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ES2394129T3 - Construcciones que contienen múltiples casetes de expresión para terapia de cáncer - Google Patents

Construcciones que contienen múltiples casetes de expresión para terapia de cáncer Download PDF

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ES2394129T3
ES2394129T3 ES08842129T ES08842129T ES2394129T3 ES 2394129 T3 ES2394129 T3 ES 2394129T3 ES 08842129 T ES08842129 T ES 08842129T ES 08842129 T ES08842129 T ES 08842129T ES 2394129 T3 ES2394129 T3 ES 2394129T3
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ES
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igf
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dta
seq
promoter
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ES08842129T
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Avraham Hochberg
Doron Amit
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Original Assignee
Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
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Abstract

Una construcción de ácido nucleico, que comprende:un primer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando el primer marco abierto de lecturaunido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19; yun segundo marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando el segundo marco abierto delectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción de IGF-II seleccionada de lassecuencias P4 de IGF-II y P3 de IGF-II,o que comprende:un primer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando dicho primer marco abierto delectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II; yun segundo marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando dicho segundo marco abierto delectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II,en la que:la secuencia reguladora de la transcripción específica de H19 es un promotor cuya secuencia es SEC ID Nº: 1 oSEC ID Nº: 2; la secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II es una secuencia seleccionada de SECID Nº: 9 y SEC ID Nº: 13; y la secuencia P3 de IGF-II es SEC ID Nº: 17 o se selecciona de SEC ID Nº: 8 y SECID Nº: 12.

Description

Construcciones que contienen múltiples casetes de expresión para terapia de cáncer
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo del tratamiento de cáncer, específicamente a nuevas construcciones de ácido nucleico que son particularmente útiles para tratar tumores que expresan H19 y/o IGF-II.
Antecedentes de la invención
La neoplasia es un proceso que se produce en cáncer, por el que los mecanismos de control normales que regulan el crecimiento y la diferenciación celulares se alteran, dando como resultado crecimiento progresivo. Esta alteración de los mecanismos de control permite que un tumor se amplíe y ocupe espacios en áreas vitales del cuerpo. Si el tumor invade el tejido circundante y se transporta a sitios distantes (metástasis) probablemente dé como resultado la muerte del individuo.
El objetivo deseado de la terapia de cáncer es eliminar preferentemente células cancerosas, sin tener un efecto deletéreo en células normales. Se han usado varios procedimientos en un intento de alcanzar este objetivo, incluyendo cirugía, radioterapia y quimioterapia.
Los tratamientos locales, tales como radioterapia y cirugía, ofrecen un medio para reducir la masa tumoral en regiones del cuerpo que sean accesibles a través de técnicas quirúrgicas o altas dosis de radioterapia. Sin embargo, se necesitan terapias locales más eficaces con menos efectos secundarios. Además, estos tratamientos no son aplicables a la destrucción de células tumorales ampliamente diseminadas o en circulación que se encuentran con el tiempo en la mayoría de los pacientes con cáncer. Para combatir la propagación de células tumorales, se usan terapias sistémicas.
Un tratamiento sistémico tal es la quimioterapia. La quimioterapia es el principal tratamiento para cánceres malignos diseminados. Sin embargo, los agentes quimioterapéuticos están limitados en su eficacia para tratar muchos tipos de cáncer, incluyendo muchos tumores sólidos habituales. Esta limitación se debe en parte a la resistencia a fármacos intrínseca o adquirida de muchas células tumorales. Otro inconveniente del uso de agentes quimioterapéuticos son sus graves efectos secundarios. Estos incluyen supresión de médula ósea, náuseas, vómitos, pérdida de cabello y úlceras en la boca. Claramente, se necesitan nuevos enfoques para potenciar la eficacia con la que un agente quimioterapéutico puede destruir células tumorales malignas, evitando a la vez la toxicidad sistémica.
H19 en diagnóstico y terapia
El gen H19 es uno de varios genes que se sabe que están impresos en seres humanos (Hurst y col., 1996, Nature Genetics 12: 234 237). Al comienzo de la embriogénesis, H19 se expresa a partir de ambos alelos cromosómicos (DeGroot y col., 1994, Trophoblast 8: 285 302). Poco después, se produce el silenciamiento del alelo paterno, y solo se transcribe el alelo heredado materno.
H19 se expresa abundantemente durante la embriogénesis y se identificó en primer lugar como un gen que estaba regulado de forma coordinada con alfa-fetoproteína en el hígado por el locus de acción en trans raf (Pachnis y col., 1984, “Locus unlinked to alpha-fetoprotein under the control of the murine raf and Rif genes”, Proc Natl Acad Sci. 81: 5523 5527). Adicionalmente, se ha clonado H19 de forma independiente por varios grupos usando exploraciones dirigidas a aislar genes expresados durante la diferenciación tisular. Por ejemplo, se identificó el homólogo de ratón de H19 en una exploración con respecto a genes que estaban activos durante la diferenciación temprana de células C3H10T1/2 (Davis y col., 1987, “Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts”, Cell
51:987 1000). De forma similar, se mostró que H19 murino se expresaba durante la diferenciación de células madre y en el momento de la implantación (Poirier y col., 1991, “The murine H19 gene is activated during embryonic stem cell differentiation in vitro and at the time of implantation in the developing embryo”, Development 113: 1105 1114). También se descubrió transcripción del gen H19 humano en la diferenciación de citotrofoblastos de placenta humana (Rachmilewitz y col., 1992, Molec. Reprod. Dev. 32: 196 202).
Aunque se produce transcripción de ARN de H19 en muchos tejidos embrionarios diferentes durante la vida fetal y el desarrollo placentario, la expresión de H19 se regula negativamente después del nacimiento, aunque se han indicado niveles bajos de transcripción de H19, por ejemplo, en músculo e hígado adulto murino (Brunkow y Tilghman, 1991, “Ectopic expression of the H 19 gene in mice causes prenatal lethality”, Genes Dev. 5: 1092 1101).
La transcripción de H19 puede reactivarse después del nacimiento en células cancerosas como se ha demostrado en tumores derivados de tejidos que expresan H19 antes del nacimiento (Ariel y col., 1997, “The product of the imprinted H19 gene is an oncofetal RNA”, Mol Pathol. 50: 34 44). Adicionalmente, ARN H19 se expresa después del nacimiento en algunos tumores, en particular astrocitoma y ganglioneuroblastoma, que derivan de tejidos neurales que no se sabe que expresen H19 (Ariel y col. mencionado anteriormente). Puesto que el ARN de H19 se expresa en muchos tipos de tumores y cánceres, Ariel y col. especularon que el ARN de H19 era un ARN oncofetal, y
propusieron investigar H19 como un marcador tumoral para neoplasia humana.
H19 se expresa de forma significativa en el 84 % de los carcinomas de vejiga humanos, reduciéndose la expresión con la diferenciación de pérdida tumoral. Independientemente del grado tumoral, el nivel de expresión de H19 se correlacionaba de forma significativa con reaparición de tumor temprana (Ayesh, B., y col, Mol Ther, 2003. 7(4): p. 535-41).
La comparación de los patrones de expresión génica en dos poblaciones celulares homogéneas que difieren solamente en la presencia o ausencia de ARN de H19 ha identificado una multitud de efectores corriente abajo de ARN de H19. Entre estos están los grupos de genes que se ha indicado previamente que desempeñan papeles cruciales en algunos aspectos del proceso tumorogénico. La presencia de ARN de H19 puede potenciar la capacidad invasiva, migratoria y angiogénica de la célula regulando positivamente genes que actúen en esas rutas, y de este modo podría contribuir al menos a las etapas iniciales de la cascada metastásica. Estudios adicionales destacan el papel potencial de H19 en la promoción de la progresión de cáncer y metástasis tumoral siendo un gen sensible al factor de crecimiento/factor de dispersión de Hepatocitos (HGF/SF).
La expresión específica del gen de H19 en células cancerosas ha impulsado su uso en aplicaciones clínicas para diagnosticar cáncer. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.955.273 enseña el uso del gen H19 como un marcador específico tumoral. El documento PCT Pub. Nº WO 2004/024957 desvela el uso de H19 para la detección, en un paciente sospechoso de tener cáncer, de la presencia de células cancerosas residuales o micrometástasis que se originan de tumores sólidos.
IGF-II
El factor de crecimiento de tipo insulina II (IGF-II) se expresa la mayoría de los carcinomas de vejiga tales como carcinomas de células transicionales (TCC; Ariel, I., y col., The imprinted H19 gene is a marker of early recurrence in human bladder carcinoma. Mol Pathol, 2000. 53(6): p. 320-3). Las actividades biológicas están mediadas por la unión con los receptores de superficie celular, receptor de IGF-I (IGF-1R), receptor de IGF-II (IGF-2R) y receptor de insulina (IR). Los receptores de IGF están presentes en casi todos los tejidos de animales fetales y adultos. IGF-2R se une a IGF-II con la mayor afinidad, mientras que el IGF-1R e IR posen afinidad alta, pero menor por IGF-II que por sus ligandos respectivos. IGF-II es un potente factor de crecimiento embrionario y tumoral que señaliza mediante el IGF1R a través de las rutas de señalización proteína quinasa activada por mitógeno/Ras, fosfatidilinositol 3quinasa/Akt/FOXO, y diana de rapamicina de mamífero/S6K (mTOR) para modificar la proliferación celular, supervivencia celular, expresión génica y crecimiento celular.
IGF-II es otro gen impreso cuya expresión depende de su origen parental. Sin embargo a diferencia de H19, IGF-II está impreso por vía materna tanto en ratones como en seres humanos, y por lo tanto se expresa a partir del alelo heredado por vía paterna (Rainier y col., 1993, “Relaxation of imprinted genes in human cancer”, Nature 362: 747 749). El gen IGF-II humano muestra un patrón transcripcional complejo. Hay cuatro promotores de IGF-II que se activan de una manera específica de tejido y específica de desarrollo. Solamente tres de los promotores de IGF-II (es decir, P2, P3 y P4) están impresos y activos durante el desarrollo fetal y en tejidos cancerosos. El promotor P3 del gen IGF-II se ha implicado en la progresión de cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular (Seo y col., 1998, “Different protein-binding patterns in the P3 promoter region of the human insulin-like growth factor II gene in the human liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma tissues”, J Korean Med Sci. 13: 171 178).
El cuarto promotor de IGF-II (es decir, P1) no está impreso y se activa en el hígado y los plexos coroideos del adulto (Véase Holthuizen y col., 1993, “Transcriptional regulation of the major promoters of the human IGF-II gene”, Mol Reprod Dev. 35: 391 393).
La pérdida de impresión de IGF-II se ha implicado en el tumor de Wilm (Ogawa y col., 1993, “Relaxation of insulinlike growth factor II gene imprinting implicated in Wilm’s tumour”, Nature 362: 749 751). Esta observación condujo a muchos investigadores a especular que la pérdida de impresión y expresión bialélica de genes impresos puede estar implicada en trastornos del crecimiento y el desarrollo de cáncer (Rainier y col., 1993, Nature 362: 747 749; Glassman y col., 1996, “Relaxation of imprinting in carcinogenesis”, Cancer Genet Cytogenet. 89: 69 73).
Se produce modificación epigenética y mutaciones del sistema de señalización de IGF-II en cánceres tales como tumores colorrectales humanos (Hassan AB, Macaulay VM. The insulin-like growth factor system as a therapeutic target in colorectal cancer. Ann Oncol 2002; 13: 349-56). El aporte de IGF-II con frecuencia se regula positivamente, y el análisis en serie de la expresión génica ha mostrado que IGF-II es un gen habitualmente sobreexpresado en varias líneas celulares de cáncer y tumores, por ejemplo carcinoma de vejiga humana y cáncer colorrectal (Zhang L, Zhou W, Velculescu VE, y col. Gene expression profiles in normal and cancer cells. Science 1997; 276: 1268-72).
El documento WO 99/18195 y la Patente de Estados Unidos Nº 7.041.654 enseña la expresión específica de secuencias heterólogas, particularmente genes que codifican productos citotóxicos (por ejemplo, toxina Diftérica), en células tumorales bajo el control de un promotor específico de cáncer (por ejemplo, un promotor y potenciador de H19, promotor P3 de IGF-II, promotor P4 de IGF-II o promotor de IGF-1).
El documento WO 04/031359 enseña un procedimiento para regular la expresión de genes que controlan la angiogénesis en células que están implicadas en neovascularización, que comprende administrar a las células una cantidad eficaz de un modulador de H19.
El documento WO 2007/034487 desvela una construcción de ácido nucleico que comprende: (i) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica TNF alfa; (ii) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una toxina Diftérica; y (iii) al menos una secuencia de ácido nucleico adicional que comprende un promotor específico de cáncer (por ejemplo promotores de H19, de IGF-1, P3 de IGF-II o P4 de IGF-II); estando las secuencias que codifican TNF alfa y toxina Diftérica bajo un control de expresión del promotor específico de cáncer. También se proporcionan sistemas de construcción y procedimientos y usos de los mismos.
El documento WO 2007/007317 desvela oligonucleótidos aislados capaces de regular negativamente un nivel de ARNm de H19 en células de cáncer, artículos de fabricación que comprenden agentes capaces de regular negativamente el ARNm de H19 en combinación con un tratamiento antineoplásico adicional así como procedimientos para tratar cáncer administrando los mismos. El documento WO 2007/007317 desvela que los fármacos antineoplásicos pueden coadministrarse con los oligonucleótidos reivindicados.
El documento WO 2008/087641 desvela composiciones y procedimientos para tratar artritis reumatoide, utilizando agentes de ácido nucleico silenciadores de H19 tales como ARN inhibidor.
El documento WO 2008/087642 desvela composiciones y procedimientos para tratamiento de cáncer y otras afecciones que están asociadas con expresión elevada del gen H19, utilizando agentes de ácido nucleico silenciadores de H19 tales como ARN inhibidor.
El documento WO 2008/099396 desvela composiciones y procedimientos para tratar reestenosis, utilizando agentes de ácido nucleico silenciadores de H19 tales como ARN inhibidor.
Ohana P. y col.; Journal of Gene Medicine; 7 (2005); pp. 366-374 desvela secuencias reguladoras del H19 y P3 y P4 de IGF-II para dirigir la expresión selectiva de tumores de un fragmento de toxina diftérica.
Ohana P. y col.; International Journal of Cancer; 98 (2002), pp. 645-650 se refiere a un enfoque de terapia génica de tumores. Se proporcionan construcciones que comprenden bajo el control regulador del promotor H19 el gen para el fragmento A de la toxina diftérica o timidina quinasa del virus del herpes.
Ninguna de las referencias anteriores desvela o sugiere una construcción única que contenga múltiples fases abiertas de lectura que expresen toxina diftérica, en las que la toxina diftérica se exprese a partir de una pluralidad de promotores.
El uso de un promotor único (por ejemplo, un promotor de H19 o un promotor P3 o P4 de IGF-II) solo para expresión de un gen citotóxico o citostático a partir de una construcción terapéutica antineoplásica presenta varios problemas no resueltos. En primer lugar no todos los tumores de un tipo dado de cáncer (por ejemplo carcinoma de vejiga, cáncer de vejiga superficial, etc.) son positivos para expresión a través del promotor de H19 o el promotor P3 o P4 de IGF-II. Por lo tanto, dicha terapia fracasará en una considerable proporción de pacientes, incluso sin tener en cuenta la mutagénesis tumoral. La determinación de sensibilidad a tales construcciones implicaría la etapa costosa y difícil de genotipar tumores individuales.
Se sabe que los tumores muestran inestabilidad y heterogenicidad genómica significativa. Por lo tanto, incluso individuos con un tumor que exprese H19, por ejemplo, probablemente contengan un número considerable de células cancerosas que han regulado negativamente o suprimido la expresión de H19 mediante mutación. Por lo tanto, la expresión del gen citotóxico o citostático a partir de un promotor único en tales pacientes puede dar como resultado regresión tumoral temporal y parcial que rápidamente se invertirá cuando las células que contienen estas mutaciones sobrevivan y se multipliquen rápidamente.
Sigue existiendo la necesidad médica no satisfecha de desarrollar modalidades terapéuticas seguras y eficaces adicionales útiles en terapia de cáncer.
La inclusión o la descripción de referencias de bibliografía en la presente sección o cualquier otra parte de la presente solicitud no constituyen una admisión de que las referencias se consideran técnica anterior de la presente invención.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere al campo de tratamiento de cáncer, y en particular a nuevas construcciones de ácido nucleico y vectores de expresión que son particularmente útiles para tratar tumores que expresen H19 y/o Factor de Crecimiento de Tipo Insulina II (IGF-II).
La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Puede proporcionarse una construcción de ácido nucleico que comprende:
(a)
un primer marco abierto de lectura que codifica un producto génico citotóxico o citostático, estando el primer marco abierto de lectura unido operativamente a una primera secuencia reguladora de la transcripción; y
(b)
un segundo marco abierto de lectura que codifica el producto génico citotóxico o citostático, estando el
5 segundo marco abierto de lectura unido operativamente a una segunda secuencia reguladora de la transcripción;
en la que la primera secuencia reguladora de la transcripción y la segunda secuencia reguladora de la transcripción son diferentes, y se seleccionan del grupo que consiste en: i) secuencias reguladoras de la transcripción específicas de H19 y ii) secuencias reguladoras de la transcripción de IGF-II seleccionadas de P3 de IGF-II y P4 de IGF-II.
10 Por ejemplo, las secuencias reguladoras de la transcripción pueden ser:
i) una primera secuencia reguladora de la transcripción que es una secuencia reguladora de la transcripción
específica de H19 y una segunda secuencia reguladora de la transcripción que es una secuencia
reguladora de la transcripción P4 de IGF-II;
ii) una primera secuencia reguladora de la transcripción que es una secuencia reguladora de la
15 transcripción específica de H19, y una segunda secuencia reguladora de la transcripción que es una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II; o
iii) una primera secuencia reguladora de la transcripción que es una secuencia reguladora de la
transcripción P4 de IGF-II y una segunda secuencia reguladora de la transcripción que es una secuencia
reguladora de la transcripción P3 de IGF-II;
20 Opcionalmente, dicha construcción puede comprender además un tercer marco abierto de lectura que codifica el producto génico citotóxico o citostático, estando el tercer marco abierto de lectura unido operativamente a una tercera secuencia reguladora de la transcripción seleccionada de secuencias reguladoras de la transcripción específicas de H19, secuencias reguladoras de la transcripción P3 de IGF-II y secuencias reguladoras de la transcripción P4 de IGF-II.
25 Puede proporcionarse una construcción de ácido nucleico que comprende: a) un primer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando el primer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19 y b) un segundo marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando el segundo marco abierto de lectura unido operativamente a una primera secuencia reguladora de la transcripción de IGF-II seleccionada de las secuencias P4 de IGF-II y P3 de IGF-II.
30 Dicha construcción de ácido nucleico puede comprender además un tercer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando dicho tercer marco abierto de lectura unido operativamente a una segunda secuencia reguladora de la transcripción de IGF-II seleccionada de secuencias P4 de IGF-II y P3 de IGF-II, en la que la primera secuencia reguladora de la transcripción de IGF-II y la segunda secuencia reguladora de la transcripción de IGF-II son diferentes. Por ejemplo, el segundo marco abierto de lectura puede estar unida operativamente con una
35 secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II y el tercer marco abierto de lectura puede estar unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II, o como alternativa el segundo marco abierto de lectura puede estar unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II y el tercer marco abierto de lectura puede estar unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II.
40 Puede proporcionarse una construcción de ácido nucleico, que comprende: a) un primer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando dicho primer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IFG-II; y b) un segundo marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando dicho segundo marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II.
45 Dicha construcción de ácido nucleico puede comprender además un tercer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando dicho tercer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19.
En las construcciones, la toxina diftérica, puede ser, por ejemplo, una cadena A de toxina diftérica (toxina diftérica A, DTA), por ejemplo una toxina que tenga una secuencia de aminoácidos que comprenda una secuencia como se
50 expone en SEC ID Nº: 7, como se detalla posteriormente en el presente documento.
La secuencia reguladora de la transcripción puede ser una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor o potenciador) que induzca o potencie la expresión de forma selectiva (o, preferentemente) en células cancerosas, como se detalla en el presente documento.
La expresión “secuencia reguladora de la transcripción de IGF-II” puede referirse a una secuencia que regula la
transcripción de una manera específica (o diferencial) y se encuentra en asociación con un gen de IGF-II en un cromosoma, por ejemplo un cromosoma humano. “Secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II” y “secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II” pueden referirse a un promotor P3 o P4 (respectivamente). Las expresiones también pueden referirse a una secuencia reguladora de la transcripción derivada de un promotor P3 o P4 (respectivamente). Las expresiones pueden referirse adicionalmente a una de las secuencias reguladoras de la transcripción específicas de P3 o P4 (respectivamente) desveladas en el presente documento.
Por ejemplo, la secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II puede ser un promotor que comprenda una secuencia de ácido nucleico expuesta en SEC ID Nº: 9, como se detalla posteriormente en el presente documento. Los ejemplos de promotores P3 de IGF-II incluyen promotores que comprenden una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 12 y SEC ID Nº: 17, como se detalla posteriormente en el presente documento.
“Secuencia reguladora de la transcripción específica de H19” puede referirse a una secuencia que regula la transcripción de una manera específica (o diferencial) y se encuentra en asociación con un gen H19 en un cromosoma, por ejemplo un cromosoma humano. La expresión puede referirse también a un promotor específico de H19. La expresión puede referirse adicionalmente a una secuencia reguladora de la transcripción derivada de un promotor de H19. La expresión puede referirse a una de las secuencias reguladoras de la transcripción específicas de H19 desveladas en el presente documento. Por ejemplo, la secuencia reguladora de la transcripción específica de H19 puede ser un promotor que comprenda una secuencia de ácido nucleico expuesta en una cualquiera de SEC ID Nº: 1-2, como se detalla posteriormente en el presente documento.
Tales construcciones proporcionan un tratamiento particularmente eficaz y seguro dirigido específicamente a tumores malignos que expresan H19 y/o que expresan IGF-II a partir del promotor P3 y/o P4. Provechosamente, se desvela ahora que las construcciones inducen respuestas en un mayor número de células y/o mayor proporción de pacientes, proporcionando de este modo un tratamiento de cáncer mejorado en comparación con la terapia conocida hasta ahora.
Dicha construcción de ácido nucleico puede ser un plásmido. Puede proporcionarse un vector de expresión eucariota que comprenda una construcción de ácido nucleico.
Puede usarse una construcción de ácido nucleico (por ejemplo una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción de ácido nucleico) para reducir o aliviar un síntoma asociado con un trastorno neoplásico en un sujeto humano que lo necesite. La construcción de ácido nucleico puede usarse en el tratamiento de un tumor, o inhibición de la progresión tumoral o inhibición de la metástasis tumoral en un sujeto humano que lo necesite.
Dicho sujeto puede estar aquejado de un tumor caracterizado por expresión de ARN de H19 en al menos una parte de las células del tumor, por ejemplo, en el que una célula de dicho tumor es capaz de expresar un transcrito dirigido por el promotor de H19, un transcrito dirigido por el promotor P4 de IGF-II y/o un transcrito dirigido por el promotor P3 de IGF-II.
