o una proteína que se encuentra en una condición distinta de su entorno original, como por ejemplo, separado de la sangre y el tejido animal. Dentro de una aplicación, el polipéptido o proteína aislado no contiene sustancialmente otros polipéptidos o proteínas, en particular otros polipéptidos o proteínas de origen animal. Los polipéptidos o proteínas aislados pueden proporcionarse en una forma altamente purificada, es decir, pureza mayor al 95% o pureza mayor al 99%. Al usarlo en este contexto, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido o proteína en formas físicas alternativas, tales como dímeros o, como alternativa, en formas glucosiladas o derivatizadas.

"Ligado operablemente" significa que dos o más entidades se unen de modo tal que funcionan en forma conjunta para alcanzar sus fines previstos. Cuando se refiere a segmentos de ADN, la frase indica, por ejemplo, que las secuencias codificantes están unidas en el marco de lectura correcto, y que la transcripción se inicia en el promotor y avanza por el (los) segmento(s) codificante(s) hasta el terminador. Cuando se refiere a polipéptidos, "ligado operablemente", incluye las secuencias ligadas en forma covalente (p. ej., con unión disulfuro) y en forma no covalente (p. ej., por unión hidrógeno, interacciones hidrófobas o interacciones puente de sales), mientras que se retiene(n) la(s) fun-
ción(es) deseada(s) de las secuencias.

El término "polipéptido del PDGF-D" se utiliza en la presente para denotar a un polipéptido que comprende el dominio del factor de crecimiento central de un PDGF-D (p. ej., residuos 258-365 del PDGF-D (SEC. ID. N.º 2) humano o del PDGF-D (SEC. ID. N.º 4) de ratón). Un polipéptido del PDGF-D puede, además, comprender uno o más aminoácidos adicionales derivados de la cadena de polipéptidos del PDGF-D de longitud completa o de un polipéptido heterólogo. Utilizando métodos conocidos en la especialidad, los polipéptidos del PDGF-D pueden prepararse en diversas formas, incluidas formas glucosiladas o no glucosiladas, pegiladas o no pegiladas, con un residuo de metionina inicial o sin él, y como polipéptidos de fusión. Los polipéptidos del PDGF-D pueden estar en forma de monómeros o dímeros con uniones disulfuro.

Un "polinucleótido" es un polímero monocatenario o bicatenario de bases de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos leídas desde el extremo 5' hasta el 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden aislarse de fuentes naturales, sintetizarse in vitro o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. Los tamaños de los polinucleótidos se expresan como pares de bases (cuya abreviatura es "pb"), nucleótidos ("nt") o kilobases ("kb"). Cuando el contexto lo permita, los últimos dos términos pueden describir polinucleótidos que son monocatenarios o bicatenarios. Cuando el término se aplica a moléculas bicatenarias, se utiliza para denotar la longitud total y se entenderá que es equivalente al término "pares de bases". Los especialistas en la materia reconocerán que las dos cadenas de un polinucleótido bicatenario pueden diferir levemente en cuanto a su longitud, y que sus extremos pueden estar escalonados como resultado de una segmentación enzimática; por ende, pueden no estar apareados todos los nucleótidos dentro de una molécula de polinucleótido bicatenaria. Por lo general, dichos extremos no apareados no tendrán una longitud mayor a 20 nt.

Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por uniones peptídicas, sea producido en forma natural o sintética. Los polipéptidos de menos de alrededor de 10 residuos de aminoácidos se conocen comúnmente como "péptidos".

El término "promotor" se utiliza en la presente por su significado reconocido en la especialidad para denotar una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que permiten la unión de la ARN polimerasa y el inicio de la transcripción. Comúnmente, pero no siempre, las secuencias de promotores se encuentran en las regiones no codificantes 5' de los genes.

Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas de polipéptidos. Una proteína también puede comprender componentes no peptídicos, tales como grupos carbohidrato. Los carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos pueden ser agregados a una proteína por la célula en la cual se produce dicha proteína y varían según el tipo de célula. Las proteínas se definen en la presente en función de la estructura de sus esqueletos de aminoácidos; en general, los sustituyentes tales como los grupos carbohidrato no se especifican, aunque pueden estar
presentes.

Una "secuencia señal de secreción" es una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un "péptido de secreción") que, como componente de un polipéptido mayor, dirige al polipéptido mayor a través de una vía de secreción de una célula en la que es sintetizado. Comúnmente, el polipéptido mayor es segmentado para eliminar el péptido de secreción durante el tránsito por la vía de secreción.

Un "segmento" es una porción de una molécula más grande (p. ej., un polinucleótido o un polipéptido) que posee atributos especificados. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica un polipéptido especificado es una porción de una molécula de ADN más larga, como un plásmido o el fragmento de un plásmido que, cuando se lee en dirección 5' a 3', codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido especificado.

Una secuencia representativa del polipéptido del PDGF-D humano (producto primario de la traducción) se muestra en la SEC. ID. N.º 2 y una secuencia representativa del polipéptido del PDGF-D humano se muestra en la SEC. ID. N.º 4. Los ADN que codifican estos polipéptidos se muestran en las SEC. ID. N.º 1 y 3, respectivamente. Los especialistas en la materia reconocerán que estas secuencias representan alelos únicos de los respectivos genes humanos y de ratón, y se prevé que se produzca dicha variación alélica. El análisis de la secuencia de aminoácidos que se mostró en la SEC. ID. N.º 2 indica que los residuos 1 a 18 forman un péptido de secreción. El producto primario de la traducción también incluye un dominio CUB que se extiende desde aproximadamente el residuo 52 hasta aproximadamente el residuo 179; una secuencia similar a la de un propéptido que se extiende desde aproximadamente el residuo 180 hasta el residuo 245, el residuo 249 o el residuo 257 con cuatro posibles sitios de segmentación, incluidos sitios monobásicos en el residuo 245 y el residuo 249, un sitio dibásico en los residuos 254-255, y un sitio diana para la furina o una proteasa similar a la furina en los residuos 254-257; y el dominio del factor de crecimiento carboxilo terminal que se divulgó anteriormente. La proteína producida por la expresión del ADN de longitud completa en un sistema de expresión del baculovirus mostró segmentación entre los residuos 249 y 250, así como especies más largas con amino terminales en los residuos 19 y 35. La segmentación del dímero del PDGF-DD de longitud completa con plasmina provocó una activación de la proteína. Mediante análisis Western blot, se observó una banda que migraba a, aproximadamente, el mismo tamaño que el dominio del factor de crecimiento. Un muestra de longitud completa, no segmentada, coincidente del PDGF-DD no demostró actividad.

Sin la intención de imponer restricciones teóricas, se cree que el dominio del factor de crecimiento del PDGF-D forma dímeros antiparalelos, así como lo hacen los polipéptidos PDGF A y B. También se cree que los dos polipéptidos del PDGF-D dentro de un dímero se unen con, al menos, una unión disulfuro intracatenaria.

La presente invención proporciona materiales y métodos para potenciar la producción de los dímeros del dominio del factor de crecimiento del PDGF-D. Se ha determinado que la expresión del PDGF-D de longitud completa y el dominio del factor de crecimiento aislado en un sistema de baculovirus produce niveles bajos de proteína biológicamente activa. El aumento de la presión selectiva no produjo niveles de expresión satisfactorios. Cuando se produjo un inicio del polipéptido del PDGF-D truncado en Arg-250 de la SEC. ID. N.º 2 en células de insectos y mamíferos cultivadas, una parte sustancial del producto segregado estaba en forma inactiva y monomérica. Por ende, los inventores actuales buscaron formas de aumentar la producción de proteínas del PDGF-DD biológicamente
activas.

En la presente invención, los dímeros con uniones disulfuro de los polipéptidos del PDGF-D se producen mediante la expresión, en una célula huésped cultivada, de un polinucleótido que codifica una cadena del polipéptido fusionada, que consta de un primer polipéptido que es un polipéptido del dominio del factor de crecimiento del PDGF-D, un segundo polipéptido que es un polipéptido ligador, y un tercer polipéptido que es un fragmento de cadena pesada de inmunoglobulina (Ig), mientras que el segundo polipéptido se posiciona entre el primer polipéptido y el tercero, y se unen a ellos a través de uniones peptídicas. Dentro de una aplicación de la invención los tres polipéptidos se unen, desde el amino terminal hasta el carboxilo terminal, como primer polipéptido-segundo polipéptido-tercer polipéptido. Dentro de otra aplicación de la invención los tres polipéptidos se unen, desde el amino terminal hasta el carboxilo terminal, como tercer polipéptido-segundo polipéptido-primer polipéptido. Según el tipo de célula huésped, el polipéptido del PDGF-D se produce como un monómero o un dímero. Si el polipéptido del PDGF-D se produce como un monómero, puede recuperarse y dimerizarse según métodos de rutina, como se divulga más detalladamente a
continuación.

