ES2374964T3

ES2374964T3 - Agentes citotóxicos que comprenden nuevos derivados de tomaimicina.

Info

Publication number: ES2374964T3
Application number: ES06290154T
Authority: ES
Inventors: Laurence Gauzy; Robert Zhao; Yonghong Deng; Wei Li; Hervé Bouchard; Ravi V.J. Chari; Alain Commercon
Original assignee: Sanofi SA; Sanofi Aventis France
Current assignee: Sanofi SA; Sanofi Aventis France
Priority date: 2006-01-25
Filing date: 2006-01-25
Publication date: 2012-02-23
Anticipated expiration: 2026-01-25
Also published as: JP5116696B2; KR101428112B1; MY157715A; EP1981889B1; HK1129106A1; TNSN08283A1; WO2007085930A1; AU2007209072C1; SI1813614T1; CA2635482C; EA200870193A1; PT1981889E; DK1813614T3; ES2457525T3; CY1112495T1; EP2386559A1; RS53293B; CN101374846A; PT1813614E; US20090036431A1

Abstract

Compuestos de fórmula (I): donde: ---- representa un enlace sencillo opcional;---- representa o un enlace sencillo o un doble enlace ;con la condición de que cuando ---- represente un enlace sencillo, U y U', iguales o diferentes, representenindependientemente H y W y W, iguales o diferentes, se seleccionan independientemente del grupo que consiste enOH, -OR, -OCOR, -OCOOR, -OCONRR', un carbamato cíclico tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -NRCONRR', -OCSNHR, un tiocarbamato cíclico tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -SH, -SR, -SOR, -SOOR,10-SO3, -OSO3, -NRSOOR, -NRR', amina opcionalmente cíclica tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, - NROR', -NRCOR, -N3, un ciano, un halo, un trialquilo triarilfosfonio ;y cuando represente un doble enlace, U y U' están ausentes y W y W' representan H; R1, R2, R1', R2' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre un Haluro o Alquilo opcionalmente sustituido con uno o más Hal, CN, NRR', CF3, OR, Arilo, Het, S(O)qR, o R1 y R2 y R1' y R2' forman juntos un grupo que contiene un doble enlace =B y =B' respectivamente.B y B' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre alquilo opcionalmente sustituido con uno o másde Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR, Arilo, Het; - A y A' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre Alquilo o Alquenilo estando cada uno opcionalmente sustituido con uno o más de Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR, Arilo, Het, Alquilo, Alquenilo. - Y e Y' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre H, OR;- q es 0, 1 ó 2;n, n', iguales o diferentes, son 0 ó 1 ;R y R' son iguales o diferentes y se seleccionan independientemente de H, Alquilo, Arilo, estando cada unoopcionalmente sustituido con Hal, CN, NRR', CF3, OR, Arilo, Het;- T es -NR- o un arilo o heteroarilo de 4 a 10 miembros, estando cada uno opcionalmente sustituido con uno o másHal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)q R, alquilo y sustituidos con uno o más sustituyente(s) que contienen tiol-, sulfuro- odisulfuro de fórmula: -(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ' ;-(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16) y(OCH2CH2)ySZ';-(CR13R14)t(NT19CO)(CR15R18)u(OCH2CH2)ySZ';-(CR13R14)t(OCO)(R15R16)u(OCH2CH2)ySZ';-(CR13R14)t(CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ' :-(CR13R14)t(CONR19)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ' ;-(CR13R14)t-fenil-CO(CR15R16)uSZ'; -(CR13R14)t-furil-CO(CR15R16)uSZ';-(CR13R14)t-oxazolil-CO(CR15R16)uSZ'; -(CR13R14)t-tiazolil-CO(CR15R16)uSZ';-(CR13R14)t-tienil-CO(CR15R16)uSZ';-(CR13R14)t-imidazolil-CO(CR15R16)uSZ',E0629015403-01- 46-(CR13R14)t-morfolino-CO(CR15R16)uSZ';-(CR13R14)t-piperazino-CO(CR15R16)uSZ';-(CR13R14)t-N-metil-piperazino-CO(CR15R16)uSZ';-(CR13R14)t-fenil-QSZ';-(CR13R14)t-furil-QSZ'; -(CR13R14)t-oxazolil-QSZ';-(CR13R14)t-tiazolil-QSZ';-(CR13R14)t-tienil-QSZ';-(CR13R14)t-imidazolil-QSZ';-(CR13R14)t-morfolino-QSZ'; -(CR13R14)t-piperazino-QSZ';-(CR13R14)t-N-metilpiperazino-QSZ';-O(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';-O(CR13R14)t-NR19CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';-O(CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)t (OCH2CH2)y SZ';10-O-fenil-OSZ';-O-furil-QSZ'; -O-oxazolil-QSZ'; -O-tiazolil-QSZ'; -O-tienil-QSZ';-O-imidazolil-QSZ';-O-morfolino-QSZ';-O-piperazino-QSZ';-O-N-metilpiperazino-QSZ';-OCO-(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';-OCONR12(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';15-OCO-fenil-QSZ'; -OCO-furil-QSZ'; -OCO-oxazolil-QSZ';-OCO-tiazolil-QSZ';-OCO-tienil-QSZ';-OCO-imidazolil-QSZ';-OCO-morfolino-QSZ' ;-OCO-piperazino-QSZ'; -OCO-N-metilpiperazino-QSZ';-CO(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)y SZ';-CO-(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';-CONR12(CR13R14)tCR15R16)u (OCH2CH2)ySZ';-CO-fenil-QSZ'; -CO-furil-QSZ'; -CO-oxazolil-QSZ'; -CO-tiazolil-QSZ'; -CO-tienil-QSZ'; -CO-imidazolil-QSZ'; -CO-morfolino-QSZ' ; -CO-piperazino-QSZ';-CO-piperidino-QSZ';-CO-N-metilpiperazino-QSZ';-NR19(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';- NR19CO(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';-NR19(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)ySZ';-NR19CO(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)ySZ';-NR19CONR12(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';-NR19CONR12(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)ySZ';30-NR19CO-fenil-QSZ'; -NR19CO-furil-OSZ'; -NR19CO-oxazolil-QSZ';-NR19CO-tiazolil-QSZ'; -NR19CO-tianil-QSZ'; -NR19CO-imidazolil-QSZ';-NR19CO-morfolino-QSZ'; -NR19CO-piperazino-QSZ';-NR19CO-piperidino-QSZ'; -NR19CO-N-metilpiperazino-QSZ';-NR19-fenil-QSZ'; -NR19-furil-QSZ'; -NR19-oxazolil-QSZ'; -NR19-tiazolil-QSZ';-NR19-tienil-QSZ'; -NR19-imidazolil-QSZ'; -NR19-morfolino-QSZ';-NR19-piperazino-QSZ'; -NR19-piperidino-QSZ'; -NR19-N-metilpiperazino-QSZ'; -NR19CO-NR12-fenil-QSZ'; -NR19CO-NR12-oxazolil-QSZ';-NR19CO-NR12-tiazolil-QSZ';-NR19CO-NR12-tienil-QSZ';-NR19CO-NR12-piperidino-QSZ';-S(O)q(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';-S(O)q(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)ySZ';5-SCONR12(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)ySZ';-SCO-morfolino-QSZ'; -SCO-piperazino-QSZ';-SCO-piperidino-QSZ'; -SCO-N-metilpiperazino-QSZ'donde: * Z' es H, Ac, R19' o SR19' ;* Q es un enlace directo o un alquilo lineal o alquilo ramificado que tiene de 1-10 átomos de carbono o un espaciadorde polietilenglicol con 2 a 20 unidades repetitivas etilenoxi;* R19' y R12 son iguales o diferentes y son alquilo lineal, alquilo ramificado o alquilo cíclico que tiene de 1 a 10 átomosde carbono o arilo simple o sustituido o heterociclo y R12 puede ser además H ;* R13, R14, R15 y R16 son iguales o diferentes y son H o un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono,* R17, R18 y R19 son H o alquilo;* u es un número entero de 1 a 10 y también puede ser 0,* t es un número entero de 1 a 10 y también puede ser 0,* y es un número entero de 1 a 20 y también puede ser 0 o sus sales, hidratos o sales hidratadas aceptables farmacéuticamente o las estructuras cristalinas polimórficas deestos compuestos o sus isómeros ópticos, racematos, diastereómeros o enantiómeros

Description

Agentes citot6xicos que comprenden nuevos derivados de tomaimicina

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invenci6n se refiere a nuevos agentes citot6xicos y a su uso terapeutico. Mas especfficamente, la

5 invenci6n se refiere a nuevos agentes citot6xicos que comprenden derivados de tomaimicina y a su uso terapeutico. Estos nuevos agentes citot6xicos tienen utilidad terapeutica como resultado de la liberaci6n de los derivados de tomaimicina en una poblaci6n especffica de celulas de una manera dirigida por medio de la asociaci6n qufmica del derivado de tomaimicina con un agente de uni6n a las celulas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

10 Se han descrito muchos intentos de dirigir especfficamente conjugados anticuerpo-farmaco a celulas tumorales (Sela et al., en Immunoconjugates 189-216 (C. Vogel, ed. 1987); Ghose et al., en Targeted Drugs 1-22 (E. Goldberg; ed. 1.983); Diener et al, en Antibody mediated delivery systems, 1-23 (J. Rodwell, ed. 1.988); Pietersz et al, en Antibody mediated delivery systems, 25-53 (J. Rodwell, ed. 1.988); Bumol et al, en Antibody mediated delivery systems, 55-79 (J. Rodwell, ed. 1.988); G.A. Pietersz & K. Krauer, 2, J. Drug Targeting, 183-215 (1.994); R. V. J.

15 Chari, 31 Adv. Drug Delivery Revs., 89-104 (1998); W.A. Blattler & R.V.J. Chari, en Anticancer Agents, Frontiers in Cancer Chemotherapy, 317-338, ACS Symposium Series 796; e I. Ojima et al eds, American Chemical Society 2001}. Todas las referencias y patentes citadas en la presente memoria se incorporan como referencia.

Se han conjugado farmacos citot6xicos, tales como: metotrexato, daunorubicina, doxorubicina, vincristina, vinblastina, melfalan, mitomicina C y clorambucilo, con varios anticuerpos monoclonales murinos. En algunos casos, 20 las moleculas del farmaco se unieron a las moleculas de anticuerpo a traves de una molecula portadora intermedia, tal como albumina serica (Garnett et al., 46 el Cancer Res. 2.407-2.412 (1.986); Ohkawa et al 23, Cancer Immunol. Immunother. 81-86 (1.986); Endo et al., 47 Cancer Res. 1076-1080 (1980)), dextrano (Hurwitz et al., 2 Appl. Biochem. 25-35 (1980); Manabi et al., 34 Biochem. Pharmacol. 289-291 (1.985); Dillman et al, 46 Cancer Res., 4.886-4.891 (1.986); Shoval et al, 85, Proc. Natl. Acad. Sci., 8.276-8.280 (1.988)) o acido poliglutamico (Tsukada et

25 al, 73, J. Natl. Canc. Inst., 721-729 (1.984); Kato et al 27 J. Med. Chem., 1602-1607 (1984); Tsukada et al, 52, Br. J. Cancer, 111-116 (1.985)).

Se ha empleado una amplia serie de tecnologfas de enlazantes para la preparaci6n de tales inmunoconjugados y se han investigado tanto enlazantes escindibles como no escindibles. En la mayorfa de los casos, el potencial citot6xico total de los farmacos s6lo podfa observarse, sin embargo, si las moleculas de farmaco se podfan liberar de los

30 conjugados en el lugar diana de forma no modificada.

Uno de los enlazadores escindibles que se ha empleado para la preparaci6n de conjugados anticuerpo-farmaco es un enlazador labil a acidos basado en el acido cis-aconftico que se aprovecha del medio acido de los diferentes compartimentos intracelulares, tales como los endosomas encontrados durante la endocitosis mediada por receptores y los lisosomas. Shen y Ryser introdujeron este metodo para la preparaci6n de conjugados de

35 daunorubicina con vehfculos macromoleculares (102 Biochem. Biophys. Res. Commun. 1048-1054 (1981)). Yang y Reisfeld usaron la misma tecnica para conjugar daunorubicina con un anticuerpo antimelanoma (80 J. Natl. Canc. Inst. 1154-1159 (1988)). Dillman et al. tambien usaron un enlazador labil a acidos de forma similar para preparar conjugados de daunorubicina con un anticuerpo anti-celula T (48 Cancer Res. 6097-6102 (1988)).

Un enfoque alternativo, explorado por Trouet et al., implica unir la daunorubicina con un anticuerpo a traves de un

40 puente espaciador peptfdico (79 Proc. Natl. Acad. Sci. 626-629 (1982)). Esto se hizo con la premisa de que el farmaco libre podrfa liberarse de tal conjugado por acci6n de las peptidasas lisosomales.

Sin embargo, los ensayos de citotoxicidad in vitro han demostrado que los conjugados anticuerpo-farmaco raramente alcanzan la misma potencia citot6xica que los farmacos libres sin conjugar. Esto sugiri6 que los mecanismos a traves de los que las moleculas de farmaco se liberan de los anticuerpos son muy ineficaces. En el 45 area de las inmunotoxinas, los conjugados formados mediante puentes disulfuro entre anticuerpos monoclonales y toxinas proteicas catalfticamente activas mostraron ser mas citot6xicos que los conjugados que contenfan otros enlazadores. Veanse Lambert et al., 260 J. Biol. Chem. 12035-12041 (1985); Lambert et al., en Immunotoxins 175209 (A. Frankel, ed. 1988); Ghetie et al, 48, Cancer Res. 2610-2617 (1988). Esto se atribuy6 a la elevada concentraci6n intracelular de glutati6n que contribuye a una escisi6n eficaz del enlace disulfuro entre una molecula 50 de anticuerpo y una toxina. A pesar de esto, solo se han descrito unos pocos ejemplos de la utilizaci6n de puentes disulfuro para la preparaci6n de conjugados entre farmacos y macromoleculas. Shen et al. (260 J. Biol. Chem. 10905-10908 (1985)) describieron la conversi6n de metotrexato en un derivado de mercaptoetilamida seguido por conjugaci6n con poli-D-lisina mediante un enlace disulfuro. Otro informe describi6 la preparaci6n de un conjugado de la caliqueamicina, farmaco t6xico que contiene trisulfuro, con un anticuerpo (Hinman et al., 53 Cancer Res. 3336

55 3342 (1993)).

Una raz6n para la falta de conjugados anticuerpo-farmaco unidos por disulfuro es la falta de disponibilidad de farmacos citot6xicos que tengan un resto que contiene un atomo de azufre que pueda utilizarse facilmente para unir

2 10

el farmaco a un anticuerpo a traves de un puente disulfuro. Ademas, es diffcil la modificaci6n qufmica de los farmacos existentes sin disminuir su potencial citot6xico.

Otra desventaja principal de los conjugados anticuerpo-farmaco existentes es su incapacidad para suministrar una concentraci6n suficiente de farmaco en el lugar diana debido al numero limitado de antfgenos dirigidos y la citotoxicidad relativamente moderada de los farmacos canceroestaticos como metotrexato, daunorubicina y vincristina. Para conseguir una citotoxicidad significativa, se hace necesaria la uni6n de un gran numero de moleculas de farmaco, bien directamente al anticuerpo o mediante una molecula portadora polimerica. Sin embargo, tales anticuerpos modificados de forma importante presentan a menudo una uni6n debilitada con el antfgeno diana y una eliminaci6n in vivo rapida del torrente circulatorio.

A pesar de las dificultades descritas anteriormente, se han descrito agentes citot6xicos utiles que comprenden restos de uni6n a las celulas y el grupo de farmacos citot6xicos conocidos como maitansinoides (documentos USP 5.208.020, USP 5.416.064 y R. V. J. Chari, 31 Advanced Drug Delivery Reviews 89-104 (1998)). De manera similar, tambien se han descrito agentes citot6xicos utiles que comprenden restos de uni6n a la celula y analogos y derivados del potente antibi6tico antitumoral CC-1065 (patentes de EE.UU. 5,475,092, 5,585,499 y 6,756,397).

Los derivados de tomaimicina son pirrolo[1.4]benzodiazepinas (las PBD), una clase conocida de compuestos que ejercen sus propiedades biol6gicas por medio de la uni6n covalente al N2 de guanina en el surco menor del ADN. Las PBD incluyen una serie de aglutinantes de surco menor tales como antramicina, neotramicina y DC-81. Sin embargo, la actividad antitumoral de la tomaimicina esta limitada sin embargo debido a su toxicidad no especffica para las celulas normales. De esta manera, existe la necesidad de aumentar la actividad terapeutica y disminuir los efectos t6xicos no especfficos de los compuestos de tomaimicina. Los presentes autores han demostrado que esta necesidad puede satisfacerse por la liberaci6n dirigida de compuestos de tomaimicina por medio de su uni6n con agentes de uni6n a la celula. Adicionalmente, existe la necesidad de desarrollar derivados de tomaimicina que sean solubles y estables en disoluciones acuosas. Ademas, la tomaimicina no es suficientemente potente como para usarse en conjugados de agentes de uni6n a la celula.

Recientemente se han descrito algunos derivados de PBD y su actividad antitumoral en modelos preclfnicos (documentos WO 00/12508 y WO2005/085260). Sin embargo, los ensayos clfnicos iniciales realizados en seres humanos indican que esta clase de compuestos son muy t6xicos, basandose en la muy baja dosis que puede administrarse a los seres humanos (I. Puzanov, Proc. AACR-NCI-EORTC International Conference, Filadelfia, USA 2.005, Resumen #B117). Por lo tanto, es deseable proporcionar derivados alternativos que sean mas potentes y/o puedan unirse a agentes de uni6n a las celulas.

El documento WO 200508250 describe compuestos de f6rmula :

PBD-A-Y-X-(Het)na-L-(Het)nb-L-(Het)nc-T-(Het')nd-L-(Het)ne-L-(Het)nf-X'-Y'-A'-PBD' en donde X y X' son NH o C(=O) y T es -NH-Q-NH-o -C(=O)-Q-C(=O)-. Q es un radical divalente derivado de un grupo alquilo(C1-C7) opcionalmente sustituido, un grupo heterociclo(C3-C20) o un grupo arilo(C5-C20). El documento WO 200508250 no describe la preparaci6n de conjugados.

El documento WO 2005/110423 describe compuestos de f6rmula :

El documento WO 2005/110423 no describe ningun conjugado. El documento WO 2005/040170 describe compuestos de f6rmula :

en donde Z es un grupo alcano, alqueno o alquino divalente, sustituido o sin sustituir (vease la reivindicaci6n 1). El sustituyente puede ser hal6geno, nitro, amino, hidroxilo, alcoxi, aralcoxi, ester, amida, sulfhidrilo, sulfuro de alquilo,

3 5

sulfuro de arilo, alquilsulf6xido, arilsulf6xido, alquilsulfonilo, arilsulfionilo, ceto, tioceto, alquilo, ciano y similares (vease la pagina 6 de la solicitud). El documento WO 2004/087716 describe compuestos de f6rmula :

pero no describe ningun conjugado.

J. Chem. Soc., Chem. Comm. 1999, 797-798 (issn=0022-4936), Bioorganic & Med.Chem. Let. 2004, 14(10), 26692672 (issn=0960-894X), J. Med. Chem. 2004, 47, 1161-1174 (issn=0022-2623), Bioorganic & Med.Chem. Let. 2004, 14(22), 5699-5702 (issn=0960-894X) describe dfmeros con los enlaces -O-(CH2)n-O-. Tetrahedron Lett. 1988, 29(40), 5105-5108 (issn=0040-4039) describe dfmeros con los enlaces -S(CH2)6S-(compuesto 13), -O(CH2)2N(CH3)(CH2)2O-(compuesto 14), NH(CH2)3N(CH3)(CH2)3NH-(compuesto 15).

Ninguno de estos documentos describe los compuestos tal como se reivindican.

Por consiguiente, es muy necesario un metodo para tratar enfermedades con derivados de tomaimicina en el que sus efectos colaterales se reduzcan sin comprometer su citotoxicidad.

COMPENDIO DE LA INVENCION

Como se describe en una primera realizaci6n, un objeto de la presente invenci6n es proporcionar derivados de tomaimicina que son altamente t6xicos pero que pueden usarse eficazmente en el tratamiento de muchas enfermedades.

Otro objeto de la presente invenci6n es proporcionar nuevos derivados de tomaimicina, que opcionalmente se pueden unir o unidos a un agente de uni6n a las celulas.