Las construcciones también pueden estar en forma de un kit o un envase farmacéutico que contenga uno o más ciclos de tratamiento para una neoplasia que exprese H19 y/o que exprese IGF-II a partir del promotor P3 y/o P4 en un sujeto que lo necesite. Por lo tanto, puede proporcionarse un kit que contenga i) una construcción de ácido nucleico de la invención; y ii) instrucciones para administrar dicha construcción de ácido nucleico a un sujeto que lo necesite (por ejemplo un sujeto aquejado de cáncer).
Las composiciones y los kits pueden ser útiles en el tratamiento de diversos tumores malignos asociados con expresión de H19 y/o expresión de IGF-II a partir del promotor P3 y/o P4. El tumor puede ser un tumor sólido. El tumor puede ser un carcinoma. El tumor puede incluir carcinoma de vejiga, neoplasias de hígado (por ejemplo carcinoma hepatocelular), adenocarcinoma de pulmón (cáncer de pulmón de células pequeñas y no pequeñas), carcinoma esofágico, ovárico, rabdomiosarcoma, carcinoma cervical, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, tumores colorrectales, de útero y de células germinales testiculares, meduloblastoma, glioblastoma y tumores adenocorticales.
El tumor puede seleccionarse del grupo que consiste en carcinoma de vejiga, carcinoma hepatocelular y carcinoma de colon. El tumor puede seleccionarse del grupo que consiste en carcinoma de vejiga, un carcinoma hepatocelular, un carcinoma de ovario y un carcinoma pancreático. El tumor puede seleccionarse del grupo que consiste en un carcinoma de vejiga, un carcinoma hepatocelular, un carcinoma ovárico, un carcinoma pancreático, un carcinoma de mama, un carcinoma de próstata, un carcinoma cervical, un carcinoma de colon y un carcinoma de pulmón. El sujeto puede estar aquejado de cáncer de vejiga superficial.
Tumores metastásicos a modo de ejemplo incluyen por ejemplo cáncer colorrectal que metastatiza al hígado y cáncer de mama metastásico. Las combinaciones pueden usarse para prevenir o inhibir la formación de metástasis hepáticas.
Otros objetos, características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción y dibujos.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Una ilustración esquemática que representa la construcción del vector de expresión H19-DTA-P4-DTA de doble promotor. La secuencia codificante de cada DTA está bajo el control transcripcional de las secuencias promotoras tanto P4 de IGF-II como de H19, respectivamente, Kana (R) – gen de resistencia a kanamicina.
Figura 2. Actividad relativa in vitro de construcciones que expresan DTA con secuencias reguladoras H19, P4 y H19 + P4 en células T24P. Las células T24P humanas se cotransfectaron con 2 μg de LucSV40 y las concentraciones indicadas de H19-DTA, P4-DTA o H19-DTA-P4-DTA. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Repetición adicional del experimento descrito en (A). C. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg. Eje Y (para A-C): actividad luciferasa (% de control). Eje X (para A-B): μg de plásmido/pocillo. Las barras de error en esta Figura y en todas las Figuras reflejan un error típico de la media.
Figura 3. Actividad relativa de construcciones que expresan DTA en células UMUC3. El experimento se realizó como se ha descrito para la Figura 2; los ejes son los mismos que en la Figura 2. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Repetición adicional del experimento descrito en (A). C. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg.
Figura 4. Actividad relativa de construcciones que expresan DTA en células Hep3B. El experimento se realizó como se ha descrito para la Figura 2; los ejes son los mismos que en la Figura 2. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg.
Figura 5. Actividad relativa de construcciones que expresan DTA en células ES-2. El experimento se realizó como se ha descrito para la Figura 2; los ejes son los mismos que en la Figura 2. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg.
Figura 6. Actividad relativa de construcciones que expresan DTA en células PC-1. El experimento se realizó como se ha descrito para la Figura 2; los ejes son los mismos que en la Figura 2. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg.
Figura 7. Actividad relativa de construcciones que expresan DTA en células CRL-1469. El experimento se realizó como se ha descrito para la Figura 2; los ejes son los mismos que en la Figura 2. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg.
Figura 8. Actividad relativa in vitro de construcciones que expresan DTA con secuencias reguladoras P3, P4 y P3 + P4 en células T24P. Las células humanas T24P se cotransfectaron con 2 μg de LucSV40 y las concentraciones indicadas de P3-DTA, P4-DTA o P4-DTA-P3-DTA. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg. Eje Y (para A-B): actividad luciferasa (% de control). Eje X (para A): μg de plásmido/pocillo. Los ejes son los mismos que en la Figura 2.
Figura 9. Actividad relativa de construcciones que expresan DTA en células HT-1376. El experimento se realizó como se ha descrito para la Figura 8; los ejes son los mismos que en la Figura 8. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg.
Figura 10. Actividad relativa de construcciones que expresan DTA en células Hep3B. El experimento se realizó como se ha descrito para la Figura 8; los ejes son los mismos que en la Figura 8. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg.
Figura 11. Actividad relativa de construcciones que expresan DTA en células ES-2. El experimento se realizó como se ha descrito para la Figura 8; los ejes son los mismos que en la Figura 8. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg.
Figura 12. Actividad relativa de construcciones que expresan DTA en células PC-1. El experimento se realizó como se ha descrito para la Figura 8; los ejes son los mismos que en la Figura 8. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg.
Figura 13. Actividad relativa de construcciones que expresan DTA en células CRL-1469. El experimento se realizó como se ha descrito para la Figura 8; los ejes son los mismos que en la Figura 8. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg.
Figura 14. Actividad relativa in vitro de DTA expresada de construcciones con secuencias reguladoras H19, P3 y H19 + P3 en células T24P. Las células T24P se cotransfectaron con 2 μg de LucSV40 y las concentraciones indicadas de H19-DTA, P3-DTA o H19-DTA-P3-DTA. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg. Eje Y (para A-B): actividad luciferasa (% de control). Eje X (para A): μg de plásmido/pocillo. Los ejes son los mismos que en la Figura 2.
Figura 15. Actividad relativa in vitro en células T24P de H19-DTA-P4-DTA frente a construcciones dirigidas por P4 y dirigidas por H19 en combinación. Las células T24P se cotransfectaron con 2 μg de LucSV40 y las concentraciones indicadas de H19-DTA-P4-DTA o una cantidad igual de cada uno de P4-DTA + H19-DTA.
A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg. Eje Y (para A-B): actividad luciferasa (% de control). Eje X (para A): μg de plásmido/pocillo.
Figura 16. Actividad relativa in vitro en células Hep3B de H19-DTA-P4-DTA frente a construcciones dirigidas por P4 y dirigidas por H19 en combinación. El experimento se realizó como se ha descrito para la Figura 15; los ejes son los mismos que en la Figura 15. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg.
Figura 17. Actividad relativa in vitro en células ES-2 de H19-DTA-P4-DTA frente a construcciones dirigidas por P4 y dirigidas por H19 en combinación. El experimento se realizó como se ha descrito para la Figura 15; los ejes son los mismos que en la Figura 15. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg.
Figura 18. Actividad relativa in vitro en células PC-1 de H19-DTA-P4-DTA frente a construcciones dirigidas por P4 y dirigidas por H19 en combinación. El experimento se realizó como se ha descrito para la Figura 15; los ejes son los mismos que en la Figura 15. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg.
Figura 19. Actividad relativa in vitro en células CRL-1469 de H19-DTA-P4-DTA frente a construcciones dirigidas por P4 y dirigidas por H19 en combinación. El experimento se realizó como se ha descrito para la Figura 15; los ejes son los mismos que en la Figura 15. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg.
Figura 20. Actividad relativa in vitro en células HT-1376 de P4-DTA-P3-DTA frente a construcciones dirigidas por P3 y dirigidas por P4 en combinación. Las células HT-1376 se cotransfectaron con 2 μg de LucSV40 y las concentraciones indicadas de P4-DTA-P3-DTA o una cantidad igual de cada uno de P3-DTA
+ P4-DTA. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg. Los ejes son los mismos que para la Figura 15.
Figura 21. Actividad relativa in vitro en células ES-2 de P4-DTA-P3-DTA frente a construcciones dirigidas por P3 y P4 en combinación. Las células ES-2 se cotransfectaron con 2 μg de LucSV40 y las concentraciones indicadas de P4-DTA-P3-DTA o una cantidad igual de cada uno de P3-DTA + P4-DTA. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg. Los ejes son los mismos que para la Figura 15.
Figura 22. Actividad relativa in vitro en células Hep-3B de 0,005 μg de P4-DTA-P3-DTA frente a 0,005 μg de cada una de las construcciones dirigidas por P3 y dirigidas por P4 en combinación. El experimento se realizó como se ha descrito por la Figura 21. Los ejes son los mismos que para la Figura 15B.
Figura 23. Actividad relativa de construcciones que expresan DTA en células HT-1376. El experimento se realizó como se ha descrito para la Figura 15; los ejes son los mismos que en la Figura 15. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Repetición adicional del experimento descrito en (A). C. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg.
Figura 24. Actividad relativa in vitro en células CRL-1469 de 0,005 μg de P4-DTA-P3-DTA frente a 0,005 μg de cada una de las construcciones dirigidas por P3 y dirigidas por P4 en combinación. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg. El experimento se realizó como se ha descrito para la Figura 21. Los ejes son los mismos que para la Figura 15.
Figura 25. Efecto antitumoral in vivo de la inyección de 25 μg de H19-DTA. Eje Y: aumento del volumen tumoral en veces. Eje X: tiempo (días).
Figura 26. Efecto antitumoral in vivo de la inyección de 25 μg de P4-DTA. Eje Y: aumento del volumen tumoral en veces. Eje X: tiempo (días).
Figura 27. Efecto antitumoral in vivo de la inyección de 25 μg de H19-DTA-P4-DTA. Eje Y: aumento del volumen tumoral en veces. Eje X: tiempo (días).
Figura 28. Volumen ex vivo de tumores de ratones tratados con H19-DTA-P4-DTA.
Figura 29. Peso ex vivo de tumores de ratones tratados con H19-DTA-P4-DTA.
Figura 30. Efecto antitumoral in vivo de la inyección de 25 μg de cada uno de H19-DTA y P4-DTA. Eje Y: aumento del volumen tumoral en veces. Eje X: tiempo (días).
Figura 31. Sumario de datos del modelo de cáncer de vejiga T24P.
Figura 32. Efecto antitumoral in vivo de la inyección de 25 μg de cada uno de H19-DTA y P4-DTA en el modelo HT-1376. Eje Y: aumento del volumen tumoral en veces. Eje X: tiempo (días).
Figura 33. Efecto antitumoral in vivo de la inyección de 25 μg de H19-DTA-P4-DTA en el modelo HT-1376. Eje Y: aumento del volumen tumoral en veces. Eje X: tiempo (días).
Figura 34. Efecto antitumoral in vivo de la inyección de 25 μg de P3-DTA. Eje Y: aumento del volumen tumoral en veces. Eje X: tiempo (días).
Figura 35. Efecto antitumoral in vivo de la inyección de 25 μg de P4-DTA. Eje Y: aumento del volumen tumoral en veces. Eje X: tiempo (días).
Figura 36. Efecto antitumoral in vivo de la inyección de 25 μg de P4-DTA-P3-DTA. Eje Y: aumento del volumen tumoral en veces. Eje X: tiempo (días).
Figura 37. Efecto antitumoral in vivo de la inyección de 25 μg de cada uno de P3-DTA y P4-DTA. Eje Y: aumento del volumen tumoral en veces. Eje X: tiempo (días).
Figura 38. Efecto antitumoral in vivo de la inyección de 25 μg de P3-DTA. Eje Y: aumento del volumen tumoral en veces. Eje X: tiempo (días).
Figura 39. Efecto antitumoral in vivo de la inyección de 25 μg de H19-DTA-P3-DTA. Eje Y: aumento del volumen tumoral en veces. Eje X: tiempo (días).
Figura 40. Actividad relativa de construcciones que expresan DTA en células HT-1376. El experimento se realizó como se ha descrito para la Figura 2; los ejes son los mismos que en la Figura 2. A. Actividad luciferasa a diversas dosificaciones en comparación con células transfectadas con LucSV40 solamente. B. Gráfico de barras de datos de 0,005 μg.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere al campo del tratamiento de cáncer, particularmente a una nueva terapia útil para tratar tumores que expresan H19 y/o expresan Factor de Crecimiento de Tipo Insulina II (IGF-II).
Puede proporcionarse una construcción de ácido nucleico que comprende:
(a)
un primer marco abierto de lectura que codifica un producto génico citotóxico o citostático, estando el primer marco abierto de lectura unido operativamente a una primera secuencia reguladora de la transcripción específica de cáncer; y
(b)
un segundo marco abierto de lectura que codifica el producto génico citotóxico o citostático (es decir el mismo producto génico o una variante del mismo), estando el segundo marco abierto de lectura unido operativamente a una segunda secuencia reguladora de la transcripción específica de cáncer;
en la que la primera secuencia reguladora de la transcripción y la segunda secuencia reguladora de la transcripción son diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en: i) una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19 (por ejemplo un promotor de H19) y ii) una secuencia reguladora de la transcripción de IGF-II (por ejemplo un promotor P3 de IGF-II o P4 de IGF-II).
En otras palabras, la construcción puede contener al menos dos secuencias reguladoras de la transcripción diferentes, derivando cada una de una secuencia reguladora diferente (H19, P4 o P3), y estando cada una unida
operativamente a una secuencia separada que codifica el producto génico citotóxico o citostático. Por ejemplo, las dos secuencias reguladoras de la transcripción pueden ser:
i) una primera secuencia reguladora de la transcripción que es una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19, y una segunda secuencia reguladora de la transcripción que es una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II;
ii) una primera secuencia reguladora de la transcripción que es una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19, y una segunda secuencia reguladora de la transcripción que es una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II; o
iii) una primera secuencia reguladora de la transcripción que es una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II, y una segunda secuencia reguladora de la transcripción que es una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II;
Debería entenderse que los múltiples casetes de expresión están unidos operativamente a distintas secuencias reguladoras de la transcripción, permitiendo la regulación independiente de la transcripción de cada marco abierto de lectura que codifica el agente citotóxico. Por lo tanto, la disposición de las fases abiertas de lectura dentro de la construcción pueden variar, por ejemplo, la construcción pueden diseñarse de tal modo que el primer casete de expresión esté cadena arriba o cadena abajo del segundo casete de expresión.
Puede proporcionarse una única molécula de ácido nucleico, que comprenda un primer marco abierto de lectura que codifique un producto génico citotóxico o citostático, estando el primer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19; y un segundo marco abierto de lectura que codifique el producto génico citotóxico o citostático, estando el segundo marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II. La molécula de ácido nucleico puede comprender además un tercer marco abierto de lectura que codifique el producto génico citotóxico o citostático, estando dicho tercer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II.
Puede proporcionarse una única molécula de ácido nucleico, que comprenda un primer marco abierto de lectura que codifique un producto génico citotóxico o citostático, estando el primer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19; y un segundo marco abierto de lectura que codifique el producto génico citotóxico o citostático, estando el segundo marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II. La molécula de ácido nucleico puede comprender además un tercer marco abierto de lectura que codifique el producto génico citotóxico o citostático, estando dicho tercer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II.
Puede proporcionarse una única molécula de ácido nucleico, que comprenda un primer marco abierto de lectura que codifique un producto génico citotóxico o citostático, estando el primer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II; y un segundo marco abierto de lectura que codifique el producto génico citotóxico o citostático, estando el segundo marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II. La molécula de ácido nucleico puede comprender además un tercer marco abierto de lectura que codifique el producto génico citotóxico o citostático, estando dicho tercer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19.
Se representa en la Figura 1 una construcción ejemplar de la invención, que expresa un agente citotóxico (DTA) bajo control de expresión separado de los promotores de H19 y P4, H19-DTA-P4-DTA, y se describe adicionalmente en el presente documento (Ejemplo 1). Se describen construcciones ejemplares de la invención que expresan DTA bajo control de expresión separado de los promotores P4 y P3 (P4-DTA-P3-DTA) y de los promotores de H19 y P3 (H19-DTA-P3-DTA) también en la sección de Detalles Experimentales en el Ejemplo 5 y Ejemplo 6, respectivamente. Estas construcciones se representan por las secuencias de ácido nucleico como se exponen en SEC ID Nº: 11, 24 y 18, respectivamente, como se detalla posteriormente en el presente documento.
Como se demuestra en el presente documento, la administración de un vector de expresión único que comprenda dos secuencias diferentes, expresando cada una DTA bajo el control transcripcional de un promotor específico de tumor diferente, concretamente, los promotores H19 y P4 de IGF-II, dio como resultado la destrucción potenciada de una amplia diversidad de células de carcinoma, en comparación con cada construcción (que expresan DTA bajo el control del promotor de H19 o P4) administradas por separado (Ejemplos 1-4). Además, se mostró que los resultados eran mayores que los aditivos en comparación con la administración de las construcciones de promotor único en combinación (Ejemplo 7). La capacidad potenciada del vector de expresión único que comprende los dos genes diferentes se confirmó también por ensayos in vivo (Ejemplo 10).
Además, la administración de un vector de expresión único que comprende dos secuencias diferentes, expresando cada una DTA bajo el control transcripcional de un promotor específico de tumor diferente, concretamente los promotores P3 de IGF-II y P4 de IGF-II, dio como resultado la destrucción potenciada de una amplia diversidad de
células de carcinoma, en comparación con cada construcción (que expresa DTA bajo el control del promotor P3 o P4) administrada por separado (Ejemplo 5). Además, se mostró que los resultados eran mayores que los aditivos en comparación con la administración de construcciones de promotor único en combinación (Ejemplo 8). La capacidad potenciada del vector de expresión único que comprende los dos genes diferentes se confirmó también por ensayos in vivo (Ejemplo 11).
Además, la administración de un vector de expresión único que comprende dos secuencias diferentes, expresando cada una DTA bajo el control transcripcional de un promotor específico de tumor diferente, concretamente los promotores de H19 y P3 de IGF-II, dio como resultado la destrucción potenciada de células de carcinoma de vejiga, en comparación con cada construcción (que expresaba DTA bajo el control del promotor P3 o de H19) administrada por separado (Ejemplo 6). La capacidad potenciada del vector de expresión único que comprende los dos genes diferentes se confirmó también por ensayos in vivo (Ejemplo 12).
El producto génico citotóxico de las composiciones usadas puede ser una toxina diftérica. Ambas secuencias pueden codificar la misma toxina diftérica. Cada secuencia puede codificar una variante diferente de una toxina diftérica. La toxina diftérica puede ser DTA.
La construcción puede comprender además un marco abierto de lectura adicional que codifique un TNF alfa, estando el marco abierto de lectura adicional unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción adicional seleccionada de una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19, una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II o una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II.
El producto génico citotóxico puede ser timidina quinasa. El producto génico citotóxico puede ser toxina de Pseudomonas. El producto génico citotóxico puede ser ricina. El producto génico citotóxico puede ser toxina del cólera. El producto génico citotóxico puede ser producto génico de retinoblastoma. El producto génico citotóxico puede ser p53. El producto génico citotóxico puede ser un producto génico de retinoblastoma.
El agente citotóxico puede ser tumoricida, es decir de mayor toxicidad para células tumorales en relación con células no tumorales.
El producto génico citostático de los usos y composiciones puede ser p21. El producto génico citostático puede ser p27. El producto génico citostático puede ser p53. El producto génico citostático puede ser p53175P. El producto génico citostático puede ser p57. El producto génico citostático puede ser p15. El producto génico citostático puede ser p16. El producto génico citostático puede ser p18. El producto génico citostático puede ser p19. El producto génico citostático puede ser p73. El producto génico citostático puede ser GADD45. El producto génico citostático puede ser APC1. El producto génico citostático puede ser p73RB1. El producto génico citostático puede ser WT1. El producto génico citostático puede ser NF1. El producto génico citostático puede ser VH. El producto génico citostático puede ser p53. El agente citotóxico puede ser tumoristático, es decir de mayor toxicidad para células tumorales en relación con células no tumorales. Puede obtenerse una secuencia de ácido nucleico que codifique un agente citotóxico o citostático por procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, como se ejemplifica posteriormente en el presente documento.
Puede proporcionarse una composición farmacéutica que comprenda una construcción de ácido nucleico y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención puede proporcionar construcciones de expresión eucariotas y vectores que comprendan una construcción de ácido nucleico de la presente invención.
La presente invención puede proporcionar una construcción de ácido nucleico para su uso en el tratamiento de un tumor en un sujeto humano que lo necesite. La construcción puede contener dos secuencias de ácido nucleico separadas que expresen el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor P3 de IGF-II y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P3 de IGF-II. El producto génico citotóxico puede ser una toxina diftérica. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción de ácido nucleico. El tumor puede caracterizarse por la expresión de ARN de H19 y/o IGF-II a partir del promotor P3 y/o P4.
Puede proporcionarse una construcción de ácido nucleico para su uso en la inhibición de la progresión tumoral en un sujeto humano que lo necesite. La construcción puede contener dos secuencias de ácido nucleico separadas que expresen el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor P3 de IGF-II y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P3 de IGF-II. El producto génico citotóxico puede ser una toxina diftérica. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción de ácido nucleico. El tumor puede caracterizarse por la expresión de ARN de H19 y/o IGF-II a partir del promotor P3 y/o P4.
Puede proporcionarse una construcción de ácido nucleico para su uso en la inhibición de metástasis tumoral en un sujeto humano que lo necesite. La construcción puede contener dos secuencias de ácido nucleico separadas que expresen el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor P3 de IGF-II y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P3 de IGF-II. El producto génico citotóxico puede ser una toxina diftérica. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción de ácido nucleico. El tumor puede caracterizarse por la expresión de ARN de H19 y/o IGF-II a partir del promotor P3 y/o P4.
Puede usarse una construcción de ácido nucleico para reducir o aliviar un síntoma asociado con un trastorno neoplásico en un sujeto humano que lo necesite. La construcción puede contener dos secuencias de ácido nucleico separadas que expresen el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor H19 y un promotor P4 de IGF-
II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor P3 de IGF-II y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P3 de IGF-II. El producto génico citotóxico puede ser una toxina diftérica. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción de ácido nucleico. El trastorno neoplásico puede caracterizarse por la expresión de ARN de H19 y/o IGF-II a partir del promotor P3 y/o P4.
Puede proporcionarse el uso de una construcción de ácido nucleico para la preparación de un medicamento para tratar un tumor en un sujeto humano. La construcción puede contener dos secuencias de ácido nucleico separadas que expresen el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor P3 de IGF-II y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P3 de IGF-II. El producto génico citotóxico puede ser una toxina diftérica. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción de ácido nucleico. El tumor puede caracterizarse por la expresión de ARN de H19 y/o IGF-II a partir del promotor P3 y/o P4.
Puede proporcionarse el uso de una construcción de ácido nucleico para la preparación de un medicamento para inhibir la progresión tumoral en un sujeto humano. La construcción puede contener dos secuencias de ácido nucleico separadas que expresen el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor P3 de IGF-II y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P3 de IGF-II. El producto génico citotóxico es una toxina diftérica. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción de ácido nucleico. El tumor puede caracterizarse por la expresión de ARN de H19 y/o IGF-II a partir del promotor P3 y/o P4.
Puede proporcionarse el uso de una construcción de ácido nucleico para la preparación de un medicamento para inhibir metástasis tumoral en un sujeto humano. La construcción puede contener dos secuencias de ácido nucleico separadas que expresen el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor P3 de IGF-II y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P3 de IGF-II. El producto génico citotóxico puede ser una toxina diftérica. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción de ácido nucleico. El tumor puede caracterizarse por la expresión de ARN de H19 y/o IGF-II a partir del promotor P3 y/o P4.