El polipéptido del dominio del factor de crecimiento del PDGF-D consta de una secuencia de residuos de aminoácidos como se muestra en la SEC. ID. N.º 2 o en la SEC. ID. N.º 4 desde el aminoácido x hasta el aminoácido y, donde x es un número entero del 246 al 258, inclusive, e y es un número entero del 365 al 370, inclusive. Por ende, el polipéptido del dominio del factor de crecimiento del PDGF-D puede constar de, por ejemplo, residuos 246-370 de la SEC. ID. N.º 2, residuos 247-370 de la SEC. ID. N.º 2, residuos 248-370 de la SEC. ID. N.º 2, residuos 249-370 de la SEC. ID. N.º 2, residuos 250-370 de la SEC. ID. N.º 2, residuos 251-370 de la SEC. ID. N.º 2, residuos 252-370 de la SEC. ID. N.º 2, residuos 253-370 de la SEC. ID. N.º 2, residuos 254-370 de la SEC. ID. N.º 2, residuos 255-370 de la SEC. ID. N.º 2, residuos 256-370 de la SEC. ID. N.º 2, residuos 257-370 de la SEC. ID. N.º 2, o residuos 258-370 de la SEC. ID. N.º 2. Dentro de otras aplicaciones de la invención el polipéptido del dominio del factor de crecimiento del PDGF-D posee un amino terminal de uno de los polipéptidos divulgados anteriormente, y un carboxilo terminal terminal en el residuo 365 de la SEC. ID. N.º 2, residuo 366 de la SEC. ID. N.º 2, residuo 367 de la SEC. ID. N.º 2, residuo 368 de la SEC. ID. N.º 2, residuo 369 de la SEC. ID. N.º 2, o residuo 370 de la SEC. ID. N.º 2. Dentro de otras aplicaciones el polipéptido del dominio del factor de crecimiento del PDGF-D consta de los residuos correspondientes de la SEC. ID. N.º 4.

El segundo (ligador) polipéptido está diseñado para proporcionar, dentro de las cadenas polipeptídicas fusionadas dimerizadas, una distancia de aproximadamente 40\ring{A} entre los carboxilos terminales de los dos polipéptidos del dominio del factor de crecimiento del PDGF-D. Las longitudes de ligador requeridas pueden determinarse a través de modelos moleculares mediante el cálculo de la distancia entre los terminales de los componentes de la cadena pesada de Ig de la proteína de fusión. Por ejemplo, se calcula que la distancia entre los amino terminales de las cadenas componentes del fragmento Fc es de aproximadamente 24\ring{A}, por ello cada polipéptido ligador debería abarcar, al menos, 8\ring{A} y abarcará, preferentemente, más de 8\ring{A} para acomodar fácilmente la estructura tridimensional de la molécula. En la especialidad, el cálculo de la longitud efectiva de un polipéptido en solución es un procedimiento de rutina. Véase, por ejemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties, 2.^{a} edición, W.H. Freeman and Company, 1993, Capítulo 5. En general, el polipéptido ligador consta de, al menos, 4 residuos de aminoácidos y puede tener una longitud de hasta 20 residuos.

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El polipéptido ligador debería tener un carácter hidrófilo general y debería ser no inmunógeno y flexible. Como se utiliza en la presente, un ligador "flexible" es un ligador que carece de conformación de orden superior sustancialmente estable en solución. Se deben evitar las áreas de carga local. En general, se prefieren los residuos pequeños, polares e hidrófilos, y no son deseados los residuos de gran tamaño e hidrófobos. Si el polipéptido ligador incluye residuos cargados; por lo general, se posicionarán en forma tal que proporcionen una carga neta neutral en una pequeña región del polipéptido. Por ello, se prefiere colocar un residuo cargado adyacente a un residuo de carga opuesta. En general, los residuos preferidos para inclusión en el polipéptido ligador incluyen Gly, Ser, Ala, Thr, Asn y Gln; los residuos de preferencia incluyen Gly, Ser, Ala y Thr; y los residuos más preferidos son Gly y Ser. En general, se evitarán los residuos Phe, Tyr, Trp, Cys, Pro, Leu, Ile, Lys y Arg, los residuos Cys debido a su capacidad de formar uniones disulfuro no deseadas, los residuos Pro debido a su alta hidrofobicidad y su falta de flexibilidad, y los residuos Lys y Arg debido a su posible inmunogenicidad. No obstante, estos residuos menos deseables pueden incluirse para proporcionar un sitio de segmentación proteolítica específico, como se divulga a continuación. Los ejemplos de ligadores son aquellos que tienen la estructura [Ser-Gly-Ser-Gly-Ser]_{x} (SEC. ID. N.º 6), donde x es 1 ó 2. Dentro de ciertas aplicaciones de la invención el polipéptido ligador comprende un sitio de segmentación proteolítica para facilitar la separación de los fragmentos de cadena pesada de Ig de los polipéptidos del dominio del factor de crecimiento del PDGF-D dimerizado. Los ejemplos de sitios de segmentación proteolítica incluyen secuencias segmentadas por plasmina, trombina, factor Xa, enterocinasa, furina y proteasa del rinovirus 3C. En la especialidad, se conoce el uso de estas y otras proteasas para segmentar las proteínas de fusión. Véase, por ejemplo, Rubinstein et al., WO 00/61768; van de Ven et al., Patente de EE. UU. N.º 5.935.815; y Fischer et al., Patente de EE. UU. N.º 6.010.844. La trombina se segmenta después de la secuencia dipeptídica Arg-Pro. La enterocinasa se segmenta después de la secuencia pentapeptídica Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEC. ID. N.º 7). El factor Xa se segmenta después de la secuencia Ile-Glu-Gly-Arg (SEC. ID. N.º 8). La plasmina se segmenta después de la secuencia Arg-Pro. La proteasa del rinovirus 3C segmenta las uniones peptídicas Gln-Gly, como en la secuencia Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro (SEC. ID. N.º 9). La furina se segmenta después de Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg (SEC. ID. N.º 10).

El tercer segmento polipeptídico comprende los dominios C_{H}2 y C_{H}3 de una cadena pesada de inmunoglobulina. El tercer segmento polipeptídico puede, además, comprender una región bisagra o una porción de esta. La región bisagra o porción de esta proporciona espacio adicional entre el primer polipéptido y el tercero y, si la región bisagra contiene uno o más residuos Cys, puede contribuir a la estabilización de la proteína dimérica a través de la formación de una unión disulfuro. Por ende, dentro de ciertas aplicaciones de la invención el tercer segmento polipeptídico consta de una región bisagra, C_{H}2, y C_{H}3 (es decir, una cadena de fragmentos Fc). Dentro de otras aplicaciones la región bisagra es modificada para eliminar el residuo de cisteína que forma una unión disulfuro con la cadena liviana, como por truncamiento de la bisagra o sustitución de aminoácidos como se muestra en las Fig. 1A-1C. En vertebrados superiores se han identificado cinco clases de proteína de inmunoglobulina, o anticuerpo, (IgG, IgA, IgM, IgD e IgE). La IgG comprende la clase principal dado que se presenta normalmente como la segunda proteína más abundante encontrada en el plasma. En seres humanos, la IgG consta de cuatro subclases, denominadas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Las regiones constantes de la cadena liviana de la clase IgG se identifican con la letra griega \gamma. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la subclase IgG1 contienen una región constante de la cadena pesada \gamma1. En la especialidad, se conocen las secuencias de ADN que codifican cadenas de inmunoglobulina humana. Véanse, por ejemplo, Ellison et al., Nucleic Acids Res. 10:4071-4079, 1982; Kenten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 79:6661-6665, 1982; Seno et al., Nuc. Acids Res. 11:719-726, 1983; y GenBank Accession N.º J00228. La región bisagra \gamma se prefiere para su uso en le presente invención.

La fusión de un polipéptido de inmunoglobulina al polipéptido del PDGF-D puede extender la vida media in vivo de un dímero del PDGF-DD. Las secuencias IgG1 son particularmente útiles en tal sentido, dado que la vida media en suero de la IgG1 es más prolongada que cualquier otra proteína sérica (t_{^{1}/_{2}} promedio = 21-24 días).