En un segundo modo de realizaci6n, la presente invenci6n proporciona una composici6n terapeutica que comprende:

(A): una cantidad eficaz de uno o mas derivados de tomaimicina que opcionalmente se pueden unir o unidos a un agente de uni6n a las celulas, y

(B): un vehfculo, diluyente o excipiente aceptable farmaceuticamente.

En una tercera realizaci6n, la presente invenci6n proporciona un metodo para eliminar poblaciones celulares elegidas in vitro que comprende poner en contacto las celulas diana o el tejido que contiene las celulas diana con una cantidad citot6xica de un agente citot6xico que comprende uno o mas derivados de tomaimicina, que opcionalmente se pueden unir o unidos a un agente de uni6n a las celulas.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Esta invenci6n se basa en la sfntesis de nuevos derivados de tomaimicina que mantienen una alta citotoxicidad y que pueden unirse eficazmente con agentes de uni6n a las celulas. Previamente se ha demostrado que la uni6n de farmacos muy citot6xicos a anticuerpos usando una uni6n escindible, tal como un enlace disulfuro, asegura la liberaci6n de farmacos totalmente activos dentro de la celula y que tales conjugados son citot6xicos con especificidad de antfgeno (documentos US 6.340.701; US 6.372.738; US 6.436.931). Sin embargo, la tecnica revela que es extremadamente diffcil modificar los farmacos existentes sin disminuir su potencial citot6xico. La invenci6n descrita resuelve este problema modificando los derivados de tomaimicina descritos con restos qufmicos. Como resultado, los nuevos derivados de tomaimicina descritos conservan y en algunos casos podfan incluso aumentar la potencia citot6xica de los derivados de tomaimicina. Los complejos agente de uni6n a la celula-derivado de tomaimicina permiten la medici6n completa de la acci6n citot6xica de los derivados de tomaimicina que se van a aplicar de forma dirigida contra celulas no deseadas s6lo, evitando por lo tanto los efectos secundarios debidos al dano en las celulas sanas no diana. Asf, la invenci6n proporciona agentes utiles para la eliminaci6n de celulas enfermas o anormales que deben destruirse o lisarse, tales como las celulas tumorales (particularmente, las celulas de tumor s6lido).

El agente citot6xico de acuerdo con la presente invenci6n comprende uno o mas derivados de tomaimicina, que opcionalmente se pueden unir o unidos a un agente de uni6n a las celulas mediante un grupo de uni6n. El grupo enlazador es parte de un resto qufmico que se une por enlaces covalentes a un derivado de tomaimicina por metodos convencionales. En un modo de realizaci6n preferido el resto qufmico puede estar unido covalentemente al derivado de tomaimicina mediante un enlace disulfuro.

4 5

Los derivados de tomaimicina se describen en las reivindicaciones 1-11. Los derivados de tomaimicina utiles en la presente invenci6n tienen la f6rmula (I) mostrada a continuaci6n:

----representa un enlace sencillo opcional; representa o un enlace sencillo o un doble enlace;

con la condici6n de que cuando representa un enlace sencillo, U y U', iguales o diferentes, representan independientemente H, y W y W', iguales o diferentes, se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en OH, un eter tal como -OR, un ester (por ejemplo un acetato), tal como -OCOR, un carbonato tal como -OCOOR, un carbamato tal como -OCONRR', un carbamato cfclico, tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, una urea tal como -NRCONRR', un tiocarbamato tal como -OCSNHR, un tiocarbamato cfclico tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -SH, un sulfuro tal como -SR, un sulf6xido tal como -SOR, una sulfona tal como -SOOR, un sulfito tal como -SO3-, , un bisulfito tal como -OSO3, una sulfonamida tal como -NRSOOR, una amina tal como -NRR', opcionalmente amina cfclica tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, un derivado de hidroxilamina tal como -NROR', una amida tal como -NRCOR, un azido tal como -N3, un ciano, un halo, un trialquilo o triarilfosfonio, un grupo derivado de aminoacido; Preferiblemente W y W' son iguales o diferentes y son OH, Ome, Oet, NHCONH2, SMe;

y cuando represente un doble enlace, U y U' estan ausentes y W y W' representan H;

•: R1, R2, R1', R2' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre un Haluro o Alquilo opcionalmente sustituido con uno o mas Hal, CN, NRR', CF3, OR, Arilo, Het, S(O)qR, o R1 y R2 y R1' y R2' forman juntos un grupo que contiene un doble enlace =B y =B' respectivamente.

Preferiblemente, R1= R2= R1'= R2'= H, o mas preferiblemente R1 y R2 y R1' y R2' forman juntos un enlace doble que contiene el grupo =B y =B' respectivamente.

•: B y B' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre alquilo opcionalmente sustituido con uno o mas de Hal, CN, NRR', CF3, OR, Arilo, Het, S(O)qR Preferiblemente, B=B'.

Mas preferiblemente, B=B'= =CH2 o =CH-CH3, X=X'=O.

•: A, A' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre Alquilo o Alquenilo opcionalmente sustituido con uno o mas de Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR, Arilo, Het, Alquilo, Alquenilo.

Preferiblemente, A=A'. Mas preferiblemente, A=A'=alquilo lineal no sustituido.

•: Y, Y' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre H, OR; Preferiblemente Y=Y'. Mas preferiblemente Y=Y'=OAlquilo, mas preferiblemente OMetilo.

•: T es -NR-, o un arilo o heteroarilo de 4 a 10 miembros, todos opcionalmente sustituidos con uno o mas de Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR, Alquilo, y sustituidos con uno o mas enlazador(es).

Preferiblemente, T es un grupo arilo o heteroarilo de 4 a 10 miembros, mas preferiblemente fenilo o piridilo sustituido con uno o mas enlazador(es).

Los grupos de uni6n adecuados se conocen bien en la tecnica e incluyen grupos tiol, sulfuro, disulfuro, grupos tioeter, grupos acido labiles, grupos fotolabiles, grupos peptidasa labiles y grupos esterasa labiles. Se prefieren los grupos disulfuro y tioeter.

Cuando el grupo de uni6n es un grupo que contiene tiol, sulfuro (o el denominado tioeter -S-) o disulfuro (-S-S-), la cadena lateral que tiene el grupo tiol, sulfuro o disulfuro puede ser lineal o ramificada, aromatica o heterocfclica. Los especialistas en la materia pueden identificar facilmente cadenas laterales adecuadas.

Los sustituyentes que contienen tiol-, sulfuro- o disulfuro- incluyen -(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ', -(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)y(OCH2CH2)ySZ', -(CR13R14)t(NR19CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)y SZ', -(CR13R14)t(OCO)(R15R16)u(OCH2CH2)ySZ', -(CR13R14)t(CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ', -(CR13R14)t(CONR19)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ', -(CR13R14)t-fenil-CO(CR15R16)uSZ', -(CR13R14)t-furil-CO(CR15R16)uSZ', -(CR13R14)t-oxazolil-CO(CR15R16)uSZ', -(CR13R14)t-tiazolil-CO(CR15R16)uSZ', -(CR13R14)t-tienil-CO(CR15R16)uSZ', -(CR13R14)t-imidazolil-CO(CR15R16)uSZ', -(CR13R14)t-morfolino-CO(CR15R16)uSZ', -(CR13R14)tpiperazino- CO(CR15R16)USZ', -(CR13R14)t-N-metilpiperazin-CO(CR15R16)uSZ', -(CR13R14)t-fenil-QSZ', -(CR13R14)t-furil-QSZ', -(CR13R14)t-oxazolil-QSZ', -(CR13R14)t-tiazolil-QSZ', -(CR13R14)t-tienil-QSZ', -(CR13R14)t-imidazolil- QSZ', -(CR13R14)t-morfolino-QSZ', -(CR13R14)t-piperazino-QSZ', -(CR13R14)t-N-metilpiperazino-QSZ', o

-O(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ', -O(CR13R14)t(NR19CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ', -O(CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)t (OCH2CH2)ySZ', -O-fenil-QSZ', -O-furil-QSZ', -O-oxazolil-QSZ', -O-tiazolil-QSZ', -O-tienil-QSZ', -O-imidazolil-QSZ', -O-morfolino-QSZ', -O-piperazino-QSZ', -O-N-metilpiperazino-QSZ',

-OCO-(CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ', -OCONR12(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)ySZ', -OCO-fenil-QSZ', -OCO-furil-QSZ', -OCO-oxazolil-QSZ', -OCOtiazolil-QSZ', -OCO-tienil-QSZ', -OCO-imidazolil-QSZ', -OCOmorfolino-QSZ', -OCO-piperazino-QSZ', -OCO-N-metilpiperazino-QSZ', o

-CO(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)y SZ', -CO-(CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ',

6 5

-: CONR12(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)ySZ',

-CO-fenil-QSZ', -CO-furil-QSZ', -CO-oxazolil-QSZ', -CO-tiazolil-QSZ', -CO-tienil-QSZ', -CO-imidazolil-QSZ', -CO-morfolino-QSZ', -COpiperazino-QSZ', -CO-piperidino-QSZ', -CO-N-metilpiperazino-QSZ',

-: NR19(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ',

-: NR19CO(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ',

-: NR19(CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)t (OCH2CH2)ySZ',

-: NR19CO(CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)ySZ',

-: NR19CONR12(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)ySZ',

-: NR19CO NR12 (CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)t (OCH2CH2)ySZ',

-NR19CO-fenil-QSZ', -NR19CO-furil-QSZ', -NR19CO-oxazolil-QSZ', -NR19CO-tiazolil-QSZ', -NR19CO-tienil-QSZ', -NR19CO-imidazolil-QSZ', -NR19CO-morfolino-QSZ', -NR19CO-piperazino-QSZ', -NR19COpiperidino-QSZ', -NR19CO-N-metilpiperazino-QSZ', -NR19-fenil-QSZ', -NR19-furil-QSZ', -NR19-oxazolil-QSZ', -NR19- tiazolil-QSZ', -NR19-tienil-QSZ', -NR19-imidazolil-QSZ', -NR19- morfolino-QSZ', -NR19-piperazino-QSZ', -NR19-piperidino-QSZ', -N R19-N-metilpiperazino-QSZ', -NR19CO-NR12-fenil-QSZ', -NR19CO-NR12-oxazolil-QSZ', -NR19CO-NR12- tiazolil-QSZ', -NR19CO-NR12-tienil-QSZ', -NR19CO-NR12-piperidino-QSZ',

-: S(O)q(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ',

-: S(O)q(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)ySZ',

-: SCONR12(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)ySZ',

-SCO-morfolino-QSZ', -SCO-piperazino-QSZ', -SCO-piperidino-QSZ', y -SCO-N-metilpiperazino-QSZ', en donde: Z' es H, un grupo protector de tiol, tal como Ac, R19' o SR19', donde Q es un enlace directo o un grupo alquilo lineal o alquilo ramificado que tiene 1-10 atomos de carbono o un

espaciador de polietilenglicol con 2 a 20 unidades de repetici6n etileno oxi;

R19' y R12 son iguales o diferentes y son alquilo lineal, alquilo ramificado o alquilo cfclico que tiene de 1 a 10 atomos de carbono, o un grupo arilo o heterocfclico simple o sustituido, y R12 puede ser ademas H, R13, R14, R15 y R16 son iguales o diferentes y son H o un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 atomos de

carbono, R17, R18 y R19 son H o alquilo, u es un numero entero de 1 a 10 y tambien puede ser 0, t es un numero entero de 1 a 10 y tambien puede ser 0, y es un numero entero de 1 a 20 y tambien puede ser 0.

• n, n', iguales o diferentes son 0 o 1, y n=n'=1.

7 5

•: q es 0, 1 o 2.

•: R, R' son iguales o diferentes y se seleccionan independientemente de H, Alquilo, Arilo, opcionalmente sustituido con Hal, CN, NRR', CF3, OR, Arilo, Het;

o sus sales, hidratos o sales hidratadas aceptables farmaceuticamente o las estructuras cristalinas polim6rficas de estos compuestos o sus is6meros 6pticos, racematos, diastere6meros o enanti6meros.

De acuerdo con un aspecto preferido, los compuestos de la invenci6n son aquellos de f6rmula (I) donde T= arilo opcionalmente sustituido con uno o mas de Hal, CN, NRR', CF 3, OR, S(O)qR, Alquilo, y sustituidos con uno o mas

enlazador(es). y A, A', X, X', U, U', W, W', m, m', n, n', ----, se definen como anteriormente. En particular, n=n'=1. Los compuestos preferidos son los de f6rmula:

donde X, X', A, A', Y, Y', T, n, n', m, m' se definen como anteriormente.

Como se ha usando anteriormente o como se usa a continuaci6n en este documento:

Alk representa alquilo, alqueno o alquino.

"Alquilo" significa un grupo hidrocarbonado alifatico que puede ser lineal o ramificado, con 1 a 20 atomos de carbono en la cadena o cfclico con 3 a 10 atomos de carbono. Los grupos alquilo preferidos tienen de 1 a 12 atomos de carbono en la cadena. "Ramificado" significa que uno o mas grupos alquilo inferior tales como metilo, etilo o propilo se unen a una cadena alquflica lineal. Los grupos alquilo ejemplares incluyen metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, nbutilo, t-butilo, n-pentilo, 3-pentilo, octilo, nonilo, decilo, ciclopentilo y ciclohexilo.

"Alqueno" significa un grupo hidrocarbonado alifatico que contiene un doble enlace carbono-carbono y que puede ser lineal o ramificado, que tiene de 2 a 15 atomos de carbono en la cadena. Los grupos alquenilo preferidos tienen de 2 a 12 atomos de carbono en la cadena; y mas preferiblemente de aproximadamente 2 a 4 atomos de carbono en la cadena. Los grupos alquenilo ejemplares incluyen etenilo, propenilo, n-butenilo, i-butenilo, 3-metilbut-2-enilo, npentenilo, heptenilo, octenilo, nonenilo, decenilo.

"Alquino" significa un grupo hidrocarbonado alifatico que contiene un triple enlace carbono-carbono y que puede ser lineal o ramificado, que tiene de 2 a 15 atomos de carbono en la cadena. Los grupos alquinilo preferidos tienen de 2 a 12 atomos de carbono en la cadena; y mas preferiblemente de 2 a 4 atomos de carbono en la cadena. Los grupos alquinilo ejemplares incluyen etinilo, propinilo, n-butinilo, 2-butinilo, 3-metilbutinilo, n-pentinilo, heptinilo, octinilo y decinilo.

"Atomo de hal6geno" se refiere a un atomo de fluor, cloro, bromo o yodo; preferiblemente un atomo de fluor y cloro.

"Arilo" significa un sistema de anillos hidrocarbonado, monocfclico o multicfclico, aromatico, de 6 a 14 atomos de carbono, preferiblemente de 6 a 10 atomos de carbono. Los grupos arilo ejemplares incluyen fenilo o naftilo.

El termino "Het" se refiere a heterociclo o heteroarilo.

Como se usan en este documento, las expresiones "heterociclo" o "grupo heterocfclico" se refieren a anillos mono, bi

o multicfclicos, saturados, parcialmente insaturados o insaturados, no aromaticos, estables, de 3 a 14 y preferiblemente de 5 a 10 miembros, donde al menos un miembro del anillo es un heteroatomo. Tfpicamente, los heteroatomos incluyen, pero no se limitan a, atomos de oxfgeno, nitr6geno, azufre, selenio y f6sforo. Los heteroatomos preferidos son oxfgeno, nitr6geno y azufre.

8 10

Tambien se describen heterociclos adecuados en The Handbook of Chemistry and Physics, 76a Edici6n, CRC Press, Inc., 1.995-1.996, pag. 2-25 a 2-26, cuya descripci6n se incorpora de ese modo como referencia.

Los grupos heterocfclicos no aromaticos preferidos incluyen, pero sin limitaci6n, pirrolidinilo, pirazolidinilo, imidazolidinilo, oxiranilo, tetrahidrofuranilo, dioxolanilo, tetrahidro-piranilo, dioxanilo, dioxolanilo, piperidilo, piperazinilo, morfolinilo, piranilo, imidazolinilo, pirrolinilo, pirazolinilo, tiazolidinilo, tetrahidrotiopiranilo, ditianilo, tiomorfolinilo, dihidro-piranilo, tetrahidropiranilo, dihidropiranilo, tetrahidro-piridilo, dihidropiridilo, tetrahidropirinidinilo, dihidrotiopiranilo, azepanilo, asf como los sistemas condensados producidos por la condensaci6n con un grupo fenilo.

Como se usa en este documento, el termino "heteroarilo" o heterociclos aromaticos se refiere a un anillo mono-, bi-o multicfclico, aromatico, de 5 a 14 y preferiblemente de 5 a 10 miembros. Los ejemplos incluyen pirrolilo, piridilo, pirazolilo, tienilo, pirimidinilo, pirazinilo, tetrazolilo, indolilo, quinolinilo, purinilo, imidazolilo, tienilo, tiazolilo, benzotiazolilo, furanilo, benzofuranilo, 1,2,4-tiadiazolilo, isotiazolilo, triazoilo, tetrazolilo, isoquinolilo, benzotienilo, isobenzofurilo, pirazolilo, carbazolilo, bencimidazolilo, isoxazolilo, N-6xido de piridilo, asf como los sistemas condensados producidos por la condensaci6n con un grupo fenilo.

Los terminos "alquilo", "cicloalquilo", "alquenilo", "alquinilo", "arilo", "heteroarilo", "heterociclo" y similares tambien se refieren a los terminos "alquileno", "cicloalquileno", "alquenileno", "alquinileno", "arileno", "heteroarileno", "heterociclona" correspondientes y similares que se forman por la retirada de dos atomos de hidr6geno.

Como se usa en este documento, la expresi6n "enlazable a un agente de uni6n a las celulas" se refiere a los derivados de tomaimicina que comprenden al menos un grupo de uni6n, o un precursor del mismo, adecuado para unir dichos derivados con un agente de uni6n a las celulas; siendo los grupos de uni6n preferidos enlaces tiol o disulfuro, o precursores de los mismos.

Como se usa en este documento, la expresi6n "enlazado a un agente de uni6n a las celulas" se refiere a la molecula conjugada que comprende al menos un derivado de tomaimicina unido a un agente de uni6n a las celulas mediante un grupo de uni6n adecuado, o un precursor del mismo; siendo los grupos de uni6n preferidos enlaces tiol o disulfuro, o precursores de los mismos.

Como se usa en este documento, el "precursor" de un grupo dado se refiere a cualquier grupo que pueda conducir a ese grupo mediante cualquier reacci6n de desprotecci6n, modificaci6n qufmica o acoplamiento.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el termino "paciente" se refiere a un animal, tal como un animal valioso para fines de crfa, companfa o conservaci6n, o preferiblemente un ser humano o un nino que padece o que presenta el potencial de padecer una o mas enfermedades y afecciones descritas en la presente memoria.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una "cantidad eficaz terapeuticamente" se refiere a una cantidad de un compuesto de la presente invenci6n que es eficaz para prevenir, reducir, eliminar, tratar o controlar los sfntomas de las enfermedades y afecciones descritas en la presente memoria. El termino "controlar" pretende referirse a todos los procesos en los que puede existir un retraso, interrupci6n, detenci6n o parada de la progresi6n de las enfermedades y afecciones descritas en la presente memoria, pero no indica necesariamente una eliminaci6n total de todos los sfntomas de la enfermedad y afecci6n, y pretende incluir tratamiento profilactico.

Como se usa en este documento, la expresi6n "farmaceuticamente aceptable" se refiere a los compuestos, materiales, excipientes, composiciones o formas de dosificaci6n que, dentro del alcance del juicio medico, son adecuados para ponerse en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin provocar toxicidad, irritaci6n, respuesta alergica excesivas u otras complicaciones problematicas en proporci6n a una relaci6n beneficio/riesgo razonable.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la expresi6n "sales aceptables farmaceuticamente" se refiere a derivados de los compuestos descritos donde el compuesto precursor se modifica preparando sales de acidos o bases del mismo. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales no t6xicas convencionales o la sales de amonio cuaternario del compuesto precursor formadas, por ejemplo, a partir de acidos inorganicos u organicos, no t6xicos. Por ejemplo, dichas sales no t6xicas convencionales incluyen las procedentes de acidos inorganicos tales como: clorhfdrico, bromhfdrico, sulfurico, sulfamico, fosf6rico, nftrico y similares y las sales preparadas a partir de acidos organicos tales como: acetico, propi6nico, succfnico, tartarico, cftrico, metanosulf6nico, bencenosulf6nico, glucor6nico, glutamico, benzoico, salicflico, toluenosulf6nico, oxalico, fumarico, maleico, lactico y similares. Otras sales de adici6n incluyen sales de amonio tales como trometamina, meglumina, epolamina, etc., sales de metales tales como sodio, potasio, calcio, cinc o magnesio.