Puede proporcionarse el uso de una construcción de ácido nucleico para la preparación de un medicamento para reducir o aliviar un síntoma asociado con un trastorno neoplásico en un sujeto humano. La construcción puede contener dos secuencias de ácido nucleico separadas que pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor P3 de IGF-II y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P3 de IGF-II. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción de ácido nucleico. El trastorno neoplásico puede caracterizarse por la expresión de ARN de H19 y/o IGF-II a partir del promotor P3 y/o P4.
Puede usarse una composición para tratar un tumor en un sujeto humano, que comprenda una construcción de ácido nucleico. La construcción puede contener dos secuencias de ácido nucleico separadas que pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor P3 de IGF-II y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P3 de IGF-II. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción de ácido nucleico. El tumor puede caracterizarse por la
expresión de ARN de H19 y/o IGF-II a partir del promotor P3 y/o P4.
Puede usarse una composición para inhibir la progresión tumoral en un sujeto humano, que comprenda una construcción de ácido nucleico. La construcción puede contener dos secuencias de ácido nucleico separadas que pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor P3 de IGF-II y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P3 de IGF-II. El producto génico citotóxico puede ser una toxina diftérica. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción de ácido nucleico. El tumor puede caracterizarse por la expresión de ARN de H19 y/o IGF-II a partir del promotor P3 y/o P4.
Puede usarse una composición para inhibir metástasis tumoral en un sujeto humano, que comprenda una construcción de ácido nucleico. La construcción puede contener dos secuencias de ácido nucleico separadas que pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor P3 de IGF-II y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P3 de IGF-II. El producto génico citotóxico puede ser una toxina diftérica. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción de ácido nucleico. El tumor puede caracterizarse por la expresión de ARN de H19 y/o IGF-II del promotor P3 y/o P4.
Puede usarse una composición para reducir o aliviar un síntoma asociado con un trastorno neoplásico en un sujeto humano, que comprenda un ácido nucleico. La construcción puede contener dos secuencias de ácido nucleico separadas que pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor P3 de IGF-II y un promotor P4 de IGF-II. Las dos secuencias de ácido nucleico separadas pueden expresar el mismo producto génico citotóxico a partir de un promotor de H19 y un promotor P3 de IGF-II. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción de ácido nucleico. El trastorno neoplásico puede caracterizarse por la expresión de ARN de H19 y/o IGF-II a partir del promotor P3 y/o P4.
El trastorno neoplásico de los usos y composiciones puede ser un carcinoma, por ejemplo un carcinoma de vejiga, un carcinoma hepatocelular, un carcinoma ovárico y un carcinoma pancreático. El trastorno neoplásico de los usos y composiciones de la presente invención puede ser un carcinoma de vejiga. El trastorno neoplásico puede ser un carcinoma hepatocelular. El trastorno neoplásico puede ser un carcinoma ovárico. El trastorno neoplásico puede ser un carcinoma pancreático. El trastorno neoplásico puede ser un carcinoma de colon. El trastorno neoplásico puede ser otro tipo de tumor sólido.
La secuencia reguladora de la transcripción específica de H19 de los usos puede ser un promotor de H19. El promotor de H19 puede comprender una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia desvelada en el presente documento. El promotor de H19 puede comprender un fragmento de una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia desvelada en el presente documento. El promotor de H19 puede consistir en una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia desvelada en el presente documento.
La secuencia reguladora de la transcripción específica de H19 de los usos puede comprender un potenciador de H19. El potenciador de H19 puede comprender una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia desvelada en el presente documento. El potenciador de H19 puede comprender un fragmento de una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia desvelada en el presente documento. El potenciador de H19 puede consistir en una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia desvelada en el presente documento.
La secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II de los usos puede ser un promotor P3 de IGF-II. El promotor P3 de IGF-II puede comprender una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia desvelada en el presente documento. El promotor P3 de IGF-II puede comprender un fragmento de una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia desvelada en el presente documento. El promotor P3 de IGF-II puede consistir en una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia desvelada en el presente documento.
La secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II de los usos puede comprender un potenciador de H19. El potenciador de H19 puede comprender una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia desvelada en el presente documento. El potenciador de H19 puede comprender un fragmento de una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia desvelada en el presente documento. El potenciador de H19 puede consistir en una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia desvelada en el presente documento.
La secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II de los usos puede ser un promotor P4 de IGF-II. El promotor P4 de IGF-II puede comprender una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia
desvelada en el presente documento. El promotor P4 de IGF-II puede comprender un fragmento de una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia desvelada en el presente documento. El promotor P4 de IGF-II puede consistir en una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia desvelada en el presente documento.
La secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II de los usos puede comprender un potenciador de H19. El potenciador de H19 puede comprender una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia desvelada en el presente documento. El potenciador de H19 puede comprender un fragmento de una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia desvelada en el presente documento. El potenciador de H19 puede consistir en una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia desvelada en el presente documento.
Construcciones de ácido nucleico
La expresión “construcción de ácido nucleico” o “construcción” como se usa en el presente documento incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto génico citotóxico o citostático (por ejemplo, toxina Diftérica, DT) de acuerdo con la presente invención, estando la secuencia de ácido nucleico unida operativamente a un promotor y opcionalmente otras secuencias reguladoras de la transcripción. En las construcciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica DT puede estar unida operativamente al menos a una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19, secuencia reguladora de la transcripción P3 y/o secuencia reguladora de la transcripción P4.
La construcción de ácido nucleico de los usos y composiciones puede ser un vector de expresión eucariota. La construcción de ácido nucleico puede ser un plásmido. La construcción de ácido nucleico puede ser cualquier otro tipo de vector de expresión capaz de mediar en la expresión en una célula cancerosa.
La frase “unido operativamente” se refiere a una secuencia de ácido nucleico unida a una secuencia de control de la transcripción de tal manera que la molécula tenga la capacidad de expresarse cuando se use para transfectar (es decir, transformar, transducir, infectar o transfectar) una célula huésped. Las secuencias de control de la transcripción son secuencias, que controlan el inicio, elongación y terminación de la transcripción. Son secuencias de control de la transcripción particularmente importantes las que controlan el inicio de la transcripción, tales como secuencias promotoras, potenciadoras, operadoras y represoras.
La molécula de ácido nucleico de los usos y composiciones puede ser una molécula de ADN. La molécula puede ser una molécula de ARN. La molécula puede ser cualquier otro tipo de molécula de ácido nucleico conocida en la técnica.
Como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a una construcción, que comprende una secuencia reguladora unida operativamente a un polinucleótido heterólogo, que se administra a células diana. El vector puede ser un vector de expresión viral, un plásmido o una construcción de ADN desnudo y, opcionalmente puede incluir secuencias adicionales requeridas para la construcción, selección, estabilidad, penetración, etc.
Como se usa en el presente documento, el término “variante” se refiere a una sal, homólogo, análogo o fragmento de una secuencia de ácido nucleico farmacéuticamente aceptable útil para la invención (por ejemplo, secuencias de vector, secuencias reguladoras de la transcripción, polinucleótidos de interés clonados, etc.). Se abarcan dentro del término “variante” moléculas de nucleótidos naturales y sintéticos modificadas químicamente. También están abarcadas dentro del término “variante” sustituciones conservativas dentro de la secuencia de nucleótidos de la molécula. Además, están abarcados dentro del término “variante” como se usa en el presente documento sustituciones no conservativas dentro de la secuencia de nucleótidos de la molécula, siempre que la secuencia conserve sustancialmente su función requerida.
Una “variante”, por ejemplo una “variante” de un producto génico citotóxico o citostático, como se usa en el presente documento, puede referirse a un gen que se reconoce en la técnica que es un producto de otra versión del mismo gen por ejemplo citotóxico o citostático. Las secuencias génicas y sus productos se clasifican de forma rutinaria como secuencias de un gen particular en bases de datos públicas tales como la base de datos PubMed del Centro Nacional de Estados Unidos para la Información Biotecnológica; por lo tanto, estas pueden estar fácilmente dentro de la experiencia de los expertos en la técnica para identificar variantes de, por ejemplo, un producto génico citotóxico o citostático.
Las “variantes”, por ejemplo de un producto génico citotóxico o citostático, pueden ser al menos el 70 % homólogas,
o compartir al menos el 75 %, 80 %, 82 %, 84 %, 86 %, 88 %, 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 98 % o 99 % de homología de secuencia.
Como se usa en el presente documento la frase “toxina Diftérica” (DT o DTX) se refiere a una toxina Diftérica o un fragmento de la misma que contiene al menos una parte activa de la toxina Diftérica, que promueve la muerte celular, o que puede actuar para promover la muerte celular o aliviar de otro modo un trastorno neoplásico en un sujeto. DT está comprendida por dos fragmentos polipeptídicos, A y B [Zdanovskaia, M. V.; Zdanovsky, A. G.; Yankovsky, N. K. “Diphtheria toxin NAD affinity and ADP ribosyltransferase activity are reduced at tryptophan 153
substitutions for alanine or phenylalanine.” Research in Microbiology, 2000, 151, 557-562; Bennet, M. J.; Choe, S.; Eisenberg, D. “Refined structure of dimeric diphtheria toxin at 2.0 angstrom resolution.” Protein Science, 1994, 3, 1444-1463]. El fragmento A (DTA) consiste en el dominio catalítico (C), mientras que el fragmento B está compuesto del dominio receptor, (R), y el domino transmembrana, (T). El dominio R contiene una parte receptora que se une al receptor HB-EGF en la superficie celular [Raab, Gerhard; Klagsbrun, Michael “Heparin-binding EGF-like growth factor” Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Reviews on Cancer 1997, 1333, F179-F199]. Después la toxina unida entra en el citoplasma por endocitosis. La serie hidrófoba C terminal de láminas alfa, conocida como el dominio T, se incluye después en la membrana, provocando que el dominio C del extremo N terminal se escinda y se transloque al citoplasma. Una vez escindido, el dominio C se convierte en una enzima activa, cataliza la creación de ADP-ribosaEF-2 a partir del péptido de translocación de síntesis proteica EF-2 y NAD+ (Hudson TH y col, Quantal entry of diphtheria toxin to the cytosol. J Biol Chem. 10 Mar 1985; 260(5): 2675-80). Un dominio C único puede usar el suministro completo de EF-2 de una célula en un periodo de horas, deteniendo la síntesis proteica, dando como resultado muerte celular. La toxina puede ser toxina diftérica de cadena A (DTA).
La DTA puede codificarse por la secuencia de ácido nucleico como se expone en SEC ID Nº: 6:
atggatcctgatgatgttgttgattcttctaaatcttttgtgatggaaaacttttcttcgtaccacgggactaaacctggttatgtag attccattcaaaaaggtatacaaaagccaaaatctggtacacaaggaaattatgacgatgattggaaagggttttatagtaccgacaataa atacgacgctgcgggatactctgtagataatgaaaacccgctctctggaaaagctggaggcgtggtcaaagtgacgtatccaggactg acgaaggttctcgcactaaaagtggataatgccgaaactattaagaaagagttaggtttaagtctcactgaaccgttgatggagcaagtc ggaacggaagagtttatcaaaaggttcggtgatggtgcttcgcgtgtagtgctcagccttcccttcgctgaggggagttctagcgttgaat atattaataactgggaacaggcgaaagcgttaagcgtagaacttgagattaattttgaaacccgtggaaaacgtggccaagatgcgatg tatgagtatatggctcaagcctgtgcaggaaatcgtgtcaggcgatctttgtga (SEC ID Nº: 6). La secuencia que codifica DTA puede comprender una secuencia de ácido nucleico como se expone en SEC ID Nº: 6. La secuencia que codifica DTA puede consistir en una secuencia de ácido nucleico como se expone en SEC ID Nº: 6. La secuencia que codifica DTA puede ser un homólogo de SEC ID Nº: 6. La secuencia que codifica DTA puede ser una variante de SEC ID Nº: 6. La secuencia que codifica de DTA puede ser un fragmento de SEC ID Nº: 6. La secuencia que codifica de DTA puede ser un homólogo de un fragmento de SEC ID Nº: 6. La secuencia que codifica DTA puede ser una variante de un fragmento de SEC ID Nº: 6.
La secuencia de aminoácidos de la DTA puede ser como se expone en SEC ID Nº: 7:
MDPDDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDW KGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKEL
GLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEI NFETRGKRGQDAMY-EYMAQACAGNRVRRSL (SEC ID Nº: 7). La DTA puede comprender una secuencia de ácido nucleico como se expone en SEC ID Nº: 7. La DTA puede consistir en una secuencia de ácido nucleico como se expone en SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser un homólogo de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser una variante de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser un fragmento de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser un homólogo de un fragmento de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser una variante de un fragmento de SEC ID Nº: 7.
La DTA puede ser al menos el 60 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser al menos el 65 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser al menos el 70 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser al menos el 72 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser al menos el 74 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser al menos el 76 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser al menos el 78 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser al menos el 80 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser al menos el 82 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser al menos el 84 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser al menos el 86 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser al menos el 88 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser al menos el 90 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser al menos el 92 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser al menos el 94 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser al menos el 95 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser al menos el 96 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser al menos el 97 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser al menos 98 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser al menos el 99 % homóloga de SEC ID Nº: 7. La DTA puede ser más del 99 % homóloga de SEC ID Nº: 7.
Las construcciones pueden contener, en la misma construcción, múltiples casetes de expresión, en los que la expresión del producto génico citotóxico o citostático puede estar dirigida por al menos dos de las siguientes tres secuencias reguladoras de la transcripción: una secuencia reguladora de H19, una P3 de IGF-II y una P4 de IGF-II, es decir la secuencia de ácido nucleico que codifica el producto génico puede estar bajo el control transcripcional de al menos dos de estas secuencias. Como se usa en el presente documento, la frase “que está bajo el control de la expresión de H19 (o P3 de IGF-II o P4 de IGF-II)” (o “control transcripcional”) se refiere a la transcripción de la secuencia codificada a partir de una secuencia promotora específica de H19 (o P3 de IGF-II o P4 de IGF-II), o una secuencia derivada de la misma, que puede unirse operativamente a la misma para regular su patrón de expresión (incluyendo patrón de expresión espacial y temporal).
La secuencia reguladora de los usos y composiciones puede derivarse de una secuencia reguladora de la transcripción de H19, P3 de IGF-II o P4 de IGF-II. Como se usa en el presente documento, una descripción de una
secuencia reguladora “derivada de una secuencia reguladora de la transcripción de H19, P3 de IGF-II o P4 de IGF-II” se refiere a una secuencia “derivada” (véase posteriormente) de una región del gen que regula y/o controla la expresión de las secuencias codificantes de H19 o IGF-II. Como tal, una secuencia reguladora incluye, sin limitación, una secuencia derivada de un promotor o potenciador de las secuencias de H19, P3 de IGF-II o P4 de IGF-II.
El término “derivado” se refiere al hecho de que una secuencia reguladora de la transcripción (por ejemplo, un promotor o potenciador) puede ser la secuencia reguladora nativa completa del gen, una parte de la secuencia reguladora nativa, una construcción quimérica de la secuencia reguladora nativa, una construcción combinatoria de una o más secuencias reguladoras nativas o una variante de la secuencia reguladora nativa obtenida, por ejemplo, por deleción, adición o reemplazo de al menos un nucleótido. Una secuencia reguladora variante puede comprender nucleótidos modificados. La secuencia derivada preferentemente demuestra propiedades de control/regulación (por ejemplo, aumento) de la expresión de secuencias codificantes unidas operativamente a la misma.
Se describen en el presente documento secuencias reguladoras de H19 que pueden usarse en las construcciones de ácido nucleico para dirigir la expresión específica de un producto génico citotóxico o citostático. Las secuencias reguladoras de H19 útiles en la presente invención incluyen entre otras la región promotora de H19 cadena arriba y la región potenciadora de H19 cadena abajo. En ciertas realizaciones, las secuencias promotoras y potenciadoras de H19 que pueden usarse son las descritas en la Patente de Estados Unidos Nº 6.306.833, como se detalla en el presente documento.
La secuencia reguladora de la transcripción específica de H19 de las composiciones es un promotor de H19. El promotor de H19 puede comprender una secuencia de ácido nucleico como se expone en una cualquiera de las SEC ID Nº: 1-2. El promotor de H19 puede consistir en una secuencia de ácido nucleico como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 1-2.
Se muestra la secuencia de nucleótidos de una región promotora de H19 en SEC ID Nº: 1:
ctgcagggccccaacaaccctcaccaaaggccaaggtggtgaccgacggacccacagcggggtggctgggggagtcg
aaactcgccagtctccactccactcccaaccgtggtgccccacgcgggcctgggagagtctgtgaggccgcccaccgcttgtcagta
gagtgcgcccgcgagccgtaagcacagcccggcaacatgcggtcttcagacaggaaagtggccgcgaatgggaccggggtgccc
agcggctgtggggactctgtcctgcggaaaccgcggtgacgagcacaagctcggtcaactggatgggaatcggcctggggggctg
gcaccgcgcccaccagggggtttgcggcacttccctctgcccctcagcaccccacccctactctccaggaacgtgaggtctgagccg
tgatggtggcaggaaggggccctctgtgccatccgagtccccagggacccgcagctggcccccagccatgtgcaaagtatgtgcag
ggcgctggcaggcagggagcagcaggcatggtgtcccctgaggggagacagtggtctgggagggagaggtcctggaccctgagg
gaggtgatggggcaatgctcagccctgtctccggatgccaaaggaggggtgcggggaggccgtctttggagaattccaggatgggt
gctgggtgagagagacgtgtgctggaactgtccagggcggaggtgggccctgcgggggccctcgggagggccctgctctgattgg
ccggcagggcaggggcgggaattctggcgggccaccccagttagaaaaagcccgggctaggaccgagga (SEC ID Nº: 1). La secuencia
de H19 puede ser un homólogo de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser una variante de SEC ID Nº: 1.
La secuencia de H19 puede ser un fragmento de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser un homólogo de
un fragmento de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser una variante de un fragmento de SEC ID Nº: 1.
La secuencia de H19 puede ser al menos el 60 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser al menos el 65 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser al menos el70 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser al menos el 72 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser al menos el 74 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser al menos el 76 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser al menos el 78 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser al menos el 80 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser al menos el 82 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser al menos el 84 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser al menos el 86 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser al menos el 88 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser al menos el 90 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser al menos el 92 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser al menos el 94 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser al menos el 95 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser al menos el 96 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser al menos el 97 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser al menos el 98 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser al menos el 99 % homóloga de SEC ID Nº: 1. La secuencia de H19 puede ser más de el 99 % homóloga de SEC ID Nº: 1.
Esta secuencia de 831 nucleótidos se extiende de los nucleótidos -837 a -7 desde el sitio del extremo (como se describe en Brannan y col. 1990). Aparece una secuencia TATA consenso en los nucleótidos -27 a - 35. Aparecen dos sitios de unión a AP2 consenso (8/9 coincidencias) a aproximadamente -500 y -40 nucleótidos cadena arriba desde el inicio de la transcripción. Cuando se sitúan cadena arriba de la región codificante para un gen heterólogo, aproximadamente 831 pares de bases de la región reguladora pueden ser suficientes para dirigir la expresión del gen heterólogo unido operativamente en células cancerosas que también pueden expresar H19 endógeno. Una región promotora de H19 adicional entre los nucleótidos -819 a +14 (SEC ID Nº: 2) también puede ser suficiente para dirigir la expresión del gen heterólogo unido operativamente en células cancerosas:
gacaaccctcaccaagggccaaggtggtgaccgacggacccacagcggggtggctgggggagtcgaaactcgccagt
ctccactccactcccaaccgtggtgccccacgcgggcctgggagagtctgtgaggccgcccaccgcttgtcagtagagtgcgcccgc gagccgtaagcacagcccggcaacatgcggtcttcagacaggaaagtggccgcgaatgggaccggggtgcccagcggctgtggg gactctgtcctgcggaaaccgcggtgacgagcacaagctcggtcaactggatgggaatcggcctggggggctggcaccgcgccca ccagggggtttgcggcacttccctctgcccctcagcaccccacccctactctccaggaacgtgagttctgagccgtgatggtggcagg aaggggccctctgtgccatccgagtccccagggacccgcagctggcccccagccatgtgcaaagtatgtgcagggcgctggcagg cagggagcagcaggcatggtgtcccctgaggggagacagtggtctgggagggagaagtcctggccctgagggaggtgatggggc aatgctcagccctgtctccggatgccaaaggaggggtgcggggaggccgtctttggagaattccaggatgggtgctgggtgagaga gacgtgtgctggaactgtccagggcggaggtgggccctgcgggggccctcgggagggccctgctctgattggccggcagggcag gggcgggaattctgggcggggccaccccagttagaaaaagcccgggctaggaccgaggagcagggtgagggag (SEC ID Nº: 2). La secuencia de H19 puede ser un homólogo de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser una variante de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser un fragmento de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser un homólogo de un fragmento de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser una variante de un fragmento de SEC ID Nº: 2.
La secuencia de H19 puede ser al menos el 60 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser al menos el 65 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser al menos el 70 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser al menos el 72 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser al menos el 74 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser al menos el 76 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser al menos el 78 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser al menos el 80 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser al menos el 82 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser al menos el 84 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser al menos el 86 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser al menos el 88 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser al menos el 90 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser al menos el 92 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser al menos el 94 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser al menos el 95 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser al menos el 96 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser al menos el 97 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser al menos el 98 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser al menos el 99 % homóloga de SEC ID Nº: 2. La secuencia de H19 puede ser más del 99 % homóloga de SEC ID Nº: 2.
La región potenciadora cadena abajo del gen H19 humano puede añadirse opcionalmente a una construcción de promotor de H119/DTA para proporcionar niveles potenciados de expresión específica de célula de la molécula DTA. Como se esperaba de una secuencia potenciadora, el potenciador cadena abajo puede ejercer su efecto cuando se sitúa en orientación inversa o directa (en relación con la orientación del potenciador de H19 en el gen de H19 endógeno) cadena abajo desde la región codificante de un gen heterólogo bajo el control del promotor de H19.
La secuencia potenciadora de H19 comprende la secuencia:
caaggacatggaatttcggaccttctgtccccaccctctctgctgagcctaggaacctctgagcagcaggaaggccttgggt ctagagcctagaaatggacccccacgtccacctgcccagcctagacccccagcattgaagggtggtcagacttcctgtgagaggaag ccactaagcgggatggacaccatcgcccactccacccggccctgcccagccctgcccagtccagcccagtccagcccagccctgcc cttcccagccctgcccagcccagctcatccctgccctacccagcccagccctgtcctgccctgcccagcccagcccagcccagccct gccctgccctgccctgcccttcccagccctgaccttcccagccctgcccagcccagctcatccctgccctacccagctcagccctgcc ctgccctgccctgccctgcccagccctacccagcccagccctgccctgccctgcccagctcagccctgcccaccccagcccagccc agcccagcatgcgttctctggatggtgagcacaggcttgaccttagaaagaggctggcaacgagggctgaggccaccaggccactg ggtgctcacgggtcagacaagcccagagcctgctcccctgccacgggtcggggctgtcaccgccagcatgctgtggatgtgcatgg cctcagggctgctggctccaggctgcccccgccctggctcccgaggccacccctcttatgccatgaaccctgtgccacacccacctct gagctgtccccgctcctgccgcctgcaccccctgagcagccccctgtgtgtttcatgggagtcttagcaaggaaggggagctcgaatt
cctgcagcccggg (SEC ID Nº: 3). La secuencia de H19 puede ser un homólogo de SEC ID Nº: 3. La secuencia de H19 puede ser una variante de SEC ID Nº: 3. La secuencia de H19 puede ser un fragmento de SEC ID Nº: 3. La secuencia de H19 puede ser un homólogo de un fragmento de SEC ID Nº: 3. “Homólogo” puede referirse a cualquier grado de homología desvelado en el presente documento. La secuencia de H19 puede ser una variante de un fragmento de SEC ID Nº: 3.