Determinadas sustituciones de aminoácidos pueden introducirse en la porción de inmunoglobulina para modificar las funciones efectoras y otras propiedades asociadas con los dominios de regiones constantes de Ig natural. Se han identificado varios de los residuos de aminoácidos específicos que son importantes para la actividad mediada por la región constante del anticuerpo en la subclase IgG1 (Burton y Woof, Adv. Immunol. 51:1-84, 1992; Sarmay et al., Mol Immunol. 5:633-639, 1992; Kim et al., Eur J Immunol. 24:542-548, 1994; Morgan et al., Immunology 2:319-324, 1995; y Ghetie et al., Nature Biotechnol. 15:637-40, 1997). La inclusión o exclusión de estos residuos de aminoácidos específicos permite la inclusión o exclusión de la actividad específica mediada por la región constante de Ig. Las secuencias de Ig modificada pueden utilizarse dentro de la presente invención para elaborar proteínas de fusión con actividad específica definida por la secuencia de la Ig en particular utilizada. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse en las posiciones 234, 235 y 237 del índice de la UE para reducir la unión al receptor-1 del Fc \gamma (Fc\gammaRI), y en las posiciones 330 y 331 del índice de la UE para reducir la fijación de complemento. Véase, Duncan et al., Nature 332:563-564, 1988; Winter et al., Patente de EE. UU. N.º 5.624.821; Tao et al., J. Exp. Med. 178:661, 1993; y Canfield y Morrison, J. Exp. Med. 173:1483, 1991. El residuo de lisina carboxilo terminal puede eliminarse del dominio C_{H}3 para aumentar la homogeneidad del producto. El residuo Cys dentro de la región bisagra que, por lo general, está unida con disulfuro a la cadena liviana (posición 222 del índice de la UE) puede reemplazarse por otro residuo de aminoácido, como un residuo de serina. Ejemplos de secuencias se muestran en las Fig. 1A-1C (SEC. ID. N.º 5).

Como se puntualizó antes, el primer polipéptido puede posicionarse en el amino terminal o en el carboxilo terminal del polipéptido de fusión. Por ende, la presente invención comprende las siguientes cuatro clases de polipéptidos de fusión:

\newpage

n-P1-P2-h-C_{H}2-C_{H}3-c

(I)

n-P1-P2-C_{H}2-C_{H}3-c

(II)

n-h-C_{H}2-C_{H}3-P2-P1-c

(III)

n-C_{H}2-C_{H}3-P2-P1-c

(IV)

donde n es el amino terminal, c es el carboxilo terminal, P1 es el primer polipéptido (dominio del factor de crecimiento del PDGF-D), P2 es el segundo polipéptido (ligador), h es una región bisagra de inmunoglobulina, y C_{H}2 y C_{H}3 son dominios C_{H}2 y C_{H}3 de una cadena pesada de inmunoglobulina, respectivamente. Dentro de cada clase, el polipéptido ligador puede ser diseñado para proporcionar el espacio óptimo entre el primer polipéptido y el segundo. Para los polipéptidos de la clase I, el ligador proporcionará preferentemente un espacio de entre 8 y 13 \ring{A}. Por ende, los ligadores de los polipéptidos de la clase I, por lo general, no excederán los 13 residuos de aminoácidos de longitud y constan más comúnmente de entre 4 y 8 residuos de aminoácidos. Para los polipéptidos de la clase II, el ligador proporcionará preferentemente un espacio de entre 14 y 19 \ring{A}. Por ende, los ligadores de los polipéptidos de la clase II, por lo general, no excederán los 19 residuos de longitud y constan más comúnmente de entre 5 y 12 residuos. Dentro de los polipéptidos de la clase III y de la clase IV, el ligador proporcionará preferentemente un espacio de entre 11 y 16 \ring{A}. Por ende, los ligadores de los polipéptidos de la clase III y de la clase IV, por lo general, no excederán los 16 residuos de longitud y constarán más comúnmente de entre 4 y 10 residuos. No obstante, los especialistas en la materia reconocerán que existe cierta flexibilidad en el diseño de polipéptidos ligadores. Por ende, la presente invención incluye, a modo de ejemplo, el uso de polipéptidos ligadores de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20 residuos dentro de cada clase de polipéptido de fusión de la I a
la IV.

La presente invención también proporciona moléculas de polinucleótidos, incluidas moléculas de ADN y ARN, que codifican los polipéptidos del PDGF-D divulgados anteriormente. Los polinucleótidos de la presente invención incluyen moléculas monocatenarias y bicatenarias. Una secuencia representativa de ADN, que codifica PDGF-D humano se presenta en la SEC. ID. N.º 1, y una secuencia representativa de ADN, que codifica PDGF-D de ratón se presenta en la SEC. ID. N.º 3. Las secuencias adicionales de ADN que codifican polipéptidos del PDGF-D pueden ser generadas fácilmente por quienes cuentan con conocimientos generales en la materia, sobre la base del código genético. Las secuencias de ARN que representan contrapartes pueden generarse mediante la sustitución de T por U. Los especialistas en la materia reconocerán fácilmente que, en vista de la degeneración del código genético, es posible que exista una variación considerable en las secuencias entre las moléculas de polinucleótidos que codifican polipéptidos del PDGF-D.

Los métodos para preparar ADN y ARN son bien conocidos por los especialistas en la materia. Los clones de ADN complementario (ADNc) se preparan a partir de ARN que es aislado de un tejido o célula que produce grandes cantidades de ARN de PDGF-D. Dichos tejidos y células se identifican mediante el análisis Northern blot (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 77:5201, 1980), e incluyen el corazón, el páncreas, el estómago y la glándula suprarrenal. El ARN total puede prepararse mediante extracción con clorhidrato de guanidina y realizando, luego, el aislamiento mediante centrifugación en un gradiente de CsCl (Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979). Se prepara ARN poli(A)+ a partir del ARN total utilizando el método de Aviv y Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 69:1408-1412, 1972). Se prepara ADN complementario a partir del ARN poli(A)+ utilizando los métodos conocidos. Como alternativa, puede aislarse el ADN genómico. Para algunas aplicaciones (p. ej. expresión en animales transgénicos), puede ser ventajoso usar un clon genómico, o modificar un clon de ADNc para que incluya, al menos, un intrón genómico. Los métodos para identificar y aislar clones de ADNc y genómicos son bien conocidos para quienes cuentan con conocimientos generales de la materia, e incluyen el uso de las secuencias divulgadas en la presente, o partes de ellas, para sondar o cebar una genoteca. Los polinucleótidos que codifican polipéptidos del PDGF-D se identifican y se aíslan mediante, por ejemplo, hibridación o reacción en cadena de la polimerasa ("PCR", Mullis, Patente de EE. UU. 4.683.202). Las genotecas de expresión pueden sondarse con anticuerpos contra el PDGF-D, fragmentos receptores u otros elementos de unión específicos.

Los polinucleótidos de la presente invención también pueden prepararse mediante síntesis automatizada. La producción de genes cortos bicatenarios (de 60 a 80 pb) es técnicamente sencilla y se puede lograr sintetizando las cadenas complementarias y luego apareándolas. Los segmentos más largos (habitualmente >300 pb) se arman en forma modular a partir de fragmentos monocatenarios de entre 20 y 100 nucleótidos de longitud. La síntesis automatizada de polinucleótidos se encuentra dentro de los conocimientos generales de la materia, y los equipos y reactivos adecuados se encuentran disponibles a través de proveedores comerciales. Véase, en general, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994; Itakura et al., Ann. Rev. Biochem. 53: 323-356, 1984; y Climie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 87:633-637, 1990.

Los polipéptidos del PDGF-D de la presente invención, pueden producirse en células huésped producidas por genomanipulación de acuerdo con las técnicas convencionales. Las células huésped adecuadas son aquellos tipos celulares que pueden transformarse o transfectarse con ADN exógeno y hacerse crecer en medio de cultivo, e incluyen las células bacterianas, células fúngicas y células eucariotas superiores cultivadas (incluidas células de organismos multicelulares cultivadas), en particular, células cultivadas de mamíferos. Las técnicas para manipular moléculas de ADN clonadas e introducir ADN exógeno en diversas células huésped han sido divulgadas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.^{a} ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, y Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green and Wiley and Sons, NY,
1993.

En general, una secuencia de ADN que codifica un polipéptido del PDGF-D se liga operablemente a otros elementos genéticos necesarios para su expresión, entre los que generalmente se incluyen un promotor y un terminador de la transcripción, dentro de un vector de expresión. Por lo general, el vector también contendrá uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque los especialistas en la materia reconocerán que dentro de determinados sistemas pueden proporcionarse marcadores seleccionables en vectores separados, y la replicación del ADN exógeno puede proporcionarse mediante la integración dentro del genoma de la célula huésped. La selección de promotores, terminadores, marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es una cuestión de diseño de rutina dentro de los conocimientos generales de la materia. Muchos de estos elementos se describen en la bibliografía y están disponibles a través de proveedores comerciales.

Para dirigir un polipéptido del PDGF-D hacia la vía de secreción de una célula huésped, se proporciona una secuencia señal de secreción (también conocida como secuencia líder, secuencia prepro o presecuencia) en el vector de expresión. La secuencia señal de secreción puede ser la de un PDGF-D, o puede derivar de otra proteína segregada (p. ej., t-PA; véase la Patente de EE. UU. N.º 5.641.655) o puede sintetizarse de novo. La secuencia señal de secreción está ligada operablemente a la secuencia de ADN del PDGF-D, es decir, ambas secuencias están unidas en el marco de lectura correcto y posicionadas para dirigir el polipéptido nuevo sintetizado hacia la vía de secreción de la célula huésped. Las secuencias señal de secreción comúnmente están en posición 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, aunque determinadas secuencias señal pueden estar posicionadas en otro lugar de la secuencia de ADN de interés (véase, p. ej. Welch et al., Patente de EE. UU. N.º 5.037.743; Holland et al., Patente de EE. UU. N.º 5.143.830).