Las sales aceptables farmaceuticamente de la presente invenci6n pueden sintetizarse a partir del compuesto precursor que contiene un resto basico o acido por metodos qufmicos convencionales. En general, tales sales pueden prepararse haciendo reaccionar las formas acidas o basicas libres de estos compuestos con una cantidad estequiometrica de la base o el acido apropiado, en agua o en un disolvente organico o en una mezcla de los dos. En general, se prefieren medios no acuosos como eter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Las listas

9 5

de sales adecuadas se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1.985, p. 1418, cuya descripci6n se incorpora en la presente memoria por referencia.

Los compuestos de f6rmula general (I) que tienen is6meros geometricos y estereois6meros tambien son una parte de la invenci6n.

Se sabe que el doble enlace N-10, C-11 de los derivados de tomaimicina de f6rmula (I) puede convertirse facilmente y de manera reversible en los aductos de imina correspondientes en presencia de agua, un alcohol, un tiol, una amina primaria o secundaria, urea y otros nucle6filos. Este proceso es reversible y puede regenerar facilmente los derivados de tomaimicina correspondientes en presencia de un agente deshidratante, en un disolvente organico no pr6tico, al vacfo o a temperaturas elevadas (Z. Tozuka, 36, J. Antibiotics, 276 (1.983).

Asf, esta invenci6n tambien proporciona derivados reversibles de derivados de tomaimicina de f6rmula general (II):

en la que A, X, Y, m, n, T, A', X', Y', m', n', R1, R2, R1', R2' son como se han definido en la f6rmula (XX) y W, W' son iguales o diferentes y se seleccionan entre el grupo que consiste en OH, un eter tal como -OR, un ester (por ejemplo un acetato), tal como -OCOR, -COOR, un carbonato tal como -OCOOR, un carbamato tal como -OCONRR', un carbamato cfclico, tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, una urea tal como -NRCONRR', un tiocarbamato tal como -OCSNHR, un tiocarbamato cfclico tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -SH, un sulfuro tal como -SR, un sulf6xido tal como -SOR, una sulfona tal como -SOOR, un sulfito tal como -SO3, un bisulfito tal como -OSO3, una sulfonamida tal como -NRSOOR, una amina tal como -NRR', opcionalmente amina cfclica tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, un derivado de hidroxilamina tal como -NROR', una amida tal como -NRCOR, -NRCONRR', un azido tal como -N3, un ciano, un halo, un trialquilo o triarilfosfonio. Preferiblemente, W y W' son iguales o diferentes y son: OH, OMe, OEt, NHCONH2, SMe.

Asf, los compuestos de f6rmula (II) pueden considerarse como solvatos, incluyendo el agua cuando el disolvente es agua; estos solvatos pueden ser particularmente utiles.

De acuerdo con otro aspecto adicional, la presente invenci6n tambien es de interes con el proceso de preparaci6n de los compuestos de f6rmula (I).

Los compuestos y procesos de la presente invenci6n pueden prepararse por varias rutas muy conocidas por los expertos en la tecnica. Los compuestos pueden sintetizarse, por ejemplo, por aplicaci6n o adaptaci6n de los metodos que se describen a continuaci6n, o variaciones de los mismos que puedan apreciarse por los especialistas en la tecnica. Las modificaciones y sustituciones apropiadas seran obvias y se conoceran bien o podran obtenerse facilmente a partir de la bibliograffa cientffica por los expertos en la tecnica.

En particular, dichos metodos pueden encontrarse en R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, Wiley-VCH Publishers, 1.999.

Se apreciara que los compuestos de la presente invenci6n pueden contener uno o mas atomos de carbono asimetricamente sustituidos y pueden aislarse en formas 6pticamente activas o racemicas. Por lo tanto, se desean todas las formas quirales, diastereomericas, racemicas y todas las formas isomericas geometricas de una estructura, a menos que se indique especfficamente la estereoqufmica o la forma isomerica especffica. Se sabe bien en la tecnica c6mo preparar y aislar dichas formas 6pticamente activas. Por ejemplo, pueden separarse mezclas de estereois6meros por tecnicas estandar que incluyen, pero no se limitan a, resoluci6n de formas racemicas, cromatograffa normal, de fase reversa y quiral, formaci6n de sales preferencial, recristalizaci6n y similares o por sfntesis quiral bien a partir de materiales de partida quirales o por sfntesis deliberada de centros quirales diana.

Los compuestos de la presente invenci6n pueden prepararse mediante varias rutas sinteticas. Los reactivos y materiales de partida estan disponibles comercialmente, o se sintetizan facilmente por tecnicas muy conocidas por el experto en la tecnica. Todos los sustituyentes, a menos que se indique otra cosa, son como se han definido anteriormente.

En las reacciones descritas a continuaci6n en la presente memoria, puede ser necesario proteger grupos funcionales reactivos, por ejemplo grupos hidroxi, amino, imino, tio o carboxi, cuando se desean en el producto final, para evitar su participaci6n no deseada en las reacciones. Pueden usarse grupos protectores convencionales de acuerdo con la practica estandar, para ejemplos, veanse T. W. Greene y P. G. M. Wuts in Protective Groups in Organic Chemistry, 3a ed., John Wiley and Sons, 1999; J. F. W. McOmie en Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, 1973.

Algunas reacciones pueden realizarse en presencia de una base. No existe ninguna restricci6n particular sobre la naturaleza de la base que se tiene que usar en esta reacci6n y puede usarse aquf igualmente cualquier base usada convencionalmente en reacciones de este tipo, con la condici6n de que no afecte de forma adversa a otras partes de la molecula. Los ejemplos de bases adecuadas incluyen: hidr6xido de sodio, carbonato de potasio, trietilamina, hidruros de metales alcalinos, tales como hidruro de sodio e hidruro de potasio; compuestos de alquil-litio, tales como metil-litio y butil-litio; y alc6xidos de metales alcalinos, tales como met6xido de sodio y et6xido de sodio.

Habitualmente, las reacciones se realizan en un disolvente adecuado. Pueden usarse varios disolventes, con la condici6n de que no afecten de forma adversa a la reacci6n o a los reactivos implicados. Los ejemplos de disolventes adecuados incluyen: hidrocarburos, que pueden ser hidrocarburos aromaticos, alifaticos o cicloalifaticos, tales como hexano, ciclohexano, benceno, tolueno y xileno; amidas, tales como dimetilformamida; alcoholes tales como etanol y metanol y eteres, tales como eter dietflico y tetrahidrofurano.

Las reacciones pueden realizarse en un amplio intervalo de temperaturas. En general, se encuentra conveniente realizar la reacci6n a una temperatura de 0°C a 150°C (mas preferiblemente de aproximadamente la temperatura ambiente a 100°C). El tiempo requerido para la reacci6n tambien puede variar ampliamente, dependiendo de muchos factores, en particular de la temperatura de la reacci6n y de la naturaleza de los reactivos. Sin embargo, si la reacci6n se realiza en las condiciones preferidas indicadas anteriormente, normalmente sera suficiente un periodo de 3 horas a 20 horas.

El compuesto preparado de esta manera puede recuperarse de la mezcla de reacci6n por medios convencionales. Por ejemplo, los compuestos pueden recuperarse mediante retirada por destilaci6n del disolvente de la mezcla de reacci6n o, si es necesario despues de la retirada por destilaci6n del disolvente de la mezcla de reacci6n, vertiendo el residuo en agua seguido de la extracci6n con un disolvente organico inmiscible en agua y retirando por destilaci6n el disolvente del extracto. Ademas, si se desea, el producto puede purificarse adicionalmente mediante diversas tecnicas bien conocidas, tales como recristalizaci6n, reprecipitaci6n o las diversas tecnicas de cromatograffa, principalmente cromatograffa en columna o cromatograffa preparativa de capa fina.

El proceso de preparaci6n de un compuesto de f6rmula (I) de la invenci6n es un objeto adicional de la presente invenci6n.

De acuerdo con un primer aspecto, el proceso de preparaci6n de los compuestos de f6rmula (I) comprende la etapa de desproteger los compuestos correspondientes de f6rmula (III):

en la que Y, Y', X, A, A', X', m, n, m', n', W, W', U, U', ----, R1, R2, R1', R2', son como se han definido en la f6rmula (I) y T' se corresponde con T donde el/los grupo(s) funcional(es) se ha(n) protegido.

Preferiblemente, la funci6n SH se protege y preferiblemente el grupo protector es acetilo, benzoflo, metanosulfonilo, metiltio, piridiltio, nitropiridiltio, triisopropilsililo (TIPS). En general, la etapa de desprotecci6n se realiza usando condiciones clasicas tales como una base para retirar los grupos protectores de acetilo, benzoflo y metanosulfonilo, un agente reductor tal como ditiotreitol o tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) para escindir un grupo protector de metiltio

o de manera conocida haciendo reaccionar los compuestos con un fluoruro de amonio para retirar el TIPS.

Los compuestos de f6rmula (II) pueden obtenerse a partir del acoplamiento de compuestos correspondientes de f6rmulas (IV), (IV') y (V):

donde Y, Y', A, A', n, n', T', W, W', U, U', ----, , R1, R2, R1', R2' son como se han definido en la f6rmula (III), y Lg es un grupo saliente tal como un hal6geno o OMs, OTs.

Los compuestos de f6rmula (IV) y (IV') son generalmente compuestos conocidos, como se describe por ejemplo en las solicitudes de patente WO 00/12508, WO 00/12507, WO 2005/040170, WO 2005/085260, o estan disponibles en el mercado, y/o estan disponibles por sfntesis total (M. Mori et al, 42 Tetrahedron, 3793-3806, 1986) o se producen por especies de Streptomyces, en particular, siguiendo el procedimiento de la patente de Francia Fr. 1.516.743 o

5 pueden prepararse por aplicaci6n o adaptaci6n de los procedimientos ilustrativos dados en los ejemplos.

Los compuestos de f6rmula (V) pueden obtenerse a partir de compuestos correspondientes de f6rmula (VI):

(VI) HO-An-T'-A'n'-OH

en la que A, A', n, n', T' son como se han definido en la f6rmula (III).

Esta reacci6n se realiza generalmente en presencia de PPh3 y CHal4 o por reacci6n con un clorosulfonato en 10 presencia de una base tal como hidr6xido de potasio.

Los compuestos de f6rmula (VI) pueden obtenerse a partir de compuestos correspondientes de f6rmula (VII):

(VII) HO-An-T"-A'n'-OH

donde A, A', n, n' se definen como en la f6rmula (III) y T" es un grupo precursor de T. Un grupo precursor de T se refiere a cualquier grupo que puede conducir a T mediante cualquier desprotecci6n, modificaci6n qufmica, o

15 acoplamiento. Preferiblemente, T se obtiene por acoplamiento de T' con la porci6n complementaria, donde T' y la porci6n complementaria comprenden funciones que son reactivas entre sf, por ejemplo, T' comprende una funci6n amina y la porci6n complementaria comprende una funci6n acido.

Un ejemplo representativo para esta reacci6n es:

20 En general, esta reacci6n se realiza en presencia de N-hidroxisuccinimida y HOBT.

Los compuestos de f6rmula (VII) pueden estar disponibles en el mercado o prepararse por adaptaci6n o aplicaci6n de metodos conocidos o de acuerdo con los ejemplos. A continuaci6n se da un esquema ejemplar, no limitante, para esta realizaci6n del proceso de la invenci6n:

25 De acuerdo con un segundo aspecto, el compuesto de f6rmula (I) puede obtenerse a partir del compuesto correspondiente de f6rmula (III'):

en la que Y, Y', X, A, A', X', m, n, m', n', W, W', U, U', ----, , R1, R2, R1', R2' son como se han definido en la f6rmula (I) y T'' es un grupo precursor opcionalmente protegido de T.

Un grupo precursor de T se refiere a cualquier grupo que pueda conducir a T por modificaci6n qufmica o acoplamiento. Preferiblemente, T se obtiene por acoplamiento de T' con la porci6n complementaria correspondiente, donde T' y la porci6n complementaria comprenden funciones que son reactivas entre sf, por ejemplo, T' comprende una funci6n amina y la porci6n complementaria comprende una funci6n acido.

Un ejemplo representativo de esta reacci6n es:

10 donde Tomay representa un derivado de tomaimicina de f6rmula:

En general, esta reacci6n se realiza en presencia de: N-hidroxisuccinimida y HOBT.

El compuesto de f6rmula (III') puede obtenerse por acoplamiento del compuesto correspondiente de f6rmulas (IV), (IV') y (V'):

donde Y, Y', A, A', n, n', T', W, W', U, U', ----, , R1, R2, R1', R2' son como se han definido en la f6rmula (III), T" es un grupo precursor de T opcionalmente protegido y Lg es un grupo saliente tal como hal6geno o OMs, OTs.

Los compuestos de f6rmula (IV) y (IV') son generalmente compuestos conocidos y estan disponibles por sfntesis total (M. Mori et al, 42 Tetrahedron, 3793-3806, 1986) o se producen por especies de Streptomyces, en particular, 20 siguiendo el procedimiento de la patente de Francia Fr. 1.516.743.

Los compuestos de f6rmula (V') pueden obtenerse a partir de compuestos correspondientes de f6rmula (VII):

(VII) HO-An-T"-A'n'-OH

en la que A, A', n, n' son como se han definido en la f6rmula (I), T'' es un grupo precursor opcionalmente protegido de T'.

Esta reacci6n se realiza generalmente en presencia de PPh3 y CHal4.

De acuerdo con un tercer aspecto, el proceso de preparaci6n del compuesto de f6rmula (I) comprende la etapa de ciclar el compuesto correspondiente de f6rmula (VIII):

donde Y, Y', X, A, A', X', m, n, m', n', R1, R2, R1', R2', T se definen como en la f6rmula (I). En general, esta reacci6n 10 se realiza en presencia de un reactivo tal como hidrosulfito s6dico (Na2S2O4), en un disolvente apropiado tal como una mezcla de THF y agua, seguido de la adici6n de metanol y AcCl.

El compuesto de f6rmula (VIII) puede obtenerse a partir del compuesto correspondiente de f6rmula (IX):

en la que Y, Y', A, A', n, n', R1, R2, R1', R2', T se definen como en la f6rmula (I). En general, esta reacci6n se realiza 15 en presencia de un reactivo tal como DIBAL-H en un disolvente apropiado, tal como tolueno.

El compuesto de f6rmula (IX) puede obtenerse por acoplamiento de los compuestos correspondientes de f6rmula (X) y (XI):

en la que Y, Y', A, A', n, n', R1, R2, R1', R2', T se definen como en la f6rmula (I). En general, esta reacci6n se realiza mediante la adici6n a (X) de un reactivo tal como cloruro de oxalilo en un disolvente apropiado, tal como DMF, seguido de adici6n de (XI) en un disolvente apropiado, tal como THF.

A continuaci6n se da un esquema representativo:

Las reacciones anteriores pueden realizarse por el especialista aplicando o adaptando los metodos ilustrados en los ejemplos de ahora en adelante.

Ademas, el proceso de la invenci6n tambien puede comprender la etapa adicional de aislar el compuesto de f6rmula

10 (I) y (II). Esto puede realizarse por el especialista mediante cualquiera de los medios convencionales conocidos, tales como los metodos de recuperaci6n descritos anteriormente.

Los productos de partida estan disponibles en el mercado o pueden obtenerse aplicando o adaptando cualquiera de los metodos conocidos o los descritos en los ejemplos.

La sfntesis tambien puede realizarse en un recipiente como una reacci6n multicomponente.

15 De acuerdo a un aspecto adicional, la presente invenci6n se refiere a una molecula conjugada que comprende al menos un derivado de tomaimicina unido covalentemente a un agente de uni6n a celula a traves de un grupo enlazador, en donde dicho derivado de tomaimicina es de f6rmula (I'):

donde ----representa un enlace sencillo opcional; representa bien un enlace sencillo o un enlace doble;

•: B y B' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre alquilo opcionalmente sustituido con uno o mas de Hal, CN, NRR', CF3, OR, Arilo, Het, S(O)qR

Preferiblemente, B=B'.

Mas preferiblemente, B=B'= =CH2 o =CH-CH3,

X=X'=O.

• A, A' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre Alquilo o Alquenilo opcionalmente sustituido con uno o mas de Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR, Arilo, Het, Alquilo, Alquenilo.

Preferiblemente, A=A'.

Mas preferiblemente, A=A'=alquilo lineal no sustituido.

• Y, Y' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre H, OR;

Preferiblemente Y=Y'.

Mas preferiblemente y=Y'=OAlquilo, mas preferiblemente OMetilo.

• T es -NR-, o un arilo o heteroarilo de 4 a 10 miembros, todos opcionalmente sustituidos con uno o mas de Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR, Alquilo, y sustituidos con uno o mas enlazador(es).

El conjugado se describe en las reivindicaciones 12-15.

Cuando el grupo de uni6n es un grupo que contiene tiol-, sulfuro o disulfuro, la cadena lateral que tiene el grupo tiol

o disulfuro puede ser lineal o ramificada, aromatica o heterocfclica. Los especialistas en la materia pueden identificar facilmente cadenas laterales adecuadas. Los sustituyentes que contienen tiol-, sulfuro- o disulfuro- incluyen -(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ', -(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)y(OCH2CH2)ySZ', -(CR13R14)t(NR19CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)y SZ', -(CR13R14)t(OCO)(R15R16)u(OCH2CH2)ySZ', -(CR13R14)t(CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ', -(CR13R14)t(CONR19)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ', -(CR13R14)t-fenil-CO(CR15R16)uSZ', -(CR13R14)t-furil-CO(CR15R16)uSZ', -(CR13R14)t-oxazolil-CO(CR15R16)uSZ', -(CR13R14)t-tiazolil-CO(CR15R16)uSZ', -(CR13R14)t-tienil-CO(CR15R16)uSZ', -(CR13R14)t-imidazolil-CO(CR15R16)uSZ',

-(CR13R14)t-morfolino-CO(CR15R16)uSZ', -(CR13R14)tpiperazino- CO(CR15R16)USZ', -(CR13R14)t-N-metilpiperazin-CO(CR15R16)uSZ',

-(CR13R14)t-fenil-QSZ', -(CR13R14)t-furil-QSZ', -(CR13R14)t-oxazolil-QSZ', -(CR13R14)t-tiazolil-QSZ', -(CR13R14)t-tienil-QSZ', -(CR13R14)t-imidazolil- QSZ', -(CR13R14)t-morfolino-QSZ', -(CR13R14)t-piperazino-QSZ', -(CR13R14)t-N-metilpiperazino-QSZ', o

-: CO(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)y SZ',

-CO-(CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ',

-: CONR12(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)ySZ',

-: NR19(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ',

-: NR19CO(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ',

-: NR19(CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)t (OCH2CH2)ySZ',

-: NR19CO(CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)ySZ',

-: NR19CONR12(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)ySZ',

-: NR19CO NR12 (CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)t (OCH2CH2)ySZ',

-NR19CO-fenil-QSZ', -NR19CO-furil-QSZ', -NR19CO-oxazolil-QSZ', -NR19CO-tiazolil-QSZ', -NR19CO-tienil-QSZ', -NR19CO-imidazolil-QSZ', -NR19CO-morfolino-QSZ', -NR19CO-piperazino-QSZ', -NR19COpiperidino-QSZ', -NR19CO-N-metilpiperazino-QSZ', -NR19-fenil-QSZ', -NR19-furil-QSZ', -NR19-oxazolil-QSZ', -NR19- tiazolil-QSZ', -NR19-tienil-QSZ', -NR19-imidazolil-QSZ', -NR19- morfolino-QSZ', -NR19-piperazino-QSZ', -NR19-piperidino-QSZ', -NR19-N-metilpiperazino-QSZ', -NR19CO-NR12-fenil-QSZ', -NR19CO-NR12-oxazolil-QSZ', -NR19CO-NR12- tiazolil-QSZ', -NR19CO-NR12-tienil-QSZ', -NR19CO-NR12-piperidino-QSZ',

-: S(O)q(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ',

-: S(O)q(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)ySZ',

-: SCONR12(CR13R14)tCR15R16)u (OCH2CH2)ySZ',

espaciador de polietilenglicol con 2 a 20 unidades de repetici6n etileno oxi;

•: n, n', iguales o diferentes son 0 o 1, y n=n'=1.

•: q es 0, 1 o 2.

R, R' son iguales o diferentes y se seleccionan independientemente de H, Alquilo, Arilo, opcionalmente sustituido con Hal, CN, NRR', CF3, OR, Arilo, Het;

o sus sales farmaceuticamente aceptables, hidratos o sales hidratadas, o las estructuras polim6rficas cristalinas de estos compuestos o sus is6meros 6pticos, racematos, diastereois6meros o enanti6meros,

estando dicho derivado unido covalentemente a un agente de uni6n a las celulas a traves de dicho enlazador.