La secuencia potenciadora de H19 comprende la secuencia:
ccgggtaccgagctcccaggaagataaatgatttcctcctctctagagatgggggtgggatctgagcactcagagccaagg gcgcagtgggtccgggcgggggccctcctcggccctcccaacatgggggccaggaggtcagcccctcaacctggaccccggctg ggtctcagggaatggtctcccccagtggcccagcttgcttgtgttttcagatgggtgtgcatgggtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgt gtgtgtgtgtgtgtgtgatgcctgacaagccccagagagccaaagacctgagtggagatcttgtgacttctcaaaagggggattggaag gttcgagaaagagctgtggtcagccttgctctcccttaaggctgtggtaaccacactaggcatagcataggcctgcgccccgtccctcct tccctcctccgcgcctctcctttctctttctcccccctctaccccgctccctggcctgctcctggtgacaccgttggcccccttccagggct gagggaagccagcgggggccccttcctgaaagcccacctgcaggccggcttgctgggaaggggctgctctcgcagaggctcccgc ccgccctgcagccgtttcctggaagcagtcgctgtgggtattctgttccttgtcagcactgtgcttgcaaagaaagcagacactgtgctcc ttgtccttagggagccccgctccatcacccaacacctggctggacacaggcgggaggccgggtccgcggggagcggcgcggggct ggggccggaccattaaacacacacgggcgccaggcactgcaggctcctcctcctcctcctgcccagcgcctctgctcacaggcacgt gccaagcccctaggccaggaggccagcagtgggtgcagaacaagctcctgggaagggggtgcagggcggacccccggggaga
agggctggcagggctgtgggggacgctgaccgtgggccccacgttgcagaaaactggntgcctggctggaagatgggggagatgc caagcctctgaggcagcacgagcagggtgcatggaggccggggcgcggggaggctgcactgcagcatgcaccccaaagcccan agggagtggagaccaggccctggaatcgagaagtagaaaggcggcttggaggcctcggaaccggctgacctccaacagagtgggt ctccagcctggctctgccctgccgcaggtcccctcccctcattaccaggcctagagcctccagtcccggtggcccccagcccgaggg tgaacggcctcaccctgggtcgtgggacagagggcacgttcatcaagagtggctcccaagggacacgtggctgtttgcagttcacag gaagcattcgagataaggagcttgttttcccagtgggcacggagccagcaggggggctgtggggcagcccagggtgcaaggccag gctgtggggctgcagctgccttgggccccactcccaggcctttgcgggaggtgggaggcgggaggcggcagctgcacagtggccc caggcgaggctctcagccccagtcgctctccgggtgggcagcccaagagggtctggctgagcctcccacatctgggactccatcacc caacaacttaattaaggctgaatttcacgtgtcctgtgacttgggtagacaaagcccctgtccaaaggggcagccagcctaaggcagtg gggacggcgtgggtggcgggcgacgggggagatggacaacaggaccgagggtgtgcgggcgatgggggagatggacaacagg accgagggtgtgcgggcgatgggggagatggacaacaggaccgagggtgtgcgggacacgcatgtcactcatgcacgccaatgg ggggcgtgggaggctggggagcagacagactgggctgggctgggcgggaaggacgggcagatg (SEC ID Nº: 4). La secuencia de H19 puede ser un homólogo de SEC ID Nº: 4. La secuencia de H19 puede ser una variante de SEC ID Nº: 4. La secuencia de H19 puede ser un fragmento de SEC ID Nº: 4. La secuencia de H19 puede ser un homólogo de un fragmento de SEC ID Nº: 4. “Homólogo” puede referirse a cualquier grado de homología desvelado en el presente documento. La secuencia de H19 puede ser una variante de un fragmento de SEC ID Nº: 4.
La secuencia potenciadora de H19 comprende la secuencia:
ccgggtaccgagctcccaggaagataaatgatttcctcctctctagagatgggggtgggatctgagcactcagagccaagg gcgcagtgggtccgggcgggggccctcctcggccctcccaacatgggggccaggaggtcagcccctcaacctggaccccggctg ggtctcagggaatggtctcccccagtggcccagcttgcttgtgttttcagatgggtgtgcatgggtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgt gtgtgtgtgtgtgtgtgatgcctgacaagccccagagagccaaagacctgagtggagatcttgtgacttctcaaaagggggattggaag gttcgagaaagagctgtggtcagccttgctctcccttaaggctgtggtaaccacactaggcatagcataggcctgcgccccgtccctcct tccctcctccgcgcctctcctttctctttctcccccctctaccccgctccctggcctgctcctggtgacaccgttggcccccttccagggct gagggaagccagcgggggccccttcctgaaagcccacctgcaggccggcttgctgggaaggggctgctctcgcagaggctcccgc ccgccctgcagccgtttcctggaagcagtcgctgtgggtattctgttccttgtcagcactgtgcttgcaaagaaagcagacactgtgctcc ttgtccttagggagccccgctccatcacccaacacctggctggacacaggcgggaggccgggtccgcggggagcggcgcggggct ggggccggaccattaaacacacacgggcgccaggcactgcaggctcctcctcctcctcctgcccagcgcctctgctcacaggcacgt gccaagcccctaggccaggaggccagcagtgggtgcagaacaagctcctgggaagggggtgcagggcggacccccggggaga
agggctggcagggctgtgggggacgctgaccgtgggccccacgttgcagaaaactggntgcctggctggaagatgggggagatgc caagcctctgaggcagcacgagcagggtgcatggaggccggggcgcggggaggctgcactgcagcatgcaccccaaagcccan agggagtggagaccaggccctggaatcgagaagtagaaaggcggcttggaggcctcggaaccggctgacctccaacagagtggg gccggccctggaggcaaagaggtgcccggggtccggccctgcctgggggagctatgtgtcatgggcaagccacaggatatgtagc
ccgctctgagcctatggacccagggcagggctgcaaggcagggcaggggagacagcacgggggagcaaggagcagagagggg gcctcaggctctcccaggaggaacattctcccgacaggaggaagagacggcccaggggtgactgtggggagccatggtggcagct ggggtcgtggcagatgggagagaggctggcgaggtgaaggtgcaggggtcagggctctggggcccacatgcctgtgggagcagg caggcccagggctctccgccactccccactcccgcttggctcataggctgggcccaagggtggggtgggatgagcaggagatggg gcccagggggcaagcagggccccaaagacatttagaaaaaccggtttatgcaggcagcattcagagcaggcggcgtgcgtggcgg gggccctgggagcacagagaggcacacgtagggcccccgaggggctccccattggccggcagtgacatcacccctgtgtcaacag
tgatgtctgcagctccggccagccagggtttatggagcgagacccagcccggcctgggccctcactccccaggcccacacactagc ccactgttcagggtccggggtggcggcatggcctgggggtcctggcaccgctgctcctctgcccaccctaacttcccggcatcgcgg ctgccccctctgagcgtccccaaccagtaagtgtggggcccagcaggcctgccgtcctcctcctcttcccctctagagagaaacgtgg aggtcctggggctgggggcgctcatagccctgtgacacaggtgcatggggtcaggggtcccagaatggcccctgggaaggacctca gctgggccggcggctctaggcttcaggggtctgtctgcacaggggntagcccctcccagacctctgtgaagccagtacgggcctccc ctccctgccccgtgctctgtccggtgcttcctggactgcactgcgggccactggtgagagggtggacagggaagggccgccgtggtg cctgttcctgcccacctggctgtgtggtcccctccaagtagggacaacccttctgagggcttgggggcaccctggggttgccagggcc tcccagagccctgtgagcccctggggggtctggcctgatgcccccctccacgtccagggccggctgtggcccagaaccccagcttcc cagcaggccggtgtgcggtggtgacccaggagaggcctcgcctccactgaggggccaccgacctctgtcagaccacagagacccc caaggagtctgaaggctggagacccggggctgggaccaggtgggactttcccacggagccgtccccaggcccagctggggacac
gtcccccttctctccagacacaccctgcctgccaccaggacacaccggcctgttgggggtctcttttaagtgcttgccactctgaggtga ctgtccctttccaaagaggtttctggggcccaggtgggatgcgtcggcctgagcaggaggatctgggccgccaggggctggggact gtctcctggggaaggaagcgcctgggagcgtgtgtgctgacccaggaccatccagggaggcccgtctgtggggcaagcgggaag ggagcggctggagaggcttggccgcccccgccctgcctcccattccttagctccatgcctgtcaacctctgtcacccagtgagtgatgt ccaggggccctggaaaggtcacagcatgtttgagcggggtgagagagaggggaaaggcgggggcggggaaaagtacgtggagg aagctttaggcccaaggaaggagacagggttctgggagggagggagccactggggccgccgggaaggtccctgcttgctgctgcc acccagaaccctcgcctcttagctagcccccgcagccccagcctttctggcntgtggccctctcccccatccccaggtgtcctgtgcaa ccaggccttggacccaaaccctcctgccccctcctctccctcctcaccctcccaatgcagtggtctccagcctggctctgccctgccgc aggtcccctcccctcattaccaggcctagagcctccagtcccggtggcccccagcccgagggtgaacggcctcaccctgggtcgtgg gacagagggcacgttcatcaagagtggctcccaagggacacgtggctgtttgcagttcacaggaagcattcgagataaggagcttgttt tcccagtgggcacggagccagcaggggggctgtggggcagcccagggtgcaaggccaggctgtggggctgcagctgccttgggc cccactcccaggcctttgcgggaggtgggaggcgggaggcggcagctgcacagtggccccaggcgaggctctcagccccagtcg ctctccgggtgggcagcccaagagggtctggctgagcctcccacatctgggactccatcacccaacaacttaattaaggctgaatttca cgtgtcctgtgacttgggtagacaaagcccctgtccaaaggggcagccagcctaaggcagtggggacggcgtgggtggcgggcga cgggggagatggacaacaggaccgagggtgtgcgggcgatgggggagatggacaacaggaccgagggtgtgcgggcgatggg ggagatggacaacaggaccgagggtgtgcgggacacgcatgtcactcatgcacgccaatggggggcgtgggaggctggggagca gacagactgggct
gggctgggcgggaaggacgggcagatg (SEC ID Nº: 5). La secuencia de H19 puede ser un homólogo de SEC ID Nº: 5. La secuencia de H19 puede ser una variante de SEC ID Nº: 5. La secuencia de H19 puede ser un fragmento de SEC ID Nº: 5. La secuencia de H19 puede ser un homólogo de un fragmento de SEC ID Nº: 5. “Homólogo” puede referirse a cualquier grado de homología desvelado en el presente documento La secuencia de H19 puede ser una variante de un fragmento de SEC ID Nº: 5.
También pueden usarse fragmentos de este potenciador, por ejemplo fragmentos de las secuencias expuestas en una cualquiera de SEC ID Nº: 3-5 para facilitar la expresión génica. El potenciador puede consistir en una secuencia como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 3-5.
Se describen adicionalmente en el presente documento secuencias reguladoras P3 de IGF-II que pueden usarse en las construcciones de ácido nucleico para dirigir la expresión específica de un producto génico citotóxico o citostático. La secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II de las composiciones puede ser un promotor P3 de IGF-II. El promotor P3 corresponde a la secuencia de nucleótidos -1229 a +140 del gen de IGF-II (un ejemplo de una secuencia del gen de IGF-II se encuentra en el Cromosoma 11, NC_000011.8, pares de bases 21069262116578).
Una secuencia del gen de IGF-II de los usos y composiciones es:
cccaaccccgcgcacagcgggcactggtttcgggcctctctgtctcctacgaagtccgtagagcaactcggatttgggaaa tttctctctagcgttgcccaaacacacttgggtcggccgcgcgccctcaggacgtggacagggagggcttccccgtgtccaggaaagc gaccgggcattgcccccagtctcccccaaatttgggcattgtccccgggtcttccaacggactgggcgnngctcccggacactgagg actggccccggggtctcgctcaccttcagcagcgtccaccgcctgccacagagcgttcgatcgctcgctgcctgagctcctggtgcgc ccgcggacgcagcctccagcttcgcggtgagctccccgccgcgccgatcccctccgcctctgcgcccctgaccggctctcggcccg catctgctgctgtcccgccggtgctggcgctcgtccgctgcgccggggaggccggcgtggggcgcgggacacggctgcggacttg cggctgcgctgcgctcgctcctgctgggcgccccgaaatccgcgccactttcgtttgctcattgcaaagatctcatttgtggggaaagcg gctggagggtcccaaagtggggcgggcagggggctggggcgagggacgcggaggagaggcgctcccgccgggcggtaaagtg cctctagcccgcgggcctaggactccgccgggagggcgcgcggagngcgaagtgattgatggcggaagcgggggggcaaggg gggcaggggggcgcgggattccgccggcgaccccttccccttggctaggcttaggcggcggggggctggcggggtgcgggatttt gtgcgtggtttttgacttggtaaaaatcacagtgctttcttacatcgttcaaactctccaggagatggtttccccagacccccaaattatcgt ggtggcccccgagaccgaactcgcgtctatgcaagtccaacgcactgaggacggggtaaccattatccagatattttgggtgggccgc aaaggcgagctacttagacgcaccccggtgagctcggccatgcaggtaggatttgagctgtgtttcccgccctgatcctctctcctctgg cggccggagcctccgtaggctccaagcctggcccagattcggcggcgcagccggccttccgcgcgtccgcacctagcgggggctc cggggctccggcgcggcaccggggggcgctcgggatctggctgaggctccaaggcccgcgtggccggctcctcctgctggggca ggtggcggctgcgcgccccgcccgagcccaggggccccctcagccgcaacaaccagcaaggaccccccgactcagccccaagc cacctgcatctgcactcagacggggcgcacccgcagtgcagcctcctggtggggcgctgggagcccgcctgcccctgcctgcccg gagaccccagctcacgagcacaggccgcccgggcaccccagaaacccgggatggggcccctgaattctctaggacgggcattcag catggccttggcgctctgcggctccctgccccccacccagcctcgcccccgcgcaccccccagcccctgcgaccgccgcccccccc cccggggccccagggccccagcccgcaccccccgccccgctcttggctcgggttgcgggggcgggccgggggcggggcgagg gctccgcgggcgcccattggcgcgggcgcgaggccagcggccccgcgcggccctgggccgcggctggcgcgactataagagcc gggcgtgggcgcccgcagttcgcctgctctccggcggagctgcgtgaggcccggccggccccggccccccccttccggccgccc ccgcctcctggcccacgcctgcccgcgctctgcccaccagcgcctccatcgggcaaggcggccccgcgtcgacgccgcccgctgc ctcgctgctgactcccgtcccgggcgccgtccgcggggtcgcgctccgccgggcctgcggattccccgccgcctcctcttcatctacc tcaactccccccatccccgcttcgcccgaggaggcggttccccccgcaggcagtccggctcgcaggccgccggcgttgtcaccccc cccgcgctccccctccagccctccccccggcgcgcagcctcgggccgctcccctttccgcgctgcgtcccggagcggccccggtgc cgccaccgcctgtccccctcccgaggcccgggctcgcgacggcagagggctccgtcggcccaaaccgagctgggcgcccgcggt ccgggtgcagcctccactccgccccccagtcaccgcctcccccggcccctcgacgtggcgcccttccctccgcttctctgtgctcccc gcgcccctcttggcgtctggccccggcccccgctctttctcccgcaaccttcccttcgctccctcccgtcccccccagctcctagcctcc gactccctccccccctcacgcccgccctctcgccttcgccgaaccaaagtggattaattacacgctttctgtttctctccgtgctgttctctc ccgctgtgcgcctgcccgcctctcgctgtcctctctccccctcgccctctcttcggcccccccctttcacgttcactctgtctctcccactat ctctgcccccctctatccttgatacaacagctgacctcamcccgataccmtcccccccgaaaagtacaacatctggcccgccccagc ccgaagacagcccgtcctccctggacaatcagacgaattctccccccccccccaaaaaaaagccatccccccgctctgccccgtcgc acattcggcccccgcgactcggccagagcggcgctggcagaggagtgtccggcaggagggccaacgcccgctgttcggmgcga cacgcagcagggaggtgggcggcagcgtcgccggcttccaggtaagcggcgtgtgcgggccgggccggggccggggctgggg cggcgcgggcttgcggcgacgcccggcccttcctccgcccgctcccggcccggggcctgcggggctcggcggggcggctgagc cgggggggaggaggaggaggaggaggaggacggacggctgcgggtcccgttccctgcgcggagcccgcgctaccnnnnnnn nnnnnnnnnnnnnnnnnnngacgtccccgctgaagggggtcggtctgtgggtgcagggggtgccgcctcacatgtgtgattcgt gccttgcgggccctggcctccggggtgctgggtaacgaggaggggcgcggagccgcagaagcccaccctggtgtcgttgacgccg gtgccagcgagaccgcgagaggaagacgggggcgggcggggccaggatggagaggggccgagttggcaggagtcatggcaga cgccacactcgcgaccatctcccccacacccctctggcctctgtccgcaacatttccaaacaggagtcccgggagagggggagagg ggctgctggtctgaggctaagaagggcagagccttcgacccggagagaggccgcggccgcctgccccagtggcaacgttgaagttt tccatacaacggaggtcgggaaggagaccccccccccccttcactgccctgtgaagagatgagccgggggtgcaggatgggagcc catggcacttcgctacgggatgtccagggctccggttgggggtgcaggagagaagagactggctgggaggagggagagggcggg agcaaaggcgcgggggtgtggtcagagggagaggggtgggggttaggtggagcccgggctgggaggagtcggctcacacataa aactgaggcactgaccagcctgcaaactggatattagcttctcctgtgaaagagacttccagcttcctcctcctcctcttcctcctcctcctc ctgccccagcgagccttctgctgagctgtaggtaaccagggctgtggagtgaaggacccccgctgccatcccactccagcctgaggc agggcagcagggggcacggcccacgcctgggcctcgggccctgcagccgccagcccgctgcctctcggacagcacccccctccc
ctcttttcctctgcccctgcccccacctggcgtctctgctccctcacctgctccttccctttctgttccttcccttcggccccctccttgcccag ctcaggacttttcctgggccctcacctgctccgcaccgctgcatgcttcctgtcctgctttctgccggtcccctgacccggacctccaagc gcagagtggtggggcttgttgcggaagcgcggcgagggctagagtggccagctggcggagtgtgctcttagaatttggaagggggt ggcagagggggcggtgagaggactggccagggtccgccatgtcaaggagatgaccaaggaggctttcagatcctcggcgcagtcg cccactagtctttagagagggcatgcaaagttgtgcttctgtcccactgcctgctcagtcgctcacataatttattgcatcaaaaactcccct gggtctgcggagcaaggctggggctgcccgcctggagggtaccaccttctgcaggagcagggccaacttgctgtggtggctcccgg cctcccacccccgagtgggtaacccggccctgtgacctgcagcctgtggagggggtgtgcctaagactggcctccccttccagattgt agtctggggaacctggtgtcggacttcccaggtggcctgagctggtctcttcagctccacggggagagtttggtagcgcaaataggga gatgttctgggcccctggccttactggttcgatttgaggcctggaaaggaggctctgggcgtgtgtgtgtgtgtttgggggtacccaagg cagactggagttggagaactgggtgactgggaaaacaaggtttctagagcatgggtggcgtggttgtgttaaccattggagtcgcttga cccaggcctggctcagctgcagactggaaaggtggaaaagccagggggaggggcggggctggcccagcaggactggcctgctg ctttgagggcgatggtcctcctggaccccccctgctcagctgggggttgtggggaggaaggggctggtcctccttggagcacatgctc tgtaggggtggggctgtctgccatcttggcggcgctggaggcctgagaagtggcgatgtaacgctgggctggccctgcccccatggt gtcataggacggaggcaggtcgggtgtccagcctgggcccctgcagctgtggatgccgctgagctcctgcaataatgaccgtgcaga tggtcacccctcgtgtaaaattactagtgcttcttgcaaatggaaggaactgggccttttctgtgtgcttctggacgcttcattctgcacatg gccctgcgccctcacctcggcattatgacctgtgtgttacttttgtaataaaaataatgtttataggaaagccgtgctttcaattttcaactga atttgtaggttggcaaatttggtttgggaggggcacctctggcctggggcttggcctggctgccccgctcacgccacttctctcccgccc ccagacaccaatgggaatcccaatggggaagtcgatgctggtgcttctcaccttcttggccttcgcctcgtgctgcattgctgcttaccgc cccagtgagaccctgtgcggcggggagctggtggacaccctccagttcgtctgtggggaccgcggcttctacttcagtaagtagcag ggaggggcttcctcagacctggtcaggcccctagagtgaccggtgaggatctcccatcctcaagccaggggagcacactcctaggtc agcagcccagccgcttgctctgagactttgaccttcccgccgcgtttctgagcacgtgcggtgtcccagggcatccacaccagctgcct ttcccatcacacgcctccttcgaagggtgggccagaggtgccccctagacgtcaggggcatctacaggggtctccctgggcatcaga atttctgttgggggccgtgaggctcctgctcctgaggcaccgcacgcctagtgcagggcttcaggctctggaggaagagcctgcctttc ttcctgcaccttttggacattttgacaagggacgtgcgttcggtgaatgatcagaattaaaatcaataaagtgatttatataattaaaatcaat aagacaagtgcagttggtgggtggcaggggtgagcggtgcatgcgcctccttgggccccaaggctgccgtggggggtgcccacctg ctgacctcaaggacgcttcagcctttcctcatgtttctctcttggttctccagcctgggggctggcaggtgggtgcatggcccattgtcctt gagaccccacccccagataggggggctgggtggatgcagaggcaggcatggtgcctgggcatgcctgatggggcaggggaggg gccgctccttactggcagaggccgcaacttattccacctgacactcaccacgtgacatctttaccaccactgcttactcacgctgtgaaat gggctcacaggatgcaaatgcacttcaaagcttctctctgaaaagttcctgctgcttgactctggaagcccctgcccgccctggcctctc ctgtgccctctctcttgcctgccccatttgggggtaggaagtggcactgcagggcctggtgccagccagtccttgcccagggagaagc ttccctgcaccaggctttcctgagaggaggggagggccaagcccccacttgggggcccccgtgacggggcctcctgctccctcctcc ggctgatggcacctgccctttggcaccccaaggtggagcccccagcgaccttccccttccagctgagcattgctgtgggggagaggg ggaagacgggaggaaagaagggagtggttccatcacgcctcctcagcctcctctcctcccgtcttctcctctcctgcccttgtctccctgt ctcagcagctccaggggtggtgtgggcccctccagcctcccaggtggtgccaggccagagtccaagctcacggacagcagtcctcc tgtgggggccctgaactgggctcacatcccacacattttccaaaccactcccattgtgagcctttggtcctggtggtgtccctctggttgtg ggaccaagagcttgtgcccatttttcatctgaggaaggaggcagcagaagtcacgggctggtctgggccccactcacctcccctctca cctctcttcttcctgggacgcctctgcctgccggctctcacttccctcccctgacccgcagggtggctgcgnccttccagggcctggcct gagggcaggggtggtttgctgggggttcggcctccgggggctgggggtcggtgcggtgctaacacggctctctctgtgctgtgggac ttccaggcaggcccgcaagccgtgtgagccgtcgcagccgtggcatcgttgaggagtgctgtttccgcagctgtgacctggccctcct ggagacgtactgtgctacccccgccaagtccgagagggacgtgtcgacccctccgaccgtgcttccggtgagggtcctgggcccctt tcccactctctagagacagagaaatagggcttcgggcgcccagcgtttcctgtggcctctgggacctcttggccagggacaaggaccc gtgacttccttgcttgctgtgtggcccgggagcagctcagacgctggctccttctgtccctctgcccgtggacattagctcaagtcactga tcagtcacaggggtggcctgtcaggtcaggcgggcggctcaggcggaagagcgtggagagcaggcacctgctgaccagccccttc ccctcccaggacaacttccccgagatacccctgggcaagttcttccaatatgacacctggaagcagtccacccagcgcctgcgcagg ggcctgcctgccctcctgcgtgcccgccggggtcacgtgctcgccaaggagctcgaggcgttcagggaggccaaacgtcaccgtcc cctgattgctctacccacccaagaccccgcccacgggggcgcccccccagagatggccagcaatcggaagtgagcaaaactgccg caagtctgcagcccggcgccaccatcctgcagcctcctcctgaccacggacgtttccatcaggttccatcccgaaaatctctcggttcca cgtcccctggggcttctcctgacccagtccccgtgccccgcctccccgaaacaggctactctcctcggccccctccatcgggctgagg aagcacagcagcatcttcaaacatgtacaaaatcgattggctttaaacacccttcacataccctccccccaaattatccccaattatcccca cacataaaaaatcaaaacattaaactaacccccttcccccccccccacaacaaccctcttaaaactaattggctttttagaaacaccccac aaaagctcagaaattggctttaaaaaaaacaaccaccaaaaaaaatcaattggctaaaaaaaaaaagtattaaaaacgaattggctgag aaacaattggcaaaataaaggaatttggcactccccacccccctctttctcttctcccttggactttgagtcaaattggcctggacttgagtc cctgaaccagcaaagagaaaagaagggccccagaaatcacaggtgggcacgtcgcgtctaccgccatctcccttctcacgggaatttt
cagggtaaact (SEC ID Nº: 10).
