ES2287950T3

ES2287950T3 - Proteina receptora designada 2f1.

Info

Publication number: ES2287950T3
Application number: ES97905729T
Authority: ES
Inventors: Patricia Parnet; John E. Sims
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1996-02-21
Filing date: 1997-02-06
Publication date: 2007-12-16
Anticipated expiration: 2017-02-06
Also published as: US6451760B1; US7625710B2; US20100080804A1; US5776731A; ATE368682T1; JP4082733B2; DK1007537T3; US20020143155A1; DE69737978D1; CA2245496C; WO1997031010A1; US6090918A; AU2255397A; US7235238B2; PT1007537E; EP1007537A1; JP2000506005A; US20080213793A1; US20040253682A1; EP1007537A4

Abstract

Un ADN aislado que codifica un polipéptido 2F1, en el que dicho 2F1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los residuos -19 a 552 de la ID SEC Nº:2, los residuos 1 a 552 de la ID SEC Nº:2, los residuos -19 a 310 de la ID SEC Nº:2, los residuos 1 a 310 de la ID SEC Nº:2, los residuos -18 a 519 de la ID SEC Nº:4, los residuos 1 a 519 de la ID SEC Nº:4, los residuos -18 a 307 de la ID SEC Nº:4 y los residuos 1 a 307 de la ID SEC Nº:4.

Description

Proteína receptora designada 2F1.

Antecedentes de la invención

El receptor de interleucina-1 de tipo I (IL-1RI) actúa como mediador de los efectos biológicos de la interleucina-1, una citocina proinflamatoria (Sims et al., Science 241:585-589, 1988; Curtis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3045-3049, 1989). Un segundo receptor de interleucina-1 (designado IL-1R de tipo II o IL-1RII) une IL-1, pero no parece actuar como mediador en la transducción de la señal (McMahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991; Sims et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6155-6159, 1993). IL-1RI e IL-1RII unen cada uno IL-1\alpha e IL-1\beta.

IL-1RI e IL-1RII pertenecen a una familia de proteínas que exhiben una homología de secuencias significativa. Una proteína tal es la proteína accesoria de IL-1R (IL-1R AcP), descrita en Greenfeder et al. (J. Biol. Chem. 270: 13757-13765, 1995). Esta proteína, por sí misma, no es capaz de unir IL-1, pero sí forma un complejo con IL-1RI e IL-1\alpha o IL-1\beta. Cuando se coexpresa con IL-1RI, la IL-1R AcP recombinante incrementa la afinidad de IL-1RI por IL-1\beta (Greenfeder et al., anteriormente mencionado).

La proteína conocida de forma diversa como ST2, ST2L, T1 o Fit-1 es también un miembro de la familia de IL-1R, pero no une IL-1. Se ha informado del clonado de cADNs de ratón y rata que codifican formas de esta proteína asociadas a membrana y secretadas (Klemenz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5708, 1989; Tominaga, FEBS LETTERS 258:301, 1989; Yanagisawa et al., FEBS LETTERS 318:83, 1993; Bergers et al., EMBO J. 13:1176, 1994). También se han aislado clones de cADN y genómicos de ST2 humano (Tominaga et al. Biochimica et Biophysica Acta 1171:215, 1992).

Otras proteínas que exhiben homología de secuencia significativa con IL-1RI son MyD88 murino (Lord et al., Oncogene 5: 1095-1097, 1990), rsc786 humano (Nomura et al., DNA Res. 1:27-35, 1994), y varias proteínas de Drosophila, de las cuales la mejor caracterizada es Toll (Hashimoto et al., Cell 52, 269-279, 1988). El gen N de tabaco (Whitham et al., Cell 78:1101-1115, 1994) está entre los miembros adicionales de la familia de IL-1R.

MyD88, rsc786, Toll y el producto del gen N de tabaco contienen dominios que exhiben una homología significativa con el dominio citoplasmático de IL-1RI. Las proteínas IL-1R AcP y ST2 exhiben similitudes de secuencia con IL-1RI tanto en sus porciones extracelulares como en las citoplasmáticas. La proteína B16R del virus vaccinia (Goebel et al., Virology 179:247, 1990) parece ser un homólogo viral de IL-1RII.

Es deseable la identificación de los receptores adicionales de esta familia. Se pueden estudiar tales proteínas receptoras para determinar si unen o no IL-1, y, de ser así, si los receptores desempeñan una función en la mediación de la transducción de señales. También se puede investigar la posible existencia de subunidades reguladoras de la afinidad adicionales para los receptores de esta familia.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona una proteína receptora nueva designada 2F1. Se describen aquí tanto las formas solubles como las asociadas a membrana de 2F1. La presente invención también proporciona el ADN aislado que codifica las proteínas 2F1, los vectores de expresión que comprenden el ADN aislado, y un método para producir 2F1 cultivando células hospedadoras transformadas con los vectores de expresión en condiciones apropiadas para la expresión de la proteína 2F1. También se describen anticuerpos dirigidos contra 2F1. 2F1 tiene uso en la inhibición de la síntesis de prostaglandinas y en el alivio de la inflamación.

Descripción detallada de la invención

Se ha aislado el ADN que codifica una proteína receptora nueva designada 2F1 de acuerdo con la presente invención. Se proporcionan los vectores de expresión que comprenden el ADN de 2F1, así como los métodos para producir polipéptidos 2F1 recombinantes cultivando células hospedadoras que contienen los vectores de expresión en las condiciones apropiadas para la expresión de 2F1, y después recuperando la proteína 2F1 expresada. La presente invención también abarca la proteína 2F1 purificada, que incluye las formas solubles de la proteína que comprenden el dominio extracelular.

La presente invención también proporciona 2F1 y sus fragmentos inmunógenos que se pueden emplear como inmunógenos para generar anticuerpos específicos hacia ellos. En una realización, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales.

Se aislaron clones de 2F1 humano como se describe en el ejemplo 1. Se presenta una secuencia de ADN de 2F1 humano en la ID SEC Nº:1, y la secuencia de aminoácidos codificada por ella se presenta en la ID SEC Nº:2. La proteína incluye un péptido señal (aminoácidos -19 a -1) seguido de un dominio extracelular (aminoácidos 1 a 310), una región transmembrana (aminoácidos 311 a 332) y un dominio citoplasmático (aminoácidos 333 a 522).

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Se aisló cADN de 2F1 de ratón mediante hibridación interespecies, como se describe en el ejemplo 2. Las secuencias de ADN y de los aminoácidos codificados por este ADN de 2F1 de ratón se presentan en la ID SEC Nº:3 y en la ID SEC Nº:4. La proteína de ID SEC Nº:4 comprende un péptido señal (aminoácidos -18 a -1), un dominio extracelular (aminoácidos 1 a 307), una región transmembrana (aminoácidos 308 a 330), y un dominio citoplasmático (aminoácidos 331 a 519). Las secuencias de aminoácidos de 2F1 de ratón y humano son idénticas en un 65%.

La secuencia de aminoácidos de la proteína 2F1 indica que es un miembro de la familia de receptores de IL-1. De los miembros conocidos de la familia de receptores de IL-1, 2F1 tiene el grado más elevado de homología de secuencia con la proteína accesoria de IL-1R (IL-1R AcP), T1/ST2 y el receptor de IL-1 de tipo I (IL-1RI). La secuencia de aminoácidos de 2F1 murino de ID SEC Nº:4 es idéntica en un 31% a la secuencia de aminoácidos de IL-1R AcP murino, idéntica en un 30% a la de T1/ST2 murino de tamaño completo, e idéntica en un 27% a la de IL-1RI murino. Los dominios citoplasmáticos muestran una conservación de secuencias ligeramente mayor (36% - 44%) que la que muestran las porciones extracelulares (20% - 27%).

Se llevó a cabo el ensayo de unión descrito en el ejemplo 3 para determinar si 2F1 une IL-1\alpha, IL-1\beta o el antagonista del receptor de IL-1. Aunque 2F1 es un miembro de la familia de receptores de IL-1, no unió ninguna de las tres proteínas ensayadas.

2F1 humano y de ratón están dentro del alcance de la presente invención, como lo están las proteínas 2F1 derivadas de otros organismos, que incluyen, pero no se limitan a, las especies de mamíferos tales como rata, ganado bovino, ganado porcino, o diversos primates no humanos. Se puede identificar el ADN que codifica las proteínas 2F1 de organismos adicionales mediante técnicas de hibridación interespecies. Los ARNs mensajeros aislados de diversos tipos celulares se pueden cribar en transferencias de Northern para determinar una fuente adecuada de ARNm para el uso en el clonado de cADN de 2F1 de otras especies.

El término "2F1", como se usa aquí, se refiere a un género de polipéptidos que son sustancialmente homólogos a una proteína 2F1 nativa (p.ej., la proteína de la ID SEC Nº:2 ó 4), y que exhiben la actividad biológica de una proteína 2F1 nativa. Las proteínas 2F1 de la presente invención incluyen las proteínas asociadas a membrana (que comprenden un dominio extracelular, una región transmembrana y un dominio citoplasmático), así como las proteínas truncadas que mantienen una propiedad deseada. Tales proteínas truncadas incluyen, por ejemplo, 2F1 soluble que comprende solamente el dominio extracelular o un fragmento suyo. También están incluidas las variantes de las proteínas 2F1 nativas, en las que las variantes mantienen una actividad biológica deseada de un 2F1 nativo. Tales variantes se describen con más detalle más adelante.

Se puede ensayar la actividad biológica de un polipéptido 2F1, o de un fragmento o variante suyo, en cualquier ensayo adecuado. Cuando se altera el dominio citoplasmático (p.ej., se trunca o se altera mediante deleción, adición o sustitución de residuos de aminoácidos), se puede ensayar la actividad biológica del polipéptido 2F1 en un ensayo de transducción de señal. Tales ensayos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en los ejemplos 5 a 7 más adelante. El dominio citoplasmático alterado se puede fusionar al dominio extracelular de un receptor de IL-1, y se analiza en el receptor quimérico resultante la capacidad de responder a IL-1 mediante la activación de NF-\kappaB (véase el procedimiento del ejemplo 5), la inducción de la función del promotor de IL-8 (ejemplo 6) o la estimulación de la síntesis de prostaglandina E_{2} (ejemplo 7). Los polipéptidos 2F1 que incluyen un dominio extracelular (p.ej., 2F1 soluble, como se describe más adelante) se pueden ensayar en cuanto a la capacidad de inhibir la síntesis de prostaglandina E_{2} in vivo en estudios con animales. 2F1 se administra in vivo, y se miden las concentraciones de prostaglandina E_{2} en los animales (antes y después de la administración de 2F1, y se comparan con los animales de control) mediante cualquier medio adecuado, p.ej., mediante ELISA.

Una realización de la presente invención se dirige a los polipéptidos 2F1 solubles. Los polipéptidos 2F1 solubles comprenden todo o parte del dominio extracelular de un 2F1 nativo, pero carecen de la región transmembrana que provocaría la retención del polipéptido en una membrana celular. Cuando se sintetizan inicialmente, los polipéptidos 2F1 solubles comprenden de forma ventajosa el péptido señal nativo (o uno heterólogo) para favorecer la secreción, pero el péptido señal se escinde tras la secreción de 2F1 desde la célula.

Un uso de los polipéptidos 2F1 solubles es el bloqueo de una actividad biológica de 2F1. Se puede administrar 2F1 soluble a un mamífero para unir cualquier/cualesquiera ligando(s) de 2F1 endógeno(s), por lo que se inhibe la unión de tales ligandos a los receptores endógenos que comprenden 2F1. En una realización, se administra un polipéptido 2F1 soluble para tratar el dolor o la inflamación mediante la inhibición de la síntesis de prostaglandinas, como se discute con más detalle más adelante.