En particular, n=n'=1.

Los agentes de uni6n a la celula pueden ser de cualquier tipo e incluyen peptidos y no peptidos. En general, pueden ser anticuerpos (especialmente anticuerpos monoclonales) o un fragmento de un anticuerpo que contenga al menos un sitio de uni6n, linfoquinas, hormonas, factores de crecimiento, moleculas de transporte de nutrientes (tales como transferrina) o cualquier otra molecula o sustancia que se une a celulas. Los ejemplos mas especfficos de agentes que se unen a celulas que se pueden usar incluyen: anticuerpos monoclonales; anticuerpos monocatenarios; fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab', F(ab')2 y Fv {Parham, 131 J. Immunol. 2.895-2.902 (1.983); Spring et al, 113 J. Immunol. 470-478 (1974); Nisonoff et al, 89 Arch. Biochem. Biophys. 230-244 (1960)}; interferones; peptidos; linfocinas tales como IL-2, IL-3, IL-4, IL-6; hormonas tales como insulina, TRH (hormonas liberadoras de tirotropina), MSH (hormona estimuladora de melanocitos), hormonas esteroideas, tales como andr6genos y estr6genos; factores de crecimiento y factores estimuladores de colonias tales como EGF, TGFa, factor de crecimiento de tipo insulina (IGF-I, IGF-II) G-CSF, M-CSF y GM-CSF {Burgess, 5 Immunology Today 155-158 (1.984)}; vitaminas, tales como folato y transferrina {O'Keefe et al, 260 J. Biol. Chem. 932-937 (1.985)}.

La tecnologfa de los anticuerpos monoclonales permite la producci6n de agentes que se unen a celulas extremadamente selectivos en forma de anticuerpos monoclonales especfficos. Son particularmente bien conocidas en la tecnica las tecnicas para crear anticuerpos monoclonales producidos por inmunizaci6n de ratones, ratas, hamsteres o cualquier otro mamffero con el antfgeno de interes tal como la celula diana intacta, antfgenos aislados a partir de la celula diana, virus enteros, virus enteros atenuados y protefnas virales tales como protefnas de la cubierta viral.

La selecci6n del agente que se une a celulas apropiado se elige dependiendo de la poblaci6n celular particular que se vaya a fijar como diana, pero en general se prefieren los anticuerpos monoclonales si esta disponible uno apropiado.

Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal MY9 es un anticuerpo IgG1 murino que se une especfficamente al antfgeno CD33 {J. D. Griffin et al 8 Leukemia Res., 521 (1984)} y puede usarse si las celulas diana expresan CD33 como en la enfermedad de la leucemia miel6gena aguda (AML). De manera similar, el anticuerpo monoclonal anti-B4 es una IgG1 murina que se une al antfgeno CD19 en celulas B {Nadler et al, 131 J. Immunol. 244-250 (1983)} y puede usarse si las celulas diana son celulas B o celulas enfermas que expresan este antfgeno tal como en linfoma no-Hodgkin o leucemia linfoblastica cr6nica.

Ademas, GM-CSF que se une a las celulas mieloides puede usarse como agente que se une a celulas para unirse a celulas enfermas de la leucemia miel6gena aguda. IL-2, que se une a celulas T activadas, puede usarse para la prevenci6n del rechazo de injertos trasplantados, para la terapia y prevenci6n de la enfermedad de injerto contra el anfitri6n y para el tratamiento de la leucemia aguda de celulas T. MSH, que se une a los melanocitos, puede usarse para el tratamiento de melanoma.

Las moleculas conjugadas de la invenci6n pueden formarse usando cualquier tecnica. Preferiblemente, los derivados se sintetizan de manera que contengan un grupo tiol libre o protegido, y despues uno o mas derivados que contienen disulfuro o tiol se unen covalentemente al agente de uni6n a las celulas a traves de un enlace disulfuro o un enlace tioeter.

En los documentos USP 5.416.064 y USP 5.475.092 se describen numerosos metodos de conjugaci6n. Mas preferiblemente, los derivados de tomaimicina se tratan para crear un grupo tiol libre o protegido y luego los derivados de tomaimicina que contienen disulfuro o tiol se unen al agente de uni6n a la celula mediante enlaces disulfuro.

Son conjugados representativos de la invenci6n anticuerpo-derivado de tomaimicina, fragmento de anticuerpoderivado de tomaimicina, factor de crecimiento epidermico (EGF, por sus siglas en ingles)-derivado de tomaimicina, hormona estimuladora de melanocitos (MSH, por sus siglas en ingles)-derivado de tomaimicina, hormona estimuladora del tiroides (TSH, por sus siglas en ingles)-derivado de tomaimicina, estr6geno-derivado de tomaimicina, analogo de estr6geno-derivado de tomaimicina, andr6geno-derivado de tomaimicina, analogo de andr6geno-derivado de tomaimicina y folato-derivado de tomaimicina.

Los conjugados de derivado de tomaimicina y anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, hormonas proteicas o peptfdicas, factores de crecimiento proteicos o peptfdicos y otras protefnas se obtienen de la misma manera por metodos conocidos. Por ejemplo, los peptidos y anticuerpos se pueden modificar con reactivos de entrecruzamiento, tales como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo, 4-(2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP), 4-succinimidil-oxicarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)-tolueno (SMPT), butirato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SDPB), butirato de N-sulfosuccinimidil-3-(2-(5-nitro-piridilditio) (SSNPB), 2-iminotiolano o anhfdrido S-acetilsuccfnico por metodos conocidos. Veanse, Carlsson et al., 173 Biochem. J. 723-737 (1978); Blattler et al., 24 Biochem. 1517-1524 (1985); Lambert et al., 22 Biochem. 3913-3920 (1983); Klotz et al., 96 Arch. Biochem. Biophys. 605 (1962); y Liu et al., 18 Biochem. 690 (1979), Blakey y Thorpe, 1 Antibody, Immunoconjugates & Radiopharmaceuticals, 1-16 (1988), Worrell et al. 1 Anti-Cancer Drug Design 179-184 (1986). El agente de uni6n a la celula que contiene tiol libre o protegido obtenido de esta forma posteriormente se hace reaccionar con un derivado de tomaimicina que contiene disulfuro o tiol para producir los conjugados. Los conjugados se pueden purificar por HPLC o por filtraci6n en gel.

Preferiblemente, los conjugados derivado de tomaimicina-anticuerpo monoclonal o derivado de tomaimicina-agente de uni6n a las celulas son los que estan unidos mediante un enlace disulfuro, como se ha indicado anteriormente, que son capaces de liberar los derivados de tomaimicina. Tales conjugados de uni6n a la celula se preparan por metodos conocidos, tales como por modificaci6n de los anticuerpos monoclonales con piridil-ditiopropionato de succinimidilo (SPDP) (Carlsson et al., 173 Biochem. J. 723-737 (1978)). El grupo tiopiridilo resultante despues se desplaza por tratamiento con derivados de tomaimicina que contienen tiol para producir conjugados unidos por enlaces disulfuro. Alternativamente, en el caso de los arilditio-derivados de tomaimicina, la formaci6n del conjugado de uni6n a las celulas se realiza por desplazamiento directo del aril-tiol del derivado de tomaimicina por grupos sulfhidrilo previamente introducidos en las moleculas de anticuerpo. Los conjugados que contienen de 1 a 10 farmacos de derivado de tomaimicina unidos mediante un puente disulfuro se preparan facilmente por cualquier metodo.

Mas especfficamente, se trata una disoluci6n del anticuerpo modificado por ditio-nitropiridilo a una concentraci6n de 2,5 mg/ml en disoluci6n tamp6n de fosfato potasico 0,05 M, a pH 7,5, que contiene EDTA 2 mM, con el derivado de tomaimicina que contiene tiol (1,3 eq. molares/grupo ditiopiridilo). La liberaci6n de la tio-nitropiridina del anticuerpo modificado se sigue espectrofotometricamente a 325 nm y se completa en aproximadamente 16 horas. El conjugado derivado de tomaimicina-anticuerpo se purifica y se libera del farmaco sin reaccionar y otro material de bajo peso molecular por exclusi6n molecular a traves de una columna de Sephadex G-25 o Sephacryl S300. El numero de restos de derivado de tomaimicina unidos por molecula de anticuerpo se puede determinar midiendo la relaci6n entre la absorbancia a 230 nm y a 275 nm. Por este metodo se pueden unir mediante enlaces disulfuro una media de 1-10 moleculas de derivado de tomaimicina/molecula de anticuerpo.

El efecto de la conjugaci6n sobre la afinidad de uni6n por las celulas que expresan el antfgeno se puede determinar utilizando los metodos descritos previamente por Liu et al., 93 Proc. Natl. Acad. Sci 8618-8623 (1.996). La citotoxicidad de los derivados de tomaimicina y sus conjugados de anticuerpo para lfneas celulares se puede medir por retro-extrapolaci6n de las curvas de proliferaci6n celular, como se describe en Goldmacher et al., 135 J. Immunol. 3648-3651 (1.985). La citotoxicidad de estos compuestos contra lfneas de celulas adherentes se puede determinar por ensayos clonogenicos, como se describe en Goldmacher et al., 102 J. Cell Biol. 1.312-1.319 (1.986).

Son conjugados representativos de la invenci6n los derivados de tomaimicina con anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, factor de crecimiento epidermico (EGF, por sus siglas en ingles), hormona estimuladora de melanocitos (MSH), hormona estimuladora del tiroides (TSH), estr6genos, analogos de estr6genos, andr6genos y analogos de andr6genos.

A continuaci6n se describen ejemplos representativos de la preparaci6n de diversos conjugados de derivados y agentes de uni6n a la celula.

Enlazantes disulfuro: Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal MY9 es un anticuerpo IgG1 murino que se une especfficamente al antfgeno CD33 {J. D. Griffin et al 8 Leukemia Res., 521 (1984)} y puede usarse si las celulas diana expresan CD33 como en la enfermedad de la leucemia miel6gena aguda (AML). De manera similar, el anticuerpo monoclonal anti-B4 es una IgG1 murina que se une al antfgeno CD19 en celulas B {Nadler et al, 131 J. Immunol. 244-250 (1983)} y puede usarse si las celulas diana son celulas B o celulas enfermas que expresan este antfgeno tal como en linfoma no-Hodgkin o leucemia linfoblastica cr6nica.

El anticuerpo u otro agente de uni6n a las celulas se modifica con N-succinimidil-3-piridilditio propionato como se ha descrito previamente {J. Carlsson, H. Drevin & R. Axen, Biochem. J., 173:723 (1978)} para introducir, en promedio, 4 grupos piridilditio por molecula de anticuerpo. El anticuerpo modificado se hace reaccionar con el derivado que contiene tiol para producir un conjugado unido por enlaces disulfuro.

Alternativamente, los conjugados se pueden preparar por aplicaci6n y/o adaptaci6n del metodo descrito en el documento de patente WO2004/103272.

Enlazadores tioeter: Los derivados que contienen tiol de la presente invenci6n pueden unirse a anticuerpos y otros agentes que se unen a celulas a traves de un enlace tioeter como se ha descrito previamente (Pat. EEUU No 5.208.020). El anticuerpo u otro agente de uni6n a celulas puede modificarse con el compuesto disponible comercialmente tal como N-succinimidil-4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato (SMCC), N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato), que es un analogo de "cadena larga" de SMCC (LC-SMCC). Estos reactivos de entrecruzamiento forman enlazadores no escindibles derivados de restos basados en maleimido.

Los reactivos de entrecruzamiento que comprenden un resto basado en haloacetilo incluyen 4-(yodoacetil)aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB), yodoacetato de N-succinimidilo (SIA), bromoacetato de N-succinimidilo (SBA) y 3-(bromo-acetamido)propionato de N-succinimidilo (SBAP). Estos reactivos de entrecruzamiento forman enlazantes no escindibles procedentes de restos basados en haloacetilo.

Los conjugados preparados por los metodos anteriores pueden purificarse por tecnicas de cromatograffa convencionales tales como exclusi6n por tamano, cromatograffa de adsorci6n incluyendo, pero no limitandose a, intercambio i6nico, cromatograffa de interacci6n hidr6foba, cromatograffa de afinidad, cromatograffa sobre hidroxiapatito ceramico o en Porapak o por HPLC. Tambien puede usarse la purificaci6n por dialisis o diafiltraci6n.

Preferiblemente, los conjugados entre anticuerpos monoclonales o agentes de uni6n a las celulas y derivados de la presente invenci6n son los que se unen a traves de un enlace disulfuro, como se ha descrito anteriormente. Tales conjugados de uni6n a la celula se preparan por metodos conocidos, tales como por modificaci6n de los anticuerpos monoclonales con piridil-ditiopropionato de succinimidilo (SPDP) {Carlsson et al., 173 Biochem. J. 723-737 (1978)}. El grupo tiopiridilo resultante se desplaza luego por tratamiento con un derivado que contiene tiol para producir conjugados enlazados por disulfuro. Por este metodo se preparan facilmente conjugados que contienen de 1 a 10 derivados a traves de un puente disulfuro. La conjugaci6n por este metodo se describe con detalle en la Pat. EEUU 5.585.499, que se incorpora por referencia.

De acuerdo con un aspecto preferido, el agente de uni6n a la celula es un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal.

De acuerdo con otro aspecto preferido, el agente de uni6n a las celulas es un fragmento de anticuerpo con especificidad de antfgeno, tal como sFV, Fab, Fab', o F(ab')2.

De acuerdo con otro objetivo, la presente invenci6n tambien se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden una molecula conjugada de la invenci6n o un compuesto de f6rmula (I) como se ha definido anteriormente, junto con un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

De acuerdo con otro objetivo, la presente invenci6n tambien se refiere a un metodo para destruir o inhibir el crecimiento de celulas, preferiblemente poblaciones celulares seleccionadas, que comprende poner en contacto celulas diana o tejidos que contienen celulas diana con una cantidad eficaz de la composici6n farmaceutica de acuerdo con la invenci6n.

La poblaci6n celular seleccionada consiste en celulas cancerosas y/o proliferativas.

De acuerdo con la presente invenci6n, "tratamiento selectivo de canceres" se refiere a la destrucci6n de celulas cancerosas y/o proliferativas sustancialmente sin destruir celulas normales y/o no proliferativas.

De acuerdo con otro objetivo, la presente invenci6n tambien se refiere al uso de una molecula conjugada de la invenci6n o un compuesto de f6rmula (I) como se ha definido anteriormente, para la preparaci6n de un medicamento para el tratamiento de canceres.

El metodo para inhibir el crecimiento de poblaciones celulares seleccionadas puede ponerse en practica in vitro, o ex vivo.

Los ejemplos de usos in vitro incluyen tratamientos de cultivos celulares para destruir todas las celulas excepto variantes deseadas que no expresen el antfgeno diana o para destruir las variantes que expresen un antfgeno no deseado.

Las condiciones de uso in vitro no clfnico se determinan facilmente por el experto en la tecnica.

Los ejemplos de usos ex vivo incluyen tratamientos de medula 6sea aut6loga antes de su trasplante en el mismo paciente para destruir celulas enfermas o malignas; tratamientos de medula 6sea antes de su trasplante para destruir celulas T competentes y prevenir la enfermedad de injerto contra el anfitri6n (GVHD).

El tratamiento ex vivo clfnico para eliminar celulas tumorales o celulas linfoides de medula 6sea antes del trasplante aut6logo en el tratamiento de cancer o en el tratamiento de enfermedad autoinmune o para eliminar celulas T y otras celulas linfoides de medula 6sea o de tejido alogenico antes del trasplante para prevenir la GVHD, puede realizarse

como se indica a continuaci6n. Se recoge medula 6sea del paciente u otro individuo y despues se incuba en un medio que contiene suero al que se anade el agente citot6xico de la invenci6n, en un intervalo de concentraciones de aproximadamente 10 IM a 1 pM, durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas a aproximadamente 37°C. Las condiciones exactas de concentraci6n y tiempo de incubaci6n (= dosis) se determinan facilmente por el experto en la tecnica. Despues de la incubaci6n,las celulas de la medula 6sea se lavan con medio que contiene suero y se devuelven al paciente por infusi6n i.v. segun metodos conocidos. En circunstancias en las que el paciente recibe otro tratamiento tal como un curso de quimioterapia ablativa o irradiaci6n de todo el cuerpo entre el momento de la recolecci6n de la medula y la reinfusi6n de las celulas tratadas, las celulas de medula 6sea tratadas se conservan congeladas en nitr6geno lfquido usando un equipo medico estandar.

Para uso in vivo clfnico, el agente citot6xico de la invenci6n se suministrara como disoluciones que se ensayan con respecto a la esterilidad y con respecto a los niveles de endotoxinas o como un s6lido liofilizado que puede redisolverse en agua esteril para inyecci6n. A continuaci6n se proporcionan ejemplos de protocolos adecuados de administraci6n de conjugados. Los conjugados se administran semanalmente durante 6 semanas como un bolo i.v. Las dosis de bolo se administran en 50 a 400 ml de disoluci6n salina normal a la que puede anadirse albumina de suero humano (por ej., de 0,5 a 1 ml de una disoluci6n concentrada de albumina de suero humano, 100 mg/ml). Las dosificaciones seran de aproximadamente 50 Ig a 10 mg/kg de peso corporal por semana, i.v. (intervalo de 10 Ig a 100 mg/kg por inyecci6n). Seis semanas despues del tratamiento, el paciente puede recibir un segundo tratamiento. El experto en la tecnica puede determinar los protocolos clfnicos especfficos con respecto a la ruta de administraci6n, excipientes, diluyentes, dosificaciones, tiempos, etc., cuando lo justifique la situaci6n clfnica.

Los ejemplos de condiciones medicas que pueden tratarse de acuerdo con los metodos in vivo o ex vivo de destrucci6n de poblaciones celulares seleccionadas incluyen tumor maligno de cualquier tipo incluyendo, por ejemplo, cancer de pulm6n, mama, colon, pr6stata, rin6n, pancreas, ovarios y 6rganos linfaticos; melanomas; enfermedades autoinmunes, tales como lupus sistemico, artritis reumatoide y esclerosis multiple; rechazos de injerto tales como rechazo de trasplante renal, rechazo de trasplante hepatico, rechazo de trasplante pulmonar, rechazo de trasplante cardfaco y rechazo de trasplante de medula 6sea; enfermedad del injerto frente al anfitri6n; infecciones vfricas tales como infecci6n por CMV, infecci6n por VIH, SIDA etc.; infecci6n bacteriana e infecciones parasitarias tales como giardiasis, amebiasis, esquistosomiasis y otras, como determine un experto en la tecnica.

La identificaci6n de los pacientes que necesitan tratamiento de las enfermedades y afecciones descritas en este documento esta bien dentro de la capacidad y conocimiento del especialista en la tecnica. Un veterinario o un medico especialistas en la tecnica pueden identificar facilmente, por medio del uso de ensayos clfnicos, examen ffsico, historia medica/familiar o ensayos biol6gicos y diagn6sticos, los sujetos que necesitan dicho tratamiento.

Una cantidad terapeuticamente eficaz puede determinarse facilmente por el medico a cargo del caso, como especialista en la materia, por medio del uso de tecnicas convencionales y observando los resultados obtenidos en circunstancias analogas. Para determinar la cantidad terapeuticamente eficaz, el medico a cargo del diagn6stico considera varios factores que incluyen, pero no se limitan a: la especie de sujeto; su tamano, edad y salud general; la enfermedad especffica implicada; el grado de complicaci6n o la gravedad de la enfermedad; la respuesta del sujeto individual; el compuesto particular administrado; el modo de administraci6n; las caracterfsticas de biodisponibilidad de la preparaci6n administrada; el regimen posol6gico seleccionado; el uso de medicaci6n concomitante; y otras circunstancias relevantes.

La cantidad de un compuesto de f6rmula (I) o conjugado que se requiere para conseguir el efecto biol6gico deseado variara dependiendo de varios factores que incluyen las caracterfsticas qufmicas (por ejemplo, hidrofobia) de los compuestos empleados, la potencia de los compuestos, el tipo de enfermedad, la especie a la que pertenece el paciente, el estado de enfermedad del paciente, la vfa de administraci6n, la biodisponibilidad del compuesto por la vfa elegida, todos los factores que dictan las cantidades de dosificaci6n requeridas, la liberaci6n y el regimen que se va a administrar.