La secuencia de IGF-II puede comprender una secuencia de ácido nucleico como se expone en SEC ID Nº: 10. La secuencia de ácido nucleico de la secuencia de IGF-II puede consistir en SEC ID Nº: 10. La secuencia de IGF-II puede ser un homólogo de SEC ID Nº: 10. La secuencia de IGF-II puede ser una variante de SEC ID Nº: 10. La secuencia de IGF-II puede ser un fragmento de SEC ID Nº: 10. La secuencia de IGF-II puede ser un homólogo de un fragmento de SEC ID Nº: 10. La secuencia de IGF-II puede ser una variante de un fragmento de SEC ID Nº: 10.
La secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II de los usos es un promotor P3 de IGF-II (también denominado en el presente documento “P3”). La secuencia del promotor P3 es:
gagctcggccatgcaggtaggatttgagctgtgtttcccgccctgatcctctctcctctggcggccggagcctccgtaggct
ccaagcctggcccagattcggcggcgcagccggccttccgcgcgtccgcacctagcgggggctccggggctccggcgcggcac cggggggcgctcgggatctggctgaggctccaaggcccgcgtggccggctcctcctgctggggcaggtggcggctgcgcgcccc gcccgagcccaggggccccctcagccgcaacaaccagcaaggaccccccgactcagccccaagccacctgcatctgcactcaga cggggcgcacccgcagtgcagcctcctggtggggcgctgggagcccgcctgcccctgcctgcccggagaccccagctcacgagc acaggccgcccgggcaccccagaaacccgggatggggcccctgaattctctaggacgggcattcagcatggccttggcgctctgc ggctccctgccccccacccagcctcgcccccgcgcaccccccagcccctgcgaccgccgcccccccccccggggccccagggc cccagcccgcaccccccgccccgctcttggctcgggttgcgggggcgggccgggggcggggcgagggctccgcgggcgccca ttggcgcgggcgcgaggccagcggccccgcgcggccctgggccgcggctggcgcgactataagagccgggcgtgggcgcccg cagttcgcctgctctccggcggagctgcgtgaggcccggccggccccggccccccccttccggccgcccccgcctcctggcccac gcctgcccgcgctctgcccaccagcgcctccatcgggcaaggcggccccgcgtcgac (SEC ID Nº: 8; los primeros 6 pares de bases [pb] son un sitio de restricción añadido que puede usarse opcionalmente en subclonación).
El promotor P3 de IGF-II puede comprender una secuencia de ácido nucleico como se expone en SEC ID Nº: 8. La secuencia de ácido nucleico del promotor P3 de IGF-II puede consistir en SEC ID Nº: 8. El promotor P3 de IGF-II puede ser homólogo de SEC ID Nº: 8. el promotor P3 de IGF-II puede ser una variante de SEC ID Nº: 8. El promotor P3 de IGF-II puede ser un fragmento de SEC ID Nº: 8. El promotor P3 de IGF-II puede ser un homólogo de un fragmento de SEC ID Nº: 8. El promotor P3 de IGF-II puede ser una variante de un fragmento de SEC ID Nº: 8.
La secuencia del promotor P3 es:
gacgggggtgggcggggccaggatggagaggggccgagttggcaggagtcatggcagacgccacattcgcgacact ctccccacaccccctctggctctgtccgcaacatttccaaacaggagtcccgggagagggggagaggggctgctggtctgaggcta agaagggcagagccttcgacccggagagaggccgcggcccctgcccagtgggcagcgtggaagtttccatacaaggaggtggga aggagaccccccccccccttcactgccctgtgcagagatgagccgggggtgcaggatgggagcccatggcacttcgctacgggat ggtcagggctcccggttgggggtgcaggagagaagagactggctgggaggagggagagggcgggagcaaaggcgcggggga gtggtcagcagggagaggggtggggggtagggtggagcccgggctgggaggagtcggctcacacataaaagctgaggcactga ccagcctgcaaactggacattagcttctcctgtgaaagagacttccagcttcctcctcctcctcttcctcctcctcctcctgccccagcga gccttctgctgagctgtaggtaaccagggccgtggatgagactctc (SEC ID Nº: 12)
El promotor P3 de IGF-II puede comprender una secuencia de ácido nucleico como se expone en SEC ID Nº: 12. La secuencia de ácido nucleico del promotor P3 de IGF-II puede consistir en SEC ID Nº: 12. El promotor P3 de IGF-II puede ser homólogo de SEC ID Nº: 12. El promotor P3 de IGF-II puede ser una variante de SEC ID Nº: 12. El promotor P3 de IGF-II puede ser un fragmento de SEC ID Nº: 12. El promotor P3 de IGF-II puede ser un homólogo de un fragmento de SEC ID Nº: 12. El promotor P3 de IGF-II puede ser una variante de un fragmento de SEC ID Nº:
12.
El promotor P3 de IGF-II puede comprender un sitio de unión a Sp1 del mismo. El sitio de unión a Sp1 puede ser los restos 10-18 de SEC ID Nº: 12. El sitio de unión a Sp1 puede ser los restos 388-399 de SEC ID Nº: 12. El sitio de unión a Sp1 puede ser otros sitio de unión a Sp1 hallado en SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12. El promotor P3 de IGF-II puede comprender una caja TATA. La caja TATA puede ser los restos 476-482 de SEC ID Nº: 12. La caja TATA puede ser otra caja TATA hallada en SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12.
La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 60 % homóloga de una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 12 y SEC ID Nº: 17. La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 65 % homóloga de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12. La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 70 % homóloga de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12. La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 72 % homóloga de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12. La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 74 % homóloga de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12. La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 76 % homóloga de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12. La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 78 % homóloga de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12. La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 80 % homóloga de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12. La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 82 % homóloga de SEC ID Nº: 8
o SEC ID Nº: 12. La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 84 % homóloga de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12. La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 86 % homóloga de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12. La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 88 % homóloga de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12. La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 90 % homóloga de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12. La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 92 % homóloga de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12. La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 94 % homóloga de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12. La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 95 % homóloga de SEC ID Nº: 8
o SEC ID Nº: 12. La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 96 % homóloga de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12. La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 97 % homóloga de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12. La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 98 % homóloga de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12. La secuencia P3 de IGF-II puede ser al menos el 99 % homóloga de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12. La secuencia P3 de IGF-II puede ser más del 99 % homóloga de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12.
El promotor P3 de IGF-II puede contener los elementos promotores hallados en -291 -+130, en relación con el sitio de inicio de P3. El promotor P3 de IGF-II puede contener los elementos promotores hallados en -1232 - -812, en relación con el sitio de inicio de P3. El promotor P3 de IGF-II puede contener los elementos promotores hallados en 238 -+140, en relación con el sitio de inicio de P3. El promotor P3 de IGF-II puede contener los elementos promotores hallados 5’ del resto -515, en relación con el sitio de inicio de P3. El promotor P3 de IGF-II puede
contener los elementos promotores hallados 5’ del resto -238, en relación con el sitio de inicio de P3
Se describen además en el presente documento secuencias reguladoras P4 de IGF-II que pueden usarse en las construcciones de ácido nucleico para dirigir la expresión específica de un producto génico citotóxico o citostático. La secuencia reguladora de la transcripción de P4 de IGF-II de las composiciones puede ser un promotor P4 de IGF-II (también denominado en el presente documento “P4”). La secuencia del promotor P4 puede ser la expuesta en SEC ID Nº: 9, como se expone posteriormente en el presente documento.
El promotor P4 de IGF-II puede comprender una secuencia de ácido nucleico como se expone en SEC ID Nº: 9. La secuencia de ácido nucleico del promotor P4 de IGF-II puede consistir en SEC ID Nº: 9. El promotor P4 de IGF-II puede ser homólogo de SEC ID Nº: 9. el promotor P4 de IGF-II puede ser una variante de SEC ID Nº: 9. El promotor P4 de IGF-II puede ser un fragmento de SEC ID Nº: 9. El promotor P4 de IGF-II puede ser un homólogo de un fragmento de SEC ID Nº: 9. El promotor P4 de IGF-II puede ser una variante de un fragmento de SEC ID Nº: 9.
La secuencia del promotor P4 se expone en SEC ID Nº: 13:
ggatccccaaaatgtgttccttgctttcatctgccaattttacgtaatatggctctacggcaaaattcccaatttcatatggagaa
ttttctttaactacccctcctcacaaattggtcccccaagctagctggcccctatttgagacctctttctctatgttcccaattgcatggagca
acttctctcatcccccaaacctgtaatctatttttctggagtctcgagtttagtcattaatcacggttcccacattaacggagtccccggggt
cccctcctccaggacacccattcgctaagcccgcaaggcagaaagaactctgccttgcgttccccaaaatttgggcattgttccggctc
gccggccacccactgcagcttccccaaccccgcgcacagcgggcactggtttcgggcctctctgtctcctacgaagtccccagagca
actcggatttgggaaatttctctctagcgttgcccaaacacacttgggtcggccgcgcgccctcaggacgtggacagggagggcttcc
ccgtgtccaggaaagcgaccgggcattgcccccagtctcccccaaatttgggcattgtccccgggtcttccaacggactgggcgttgc
tcccggacactgaggactggccccggggtctcgctcaccttcagcagcgtccaccgcctgccacagagcgttcgatcgctcgctgcc
tgagctcctggtgcgcccgcggacgcagcctccagcttcgcggtgagctccccgccgcgccgatcccctccgcctctgcgcccctg
accggctctcggcccgcatctgctgctgtcccgccggtgctggcgctcgtctccggctgccgccggggaggc (SEC ID Nº: 13).
El promotor P4 de IGF-II puede comprender una secuencia de ácido nucleico como se expone en SEC ID Nº: 13. La secuencia de ácido nucleico del promotor P4 de IGF-II puede consistir en SEC ID Nº: 13. El promotor P4 de IGF-II puede ser homólogo de SEC ID Nº: 13. El promotor P4 de IGF-II puede ser una variante de SEC ID Nº: 13. El promotor P4 de IGF-II puede ser un fragmento de SEC ID Nº: 13. El promotor P4 de IGF-II puede ser un homólogo de un fragmento de SEC ID Nº: 13. El promotor P4 de IGF-II puede ser una variante de un fragmento de SEC ID Nº:
13.
La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos el 60 % homóloga de una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 9 y SEC ID Nº: 13. La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos el 65 % homóloga de SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 13. La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos el 70 % homóloga de SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 13. La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos el 72 % homóloga de SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 13. La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos el 74 % homóloga de SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 13. La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos el 76 % homóloga de SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 13. La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos el 78 % homóloga de SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 13. La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos el 80 % homóloga de SEC ID Nº: 9
o SEC ID Nº: 13. La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos el 82 % homóloga de SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 13. La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos el 84 % homóloga de SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 13. La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos el 86 % homóloga de SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 13. La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos el 88 % homóloga de SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 13. La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos 90 % homóloga de SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 13. La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos el 92 % homóloga de SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 13. La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos el 94 % homóloga de SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 13. La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos el 95 % homóloga de SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 13. La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos el 96 % homóloga de SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 13. La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos el 97 % homóloga de SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 13. La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos 98 % homóloga de SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 13.La secuencia P4 de IGF-II puede ser al menos el 99 % homóloga de SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 13. La secuencia P4 de IGF-II puede ser más de el 99 % homóloga de SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 13.
El promotor P4 puede corresponder a la secuencia de nucleótidos -546 a +102 del gen de IGF-II, en relación con el sitio de inicio de P4 de IGF.
Estas secuencias reguladoras de genes impresos y no impresos genómicamente que se expresan en células cancerosas pueden delinearse además para definir las secuencias reguladoras mínimas requeridas para obtener la expresión específica de tumor deseada. Por ejemplo, la región promotora puede alterarse mediante adiciones, sustituciones o deleciones y ensayarse con respecto a retención de función de expresión específica de tumor. Pueden ensayarse diversas partes del potenciador corriente abajo H19 individualmente con respecto a la capacidad para potenciar la transcripción del promotor de H19.
La proteína TNF-alfa de los usos y composiciones puede codificarse por una molécula de nucleótidos que tiene la secuencia:
tcatgagcaccgagagcatgatcagggatgtggagctggccgaggaggccctgcccaagaaaacaggcggccctcagg
gcagcagaagatgcctgttcctgagcctgttcagcttcctgatcgtggccggagccaccaccctgttctgcctgctgaacttcggcgtga tcggcccccagagagaggagttccccagagacctgagcctgatctcccccctggcccaggctgtgagaagcagcagcagaacccc cagcgacaagcccgtggcccacgtggtggccaacccccaggccgagggccagctgcagtggctgaacagaagagccaacgccct gctggccaacggcgtggagctgagagacaaccagctggtggtgcccagcgagggcctgtacctgatctacagccaggtgctgttca agggccagggctgccccagcacccacgtgctgctgacccacaccatcagcagaatcgccgtgtcctaccagaccaaggtgaacctg ctgtccgccatcaagagcccttgccagagagagacccccgagggcgccgaggccaagccctggtacgagcctatctacctgggcg gcgtgttccagctggagaagggcgacagactgagcgccgagatcaacagacccgactacctggatttcgccgagagcggccaggt gtacttcggcatcatcgccctgtgataatctagaaccatgg (SEC ID Nº: 14). La secuencia de ácido nucleico que codifica el TNF-alfa puede consistir en SEC ID Nº: 14. La secuencia que codifica el TNF-alfa puede ser homóloga de SEC ID Nº: 14. La secuencia que codifica el TNF-alfa puede ser una variante de SEC ID Nº: 14. La secuencia que codifica el TNFalfa puede ser un fragmento de SEC ID Nº: 14. La secuencia que codifica el TNF-alfa puede ser un homólogo de un fragmento de SEC ID Nº: 14. La secuencia que codifica el TNF-alfa puede ser una variante de un fragmento de SEC ID Nº: 14.
La secuencia de aminoácidos del TNF-alfa es
MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLNFG VIGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANAL LANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLL SAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYF GIIAL (SEC ID Nº: 15) La secuencia del TNF-alfa puede consistir en SEC ID Nº: 15. La secuencia del TNF-alfa puede ser homóloga de SEC ID Nº: 15. La secuencia del TNF-alfa puede ser una variante de SEC ID Nº: 15. La secuencia del TNF-alfa puede ser un fragmento de SEC ID Nº: 15. La secuencia del TNF-alfa puede ser un homólogo de un fragmento de SEC ID Nº: 15. La secuencia del TNF-alfa puede ser una variante de un fragmento de SEC ID Nº: 15.
Pueden generarse alteraciones en una secuencia reguladora (por ejemplo una secuencia que codifica un producto génico citotóxico o citostático) usando diversos procedimientos químicos y enzimáticos que se conocen bien por los expertos en la materia. Por ejemplo, puede suprimirse regiones de las secuencias definidas por sitios de restricción. Puede emplearse mutagénesis dirigida por oligonucleótidos para alterar la secuencia de una manera definida y/o introducir sitios de restricción en regiones específicas dentro de la secuencia. Adicionalmente, pueden generarse mutantes de deleción usando ADN nucleasas tales como Bal31 o ExoIII y nucleasa S1. Se generan deleciones progresivamente mayores en las secuencias reguladoras incubando el ADN con nucleasas durante mayores periodos de tiempo.
Las secuencias alteradas se evalúan con respecto a su capacidad para cumplir la función requerida, por ejemplo dirigir la expresión específica de tumor de secuencias codificantes heterólogas en células huésped apropiadas. Puede estar dentro del alcance que cualquier secuencia reguladora alterada que conserve su capacidad para dirigir la expresión específica de tumor se incorpore en las construcciones de ácido nucleico para uso adicional.
Las construcciones pueden producirse usando procedimientos recombinantes y de síntesis convencionales bien conocidos en la técnica. Puede obtenerse una secuencia de ácido nucleico aislada de su fuente natural, como un gen entero (es decir, completo) o una parte del mismo. También puede producirse una molécula de ácido nucleico usando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), clonación) o síntesis química (véase por ejemplo Sambrook y col., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York; Ausubel, y col., 1989, Capítulos 2 y 4). Las secuencias de ácido nucleico incluyen secuencias de ácido nucleico naturales y homólogos de las mismas, incluyendo, pero sin limitación, variantes alélicas naturales y secuencias de ácido nucleico modificadas en las que se han insertado, suprimido, sustituido y/o invertido nucleótidos de tal manera que tales modificaciones no interfieran sustancialmente con la capacidad de la molécula de ácido nucleico para codificar un oligonucleótido funcional.
Puede producirse un análogo de molécula de ácido nucleico usando varios procedimientos conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook y col., 2001, igual que la referencia anterior). Por ejemplo, pueden modificarse moléculas de ácido nucleico usando diversas técnicas incluyendo, pero sin limitación, técnicas de mutagénesis clásica y técnicas de ADN recombinante, tales como mutagénesis dirigida, tratamiento químico de una molécula de ácido nucleico para inducir mutaciones, escisión de enzimas de restricción de un fragmento de ácido nucleico, ligación de fragmentos de ácido nucleico, amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/o mutagénesis de regiones seleccionadas de una secuencia de ácido nucleico, síntesis de mezclas de oligonucleótidos y ligación de grupos de mezcla para “construir” una mezcla de moléculas de ácido nucleico y combinaciones de las mismas. Por ejemplo, pueden seleccionarse análogos de moléculas de ácido nucleico de una mezcla de ácidos nucleicos modificados explorando con respecto a la función del ácido oligonucleico codificado por el ácido nucleico con respecto a progresión tumoral, por ejemplo por los procedimientos descritos en el presente documento.
Opcionalmente, la construcción puede comprender además una o más secuencias que codifican productos génicos adicionales bajo un control de la transcripción específico de cáncer (por ejemplo uno específico de H19). La construcción también puede comprender otras secuencias reguladoras o marcadores seleccionables, como se conoce en la técnica. La construcción de ácido nucleico (también denominada en el presente documento “vector de
expresión”) o sistema de construcción puede incluir secuencias adicionales que hacen a este vector adecuado para replicación e integración en procariotas, eucariotas o preferentemente ambas (por ejemplo, vectores lanzadera). Además, un vector de clonación típico puede contener también secuencias de inicio de la transcripción y la traducción, terminadores de la transcripción y la traducción y una señal de poliadenilación.
Los elementos potenciadores pueden estimular la transcripción hasta 1.000 veces de promotores homólogos o heterólogos unidos. Los potenciadores están activos cuando se sitúan cadena abajo o cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción. Muchos elementos potenciadores derivados de virus tienen una amplia serie de huéspedes y están activos en diversos tejidos. Por ejemplo, el potenciador de gen temprano SV40 puede ser adecuado para muchos tipos celulares. Otros potenciadores que son adecuados para la presente invención incluyen los derivados de virus del polioma, citomegalovirus humanos o murino (CMV), la repetición a largo plazo de diversos retrovirus tales como virus de leucemia murina, virus de sarcoma de Rous o murino y VIH.
En la construcción del vector de expresión, el promotor puede situarse de modo preferente aproximadamente a la misma distancia del sitio de inicio de la transcripción heterólogo de la que puede estar del sitio de inicio de la transcripción en su entorno natural. Como se puede conocer en la técnica, sin embargo, puede acomodarse cierta variación en esta distancia sin pérdida de función del promotor.
También pueden añadirse secuencias de poliadenilación al vector de expresión para aumentar la estabilidad del ARN. Se requieren dos elementos de secuencia distintos para poliadenilación precisa y eficaz: secuencias ricas en GU o U localizadas cadena abajo del sitio de poliadenilación y una secuencia altamente conservada de seis nucleótidos, AAUAAA, localizada 11-30 nucleótidos cadena arriba. Las señales de terminación y poliadenilación ejemplares que son adecuadas para la presente invención incluyen las derivadas de SV40.
Además de los elementos ya descritos, el vector de expresión puede contener normalmente otros elementos especializados que se pretende que aumenten el nivel de expresión de ácidos nucleicos clonados o que faciliten la identificación de células que porten el ADN recombinante. Por ejemplo, varios virus animales contienen secuencias de ADN que promueven la replicación cromosómica extra del genoma viral en tipos celulares permisivos. Se replican plásmidos que portan estos replicones virales de forma episómica siempre que se proporcionen los factores apropiados por genes portados en el plásmido o con el genoma de la célula huésped.
El vector puede o no incluir un replicón eucariota. Si puede estar presente un replicón eucariota, entonces el vector puede ser amplificable en células eucariotas usando el marcador seleccionable apropiado. Si el vector no comprende un replicón eucariota, no es posible la amplificación episómica. En su lugar, el ADN recombinante se integra en el genoma de la célula modificada por ingeniería genética, cuando el promotor dirige la expresión del ácido nucleico deseado.
Ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, y pNMT81, que están disponibles de Invitrogen, pCI que puede estar disponible de Promega, pMbac, pPbac, pBK-RSV y pBK-CMV, que están disponibles de Strategene, pTRES que puede estar disponible de Clontech, y sus derivados. Estos pueden actuar como cadena principal de vector para las construcciones.