Se espera que la expresión de los polipéptidos del PDGF-D a través de una vía de secreción de una célula huésped produzca proteínas diméricas. Los dímeros también pueden ligarse in vitro después de la incubación de polipéptidos componentes en condiciones adecuadas. En general, la ligadura in vitro incluirá la incubación de la mezcla de proteínas en condiciones desnaturalizantes y de reducción seguida del replegamiento y la reoxidación de los polipéptidos para formar dímeros. A continuación, se divulga la recuperación y la ligadura de proteínas expresadas en células bacterianas.

Las células cultivadas de mamíferos son huéspedes adecuados para su uso dentro de la presente invención. Los métodos para introducir ADN exógeno en células huésped de mamíferos incluyen la transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham y Van der Eb, Virology 52:456, 1973), la electroporación (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982), la transfección mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al., ibid.) y la transfección mediada por liposomas (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993). La producción de polipéptidos recombinantes en células cultivadas de mamíferos ha sido divulgada, por ejemplo, por Levinson et al., Patente de EE. UU. N.º 4.713.339; Hagen et al., Patente de EE. UU. N.º 4.784.950; Palmiter et al., Patente de EE. UU. N.º 4.579.821; y Ringold, Patente de EE. UU. N.º 4.656.134. Las células cultivadas de mamíferos adecuadas incluyen las líneas celulares COS-1 (ATCC N.º CRL 1650), COS-7 (ATCC N.º CRL 1651), BHK (ATCC N.º CRL 1632), BHK 570 (ATCC N.º CRL 10314), 293 (ATCC N.º CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) y líneas celulares de ovario de hámster chino (p. ej. CHO-K1, ATCC N.º CCL 61). Existen otras líneas celulares adecuadas conocidas en la especialidad y que pueden obtenerse a través de depósitos públicos como la Colección Estadounidense de Cultivos de Tipos (American Type Culture Collection), Manassas, Virginia. Pueden utilizarse los promotores de la transcripción fuertes, como los promotores obtenidos del SV-40 o del citomegalovirus. Véase, p. ej. la Patente de EE. UU. N.º 4.956.288. Otros promotores adecuados incluyen los genes de la metalotioneína (Patentes de EE. UU. N.º 4.579.821 y 4.601.978) y el principal promotor tardío del adenovirus. Los vectores de expresión utilizados en las células de mamíferos incluyen el pZP-1 y el pZP-9, que se encuentran en depósito en la Colección Estadounidense de Cultivos de Tipos, 10801 University Blvd., Manassas, VA EE. UU. con los números de acceso 98.669 y 98.668, respectivamente, y derivados de estos vectores.

Generalmente, se utiliza la selección por fármaco a fin de seleccionar células cultivadas de mamíferos en las que se ha introducido ADN extraño. Dichas células suelen denominarse "transfectantes". Las células que han sido cultivadas en presencia del agente selectivo y pueden pasar el gen de interés a su progenie se denominan "transfectantes estables". Un ejemplo de marcador seleccionable es un gen que codifica la resistencia al antibiótico neomicina. La selección se realiza en presencia de un fármaco del tipo de la neomicina, por ejemplo, el G-418 o un fármaco similar. Los sistemas de selección también pueden usarse para aumentar el nivel de expresión del gen de interés, proceso conocido como "amplificación". La amplificación se realiza cultivando transfectantes en presencia de un nivel bajo del agente selectivo y luego aumentando la cantidad de agente selectivo para seleccionar las células que producen altos niveles de los productos de los genes introducidos. Un ejemplo de marcador seleccionable amplificable es la dihidrofolato reductasa, que confiere resistencia al metotrexato. También pueden utilizarse otros genes de resistencia a fármacos (p. ej., resistencia a la higromicina, resistencia a múltiples fármacos, puromicina acetiltransferasa).

También pueden utilizarse como huéspedes otras células eucariotas superiores, incluidas células de insectos, células de origen vegetal y células aviares. El uso de la Agrobacterium rhizogenes como vector para expresar los genes en las células de origen vegetal ha sido analizado por Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987. La transformación de células de insectos y la producción de polipéptidos extraños en dichas células han sido divulgadas por Guarino et al., Patente de EE. UU. N.º 5.162.222 y Publicación de la WIPO WO 94/06463.

Pueden infectarse células de insectos con baculovirus recombinante, comúnmente derivado del virus de la poliedrosis nuclear de la Autographa californica (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV). Véase, King y Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman & Hall, London; O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press., New York, 1994; y Richardson, Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, NJ, 1995. El baculovirus recombinante también puede producirse a través del uso de un sistema basado en transposones descrito por Luckow et al. (J. Virol. 67:4566-4579, 1993). Este sistema, que utiliza vectores de transferencia, se comercializa en forma de equipo (equipo Bac-to-Bac^{TM} kit; Life Technologies, Gaithersburg, MD). El vector de transferencia (p. ej., pFastBac1^{TM}; Life Technologies) contiene un transposón Tn7 para trasladar el ADN que codifica la proteína de interés a un genoma de baculovirus mantenido en E. coli como un gran plásmido denominado "bácmido". Véanse, Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol. 75:1551-1556, 1994; y Chazenbalk y Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543-1549, 1995. Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión dentro del marco con ADN que codifica una extensión de polipéptidos o una etiqueta de afinidad según lo divulgado más arriba. Utilizando técnicas conocidas en la especialidad, un vector de transferencia que contiene una secuencia que codifica el polipéptido PDGF-D se transforma en células huésped de E. coli, y las células se criban para detectar bácmidos que contengan un gen lacZ interrumpido que indica baculovirus recombinante. El ADN del bácmido que contiene el genoma del baculovirus recombinante se aísla usando las técnicas habituales, y se lo utiliza para transfectar las células de Spodoptera frugiperda, como las células Sf9. Luego, se produce el virus recombinante que expresa la proteína PDGF-D. Se elaboran lotes de virus recombinante mediante métodos utilizados comúnmente en la especialidad.

Para la producción de proteínas, el virus recombinante se utiliza para infectar las células huésped, generalmente una línea celular derivada del gusano cogollero de otoño, Spodoptera frugiperda (p. ej., células Sf9 o Sf21) o Trichoplusia ni (p. ej., células High Five^{TM}; Invitrogen, Carlsbad, CA). Véase, en general, Glick y Pasternak, ibid. Véase también la Patente de EE. UU. N.º 5.300.435. Se utiliza un medio sin suero para cultivar y mantener las células. Las formulaciones del medio adecuadas son conocidas en la especialidad y pueden obtenerse a través de proveedores comerciales. Las células se cultivan desde una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5x10^{5} células hasta una densidad de 1-2x106 células, en cuyo momento se agrega un lote de virus recombinante a una multiplicidad de infección (multiplicity of infection, MOI) de 0,1 a 10, más habitualmente cerca de 3. Los procedimientos utilizados se describen de manera general en los manuales de laboratorio existentes (p. ej., King y Possee, ibid.; O'Reilly et al., ibid.; Richardson, ibid.).

Las células fúngicas, incluidas las células de levaduras, también pueden utilizarse dentro de la presente invención. Las especies de levaduras de interés en tal sentido incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Pichia methanolica. Los métodos para transformar células de S. cerevisiae con ADN exógeno y producir polipéptidos recombinantes a partir de ellas son divulgados, por ejemplo, por Kawasaki, Patente de EE. UU. N.º 4.599.311; Kawasaki et al., Patente de EE. UU. N.º 4.931.373; Brake, Patente de EE. UU. N.º 4.870.008; Welch et al., Patente de EE. UU. N.º 5.037.743; y Murray et al., Patente de EE. UU. N.º 4.845.075. Las células transformadas se seleccionan por fenotipo determinado por el marcador seleccionable, comúnmente la resistencia a los fármacos o la capacidad de crecer en ausencia de un nutriente en particular (p. ej. leucina). Un ejemplo de sistema de vectores para usar en Saccharomyces cerevisiae es el sistema de vectores POT1 divulgado por Kawasaki et al. (Patente de EE. UU. N.º 4.931.373), que permite seleccionar las células transformadas por cultivo en un medio que contenga glucosa. Los promotores y terminadores adecuados para usar en levaduras incluyen los de los genes de enzimas glucolíticas (véase, p. ej. Kawasaki, Patente de EE. UU. N.º 4.599.311; Kingsman et al., Patente de EE. UU. N.º 4.615.974; y Bitter, Patente de EE. UU. N.º 4.977.092) y genes de la alcohol deshidrogenasa. Véanse también las Patentes de EE. UU. N.º 4.990.446; 5.063.154; 5.139.936 y 4.661.454. En la especialidad, se conocen los sistemas de transformación para otras levaduras, incluidas Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltosa. Véanse, por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986; Cregg, Patente de EE. UU. N.º 4.882.279; y Raymond et al., Yeast 14:11-23, 1998. Pueden utilizarse células de Aspergillus según los métodos de McKnight et al., Patente de EE. UU. N.º 4.935.349. Los métodos para transformar Acremonium chrysogenum han sido divulgados por Sumino et al., Patente de EE. UU. N.º 5.162.228. Los métodos para transformar Neurospora han sido divulgados por Lambowitz, Patente de EE. UU. N.º 4.486.533. La producción de proteínas recombinantes en Pichia methanolica se divulga en las Patentes de EE. UU. N.º 5.716.808; 5.736.383; 5.854.039 y 5.888.768.