Se puede identificar 2F1 soluble (y distinguirlo de sus homólogos insolubles asociados a membrana) separando las células intactas que expresan la proteína deseada del medio de cultivo, p.ej. mediante centrifugación, y analizando en el medio (sobrenadante) la presencia de la proteína deseada. La presencia de 2F1 en el medio indica que la proteína se secretó desde las células y, así, es una forma soluble de la proteína deseada. 2F1 soluble puede ser una forma natural de esta proteína.

El uso de las formas solubles de 2F1 es ventajoso para ciertas aplicaciones. Se facilita la purificación de las proteínas a partir de las células hospedadoras recombinantes, ya que las proteínas solubles se secretan desde las células. Además, las proteínas solubles son en general más adecuadas para la administración intravenosa.

Los ejemplos de polipéptidos 2F1 solubles incluyen aquellos que comprenden el dominio extracelular completo de una proteína 2F1 nativa. Un polipéptido tal es un 2F1 humano soluble que comprende los aminoácidos 1 a 310 de la ID SEC Nº:2. Otro es un 2F1 murino soluble que comprende los aminoácidos 1 a 307 de la ID SEC Nº:4. Cuando se expresa inicialmente dentro de una célula hospedadora, el polipéptido soluble puede comprender adicionalmente uno de los péptidos señal heterólogos descritos más adelante que es funcional dentro de las células hospedadoras empleadas. De forma alternativa, el polipéptido puede comprender el péptido señal nativo, de forma que 2F1 comprende los aminoácidos -19 a 310 de la ID SEC Nº:2 o los aminoácidos -18 a 307 de la ID SEC Nº:4. Los polipéptidos 2F1 solubles incluyen los fragmentos del dominio extracelular que mantienen una actividad biológica deseada. La presente invención abarca las secuencias de ADN que codifican polipéptidos 2F1 solubles.

Los fragmentos de 2F1, que incluyen los polipéptidos solubles, se pueden preparar mediante cualquiera de varias técnicas convencionales. Se puede sintetizar químicamente una secuencia deseada de ADN mediante el uso de técnicas conocidas. También se pueden producir fragmentos de ADN mediante digestión con endonucleasas de restricción de una secuencia de ADN clonada de tamaño completo, y aislarlos mediante electroforesis en geles de agarosa. Se pueden sintetizar oligonucleótidos que reconstruyen el extremo 5' o 3' de un fragmento de ADN hasta un punto deseado. Los oligonucleótidos pueden contener un sitio de escisión para una endonucleasa de restricción en dirección 5' de la secuencia codificante deseada, y se puede colocar un codón de iniciación (ATG) en el extremo 5' de la secuencia codificante. Se pueden emplear ligadores que contienen el/los sitio(s) de escisión para endonucleasa(s) de restricción para insertar el fragmento de ADN deseado en un vector de expresión. De forma alternativa, se pueden emplear técnicas conocidas de mutagénesis para insertar un codón de parada en un punto deseado, p.ej., inmediatamente en dirección 3' del codón del último aminoácido del dominio extracelular.

Como alternativa adicional, se puede emplear el procedimiento bien conocido de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para aislar una secuencia de ADN que codifica el fragmento de proteína deseado. Se emplean los oligonucleótidos que definen los extremos del fragmento deseado como cebadores en la reacción. Los procedimientos de PCR se describen, por ejemplo, en Saiki et al. (Science 239:487, 1988) y en Recombinant DNA Methodology, Wu et al. eds., Academic Press Inc., San Diego, 1989, págs. 189-196.

Con respecto a la discusión anterior de los péptidos señal y los diversos dominios de las proteínas 2F1, el técnico experto reconocerá que los límites anteriormente descritos de tales regiones de las proteínas son aproximados. Por ejemplo, aunque hay disponibles programas informáticos que predicen el sitio de escisión de un péptido señal, la escisión se puede dar en sitios distintos de los predichos. Además, se reconoce que una preparación de proteína puede comprender una mezcla de moléculas de proteína que tienen diferentes aminoácidos N-terminales, debido a la escisión del péptido señal en más de un sitio. Además, los límites exactos de una región transmembrana pueden diferir de los predichos mediante un programa informático. Tales formas de 2F1 que mantienen una actividad biológica deseada están incluidas entre los polipéptidos 2F1 de la presente invención.

La presente invención proporciona polipéptidos 2F1 purificados, tanto recombinantes como no recombinantes. Las variantes y derivados de las proteínas 2F1 nativas que mantienen una actividad biológica deseada están también dentro del alcance de la presente invención. Se pueden obtener variantes de 2F1 mediante mutaciones de las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos 2F1 nativos. Una variante de 2F1, como se menciona aquí, es un polipéptido sustancialmente homólogo a un 2F1 nativo, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la de 2F1 nativo debido a una o más deleciones, inserciones o sustituciones.

La secuencia de aminoácidos variante es preferiblemente idéntica en al menos un 80% a una secuencia de aminoácidos de 2F1 nativo, lo más preferiblemente idéntica en al menos un 90%. El porcentaje de identidad se puede determinar, por ejemplo, comparando la información de las secuencias mediante el uso del programa informático GAP, versión 6.0, descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) y disponible del University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). El programa GAP utiliza el método de alineación de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), como revisaron Smith y Waterman (Adv. Appl. Math 2:482, 1981). Los parámetros por defecto preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y 0 para las no identidades) para los nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, como describieron Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3,0 por cada hueco y una penalización adicional de 0,10 por cada símbolo en cada hueco; y (3) sin penalización para los huecos terminales.

La presente invención también proporciona el ADN que codifica tales variantes. Tales secuencias de ADN son preferiblemente idénticas en al menos un 80% a la secuencia de ADN de 2F1 nativo, y lo más preferiblemente idénticas en al menos un 90%. El porcentaje de identidad se puede determinar mediante el uso de programas informáticos conocidos, tales como el programa GAP anteriormente descrito.

Se pueden llevar a cabo alteraciones de la secuencia de aminoácidos nativa mediante cualquiera de varias técnicas conocidas. Se pueden introducir mutaciones en loci particulares sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten la ligadura a los fragmentos de la secuencia nativa. Tras la ligadura, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción de aminoácidos deseada.

De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de mutagénesis específica de sitio dirigida por oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado que tiene codones particulares alterados según la sustitución, deleción o inserción necesaria. Los métodos para producir las alteraciones enumeradas anteriormente se describen en Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, enero de 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987); y las patentes de EE.UU. nºs 4.518.584 y 4.737.462.

Las variantes incluyen las secuencias sustituidas de forma conservativa, lo que significa que uno o más residuos de aminoácidos de un 2F1 nativo se sustituyen por un residuo diferente, pero el polipéptido 2F1 sustituido de manera conservativa mantiene una actividad biológica deseada de la proteína nativa. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de residuos que no altera la estructura secundaria o terciaria de la proteína.

Se puede sustituir un aminoácido dado por un residuo que tiene características fisicoquímicas similares. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala entre sí, o las sustituciones de un residuo polar por otro, tales como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Se conocen otras sustituciones conservativas, p.ej., que implican sustituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad similares.

También se pueden modificar las proteínas 2F1 para crear derivados de 2F1 formando conjugados covalentes o agregados con otros restos químicos, tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Se pueden preparar derivados covalentes de 2F1s uniendo los restos químicos a los grupos funcionales de las cadenas laterales de los aminoácidos de 2F1, o en el extremo N-terminal o C-terminal de un polipéptido 2F1 o de su dominio extracelular. Otros derivados de 2F1 dentro del alcance de esta invención incluyen los conjugados covalentes o agregados de 2F1s con otras proteínas o polipéptidos, p.ej., fusiones N-terminales o C-terminales producidas mediante tecnología de ADN recombinante. Por ejemplo, el conjugado puede comprender una secuencia polipeptídica señal o líder heteróloga en el extremo N-terminal de un polipéptido 2F1. El péptido señal o líder dirige de manera cotraduccional o postraduccional la transferencia del conjugado desde su lugar de síntesis a un lugar dentro o fuera de la membrana o pared celular.

Las fusiones de polipéptido 2F1 pueden comprender los péptidos añadidos para facilitar la purificación e identificación de 2F1. Tales péptidos incluyen, por ejemplo, poli-His o los péptidos de identificación antigénica descritos en la patente de EE.UU. nº 5.011.912 y en Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988. Un péptido tal es el péptido FLAG®, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (ID SEC Nº:5), que es sumamente antigénico y proporciona un epítopo que se une de manera reversible a un anticuerpo monoclonal específico, lo que permite un análisis rápido y una purificación fácil de la proteína recombinante expresada. Los sistemas de expresión útiles para fusionar el octapéptido Flag® al extremo N- o C-terminal de una proteína dada están disponibles de Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, CT, como lo están los anticuerpos monoclonales que se unen al octapéptido.

La presente invención incluye además polipéptidos 2F1 con o sin el patrón nativo asociado de glicosilación. El 2F1 expresado en sistemas de expresión de levaduras o de mamíferos puede ser similar a, o significativamente diferente de, un polipéptido 2F1 nativo en peso molecular y patrón de glicosilación, dependiendo de la elección del sistema de expresión. La expresión de polipéptidos 2F1 en sistemas de expresión bacterianos, tales como E. coli, proporciona moléculas sin glicosilar.

Los sitios de N-glicosilación en el dominio extracelular de 2F1 se pueden modificar para impedir la glicosilación. Los sitios de N-glicosilación en los polipéptidos eucarióticos se caracterizan por un triplete de aminoácidos Asn-X-Y, en el que X es cualquier aminoácido excepto Pro, e Y es Ser o Thr. El dominio extracelular de la proteína 2F1 humana contiene tales tripletes en los aminoácidos 72-74, 83-85, 131-133, 149-151, 178-180, 184-186, 217-219 y 278-280 de la ID SEC Nº:2. La proteína 2F1 murina contiene tales tripletes en los aminoácidos 32-34, 53-55, 89-91, 93-95, 116-118, 171-173, 176-178, 182-184, 215-217, 277-279 y 460-462 de la ID SEC Nº:4. Las modificaciones apropiadas de la secuencia de nucleótidos que codifica este triplete darán como resultado sustituciones, adiciones o deleciones que evitan la unión de los residuos de carbohidrato en la cadena lateral de Asn. La alteración de un único nucleótido, elegido de forma que Asn se sustituya por un aminoácido diferente, por ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de N-glicosilación. Los procedimientos conocidos para inactivar sitios de N-glicosilación en proteínas incluyen los descritos en la patente de EE.UU. 5.071.972 y en el documento EP 276.846.

Las variantes adicionales son aquellas en las que los residuos de cisteína que no son esenciales para la actividad biológica se eliminan o se sustituyen por otros aminoácidos, lo que evita la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos tras la renaturalización. Como con los otros miembros de la familia de IL-1R, el dominio extracelular de 2F1 contiene tres dominios similares a inmunoglobulina (Ig). Basándose en la alineación de la secuencia de aminoácidos de 2F1 humano con la de otros miembros de la familia, las cisteínas que se predice que forman los puentes disulfuro intradominio típicos de los dominios de Ig están localizadas en las posiciones 121, 166, 218 y 279 de la ID SEC Nº:2. El primer dominio de Ig (el más N-terminal) incluye la primera cisteína (residuo 22), pero carece de la segunda del par conservado en otras proteínas de esta familia. Se predice así que el primer dominio de Ig de 2F1 carece del enlace disulfuro intradominio que es típico de los dominios de Ig. Como todas las proteínas similares a IL-1R excepto T1/ST2, 2F1 de ratón y humano tiene también un residuo de cisteína justo unos pocos residuos en dirección C-terminal respecto del punto de escisión del péptido señal (la cisteína en la posición 2 de la ID SEC Nº:2 y en la posición 4 de la ID SEC Nº:4). Los fragmentos y las variantes de 2F1 contienen preferiblemente estas cisteínas conservadas.