También pueden usarse vectores de expresión que contengan elementos reguladores de virus eucariotas tales como retrovirus. Los vectores SV40 incluyen pSVT7 y pMT2, por ejemplo. Los vectores derivados de virus de papiloma bovino incluyen pBV-1MTHA, y los vectores derivados del virus de Epstein-Barr incluyen pHEBO y p2O5. Otros vectores ejemplares incluyen pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, pDSVE de baculovirus y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor temprano de SV40, promotor tardío de SV40, promotor de metalotioneína, promotor del virus de tumor de mama murino, promotor del virus de sarcoma de Rous, promotor de polihedrina u otros promotores que se ha mostrado que son eficaces para la expresión de células eucariotas. Estos pueden actuar como cadena principal de vector para las construcciones.
Como se ha descrito anteriormente, los virus son agentes infecciosos muy especializados que han evolucionado, en muchos casos, para eludir mecanismos de defensa del huésped. Normalmente, los virus infectan y se propagan en tipos celulares específicos. La especificidad de dirección de los vectores virales utiliza su especificidad natural para dirigirse específicamente a tipos celulares predeterminados e introducir de este modo un gen recombinante en la célula infectada. Por lo tanto, el tipo de vector usado por la presente invención dependerá del tipo celular transformado. La capacidad para seleccionar vectores adecuados de acuerdo con el tipo celular transformado puede estar dentro de las capacidades del experto habitual en la materia y como tales, no puede proporcionarse en el presente documento una descripción general de las consideraciones de selección. Por ejemplo, pueden marcarse como objetivo las células de médula ósea usando el virus de leucemia de linfocitos T humana de tipo I (HTLV-I) y las células de riñón pueden marcarse como objetivo usando el promotor heterólogo presente en el baculovirus nucleopolihedrovirus múltiple de Autographa californica (AcMNPV), como se describe por Liang, C. Y. y col. (2004). High efficiency gene transfer into mammalian kidney cells using baculovirus vectors. Arch Virol 149, 51-60.
Los vectores virales recombinantes son útiles para expresión in vivo de los genes puesto que ofrecen ventajas tales como infección lateral y especificidad de dirección. La infección lateral puede ser inherente en el ciclo de vida de los
retrovirus, por ejemplo, y puede ser el procedimiento por el que una célula infectada única produce muchos viriones descendientes que emergen e infectan células vecinas. El resultado puede ser la rápida infección de una gran área de células, la mayoría de las cuales no fueron infectadas inicialmente por las partículas virales originales. Esto puede contrastar con la infección de tipo vertical en la que el agente infeccioso se propaga solamente a través de la descendencia directa. También pueden producirse vectores virales que son incapaces de propagarse de forma lateral. Esta característica puede ser útil si el fin deseado puede ser introducir un gen específico en solamente un número localizado de células diana.
Pueden usarse diversos procedimientos para introducir el vector de expresión en células. Tales procedimientos se describen en general en Sambrook y col, igual que la referencia anterior; Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989); Chang y col., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995); Vega y col., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988); y Gilboa y col. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986] e incluyen, por ejemplo, transfección estable o transitoria, lipofección, electroporación e infección con vectores virales recombinantes. Además, véase Patentes de Estados Unidos Nº 5.464.764 y 5.487.992 para procedimientos de selección positivos-negativos.
Terapia génica
Pueden usarse enfoques de terapia génica de acuerdo con la presente invención para prevenir o tratar cáncer. La terapia génica se refiere a terapia realizada mediante la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable.
Puede usarse cualquiera de los procedimientos para terapia génica disponibles en la técnica de acuerdo con la presente invención. Se ha demostrado el uso eficaz a largo plazo de un vector de terapia génica para aliviar la enfermedad en mamíferos grandes. Por ejemplo, la administración de un virus adenoasociado (“AAV”) que contenía un gen de tipo silvestre a perros que padecían amaurosis congénita de Leber, una afección que da como resultado ceguera debido a una mutación de un gen (RPE65) en el epitelio pigmentario retinal, ha corregido con éxito el defecto genético (Ackland y col., 2001, Nature Genetics 28: 92). La expresión del gen RPE65 de tipo silvestre se confirmó por RT PCR. Además, se demostró la restauración de la función mediante estudios electrofisiológicos de la retina, así como observaciones imparciales de los animales tratados. Se mostró que el tratamiento era eficaz durante al menos cuatro meses.
También se ha demostrado que la terapia génica es útil en el tratamiento de una complicación de la diabetes. Ya está en ensayos clínicos la terapia génica con VEGF (Factor de Crecimiento Endotelial Vascular) de angiogénesis terapéutica funcional y otras proteínas para tratar enfermedades poligénicas y complejas tales como isquemia miocárdica, hipertensión, aterosclerosis y reestenosis (Pachori AS y col, Gene therapy: role in myocardial protection. Handb Exp Pharmacol. 2006;(176 Pt 2):335-50). Además, se mostró que los plásmidos que expresaban VEGF tenían eficacia en un estudio de fase III en comparación con suministro intramuscular de ANG1 con placebo en pacientes diabéticos con isquemia de las extremidades crítica que se llevó a cabo en treces pacientes (Kusumanto y col., Molecular Therapy 3: S73).
También se ha usado de forma exitosa terapia génica para tratar un trastorno hereditario del cromosoma X, concretamente inmunodeficiencia combinada grave (SCID) y enfermedad granulomatosa crónica (CGD), como se revisa en Blaese RM, Immunol Res. 2007; 38(1-3): 274-84.
Además, recientes estudios han mostrado que p53 puede expresarse de forma exitosa y terapéutica en tejidos normales y malignos (Fischer U, Janssen K, Schulze-Osthoff K, BioDrugs. 2007; 21 (5): 273-97).
En consecuencia, pueden usarse enfoques de terapia génica que utilizan los vectores, que comprenden un polinucleótido heterólogo unido operativamente a más de una secuencia reguladora de la transcripción, para prevenir o tratar cáncer y enfermedades hiperproliferativas.
Puede suministrarse un vector in vivo (es decir, directamente a un sujeto). Puede inyectarse un vector directamente en el tejido diana o sitio de derivación celular. Puede introducirse un vector en el tejido diana como un implante, tal como, por ejemplo, en una formulación polimérica (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 5.702.717). Puede dirigirse un vector a las células o tejidos deseados.
Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo (es decir, terapia génica in vivo) pueden incluir transfección con construcciones virales o no virales, tales como adenovirus, lentivirus, virus del Herpes simple I o virus adenoasociado (AAV) y sistemas basados en lípidos.
El vector puede inyectarse directamente en un tejido diana como ADN desnudo. Puede introducirse un vector de forma intracelular usando bombardeo de micropartículas, por ejemplo, usando una pistola génica de Biolística (DuPont). Puede suministrarse ADN plasmídico con la ayuda de, por ejemplo, polímeros catiónicos, liposomas catiónicos (por ejemplo lipofectina, derivados de colesterol tales como D.D.A.B. y fosfolípidos catiónicos) o conjugados de polilisina derivatizados (por ejemplo, conjugados con anticuerpos), gramicidina S, envolturas virales artificiales u otros vehículos intracelulares tales, así como inyección directa de la construcción génica desnuda,
electroporación o precipitación de CaPO4 llevada a cabo in vivo así como sistemas de suministro génico no virales basados en polietilenimina. Las revisiones sobre sistemas de transferencia y expresión de ácidos nucleicos para terapia génica de cáncer incluyen Lungwitz (2005) Eur. J. Phar. Biopharm. 60 (2): 247-66; Aigner (2006) J. Biotechnol. 254: 12-25; Christopher y Wong (2006) Curr. Pharm. Des. 1995-2006; y Wolff (2005) Acta Myol. 24: 202
8.
Medición de la expresión de genes en células tumorales
Puede determinarse la expresión dirigida por H19, P3 de IGF-II y P4 de IGF-II en tumores y líneas celulares, por ejemplo, usando las técnicas de análisis de ARN, hibridación in situ o construcciones de genes indicadores. Además, las células tumorales con expresión génica de IGF-1 activada pueden determinarse de forma similar y marcarse como objetivo en terapia génica usando el promotor de IGF-1 para dirigir la expresión de un polinucleótido heterólogo.
Para la mayoría de las aplicaciones de análisis de ARN, puede prepararse una sonda marcada que hibride específicamente con el transcrito génico de interés usando cualquier variedad de técnicas bien conocidas en este campo. La sonda marcada puede contener al menos 15-30 bases complementarias de la secuencia de nucleótidos H19, y más preferentemente pueden contener al menos de 50 a 100 bases complementarias del transcrito de H19. Una sonda de hibridación particularmente preferida para la expresión de H19 puede ser un polinucleótido complementario del extremo 3’ del mensaje de H19 desde aproximadamente 800 pares de bases cadena arriba del sitio de poli A hasta el sitio de poli A.
Puede generarse una sonda de ARN antisentido marcada in vitro usando un plásmido de expresión T7 o T3. Las sondas de H19 también pueden marcarse mediante uso de cebadores aleatorios en presencia de nucleótidos marcados, por ejemplo, usando el kit Prime-It (Stratagene ™, La Jolla, Calif; Nº de Catálogo 300392). Como alternativa, pueden generarse sondas marcadas en una reacción de PCR usando un clon de ADNc de la región codificante de H19 y cebadores diseñados para amplificar una región de la región codificante, o mediante una reacción de traslación de hueco convencional.
Los marcadores apropiados para sondas polinucleotídicas incluyen nucleótidos que incorporan isótopos radiactivos (tales como 35S y 32P), marcadores fluorescentes, luminiscentes y de color, y restos enzimáticos.
La sonda marcada puede hibridarse in situ con una muestra celular o tisular usando técnicas convencionales tales como se describen en la patente de Estados Unidos 5.955.273, incorporada en el presente documento por referencia. Como alternativa, si puede obtenerse una cantidad suficiente de las células apropiadas, se puede realizar análisis de ARN convencional (análisis de Northern, protección de RNasa o extensión de cebadores) para determinar el nivel de expresión de ARNm del gen de interés.
Adicionalmente, dichos ensayos de expresión génica pueden realizarse “in situ”, es decir, directamente sobre secciones tisulares (fijadas y/o congeladas) de tejido del paciente obtenido de biopsias o resecciones, de modo que pueda no ser necesaria ninguna purificación de ácidos nucleicos. Pueden usarse reactivos de ácidos nucleicos tales como los descritos anteriormente como sondas y/o cebadores para tales procedimientos in situ (véase, por ejemplo, Nuovo, 1992, "PCR In Situ Hybridization: Protocols And Applications," Raven Press, NY).
Un procedimiento alternativo para determinar si un tipo celular o un tumor serán capaz de activar específicamente las construcciones de expresión que contienen las secuencias reguladoras de la transcripción particulares ligadas operativamente a un polinucleótido heterólogo puede ser transfectar de hecho dichas construcciones de expresión en la célula. Para estos fines, el polinucleótido heterólogo puede ser preferentemente un producto génico marcador. Un resultado positivo en un ensayo para el producto génico marcador revela que la célula o línea celular puede ser capaz de activar la expresión de las secuencias reguladoras de la transcripción.
Además, también pueden usarse diversos procedimientos de amplificación, que sean suficientemente sensibles para detectar cantidades mínimas de ARN, para determinar si el tumor puede expresar H19 y/o IGF-II. Tales procedimientos incluyen, PCR, RT-PCR y PCR in situ (refiriéndose todas las anteriores también a PCR “anidada” y RT-PCR anidada), LCR (reacción en cadena de la ligasa) y 3SR (replicación de secuencia autosostenida). Pueden usarse RT-PCR y RT-PCR anidada. Los productos de amplificación se identifican por procedimientos usados en este campo tales como por separación en un gel.
Composiciones y kits farmacéuticos
Puede proporcionarse una composición farmacéutica que comprenda una construcción de ácido nucleico, y opcionalmente uno o más vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
Puede proporcionarse una composición farmacéutica que comprende i) una construcción de ácido nucleico que contiene al menos dos secuencias de ácido nucleico que codifiquen una proteína de gen citotóxico, en la que una secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19 y otra secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II; y ii) un vehículo, un excipiente o un diluyente farmacéuticamente aceptables.
Puede proporcionarse una composición farmacéutica que comprende i) una construcción de ácido nucleico que contiene al menos dos secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de gen citotóxico, en la que una secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGN-II y otra secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II; y ii) un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Puede proporcionarse una composición farmacéutica que comprende i) una construcción de ácido nucleico que contiene al menos dos secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de gen citotóxico, en las que una secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19 y otra secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II; y ii) un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Puede proporcionarse una composición farmacéutica que comprende i) una construcción de ácido nucleico que contiene un primer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando el primer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19, y un segundo marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando el segundo marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II; y ii) un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Dicha construcción de ácido nucleico puede comprender además un tercer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando dicho tercer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II.
Puede proporcionarse una composición farmacéutica que comprende i) una construcción de ácido nucleico que contiene un primer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando el primer marco abierto de lectura unida operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19, y un segundo marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando el segundo marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II; y ii) un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Dicha construcción de ácido nucleico puede comprender además un tercer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando dicho tercer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II.
Puede proporcionarse una composición farmacéutica que comprende i) una construcción de ácido nucleico que contiene un primer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando el primer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II, y un segundo marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando el segundo marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II; y ii) un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Dicha construcción de ácido nucleico puede comprender además un tercer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando dicho tercer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19.
La toxina diftérica puede ser toxina diftérica A (DTA). Dicha toxina diftérica puede comprender una secuencia como se expone en SEC ID Nº: 7.
La secuencia reguladora de la transcripción específica de H19 puede ser un promotor que comprende una secuencia de ácido nucleico expuesta en una cualquiera de SEC ID N: 1-2.
La secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II puede ser un promotor que comprende una secuencia de ácido nucleico expuesta en SEC ID Nº: 9.
La secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II puede ser un promotor que comprende una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 12 y SEC ID Nº: 17.
Dicha construcción de ácido nucleico puede ser un plásmido o un vector de expresión eucariota.
Puede proporcionarse un envase farmacéutico que contiene un ciclo de tratamiento antineoplásico para un mamífero individual que comprende un recipiente que tiene una unidad de construcción de ácido nucleico en forma farmacéutica unitaria.
Las construcciones pueden proporcionarse en envases en una forma lista para administración. Las construcciones pueden proporcionarse en forma concentrada en envases, opcionalmente con el diluyente requerido para realizar la solución o las soluciones finales para administración. El producto puede contener un compuesto útil en la invención en forma sólida y, opcionalmente, un recipiente separado con un disolvente o vehículo adecuado para el compuesto útil en la invención.
Los envases/kits anteriores pueden incluir otros componentes, por ejemplo, instrucciones para dilución, mezcla y/o administración del producto, otros recipientes, jeringas, agujas, etc. Otros de tales componentes del envase/kit resultarán evidentes para un experto en la materia.
Los kits pueden comprender además instrucciones para administrar dicha construcción de ácido nucleico a un sujeto aquejado de cáncer, particularmente con un tumor caracterizado por expresión de ARN de H19 y/o expresión de IGF-II del promotor P3 y/o P4 en al menos en una parte de las células del tumor, como se detalla en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, una “composición farmacéutica” se refiere a una preparación de uno o más de los principios activos descritos en el presente documento, por ejemplo una construcción que codifica una molécula de DTA, con otros componentes tales como vehículos y excipientes fisiológicamente adecuados. El fin de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un sujeto.
En lo sucesivo en el presente documento, las frases “vehículo terapéuticamente aceptable” y “vehículo farmacéuticamente aceptable”, que pueden usarse de forma intercambiable, se refieren a un vehículo o un diluyente que no provoca irritación significativa a un organismo y no suprime la actividad biológica y propiedades del compuesto administrado. Como se usa en el presente documento, un “vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable” puede referirse a un material auxiliar secundario o a diversas mezclas y combinaciones de dichos ingredientes terapéuticamente inertes.
En el presente documento, el término “excipiente” se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un principio activo. Los ejemplos, sin limitación, de excipientes particularmente adecuados para administrar agentes de ácidos nucleicos incluyen carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.
Una composición terapéutica puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, un “vehículo” se refiere a cualquier sustancia adecuada como un vehículo para suministrar un agente terapéutico, por ejemplo una molécula de ácido nucleico, a un sitio in vivo o in vitro adecuado. Como tales, los vehículos pueden actuar como un excipiente farmacéuticamente aceptable de una composición terapéutica que contenga una molécula de ácido nucleico. Los vehículos preferidos particularmente adecuados para administrar agentes de ácido nucleico son capaces de mantener una molécula de ácido nucleico en una forma que, tras la llegada de la molécula de ácido nucleico a una célula, la molécula de ácido nucleico sea capaz de entrar en la célula y expresarse por la célula. Los vehículos pueden incluir: (1) excipientes o formularios que transportan, pero no dirigen específicamente una molécula de ácido nucleico a una célula (denominados en el presente documento vehículos no directores); y (2) excipientes o formularios que suministran una molécula de ácido nucleico a un sitio específico en un sujeto o una célula específica (es decir, vehículos de dirección). Los ejemplos de vehículos no directores incluyen, pero sin limitación, agua, solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer, solución de dextrosa, soluciones que contienen suero, solución de Hank, otras soluciones fisiológicamente equilibradas acuosas, aceites, ésteres y glicoles. Los vehículos acuosos pueden contener sustancias adyuvantes adecuadas requeridas par aproximar las condiciones fisiológicas del receptor, por ejemplo, potenciando la estabilidad química e isotonicidad.
Las sustancias adyuvantes adecuadas incluyen, por ejemplo, acetato sódico, cloruro sódico, lactato sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico y otras sustancias usadas para producir tampón fosfato, tampón Tris y tampón de bicarbonato. Las sustancias adyuvantes también pueden incluir conservantes, tales como timerosal, m y o-cresol, formalina y alcohol benzol. Las sustancias adyuvantes preferidas para suministro de aerosoles incluyen sustancias tensioactivas no tóxicas para un sujeto, por ejemplo, ésteres o ésteres parciales de ácidos grasos que contienen de aproximadamente seis a aproximadamente veintidós átomos de carbono. Los ejemplos de ésteres incluyen ácidos caproico, octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleico. Otros vehículos pueden incluir partículas metálicas (por ejemplo, partículas de oro) para su uso con, por ejemplo, una pistola de biolística a través de la piel. Las composiciones terapéuticas pueden esterilizarse por procedimientos convencionales.
Los vehículos de dirección se denominan en el presente documento “vehículos de suministro”. Los vehículos de suministro son capaces de suministrar una composición terapéutica a un sitio diana en un sujeto. Un “sitio diana” se refiere a un sitio en un sujeto en el que se desea suministrar una composición terapéutica. Los ejemplos de vehículos de suministro particularmente adecuados para administrar agentes de ácido nucleico incluyen vehículos de suministro que contienen lípidos artificiales y naturales. Los vehículos de suministro que contienen lípidos naturales incluyen células y membranas celulares. Los vehículos de suministro que contienen lípidos artificiales incluyen liposomas y micelas. Un vehículo de suministro puede modificarse para dirigirse a un sitio particular en un sujeto, dirigiendo y haciendo uso de este modo de una molécula de ácido nucleico en ese sitio. Las modificaciones adecuadas incluyen manipular la fórmula química de la parte lipídica del vehículo de suministro y/o introducir en el vehículo un compuesto capaz de dirigir específicamente un vehículo de suministro a un sitio preferido, por ejemplo, un tipo celular preferido. La dirección específica se refiere a provocar que un vehículo de suministro se una a una célula particular mediante la interacción del compuesto en el vehículo con una molécula de la superficie de la célula. Los compuestos de dirección adecuados incluyen ligandos capaces de unirse selectivamente (es decir, específicamente) a otra molécula en un sitio particular. Los ejemplos de tales ligandos incluyen anticuerpos, antígenos, receptores y ligandos de receptores. Por ejemplo, puede introducirse un anticuerpo específico para un antígeno hallado en la superficie de una célula diana en la superficie exterior de un vehículo de suministro liposómico para dirigir el vehículo de suministro a la célula diana. La manipulación de la fórmula química de la parte
lipídica del vehículo de suministro puede modular la dirección extracelular o intracelular del vehículo de suministro. Por ejemplo, puede añadirse un compuesto químico a la fórmula lipídica de un liposoma que altere la carga de la bicapa lipídica del liposoma de modo que el liposoma se fusione con células particulares que tienen características de carga particulares.
Un vehículo de suministro particularmente adecuado para administrar agentes de ácido nucleico puede ser un liposoma. Un liposoma puede ser capaz de permanecer estable en un sujeto durante una cantidad de tiempo suficiente para suministrar una molécula de ácido nucleico en un sitio preferido en el sujeto. Un liposoma puede ser preferentemente estable en el sujeto en el que se ha administrado durante al menos aproximadamente 30 minutos, más preferentemente durante al menos aproximadamente 1 hora y aún más preferentemente durante al menos aproximadamente 24 horas.
Un liposoma puede comprender una composición lipídica que pueda ser capaz de dirigir una molécula de ácido nucleico a un sitio particular, o seleccionado, en un sujeto.
Los liposomas adecuados para su uso con la presente invención incluyen cualquier liposoma. Los liposomas preferidos incluyen los liposomas usados convencionalmente en, por ejemplo, procedimientos de suministro de genes conocidos por los expertos en la materia. Los liposomas más preferidos comprenden liposomas que pueden tener una composición lipídica policatiónica y/o liposomas que tienen una cadena principal de colesterol conjugada con polietilenglicol.
Preferentemente la composición farmacéutica también puede incluir un agente de transfección tal como DOTMA, DOPE y DC-Chol (Tonkinson y col., 1996). Un ejemplo preferido de un agente de transfección puede ser poli(etilamina) (PEI).
Otros agentes particularmente adecuados para administrar agentes de ácido nucleico que pueden usarse son, por ejemplo, lípidos catiónicos, polilisina y dendrímeros. Como alternativa, puede administrarse ADN desnudo.
Uso terapéutico
En otro aspecto, la invención puede proporcionar el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de ácido nucleico para tratar cáncer en un sujeto que lo necesite, en el que dicho sujeto está aquejado de un tumor caracterizado por la expresión de ARN de H19 y/o IGF-II a partir del promotor P3 y/o P4, al menos en una parte de las células del tumor.
Puede usarse una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de ácido nucleico para inhibir la progresión tumoral en un sujeto que lo necesite, en el que dicho sujeto está aquejado de un tumor caracterizado por la expresión de ARN de H19 y/o IGF-II a partir del promotor P3 y/o P4, en al menos una parte de las células del tumor.
Puede usarse una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de ácido nucleico para inhibir o prevenir la metástasis tumoral en un sujeto que lo necesite, en el que el tumor puede estar caracterizado por la expresión de ARN de H19 y/o IGF-II a partir del promotor P3 y/o P4, en al menos una parte de las células del tumor.
Puede proporcionarse un uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de ácido nucleico para reducir o aliviar síntomas asociados con un trastorno neoplásico en un sujeto que lo necesite, en el que el sujeto puede estar aquejado de un tumor caracterizado por la expresión de ARN de H19 y/o IGF-II a partir del promotor P3 y/o P4, en al menos una parte de las células del tumor.
La construcción de ácido nucleico puede contener un primer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando el primer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19, y un segundo marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando el segundo marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II. Una célula de dicho tumor puede ser capaz de expresar un transcrito dirigido por el promotor de H19 y/o un transcrito dirigido por el promotor P4 de IGF-II. Dicha construcción de ácido nucleico puede comprender además un tercer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando dicho tercer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II.