Las células huésped procariotas, incluidas las cepas de las bacterias Escherichia coli, Bacillus y de otros géneros, también son células huésped útiles dentro de la presente invención. Las técnicas para transformar estos huéspedes y expresar las secuencias de ADN extraño clonadas en dichos huéspedes son bien conocidas en la especialidad (véase, p. ej. Sambrook et al., ibid.). Cuando se expresa un polipéptido del PDGF-D en bacterias, por ejemplo, E. coli, el polipéptido puede ser retenido en el citoplasma, habitualmente en forma de gránulos insolubles, o puede ser dirigido al espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células se lisan, se recuperan los gránulos y se los desnaturaliza con, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado luego puede replegarse y dimerizarse diluyendo el desnaturalizante, por ejemplo, por diálisis contra una solución de urea y una combinación de glutatión reducido y oxidado, seguida de diálisis contra una solución salina amortiguada. Como alternativa, la proteína puede recuperarse del citoplasma en forma soluble y puede aislarse sin el uso de desnaturalizantes. La proteína se recupera de la célula como un extracto acuoso en, por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato. Para capturar la proteína de interés, se aplica el extracto directamente a un medio cromatrográfico, como un anticuerpo inmovilizado o una columna de heparina-sefarina. Los polipéptidos segregados pueden recuperarse del espacio periplásmico en forma soluble y funcional alterando las células (por ejemplo, por sonicación o choque osmótico) para liberar el contenido del espacio periplásmico y recuperar la proteína, obviando así la necesidad de desnaturalizar y replegar.

Las células huésped transformadas o transfectadas se cultivan de acuerdo con los procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes necesarios para el crecimiento de las células huésped elegidas. Se conocen en la especialidad diversos medios adecuados, incluidos los medios definidos y medios complejos, que generalmente incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios también pueden contener componentes tales como factores de crecimiento o suero, según sea necesario. El medio de crecimiento generalmente selecciona células que contienen el ADN agregado en forma exógena por, a modo de ejemplo, selección por fármaco o por deficiencia en un nutriente esencial, que es complementado por el marcador seleccionable transportado en el vector de expresión o cotransfectado en la célula huésped.

Cuando el segundo segmento polipeptídico comprende un sitio de segmentación proteolítica, los polipéptidos del PDGF-D pueden segmentarse dentro de la célula huésped para eliminar el tercer polipéptido (porción Ig) si la célula huésped produce una proteasa que se segmenta en el sitio de segmentación proteolítica. Si la célula huésped no produce naturalmente la proteasa, puede transfectarse para coexpresar la proteasa y el polipéptido del PDGF-D. Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. N.º 5.648.254 y 5.935.815.

Las proteínas de la presente invención que contienen un sitio de segmentación en el segundo polipéptido también pueden segmentarse in vitro, de acuerdo con los métodos convencionales. En la especialidad, el uso de proteasas para el procesamiento de proteínas recombinantes es un procedimiento de rutina e incluye el uso de proteasas inmovilizadas. Véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N.º 6.010.844. Las condiciones específicas de la reacción se basan en la proteasa que se utilizará y se ajustarán para minimizar la proteólisis no deseada con el primer segmento polipeptídico. En general, se ajustarán ciertos parámetros, como tiempo de reacción y proporción proteasa sustrato para obtener el resultado deseado.

Las proteínas de la presente invención se purifican mediante métodos convencionales de purificación de proteínas, generalmente mediante una combinación de técnicas cromatográficas. Véanse, en general, Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988; y Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nueva York, 1994. Las proteínas que comprenden un polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad en proteína A inmovilizada. Pueden utilizarse pasos adicionales de purificación, como filtración en gel, para obtener el nivel de pureza deseado o para proporcionar desalinización, intercambio de solución amortiguadora y procedimientos similares.

Las proteínas del PDGF-DD pueden utilizarse donde sea necesario para estimular la producción de tejido óseo y/o conjuntivo en seres humanos y en animales no humanos. Los usos veterinarios incluyen el uso en animales domésticos, incluido ganado y animales de compañía. Las aplicaciones específicas incluyen, a modo de ejemplo: fracturas, incluidas fracturas con seudoartrosis y fracturas en pacientes con un compromiso de la cicatrización, como diabéticos, alcohólicos y personas de edad avanzada; injertos óseos; cicatrización del hueso posterior a osteonecrosis inducida por radiación; implantes, incluidos reemplazos articulares e implantes dentales; reparación de defectos óseos provocados por cirugía, como reparación craneomaxilofacial posterior a la extirpación de un tumor, reconstrucción quirúrgica posterior a un traumatismo, reparación de anormalidades físicas hereditarias o de otro tipo, y promoción de la cicatrización ósea en cirugía plástica; tratamiento de la enfermedad periodontal y reparación de otros defectos dentales; tratamiento de defectos óseos posterior al tratamiento terapéutico de algunos tipos de cáncer óseo; aumento de la formación ósea durante osteogénesis por distracción; tratamiento de lesiones articulares, incluida la reparación de cartílago y ligamento; reparación de las articulaciones afectadas por osteoartritis; reparación y reinserción de un tendón; tratamiento de la osteoporosis (incluida la osteoporosis relacionada con la edad, osteoporosis posmenopáusica, osteoporosis inducida por glucocorticoides, y osteoporosis por desuso) y otras condiciones caracterizadas por un aumento de la pérdida ósea o una disminución de la formación ósea; aumento de la masa ósea pico en mujeres premenopáusicas; y uso en la cicatrización de tejidos conjuntivos relacionados con la duramadre.

Para uso farmacéutico, las proteínas del PDGF-DD se formulan para administración local o sistémica (en particular intravenosa o subcutánea) de acuerdo con los métodos convencionales. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán una proteína del PDGF-DD en combinación con un vehículo de administración aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Los vehículos de administración incluyen matrices sólidas y semisólidas biocompatibles, incluido hueso en polvo, cerámica, polímeros sintéticos biodegradables y no biodegradables, y polímeros naturales; adhesivos tisulares (p. ej., a base de fibrina); geles poliméricos acuosos; soluciones acuosas; liposomas; y sustancias similares. En la especialidad, se conocen estos y otros vehículos adecuados. Además, las formulaciones pueden incluir, en forma adicional, uno o más factores de crecimiento, excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes amortiguadores, albúmina para prevenir la pérdida de proteínas en las superficies de los viales, etc. Los métodos de formulación son bien conocidos en la especialidad y han sido divulgados, por ejemplo, por Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20.^{a} ed., Gennaro et al., eds., Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, 2000. Una "cantidad efectiva" de una composición es aquella cantidad que produce un efecto significativo desde el punto de vista estadístico, como un aumento significativo desde el punto de vista estadístico en la tasa de reparación de fracturas, reversión de la pérdida ósea en la osteoporosis, aumento en la tasa de cicatrización de una lesión articular, aumento en la reversión de los defectos del cartílago, aumento o aceleración del crecimiento óseo en dispositivos protésicos, mejora en la reparación de defectos dentales, y efectos similares. El médico clínico determinará la dosis exacta, según los estándares aceptados, teniendo en cuenta la naturaleza y severidad de la condición tratada, las características del paciente, etc. La determinación de la dosis está dentro de los conocimientos generales de la materia. Según la vía y el método de administración, la proteína puede ser administrada en una dosis única, como una infusión prolongada, o en forma intermitente durante un período prolongado. La administración intravenosa se realizará mediante inyección o infusión en bolo durante un período típico, que durará entre una y varias horas. Pueden utilizarse formulaciones de liberación prolongada. En general, una cantidad terapéuticamente efectiva de proteína del PDGF-DD es una cantidad suficiente para producir un cambio significativo desde el punto de vista clínico en la condición tratada, como por ejemplo, una reducción significativa desde el punto de vista clínico en el tiempo requerido para la reparación de una fractura, una reducción significativa en el volumen de un hueco u otro defecto, un aumento significativo de la densidad ósea, una reducción significativa de la morbilidad, o un aumento significativo en el índice
histológico.

Por lo general, el PDGF-DD se utilizará en una concentración de entre aproximadamente 10 y 100 \mug/ml del volumen total, aunque pueden utilizarse concentraciones dentro del rango de entre 1 ng/ml y 1000 \mug/ml. Para aplicación local, así como para la regeneración ósea en una fractura u otro defecto óseo, la proteína se aplicará en un rango de 0,1-100 \mug/cm^{2} de área de la herida.