"Farmaceuticamente" o "farmaceuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacci6n adversa, alergica u otra reacci6n desfavorable cuando se administran a un animal o a un ser humano, segun sea apropiado.

Como se usa en este documento, "excipiente farmaceuticamente aceptable" incluye cualquier soporte, diluyente, adyuvante o vehfculo, tales como agentes conservantes o antioxidantes, cargas, agentes disgregantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensi6n, disolventes, medios de dispersi6n, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isot6nicos y para retrasar la absorci6n y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmaceuticas activas es bien conocido en la tecnica. Excepto en la medida en que algun medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se considera su uso en las composiciones terapeuticas. En las composiciones tambien pueden incorporarse ingredientes activos suplementarios como combinaciones terapeuticas adecuadas.

En el contexto de la invenci6n, el termino "tratar" o "tratamiento", como se usa en este documento, significa invertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir el trastorno o la afecci6n a la que se aplica tal termino, o uno o mas sfntomas de dicho trastorno o afecci6n.

"Cantidad terapeuticamente eficaz" significa una cantidad de un compuesto/medicamento de acuerdo con la presente invenci6n eficaz para prevenir o tratar el estado patol6gico al que se hace referencia en este documento.

De acuerdo con la invenci6n, el termino "paciente" o "paciente que lo necesita" pretende hacer referencia a un animal o un ser humano que padece o que probablemente padecera uno de los estados patol6gicos a los que se hace referencia en este documento. Preferiblemente, el paciente es un ser humano.

En terminos generales, los compuestos de esta invenci6n pueden proporcionarse en una disoluci6n acuosa de tamp6n fisiol6gico que contiene de 0,1 a 10 � p/v de compuesto para administraci6n parenteral. Los intervalos de las dosis tfpicas son de 1 Ig/kg a 0,1 g/kg de peso corporal al dfa; un intervalo de dosis preferido es de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal al dfa o una dosis equivalente en un nino. La dosificaci6n preferida de farmaco a administrar probablemente dependera de variables tales como el tipo y grado de progresi6n de la enfermedad o trastorno, el estado de salud general del paciente particular, la eficacia biol6gica relativa del compuesto seleccionado, la formulaci6n del compuesto, la vfa de administraci6n (intravenosa, intramuscular u otra), las propiedades farmacocineticas del compuesto por la vfa de administraci6n elegida y la velocidad (embolada o infusi6n continua) y el programa de administraci6n (numero de repeticiones en un periodo de tiempo dado).

Los compuestos de la presente invenci6n tambien pueden administrarse en formas de dosificaci6n unitarias, donde el termino "dosis unitaria" significa una sola dosis que puede administrarse a un paciente, y que puede manipularse y envasarse facilmente, permaneciendo como una dosis unitaria ffsica y qufmicamente estable que comprende el propio compuesto activo, o como una composici6n farmaceuticamente aceptable, como se describe mas adelante en este documento. Como tales, los intervalos tfpicos de las dosis diarias totales son de 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal. A modo de pauta general, las dosis unitarias para los seres humanos varfan de 1 mg a 3000 mg al dfa. Preferiblemente, el intervalo de dosis unitaria es de 1 a 500 mg administrados de una a seis veces al dfa, e incluso mas preferiblemente de 10 mg a 500 mg una vez al dfa. Los compuestos proporcionados en este documento pueden formularse en composiciones farmaceuticas por medio de su mezcla con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. Estas composiciones de dosis unitarias pueden prepararse para uso por administraci6n oral, particularmente en forma de comprimidos, capsulas sencillas o capsulas de gel blando; o por vfa intranasal, particularmente en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles; o por vfa dermica, por ejemplo, t6picamente o en pomadas, cremas, lociones, geles o pulverizaciones, o por medio de parches transdermicos.

Las composiciones pueden administrarse convenientemente en forma de dosificaci6n unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los metodos bien conocidos en la tecnica farmaceutica, por ejemplo, como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed.; Ed. Gennaro, A. R.; Lippincott Williams & Wilkins: Filadelfia, PA, 2.000.

Las formulaciones preferidas incluyen composiciones farmaceuticas en las que un compuesto de la presente invenci6n se formula para administraci6n oral o parenteral.

Para la administraci6n oral, los comprimidos, pfldoras, polvos, capsulas, trociscos y similares pueden contener uno o mas de cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina o goma de tragacanto; un diluyente tal como almid6n o lactosa; un disgregante tal como almid6n y derivados de celulosa; un lubricante tal como estearato de magnesio; un agente deslizante tal como di6xido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta o salicilato de metilo. Las capsulas pueden estar en forma de una capsula dura o una capsula blanda, que generalmente se preparan a partir de mezclas de gelatina opcionalmente combinadas con plastificantes, asf como una capsula de almid6n. Ademas, Las formas de dosificaci6n unitarias pueden contener otros diversos materiales que modifican la forma ffsica de la unidad de dosificaci6n, por ejemplo, recubrimientos de azucar, goma laca o agentes entericos. Otras formas de dosificaci6n orales tales como jarabes o elixires pueden contener agentes edulcorantes, conservantes, tintes, colorantes y aromatizantes. Ademas, los compuestos activos pueden incorporarse en preparaciones y formulaciones de disoluci6n rapida, de liberaci6n modificada o de liberaci6n sostenida, siendo preferiblemente dichas formulaciones de liberaci6n sostenida bimodales. Los comprimidos preferidos contienen lactosa, almid6n de mafz, silicato de magnesio, croscarmelosa s6dica, povidona, estearato de magnesio o talco en cualquier combinaci6n.

Las preparaciones lfquidas para administraci6n parenteral incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones, acuosas o no acuosas, esteriles. Las composiciones lfquidas tambien pueden incluir agentes aglutinantes, tampones, conservantes, agentes quelantes, edulcorantes, aromatizantes y colorantes y similares. Los disolventes no acuosos incluyen: alcoholes, propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y esteres organicos tales como oleato de etilo. Los vehfculos acuosos incluyen mezclas de alcoholes y agua, medios tamponados y disoluci6n salina. En particular, pueden ser excipientes utiles para controlar la liberaci6n de los compuestos activos, los polfmeros biocompatibles y biodegradables de lactida, copolfmeros de lactida/glicolida o copolfmeros de polioxietileno -polioxipropileno. Los vehfculos intravenosos pueden incluir fluidos y agentes para reponer nutrientes, agentes para reponer electr6litos tales como los basados en dextrosa de Ringer y similares. Otros sistemas de liberaci6n parenteral que podrfan ser utiles para estos compuestos activos incluyen partfculas de copolfmero de etileno-acetato de vinilo, bombas osm6ticas, sistemas de infusi6n implantables y liposomas.

Los modos alternativos de administraci6n incluyen formulaciones para inhalaci6n, que incluyen medios tales como polvo seco, aerosol o gotas. Pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo, polioxietileno-9-lauril eter, glicocolato y desoxicolato, o soluciones oleosas para administraci6n en forma de gotas nasales, o como un gel para aplicaci6n intranasal. Las formulaciones para administraci6n bucal incluyen, por ejemplo, grageas o pastillas y tambien pueden incluir una base aromatizada, tal como sacarosa y goma arabiga, y otros excipientes tales como glicocolato. Las formulaciones adecuadas para administraci6n rectal preferiblemente se presentan como supositorios de una sola dosis, con un vehfculo s6lido, tal como manteca de cacao, y pueden incluir un salicilato. Las formulaciones para aplicaci6n t6pica a la piel preferiblemente toman la forma de una pomada, crema, loci6n, pasta, gel, pulverizaci6n, aerosol o aceite. Los vehfculos que pueden usarse incluyen parafina, lanolina, polietilenglicoles, alcoholes o sus combinaciones. Las formulaciones adecuadas para administraci6n transdermica pueden presentarse como parches discretos y pueden ser emulsiones lip6filas o soluciones acuosas tamponadas, disueltas y/o dispersas en un polfmero o un adhesivo.

La invenci6n se ilustra adicionalmente pero sin restricci6n por la descripci6n de los siguientes ejemplos.

Parte experimental

• Metodo A1: Cromatografia Liquida de Alta Presion -Espectrometria de Masas (LCMS)

Se usa un software Micromass MassLynx y el analisis se realiza en un HPLC Agilent 1100 series con una columna THERMO Hypersil Gold C18 de 3 Im (50 x 3 mm) usando un gradiente de eluci6n con una mezcla de (A) acetonitrilo y (B) agua/acido f6rmico al 0,1� (gradiente: 5� de A: 95� de B hasta 95� de A: 5� de B durante 5 minutos, 95� de A: 5� de B durante 0,5 minutos, 95� de A: 5� de B disminuyendo a 5� de A: 95� de B durante 1 minuto, 5� de A: 95� de B durante 0,5 minutos) con un caudal de 0,8 ml/minuto; espectr6metro Waters-Micromass Plataforma I, Plataforma II o ZQ con Electronebulizaci6n (aislamiento positivo y negativo); Serie de Diodos en lfnea (190-490 nm); detector auxiliar Sedere (France) Model SEDEX 65 Evaporative Light Scattering (ELS) detector.

• Metodo A2: Cromatografia Liquida de Alta Presion -Espectrometria de Masas (LCMS)

Se usa un software Micromass MassLynx y el analisis se realiza en un HPLC Waters Alliance con una columna WATERS XBridge C18 de 3,5 Im (100 x 3 mm) usando un gradiente de eluci6n con una mezcla de (A) metanol y (B) agua/acido f6rmico al 0,1� (gradiente: 5� de A: 95� de B hasta 95� de A: 5� de B durante 10 minutos, 95� de A: 5� de B disminuyendo a 5� de A: 95� de B durante 1 minuto, 5� de A: 95� de B durante 2 minutos) con un caudal de 1,1 ml/minuto; espectr6metro Waters-Micromass Plataforma II con Electronebulizaci6n (ionizaci6n positiva y negativa); Serie de Diodos en lfnea (190-500 nm); detector auxiliar Sedere (Francia) detector Evaporativo de Luz Dispersa (ELS) Modelo SEDEX 85.

•Metodo B: Purificacion por Cromatografia Liquida a Alta Presion (HPLC)

La purificaci6n por HPLC se realiz6 sobre una columna Macherey Nagel Nucleodur C18 Gravity 5 IM (21 x 100 mm, numero de catalogo 762101), eluyendo con una mezcla de (A) acetonitrilo y (B) agua (gradiente: 5� de A: 95� de B durante 5 minutos, 5� de A: 95� de B hasta 100� de A durante 20 minutos, 100� de A durante 8 minutos, de 100� de A a 5� de A: 95� de B durante 1 minuto, 5� de A: 95� de B durante 11 minutos) con un caudal de 15 ml/minuto (Metodo B1) o 20 ml/minuto (Metodo B2).

-: Metodo C: Espectros de masas por Ionizacion con Electrones (EI)

Los espectros de masas se registraron usando un espectr6metro de masas Finnigan SSQ 7000 (modo EI: 70 eV, temperatura de la fuente = 150°C, introducci6n directa)

•Metodo D: Espectros de masas por Ionizacion Quimica (Cl)

Los espectros de masas por IQ se registraron usando un espectr6metro de masas Finnigan SSQ 7000 (amoniaco)

•Metodo E: Espectro de Resonancia Magnetica Nuclear de 1H (RMN)

Los espectros de 1H RMN se registraron en un espectr6metro Bruker Avance Drx-500, un espectr6metro Bruker Avance Drx-400 o un espectr6metro A Bruker Avance DRX-300.

• Ejemplo 1: 8,8'-[1,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5Hpirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] (este compuesto no esta reivindicado).

Se anadieron carbonato potasico (22,8 mg), a,a'-dibromo-m-xileno (7,3 mg) y yoduro potasico (9,1 mg) a una disoluci6n agitada de tomaimicina (15 mg) en dimetilformamida (0,5 ml). La reacci6n se agit6 durante 20 h a 30°C.

Los s6lidos se retiraron por filtraci6n, se lavaron dos veces con dimetilformamida (0,2 ml) y despues se desecharon. A la segunda disoluci6n de dimetilformamida se le anadi6 agua (0,4 ml) y la disoluci6n resultante se inyect6 para purificaci6n por HPLC de acuerdo con el metodo B1. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron por evaporaci6n centrffuga sobre un aparato Jouan Model RC10.10 para producir 8,8'-[1,3bencenodiilbis(metilenooxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona] en forma de un polvo blanco (3,33 mg):

LC/MS (Metodo A1, Plataforma II):: ES : m/z = 647 MH+

Tiempo de retenci6n = 3,53 minutos

1H R.M.N. (500 MHz, CDCl3-d1, < en ppm):1,75 (d, J = 7,0 Hz, 6H);2,96 (m, 4H) ;3,89 (m, 2H) ;3,96 (s, 6H);4,27 (s ancho, 4H) ; 5,17 (d, J = 12,5 Hz, 2H) ; 5,23 (d, J = 12,5 Hz, 2H) ; 5,60 (m, 2H) ; 6,85 (s, 2H) ; de 7,36 a 7,43 (m, 3H); 7, 51 (s ancho, 1H); 7,53 (s, 2H) ; 7,63 (d, J = 4,5 Hz, 2H).

• Ejemplo 2: 8,8'-[5-metoxi-1,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] (este compuesto no esta reivindicado).

Puede prepararse 8,8'-[5-metoxi-1,3-bencenodiilbis(metilenooxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] siguiendo el procedimiento para la preparaci6n de 8,8'-[1,3bencenodiilbis(metilenooxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona] (Ejemplo 1), partiendo de 1,3-bis-bromometil-5-metoxi-benceno:

LC/MS (Metodo A1, Plataforma II):: ES : m/z = 677 MH+

Tiempo de retenci6n = 4,17 minutos

1H R.M.N. (300 MHz, CDCl3-d1, < en ppm) : 1,75 (d, J = 7,0 Hz, 6H) ; 2,96 (m, 4H) ; 3,81 (s, 3H) ; 3,89 (m, 2H) ; 3,96 (s, 6H) ; 4,26 (s ancho, 4H) ; 5,14 (d, J = 12,5 Hz, 2H) ; 5,21 (d, J = 12,5 Hz, 2H) ; 5,60 (m, 2H) ; 6,82 (s, 2H) ; 6,95 (s ancho, 2H) ; 7,07 (s ancho, 1H) ; 7,53 (s, 2H) ; 7,63 (d, J = 4,5 Hz, 2H).

Puede prepararse 1,3-bis-bromometil-5-metoxi-benceno como se indica a continuaci6n:

Se anadi6 tetrabromuro de carbono (663 mg) a una disoluci6n agitada de 1-bromometil-3-hidroximetil-5-metoxibenceno (420 mg) en diclorometano anhidro (10 ml) en una atm6sfera de arg6n. Despues de enfriar la disoluci6n resultante a 0°C, se anadi6 gota a gota una disoluci6n de trifenilfosfina (500 mg) en diclorometano anhidro (10 ml). La mezcla de reacci6n se agit6 a temperatura ambiente durante 20 h y despues se concentr6 al vacfo para dar un residuo. El residuo se purific6 por cromatograffa sobre gel de sflice (columna Merck SuperVarioFlash de 30 g, Si60

30 15-40 Im, eluyendo con diclorometano/heptano, 40:60) para dar 1,3-bis-bromometil-5-metoxi-benceno (170 mg):

EI (Metodo C):: m/z = 292 M+.

m/z = 213: [M -Br]+.

m/z = 134: [213 -Br]+.

Puede prepararse 1-bromometil-3-hidroximetil-5-metoxi-benceno como se indica a continuaci6n:

Se anadi6 tetrabromuro de carbono (3,47 g) a una disoluci6n agitada de 1,3-dihidroximetil-5-metoxi-benceno (800 mg) en diclorometano anhidro (16 ml) en una atm6sfera de arg6n. Despues de enfriar la disoluci6n resultante a 0°C, se anadi6 gota a gota una disoluci6n de trifenilfosfina (2,68 g) en diclorometano anhidro (16 ml). La mezcla de reacci6n se agit6 a temperatura ambiente durante 20 h y despues se concentr6 al vacfo para dar un residuo. El residuo se purific6 por cromatograffa sobre gel de sflice (columna Merck SuperVarioPrep de 90 g, Si60 15-40 Im, eluyendo con metanol/diclorometano, 4:96) para dar 1-bromometil-3-hidroximetil-5-metoxi-benceno (420 mg):

EI (Metodo C):: m/z = 230 M+.

m/z = 151: [M -Br]+.

1H R.M.N. (400 MHz, DMSO-d6, < en ppm) : 3,75 (s, 3H) ; 4,46 (d ancho, J = 5,5 Hz, 2H) ; 4,65 (s, 2H) ; 5,22 (t 10 ancho, J = 5,5 Hz, 1 H) ; 6,83 (s ancho, 1 H) ; 6,88 (s ancho, 1 H) ; 6,97 (s ancho, 1 H)

• Ejemplo 3: 8,8'-[1,5-pentanediilbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2, 1 c][1,4]benzodiazepin-5-ona] (este compuesto no esta reivindicado)

Se anadieron carbonato potasico (22,8 mg) y 1,5-diyodopentano (8,2 Il) a una disoluci6n agitada de tomaimicina

15 (15 mg) en dimetilformamida (0,5 ml). La reacci6n se agit6 durante 20 h a temperatura ambiente y se anadi6 una porci6n adicional de carbonato potasico (8 mg). La reacci6n se agit6 durante 20 h mas a temperatura ambiente.

Los s6lidos se retiraron por filtraci6n y la disoluci6n de dimetilformamida se inyect6 para purificaci6n por HPLC de acuerdo con el metodo B2. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron por evaporaci6n centrffuga sobre un aparato Jouan Model RC10.10 para producir 8,8'-[1,5-pentanodiilbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metoxi

20 1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] en forma de un polvo blanco (4 mg):

LC/MS (Metodo A2):: ES : m/z = 613 MH+

Tiempo de retenci6n = 9,04 minutos

1H R.M.N. (500 MHz, CDCl3-d1, < en ppm) : 1,66 (m parcialmente enmascarado, 2H) ; 1,75 (d ancho, J = 7,0 Hz, 6H) ; 1,96 (m, 4H) ; 2,97 (d ancho, J = 7,0 Hz, 4H) ; 3,89 (m, 2H) ; 3,94 (s, 6H) ; 4,06 (m, 2H) ; 4,13 (m, 2H) ; 4,26 (s ancho, 4H) ; 5,60 (m, 2H) ; 6,80 (s, 2H) ; 7,50 (s, 2H) ; 7,66 (d, J = 4,5 Hz, 2H)

• Ejemplo 4: 8,8'-[1,4-butanodiilbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,125 c][1,4]benzodiazepin-5-ona] (este compuesto no esta reivindicado)

Puede prepararse 8,8'-[1,4-butanodiilbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona] siguiendo el procedimiento para la preparaci6n de 8,8'-[1,5-pentanodiilbis(oxi)]-bis[(S)-2et-(E)-ilideno-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] (Ejemplo 3), partiendo de 1,4

30 diyodobutano: 1H R.M.N. (500 MHz, CDCl3-d1, < en ppm) : 1,75 (d ancho, J = 7,0 Hz, 6H) ; 2,10 (m, 4H) ; 2,98 (d ancho, J = 7,0 Hz, 4H) ; 3,90 (m, 2H) ; 3,93 (s, 6H) ; 4,11 (m, 2H) ; 4,20 (m, 2H) ; 4,27 (s ancho, 4H) ; 5,60 (m, 2H) ; 6,82 (s, 2H) ; 7,50 (s, 2H) ; 7,66 (d, J = 4,5 Hz, 2H)

LC/MS (Metodo A1, Plataforma II):: ES : m/z = 599 MH+

m/z = 318,5 (M + H + K)2+/2

Tiempo de retenci6n = 3,23 minutos

• Ejemplo 5: 8,8'-[3-metil-1 ,5-pentanodiilbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5Hpirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] (este compuesto no esta reivindicado)

Puede prepararse 8,8'-[3-metil-1,5-pentanodiilbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5Hpirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] siguiendo el procedimiento para la preparaci6n de 8,8'-[1,3bencenodiilbis(metilenooxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1

10 c][1,4]benzodiazepin-5-ona] (Ejemplo 1), partiendo de 1,5-dibromo-3-metilpentano:

LC/MS (Metodo A1, Plataforma II):: ES : m/z = 627 MH+

Tiempo de retenci6n = 3,92 minutos

• Ejemplo 6: 8,8'-[2,6-piridindiilbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona] (este compuesto no esta reivindicado)

Puede prepararse 8,8'-[2,6-piridinadiilbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1

15 c][1,4]benzodiazepin-5-ona] siguiendo el procedimiento para la preparaci6n de 8,8'-[1,3-bencenodiilbis(metilenooxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] (Ejemplo 1), partiendo de 2,6-bis-bromometil-piridina:

LC/MS (Metodo A1, ZQ):: ES : m/z = 648 MH+

Tiempo de retenci6n = 3,21 minutos

1H R.M.N. (400 MHz, CDCl3-d1, < en ppm) : 1,75 (d ancho, J = 6,5 Hz, 6H) ; de 2,94 a 2,99 (m, 4H); 3,90 (m, 2H) ; 3,99 (s, 6H) ; 4,27 (s ancho, 4H) ; 5,32 (s, 4H) ; 5,60 (m, 2H) ; 6,86 (s, 2H) ; 7,48 (d, J = 8,0 Hz, 2H) ; 7,56 (s, 2H) ; 20 7,64 (d, J = 4,5 Hz, 2H) ; 7,74 (t, J = 8,0 Hz, 1H).