Se preparan otras variantes mediante la modificación de los residuos de aminoácidos dibásicos adyacentes para aumentar la expresión en sistemas de levaduras en los que hay presente actividad de proteasa KEX2. El documento EP 212.914 describe el uso de la mutagénesis específica de sitio para inactivar los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 en una proteína. Los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 se inactivan eliminando, añadiendo o sustituyendo residuos para alterar los pares Arg-Arg, Arg-Lys y Lys-Arg para eliminar la existencia de estos residuos básicos adyacentes. El 2F1 humano contiene tales sitios de procesamiento de proteasa KEX2 en los aminoácidos 94-95, 296-297, 345-346, 418-419 y 448-449 de la ID SEC Nº:2. El 2F1 murino contiene sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 en los aminoácidos 87-88, 96-97, 231-232, 244-245, 295-296, 339-340, 416-417, 432-433 y 446-447 de la ID SEC Nº:4. Los emparejamientos Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles a la escisión mediante KEX2, y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg a Lys-Lys representa una aproximación conservativa y preferida para inactivar los sitios de KEX2.

La presente invención también abarca las variantes de 2F1 naturales. Los ejemplos de tales variantes son proteínas que resultan de un corte y empalme alternativo del ARNm o de la escisión proteolítica de la proteína 2F1, en las que se mantiene una actividad biológica deseada. El corte y empalme alternativo del ARNm puede producir una proteína 2F1 truncada pero biológicamente activa, tal como una forma soluble natural de la proteína, por ejemplo. Las variaciones atribuibles al procesamiento o proteolisis postraduccional incluyen, por ejemplo, las diferencias en los extremos N- o C-terminales tras la expresión en tipos diferentes de células hospedadoras, debido a la eliminación proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de la proteína 2F1 (en general 1-5 aminoácidos terminales).

Las proteínas 2F1 en las que las diferencias respecto de la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº:2 son atribuibles al polimorfismo genético (variación alélica entre individuos que producen la proteína) están también entre las variantes naturales contempladas aquí. La secuencia de 2F1 humana presentada en la ID SEC Nº:1 deriva de tres clones de cADN de una biblioteca de linfocitos de sangre periférica y cuatro clones de PCR de la línea de carcinoma epidermoide KB (véase el ejemplo 1). El codón para la alanina 298 es polimórfico, y está presente en los clones de LSP y en dos de los clones de KB, y ausente en los otros dos clones de KB. También está ausente de los dos clones de ratón que derivaron de una biblioteca de células T EL4. La presente invención proporciona así proteínas 2F1 humanas que contienen o carecen de un residuo de alanina en la posición 298.

La presente invención proporciona secuencias de ADN aisladas que codifican los polipéptidos 2F1 nuevos descritos aquí. El ADN que codifica 2F1 abarcado por la presente invención incluye, por ejemplo, cADN, ADN sintetizado químicamente, ADN aislado mediante PCR, ADN genómico, y sus combinaciones. El ADN genómico de 2F1 se puede aislar mediante técnicas convencionales, p.ej., mediante el uso del ADN de las ID SEC Nºs: 1 ó 3, o un fragmento suyo, como sonda en un procedimiento de hibridación.

Las realizaciones particulares de la presente invención se dirigen a un ADN aislado que comprende los nucleótidos 1 a 1626 de la ID SEC Nº:1 (la región codificante entera), los nucleótidos 58 a 1626 de la ID SEC Nº:1 (que codifican 2F1 humano maduro), los nucleótidos 381 a 1994 de la ID SEC Nº:3 (la región codificante entera), o los nucleótidos 435 a 1994 de la ID SEC Nº:3 (que codifican 2F1 murino maduro). En otras realizaciones, las secuencias de ADN aisladas codifican un fragmento de 2F1, tal como uno de los polipéptidos solubles anteriormente descritos. Tales ADNs incluyen un ADN que comprende los nucleótidos 1 a 985 de la ID SEC Nº:1 (que codifican los aminoácidos -19 a 310 de la ID SEC Nº:2), los nucleótidos 58 a 985 de la ID SEC Nº:1 (que codifican los aminoácidos 1 a 310 de la ID SEC Nº:2), los nucleótidos 381 a 1355 de la ID SEC Nº:3 (que codifican los aminoácidos -18 a 307 de la ID SEC Nº:4), y los nucleótidos 435 a 1355 de la ID SEC Nº:3 (que codifican los aminoácidos 1 a 307 de la ID SEC Nº:4). La presente invención abarca los ADNs que codifican las diversas formas de 2F1 descritas aquí, p.ej., las variantes y las proteínas de fusión de 2F1.

Las secuencias de ácidos nucleicos dentro del alcance de la presente invención incluyen las secuencias de ADN o ARN aisladas que hibridan con las secuencias de nucleótidos de 2F1 nativo descritas aquí en condiciones moderadamente o sumamente rigurosas, y que codifican 2F1 biológicamente activo. Las condiciones de hibridación de rigurosidad moderada se refieren a las condiciones descritas en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed., vol. 1, págs. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989). Las condiciones de rigurosidad moderada, definidas por Sambrook et al., incluyen el uso de una disolución de prelavado de 5 X SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), hibridación a alrededor de 55ºC en 5 X SSC durante la noche, seguido de lavado a 50-55ºC en 2 X SSC, 0,1% de SDS. Las condiciones sumamente rigurosas incluyen temperaturas superiores de hibridación y de lavado. El técnico experto reconocerá que se puede ajustar la temperatura y la concentración salina de la disolución de lavado como sea necesario según factores tales como la longitud de la sonda. En una realización, las condiciones sumamente rigurosas incluyen la hibridación a 68ºC seguido de lavado en 0,1X SSC/0,1% de SDS a 68ºC.

Debido a la degeneración conocida del código genético, en el que más de un codón puede codificar el mismo aminoácido, una secuencia de ADN puede variar de la presentada en la ID SEC Nº:1 ó 3, y aún así puede codificar una proteína 2F1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº:2 ó 4, respectivamente. Tales secuencias de ADN variantes pueden ser el resultado de mutaciones silenciosas que ocurren durante la amplificación mediante PCR, por ejemplo. De manera alternativa, la secuencia variante puede ser el producto de la mutagénesis deliberada de una secuencia nativa.

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La presente invención proporciona así secuencias de ADN aisladas que codifican 2F1 biológicamente activo, seleccionadas de: (a) ADN derivado de la región codificante de un gen de 2F1 nativo de mamífero (p.ej., ADN que comprende la región codificante de la secuencia de nucleótidos presentada en la ID SEC Nº:1 ó 3); (b) ADN capaz de hibridar con un ADN de (a) en condiciones moderadamente o sumamente rigurosas; y (c) ADN que está degenerado como resultado del código genético respecto de un ADN definido en (a) o (b). La presente invención abarca las proteínas 2F1 codificadas por tales secuencias de ADN.

Los ejemplos de proteínas 2F1 codificadas por ADN que varía respecto de la secuencia de ADN nativa de la ID SEC Nº:1 ó 3, en la que el ADN variante hibridará con la secuencia de ADN nativa en condiciones moderadamente o sumamente rigurosas incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de 2F1 y proteínas 2F1 que comprenden sitio(s)
inactivado(s) de N-glicosilación o sitio(s) inactivado(s) de procesamiento de la proteasa KEX2. Los ejemplos adicionales son proteínas 2F1 codificadas por ADN derivado de otras especies mamíferas, en las que el ADN hibridará con el ADN humano de la ID SEC Nº:1 o con el ADN de ratón de la ID SEC Nº:3.

Proteína 2F1 purificada y sus usos

La presente invención proporciona polipéptidos 2F1 purificados que se pueden producir mediante sistemas de expresión recombinante, como se describe más adelante, o se pueden purificar a partir de células naturales. Se pueden emplear técnicas convencionales de purificación de proteínas.

El grado de pureza deseado puede depender del uso deseado de la proteína. Se desea un grado de pureza relativamente elevado cuando la proteína se va a administrar in vivo, por ejemplo. De forma ventajosa, se purifican los polipéptidos 2F1 de forma que no se detectan bandas de proteínas correspondientes a otras proteínas (que no son 2F1) mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Los expertos del campo pertinente reconocerán que se pueden detectar múltiples bandas que corresponden a la proteína 2F1 mediante SDS-PAGE, debido a la glicosilación diferencial, las variaciones en el procesamiento postraduccional y similares, como se discutió anteriormente. Lo más preferiblemente, se purifica 2F1 hasta una homogeneidad sustancial, indicada por una única banda de proteína tras el análisis mediante SDS-PAGE. La banda de proteína se puede visualizar mediante tinción de plata, tinción con azul de Coomassie o (si la proteína está radiomarcada) mediante autorradiografía.

Un proceso para producir la proteína 2F1 comprende cultivar una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica 2F1 en condiciones en las que se expresa 2F1. La proteína 2F1 se recupera después del medio de cultivo o de los extractos celulares, dependiendo del sistema de expresión empleado. Como reconocerá el técnico experto, los procedimientos para purificar 2F1 recombinante variarán según factores tales como el tipo de células hospedadoras empleadas, y si 2F1 se secreta o no al medio de
cultivo.

Por ejemplo, cuando se emplean sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante, primero se puede concentrar el medio de cultivo mediante el uso de un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración de Amicon o Pellicon de Millipore. Tras la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación, tal como un medio de filtración en gel. De forma alternativa, se puede emplear una resina de intercambio de aniones, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados habitualmente en la purificación de proteínas. De forma alternativa, se puede emplear una etapa de intercambio de cationes. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo. Finalmente, se pueden emplear una o más etapas de cromatografía líquida de elevado rendimiento en fase inversa (RP-HPLC) que emplean medios de RP-HPLC hidrófobos (p.ej., gel de sílice que tiene grupos metilo u otros grupos alifáticos pendientes) para purificar adicionalmente 2F1. Se pueden emplear algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, para proporcionar una proteína recombinante sustancialmente homogénea.

También es posible utilizar una columna de afinidad que comprende un anticuerpo que une 2F1 para purificar polipéptidos 2F1 mediante cromatografía de inmunoafinidad. El ejemplo 8 describe un procedimiento para emplear la proteína 2F1 de la presente invención como inmunógeno para generar anticuerpos monoclonales.

Los procedimientos cromatográficos anteriores están entre los que se pueden emplear para purificar 2F1 recombinante o no recombinante. El cultivo de células recombinantes permite la producción de la proteína exenta de las proteínas contaminantes que pueden estar asociadas normalmente a 2F1 tal como se halla en la naturaleza, p.ej., en la superficie de ciertos tipos de células.

La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano se aísla habitualmente mediante la ruptura inicial de las células hospedadoras, centrifugación, extracción de los sedimentos celulares si se trata de un polipéptido insoluble, o del líquido sobrenadante si se trata de un polipéptido soluble, seguido de una o más etapas de concentración, desalinización, intercambio de iones, purificación por afinidad o cromatografía de exclusión por tamaño. Finalmente, se puede emplear RP-HPLC para las etapas finales de purificación. Las células microbianas se pueden romper mediante cualquier método conveniente, que incluye los ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica o el uso de agentes de lisis de células.

2F1 se expresa preferiblemente en forma de un polipéptido secretado para simplificar la purificación. Los polipéptidos recombinantes secretados a partir de una fermentación de células hospedadoras de levadura se pueden purificar mediante métodos análogos a los descritos por Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171, 1984), que incluyen dos etapas secuenciales de HPLC en fase inversa.

Se proporcionan aquí conjugados que comprenden un polipéptido 2F1 y un agente detectable. El agente se une preferiblemente de manera covalente al polipéptido 2F1. Tales conjugados tienen uso en ensayos in vitro, por ejemplo.

Los agentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, radionucleidos, cromóforos, compuestos fluorescentes, enzimas que catalizan una reacción colorimétrica o fluorimétrica, y similares, y el agente particular se elige según la aplicación deseada. Los radionucleidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ^{123}I, ^{131}I, ^{99m}Tc, ^{111}In y ^{76}Br.