El PDGF-DD puede utilizarse en combinación con otros factores de crecimiento y otros agentes terapéuticos que tienen un efecto positivo en el crecimiento del hueso o del tejido conjuntivo. Dichos factores de crecimiento incluyen factor de crecimiento similar a la insulina de tipo 1 (insulin-like growth factor 1, IGF-1), otros PDGF, factores de crecimientos de transformación alfa y beta (alpha and beta transforming growth factors, TGF-\alpha y TGF-\beta), factor de crecimiento epidérmico (epidermal growth factor, EGF), proteínas morfogenéticas óseas, factor inhibidor de la leucemia y factores de crecimiento de fibroblastos. Otros agentes terapéuticos incluyen la vitamina D, los bisfosfonatos, la calcitonina, los estrógenos, la hormona paratiroidea, la osteogenina, el NaF, la osteoprotegerina y las estatinas.

Se ejemplifica aún más la invención a través de los siguientes ejemplos no limitantes.

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Ejemplo 1

Se diseñó un vector de expresión de una célula de insecto, denominado pZBV37L:GFD(zVEGF4)FLX1Fc4, para expresar un polipéptido del dominio del factor de crecimiento del PDGF-D con una secuencia de ligador flexible de 5 aminoácidos en dirección 3' (SEC. ID. N.º 6), seguida de dos residuos de aminoácidos codificados por la presencia de un sitio BglII, y un fragmento Fc4 C-terminal. La secuencia del fragmento Fc4 se muestra en las Fig. 1A-1C (SEC. ID. N.º 5, donde el residuo 3 es Arg, el residuo 5 es Ser, el residuo 19 es Ala, el residuo 20 es Glu, el residuo 22 es Ala, el residuo 82 es Asn, el residuo 115 es Ser, el residuo 119 es Ser, y el residuo 232 es Lys). El Fc4 se produjo mediante clonación por PCR a partir de una biblioteca de ADNc de hígado fetal humano seguida de varias vueltas de amplificación por PCR para introducir los cambios de secuencia que se muestran en las Fig. 1A-1C.

Se generó un fragmento de 401-pb (denominado GFD(zVEGF4)Flx1) que contenía sitios de restricción BspEI y BglII en los extremos 5' y 3', respectivamente, mediante amplificación por PCR a partir de un plásmido que contenía ADNc del PDGF-D utilizando los cebadores ZC38.515 (SEC. ID. N.º 11) y ZC29.007 (SEC. ID. N.º 12). Se preparó una mezcla de reacción PCR de 100 \mul utilizando reactivos disponibles comercialmente (sistema PCR Expand^{TM} High Fidelity; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). La mezcla de reacción se incubó a 94ºC durante 2 minutos; luego, 35 ciclos a 94ºC durante 15 segundos, a 50ºC durante 30 segundos, y a 72ºC durante 60 segundos; una incubación de 5 minutos a 72ºC; seguida de un remojo a 4ºC. Se visualizaron 5 \mul de la mezcla de reacción mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1%. El resto de la mezcla de reacción se purificó utilizando un equipo de purificación de PCR disponible comercialmente (obtenido de Qiagen, Inc., Valencia, CA), según las instrucciones del fabricante y se eluyó en 30 \mul de agua. El ADNc recuperado (producto de la PCR) se digirió en un volumen de 35 \mul utilizando BspEI y BglII (New England Biolabs, Beverly, MA) en condiciones adecuadas de amortiguación durante 1 hora a 37ºC. La banda del producto de la PCR se pasó por un gel de TAE de agarosa al 1%, se cortó, se extrajo utilizando una columna de centrifugado que contenía una membrana de gel de sílice (equipo de extracción con gel QIAquick^{TM}; Qiagen, Inc.), y se diluyó en 30 \mul de agua. El producto de la PCR GFD(zVEGF4)Flx1 digerido y el ADNc del fragmento Fc4 preparado previamente, con extremos BglII y XbaI se ligaron en el sitio de clonación múltiple (multiple cloning site, MCS) del vector pZBV37L en una ligadura de 3 direcciones. El vector pZBV37L se preparó a partir del vector de expresión pFastBac1^{TM} (Life Technologies, Gaithersburg, MD) mediante el reemplazo del promotor de la poliedrona con el promotor de la proteína básica de activación tardía y la secuencia señal líder de la Glucosiltransferasa Ecdisteroide (Ecdysteroid Glucosyltransferase, EGT) en dirección 5' del sitio de clonación múltiple (MCS). De un día para el otro se ligaron 5 \mul del GFD(zVEGF4)Flx1 digerido con enzimas de restricción, 5 \mul del fragmento Fc4 preparado, y aproximadamente 50 ng del vector pZBV37L a 16ºC en un volumen de 20 \mul. Tres \mul de la mezcla de ligadura se transformaron en 30 \mul de células huésped de E. coli (ElectoMAX^{TM} DH12S^{TM}; Life Technologies) mediante electroporación a 400 ohmios, 2 V y 25 \muF, en una cubeta de electroporación con una abertura de 2 mm (BTX, modelo n.º 620). Las células transformadas se diluyeron en 350 \mul de medio de SOC (triptona Bacto^{TM} al 2% (Difco Laboratories, Detroit, MI); extracto de levadura Bacto^{TM} al 0,5% (Difco Laboratories); 10 ml de NaCl 1 M; KCl 1,5 mM; MgCl_{2} 10 mM; MgSO_{4} 10 mM; y glucosa 20 mM) y se cultivaron durante 1 hora a 37ºC, luego 50 \mul de la dilución se colocaron en placas con LB que contenían 100 \mug/ml de ampicillina. Los clones se analizaron mediante PCR, y los clones positivos se seleccionaron, se colocaron en placas y se secuenciaron. Una vez que se confirmó la secuencia adecuada, 25 ng de ADN de clon positivo se transformaron en 100 \mul de células competentes de E. coli (células competentes MAX Efficiency® DH10Bac^{TM}; Life Technologies) mediante choque térmico durante 45 segundos en un bloque térmico de 42ºC. Las células transformadas se diluyeron en 900 \mul de medio de SOC y se dejaron crecer a 37ºC durante 1 hora; luego, 100 \mul se colocaron en placas de agar Luria que contenían 50 \mug/ml de kanamicina, 7 \mug/ml de gentamicina, 10 \mug/ml de tetraciclina, 40 \mug/mL de IPTG, y 200 \mug/mL de indolil-\beta-D-galactosida halogenada (bluo-gal). Las placas se incubaron durante 48 horas a 37ºC. Se utilizó una selección por color para identificar las células que tenían ADN viral transpuesto (denominado "bácmido"). Se analizaron las colonias blancas mediante PCR, y se seleccionaron colonias positivas (que contenían el bácmido deseado) para dejarlas crecer y purificarlas. Se cribaron los clones para detectar el inserto de peso molecular correcto mediante la amplificación del ADN con cebadores del elemento transposable en el bácmido (ZC447, SEC. ID. N.º 13; ZC976, SEC. ID. N.º 14). Las condiciones de la reacción PCR fueron 1 ciclo a 94ºC durante 2 minutos; 25 ciclos a 94ºC durante 10 segundos, 50ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 120 segundos; 1 ciclo a 72ºC durante 5 min; seguido de un remojo a 4ºC. El producto de la PCR se pasó por un gel de agarosa al 1% para evaluar el tamaño
del inserto.

Los clones que tenían el inserto de tamaño correcto (según se determinó mediante PCR) se utilizaron para transfectar las células de Spodoptera frugiperda (Sf9) después de dejarlas crecer en cultivo y de aislar el bácmido. Se sembraron células Sf9 a razón de 1 x 10^{6} células por pocillo en una placa de 6 pocillos y se dejaron unir durante 1 hora a 27ºC. Se diluyeron aproximadamente cinco \mug de ADN del bácmido en 100 \mul de un medio de cultivo de células de insecto sin proteínas disponible comercialmente (Sf-900 II SFM; Life Technologies). Se diluyeron 20 \mul de una formulación liposomal 3:1 (p/p) del lípido policatiónico 2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminocarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propaniminio-trifluoroacetato y el lípido neutro dioleoil fosfatidiletanolamina en agua filtrada con membrana (reactivo LipofectAMINE^{TM}; Life Technologies) con 100 \mul de Sf-900 II SFM. El ADN del bácmido y las soluciones lipídicas se mezclaron suavemente y se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente. Se agregaron ochocientos microlitros de Sf-900 II SFM a la mezcla de lípidos-ADN. El medio se aspiró del pocillo, y la mezcla de 1 ml de ADN-lípidos se agregó a las células. Las células se incubaron a 27ºC de un día para el otro. Se aspiró la mezcla de ADN-lípidos y se agregaron 2 ml de medio de Sf-900 II a cada placa. Las placas se incubaron a 27ºC, con una humedad del 90%, durante aproximadamente 7 días, luego de lo cual, se cosechó el virus.