La construcción de ácido nucleico puede contener un primer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando el primer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19, y un segundo marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando el segundo marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II. Una célula de dicho tumor puede ser capaz de expresar un transcrito dirigido por el promotor de H19 y/o un transcrito dirigido por el promotor P3 de IGF-II. Dicha construcción de ácido nucleico puede comprender además un tercer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando dicho tercer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II.
La construcción de ácido nucleico puede contener un primer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando el primer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la
transcripción P3 de IGF-II, y un segundo marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando el segundo marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II. Una célula de dicho tumor puede ser capaz de expresar un transcrito dirigido por el promotor P3 de IGF-II y/o un transcrito dirigido por el promotor P4 de IGF-II. Dicha construcción de ácido nucleico puede comprender además un tercer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando dicho tercer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19.
La toxina diftérica puede ser toxina diftérica A (DTA). Dicha toxina diftérica puede comprender una secuencia como se expone en SEC ID Nº: 7.
La secuencia reguladora de la transcripción específica de H19 puede ser un promotor que comprende una secuencia de ácido nucleico expuesta en una cualquiera de SEC ID N: 1-2.
La secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II puede ser un promotor que comprende una secuencia de ácido nucleico expuesta en SEC ID Nº: 9.
La secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II puede ser un promotor que comprende una secuencia de ácido nucleico como se expone en una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 12 y SEC ID Nº: 17.
Puede usarse una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico para aumentar la sensibilidad de un sujeto a un agente terapéutico.
Como se usa en el presente documento, “tratar” cáncer (o tratar a un sujeto con cáncer) se refiere a tomar medidas para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo pero sin limitación, alivio o mejora de uno o más síntomas de cáncer, reducción del alcance de la enfermedad, retardo o ralentización de la progresión de la enfermedad, alivio, paliación o estabilización de la patología, remisión parcial o completa, supervivencia prolongada y otros resultados beneficiosos conocidos en la técnica.
El sujeto puede ser humano.
Son tumores que pueden tratarse de acuerdo con el uso los que pueden expresar ARN de H19 y/o pueden expresar IGF-II a partir del promotor P3 y/o P4 durante la aparición o progresión tumoral. Una célula de un tumor diana de un uso puede expresar de forma endógena un transcrito dirigido por el promotor de H19 (por ejemplo un transcrito de H19) y un transcrito dirigido por el promotor P3 de IGF-II (por ejemplo un transcrito de IGF-II). Una célula del tumor diana puede expresar de forma endógena un transcrito dirigido por el promotor de H19 y un transcrito dirigido por el promotor P4 de IGF-II (por ejemplo un transcrito de IGF-II). Una célula del tumor diana puede expresar de forma endógena un transcrito dirigido por el promotor P3 de IGF-II y un transcrito dirigido por el promotor P4 de IGF-II. El tumor diana puede ser un tumor que pueda expresar de forma endógena el transcrito de IGF-II dirigido por P3, transcrito de IGF-II dirigido por P4 y transcrito de H19. El tumor diana puede expresar de forma endógena al menos dos de los transcritos dirigidos por P3 de IGF-II, P4 de IGF-II y H19.
Puede haberse genotipado el tumor diana con respecto a expresión de H19 y/o expresión de IGF-II bajo el control del promotor P3 o P4, o ambos. Como alternativa, el tumor diana puede no haberse genotipado.
Por ejemplo el tumor puede seleccionarse de tumor de Wilm, hepatoblastoma, rabdomiosarcoma embrionario, tumores de células germinales y tumores trofoblásticos, tumores de células germinales testiculares, seminoma testicular, teratoma, teratoma inmaduro de ovario, tumor sacrococcígeo, coriocarcinoma, tumores trofoblásticos de sitio placentario, carcinoma de vejiga, carcinoma hepatocelular, carcinoma de ovario, carcinoma cervical, carcinoma de pulmón, carcinoma de mama, carcinoma de células escamosas en cabeza y cuello, carcinoma esofágico, carcinoma tiroideo, tumores neurogénicos, astrocitoma, ganglioblastoma, neuroblastoma, osteosarcoma, melanoma, carcinoma pancreático, cáncer de próstata, cáncer de útero, carcinoma de células renales, carcinoma colorrectal, cáncer de colon, meduloblastoma, glioblastoma, tumores adrenocorticales, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, leucemia linfoblástica aguda (ALL), cánceres de cabeza y cuello, cánceres orales, tumores trofoblásticos gestacionales, meningioma y hepatoma. El tumor puede seleccionarse de cánceres de cabeza y cuello, cánceres orales y tumores trofoblásticos gestacionales.
El sujeto puede estar aquejado de síndrome de Beckwith-Wiedermann (BWS), teniendo de este modo una predisposición a desarrollar un tumor asociado con H19 y/o IGF-II tal como tumor de Wilm o hepatoblastoma.
El tumor diana puede ser un tumor sólido. El tumor diana puede ser un carcinoma. El tumor puede ser un cáncer de vejiga (por ejemplo carcinoma de vejiga), cáncer de hígado (por ejemplo carcinoma hepatocelular), cáncer de ovario (por ejemplo carcinoma de células claras), cáncer pancreático (por ejemplo carcinoma ductal pancreático, carcinoma epitelioide.
El tumor puede seleccionarse del grupo que consiste en un carcinoma de vejiga, un carcinoma hepatocelular, un carcinoma de ovario y un carcinoma pancreático. El tumor diana puede ser un carcinoma de vejiga. El tumor diana puede ser un carcinoma hepatocelular. El tumor diana puede ser un carcinoma de colon. El tumor diana puede ser un cáncer de vejiga superficial. El tumor diana puede ser un carcinoma cervical. El tumor diana puede ser un
carcinoma de pulmón. El tumor diana puede ser un adenocarcinoma de pulmón. El tumor diana puede ser un carcinoma de pulmón de células pequeñas. El tumor diana puede ser un carcinoma de mama. El tumor diana puede ser un carcinoma de células escamosas en cabeza y cuello. El tumor diana puede ser un carcinoma de células renales. El tumor diana puede ser un carcinoma esofágico. El tumor diana puede ser un cáncer pancreático. El tumor diana puede ser un hepatoblastoma. El tumor diana puede ser un rabdomiosarcoma. El tumor diana puede ser un carcinoma tiroideo. El tumor diana puede ser un ganglioblastoma. El tumor diana puede ser un carcinoma de ovario. El tumor diana puede ser un carcinoma broncogénico de células escamosas. El tumor diana puede ser una neoplasia de hígado. El tumor diana puede ser un carcinoma colorrectal. El tumor diana puede ser un carcinoma endometrial. El tumor diana puede ser un tumor testicular. El tumor diana puede ser un tumor de células germinales testiculares. El tumor diana puede ser un carcinoma broncogénico de células escamosas. El tumor diana puede ser un cáncer de próstata. El tumor diana puede ser tumor de Wilm. El tumor diana puede ser un astrocitoma. El tumor diana puede ser un neuroblastoma.
La enfermedad diana de un uso puede ser un trastorno proliferativo celular en el que al menos algunas de las células son capaces de expresar un transcrito bajo el control del promotor de H19 y/o el promotor P4 de IGF-II. La enfermedad diana puede ser un trastorno proliferativo celular en el que al menos algunas de las células son capaces de expresar un transcrito bajo el control del promotor de H19 y/o el promotor P3 de IGF-II. La enfermedad diana puede ser un trastorno proliferativo celular en el que al menos algunas de las células son capaces de expresar un transcrito bajo el control del promotor P4 de IGF-II y/o el promotor P3 de IGF-II.
Los usos pueden comprender además una etapa de detectar la presencia de ARN de H19 y/o ARN de IGF-II en células tumorales obtenidas del sujeto, en la que la presencia del ARN en al menos una parte de las células tumorales es indicativa de que dicho tumor es tratable por los usos. Por ejemplo, la presencia de ARN de H19 y/o ARN de IGF-II puede detectarse por procedimientos conocidos en la técnica tales como PCR, RT-PCR, PCR in situ, RT-PCR in situ, LCR y 3SR, e hibridación con una sonda que comprende un resto detectable. La presencia de un ARN puede determinarse en una muestra celular o tisular derivada del tumor o, como alternativa, en muestras de ensayo que contienen células de fluidos corporales, fluidos de aclarado que estuvieron en contacto con el sitio de tumor primario, o tejidos u órganos distintos del sitio de tumor primario tisular (por ejemplo para detectar metástasis tumorales).
Los tumores metastatizantes ejemplares incluyen, por ejemplo, cáncer colorrectal que metastatiza al hígado y cáncer de mama metastatizante. Las construcciones pueden usarse para prevenir o inhibir la formación de metástasis de hígado.
Para tratar a un sujeto con una enfermedad, pueden administrarse composiciones farmacéuticas al sujeto de una manera eficaz de modo que las composiciones sean capaces de tratar la enfermedad de ese sujeto. De acuerdo con la presente invención, el tratamiento de una enfermedad se refiere a aliviar una enfermedad y/o síntomas asociados y/o prevenir el desarrollo de una enfermedad secundaria resultante de la aparición de una enfermedad primaria.
Por lo tanto, la expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” a la que se hace referencia en el presente documento significa que las construcciones de ácido nucleico se administran al sujeto en una cantidad que puede ser eficaz cuando se administra a dicho sujeto, para tratar a ese sujeto.
Un protocolo de administración eficaz (es decir, administrar una composición farmacéutica de una manera eficaz) puede comprender parámetros de dosis adecuados y modos de administración que dan como resultado el tratamiento de una enfermedad. Los parámetros de dosis y modos de administración eficaces pueden determinarse usando procedimientos convencionales en la técnica para una enfermedad particular. Tales procedimientos incluyen, por ejemplo, determinación de tasas de supervivencia, efectos secundarios (es decir, toxicidad) y progresión o regresión de enfermedad.
Un tamaño de dosis única adecuado puede ser una dosis que sea capaz de tratar a un sujeto con enfermedad cuando se administra una o más veces durante un periodo de tiempo adecuado. Por ejemplo, un tamaño de dosis única adecuado puede inducir una reducción de la masa de células tumorales en un sujeto que lo necesite. Pueden usarse dosis de una composición farmacéutica adecuada para su uso con técnicas de inyección directa por un experto en la materia para determinar tamaños de dosis única apropiados para administración sistémica basándose en el tamaño de un sujeto.
Las vías adecuadas de administración pueden, por ejemplo, incluir suministro oral, rectal, transmucoso, especialmente transnasal, intestinal o parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales, intraarteriales, intravesiculares (en la vejiga) o intraoculares.
Como alternativa, se puede administrar una preparación de una manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante inyección de la preparación directamente a una región específica del cuerpo de un paciente o mediante administración directa en una cavidad corporal tal como la vejiga, útero, etc. Puede contemplarse la administración intralesional, por ejemplo inyección intratumoral.
Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol (u otros disolventes sintéticos), agentes antibacterianos (por ejemplo, alcohol bencílico, metilparabenos), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, bisulfito sódico), agentes quelantes (por ejemplo, ácido etilendiamintetracético), tampones (por ejemplo, acetatos, citratos, fosfatos), y agentes que ajustan la tonicidad (por ejemplo, cloruro sódico, dextrosa). El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico, por ejemplo. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o frascos de dosis múltiple hechos de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración parenteral incluyen soluciones o suspensiones inyectables estériles acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen a las composiciones sustancialmente isotónicas con la sangre de un receptor pretendido. Tales composiciones pueden comprender también agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales, por ejemplo. Pueden prepararse soluciones y suspensiones de inyección extemporánea a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos. Tales composiciones deberían comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector y/u otro agente terapéutico, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma para administración apropiada al sujeto. La formulación debería adecuarse al modo de administración.
Las composiciones pueden usarse para tratar cáncer solas o con otros regímenes terapéuticos establecidos o experimentales contra el cáncer. Los usos terapéuticos para tratamiento de cáncer adecuados para combinación con la presente invención incluyen quimioterapia, radioterapia, fototerapia y terapia fotodinámica, cirugía, terapia nutricional, terapia ablativa, radioterapia y quimioterapia combinadas, braquiterapia, terapia de haz de protones, inmunoterapia, terapia celular y terapia radioquirúrgica de haz de fotones.
Los fármacos antineoplásicos que pueden coadministrarse con las construcciones pueden incluir los siguientes: acivicina; aclarubicina; clorhidrato de acodazol; acronina; adriamicina; adozelesina; aldesleuquina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginasa; asperlina; azacitidina; acetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamida; clorhidrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar sódico; bropirimina; busulfán; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetímero; carboplatino; carmustina; clorhidrato de carubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucilo; cirolemicina; cisplatino; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbacina; dactinomicina; clorhidrato de daunorrubicina; decitabina; dexormaplatino; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diazicuona; docetaxel; doxorrubicina; clorhidrato de doxorrubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; clorhidrato de eflornitina; elsamitrucina; enloplatino; enpromato; epipropidina; clorhidrato de epirubicina; erbulozol; clorhidrato de esorubicina; estramustina; fosfato sódico de estramustina; etanidazol; etopósido; fosfato de etopósido; etoprina; clorhidrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracilo; flurocitabina; fosquidona; fostriecina sódica; gemcitabina; clorhidrato de gemcitabina; hidroxiurea; clorhidrato de idarrubicina; ifosfamida; ilmofosina; interferón alfa-2a; interferón alfa-2b; interferón alfa-n1; interferón alfa-n3; interferón beta-1a; interferón gamma-1b; iproplatino; clorhidrato de irinotecán; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprolide; clorhidrato de liarozol; lometrexol sódico; lomustina; clorhidrato de losoxantrona; masoprocol; maitansina; clorhidrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalán; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato sódico; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; clorhidrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatino; oxisurán; paclitaxel; pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina; perfosfamida; pipobromán; piposulfán; clorhidrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfímero sódico; porfiromicina; prednimustina; clorhidrato de procarbazina; puromicina; clorhidrato de puromicina; pirazofurina; riboprina; rogletimida; safingol; clorhidrato de safingol; semustina; simtrazeno; esparfosato sódico; esparsomicina; clorhidrato de espirogermanio; espiromustina; espiroplatino; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; taxol; tecogalán sódico; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfina; tenipósido; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofuirina; tirapazamina; clorhidrato de topotecán; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; glucuronato de trimetrexato; triptorelina; clorhidrato de tubulozol; mostaza de uracilo; uredepa; vapreotida; verteporfina; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatino; zinostatina; y clorhidrato de zorubicina. Los agentes antineoplásicos adicionales incluyen los desvelados en el Capítulo 52, “Agentes Antineoplásicos” (Calabresi, P. y Chabner, B. A.), y la introducción al mismo, pp. 1202-1263, de Goodman y Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Octava Edición, 1990, McGraw-Hill, Inc. (Health Professions Division).
Los siguientes ejemplos se presentan en orden para ilustrar más completamente algunas realizaciones de la invención. No debería interpretarse de ninguna manera, sin embargo, como limitantes del amplio alcance de la invención.
Sección de detalles experimentales
Visión de conjunto de vectores de múltiples promotores
Se crearon vectores de expresión de promotor doble, que portaban en una única construcción dos genes separados que expresaban la toxina DTA, a partir de dos secuencias reguladoras diferentes, como sigue:
-
promotores de H19 + P4 de IGF-II (en lo sucesivo en el presente documento “H19-DTA-P4-DTA”; representado en la Figura 1);
-
promotores P3 de IGF-II + P4 de IGF-II (en lo sucesivo en el presente documento “P4-DTA-P3-DTA”; descrito posteriormente); y
-
promotores de H19 + P3 de IGF-II; (en lo sucesivo en el presente documento “H19-DTA-P3-DTA”; descrito posteriormente).
Transfecciones
Se realizaron transfecciones usando el reactivo de transfección in vitro jetPEI™ (Polyplus Transfection) como lo recomienda el fabricante. Después de 48 horas, las células se recogieron y se determinó la actividad luciferasa usando el kit de Sistema de Ensayo de Luciferasa (Promega). Se midió la producción de luz usando un aparato Lumac Biocounter. Se determinó el contenido proteico total de los lisados mediante el reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad, y los resultados se normalizaron para la proteína total y se expresaron como unidades de luz/μg de proteína. Se usó un plásmido que expresa luciferasa bajo el control de transcripción de SV40, LucSV40 (Promega) como un control positivo para la eficacia de transfección, ya que contiene el promotor y potenciador de SV40, mientras que se usó un plásmido que contenía Luc1 pero carecía de secuencias reguladoras (Promega) como un control negativo para determinar la expresión de luciferasa no específica basal (esta fue insignificante en todas las líneas celulares). Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Creación de H19-DTA-P4-DTA
El casete de DTA sintético y casete de P4 sintético se ensamblaron cada uno a partir de productos de PCR y se subclonaron en pGA4 (ampR, disponible de GeneArt, Ratisbona, Alemania) usando sitios de restricción SacI y KpnI. Se purificó el ADN plasmídico (Pure Yield™ Plasmid Midiprep, Promega) de bacterias K12 XL10 gold transformadas y se determinó la concentración por espectroscopia UV. Las construcciones finales se verificaron por secuenciación y se nombraron 0704870 (SEC ID Nº: 21) y 0704867 (SEC ID Nº: 23), respectivamente. La congruencia de secuencia fue del 100 %.
El promotor P4 que se utilizó tuvo la siguiente secuencia:
A continuación, se creo un vector que expresaba DTA a partir del promotor P4 de IGF-II. Para crear este vector, la secuencia de DTA se amplificó a partir de 0704870 y se subclonó en 0704867 usando sitios de restricción NheI y KpnI. El ADN plasmídico se purificó a partir de bacterias K12 KH10B transformadas y la concentración se determinó por espectroscopia UV. La construcción final (0704877) se verificó por secuenciación. La congruencia de secuencia fue del 100 %.
Para crear el vector H19-DTA-P4-DTA, el casete P4-DTA se amplificó a partir de 0704877, y se subclonó en 052966, un vector que expresa DTA a partir del promotor de H19, usando sitios de restricción NotI y KpnI. 052966 se denomina en lo sucesivo en el presente documento “H19-DTA” y tiene la siguiente secuencia:
El ADN plasmídico se purificó a partir de bacterias K12 KH10B transformadas y la concentración se determinó por espectroscopia UV. La construcción final se verificó por secuenciación. La congruencia de secuencia era del 100 %.
La secuencia de H19-DTA-P4-DTA fue:
Creación P4-DTA-P3-DTA
La construcción P4-DTA-P3-DTA se creó usando una estrategia muy similar a la usada para crear la construcción de H19-DTA-P4-DTA. La construcción final se verificó por secuenciación. La congruencia de secuencia fue del 100 %. El promotor P3 de IFG-II tenía la siguiente secuencia:
P4-DTA-P3-DTA tenía la siguiente secuencia:
P3-DTA, que expresa DTA bajo el promotor P3 solamente, tenía la siguiente secuencia:
P4-DTA, un plásmido que expresa DTA bajo el promotor P4, se creo reemplazando el promotor P3 con el promotor P4 (SEC ID Nº: 9).
Además, se creo una construcción de control, P4-Luc-P3-Luc, usando la misma estrategia. La secuencia de P4-LucP3-Luc es como sigue:
Creación de H19-DTA-P3-DTA
La construcción H19-DTA-P3-DTA se creó usando una estrategia muy similar a la usada para crear la construcción H19/P4. La construcción final se verificó por secuenciación. La congruencia de secuencia fue del 100 %.
H19-DTA-P3-DTA tenía la siguiente secuencia:
Además, se creó una construcción de control, H19-Luc-P3-Luc, usando la misma estrategia. La secuencia de H19-Luc-P3-Luc es como sigue:
Ejemplo 1: Actividad anti-carcinoma de vejiga superior por una construcción única que contiene genes de DTA expresados por separado a partir de los promotores de H19 y P4
En primer lugar, se ensayó el efecto terapéutico antineoplásico de la construcción de doble promotor H19-DTA-P4
5 DTA in vitro determinando su capacidad para lisar tres líneas de carcinoma de vejiga humano diferentes, en relación con las construcciones de promotor único. La actividad antitumoral se determinó por medición de la inhibición de la actividad luciferasa después de cotransfección con LucSV40. Se cotransfectaron las líneas celulares de cáncer de vejiga T24P, Umuc3 y HT-1376 con H19-DTA, P4-DTA, o H19-DTA-P4-DTA a las concentraciones indicadas y 2 μg de LucSV40. Se determinó la actividad luciferasa como un indicador de la supervivencia de las células transfectadas
10 y se comparó con la de células transfectadas con LucSV40 solamente. H19-DTA y P4-DTA fueron capaces de dirigir la expresión del gen de DTA y reducir de este modo la actividad luciferasa de una manera de respuesta a dosis. H19-DTA-P4-DTA, sin embargo, mostró una eficacia muy superior en la lisis de las líneas celulares de cáncer, en relación con cada una de las construcciones del promotor único, en células T24P (Figuras 2A-C). Se obtuvieron resultados muy similares cuando el experimento se repitió con células UMUC3 (Figuras 3A-C) y HT-1376 (Figuras
15 40A-B).
Por lo tanto, un vector de expresión de DTA, que portaba en la misma construcción dos genes separados que expresaban la toxina DTA a partir de H19 y P4, mostró capacidad significativamente superior para lisar diversas líneas celulares de cáncer de vejiga humanas, en relación con vectores de expresión que portaban un de los genes solo.
Ejemplo 2: Actividad anti-carcinoma de hígado superior por una construcción única que contiene genes de DTA expresados por separado a partir de promotores de H19 y P4
Se ensayó el efecto terapéutico antineoplásico de las construcciones descritas en el Ejemplo 1 in vitro en células de cáncer de hígado humano Hep3B (carcinoma hepatocelular). Como se ha visto con las líneas celulares de carcinoma de vejiga, la construcción de doble promotor H19-DTA-P4-DTA mostró eficacia muy superior en la lisis de líneas celulares cancerosas, en relación con cada una de las construcciones de promotor único (Figuras 4A-B).
Por lo tanto, los vectores de expresión de doble promotor H19-DTA-P4-DTA muestran capacidad significativamente superior para lisar células de carcinoma de hígado, en relación con cada gen solo.
Ejemplo 3: Actividad anti-carcinoma de ovario superior por una construcción única que contiene genes de DTA expresados por separado a partir de promotores de H19 y P4
Se ensayó el efecto terapéutico antineoplásico de las construcciones descritas en el Ejemplo 1 in vitro en células de cáncer de ovario humano ES-2 (carcinoma de células claras). Como se ha visto con las líneas celulares de carcinoma de vejiga, la construcción de doble promotor H19-DTA-P4-DTA mostró eficacia muy superior en la lisis de líneas celulares de cáncer, en relación con cada una de las construcciones de promotor único (Figuras 5A-B).
Por lo tanto, los vectores de expresión de doble promotor H19-DTA-P4-DTA muestran capacidad significativamente superior para lisar células de carcinoma de ovario, en relación con cada gen solo.
Ejemplo 4: Actividad anti-carcinoma pancreático superior por una construcción única que contiene genes de DTA expresados por separado a partir de los promotores de H19 y P4
Se ensayó el efecto terapéutico antineoplásico de las construcciones descritas en el Ejemplo 1 in vitro en células de cáncer pancreático de hámster PC-1 (carcinoma ductal pancreático) y cáncer pancreático humano CRL-1469 (carcinoma epitelioide). Como se ha visto con las líneas celulares de carcinoma de vejiga, la construcción de doble promotor H19-DTA-P4-DTA mostró eficacia muy superior en la lisis de las líneas celulares de cáncer pancreático de hámster (Figura 6A-B) y humano (Figura 7A-B), en relación con cada una de las construcciones de promotor único.