Los agentes se pueden unir a 2F1 mediante el uso de cualquiera de los métodos convencionales mediante los cuales se unen tales compuestos a polipéptidos en general. Los grupos funcionales de las cadenas laterales de los aminoácidos de 2F1 se pueden hacer reaccionar con los grupos funcionales de un agente deseado para formar enlaces covalentes, por ejemplo. El agente se puede unir de manera covalente a 2F1 por medio de un enlace amida, enlace disulfuro impedido, enlace escindible mediante ácido, y similares, que están entre los enlaces que se pueden elegir según factores tales como la estructura del agente deseado. De forma alternativa, 2F1 o el agente se pueden derivatizar para generar o unir un grupo funcional reactivo deseado. La derivatización puede implicar la unión de uno de los reactivos de acoplamiento bifuncionales disponibles para unir diversas moléculas a proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford Illinois). Se conocen varias técnicas para radiomarcar proteínas. Se pueden unir radionucleidos de metales a 2F1 mediante el uso de un agente quelante bifuncional adecuado, cuyos ejemplos se describen en las patentes de EE.UU. 4.897.255 y 4.965.392.

Como se describe en el ejemplo 7, el dominio de señalización (citoplasmático) de 2F1 transduce una señal biológica que estimula la síntesis de prostaglandina E_{2}. Las prostaglandinas son ácidos grasos hidroxílicos naturales de cadena larga que exhiben efectos biológicos que incluyen, entre otros, la actuación como mediadores en el dolor y la inflamación.

Una realización de la presente invención se dirige al uso de polipéptidos 2F1 solubles para inhibir la síntesis de prostaglandinas. La transducción de la señal in vivo puede iniciarse mediante la unión de ligando(s) sin identificar a receptores que comprenden 2F1. Se administra 2F1 soluble a un mamífero para que se una a tales ligandos, por lo que se inhibe la unión de los ligandos al 2F1 endógeno de la superficie celular.

Los polipéptidos 2F1 solubles se pueden administrar a un mamífero para tratar enfermedades que están mediadas por una prostaglandina. Se dice aquí que una enfermedad está mediada por una prostaglandina cuando la enfermedad, al menos en parte, está provocada o se exacerba (directa o indirectamente) por una prostaglandina.

Tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, inflamación asociada a artritis (especialmente artritis reumatoide y osteoartritis), inflamación de los pulmones asociada a alergia o asma, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad inflamatoria intestinal, e inflamación que resulta de lesiones (especialmente la lesión de una articulación). La conveniencia de inhibir las prostaglandinas para tratar la fiebre, síndrome de Bartter, diabetes mellitus, conducto arterial persistente y dismenorrea se discute en Harrisons's Principles of Internal Medicine, 13ª edición, vol. 1, Isselbacher et al., Eds., McGraw-Hill, Inc. Nueva York, 1994, págs. 433-435.

La prostaglandina E_{2} (PGE_{2}) también se ha implicado en la resorción ósea, que incluye la resorción ósea asociada a artritis reumatoide y enfermedad periodontal (Isselbacher et al., Eds., anteriormente mencionado, en la página 434). Se ha informado que PGE_{2} provoca una permeabilidad vascular incrementada, que es un aspecto de la respuesta inflamatoria que puede llevar a edema local (Isselbacher et al., Eds., anteriormente mencionado, en la página 435). Las prostaglandinas y su función en la inflamación se discuten adicionalmente en Pathophysiology: Clinical Concepts of Disease Processes, 3ª edición, Price y Wilson, Eds., McGraw-Hill Book Company, Nueva York, 1986, págs. 36-38; y en Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates, segunda edición, Galin et al., Eds., Raven Press, Nueva York, 1992.

Se ha propuesto que las prostaglandinas desempeñan funciones en la modulación de la respuesta inmunitaria. PGE_{2} puede inhibir la estimulación inducida por mitógenos de los linfocitos humanos, por ejemplo. La inhibición de PGE_{2} puede ser beneficiosa así en pacientes en los que la inmunidad celular disminuida es atribuible, al menos en parte, a la acción de las prostaglandinas (véase Isselbacher et al., Eds., anteriormente mencionado, en la página 435). También se han propuesto las funciones de PGE_{1} y PGE_{2} en la angiogénesis.

Es notable que el dominio de señalización de 2F1 transdujo una señal que dio como resultado la activación del factor de transcripción NF-\kappaB (véase el ejemplo 5). Se cree que el efecto antiinflamatorio de ciertos fármacos (glucocorticoides) es atribuible, al menos en parte, a la inhibición de la activación de NF-\kappaB (Auphan et al., Science 270:286-290, 1995; Marx, Science 270:232-233, 1995). Los polipéptidos 2F1 solubles se pueden usar así para inhibir las señales de activación de NF-\kappaB transducidas a través de 2F1.

La activación de NF-\kappaB se ha asociado a la replicación inducida por TNF del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en las células infectadas, que incluyen las células T (Howard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2335-2339, 1993). 2F1 se expresa en las células T, y se transduce una señal de activación de NF-\kappaB mediante el dominio de señalización de 2F1. Así, se puede emplear 2F1 soluble para reducir la expresión del VIH en las células infectadas por VIH. Se administra una cantidad eficaz de 2F1 soluble in vivo para inhibir la activación de NF-\kappaB que resulta de la señalización a través de 2F1. Así, se disminuye cualquier replicación del VIH que hubiera resultado de tal activación de NF-\kappaB.

Formas oligoméricas de 2F1

La presente invención abarca los oligómeros, tales como dímeros, trímeros u oligómeros superiores, que contienen 2F1. Tales oligómeros pueden ser naturales o producidos por medios tales como la tecnología de ADN recombinante.

Los restos de 2F1 del oligómero pueden ser polipéptidos 2F1 solubles. En ciertas realizaciones, los oligómeros comprenden de dos a cuatro polipéptidos 2F1.

Se pueden formar oligómeros mediante puentes disulfuro entre residuos de cisteína en diferentes polipéptidos 2F1, o mediante interacciones no covalentes entre cadenas polipeptídicas de 2F1, por ejemplo. En otras realizaciones, los oligómeros comprenden múltiples polipéptidos 2F1 unidos por medio de interacciones covalentes o no covalentes entre restos peptídicos fusionados a los polipéptidos 2F1. Tales péptidos pueden ser ligadores peptídicos (espaciadores), o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Las cremalleras de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos están entre los péptidos que pueden promover la oligomerización de los polipéptidos 2F1 unidos a ellos, como se describe con más detalle más adelante.

Se ha descrito la preparación de proteínas de fusión que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados a diversas porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (que incluyen el dominio Fc), p.ej., en Ashkenazi et al., (PNAS USA 88:10535, 1991); Byrn et al., (Nature 344:677, 1990); y Hollenbaugh y Aruffo ("Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", en Current Protocols in Immunology, supl. 4, páginas 10.19.1 - 10.19.11, 1992). En una realización de la invención, se crea un dímero de 2F1 fusionando un 2F1 a la región Fc de un anticuerpo (IgG1). El polipéptido Fc se fusiona preferiblemente en el extremo C-terminal de un 2F1 soluble. Se inserta una fusión de genes que codifica la proteína de fusión 2F1/Fc en un vector de expresión apropiado. Las proteínas de fusión 2F1/Fc se expresan en células hospedadoras transformadas con el vector de expresión recombinante y se dejan ensamblar de forma muy similar a las moléculas de anticuerpo, tras lo cual se forman enlaces disulfuro intercatenarios entre los polipéptidos Fc, lo que produce 2F1 divalente. El dímero deseado se puede recuperar mediante procedimientos convencionales, p.ej., mediante cromatografía de afinidad que emplea una columna de proteína A o de proteína G que unirá los restos de Fc.

La expresión "polipéptido Fc", como se usa aquí, incluye las formas nativas y de muteína de los polipéptidos derivados de la región Fc de un anticuerpo. También se incluyen las formas truncadas de tales polipéptidos que contienen la región de la bisagra que promueve la dimerización. Un polipéptido Fc adecuado se describe en la solicitud PCT WO 93/10151, incorporada aquí como referencia. Este polipéptido Fc es un polipéptido de cadena única que se extiende desde la región de la bisagra N-terminal hasta el extremo C-terminal nativo (es decir, es una región Fc de anticuerpo de longitud esencialmente completa). Otro polipéptido Fc útil se describe en la patente de EE.UU. nº 5.457.035. La secuencia de aminoácidos de la muteína es idéntica a la de la secuencia de Fc nativa presentada en el documento WO 93/10151, excepto en que el aminoácido 19 se ha cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 se ha cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 se ha cambiado de Gly a Ala. Esta muteína de Fc exhibe una afinidad reducida por los receptores de Fc. Los procedimientos para preparar una proteína de fusión que contiene un polipéptido Fc o muteína de Fc se describen adicionalmente en Baum et al. (EMBO J. 13:3992-4001, 1994).

En otras realizaciones, 2F1 se puede sustituir por la porción variable de una cadena pesada o ligera de anticuerpo. Si se producen proteínas de fusión con cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo, es posible formar un oligómero de 2F1 con hasta cuatro regiones extracelulares de 2F1.

Otro método para preparar 2F1 oligomérico implica el uso de una cremallera de leucina. Los dominios de cremalleras de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las que se hallan. Se identificaron originariamente en varias proteínas de unión al ADN (Landschulz et al., Science 240:1759, 1988), y desde entonces se han hallado cremalleras de leucina en una diversidad de proteínas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas están los péptidos naturales y sus derivados que dimerizan o trimerizan. Los ejemplos de dominios de cremalleras de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles son los descritos en la solicitud PCT WO 94/10308. Los péptidos que forman preferentemente trímeros incluyen, por ejemplo, la cremallera de leucina derivada de la proteína D del surfactante pulmonar (SPD) descrita en Hoppe et al. (FEBS Letters 344:191, 1994), y en la solicitud de patente de EE.UU. de nº de serie 08/446.922, incorporados aquí como referencia. Las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un polipéptido 2F1 soluble fusionado a un péptido de cremallera de leucina se expresan en células hospedadoras adecuadas, y el 2F1 oligomérico soluble resultante que se forma se recupera del sobrenadante del cultivo.

Como alternativa adicional, se puede expresar 2F1 oligomérico en forma de una proteína de fusión recombinante, con o sin ligadores peptídicos entre los restos de 2F1. Los ligadores peptídicos adecuados se conocen en la técnica, y se pueden emplear según las técnicas convencionales. Entre los ligadores peptídicos adecuados están los descritos en las patentes de EE.UU. 4.751.180 y 4.935.233, que se incorporan aquí como referencia. Se puede insertar una secuencia de ADN que codifica un ligador peptídico deseado en medio, y en el mismo marco de lectura, de las secuencias de ADN que codifican 2F1, mediante el uso de cualquier técnica convencional adecuada. En una realización, se unen dos polipéptidos 2F1 solubles mediante un ligador peptídico.

Los oligómeros anteriormente descritos se pueden purificar mediante procedimientos convencionales de purificación de proteínas. Se puede emplear, por ejemplo, la cromatografía de inmunoafinidad mediante el uso de un anticuerpo dirigido contra 2F1. Los oligómeros que contienen polipéptidos Fc derivados de anticuerpos se pueden purificar mediante cromatografía de afinidad, mediante el empleo de una columna de proteína A o de proteína G que unirá los restos de Fc.

La presente invención proporciona secuencias de ADN aisladas que codifican polipéptidos 2F1 fusionados a polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. Tales secuencias de ADN pueden codificar un 2F1 soluble fusionado a un polipéptido de la región Fc de un anticuerpo, por ejemplo. La presente invención abarca también las secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión que comprenden múltiples restos de polipéptidos 2F1.