• Ejemplo 7: Puede prepararse 8,8'-[4-(3-terc-butoxicarbonilaminopropiloxi)-2,6-piridinadiilbis(metilenooxi)]bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] como se indica a continuacion:

25 A una disoluci6n agitada de tomaimicina (30 mg) en dimetilformamida (0,5 ml) se le anadieron carbonato potasico (45,7 mg), una disoluci6n de 4-(3-terc-butoxicarbonilamino-propoxi)-2,6-bis-(tosiloximetil)-piridina (41 mg) en dimetilformamida (0,5 ml) y yoduro potasico (18,3 mg). La reacci6n se agit6 durante 20 h a 30°C. Los s6lidos se retiraron por filtraci6n y se lavaron con dimetilformamida (0,2 ml). A la segunda disoluci6n de dimetilformamida se le anadi6 agua (0,5 ml) y se anadi6 acido f6rmico hasta que se produjo la completa disoluci6n del precipitado. La disoluci6n resultante se inyect6 para purificaci6n por HPLC de acuerdo con el metodo B1. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron por evaporaci6n centrffuga sobre un aparato Jouan Model RC10.10 para producir 8,8'-[4-(3-terc-butoxicarbonilaminopropiloxi)-2,6-piridindiilbis(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] (8,3 mg).

LC/MS (Metodo A1, Plataforma I):: ES : m/z = 857 MH+ + 2 H2O

m/z = 839: MH+ + H2O

m/z = 821: MH+

m/z = 721: [M-C5O2H8] + H+

Tiempo de retenci6n = 3,67 minutos

1H R.M.N. (500 MHz, CD3CO2D-d4, < en ppm) : 1,41 (s, 9H) ; 1,71 (d, J = 6,5 Hz, 6H) ; 2,08 (m, 2H) ; 2,95 (m, 4H) ; 3,34 (m, 2H) ; 3,90 (s, 6H) ; 4,06 (m, 2H) ; 4,18 (m, 2H) ; de 4,24 a 4,36 (m, 4H); 4,43 (t, J = 6,0 Hz, 2H) ; 5,50 (s 10 ancho, 4H) ; 5,61 (m, 2H) ; de 6,80 a 7,70 (m muy ancho, 2H); 6,95 (s ancho, 2H) ; de 7,48 a 7,58 (m, 4H). Puede prepararse 4-(3-terc-butoxicarbonilamino-propoxi)-2,6-bis-(tosiloximetil)-piridina como se indica a continuaci6n:

A una disoluci6n enfriada previamente (0°C) de 4-(3-terc-butoxicarbonilamino-propoxi)-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina

(76 mg) en diclorometano (0,7 ml) se le anadi6 una disoluci6n de hidr6xido potasico (30 mg) en agua (0,3 ml). Se 15 anadi6 cloruro de tosilo (93,7 mg) y la mezcla heterogenea resultante se agit6 vigorosamente durante 1 h y despues

se lav6 en un embudo de decantaci6n usando diclorometano y agua. Las capas se separaron y la capa acuosa se

extrajo tres veces con diclorometano. Las disoluciones organicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio

y se concentraron al vacfo para dar un residuo. El residuo se purific6 por cromatograffa sobre gel de sflice (columna

Interchrom Puriflash de 10 g, SiOH 15-35 Im), usando un gradiente de eluci6n con una mezcla de heptano (A) y 20 acetato de etilo (B) (gradiente: 90� de A: 10� de B hasta 50� de A: 50� de B) para dar 4-(3-terc

butoxicarbonilamino-propoxi)-2,6-bis-(tosiloximetil)piridina (56 mg):

LC/MS (Metodo A1, Plataforma I):: ES : m/z = 621 MH+

Tiempo de retenci6n = 4,90 minutos

Puede prepararse 4-(3-terc-butoxicarbonilamino-propoxi)-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina como se indica a continuaci6n:

25 A una disoluci6n de ester dietflico del acido 4-(3-terc-butoxicarbonilamino-propoxi)-piridina-2,6-dicarboxflico (150 mg) en etanol absoluto (5 ml) se le anadieron borohidruro s6dico (43 mg) y cloruro de calcio (128 mg). Despues de agitar durante 4 h, ces6 el desprendimiento de hidr6geno y la reacci6n se interrumpi6 con agua. El disolvente se evapor6 a presi6n reducida. Despues, el residuo se lav6 en un embudo de decantaci6n usando diclorometano y agua. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo tres veces con diclorometano. Las soluciones organicas combinadas

30 se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron al vacfo para dar 4-(3-terc-butoxicarbonilamino-propoxi)2,6-bis-(hidroximetil)piridina (80 mg):

LC/MS (Metodo A1, ZQ):: ES m/z = 313 MH+

Tiempo de retenci6n = 1,90 minutos

1H R.M.N. (400 MHz, DMSO-d6, < en ppm): 1,37 (s, 9H) ; 1,84 (m, 2H) ; 3,08 (c, J = 6,5 Hz, 2H) ; 4,05 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 4,45 (d, J = 6,0 Hz, 4H) ; 5,32 (t, J = 6,0 Hz, 2H) ; 6,84 (s, 2H) ; 6,90 (t ancho, J = 6,5 Hz, 1H).

Puede prepararse ester dietflico del acido 4-(3-terc-butoxicarbonilamino-propoxi)-piridina-2,6-dicarboxflico como se indica a continuaci6n:

El ester dietflico del acido quelidamico (Scrimin, P.; Tecilla, P.; Tonallato, U.; Vendrame, T. J. Org. Chem. 1989, 54, 5988) (150 mg) se disolvi6 en dimetilformamida seca (2 ml). Se anadieron 3-(terc-butoxi-amino)-propilo bromuro (164 mg) y carbonato potasico (130 mg). La mezcla resultante se agit6 durante 15 h a 70°C. La reacci6n se interrumpi6 con una disoluci6n acuosa saturada de cloruro de amonio y despues se lav6 en un embudo de decantaci6n usando acetato de etilo. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo 3 veces con acetato de etilo. Las disoluciones organicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron al vacfo para dar un residuo. El residuo se purific6 por cromatograffa sobre gel de sflice (columna Merck SuperVarioFlash de 30 g, Si60 15-40 Im), usando un gradiente de eluci6n con una mezcla de heptano (A) y acetato de etilo (B) (gradiente: 60� de A: 40� de B hasta 50� de A: 50� de B) para dar ester dietflico del acido 4-(3-terc-butoxicarbonilaminopropoxi)-piridina-2,6-dicarboxflico (150 mg):

Cl (Metodo D) :: m/z = 397 MH+

1H R.M.N. (400 MHz, DMSO-d6, < en ppm): 1,34 (t, J = 7,0 Hz, 6H) ; 1,36 (s, 9H) ; 1,86 (m, 2H) ; 3,10 (c, J = 6,5 Hz, 2H) ; 4,21 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 4,37 (c, J = 7,0 Hz, 4H) ; 6,89 (m ancho, 1H) ; 7,71 (s, 2H)

• Ejemplo 8: Puede prepararse 8,8'-[5-(3-aminopropiloxi)-1,3-bencenodiilbis(metilenooxi)]-bis[(S)-2-et-(E)ilideno-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] como se indica a continuacion: (este compuesto no esta reivindicado)

A una disoluci6n agitada de tomaimicina (21 mg) en dimetilformamida (0,7 ml) se le anadieron carbonato potasico (32 mg), 1-(3-aliloxicarbonilamino-propiloxi)-3,5-bis-(bromometil)-benceno (16,2 mg) y yoduro potasico (12,8 mg). La reacci6n se agit6 durante 20 h a 30°C. Los s6lidos se retiraron por filtraci6n, se lavaron dos veces con dimetilformamida (0,2 ml) y despues se desecharon. A la segunda disoluci6n de dimetilformamida se le anadi6 agua (0,5 ml) y el precipitado resultante se retir6 por filtraci6n, se lav6 con agua y se sec6 por evaporaci6n centrffuga sobre un aparato Jouan Model RC10.10.

Al compuesto bruto (27 mg) disuelto en dimetilformamida (0,8 ml) se le anadieron tetraquis(trifenilfosfino)paladio (2 mg), trifenilfosfina (0,9 mg) y pirrolidina (5,6 Il). Despues de agitar durante 15 h a 30°C, se anadieron tetraquis(trifenilfosfino)paladio (2 mg), trifenilfosfina (1 mg) y pirrolidina (2,8 Il) y la mezcla de reacci6n se agit6 a temperatura ambiente durante 15 h mas. A la disoluci6n de dimetilformamida se le anadi6 agua (0,4 ml) y se anadi6 acido f6rmico hasta que se produjo la completa disoluci6n del precipitado. La disoluci6n resultante se inyect6 para purificaci6n por HPLC de acuerdo con el metodo B1. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron por evaporaci6n centrffuga sobre un aparato Jouan Model RC10.10 para producir 8,8'-[5-(3-aminopropiloxi)-1,3bencenodiilbis-(metilenooxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona] (0,2 mg).

LC/MS (Metodo A1, Plataforma II):: ES : m/z = 800 MH+

Tiempo de retenci6n = 2,84 minutos

Puede prepararse 1-(3-aliloxicarbonilamino-propiloxi)-3,5-bis-(bromometil)-benceno como se indica a continuaci6n:

A una suspensi6n de 1-(3-aliloxicarbonilamino-propiloxi)-3,5-bis-(hidroxi-metil)-benceno (70 mg) en diclorometano (3 ml) se le anadieron tetrabromuro de carbono (248 mg) y una disoluci6n de trifenilfosfina (199 mg) en diclorometano (2 ml). Despues de calentar a reflujo durante 3 h, la mezcla de reacci6n se purific6 por cromatograffa sobre gel de sflice (columna Merck SuperVarioFlash de 25 g, Si60 15-40 Im), eluyendo con diclorometano para dar 1-(3aliloxicarbonilamino-propiloxi)-3,5-bis-(bromometil)-benceno (52 mg):

LC/MS (Metodo A1, Plataforma II):: ES m/z = 420 MH+

Tiempo de retenci6n = 4,50 minutos

1H R.M.N. (400 MHz, DMSO-d6, < en ppm): 1,85 (m, 2H) ; 3,15 (c, J = 6,5 Hz, 2H) ; 3,99 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 4,46 (d ancho, J = 5,5 Hz, 2H) ; 4,65 (s, 4H) ; 5,16 (d ancho, J=11,0 Hz, 1 H) ; 5,26 (d ancho, J=17,5 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H); 10 6,96 (d, J = 1,5 Hz, 2H) ; 7,09 (t, J=1,5 Hz, 1 H) ; 7,29 (t ancho, J = 6,5 Hz, 1H) 1-(3-aliloxicarbonilamino-propiloxi)3,5-bis-(hidroximetil)-benceno se prepar6 como se indica a continuaci6n :

Se disolvi6 5-(3-ftalimido-propiloxi)-1,3-bis-(hidroximetil)-benceno (1,45 g) en una mezcla de diclorometano y etanol (25 ml, 25: 75). Se anadi6 hidrazina hidratada (0,62 mL) y la mezcla de reacci6n se llev6 a reflujo durante 1 h. Se

15 elimin6 el disolvente a vacfo y se disolvi6 el residuo en diclorometano. El residuo insoluble se retir6 por filtraci6n y se purific6 por cromatograffa sobre gel de sflice (columna Merck SuperVarioPrep de 70 g, Si60 15-40 Im), eluyendo con metanol/diclorometano, 20:80 y despues hidr6xido de amonio/metanol/diclorometano, 0,5:25:75 para dar 1-(3amino-propiloxi)-3,5-bis-(hidroxi-metil)-benceno (1 g) adecuado para una transformaci6n adicional.

Una muestra de 1-(3-amino-propiloxi)-3,5-bis-(hidroximetil)-benceno (100 mg) se disolvi6 en metanol (5 ml). A la

20 disoluci6n enfriada (0°C) se le anadi6 una disoluci6n de carbonato s6dico (120 mg) en agua (5 ml) y cloroformiato de alilo (42 Il). Despues de agitar durante 30 minutos a 0°C, la mezcla de reacci6n se agit6 a temperatura ambiente durante 15 h mas. El disolvente se retir6 al vacfo Despues, el residuo se lav6 en un embudo de decantaci6n usando acetato de etilo y agua. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las soluciones organicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron al vacfo para dar 5-(3

25 aliloxicarbonilamino-propiloxi)-2,6-bis-(hidroximetil)benceno (75 mg):

EI (Metodo C):: m/z = 295 M+

m/z = 142: (M -C8H9O3)+

m/z = 41: C3H5 +

1H R.M.N. (300 MHz, DMSO-d6, < en ppm) : 1,85 (m, 2H) ; 3,14 (c, J = 6,5 Hz, 2H) ; 3,96 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; de 4,41 a 4,48 (m, 6H) ; 5,11 (t parcialmente enmascarado, J = 5,5 Hz, 2H) ; 5,16 (cd, J = 1,5 y 10,5 Hz, 1H); 5,26 (qd, J = 1,5 y 17,0 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H) ; 6,72 (s ancho, 2H) ; 6,83 (s ancho, 1 H) ; 7,26 (t ancho, J = 6,5 Hz, 1H)

Puede prepararse 5-(3-ftalimido-propiloxi)-1,3-bis-(hidroximetil)-benceno como se indica a continuaci6n: Se mezclaron 3,5-Bis-hidroximetilfenol (Felder, D.; Gutierrez Nava, M.; del Pilar Carreon, M.; Eckert, J. F.; Luccisano, M.; Schall, C.; Masson, P.; Gallani, J. L.; Heinrich, B.; Guillon, D.; Nierengarten, J.F. Helv. Chimica Acta 2002, 85, 288) (2,35 g), N-(3-bromo-propil)-ftalimida (4,49 g) y carbonato potasico (10,53 g) en acetonitrilo (25 ml) y la mezcla se calent6 a reflujo durante 12 h. La mezcla de reacci6n se enfri6 a temperatura ambiente y el disolvente se retir6 a presi6n reducida. El residuo se disolvi6 de nuevo en diclorometano y el residuo insoluble se retir6 por filtraci6n. El filtrado se lav6 con agua, se sec6 sobre sulfato de magnesio y se concentr6 al vacfo para dar un residuo. El residuo se purific6 por cromatograffa sobre gel de sflice (columna Merck SuperVarioPrep de 90 g, Si60 15-40 Im), eluyendo con metanol/diclorometano, 4:96 para dar 5-(3-ftalimido-propiloxi)-1,3-bis-(hidroximetil)benceno (1,45 g):

LC/MS (Metodo A1, Plataforma II):: ES m/z = 342 MH+

m/z = 324 (MH+ -H2O)

Tiempo de retenci6n = 2,90 minutos

10 1H R.M.N. (300 MHz, DMSO-d6, < en ppm) : 2,05 (m, 2H) ; 3,76 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 3,99 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 4,40 (d, J = 5,5 Hz, 4H) ; 5,09 (t, J = 5,5 Hz, 2H) ; 6,59 (s ancho, 2H) ; 6,82 (s ancho, 1 H) ; de 7,80 a 7,90 (m, 4H)

• Ejemplo 9: Puede preparase 8,8'-[5-(N-metil-3-terc-butoxicarbonilaminopropil)-1,3bencenodiilbis(metilenooxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona] como se indica a continuacion:

Este compuesto no esta reivindicado.

A una disoluci6n enfriada (0°C) de 5-(N-metil-3-terc-butoxicarbonilaminopropil)-1,3-bis-(hidroximetil)-benceno (50 mg) y trietilamina (113 Il) en diclorometano (2 ml) se le anadi6 cloruro de metanosulfonilo (26 Il). Despues de 30 minutos, la mezcla de reacci6n se lav6 dos veces con agua y la disoluci6n de diclorometano resultante se sec6

20 sobre sulfato de magnesio y se concentr6 al vacfo para dar un aceite viscoso (50,3 mg).

Una disoluci6n de tomaimicina (15 mg) en dimetilformamida (0,5 ml) se anadi6 a una mezcla del compuesto bruto (13 mg), carbonato potasico (23 mg) y yoduro potasico (9 mg). La mezcla de reacci6n se agit6 durante 20 h a 30°C. Se anadi6 otra muestra del compuesto bruto (6 mg) y la mezcla de reacci6n se agit6 durante 20 h mas a 30°C. Los s6lidos se retiraron por filtraci6n, se lavaron con dimetilformamida (0,2 ml) y despues se desecharon. A la disoluci6n

25 de dimetilformamida combinada se le anadieron agua (0,4 ml), una gota de acido f6rmico y una cantidad adicional de agua (1,5 ml).

Se filtr6 una muestra de la suspensi6n resultante (2 ml) y el s6lido resultante se sec6 al vacfo para dar 8,8'-[5-(Nmetil-3-terc-butoxicarbonilaminopropil)-1,3-bencenodiilbis(metilenooxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] (3,1 mg):

LC/MS (Metodo A1, Plataforma II):: ES : m/z = 818 MH+

Tiempo de retenci6n = 4,11 minutos

Puede prepararse 5-(N-metil-3-terc-butoxicarbonilaminopropil)-1,3-bis-(hidroximetil)-benceno como se indica a continuaci6n:

Cl (Metodo D) :: m/z = 327 MNH4 +

m/z = 310: MH+

m/z = 271: (MNH4 +-C4H8)

A una disoluci6n enfriada (-5°C) de ester dietflico del acido 5-(N-metil-3-terc-butoxicarbonilaminopropil)-benceno-1,3dicarboxflico (100 mg) en tetrahidrofurano (2 ml) se le anadi6 lentamente una disoluci6n 1 M de hidruro de litio y aluminio en eter dietflico (0,55 ml). 10 minutos despues del final de la adici6n, se anadi6 sulfato s6dico decahidrato hasta que ces6 el desprendimiento de gas. El s6lido se retir6 por filtraci6n, se lav6 dos veces con acetato de etilo y las soluciones organicas combinadas se concentraron al vacfo para dar 5-(N-metil-3-terc-butoxicarbonilaminopropil)1,3-bis-(hidroximetil)-benceno (66,8 mg) en forma de un aceite viscoso:

1H R.M.N. (300 MHz, DMSO-d6, < en ppm) : 1,37 (s ancho, 9H) ; 1,75 (m, 2H) ; de 2,45 a 2,54 (m enmascarado, 2H); 2,77 (s, 3H) ; 3,18 (t, J = 7,0 Hz, 2H) ; 4,45 (d, J = 5,5 Hz, 4H) ; 5,08 (t, J = 5,5 Hz, 2H) ; 7,00 (s ancho, 2H) ; 10 7,08 (s ancho, 1 H)

Puede prepararse ester dietflico del acido 5-(N-metil-3-terc-butoxicarbonilaminopropil)-benceno-1,3-dicarboxflico como se indica a continuaci6n:

A una disoluci6n de ester dietflico del acido 5-(N-metil-3-terc-butoxicarbonilaminopropin-1-il)-benceno-1,3

15 dicarboxflico (890 mg) en metanol (10 ml) se le anadi6 paladio al 10� sobre carbono (89 mg) y la disoluci6n se agit6 a temperatura ambiente en una atm6sfera de hidr6geno (1 bar) durante 18 h. El s6lido se retir6 por filtraci6n y el disolvente se retir6 al vacfo para producir ester dietflico del acido 5-(N-metil-3-terc-butoxicarbonilaminopropil)benceno-1,3-dicarboxflico (767 mg) en forma de un aceite amarillo:

EI (Metodo C):: m/z = 365 M+.

m/z = 309: (M -C4H8)+.

m/z = 265: (m/z=309 -CO2)+.

m/z = 57: C4H9 +

m/z = 44: C2H6N+

1H R.M.N. (400 MHz, DMSO-d6, < en ppm): 1,32 (s ancho, 9H) ; 1,79 (m, 2H) ; 2,70 (t, J = 7,0 Hz, 2H) ; 2,76 (s, 3H) ; 20 3,16 (m, 2H) ; 3,87 (s, 6H) ; 8,06 (d, J = 2,0 Hz, 2H) ; 8,32 (t, J=2,0 Hz, 1 H)

Puede prepararse ester dietflico del acido 5-(N-metil-3-terc-butoxicarbonilaminopropin-1-il)-benceno-1,3-dicarboxflico como se indica a continuaci6n:

Se disolvi6 ester dimetflico del acido 5-trifluorometanosulfonoloxo-isoftalico (Bodwell, G.J. ; Fleming, J.J. ; Mannion,

M.R. ; Miller, D.O. J. Org. Chem. 2000, 65 (17), 5360) (1g) en 2 ml de acetonitrilo. Se anadi6 N-metil-N-tercbutoxicarbonilpropargilamina (Bradbury, B.J. ; Baumgold, J. ; Jacobsen, K.A. J. Med. Chem. 1990, 33 (2), 741) (643 mg), cloruro de bis(trifenilfosfina)paladio (205 mg), yoduro de cobre (56 mg) y trietilamina (591 mg). La mezcla resultante se agit6 durante 15 h a temperatura ambiente. El disolvente se retir6 por evaporaci6n a presi6n reducida y despues el residuo se lav6 en un embudo de decantaci6n usando acetato de etilo y agua. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo una vez con acetato de etilo. Las soluciones organicas combinadas se lavaron con una disoluci6n acuosa saturada de cloruro s6dico, se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron al vacfo para dar un residuo. El residuo se purific6 por cromatograffa sobre gel de sflice (columna Biotage FLASH 40+M de 100 g, SiOH 32-63 Im, eluyendo con acetato de etilo/heptano, 20:80) para dar ester dietflico del acido 5-(N-metil-3-tercbutoxicarbonilaminopropin-1-il)-benceno-1,3-dicarboxflico (896 mg):

1H R.M.N. (300 MHz, DMSO-d6, < en ppm) : 1,43 (s, 9H) ; 2,90 (s, 3H) ; 3,90 (s, 6H) ; 4,30 (s, 2H) ; 8,16 (d, J = 1,5 Hz, 2H) ; 8,42 (t, J = 1,5 Hz, 1H)

• Ejemplo 10: Puede prepararse 8,8'-{5-[3-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoilamino)propiloxi]-1,3bencenodiilbis(metilenooxi)}-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona] como se indica a continuacion:

A una disoluci6n enfriada (0°C) de 1-[3-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoilamino)-propiloxi]-3,5-bis-(hidroximetil)benceno (45 mg) y trietilamina (49 Il) en diclorometano (1,5 ml) se le anadi6 cloruro de metanosulfonilo (19 Il). Despues de 30 minutos, la mezcla de reacci6n se lav6 dos veces con agua y la disoluci6n de diclorometano resultante se sec6 sobre sulfato de magnesio y se concentr6 al vacfo para dar un aceite viscoso (39 mg).