Por lo tanto, los vectores de expresión de doble promotor H19-DTA-P4-DTA muestran capacidad significativamente superior para lisar células de carcinoma pancreático, en relación con cada gen solo.
En general, los vectores de expresión H19-DTA-P4-DTA mostraron sistemáticamente capacidad superior cuando se ensayaron frente a un espectro amplio de células tumorales, en relación con los vectores de expresión que portan uno de los genes solo. La uniformidad de estos resultados a través de cada una de estas líneas celulares de cáncer demuestra la capacidad superior de las construcciones H19-DTA-P4-DTA contra cáncer en general.
Ejemplo 5: Actividad superior por una construcción única que contiene genes de DTA dirigidos por P3 y P4 separados frente a seis tipos de carcinoma diferentes
A continuación, se ensayó la actividad de la construcción de expresión de doble promotor, que expresa DTA a partir de los promotores P3 de IGF-II y P4 de IGF-II, P4-DTA-P3-DTA, frente a dos líneas celulares de carcinoma de vejiga humano diferentes (T24P y HT-1376), en comparación con las construcciones de promotor único correspondientes. Las células se cotransfectaron con 2 μg de LucSV40 y P3-DTA, P4-DTA o P4-DTA-P3-DTA a las concentraciones indicadas en las figuras. Se determinó la actividad luciferasa y se comparó con la de las células transfectadas con LucSV40 solamente. P3-DTA y P4-DTA fueron capaces de dirigir la expresión del gen de DTA y reducir de este modo la actividad luciferasa de una manera de respuesta a dosis en ambas líneas celulares. La construcción de doble promotor P4-DTA-P3-DTA sin embargo, mostró eficacia superior en la lisis de las líneas celulares cancerosas, en relación con cada una de las construcciones de promotor único, en células T24P (Figuras 8A-B) y células HT1376 (Figuras 9A-B). Se obtuvieron resultados muy similares también en células de carcinoma de hígado humano Hep3B (Figuras 10A-B). Se obtuvieron resultados muy similares también en células de carcinoma de ovario humano ES-2 (Figuras 11A-B). Se obtuvieron resultados muy similares también en células de carcinoma pancreático de hámster PC-1 (Figuras 12A-B) y células de carcinoma pancreático humano CRL-1469 (Figuras 13A-B).
Por lo tanto, los vectores de expresión de DTA, que portaban en la misma construcción dos genes separados que expresaban la toxina DTA a partir de los promotores P3 de IGF-II y P4 de IGF-II, mostraron sistemáticamente capacidad significativamente superior cuando se ensayaron frente a seis líneas celulares de cáncer diferentes, en relación con vectores de expresión que portaban uno de los genes solo. La uniformidad de estos resultados a través de un amplio espectro de células tumorales demuestra la capacidad superior de las construcciones P4-DTA-P3-DTA frente a cánceres en general.
Ejemplo 6: Actividad superior por una construcción única que contiene genes de DTA dirigidos por H19 y P3 separados frente a células de carcinoma de vejiga
A continuación, se ensayó la capacidad de la construcción de expresión de doble promotor, H19-DTA-P3-DTA frente a las líneas celulares de carcinoma de vejiga humana T24P, en comparación con las construcciones de promotor
único correspondientes.
Se ensayó el efecto terapéutico de las construcciones in vitro determinando su capacidad para lisar líneas celulares de cáncer de vejiga humana, como se determinó por cotransfección con LucSV40 y medición de inhibición de la actividad luciferasa. La línea celular de cáncer de vejiga humana T24P se cotransfectó con 2 μg de LucSV40 y H19-DTA, P3-DTA o H19-DTA-P3-DTA a las concentraciones indicadas en las figuras. La actividad luciferasa se determinó y se comparó con la de las células transfectadas con LucSV40 solamente. H19-DTA y P3-DTA fueron capaces de dirigir la expresión del gen de DTA y reducir de este modo la actividad luciferasa de una manera de respuesta a dosis en las tres líneas celulares. La construcción de doble promotor H19-DTA-P3-DTA, sin embargo, mostró eficacia superior en la lisis de las líneas celulares de cáncer, en relación con cada una de las construcciones de promotor único (Figuras 14A-B).
Por lo tanto, los vectores de expresión de DTA, que portaban en la misma construcción dos genes separados que expresaban la toxina DTA a partir de los promotores de H19 y P3 de IGF-II, mostraron capacidad significativamente superior cuando se ensayaron frente a células de carcinoma de vejiga, en relación con los vectores de expresión que portaban cada gen solo.
Ejemplo 7: Los genes de DTA expresados por separado a partir de los promotores de H19 y P4 muestran actividad antineoplásica mayor que la aditiva cuando están presentes en una construcción única
A continuación, se ensayó la presencia de efecto antineoplásico mayor que el aditivo de la construcción de doble promotor H19-P4-DTA en líneas celulares de cáncer de vejiga humana T24P y HT-1376, la línea celular de cáncer de ovario humano ES-2, la línea celular de cáncer de hígado humano Hep3B, la línea celular pancreática de hámster PC-1 y la línea celular pancreática humana CRL-1469. T24P, ES-2, Hep3B, PC-1 y CRL-1469 se cotransfectaron con 2 μg de LucSV40 y (a) las concentraciones indicadas en las figuras de las construcciones de promotor único H19-DTA + P4-DTA en combinación, o (b) la misma cantidad de H19-DTA-P4-DTA que para una de las construcciones de promotor único. La cantidad total de ADN cotransfectado en las muestras que recibieron ambas construcciones de promotor único fue por lo tanto dos veces la de las células transfectadas con H19-DTA-P4-DTA. La actividad luciferasa se determinó y se comparó con la de células transfectadas con LucSV40 solo. La construcción de doble promotor H19-DTA-P4-DTA mostró eficacia superior en la lisis de líneas celulares de cáncer, en relación con la actividad combinada de ambas construcciones de promotor único (H19-DTA + P4-DTA), en células T24P (Figuras 15A-B). Se obtuvieron resultados muy similares en células cancerosas de hígado humano Hep3B (Figuras 16A-B), células de cáncer de ovario humano ES-2 (Figuras 17A-B), células pancreáticas de hámster PC-1 (Figuras 18A-B), células de cáncer pancreático humano CRL-1469 (Figuras 19A-B) y células HT-1376 (Figura 23A-B).
Por lo tanto, los genes que codificaban DTA dirigidos por P4 de IGF-II y dirigidos por H19 presentes en un vector de expresión único mostraron actividad antineoplásica mayor que la aditiva en relación con los vectores de expresión que portaban cada gen solo cuando se ensayaron frente a un amplio espectro de células tumorales. La uniformidad de estos resultados a través de cada una de estas líneas celulares de cáncer demuestra la capacidad superior de las construcciones de H19/P4 frente a cáncer en general.
Ejemplo 8: Los genes de DTA expresados por separado a partir de los promotores P3 y P4 muestran actividad antineoplásica mayor que la aditiva cuando están presentes en una construcción sencilla
A continuación, se ensayó la presencia de efecto antineoplásico mayor que el aditivo de los plásmidos de doble promotor P4-DTA-P3-DTA en células HT-1376, ES-2, Hep3B, PC-1 y CRL-1469, exactamente como se ha descrito en el ejemplo anterior. La construcción de doble promotor P4-DTA-P3-DTA mostró eficacia superior en la lisis de líneas celulares cancerosas, en relación con la actividad combinada de ambas construcciones de promotor único (P3-DTA + P4-DTA), en células HT-1376 (Figuras 20A-B). Se obtuvieron resultados muy similares en células ES-2 (Figuras 21A-B), células Hep3B (Figura 22) y células CRL-1469 (Figuras 24A-B).
Por lo tanto, los genes que codificaban DTA dirigidos por P4 de IGF-II y dirigidos por P3 de IGF-II presentes en un vector de expresión único mostraron actividad antineoplásica mayor que la aditiva en relación con vectores de expresión que portaban uno de los genes solo cuando se ensayaron frente a un amplio espectro de células tumorales. La uniformidad de estos resultados en cada una de estas líneas celulares demuestra la capacidad superior de las construcciones P3-DTA-P4-DTA frente a cáncer en general.
Ejemplo 9: Modelo animal de carcinoma de vejiga
El modelo heterotópico para tumores de vejiga subcutáneos
Se inyectaron por vía subcutánea 2 x 106 células de carcinoma de vejiga humana T24P o 3 x 106 HT-1376 en solución salina tamponada con fosfato en los dorsos de ratones hembra desnudos de 6-7 semanas de edad para establecer tumores de vejiga heterotópicos. 10 días después de la inoculación, aparecieron tumores medibles que se trataron con los vectores de expresión H19-DTA-P4-DTA, P4-DTA-P3-DTA y H19-DTA-P3-DTA.
Tratamiento de los tumores subcutáneos heterotópicos
Los animales se separaron en grupos del mismo tamaño (n=6). Se administraron 3 inyecciones de 25 μg/tumor de los vectores de expresión (P4-DTA-P3-DTA, H19-DTA-P4-DTA, o H19-DTA-P3-DTA respectivamente) o el vector de control (P4-Luc-P3-Luc, H19-Luc-P4-Luc, o H19-Luc-P3-Luc respectivamente) a cada tumor. En cada punto temporal, se midieron las dimensiones del tumor usando un calibrador, y se calculó el volumen tumoral de acuerdo con la fórmula de anchura2 x longitud x 0,5. Los animales se sacrificaron 3 días después de la última inyección, se escindieron los tumores y se midieron el peso y el volumen ex vivo.
Ejemplo 10: La construcción H19-DTA-P4-DTA muestra actividad antineoplásica mayor que la aditiva en varios modelos de cáncer de vejiga in vivo
Resultados T24P
Se ensayó la actividad terapéutica antineoplásica de H19-DTA-P4-DTA en un modelo de cáncer de vejiga in vivo. Se inyectaron por vía subcutánea células de carcinoma de vejiga humana T24P en los dorsos de ratones hembra atímicos para realizar un modelo de cáncer de vejiga heterotópico. 10 días después, los ratones desarrollaron tumores heterotópicos medibles. La potencia terapéutica de los vectores se ensayó administrando directamente 3 inyecciones de 25 μg/tumor de los vectores de expresión o el vector de control (H19-Luc, P4-Luc y H 19-Luc-P4-Luc, que expresan luciferasa bajo el promotor de H19, promotor P4 o ambos promotores, respectivamente) en cada tumor de cáncer de vejiga heterotópico. Se determinó el tamaño del tumor y se calculó el aumento en veces in vivo del tamaño del tumor al final de cada tratamiento.
Tres inyecciones de H19-DTA (Figura 25) y P4-DTA (Figura 26) a intervalos de dos días fueron capaces de inhibir el desarrollo del tumor en al menos el 49 % y el 57 %, respectivamente en comparación con tratamiento con H19-Luc y P4-Luc, respectivamente. Sin embargo, tres inyecciones del plásmido de doble promotor H19-DTA-P4-DTA a intervalos de dos días inhibieron el desarrollo del tumor en al menos el 70 %, en comparación con el tratamiento con H19-Luc-P4-Luc (Figura 27). La construcción de doble promotor mostró por lo tanto capacidad potenciada para inhibir el desarrollo tumoral in vivo, en comparación con cada una de las construcciones de promotor único (H19-DTA y P4-DTA).
Para confirmar la diferencia entre los grupos de H19-DTA-P4-DTA y H19-Luc-P4-Luc, se escindieron tumores y se determinó su peso y volumen ex vivo. Los ratones tratados con H19-DTA-P4-DTA mostraron al menos una reducción del 61 % del volumen tumoral ex-vivo (Figura 28) y al menos una reducción del 54 % de peso tumoral exvivo (Figura 29) en comparación con el tratamiento con H19-Luc-P4-Luc.
Para ensayar si la actividad antineoplásica in vivo de H19-DTA-P4-DTA era mayor que la aditiva, se trató a un grupo adicional de ratones que contenían tumor T24P con tres inyecciones de 25 μg cada una de construcciones del promotor único H19-DTA + P4-DTA en combinación. La cantidad total de ADN cotransfectado administrada fue por lo tanto dos veces la del grupo de H19-DTA-P4-DTA. Como puede verse en la Figura 30, el desarrollo tumoral en ratones que recibieron plásmidos tanto H19-DTA como P4-DTA se inhibió en el 63 % en comparación con ratones tratados con H19-Luc + P4-Luc combinado. Se observó un efecto potenciado en los ratones tratados con la construcción de doble promotor H19-DTA-P4-DTA, en la que el desarrollo tumoral se inhibió en 70 % en comparación con los ratones tratados con el plásmido de control H19-Luc-P4-Luc (Figura 27). Por lo tanto, el vector H19-DTA-P4-DTA mostró actividad antineoplásica mayor que la aditiva in vivo.
La Figura 31 resume todos los datos del modelo de cáncer de vejiga T24P. H19-DTA-P4-DTA muestra claramente actividad superior a cada uno de los plásmidos promotores únicos solos y también superior a su actividad combinada.
Resultados de HT-1376
Se ensayó la capacidad terapéutica de H19-DTA-P4-DTA en otro modelo de cáncer de vejiga, HT-1376. Se realizaron experimentos como se describe para el modelo T24P. Se administró a los ratones que contenían tumores HT-1376 25 μg de cada uno de H19-DTA y P4-DTA en combinación o 25 μg de H19-DTA-P4-DTA. La administración de H19-DTA y P4-DTA en combinación inhibió el desarrollo tumoral en al menos el 64,5 % en comparación con tumores tratados con H19-Luc + P4-Luc combinado (Figura 32), mientras que H19-DTA-P4-DTA inhibió el desarrollo tumoral en al menos el 67 % en comparación con tratamiento con H19-Luc-P4-Luc (Figura 33). Por lo tanto, H19-DTA-P4-DTA mostró actividad antitumoral potenciada, en comparación con la actividad combinada de las construcciones de promotor único.
Ejemplo 11: La construcción P4-DTA-P3-DTA muestra actividad antineoplásica mayor que la aditiva en un modelo de cáncer de vejiga in vivo
A continuación, se ensayó la actividad terapéutica antineoplásica de P4-DTA-P3-DTA en el modelo de cáncer de vejiga in vivo T24P descrito anteriormente en el presente documento en los Ejemplos 9-10. Se realizaron experimentos como se ha descrito anteriormente.
Tres inyecciones de P3-DTA a intervalos de dos días fueron capaces de inhibir el crecimiento tumoral en al menos el 50,5 % en comparación con tratamiento con P3-Luc (Figura 34), mientras que P4-DTA administrado de la misma manera inhibió el crecimiento tumoral en al menos el 57 % en comparación con el tratamiento con P4-Luc (Figura 35). Por el contrario, 3 inyecciones del plásmido de doble promotor P4-DTA-P3-DTA a intervalos de dos días inhibieron el desarrollo tumoral en al menos el 70 % en comparación con el tratamiento con P3-Luc/P4-Luc (Figura 36). Por lo tanto, P4-DTA-P3-DTA mostró actividad antitumoral potenciada, en comparación con cada una de las construcciones de promotor único (P3-DTA y P4-DTA).
Para ensayar si la actividad antineoplásica in vivo de P4-DTA-P3-DTA fue mayor que la aditiva, se trató a un grupo adicional de ratones que contenían tumor T24P con 3 inyecciones de 25 μg cada una de construcciones de promotor único P3-DTA + P4-DTA en combinación. La cantidad total de ADN cotransfectado administrado fue por lo tanto dos veces la del grupo de P4-DTA-P3-DTA. El desarrollo tumoral se inhibió en al menos el 63,3 % en comparación con tratamiento con P3-Luc + P4-Luc combinado (Figura 37), una cantidad menor del 70 % de la observada con el tratamiento con P4-DTA-P3-DTA (Figura 36). Por lo tanto, el vector P4-DTA-P3-DTA muestra actividad antineoplásica mayor que la aditiva in vivo.
Ejemplo 12: Inhibición del crecimiento tumoral in vivo por vectores de expresión H19-DTA-P3-DTA
A continuación, se ensayó la actividad terapéutica antineoplásica del plásmido de doble promotor H19-DTA-P3-DTA en el modelo de cáncer de vejiga in vivo T24P descrito anteriormente en el presente documento en los Ejemplos 9
10. Se realizaron experimentos como se ha descrito anteriormente.
Tres inyecciones de H19-DTA a intervalos de dos días fueron capaces de inhibir el crecimiento tumoral en al menos el 49 % en comparación con tratamiento con H19-Luc (Figura 25), y P3-DTA administrado de la misma manera inhibió el crecimiento tumoral en al menos el 50,5 % en comparación con el tratamiento con P3-Luc (Figura 38). Por el contrario, 3 inyecciones de H19-DTA-P3-DTA a intervalos de dos días inhibieron el desarrollo tumoral en al menos el 59 % en comparación con el tratamiento con H19-Luc/P3-Luc (Figura 39). Por lo tanto, H19-DTA-P3-DTA mostró actividad antitumoral potenciada, en comparación con cada una de las construcciones de promotor único (H19-DTA y P3-DTA).
En general, los resultados presentados en el presente documento demuestran que las construcciones de promotor múltiple muestran capacidad potenciada, mayor que la aditiva para inhibir el desarrollo tumoral, en comparación con las construcciones de promotor único correspondientes.
Listado de secuencias
<110> Yissum Research Development Company of the Hebrew university of Jerusalem Hochberg, Avraham Amit, Doron
<120> CONSTRUCCIONES QUE CONTIENEN MÚLTIPLES CASETES DE EXPRESIÓN PARA TERAPIA DE CÁNCER
<130> BCL 008 PCT
<160> 24
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211> 830
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 833
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 877
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 1960 10 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221>
misc_feature 15 <222> (1016)..(1016)
<223> n es a, c, g o t
<220>
<221>
misc_feature 20 <222> (1126)..(1126)
<223> n es a, c, g o t
<400> 4
<210> 5
<211> 4085 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
5 <221> misc_feature
<222> (1016)..(1016)
<223> n es a, c, g o t
<220>
10 <221> misc_feature
<222> (1126)..(1126)
<223> n es a, c, g o t
<220>
15 <221> misc_feature
<222> (2194)..(2194)
<223> n es a, c, g o t
<220>
20 <221> misc_feature
<222> (3235)..(3235)
<223> n es a, c, g o t
<400> 5 25
<210> 6
<211> 591
<212> ADN
<213> Corynebacterium diphtheriae
<400> 6
<210> 7
<211> 196
<212> PRT 15 <213> Corynebacterium diphtheriae
<400> 7
<210> 8
<211> 891
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 8
<210> 9
<211> 785
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 9
<210> 10
<211> 8837
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (238)..(239)
<223> n es a, c, g o t
<220>
<221> misc_feature
<222> (733)..(733)
<223> n es a, c, g o t
<220>
<221> misc_feature
<222> (3178)..(3203)
<223> n es a, c, g o t
<220>
<221> misc_feature
<222> (7393)..(7393)
<223> n es a, c, g o t
<400> 10
<210> 11
<211> 6045 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> construcción recombinante 10
<400> 11
<210> 12
<211> 632
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 12
<210> 13
<211> 870
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 13
<210> 14
<211> 720
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 14
5 <210> 15
<211> 233
<212> PRT
<213> Homo sapiens
10 <400> 15
<210> 16
<211> 4560
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> construcción recombinante
<400> 16
<210> 17
<211> 885 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> construcción recombinante 10
<400> 17
<210> 18
<211> 6163 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> construcción recombinante 10
<400> 18
<210> 19
<211> 4657 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> construcción recombinante 10
<400> 19
<210> 20
<211> 8162 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> construcción recombinante 10
<400> 20
<210> 21
<211> 3579 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> construcción recombinante 10
<400> 21
<210> 22
<211> 8086 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> construcción recombinante 10
<400> 22
<210> 23
<211> 3843
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> construcción recombinante
<400> 23
<210> 24
<211> 6084
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> construcción recombinante
<400> 24

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una construcción de ácido nucleico, que comprende:
    un primer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando el primer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19; y un segundo marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando el segundo marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción de IGF-II seleccionada de las secuencias P4 de IGF-II y P3 de IGF-II,
    o que comprende: un primer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando dicho primer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II; y un segundo marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando dicho segundo marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II, en la que: la secuencia reguladora de la transcripción específica de H19 es un promotor cuya secuencia es SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 2; la secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II es una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 9 y SEC ID Nº: 13; y la secuencia P3 de IGF-II es SEC ID Nº: 17 o se selecciona de SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 12;
  2. 2.
    La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la toxina diftérica es toxina diftérica A (DTA).
  3. 3.
    La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 2, en la que la toxina diftérica comprende una secuencia como se expone en SEC ID Nº: 7.
  4. 4.
    La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicha construcción de ácido nucleico es un plásmido.
  5. 5.
    La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que el primer marco abierto de lectura está unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19 y el segundo marco abierto de lectura está unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II.
  6. 6.
    La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que el primer marco abierto de lectura está unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19 y el segundo marco abierto de lectura está unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II.
  7. 7.
    La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicho primer marco abierto de lectura está unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P3 de IGF-II y dicho segundo marco abierto de lectura está unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción P4 de IGF-II.
  8. 8.
    Un vector de expresión eucariota que comprende la construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1.
  9. 9.
    Una construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 para uso en el tratamiento de un tumor, o inhibición de la progresión tumoral o inhibición de la metástasis tumoral en un sujeto humano que lo necesite, en la que una célula de dicho tumor es capaz de expresar un transcrito dirigido por el promotor de H19, un transcrito dirigido por el promotor P3 de IGF-II o un transcrito dirigido por el promotor P4 de IGF-II.
  10. 10.
    La construcción de ácido nucleico para uso en el tratamiento de un tumor, o inhibición de la progresión tumoral o inhibición de metástasis tumoral de acuerdo con la reivindicación 9, en la que dicho tumor es un carcinoma.
  11. 11.
    La construcción de ácido nucleico para uso en el tratamiento de un tumor, o inhibición de la progresión tumoral o inhibición de metástasis tumoral de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dicho tumor se selecciona del grupo que consiste en un carcinoma de vejiga, un carcinoma hepatocelular, un carcinoma de ovario y un carcinoma pancreático.
  12. 12.
    La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 7, en la que dicha construcción de ácido nucleico comprende además un tercer marco abierto de lectura que codifica una toxina diftérica, estando dicho tercer marco abierto de lectura unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción específica de H19.
  13. 13.
    Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 para uso en el tratamiento de un tumor, inhibición de la progresión tumoral o inhibición de la metástasis tumoral en un sujeto humano que lo necesite, en la que una célula de dicho tumor es capaz de expresar un transcrito dirigido por el promotor P3 de IGF-II o un transcrito dirigido por el promotor P4 de IGF-II.
  14. 14.
    La construcción de ácido nucleico para uso en el tratamiento de un tumor, inhibición de la progresión tumoral o inhibición de la metástasis tumoral de acuerdo con la reivindicación 13, en la que dicho tumor es un carcinoma.
  15. 15.
    La construcción de ácido nucleico para uso en el tratamiento de un tumor, inhibición de la progresión tumoral o inhibición de la metástasis tumoral de acuerdo con la reivindicación 14, en la que dicho tumor se selecciona del
    grupo que consiste en un carcinoma de vejiga, un carcinoma hepatocelular, un carcinoma de ovario y un carcinoma pancreático.
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