Composiciones que comprenden 2F1

La presente invención proporciona composiciones (que incluyen las composiciones farmacéuticas) que comprenden una cantidad eficaz de un polipéptido 2F1 purificado y un diluyente, excipiente o vehículo adecuado. Los polipéptidos 2F1 administrados in vivo están preferiblemente en forma de una composición farmacéutica.

Las composiciones de la presente invención pueden contener una proteína 2F1 en cualquier forma descrita aquí, que incluye los oligómeros, las variantes, los derivados y los fragmentos biológicamente activos. En una realización de la invención, la composición comprende una proteína 2F1 humana soluble.

Las proteínas 2F1 se pueden formular según los métodos conocidos que se usan para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Los componentes que se emplean habitualmente en las formulaciones farmacéuticas incluyen los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª ed., 1980, Mack Publishing Company.

La proteína 2F1 empleada en una composición farmacéutica se purifica preferiblemente de forma que la proteína 2F1 está sustancialmente exenta de otras proteínas de origen natural o endógeno, que contienen idealmente menos de alrededor del 1% en masa de contaminantes proteicos residuales de los procesos de producción. Tales composiciones, sin embargo, pueden contener otras proteínas añadidas como estabilizantes, vehículos, excipientes o agentes coterapéuticos.

Los componentes de las composiciones serán atóxicos para los pacientes a las dosis y concentraciones empleadas. Habitualmente, la preparación de tales composiciones implica combinar un polipéptido 2F1 de mamífero o su derivado con tampones, antioxidantes tales como ácido ascórbico, péptidos de peso molecular bajo (menores de alrededor de 10 residuos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos que incluyen glucosa, sacarosa o dextranos, agentes quelantes tales como EDTA, glutatión u otros estabilizantes y excipientes. Un diluyente apropiado es una solución salina tamponada neutra.

Para el uso terapéutico, las composiciones se administran de una manera y a las dosis apropiadas para la indicación y el paciente. La administración puede ser mediante cualquier vía adecuada, que incluye, pero no se limita a, la infusión continua, administración local, liberación sostenida desde implantes (geles, membranas y similares), o inyección intravenosa.

Anticuerpos que unen específicamente 2F1

Las proteínas 2F1 de la presente invención, o sus fragmentos inmunógenos, se pueden emplear para generar anticuerpos. La presente invención proporciona así anticuerpos que unen específicamente 2F1, es decir, los anticuerpos se unen a 2F1 por medio de los sitios de unión al antígeno del anticuerpo (al contrario que en la unión inespecífica).

Se pueden preparar anticuerpos policlonales y monoclonales mediante técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, Nueva York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988). La producción de anticuerpos monoclonales que son inmunorreactivos hacia 2F1 se ilustra adicionalmente en el ejemplo 8 más adelante.

La presente invención también abarca los fragmentos de unión al antígeno de tales anticuerpos, que se pueden producir mediante el uso de técnicas convencionales. Los ejemplos de tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos Fab, F(ab') y F(ab')_{2}. También se proporcionan los fragmentos de anticuerpos y los derivados producidos mediante técnicas de ingeniería genética.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, p.ej., versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales murinos. Tales anticuerpos humanizados se pueden preparar mediante técnicas conocidas, y ofrecen la ventaja de una inmunogenicidad reducida cuando se administran los anticuerpos a humanos. En una realización, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo murino (o solamente su sitio de unión al antígeno) y una región constante derivada de un anticuerpo humano. De forma alternativa, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de la región variable (que carece del sitio de unión al antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales quiméricos y modificados adicionalmente incluyen los descritos en Riechmann et al. (Nature 332:323, 1988), Liu et al. (PNAS 84:3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technology 7:934, 1989), y Winter y Harris (TIPS 14:139, mayo, 1993).

Entre los usos de los anticuerpos está el uso en ensayos para detectar la presencia de polipéptidos 2F1, in vitro o in vivo. Los anticuerpos tienen un uso adicional en la purificación de 2F1 mediante cromatografía de inmunoafinidad. Los anticuerpos que pueden bloquear adicionalmente la transducción de una señal biológica por medio de 2F1 se pueden usar para inhibir una actividad biológica mediada por tal transducción de señal. Se tratan así las enfermedades mediadas o exacerbadas (directa o indirectamente) mediante la señalización por medio de 2F1. Un método terapéutico implica la administración in vivo de una cantidad de tal anticuerpo que es eficaz para inhibir una actividad biológica indeseada mediada por 2F1. Tales anticuerpos se pueden administrar para inhibir la síntesis de prostaglandinas, por lo que se trata uno de los trastornos mediados por prostaglandinas anteriormente descritos, por ejemplo.

Se proporcionan aquí composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo que se dirige contra 2F1, y un diluyente, excipiente o vehículo adecuado. Los componentes adecuados de tales composiciones son como se describieron anteriormente para las composiciones que contienen proteínas 2F1.

Se proporcionan aquí conjugados que comprenden un agente diagnóstico (detectable) o terapéutico unido a los anticuerpos anteriormente descritos. En una realización, el agente es un radionucleido o fármaco. Se conocen bien las técnicas para unir tales agentes a los anticuerpos.

Sistemas de expresión

La presente invención proporciona vectores de expresión recombinantes para la expresión de 2F1, y células hospedadoras transformadas con los vectores de expresión. Se puede emplear cualquier sistema de expresión adecuado. Los vectores incluyen una secuencia de ADN de 2F1 unida de manera operable a secuencias nucleotídicas reguladoras transcripcionales o traduccionales adecuadas, como las derivadas de un gen de mamífero, microbio, virus o insecto. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen los promotores, operadores o potenciadores transcripcionales, un sitio de unión ribosómico del ARNm, y secuencias apropiadas que controlan la iniciación y la terminación de la transcripción y la traducción. Las secuencias nucleotídicas están unidas de manera operable cuando la secuencia reguladora se relaciona de manera funcional con la secuencia de ADN de 2F1. Así, un promotor está unido de manera operable a una secuencia de ADN de 2F1 si el promotor controla la transcripción de la secuencia de ADN de 2F1. Se incorpora en general en el vector de expresión un origen de replicación, que confiere la capacidad de replicarse en las células hospedadoras deseadas, y un gen de selección mediante el cual se identifican los transformantes.

Además, se pueden incorporar en los vectores de expresión secuencias que codifican péptidos señal apropiados que no son nativos para el gen de 2F1. Por ejemplo, se puede fusionar una secuencia de ADN de un péptido señal (secuencia líder secretora) en el marco de lectura al extremo 5' de una secuencia de 2F1. Un péptido señal que es funcional en las células hospedadoras deseadas aumenta la secreción extracelular del polipéptido 2F1. El péptido señal se escinde del polipéptido 2F1 tras la secreción de 2F1 desde la célula.

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de polipéptidos 2F1 incluyen las células procariotas, las levaduras o las células eucarióticas superiores. Se describen los vectores de clonado y de expresión apropiados para el uso con hospedadores celulares bacterianos, fúngicos, de levaduras y de mamíferos, por ejemplo, en Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, (1985). También se podrían emplear sistemas de traducción exentos de células para producir polipéptidos 2F1 mediante el uso de ARNs derivados de las construcciones de ADN descritas aquí.

Los procariotas incluyen organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo E. coli o Bacilli. Las células hospedadoras procarióticas adecuadas para la transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y otras diversas especies de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. En una célula hospedadora procariótica, tal como E. coli, un polipéptido 2F1 puede incluir un residuo de metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula hospedadora procariótica. La Met N-terminal se puede escindir del polipéptido 2F1 recombinante expresado.

Los vectores de expresión para el uso en las células hospedadoras procarióticas comprenden en general uno o más genes marcadores fenotípicos seleccionables. Un gen marcador fenotípico seleccionable es, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a antibióticos o que satisface una necesidad auxótrofa. Los ejemplos de vectores de expresión útiles para las células hospedadoras procarióticas incluyen aquellos derivados de plásmidos disponibles comercialmente, tales como el vector de clonado pBR322 (ATCC 37017). pBR322 contiene genes de resistencia a ampicilina y tetraciclina, y así proporciona un medio simple para identificar las células transformadas. Se inserta un promotor apropiado y una secuencia de ADN de 2F1 en el vector pBR322.

Las secuencias promotoras usadas habitualmente para los vectores de expresión en células hospedadoras procarióticas recombinantes incluyen \beta-lactamasa (penicilinasa), el sistema del promotor de lactosa (Chang et al., Nature 275:615, 1978; y Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), el sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; y el documento EP-A-36776) y el promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pág. 412, 1982). Un sistema de expresión en células hospedadoras procarióticas particularmente útil emplea un promotor P_{L} de fago \lambda y una secuencia represora termolábil cI857ts. Los vectores plasmídicos disponibles de la American Type Culture Collection que incorporan derivados del promotor P_{L} de fago \lambda incluyen el plásmido pHUB2 (residente en la cepa de E. coli JMB9 (ATCC 37092)) y pPLc28 (residente en E. coli RR1 (ATCC 53082)).

2F1 se puede expresar de forma alternativa en células hospedadoras de levadura, preferiblemente del género Saccharomyces (p.ej., S. cerevisiae). También se pueden emplear otros géneros de levaduras, tales como Pichia o Kluyveromyces. Los vectores de levaduras contendrán a menudo una secuencia del origen de replicación de un plásmido 2 \mu de levadura, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias de poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción, y un gen marcador seleccionable.

Las secuencias promotoras adecuadas para los vectores de levaduras incluyen, entre otros, los promotores de metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; y Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para el uso en la expresión en levaduras se describen adicionalmente en Hitzeman, documento EPA-73.657. Otra alternativa es el promotor de ADH2 reprimible por glucosa descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y Beier et al. (Nature 300:724, 1982). Se pueden construir vectores lanzadera replicables tanto en levaduras como en E. coli insertando secuencias de ADN de pBR322 para la selección y replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen de replicación) en los vectores de levadura anteriormente descritos.

Se puede emplear la secuencia líder del factor \alpha de levadura para dirigir la secreción del polipéptido 2F1. La secuencia líder del factor \alpha se inserta entre la secuencia promotora y la secuencia génica estructural. Véase, p.ej., Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984; patente de EE.UU. nº 4.546.082; y documento EP 324.274. Los expertos en la técnica conocen otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de los polipéptidos recombinantes de los hospedadores de levaduras. Se puede modificar una secuencia líder cerca de su extremo 3' para que contenga uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder con el gen estructural.

Los expertos en la técnica conocen los protocolos de transformación de levaduras. Se describe un protocolo en Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978. El protocolo de Hinnen et al. selecciona los transformantes Trp^{+} en un medio selectivo, en el que el medio selectivo consiste en un 0,67% de base de nitrógeno para levaduras, 0,5% de hidrolizado de caseína, 2% de glucosa, 10 \mug/ml de adenina y 20 \mug/ml de uracilo.

Las células hospedadoras de levadura transformadas mediante vectores que contienen la secuencia promotora de ADH2 se pueden cultivar para inducir la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de un medio rico es uno que consiste en un 1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 1% de glucosa suplementado con 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo. La desrepresión del promotor de ADH2 sucede cuando se agota la glucosa del medio.

También se podrían emplear sistemas de cultivo de células hospedadoras de mamíferos o insectos para expresar los polipéptidos 2F1 recombinantes. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto se revisan en Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). También se pueden emplear líneas celulares establecidas de origen mamífero. Los ejemplos de líneas celulares hospedadoras adecuadas de mamíferos incluyen las células COS derivadas de células renales de mono (p.ej., la línea celular COS-1 ATCC CRL 1650, o la línea celular COS-7 ATCC CRL 1651, Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, línea celular BHK (ATCC CRL 10), y la línea celular CV-1/EBNA-1 derivada de la línea de células renales de mono verde africano CVI (ATCC CCL 70) como describe McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991).