Una disoluci6n de tomaimicina (26 mg) en dimetilformamida (0,9 ml) se anadi6 carbonato potasico (40 mg), yoduro potasico (16 mg) y una muestra del compuesto bruto (31 mg).La mezcla de reacci6n se agit6 durante 20 h a 30°C. Se anadi6 otra muestra del compuesto bruto (6 mg) y la mezcla de reacci6n se agit6 durante 20 h mas a 30°C. Los s6lidos se retiraron por filtraci6n, se lavaron con dimetilformamida (0,3 ml) y despues se desecharon. A la segunda disoluci6n de dimetilformamida se le anadi6 agua (1,6 ml) y el s6lido resultante se filtr6, se lav6 con agua y se sec6 al vacfo para dar un residuo. El residuo se purific6 por cromatograffa sobre gel de sflice (columna Interchrom Puriflash de 2 g, SiOH 15-35 Im, eluyendo con diclorometano/metanol, 95:5) y despues otra purificaci6n por cromatograffa sobre gel de sflice (columna Chromabond OH de 2 g, 45 Im, eluyendo con diclorometano para dar 8,8'-{5-[3-(4-metil-4-metildisulfanilpentanoil-amino)propiloxi]-1,3-bencenodiilbis(metilenooxi)}-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzo-diazepin-5-ona] (0,2 mg):

LC/MS (Metodo A1, Plataforma I):: ES : m/z = 896 MH+

Tiempo de retenci6n = 4,09 minutos

1H R.M.N. (500 MHz, CDCl3-d1, < en ppm) : 1,29 (s, 6H) ; 1,75 (d, J = 6,5 Hz, 6H) ; de 1,92 a 2,03 (m, 4H) ; 2,28 (m, 2H) ; 2,39 (s, 3H) ; 2,97 (m, 4H) ; 3,45 (c, J = 6,0 Hz, 2H) ; 3,89 (c, J = 5,5 Hz, 2H) ; 3,96 (s, 6H) ; 4,04 (t, J = 5,0 Hz, 2H) ; 4,27 (s ancho, 4H) ; 5,14 (d, J = 12,5 Hz, 2H) ; 5,20 (d, J = 12,5 Hz, 2H) ; 5,60 (m, 2H) ; 5,84 (t ancho, J = 6,0 Hz, 1 H) ; 6,83 (s, 2H) ; 6,94 (s, 2H) ; 7,09 (s, 1 H) ; 7,53 (s, 2H) ; 7,64 (d, J = 5,0 Hz, 2H).

LC/MS (Metodo A1, ZQ):: ES m/z=388 MH+

Tiempo de retenci6n = 3,03 minutos

1-[3-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoilamino)-propiloxi]-3,5-bis-(hidroximetil)-benceno

A una disoluci6n de 1-(3-amino-propiloxi)-3,5-bis-(hidroximetil)-benceno (50 mg) en dimetilformamida (1 ml) se le anadieron acido 4-metil-4-metildisulfanil-pentanoico (44 mg), N,N'-diisopropilcarbodiimida (35 ml) y 1hidroxibenzotriazol hidrato (5,8 mg). Despues de 15 h a temperatura ambiente, a la mezcla de reacci6n se le anadi6 agua y la disoluci6n acuosa se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las soluciones organicas combinadas se lavaron con una disoluci6n acuosa saturada de cloruro s6dico, se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron al vacfo para dar un residuo. El residuo se purific6 por cromatograffa sobre gel de sflice (columna Interchrom Puriflash de 5 g, SiOH 15-35 Im), eluyendo con metanol/diclorometano, 5:95 para dar 1-[3-(4-metil-4metildisulfanilpentanoilamino)-propiloxi]-3,5-bis-(hidroximetil)-benceno (48 mg):

1H R.M.N. (300 MHz, DMSO-d6, < en ppm) : 1,24 (s, 6H) ; de 1,76 a 1,87 (m, 4H) ; 2,16 (m, 2H) ; 2,40 (s, 3H) ; 3,19 (c, J = 6,5 Hz, 2H) ; 3,95 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 4,44 (d ancho, J = 5,5 Hz, 4H) ; 5,12 (d, J = 5,5 Hz, 2H) ; 6,73 (s ancho, 2H) ; 6,83 (s ancho, 1 H) ; 7,92 (t ancho, J = 5,5 Hz, 1H)

• Ejemplo 11: 8,8'-[1,5-pentanodiilbis(oxi)]-bis[(S)-2-metilen-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona] (este compuesto no esta reivindicado)

A una disoluci6n de acido 4-benciloxi-5-metoxi-2-nitrobenzoico (4,8 g, 16 mmol) en diclorometano anhidro (80 ml) y THF (5 ml) se le anadieron cloruro de oxalilo (2,8 ml, 32 mmol) y DMF (30 Il, 0,38 mmol) a temperatura ambiente. Se formaron grandes cantidades de burbujas despues de la adici6n de DMF. La mezcla se agit6 durante una noche y despues los disolventes se retiraron por evaporaci6n rotatoria al vacfo. El residuo se co-evapor6 una vez mas mediante la adici6n de diclorometano anhidro para dar el cloruro de acetilo en forma de un s6lido amarillo.

A una disoluci6n de ester metflico de 4-metileno-L-prolina, compuesto A, (3,95 g, 15,5 mmol) en THF anhidro (80 ml) se le anadi6 trietilamina (6,7 ml, 48 mmol) a 0°C. Despues de 2 minutos, se anadi6 rapidamente el cloruro de acetilo anterior en THF anhidro (80 ml) durante 10 minutos mediante una canula a la misma temperatura. La disoluci6n turbia amarilla obtenida se agit6 a 0 - 5°C durante 30 minutos y despues a temperatura ambiente durante 4 horas. La disoluci6n de reacci6n se diluy6 con acetato de etilo y agua. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo dos veces y las capas organicas combinadas se lavaron con una disoluci6n al 2� de HCl y salmuera y se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro. Se filtr6 y los disolventes se retiraron. El residuo se purific6 por cromatograffa ultrarrapida (Hexanos/AcOEt, 1:1, 1:1,5) para dar ester metflico del acido (2S)-4-(metileno)-1-[5-metoxi-2-nitro-4(fenilmetoxi)-benzoil]-2-pirrolidinacarboxflico en forma de un s6lido amarillo (5,6 g, r = 85�). 1H RMN (400 Hz, CDCl3): el compuesto aparece como un par de rotameros distintos. < 7,76 (s, 0,7H), 7,73 (s, 0,3H), 7,43-7,29 (m, 5H), 6,83 (s, 0,7H), 6,80 (s, 0,3H), 5,17 (s, 1,4H), 5,16 (s, 0,6H), 5,10-4,89 (m, 2,7H), 4,57 (d, J = 16 Hz, 0,3H), 4,194,12 (m, 0,7H), 3,95-3,77 (m, 6,3H), 3,57 (s, 1H), 3,06-2,96 (m, 1H), 2,73-2,62 (m, 1H); 13C RMN (400 Hz, CDCl3): 171,8, 171,7, 166,5, 166,2, 154,9, 154,4, 148,25, 148,18, 141,7, 141,3, 137,19, 137,13, 135,3, 135,2, 128,7, 128,43, 128,41, 127,5, 127,3, 109,5, 109,1, 109,0, 108,9, 71,3, 60,6, 58,1, 56,7, 56,5, 52,39, 52,37, 52,0, 50,2, 37,1, 35,5; MS (ESI): m/z 449,3 (M + Na)+.

A una disoluci6n del ester (3,15 g, 7,39 mmol) en diclorometano anhidro (9 ml) y tolueno (27 ml) se le anadi6 gota a gota dibal-H (15 ml, 1,0 M en tolueno) mediante una bomba de jeringa durante 30 minutos a -78°C. La mezcla se mantuvo en agitaci6n a -78°C durante 2 horas y el analisis por TLC (hexanos/AcOEt, 1:1,5) mostr6 que se habfa consumido todo el material de partida. La reacci6n se interrumpi6 con metanol (0,3 ml, 7,4 mmol) a -78°C y se anadi6 HCl al 5� (20 ml) seguido de la adici6n de AcOEt (50 ml). El bano de hielo seco/acetona se retir6 y la mezcla se calent6 a 0°C y se agit6 durante 15 minutos. La capa acuosa se extrajo dos veces con AcOEt y las capas organicas combinadas se lavaron con HCl frfo al 5� y salmuera y se secaron sobre sulfato s6dico anhidro. Se filtr6 a traves de celite y los disolventes se retiraron. El residuo se purific6 por cromatograffa ultrarrapida (Hexanos/AcOEt, 1:1, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 100� de AcOEt) para dar (2S)-4-(metileno)-1-[5-metoxi-2-nitro-4-(fenilmetoxi)benzoil]-2pirrolidinacarboxaldehfdo en forma de un s6lido amarillo esponjoso (2,69 g, r = 92�). 1H RMN (400 Hz, CDCl3): el compuesto aparece como un par de rotameros distintos. < 9,75 (s, 0,7H), 9,32 (s, 0,3H), 7,76 (s, 0,7H), 7,69 (s, 0,3H), 7,45-7,31 (m, 5H), 6,85 (s, 0,7H), 6,80 (s, 0,3H), 5,19-4,82 (m, 4,7H), 4,56 (d, J = 16 Hz, 0,3H), 4,14-3,79 (m, 5H), 2,99-2,68 (m, 2H); 13C NMR (400 Hz, CDCl3): 198,3, 197,1, 167,1, 155,0, 154,6, 148,4, 141,3, 140,4, 137,2, 135,2, 128,7, 128,5, 128,4, 127,5, 126,9, 126,6, 109,8, 109,4, 109,3, 109,2, 109,1. 71,3, 66,6, 64,3, 56,7, 56,6, 52,2, 50,6, 33,2, 31,9; MS (ESI): m/z 419,2 (M + Na)+.

Procedimiento 1: A una disoluci6n de (2S)-4-(metileno)-1-[5-metoxi-2-nitro-4-(fenilmetoxi)benzoil]-2pirrolidinacarboxaldehfdo (1,0 equivalente) en THF/H2O (v/v, 1,7:1, 0,03 M) se le anadi6 en porciones hidrosulfito s6dico (5-8 equivalente) durante 2 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se agit6 adicionalmente durante 6-20 horas y se control6 mediante analisis por TLC (1:2 de hexanos/AcOEt y 5:1 de CH2Cl2/MeOH). Despues de que el aldehfdo se consumiera casi totalmente, la reacci6n se interrumpi6 con metanol (aproximadamente el mismo volumen que el THF usado). Los disolventes se retiraron por evaporaci6n rotatoria al vacfo (temperatura �40°C) y el s6lido restante se puso a vacfo elevado para secarlo completamente. El s6lido se suspendi6 en metanol anhidro (0,03 M) y se anadi6 gota a gota AcCl (8-10 equivalente) a temperatura ambiente. Despues de agitar durante 15 minutos, la disoluci6n turbia se filtr6 y el s6lido se lav6 con metanol anhidro. El filtrado amarillo transparente se agit6 a temperatura ambiente durante 1 a 2 horas y se inactiv6 con bicarbonato s6dico saturado. Despues de que se retirara la mayor parte del metanol por evaporaci6n rotatoria, el material restante se diluy6 con diclorometano y agua. La capa acuosa se extrajo con AcOEt. Las capas organicas combinadas se secaron sobre sulfato s6dico anhidro y se filtraron. Los disolventes se retiraron y el residuo se purific6 por cromatograffa ultrarrapida (hexanos/AcOEt, 1:3, 1:5) para dar (11aS)-7-metoxi-2-metileno-8-(fenilmetoxi)-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona con un rendimiento de 70� a 85�. Los espectros de RMN son coherentes con la bibliograffa indicada. MS (ESI): m/z 371,2 (M + Na)+. MS (ESI, con CH3OH): m/z 403,3 (M + CH3OH + Na)+. MS (ESI, con H2O): m/z 389,2 (M + H2O + Na)+.

Procedimiento 2: A una disoluci6n de (2S)-4-(metileno)-1-[5-metoxi-2-nitro-4-(fenilmetoxi)benzoil]-2pirrolidinacarboxaldehfdo (1,0 equivalente) en MeOH/H2O (v/v, 3,2:1, 0,03 M) se le anadi6 en porciones hidrosulfito s6dico (6-8 equivalentes) durante 2 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adici6n de hidrosulfato s6dico (0,5-1,0 equivalentes). La mezcla se agit6 adicionalmente durante 12-20 horas y se control6 mediante analisis por TLC (1:2 de hexanos/AcOEt y 5:1 de CH2Cl2/MeOH). Despues de que se consumiera casi todo el intermedio [MS (ESI): 459,0 (M - H) -], la reacci6n se interrumpi6 con bicarbonato s6dico saturado a pH 5-6. Los disolventes se retiraron por evaporaci6n rotatoria al vacfo (temperatura �40°C) y el s6lido restante se puso a vacfo elevado para secarlo completamente. El s6lido se suspendi6 en metanol anhidro (0,03 M) y se anadi6 gota a gota AcCl (8-10 equivalente) a temperatura ambiente. Despues de agitar durante 15 minutos, la disoluci6n turbia se filtr6 y el s6lido se lav6 con metanol anhidro. El filtrado amarillo transparente se agit6 a temperatura ambiente durante 1 a 2 horas y se inactiv6 con bicarbonato s6dico saturado. Despues de que se retirara la mayor parte del metanol por evaporaci6n rotatoria, el material restante se diluy6 con diclorometano y agua. La capa acuosa se extrajo con AcOEt. Las capas organicas combinadas se secaron sobre sulfato s6dico anhidro y se filtraron. Los disolventes se retiraron y el residuo

se purific6 por cromatograffa ultrarrapida (hexanos/AcOEt, 1:3, 1:5) para dar (11aS)-7-metoxi-2-metilen-8(fenilmetoxi)-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona con un rendimiento de 65� a 80�.

A una disoluci6n del material de partida (98 mg, 0,28 mmol) en diclorometano anhidro (2 ml) se le anadi6 una disoluci6n recien mezclada de acido metanosulf6nico (2 ml) en diclorometano anhidro (4 ml) a temperatura ambiente. La mezcla se agit6 a temperatura ambiente durante 1,5 horas y se verti6 en hielo (-30 g), se inactiv6 con NaHCO3 saturado y se diluy6 con diclorometano. La capa acuosa se extrajo una vez con diclorometano y las capas organicas combinadas se secaron sobre sulfato s6dico anhidro, se filtraron y los disolventes se retiraron. El residuo se purific6 por cromatograffa ultrarrapida (CH2Cl2/MeOH, 15:1) para dar el producto en forma de un s6lido amarillo (29 mg). La capa acuosa anterior se agit6 a temperatura ambiente durante una noche y se extrajo con diclorometano y posteriormente con AcOEt. El diclorometano combinado y el AcOEt se secaron sobre sulfato s6dico anhidro, se filtraron y los disolventes se retiraron para dar (11aS)-8-hidroxi-7-metoxi-2-metileno-1,2,3,11a-tetrahidro-5Hpirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona (25 mg). El rendimiento total es de 74�. 1H RMN (400 Hz, CDCl3): < 7,65 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 7,48 (s, 1H), 6,87 (s, 1H), 6,35 (s a, 1H), 5,17 (t, J = 1,6 Hz, 1H), 5,14 (7, J = 1,6 Hz, 1H), 4,26 (s, 2H), 3,93 (s, 3H), 3,87-3,83 (m, 1H), 3,12-3,05 (m, 1H), 2,91 (d, J = 16 Hz, 1H); MS (ESI): m/z 281,0 (M + Na)+. MS (ESI, con agua): m/z 258,9 (M + H)+, m/z 299,1 (M + H2O + Na)+.

A una disoluci6n de acido 4,4'-[1,5-pentanodiilbis(oxi)]-bis[(5-metoxi-2-nitro)-benzoico], compuesto 1, (494 mg, 1,0 mmol) en THF anhidro (5 mL) se anadi6 cloruro de oxalilo (356 IL, 4 mmol) y DMF (10 IL, 0,1 mmol) a temperatura ambiente. Se formaron grandes cantidades de burbujas despues de la adici6n de DMF. Despues la mezcla se agit6 durante 18 horas a temperatura ambiente, los disolventes se eliminaron por evaporaci6n rotatoria a vacio. El residuo se co-evapor6 una vez mas mediante la adici6n de diclorometano anhidro para dar el cloruro acido en forma de un s6lido amarillo.

A una disoluci6n de ester metflico de 4-metileno-L-prolina, compuesto A, (510 mg, 2 mmol) en THF anhidro (6 ml) se le anadi6 trietilamina (836 Il, 6 mmol) a 0°C. Despues de 2 minutos, se anadi6 rapidamente el cloruro de acetilo anterior en THF anhidro (4 ml) durante 5 minutos mediante una canula a la misma temperatura. La disoluci6n turbia naranja obtenida se agit6 a 0 -5°C durante 1 hora y despues a temperatura ambiente durante 3 horas. Parte del disolvente se elimin6 por evaporaci6n rotatoria a vacio (temperatura � 30°C). El resto se diluy6 con acetato de etilo y agua. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo dos veces y las capas organicas combinadas se lavaron con una disoluci6n al 2� de HCl y salmuera y se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro. Se filtr6 y los disolventes se retiraron. El residuo se purific6 mediante cromatograffa ultrarrapida (Hexanos/AcOEt, 1:1, 1:2, 1:3) para proporcionar ester metflico de 1,1'-{1,5-pentanodiilbis[oxi(5-metoxi-2-nitro-4,1-fenilen)carbonil]}-bis-(4-metilen-Lprolina), compuesto 2, como un s6lido amarillo (619 mg, y = 84�). 1H RMN (400 Hz, CDCl3): el compuesto aparece como un par de rot6meros distinto. < 7,67 (s, 1,4H), 7,64 (s, 0,6H), 6,82 (s, 1.4H), 6,79 (s, 0,6H), 5,11-4,89 (m, 5,4H), 4,57 (d, J = 16 Hz, 0,6H), 4,19-4,10 (m, 5,4H), 3,95-3,78 (m, 12,6H), 3,58 (s, 2H), 3,07-2,98 (m, 2H), 2,74-2,62 (m, 2H), 2,01-1,04 (m, 4H), 1,73-1,67 (m, 2H); MS (ESI): m/z 763,4 (M + Na)+.