Las células Sf9 se sembraron a razón de 1 x 10^{6} células por pocillo en una placa de 6 pocillos en 2 ml de SF-900 II. Se colocaron 500 \mul del virus de la placa de transfección en el pocillo, y la placa se incubó a 27ºC, con una humedad del 90% durante 96 horas, luego de lo cual, se cosechó el virus (amplificación primaria). Una segunda vuelta de amplificación se llevó a cabo en las mismas condiciones utilizando 100 \mul de virus de la placa de amplificación primaria. Para una tercera vuelta de amplificación, las células Sf9 se cultivaron en 50 ml de Sf-900 II SFM en un matraz de agitación de 250 ml hasta alcanzar una densidad aproximada de 1 x 10^{6} células/ml. Luego, se infectaron con 500 \mul del lote de virus de la placa de la segunda vuelta y se incubaron a 27ºC durante 3 días; luego de dicho tiempo, se cosechó el virus.

El lote de virus se tituló según una curva de inhibición del crecimiento, y al cultivo de titulación que indicó una multiplicidad de infección (multiplicity of infection, MOI) de 1 se lo dejó continuar durante un total de 48 horas. El sobrenadante se analizó a través de Western blot no reducido utilizando un anticuerpo monoclonal primario específico para el dominio del factor de crecimiento del PDGF-D (anticuerpo E3595) y un anticuerpo secundario conjugado HRP antirratón de cabra. Los resultados indicaron una banda de dímero con un peso molecular aparente de aproximadamente 79 kDa y especies adicionales de un peso molecular más alto. También se proporcionó sobrenadante para análisis de actividad.

Luego se generó un lote de virus grande. Las células Sf9 se cultivaron en 1L de Sf-900 II SFM en un matraz de agitación de 2.800 ml hasta alcanzar una densidad aproximada de 1 x 10^{6} células/ml. Luego se infectaron con 10 ml del lote de virus de la amplificación de la 3.^{a} vuelta y se incubaron a 27ºC durante 96 horas; luego de dicho tiempo, se cosechó el virus.

Se completaron infecciones a mayor escala para proporcionar material para purificación en dirección 3'.

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Ejemplo 2

Se diseñó un vector de expresión, denominado pZBV37L:GFD(zVEGF4)FLX2Fc4, para expresar un polipéptido del dominio del factor de crecimiento del PDGF-D con una secuencia de ligador flexible de 10 aminoácidos en dirección 3' (dos copias de la SEC. ID. N.º 6), seguida de dos residuos de aminoácidos codificados por la presencia de un sitio BglII, y un fragmento Fc4 C-terminal. El vector se construyó esencialmente como se divulgó en el Ejemplo 1 utilizando un fragmento de 416-pb (denominado GFD(zVEGF4)Flx2) que contiene sitios de restricción BspE I y Bgl II en los extremos 5' y 3', respectivamente, que fue generado mediante amplificación por PCR a partir del fragmento obtenido por PCR GFD(zVEGF4)Flx1 divulgado en el Ejemplo 1.

Se transfectaron las células Sf9 y se generaron lotes de virus como se divulgó en el Ejemplo 1. Se completaron infecciones a mayor escala para proporcionar material para purificación en dirección 3'.

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Ejemplo 3

Se produjeron proteínas de fusión recombinantes del PDGF-D/Fc4 a partir de células Sf9 infectadas con baculovirus como se divulgó en los Ejemplos 1 y 2. Se cosecharon aproximadamente dos litros de medio acondicionado y cada uno se filtró a través de filtros Nalgene® de 0,2 \mum.

Se purificaron proteínas del medio filtrado mediante una combinación de cromatografía de afinidad de proteína A y una cromatografía de exclusión en gel. Los medios de cultivo filtrados se cargaron directamente en una columna de afinidad de proteína A de 20 x 57 mm (18 ml de volumen de lecho) (Poros® 50; PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) con un caudal de aproximadamente 20 ml/minuto. Después de un lavado de diez volúmenes de columna de 5x PBS, las proteínas unidas se eluyeron en cinco volúmenes de columna de glicina 0,1 M, pH 3,0 a 10 ml/minuto. Se recolectaron fracciones de 1,5 ml cada una en tubos que contenían 50 \mul de Tris 2,0 M, pH 8,0, a fin de neutralizar las proteínas eluidas. Se analizaron muestras de la columna de afinidad mediante tinción con SDS-PAGE Coomassie y Western blot para detectar la presencia de proteínas de fusión PDGF-D/Fc4 utilizando un anticuerpo IgG(Fc) antihumano de conejo conjugado a una peroxidasa de rábano (horseradish peroxidase, HRP). Las fracciones que contenían proteínas se agruparon y se concentraron hasta alcanzar aproximadamente 10 ml utilizando un filtro de membrana (concentrador Biomax^{TM}-30; Millipore Corp., Bedford, MA) y se cargaron en una columna de filtración de gel de 20 x 170 mm (Sephadex^{TM} G-25 fina; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) en 1x PBS, pH 7,3. Las fracciones que contenían proteína purificada se agruparon, se filtraron a través de un filtro de 0,2 \mum, se dividieron en alícuotas de 100 ó 200 \mul cada una y se congelaron a -80ºC. Las concentraciones de las proteínas purificadas finales se determinaron mediante valoración BCA (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) y análisis de
aminoácidos.

Las proteínas recombinantes se analizaron mediante tinción con SDS-PAGE (Novex® Nupage^{TM} gel al 4-12%; Invitrogen, Carlsbad, CA) Coomassie y Western blot utilizando HRP de IgG(Fc) antihumano de conejo. El medio acondicionado o la proteína purificada se sometieron a electroforesis utilizando un aparato de transferencia puntual disponible comercialmente (mini celda Novex® Xcell II^{TM}; Invitrogen) y se lo transfirió a nitrocelulosa (0,2 \mum; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) a temperatura ambiente utilizando un aparato de transferencia puntual revolviendo según las indicaciones proporcionadas en el manual del instrumento. La transferencia se realizó a 500 mA durante una hora en solución amortiguadora que contenía base Tris 25 mM, glicina 200 mM y metanol al 20%. Luego los filtros se bloquearon con leche descremada al 10% en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. La nitrocelulosa se enjuagó rápidamente, luego se agregó el anticuerpo (1:2.000) a PBS que contenía 2,5% de leche descremada. Los blots se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente, o de un día para el otro a 4ºC, con agitación suave. Después de la incubación, los blots se lavaron tres veces durante 10 minutos cada uno en PBS, luego se enjuagaron rápidamente en H_{2}O. Los blots se revelaron utilizando reactivos de sustrato quimioluminiscentes disponibles comercialmente (SuperSignal® ULTRA reactivos 1 y 2 mezclados en una proporción 1:1; reactivos obtenidos a través de Pierce Chemical Co.), y la señal se capturó utilizando software disponible comercialmente (Lumi-Imager^{TM} LumiAnalyst 3.0; Boehringer Mannheim GmbH, Alemania) durante tiempos de exposición que variaron entre 10 segundos y 5 minutos o según fuera necesario.

Las proteínas purificadas se observaron como bandas únicas con la tinción de Coomassie o de plata, con pesos moleculares aparentes de alrededor de 100 kDa en condiciones de no reducción y alrededor de 50 kDa en condiciones de reducción, se observó una forma dimérica en condiciones de no reducción, como se había pre-
visto.

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Ejemplo 4

Las proteínas de fusión del PDGF-D-Fc4 producidas a partir de células infectadas con baculovirus se analizaron para determinar la actividad biológica mediante una valoración diseñada para detectar la activación de receptores del PDGF en la superficie celular. Se cultivaron las células de rata estrelladas en grupos de tejido de 96 pocillos (FALCON; BD, Franklin Lakes, NJ) en DMEM (Life Technologies) suplementados con suero bovino fetal al 10% (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT). Al día siguiente, el medio se cambió a medio sin suero mediante la sustitución del suero por BSA al 0,1% (Fraction V, Sigma, St. Louis, MO). Este medio también contenía el constructo de adenovirus KZ136, que codifica un mini gen indicador de luciferasa dirigido por elementos SRE y STAT, con una multiplicidad de infección (m.o.i.) de 1.000:1. Después de 24 horas de incorporación del constructo de adenovirus en las células, se cambió el medio y se reemplazó con medio sin suero + BSA al 0,1% que contenía proteínas recombinantes purificadas o medio acondicionado de células de insecto a la concentración final indicada. Cuatro horas después, se lisaron las células, y se determinó la actividad de la luciferasa, que indica activación del gen indicador, en el lisado mediante un equipo de valoración disponible comercialmente (obtenido de Promega Corp., Madison, WI) y un lector de luminiscencia (MICROLUMAT PLUS, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania). Los resultados se obtuvieron como unidades relativas de luciferasa (relative luciferase units, RLU) en el lisado.