Las secuencias de control transcripcionales y traduccionales para los vectores de expresión en células hospedadoras mamíferas se pueden extraer de genomas virales. Las secuencias promotoras y las secuencias potenciadoras usadas habitualmente derivan de virus del polioma, adenovirus 2, virus simio 40 (SV40), y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo, el origen, promotor temprano y tardío, potenciador, sitios de corte y empalme y de poliadenilación de SV40 se pueden usar para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia génica estructural en una célula hospedadora mamífera. Los promotores virales tempranos y tardíos son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente de un genoma viral en forma de un fragmento que puede contener también un origen de replicación viral (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Se pueden usar también fragmentos de SV40 menores o mayores, con tal de que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio de Hind III hasta el sitio de BglI localizado en el origen de replicación viral de SV40.

Los vectores de expresión para uso en las células hospedadoras mamíferas se pueden construir como describieron Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Se puede construir un sistema útil para la expresión estable de nivel elevado de cADNs de mamífero en células epiteliales mamarias murinas C127 sustancialmente como describió Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Se ha depositado como ATCC 39890 un vector de expresión elevada útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman et al. (Nature 312:768, 1984). Los vectores de expresión en mamíferos adicionales son pDC406 (McMahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991); HAV-EO (Dower et al., J. Immunol. 142:4314, 1989); pDC201 (Sims et al., Science 241:585, 1988); pDC302 (Mosley et al., Cell, 59:335, 1989); y los descritos en la patente de EE.UU. nº 5.350.683. Otros vectores adecuados pueden derivar de retrovirus.

En lugar de la secuencia señal nativa, se puede añadir una secuencia señal heteróloga, tal como la secuencia señal para interleucina-7 (IL-7) descrita en la patente de Estados Unidos 4.965.195; la secuencia señal para el receptor de interleucina-2 descrita en Cosman et al., Nature 312:768 (1984); el péptido señal del receptor de interleucina-4 descrito en el documento EP 367.566; el péptido señal del receptor de interleucina-1 de tipo I descrito en la patente de EE.UU. 4.968.607; y el péptido señal del receptor de interleucina-1 de tipo II descrito en el documento EP 460.846.

Ácidos nucleicos y sus usos

Los ADNs que codifican 2F1 descritos aquí tienen uso en la producción de polipéptidos 2F1, como se discutió anteriormente. Se proporcionan aquí complementos de ADN y de ARN del ADN presentado en las ID SEC Nºs:1 y 3, junto con sus formas monocatenarias y bicatenarias. Los fragmentos de las secuencias de nucleótidos de 2F1 presentados aquí son también útiles. Tales fragmentos comprenden convenientemente al menos alrededor de 17 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada en la ID SEC Nº:1 o la ID SEC Nº:3, o su complemento.

Entre los usos de tales ácidos nucleicos de 2F1 (que incluyen los fragmentos) está el uso como sondas. Tales sondas se pueden emplear en procedimientos de hibridación interespecies para aislar ADN de 2F1 de especies mamíferas adicionales. Como ejemplo, se puede emplear una sonda que corresponde al dominio extracelular de 2F1. Las sondas también tienen uso en la detección de la presencia de ácidos nucleicos de 2F1 en ensayos in vitro, y en procedimientos tales como transferencias de Northern y Southern. Se pueden identificar los tipos celulares que expresan 2F1. Tales procedimientos se conocen bien, y el técnico experto puede elegir una sonda de longitud adecuada, que depende de la aplicación deseada particular. Las sondas se pueden marcar (p.ej. con ^{32}P) mediante técnicas convencionales.

Los fragmentos de ácido nucleico de 2F1 también tienen uso como cebadores en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR). Se pueden emplear cebadores de 5' y 3' que corresponden a los extremos de un ADN de 2F1 deseado para aislar y amplificar el ADN, mediante el uso de técnicas de PCR convencionales.

Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos de 2F1 son los oligonucleótidos codificantes o no codificantes que comprenden una secuencia de ácido nucleico monocatenario (ARN o ADN) capaz de unirse a secuencias de ARNm de 2F1 (codificante) o de ADN de 2F1 (no codificante) seleccionadas como objetivo. Los oligonucleótidos codificantes o no codificantes, según la presente invención, comprenden un fragmento de la región codificante del cADN de 2F1. Tal fragmento comprende en general al menos alrededor de 14 nucleótidos, preferiblemente de alrededor de 14 a alrededor de 30 nucleótidos. La capacidad de crear un oligonucleótido codificante o no codificante basado en una secuencia de cADN para una proteína dada se describe, por ejemplo, en Stein y Cohen, Cancer Res. 48:2659, 1988 y van der Krol et al., BioTechniques 6:958, 1988.

La unión de oligonucleótidos codificantes o no codificantes para seleccionar como objetivo secuencias de ácido nucleico da como resultado la formación de moléculas dobles que bloquean la traducción (ARN) o la transcripción (ADN) mediante uno de varios medios, que incluyen la degradación aumentada de las moléculas dobles, la terminación prematura de la transcripción o la traducción, o mediante otros medios. Los oligonucleótidos antisentido se pueden usar así para bloquear la expresión de las proteínas 2F1.

Los oligonucleótidos codificantes o no codificantes comprenden además los oligonucleótidos que tienen esqueletos de carbohidrato-fosfodiéster modificados (u otros enlaces de carbohidratos, tales como los descritos en el documento WO91/06629), y en los que los enlaces de los carbohidratos son resistentes a las nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces de carbohidratos resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la degradación enzimática), pero mantienen la especificidad de secuencia para poder unirse a las secuencias de nucleótidos seleccionadas como objetivo. Otros ejemplos de oligonucleótidos codificantes o no codificantes incluyen los oligonucleótidos que están unidos de manera covalente a restos orgánicos, tales como los descritos en el documento WO 90/10448, y otros restos que incrementan la afinidad del oligonucleótido por una secuencia de ácido nucleico seleccionada como objetivo, tal como poli-(L-lisina). Además, se pueden unir agentes intercalantes, tales como elipticina, y agentes alquilantes o complejos metálicos a los oligonucleótidos codificantes o no codificantes para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido codificante o no codificante por la secuencia de nucleótidos seleccionada como
objetivo.

Se pueden introducir oligonucleótidos codificantes o no codificantes en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico seleccionada como objetivo mediante cualquier método de transferencia génica, que incluye, por ejemplo, la transfección de ADN mediada por CaPO_{4}^{-}, la electroporación, o usando vectores de transferencia génica tales como el virus de Epstein-Barr. Los oligonucleótidos codificantes o no codificantes se introducen preferiblemente en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico seleccionada como objetivo mediante la inserción del oligonucleótido codificante o no codificante en un vector retroviral adecuado, y después poniendo en contacto la célula con el vector retroviral que contiene la secuencia insertada, in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no se limitan a, los derivados del retrovirus murino M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV), o los vectores de copia doble designados DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase la solicitud PCT WO 90/13641).

También se pueden introducir los oligonucleótidos codificantes o no codificantes en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos seleccionada como objetivo mediante la formación de un conjugado con una molécula de unión a ligando, como se describe en el documento WO 91/04753. Las moléculas de unión a ligando adecuadas incluyen, pero no se limitan a, receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citocinas, u otros ligandos que se unen a receptores de superficie celular.

De forma alternativa, se puede introducir un oligonucleótido codificante o no codificante en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico seleccionada como objetivo mediante la formación de un complejo oligonucleótido-lípido, como se describe en el documento WO 90/10448. El complejo oligonucleótido codificante o no codificante-lípido se disocia preferiblemente dentro de la célula mediante una lipasa endógena.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar realizaciones particulares, y no para limitar el alcance de la invención

Ejemplo 1

Aislamiento de cADN que codifica 2F1 humano

Se aisló un ADN de 2F1 humano mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los cebadores empleados en la reacción fueron oligonucleótidos degenerados basados en dos regiones dentro del dominio citoplasmático de IL-1R de tipo I. Estas dos regiones están entre los motivos que están conservados en la familia de receptores de IL-1.

Inicialmente, se determinaron las condiciones apropiadas para la amplificación mediante PCR con los cebadores degenerados mediante el uso de receptores de IL-1 de tipo I humano y de ratón y clones de cADN de T1/ST2 de ratón como molde. Mediante el uso de las condiciones que se determinaron para proporcionar un producto de amplificación de cada uno de estos cADNs, se llevó a cabo la PCR usando un cromosoma artificial de levadura (YAC) de humano de 500 kb como molde. Este YAC, designado CO2133, contiene ADN de la región 2q12 de cromosoma humano, y se sabe que incluye el receptor IL-1 de tipo I, parte del receptor IL-1 de tipo II, y ST2 (Sims et al., Cytokine 7:483-490, 1995).

Las reacciones en cadena de la polimerasa (20 \mul) emplearon 0,5 \mul de una mezcla 16:1 de las ADN polimerasas Taq (Perkin-Elmer) y Vent (New England Biolabs), y contuvieron 200 pmoles de cada cebador, dNTPs 200 \muM y 5-10 \mul de ADN de YAC humano C02133, purificado parcialmente mediante extracción de un gel de campo pulsado. Las condiciones de los ciclos fueron: 5 minutos a 94ºC, durante cuyo tiempo se añadió la mezcla de ADN polimerasa; 40 ciclos de (1 minuto a 94ºC, 3 minutos a 35ºC, 1 minuto a 72ºC); seguido de 10 minutos a 72ºC. Los productos de reacción se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa de bajo punto de fusión. La banda que contenía material entre 90 y 150 pb de longitud se cortó, se fundió y se usaron 5 \mul como molde en una segunda PCR. La segunda reacción se realizó de manera similar a la primera, excepto en que se realizaron solamente 20 ciclos. Los productos de reacción se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa. Se eluyó la fracción de 90-150 pb, y el ADN se hizo romo mediante el uso de T4 ADN polimerasa, se fosforiló mediante el uso de T4 polinucleótido quinasa, se calentó durante 10 minutos a 65ºC, se precipitó con etanol y se ligó en un vector designado pCRScript (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) en presencia de la enzima de restricción SrfI.

Las células de E. coli DH10 se transformaron con los productos de ligadura. Se escogieron las colonias blancas de placas de Xgal, sus insertos se amplificaron mediante PCR mediante el uso de cebadores del vector, y se puso una pequeña cantidad en filtros de nailon. Los filtros se hibridaron subsiguientemente a 42ºC en condiciones acuosas con una mezcla de sondas oligonucleotídicas marcadas con ^{32}P derivadas de IL-1R de tipo I humano y murino. Los filtros se lavaron a 50ºC en NaCl 0,3 M. La hibridación se llevó a cabo en condiciones de rigurosidad relativamente baja.

Solamente hibridaron 5 de 180 insertos. La secuenciación aleatoria del ADN de 9 de los insertos que no hibridaron reveló que derivaban de ADN de levadura. Uno de los cinco insertos que hibridaron proporcionó una señal de hibridación fuerte, y la secuenciación del ADN reveló que éste se amplificó a partir del gen de IL-1R de tipo I. De los cuatro insertos que hibridaban débilmente, tres provenían de ADN de levadura, y se descubrió que uno representaba un gen nuevo, que se ha designado 2F1.

El fragmento de ADN de 2F1 así aislado se usó para analizar mediante sonda una biblioteca de cADN preparada a partir de linfocitos de sangre periférica humana (LSP), en un intento de aislar un clon de cADN de tamaño completo. Se identificaron los clones que hibridaban, y se aislaron tres clones de cADN de 2F1 a partir de la biblioteca de LSP. Se aislaron cuatro clones de 2F1 adicionales mediante PCR de la línea de carcinoma epidermoide humano KB (ATCC CCL 17).

Se dilucidó una secuencia de ADN de 2F1 humano mediante la secuenciación de estos clones. La secuencia de nucleótidos de la región codificante se presenta en la ID SEC Nº:1, y la secuencia de aminoácidos codificada por ella se presenta en la ID SEC Nº:2. La proteína de la ID SEC Nº:2 es una proteína transmembrana de tipo I, con un péptido señal N-terminal (aminoácidos -19 a -1) seguido de un dominio extracelular (aminoácidos 1 a 329), una región transmembrana (aminoácidos 330 a 351) y un dominio citoplasmático (aminoácidos 352 a 541). El codón de alanina 298 es polimórfico, y está presente en los clones de LSP y en dos de los clones de KB, y ausente de los otros dos clones de KB.

Ejemplo 2

Aislamiento de cADN de 2F1 murino

Se aisló cADN que codifica 2F1 murino mediante hibridación interespecies como sigue. Se usó cADN de 2F1 humano como sonda para cribar una biblioteca de cADN de ratón derivada de la línea celular designada EL4 6.1 (MacDonald et al., J. Immunol. 135:3944, 1985), que es un subclon de la línea celular de timoma EL4 (ATCC TIB 39). Se aisló un clon que hibridaba. Se presenta la secuencia nucleotídica de este cADN de 2F1 de ratón y la secuencia de aminoácidos codificada por ella en la ID SEC Nº:3 e ID SEC Nº:4.

La proteína de la ID SEC Nº:4 comprende un péptido señal (aminoácidos -18 a -1), un dominio extracelular (aminoácidos 1 a 307), una región transmembrana (aminoácidos 308 a 330), y un dominio citoplasmático (aminoácidos 331 a 519). La secuencia de aminoácidos de 2F1 de ratón de la ID SEC Nº:4 es idéntica en un 65% a la secuencia de aminoácidos de 2F1 humano presentada en la ID SEC Nº:2.

Ejemplo 3

Ensayo de unión

2F1 es un miembro de la familia de receptores de IL-1, como se discutió anteriormente. Ya que el dominio extracelular de 2F1 se parece al de los receptores de IL-1 de tipo I y de tipo II, se investigó la capacidad de 2F1 de unirse a los miembros de la familia de IL-1 como sigue.

Se ensayó la capacidad de 2F1 de unir IL-1\alpha e IL-1\beta (March et al. Nature (Lond.) 315:641, 1985), así como la proteína antagonista del receptor de IL-1 (Eisenberg et al. Nature 343:341, 1990; Hannum et al., Nature 343:336, 1990; y Carter et al., Nature 344:633, 1990). El antagonista del receptor de IL-1 (IL-1ra) se une a los receptores de IL-1, pero no transduce una señal. Al competir con IL-1 por la unión a los receptores de IL-1 endógenos, IL-1ra inhibe los efectos biológicos mediados por IL-1.

Se generó una proteína de fusión soluble designada 2F1/Fc, que comprende el dominio extracelular de 2F1 unido a la región Fc de una IgG1 humana, mediante procedimientos análogos a los descritos en Baum et al. (EMBO J. 13:3992-4001, 1994). Se preparó para el uso como control positivo una proteína de fusión soluble IL-1R de tipo I/Fc que comprende el dominio extracelular de IL-1R de tipo I humano fusionado al polipéptido de la región Fc.

Se usó un biosensor BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Piscataway, Nueva Jersey) para examinar la unión de los ligandos de IL-1 a la proteína de fusión 2F1/Fc humana, mediante el uso de procedimientos que se describen esencialmente en Arend et al. (J. Immunol. 153: 4766-4774, 1994). Brevemente, se usó un suero de cabra anti-IgG humana dirigido contra la región Fc (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA), unido covalentemente a la matriz de dextrano de un chip de hidrogel para capturar la proteína humana 2F1/Fc. La proteína de fusión 2F1/Fc se inmovilizó así en el chip de BIAcore. Se hicieron reaccionar los tres ligandos de IL-1, a varias concentraciones diferentes, con la proteína capturada, y se midió el cambio de masa por unidad de área a lo largo del
tiempo.

El análisis mediante biosensor demostró la unión fácilmente medible de IL-1\alpha, IL-1\beta e IL-1ra humanos a la proteína de fusión humana IL-1R de tipo I/Fc (control positivo). Sin embargo, no se detectó la unión de ninguna de las tres proteínas de IL-1 a la proteína de fusión 2F1/Fc. Así, a pesar de su homología de secuencia significativa, 2F1 no es un receptor de IL-1.

Ejemplo 4

Análisis de transferencia de Northern

Se investigó la presencia de ARNm de 2F1 en diversos tipos celulares mediante análisis de transferencia de Northern, mediante el uso de técnicas estándar. Las transferencias de Northern adquiridas de Clonetech, Palo Alto, California, que contienen 2 mg de ARN poliA^{+} humano en cada carril, se expusieron a una sonda durante la noche con una ribosonda de 2F1 no codificante marcada con ^{32}P a 63ºC en NaCl 0,75 M/50% de formamida, y se lavó a 63ºC en NaCl 0,3 M. Para determinar la uniformidad de la carga así como la efectividad de la eliminación del ARNr, los filtros se expusieron subsiguientemente a sondas para GAPDH y ARNr 28S.

Se halló una única banda de hibridación, que migraba con, o ligeramente más rápido que, el ARNr 28S en bazo, timo, leucocitos, hígado, pulmón, corazón, intestino delgado y grueso, próstata y placenta. Es posible, pero indeterminado, que se observase una señal débil en testículo y ovario. No se detectó ninguna banda que hibridase en cerebro, músculo esquelético, riñón y páncreas.

Ejemplo 5

Ensayo de señalización

Se investigó la capacidad de transducción de señal del dominio citoplasmático de 2F1 en el siguiente ensayo. Se construyó un vector de expresión que codifica un receptor quimérico, en el que las porciones extracelular y transmembrana del receptor de IL-1 de tipo I (IL-1RI) de ratón se fusionaron a la porción citoplasmática de 2F1 humano. El vector codificó los aminoácidos 1 a 362 de IL-1RI murino fusionado a los aminoácidos 332 a 522 de 2F1 humano. Al preparar la construcción, se introdujo un sitio de BglII en el ADN de IL-1RI murino, justo en 3' de la región transmembrana. Esto dio como resultado que el residuo de valina de la posición 361 del IL-1RI murino se cambiase a isoleucina, que es el aminoácido presente en el IL-1RI humano en esa posición.

El uso del receptor quimérico hizo posible ensayar la respuesta a un ligando conocido (IL-1). Cuando se ponen en contacto células que expresan IL-1RI con IL-1\alpha o IL-1\beta, se inducen varias respuestas, que incluyen la estimulación de la localización nuclear del factor de transcripción NF-\kappaB (Thanos, D. y T. Maniatis, Cell 80:529-532, 1995). Los complejos NF-\kappaB activados se translocan hacia el núcleo y se unen a la secuencia de reconocimiento afín.

El receptor quimérico se expresó en células COS-7 (ATCC CRL 1651), y se examinó la capacidad de IL-1 de activar el factor de transcripción NF-\kappaB en un ensayo en gel de NF-\kappaB. Se usó un antisuero policlonal de oveja anti-IL-1RI humano (designado aquí P3) para bloquear el IL-1R de mono (con reactividad cruzada) endógeno, sin afectar a la unión de IL-1 a la proteína quimérica transfectada IL-1RI murino/2F1. Se emplearon como control negativo las células COS-7 transfectadas con un vector de expresión que codifica las porciones extracelular y transmembrana del IL-1RI murino, pero no el dominio citoplasmático. Como control positivo, se transfectaron las células COS-7 con un vector de expresión que codifica el IL-1RI murino de longitud completa.

El procedimiento de ensayo fue el siguiente. Las células COS-7 se transfectaron con las construcciones de receptor. Dos días tras la transfección, las células se trataron con el anticuerpo bloqueante y se estimularon (30 minutos, 1 ng/ml) con IL-1\alpha humano. Inmediatamente después del bloqueo y la estimulación con IL-1, se prepararon extractos nucleares a partir de muestras celulares, esencialmente como describió Ostrowski et al. (J. Biol. Chem. 266:12722-33, 1991). Una sonda oligonucleotídica sintética bicatenaria que contenía el elemento potenciador \kappaB de la cadena ligera k de inmunoglobulinas se marcó en el extremo 5' mediante fosforilación con [\gamma-^{32}P]ATP. Se incubaron los extractos nucleares (10 \mug) con la sonda marcada con ^{32}P durante 20 minutos a temperatura ambiente, y los complejos proteína-ADN se resolvieron después mediante electroforesis en geles de un 10% de poliacrilamida y 0,5 X TBE (Novex). NF-\kappaB complejado con ADN indica la activación de NF-\kappaB.

Se descubrió que el dominio citoplasmático de 2F1 induce la capacidad de unión al ADN de NF-\kappaB, en respuesta a la estimulación con IL-1 de la molécula receptora quimérica. La inducción fue comparable en magnitud a la mediada por IL-1RI murino (control positivo).

Ejemplo 6

Ensayo de señalización

Se examinó adicionalmente la capacidad de señalización de 2F1 en un ensayo de activación del promotor de interleucina-8 (IL-8). Cuando las células que expresan IL-1R de tipo I se ponen en contacto con IL-1, se estimula la transcripción del gen de IL-8 (Mukaida et al., J. Biol. Chem. 265:21128-33, 1990). En este ensayo se empleó el receptor quimérico IL-1R/2F1 descrito en el ejemplo 5, de forma que se pudo investigar la respuesta a un ligando conocido (IL-1).

Se preparó un plásmido indicador designado pIL8p, que portaba un promotor de IL-8 humano parcial fusionado a la región codificante de la cadena alfa del receptor de IL-2 humano. Se cotransfectaron células COS7 (1 x 10^{5} células por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos) con 1500 ng de pIL8p y 500 ng de un vector de expresión que codifica el receptor quimérico IL-1R/2F1. Veinticuatro horas tras la transfección, se cambió el medio de cultivo y las células se pusieron en contacto con un anticuerpo bloqueante, después se estimularon con 1 ng/ml de IL-1\alpha humano o se dejaron sin estimular. El anticuerpo bloqueante fue una dilución 1:100 del suero policlonal de oveja anti-IL-1RI humano P3 (véase el ejemplo 5), que a esa concentración bloquea la unión de IL-1 a los receptores endógenos de IL-1 de las células COS7, pero que no tiene efecto sobre la unión de IL-1 a la porción de IL-1RI de ratón del receptor quimérico recombinante.

De doce a dieciséis horas tras la estimulación, las células se lavaron dos veces con medio de unión que contenía un 5% (p/v) de leche descremada en polvo (5% de MBM), y se bloqueó con 2 ml de un 5% de MBM a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las células se incubaron después a temperatura ambiente durante 60-90 minutos con 1,5 ml/pocillo de un 5% de MBM que contenía 1 \mug/ml de anticuerpo monoclonal de ratón 2A3 dirigido contra IL-2R\alpha (Cosman et al., Nature 312:768-771, 1984) con agitación suave. Las células se lavaron con un 5% de MBM, después se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con 1 ml/pocillo de un 5% de MBM que contenía una dilución 1:100 de [^{125}I]-anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri). Los pocillos se lavaron cuatro veces con un 5% de MBM, dos veces con PBS, después se trataron mediante la adición de 1 ml de NaOH 0,5 M, y se determinaron las cuentas por minuto.

Se descubrió que el receptor quimérico IL-1R/2F1 respondía a IL-1\alpha mediante la inducción de la función del promotor de IL-8. La transcripción de la construcción marcadora se indujo mediante la estimulación con IL-1 de la molécula quimérica IL-1R/2F1, hasta alrededor de la mitad del nivel mediado por el IL-1R de tipo I intacto de ratón.

Ejemplo 7

Síntesis de prostaglandinas

En un tercer ensayo, se expresó el receptor quimérico IL-1R/2F1 en células de carcinoma epidermoide humano KB (ATCC CCL 17). En presencia del antisuero policlonal que bloquea los receptores de IL-1 de tipo I humanos (véase el ejemplo 5), la estimulación con IL-1 del receptor quimérico dio como resultado la síntesis de prostaglandina E_{2}.