La calidad de las proteínas purificadas se analizó mediante SDS-PAGE, tinción de plata y Western blot. Todas las proteínas purificadas pasaron con el tamaño previsto para sus respectivas formas diméricas; el peso molecular aparente para GFD-(ligador)1-Fc4 (que comprende un péptido ligador de 5 residuos) y GFD-(ligador)2-Fc4 (que comprende un péptido ligador de 10 residuos) fue ~75kDa en condiciones de no reducción.

A continuación, se muestra la bioactividad de estas proteínas purificadas y de un dímero GFD del PDGF-D, expresada como RLU en lisados de células estrelladas:

1

<110> ZymoGenetics, Inc.

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<120> FACTOR DE CRECIMIENTO DIMERIZADO, Y MATERIALES Y MÉTODOS PARA PRODUCIRLO

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<130> 01-30PC

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/346,117

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<151> 2001-10-19

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<160> 14

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 1882

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (226)...(1338)

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<400> 1

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5

7

8

9

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<210> 2

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<211> 370

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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10

11

12

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<210> 3

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<211> 1472

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (93)...(1205)

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<400> 3

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13

14

15

16

17

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<210> 4

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<211> 370

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 4

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18

19

20

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<210> 5

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<211> 232

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (3)...(3)

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<223> Xaa = Lys o Arg

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<221> VARIANTE

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<222> (5)...(5)

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<223> Xaa = Cys o Ser

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<221> VARIANTE

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<222> (19)...(19)

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<223> Xaa = Leu o Ala

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<221> VARIANTE

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<222> (20)...(20)

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<223> Xaa = Leu o Glu

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<221> VARIANTE

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<222> (22)...(22)

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<223> Xaa = Gly o Ala

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<221> VARIANTE

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<222> (82)...(82)

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<223> Xaa = Asn o Gln

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<221> VARIANTE

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<222> (115)...(115)

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<223> Xaa = Ala o Ser

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<221> VARIANTE

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<222> (116)...(116)

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<223> Xaa = Pro o Ser

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (232)...(232)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Lys o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> polipéptido, péptido ligador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gly Ser Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> polipéptido, sitio de segmentación de la enterocinasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Asp Asp Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> polipéptido, sitio de segmentación del factor Xa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Glu Gly Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> polipéptido, sitio de segmentación de la proteasa del rinovirus 3C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> polipéptido, sitio de segmentación de furina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)...(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)...(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Lys o

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Xaa Xaa Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleótido ZC38,515

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgcatagat cttgatcctg atcctgatcg aggtggtctt gagctgca

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleótido ZC29,007

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgcattccg gatcatacca tgaccggaag tcaaaa

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleótido ZC447

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taacaatttc acacagg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleótido ZC976

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgttgtaaaa cgacggcc

\hfill

18

Claims (16)

1. Una proteína que consta de dos cadenas de polipéptidos, cada una de cuyas cadenas consta, desde el amino terminal hasta el carboxilo terminal, de los siguientes segmentos ligados operablemente:

\quad

P1-P2-h-C_{H}2-C_{H}3;

\quad

P1-P2-C_{H}2-C_{H}3;

\quad

h-C_{H}2-C_{H}3-P2-P1; {}\hskip0.3cm o

\quad

C_{H}2-C_{H}3-P2-P1;

donde:

P1 es un primer segmento polipeptídico como se muestra en la SEC. ID. N.º 2 o la SEC. ID. N.º 4, desde el aminoácido x hasta el aminoácido y, donde x es un número entero del 246 al 258, inclusive; e y es un número entero del 365 al 370, inclusive;

P2 es un segundo segmento polipeptídico que consta de entre 4 y 20 residuos de aminoácidos;

h es una región bisagra de inmunoglobulina o una porción de la misma, y que opcionalmente comprende un residuo de cisteína; y

C_{H}2 y C_{H}3 son dominios C_{H}2 y C_{H}3 de una cadena pesada de inmunoglobulina, respectivamente,

donde las citadas dos cadenas de polipéptidos están unidas por una o más uniones disulfuro, donde cada una de las cadenas es opcionalmente glucosilada.

2. La proteína de la reivindicación 1 donde y es 370 y/o donde x es 246, 248 ó 250, opcionalmente donde x es 250 e y es 370.

3. La proteína de la reivindicación 1 donde el segundo segmento polipeptidico consta de entre 5 y 15 residuos de aminoácidos, p. ej., 10 residuos de aminoácidos.

4. La proteína de la reivindicación 1 donde el segundo segmento polipeptídico consta de residuos de glicina y serina, opcionalmente donde el segundo segmento polipeptídico es [Ser-Gly-Ser-Gly-Ser]_{x}, donde x es 1 ó 2.

5. La proteína de la reivindicación 1 donde el segundo segmento polipeptídico no contiene Lys ni Arg, o donde el segundo segmento polipeptídico no contiene Cys o donde el segundo segmento polipeptídico no contiene Pro.

6. La proteína de la reivindicación 1 donde el segundo segmento polipeptídico comprende un sitio de segmentación proteolítica, opcionalmente un sitio de segmentación de plasmina, un sitio de segmentación de trombina o un sitio de segmentación del factor Xa.

7. La proteína de la reivindicación 1 donde las dos cadenas de polipéptidos constan de P1-P2-h-C_{H}2-C_{H}3 y donde h-C_{H}2-C_{H}3 consta de una secuencia de residuos de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º 5, opcionalmente donde, dentro de SEC ID N.º 5, el residuo 3 es Arg, el residuo 5 es Ser, el residuo 19 es Ala, el residuo 20 es Glu, el residuo 22 es Ala, el residuo 82 es Asn, el residuo 115 es Ser, el residuo 119 es Ser y el residuo 232 es Lys.

8. Un polinucleótido, opcionalmente ADN, que codifica una fusión de polipéptidos capaz de unir y activar la isoforma \beta/\beta o la isoforma \alpha/\beta del receptor del PDGF de la superficie celular,. y dicha fusión de polipéptidos consta, desde el amino terminal hasta el carboxilo terminal, de los siguientes segmentos ligados operablemente:

\quad

P1-P2-h-C_{H}2-C_{H}3;

\quad

P1-P2-C_{H}2-C_{H}3;

\quad

h-C_{H}2-C_{H}3-P2-P1; {}\hskip0.3cm o

\quad

C_{H}2-C_{H}3-P2-P1;

donde:

P1 es un primer segmento polipeptídico como se muestra en la SEC. ID. N.º 2 o la SEC. ID. N.º 4, desde el aminoácido x hasta el aminoácido y, donde x es un número entero del 246 al 258, inclusive; e y es un número entero del 365 al 370, inclusive;

P2 es un segundo segmento polipeptídico que consta de entre 4 y 20 residuos de aminoácidos;

h es una región bisagra de inmunoglobulina o una porción de la misma; y C_{H}2 y C_{H}3 son dominios C_{H}2 y C_{H}3 de una cadena pesada de inmunoglobulina, respectivamente.

9. El polinucleótido de la reivindicación 8 donde el polinucleótido también codifica un péptido de secreción ligado operablemente a la fusión de polipéptidos.

10. El polinucleótido de la reivindicación 8 o la reivindicación 9 donde el polipéptido codificado está aún más definido por la(s) característica(s) específica(s) de cualquiera de las reivindicaciones de 2 a 7.

11. Un vector de expresión que comprende los siguientes elementos ligados operablemente:

un promotor de la transcripción;

un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones de 8 a 10 que es ADN; y

un terminador de la transcripción.

12. Una célula cultivada en la que se ha introducido un vector de expresión de la reivindicación 11.

13. La célula de la reivindicación 12 donde el segundo segmento polipeptídico comprende un sitio de segmentación proteolítica y la célula produce una proteasa que se segmenta en el sitio de segmentación.

14. Un método de elaboración de una proteína, que comprende los siguientes pasos:

cultivar la célula de la reivindicación 12 en un medio de cultivo mediante el cual se expresa el polinucleótido de ADN y se produce la fusión de polipéptidos; y

recuperar la fusión de polipéptidos.

15. El método de la reivindicación 14 donde la célula es una célula eucariota, el polinucleótido de ADN codifica además un péptido de secreción ligado operablemente a la fusión de polipéptidos, y la fusión de polipéptidos se secreta desde la célula como un dímero con uniones disulfuro y se recupera del medio de cultivo, o donde el segundo segmento polipeptídico comprende un sitio de segmentación proteolítica y, después del paso de recuperación, la fusión de polipéptidos se segmenta en forma proteolítica en el sitio de segmentación.

16. Un método de elaboración de una proteína, que comprende los siguientes pasos:

Cultivar la célula de la reivindicación 13 en un medio de cultivo mediante el cual se expresa el polinucleótido de ADN y se produce la fusión de polipéptidos y es segmentada por la proteasa dentro de la célula, lo que produce una pluralidad de productos de segmentación; y

recuperar, al menos, uno de los productos de segmentación de la fusión de polipéptidos.