Ejemplo 8

Anticuerpos monoclonales dirigidos contra 2F1

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que son inmunorreactivos hacia una proteína 2F1. Se expresa 2F1 humano en células hospedadoras de mamíferos, tales como las células COS-7 o CV-1/EBNA-1. El 2F1 expresado se purifica y se emplea como inmunógeno para generar anticuerpos monoclonales, mediante el uso de técnicas convencionales tales como las descritas en la patente de EE.UU. 4.411.993. Los inmunógenos alternativos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de 2F1 (p.ej., 2F1 soluble que comprende el dominio extracelular), una proteína de fusión 2F1/Fc soluble, o las células que expresan 2F1 recombinante en la superficie celular.

Brevemente, se inmunizan ratones con 2F1 emulsionado en adyuvante completo de Freund e inyectado de forma subcutánea o intraperitoneal en cantidades que oscilan en 10-100 \mug. De diez a doce días más tarde, los animales inmunizados se refuerzan con 2F1 adicional emulsionado en adyuvante incompleto de Freund. Los ratones se refuerzan después en un calendario de inmunizaciones semanales a bisemanales. Se toman muestras de suero periódicamente mediante extracción retroorbital o escisión de la punta de la cola para analizar los anticuerpos de 2F1 mediante ensayo de transferencia en mancha o ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas).

Tras la detección de un título de anticuerpos apropiado, se proporciona a los animales positivos una última inyección intravenosa de 2F1 en solución salina. Tres a cuatro días más tarde, se sacrifican los animales y se recogen las células del bazo y se fusionan con una línea celular de mieloma murino, por ejemplo, NS1 o preferiblemente P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan células de hibridoma, que se colocan en placas de microtitulación múltiples en un medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de las células sin fusionar, los híbridos de mieloma y los híbridos de células de bazo.

Las células de hibridoma se criban mediante ELISA en función de la reactividad contra 2F1 purificado mediante adaptaciones de las técnicas descritas en Engvall et al. (Immunochem. 8:871, 1971) y en la patente de EE.UU. 4.703.004. Una técnica de cribado preferida es la técnica de captura con anticuerpos descrita en Beckmann et al. (J. Immunol. 144:4212, 1990). Las células de hibridoma positivas se pueden inyectar de manera intraperitoneal en ratones BALB/c singénicos para producir líquido ascítico que contiene concentraciones elevadas de anticuerpos monoclonales anti-2F1. De forma alternativa, las células de hibridoma se pueden cultivar in vitro en matraces o en botellas de agitador rotatorio mediante diversas técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en líquido ascítico de ratón se pueden purificar mediante precipitación con sulfato amónico, seguido de cromatografía de exclusión en gel. De forma alternativa, se puede usar también cromatografía de afinidad basada en la unión del anticuerpo a proteína A o proteína G, del mismo modo que se puede usar la cromatografía de afinidad basada en la unión a 2F1.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Immunex Corporation

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteína receptora designada 2F1

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 5

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(iv): DIRECCIÓN POSTAL:

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(A): DESTINATARIO: Janis C. Henry, Immunex Corporation

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(B): CALLE: 51 University Street

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(C): CIUDAD: Seattle

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(D): ESTADO: WA

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): CÓDIGO POSTAL: 98101

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(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B): ORDENADOR: IBM PC Compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS/windows 95

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(D): SOPORTE INFORMÁTICO: Word para Windows 95, 7.0a

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD EN CURSO:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US97/01697

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-FEB-1997

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/604.333

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-FEB-1996

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(viii): INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE/AGENTE:

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(A): NOMBRE: Henry, Janis C.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 34.347

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 2619-WO

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A): TELÉFONO: (206) 587-0430

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(B): TELEFAX: (206) 233-0644

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(C): TÉLEX: 756822

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1626 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: simple

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

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(iii): HIPOTÉTICO: NO

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(iv): NO CODIFICANTE: NO

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(vii): FUENTE INMEDIATA:

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(B): CLON: hu2F1

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 1..1626

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: péptido_mat

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(B): LOCALIZACIÓN: 58..1623

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: péptido_sig

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(B): LOCALIZACIÓN: 1..57

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:1:

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1

2

3

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 542 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:2:

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4

5

6

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 2830 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

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(iii): HIPOTÉTICO: NO

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(iv): NO CODIFICANTE: NO

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(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: mu2F1

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(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 381..1994

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: péptido_mat

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(B): LOCALIZACIÓN: 435..1991

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: péptido_sig

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(B): LOCALIZACIÓN: 381..434

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:3:

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7

8

9

10

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 538 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:4:

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11

12

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:5:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENA: simple

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(iii): HIPOTÉTICO: NO

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(iv): NO CODIFICANTE: NO

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(vii): FUENTE INMEDIATA:

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(B): CLON: péptido FLAG

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:5:

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13

Claims

1. Un ADN aislado que codifica un polipéptido 2F1, en el que dicho 2F1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los residuos -19 a 552 de la ID SEC Nº:2, los residuos 1 a 552 de la ID SEC Nº:2, los residuos -19 a 310 de la ID SEC Nº:2, los residuos 1 a 310 de la ID SEC Nº:2, los residuos -18 a 519 de la ID SEC Nº:4, los residuos 1 a 519 de la ID SEC Nº:4, los residuos -18 a 307 de la ID SEC Nº:4 y los residuos 1 a 307 de la ID SEC Nº:4.

2. Un ADN de la reivindicación 1, en el que dicho ADN codifica un polipéptido 2F1 humano soluble que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 a 310 de la ID SEC Nº:2.

3. Un ADN de la reivindicación 1, en el que dicho ADN comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 1 a 1626 de la ID SEC Nº:1, los nucleótidos 58 a 1626 de la ID SEC Nº:1, los nucleótidos 1 a 985 de la ID SEC Nº:1, los nucleótidos 58 a 985 de la ID SEC Nº:1, los nucleótidos 381 a 1994 de la ID SEC Nº:3, los nucleótidos 435 a 1994 de la ID SEC Nº:3, los nucleótidos 381 a 1355 de la ID SEC Nº:3 y los nucleótidos 435 a 1355 de la ID SEC Nº:3.

4. Un ADN aislado que codifica un polipéptido 2F1, en el que dicho polipéptido 2F1 comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 80% a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los residuos 1 a 522 de la ID SEC Nº:2 y los residuos 1 a 519 de la ID SEC Nº:4.

5. Un ADN de la reivindicación 4, en el que dicho ADN codifica un polipéptido 2F1 humano que comprende la secuencia de los aminoácidos 1 a 297 y 299 a 522 de la ID SEC Nº:2, con la condición de que dicho polipéptido 2F1 carezca del residuo de la posición 298 de la ID SEC Nº:2.

6. Un ADN de la reivindicación 4, en el que dicho ADN codifica un polipéptido 2F1 humano soluble que comprende la secuencia de los aminoácidos 1 a 297 y 299 a 310 de la ID SEC Nº:2, con la condición de que dicho polipéptido 2F1 carezca del residuo de la posición 298 de la ID SEC Nº:2.

7. Un ADN aislado que codifica un polipéptido 2F1 soluble, en el que dicho ADN aislado es capaz de hibridar con un ADN de la reivindicación 3 en unas condiciones de 68ºC seguido de lavado en 0,1X SSC/0,1% de SDS a 68ºC, en el que dicho polipéptido 2F1 soluble es capaz de inhibir la activación de NF-\kappaB.

8. Un ADN de la reivindicación 7, en el que dicho polipéptido 2F1 soluble comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 80% a la secuencia de los residuos 1 a 310 de la ID SEC Nº:2.

9. Un ADN de la reivindicación 7, en el que dicho ADN codifica el polipéptido 2F1 humano soluble seleccionado del grupo que consiste en:

a): el dominio extracelular de 2F1 humano de la ID SEC Nº:2, y

b): un fragmento de dicho dominio extracelular, en el que dicho fragmento es capaz de inhibir la activación de NF-\kappaB.

10. Un vector de expresión que comprende un ADN de la reivindicación 1, 4, 7 ó 9.

11. Un proceso para preparar un polipéptido 2F1, que comprende cultivar una célula hospedadora transformada con un vector de la reivindicación 10 en condiciones que favorecen la expresión de 2F1, y recuperar el polipéptido 2F1.

12. Un polipéptido 2F1 purificado, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de los residuos -19 a 552 de la ID SEC Nº:2, los residuos 1 a 552 de la ID SEC Nº:2, los residuos -19 a 310 de la ID SEC Nº:2, los residuos 1 a 310 de la ID SEC Nº:2, los residuos -18 a 519 de la ID SEC Nº:4, los residuos 1 a 519 de la ID SEC Nº:4, los residuos -18 a 307 de la ID SEC Nº:4 y los residuos 1 a 307 de la ID SEC Nº:4.

13. Un polipéptido 2F1 de la reivindicación 12, en el que dicho 2F1 es un polipéptido 2F1 humano soluble que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 a 310 de la ID SEC Nº:2.

14. Un polipéptido 2F1 purificado, en el que dicho 2F1 comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 80% a la secuencia seleccionada del grupo que consiste en los residuos 1 a 522 de la ID SEC Nº:2 y los residuos 1 a 519 de la ID SEC Nº:4.

15. Un polipéptido 2F1 de la reivindicación 14, en el que dicho 2F1 es un polipéptido 2F1 humano que comprende la secuencia de los aminoácidos 1 a 297 y 299 a 522 de la ID SEC Nº:2, con la condición de que dicho polipéptido 2F1 carezca del residuo de la posición 298 de la ID SEC Nº:2.

\newpage

16. Un polipéptido 2F1 de la reivindicación 14, en el que dicho 2F1 es un polipéptido 2F1 humano soluble que comprende la secuencia del aminoácido 1 a 297 y 299 a 310 de la ID SEC Nº:2, con la condición de que dicho polipéptido 2F1 carezca del residuo de la posición 298 de la ID SEC Nº:2.

17. Un polipéptido 2F1 soluble purificado, en el que dicho 2F1 está codificado por el ADN según la reivindicación 7.

18. Un polipéptido 2F1 soluble de la reivindicación 17, en el que dicho 2F1 comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 80% a la secuencia de los residuos 1 a 310 de la ID SEC Nº:2.

19. Un polipéptido soluble de la reivindicación 17, en el que dicho 2F1 es un polipéptido 2F1 humano soluble seleccionado del grupo que consiste en:

a): el dominio extracelular de 2F1 humano de la ID SEC Nº:2, y

20. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido 2F1 soluble de la reivindicación 18 ó 19 y un diluyente o vehículo adecuado.

21. Un anticuerpo que se dirige contra un polipéptido 2F1 según la reivindicación 12.

22. Un anticuerpo según la reivindicación 21, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

23. Un polipéptido 2F1 soluble según la reivindicación 17 ó 18 para el uso en un medicamento.

24. El uso de un polipéptido 2F1 soluble según la reivindicación 17 ó 18 en la preparación de un medicamento para la inhibición de la activación de NF-\kappaB en un mamífero.

25. El uso de un polipéptido 2F1 soluble según la reivindicación 17 ó 18 en la preparación de un medicamento para la reducción de la inflamación en un mamífero que padece una enfermedad inflamatoria.

26. Un oligómero que comprende de dos a cuatro polipéptidos 2F1 humanos solubles según la reivindicación 17 ó 18.

27. Una composición que comprende el anticuerpo de la reivindicación 21 ó 22.

28. La composición de la reivindicación 27 para el uso como un medicamento.

29. La composición de la reivindicación 27 para el uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

30. El uso de la composición de la reivindicación 27 para la fabricación de un medicamento para tratar enfermedades inflamatorias.

31. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29 o el uso de la reivindicación 30, en la que la enfermedad inflamatoria es artritis, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, alergia, asma o enfermedad inflamatoria intestinal.