A una disoluci6n del compuesto 2 (345 mg, 0,47 mmol) en diclorometano anhidro (0.7 ml) y tolueno (1,5 ml) se le anadi6 gota a gota dibal-H (1,9 ml, 1,0 M en tolueno) mediante una bomba de jeringa durante 15 minutos a -78°C. La mezcla se mantuvo en agitaci6n a -78°C durante 2 horas y el analisis por TLC (hexanos/AcOEt, 1:4) mostr6 que se habfa consumido todo el material de partida. La reacci6n se enfri6 con metanol a -78°C y se anadi6 HCl al 5� seguido de adici6n de AcOEt. El bano de hielo seco/acetona se retir6 y la mezcla se calent6 a 0°C y se agit6 durante 15 minutos. La capa acuosa se extrajo dos veces con AcOEt y las capas organicas combinadas se lavaron con HCl frfo al 5� y salmuera y se secaron sobre sulfato s6dico anhidro. Se filtr6 a traves de celite y los disolventes se retiraron. El residuo se purific6 mediante cromatograffa ultrarrapida (Hexanos/AcOEt, 1:1, 1:5, 1:10, 100� AcOEt) para proporcionar ester metflico de 1,1'-{1,5-pentanodiilbis[oxi(5-metoxi-2-nitro-4,1-fenilen)carbonil]}-bis-[(S)-4metilen-2-pirrolidincarboxaldehfdo], compuesto 3, como un s6lido amarillo (297 mg, rto = 93�). 1H RMN (400 Hz,

CDCl3): el compuesto aparece como un par de rot6meros distintos. < 9,70 (s, 1,4H), 9,28 (s, 0,6H), 7,65-7,58 (m, 2H), 6,81-6,73 (m, 2H), 5,08-4,72 (m, 5,4H), 4,53-4,49 (m, 0,6H), 4,11-3,63 (m, 14H), 2,91-2,59 (m, 4H), 1,98-1,87 (m, 4H), 1,70-1,61 (m, 2H); MS (ESI): m/z 703,2 (M + Na)+.

A una disoluci6n del compuesto 3 (34 mg, 0,05 mmol) en THF (1,6 mL) y H2O (1,0 mL) se anadi6 hidrosulfito de sodio (82 mg, 0,4 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla se agit6 a temperatura ambiente durante 19 horas y la reacci6n se enfri6 con metanol (-5 mL). Los disolventes se retiraron por evaporaci6n rotatoria al vacfo (temperatura

�40°C) y el s6lido restante se puso a vacfo elevado para secarlo completamente. El s6lido se suspendi6 en MeOH (10 mL) y se anadi6 gota a gota AcCl (0,1 mL) a temperatura ambiente. La mezcla se agit6 a temperatura ambiente durante 1 hora y se enfri6 con bicarbonato de sodio saturado. Se filtr6 y se lav6 con MeOH/CH2Cl2. El filtrado se evapor6 y el residuo se purific6 mediante cromatograffa ultrarrapida (CHCl3/MeOH, 20:1, 9:1, 5:1, 1:1) para dar 5,0 mg de 8,8'-[1,5-pentanediilbis(oxi)]-bis[(S)-2-metilen-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona], compuesto 4. Las fracciones muy polares de la columna se recogieron y se separaron los disolventes. El residuo se disolvi6 en MeOH (-10 mL) y se anadi6 AcCl (0,1 mL). Despues de agitada a temperatura ambiente durante 2 horas, la reacci6n se enfri6 con bicarbonato de sodio saturado y se concentr6 mediante evaporaci6n rotatoria. El resto se diluy6 con agua y se extrajo con diclorometano. Las capas organicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro y se filtraron. Se separaron los disolventes para proporcionar 7,2 mg del compuesto 4 como una espuma incolora. El rendimiento total (12,2 mg) es 41�. El espectro

-

1H NMR es consistente con la bibliograffa reportada. MS (ESI): m/z 583,2 (M -H). MS (ESI, con CH3OH): m/z 671,3 (M + 2CH3OH + Na)+, 639,3 (M + H + Na)+, 607,2 (M + Na)+. MS (ESI, con H2O): m/z 643,3 (M + 2H2O + Na)+, 625,3 (M + H2O + Na)+, 607,3 (M + Na)+.

• Ejemplo 12: 8,8'-[5-acetiltiometil-1,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[(S)-2-metilen-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]

A una disoluci6n de trifenilfosfina (577 mg, 2,2 mmol) en THF anhidro (5 ml) se le anadi6 gota a gota azodicarboxilato de dietilo (2,2 M en tolueno, 791 Il, 1,7 mmol) a 0°C. Despues de un periodo de agitaci6n a 0°C durante 50 minutos, se anadi6 gota a gota una disoluci6n de 1,3,5-tri(hidroximetil)benceno (269 mg, 1,6 mmol, preparada por reducci6n de 1,3,5-bencenotricarboxilato de trimetilo con hidruro de litio y aluminio en THF, coevaporaci6n con benceno seco y secado a vacfo elevado durante dos horas antes del uso) y acido tioacetico (108 Il, 1,45 mmol) en THF seco (4 ml). Despues de 1 hora, el bano de hielo/agua se retir6 y la reacci6n se agit6 a temperatura ambiente durante 15 horas. Los disolventes se retiraron por evaporaci6n rotatoria al vacfo. El residuo se purific6 por cromatograffa ultrarrapida para dar 5-acetiltiometil-1,3-bis(hidroximetil)-benceno en forma de un s6lido incoloro (110 mg). 1H RMN (400 Hz, CDCl3): < 7,13-6,99 (m, 3H), 4,45 (t ap., J = 20,4 Hz, 4H), 3,98 (t ap., J = 20,4 Hz, 4H), 3,73 (s a, 2H), 2,24 (t ap., J = 20,4 Hz, 3H); MS (ESI): m/z 249,0 (M + Na)+.

A una disoluci6n de trifenilfosfina (28 mg, 0,1 mmol) en THF anhidro (0,3 ml) se le anadi6 gota a gota azodicarboxilato de diisopropilo (19 Il, 0,09 mmol) a 0°C. Despues de agitar a 0°C durante 35 minutos, se anadi6 una disoluci6n de (11aS)-8-hidroxi-7-metoxi-2-metileno-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5ona, el compuesto 5, (18 mg, 0,07 mmol, co-evaporado con benceno seco y secado a vacfo elevado durante dos horas antes del uso) en THF seco (0,2 ml). La mezcla se mantuvo en agitaci6n durante 10 minutos antes de que se anadieran 5-acetiltiometil-1,3-bis(hidroximetil)-benceno y el compuesto 6, (6,6 mg, 0,03 mmol, co-evaporado con benceno seco y secado a vacfo elevado durante dos horas antes del uso) en THF seco (0,2 ml). La mezcla de reacci6n se dej6 en agitaci6n a 0°C durante 35 minutos. El bano de hielo/agua se retir6 y la disoluci6n se agit6 a temperatura ambiente durante 21 horas. Los disolventes se retiraron por evaporaci6n rotatoria al vacfo. El residuo se purific6 por cromatograffa ultrarrapida para formar el producto bruto que se purific6 adicionalmente por HPLC preparativa (columna C18, CH3CN/H2O) para dar 0,7 mg de 8,8'-[5-acetiltiometil-1,3-bencenodiilbis(metilenooxi)]bis[(S)-2-metileno-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona], compuesto 7. MS (ESI,

-

con H2O): m/z 765,3 (M + 2H2O + Na)+, 747,3 (M + H2O + Na)+, 729,2 (M + Na)+, 707,3 (M + H)+, 663,2 (M -Ac).

• Ejemplo 13 Ester terc-butilico del acido bis-{2-[(S)-2-metileno-7-metoxi-5-oxo-1,3,11a-tetrahidro-5Hpirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-iloxi]-etil}-carbamico

Esquema 1

5 Compuesto 1. Se anadi6 gota a gota cloruro de tionilo (5,6 ml, 76,3 mmol) a metanol seco (76 ml) a -20°C, seguido de la adici6n de trans-4-hidroxi-L-prolina (5,0 g, 38,1 mmol). La mezcla resultante se dej6 calentar a ta y se agit6 durante 20 h. El disolvente se retir6 a presi6n reducida y el residuo se sec6 adicionalmente a vacfo elevado para proporcionar ester metflico de trans-4-hidroxi-L-prolina 1 en forma de un s6lido blanco: 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) < 2,18 -2,23 (m, 2H), 3,06 (m, 1 H), 3,32 -3,36 (m, 2H), 3,76 (s, 3H), 4,42 (br. s, 1 H), 4,48 (dd, J = 5,4, 8,1 Hz, 1H),

10 5,56 (br. s, 1 H); EIMS m/z 146 ([M]++1).

Compuesto 2. A una disoluci6n de ester metflico de trans-4-hidroxi-L-prolina 1 (4,48 g, 30,9 mmol) y bicarbonato s6dico (1,56 g, 18,5 mmol) en DMF anhidra (42 ml) se le anadi6 una disoluci6n de (BOC)2O en DMF (20 ml) a 0°C

en una atm6sfera de arg6n. Despues de agitar durante una noche a ta, la reacci6n se interrumpi6 mediante la adici6n de 100 ml de H2O a 0°C y se extrajo con EtOAc (4 x 80 ml). La capa organica combinada se lav6 con salmuera (100 ml), se sec6 (MgSO4), se filtr6 y se concentr6 con un evaporador rotatorio. El residuo se purific6 por cromatograffa ultrarrapida (gel de sflice, 1:1 de hexanos/EtOAc) para dar ester metflico de trans-4-hidroxi-L-prolina 2 protegido con N-BOC en forma de un aceite incoloro: 1H RMN (300 MHz, CDCl3, rotameros) < 1,38 y 1,43 (2 x s, 9H), 2,04 -2,07 (m, 1H), 2,23 -2,27 (m, 2H), 3,54 -3,63 (m, 2H), 3,70 (s, 3H), 4,34 -4,38 (m, 1H), 4,46 (s a, 1H).

Compuesto 3. (Franco Manfre, Jean-Marc Kern, y Jean-Francois Biellmann J. Org. Chem. 1992, 57, 2060-2065). El compuesto 2, ester metflico de trans-4-hidroxi-L-prolina, protegido con N-BOC (3,24 g, 13,2 mmol) se disolvi6 en CH2Cl2 (132 ml) y se enfri6 a 0°C. Se anadieron piridina y peryodinano de Dess-Martin y la agitaci6n se mantuvo hasta que el analisis por TLC no mostr6 ningun MP restante. La mezcla de reacci6n se diluy6 con CH2Cl2, se lav6 con Na2S2O3 ac. al 10� (3 x 50 ml), HCl ac. 1 N (50 ml), NaHCO3 ac. sat. (50 ml) y salmuera (50 ml), se sec6 sobre MgSO4, se filtr6 y se concentr6. La purificaci6n del residuo por cromatograffa ultrarrapida (gel de sflice, 7:3 de hexanos/EtOAc) dio el ester metflico de 4-oxo-L-prolina protegido con N-BOC 3 en forma de un aceite amarillo claro: 1H RMN (300 MHz, CDCl3, rotameros) < 1,44 (s, 9H), 2,53 -2,57 (m, 1H), 2,85 -2,96 (m, 1H), 3,72 y 3,74 (2 x s, 3H), 3,85 -3,87 (m, 2H), 4,67 -4,77 (m, 1H).

Compuesto 4. (Kuei-Ying Lin, Mark Matteucci US 5414077) Una disoluci6n de t-but6xido potasico (2,51 g, 22,3 mmol) en THF anhidro (40 ml) se anadi6 a una suspensi6n de bromuro de metiltrifenilfosfonio (7,99 g, 22,3 mmol) en THF (40 ml) a 0°C. La suspensi6n de iluro amarillo resultante se agit6 a 0°C durante 2 h antes de la adici6n de la disoluci6n de ester metflico de 4-oxo-L-prolina protegido con N-BOC 3 (2,72 g, 11,2 mmol) en THF (32 ml). Despues de agitar a ta durante 1 h, la mezcla de reacci6n se diluy6 con EtOAc (100 ml), se lav6 con H2O (80 ml) y salmuera (80 ml), se sec6 (MgSO4) y se concentr6. La purificaci6n del residuo por cromatograffa ultrarrapida (gel de sflice, 9:1 de hexanos/EtOAc) produjo el ester metflico de 4-metileno-L-prolina protegido con N-BOC, compuesto 4, en forma de un aceite incoloro: 1H RMN (300 MHz, CDCl3, rotameros) < 1,40 y 1,45 (2 x s, 9H), 2,58 -2,62 (m, 1H), 2,88 -2,98 (m, 1H), 3,69 y 3,70 (2 x s, 3H), 4,03 -4,06 (m, 2H), 4,36 -4,49 (m, 1H), 4,97 -4,99 (m, 2H); EIMS m/z 264 ([M]++Na).

Compuesto 5. El ester metflico de 4-metileno-L-prolina protegido con N-BOC, compuesto 4, (0,8 g, 3,31 mmol) se disolvi6 en CH2Cl2 (6,5 ml) y se enfri6 a 0°C. Se anadi6 gota a gota una disoluci6n de acido trifluoroacetico (6,5 ml) en CH2Cl2 (6,5 ml) y la mezcla resultante se agit6 a ta durante 1,5 h. Despues de la retirada de los disolventes volatiles con un evaporador rotatorio, el residuo pardo se disolvi6 en 10 ml de H2O y se lav6 con Et2O (3 x 5 ml). La disoluci6n acuosa se concentr6 y se sec6 adicionalmente a vacfo elevado para producir ester metflico de 4-metilenoL-prolina 5 en forma de la sal TFA: 1HNMR (300 MHz, CDCl3, rotameros) < 2,83 - 2,87 (m, 1H), 3,05 -3,11 (m, 1 H), 3,80 y 3,81 (2 x s, 3H), 4,00 -4,10 (m, 2H), 4,55 (dd, J = 5,7, 5,7 Hz, 1H), 5,17-5,21 (m, 2H); 13CRMN < 34,0, 49,1, 53,8, 59,3, 111,7, 137,6, 169,8; EIMS m/z 142 ([M]++1).

Compuesto 6. (Kamal, A.; et al J. Med. Chem. 2002, 45, 4679-4688). Se disolvi6 dietanolamina (3,57 g, 34 mmol) en metanol (20 mL) y se trat6 con Et3N (4,7 mL, 34 mmol) y trifluoroacetato de etilo (4,90 g, 34 mmol) durante 20 h a ta, seguido de la adici6n de otro 1 ml de CF3COOEt. Despues de 20 h mas, la retirada de los disolventes volatiles a vacfo elevado produjo el compuesto N-trifluoroacetil-dietanolamina 6 en forma de un aceite amarillo claro, que se us6 sin purificaci6n adicional.

Compuesto 7. Se anadi6 gota a gota azodicarboxilato de dietilo (7,66 g, 44 mmol) a una disoluci6n agitada de valinato de metilo (7,30 g, 40,1 mmol) y trifenilfosfina (15,67 g, 59,7 mmol) en THF anhidro (57 ml) a 0°C y la mezcla resultante se agit6 durante 1 h a esta temperatura seguido de la adici6n de una disoluci6n de N-trifluoroacetildietanolamina 6 (7,30 g, 40,1 mmol) en THF anhidro (20 ml). Despues de agitar durante una noche a ta, la reacci6n se interrumpi6 con H2O (100 ml) y se extrajo con Et2O (3 x 80 ml). Las capas de Et2O combinadas se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron (MgSO4) y se concentraron. La purificaci6n del residuo por cromatograffa ultrarrapida (gel de sflice, de 8:2 a 7:3 hexanos/EtOAc) produjo N-trifluorocetil-N,N-di[2-(4-metoxicarbonil-2-metoxifenoxi)etil]amina, compuesto 7, en forma de un s6lido blanco: 1H RMN (300 MHz, CDCl3) < 3,81 (s, 3H), 3,84 (s, 3H), 3,87 (s, 3H), 3,88 (s, 3H), 4,04 -4,08 (m, 4H), 4,28 -4,32 (m, 4H), 6,84 y 6,85 (2 x d, J = 6,3 Hz, 2H), 7,50 y 7,51 (2 x d, J = 1,5 Hz, 2H), 7,61 (dd, J = 1,5, 6,3 Hz, 2H).

Compuesto 8. Se anadi6 Cu(NO3)2 s6lido·xH2O (2,33 g, 12,41 mmol) a una disoluci6n agitada de N-trifluorocetil-N,Ndi[2-(4-metoxicarbonil-2-metoxi-fenoxi)etil]amina 7 (2,62 g, 4,96 mmol) en anhfdrido acetico (50 ml) a 0°C. La mezcla de reacci6n se agit6 a 0°C durante 1 h y a ta durante 2 h y despues se verti6 en 200 ml de hielo-agua. La agitaci6n se mantuvo durante 1 h mas. El precipitado amarillo resultante se recogi6 por filtraci6n. La purificaci6n adicional con cromatograffa ultrarrapida (gel de sflice, 6:4 de hexanos/EtOAc) produjo N-trifluorocetil-N,N-di[2-(4-metoxicarbonil-2metoxi-5-nitro-feniloxi)etil]amina, compuesto 8, en forma de un s6lido amarillo claro: 1H RMN (300 MHz, CDCl3) < 3,86 (s, 3H), 3,88 (s, 3H), 3,886 (s, 3H), 3,890 (s, 3H), 4,04 - 4,09 (m, 4H), 4,30 -4,35 (m, 4H), 6,98 y 6,99 (2 x s, 2H), 7,37 y 7,40 (2 x s, 2H).

Compuesto 9. Una disoluci6n de N-trifluorocetil-N,N-di[2-(4-metoxicarbonil-2-metoxi-5-nitro-feniloxi)etil]amina 8 (2,58 g, 4,16 mmol) en THF-MeOH (1:2, 48 ml) se trat6 con K2CO3 ac. al 10� (16 ml) a ta durante 12 h. Despues de la retirada de los materiales volatiles con un evaporador rotatorio, el residuo se diluy6 con 100 ml de H2O y se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). Las capas de EtOAc combinadas se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron (MgSO4) y

se concentraron, produciendo N,N-di[2-(4-metoxicarbonil-2-metoxi-5-nitro-feniloxi)etil]amina, compuesto 9, en forma de un s6lido amarillo, que se us6 sin purificaci6n adicional: 1H RMN (300 MHz, CDCl3) < 3,17 (t, J = 3,9 Hz, 4H), 3,89 (s, 6H), 3,93 (s, 6H), 4,19 (t, J = 3,9 Hz, 4H), 7,05 (s, 2H), 7,47 (s, 2H).

Compuesto 10. Se suspendieron N,N-di[2-(4-metoxicarbonil-2-metoxi-5-nitrofenil-oxi)etil]amina, compuesto 9, (bruto, 4,16 mmol) y NaHCO3 (210 mg, 2,50 mmol) en THF, la mezcla se trat6 con (BOC)2O (999 mg, 4,58 mmol) a 0°C y la agitaci6n se mantuvo a ta durante 3 h. Despues de la retirada del THF, el residuo se reparti6 entre H2O y EtOAc (100/100 ml). La capa acuosa se extrajo de nuevo con EtOAc (2 x 50 ml). Las capas de EtOAc combinadas se lavaron con salmuera (80 ml), se secaron (MgSO4) y se concentraron. La purificaci6n del residuo por cromatograffa ultrarrapida (gel de sflice, 6:4 de hexanos/EtOAc) produjo N-terc-butoxicarbonil-N,N-di[2-(4-metoxicarbonil-2-metoxi5-nitro-feniloxi)etil]amina, compuesto 10, en forma de un s6lido amarillo claro: 1HNMR (300 MHz, CDCl3) < 1,44 (s, 9H), 3,77 (m, 4H), 3,83, 3,86 y 3,87(3 x s, 12H), 4,20 y 4,26 (2 x t, J = 3,9 Hz, 4H), 6,97 y 6,99 (2 x s, 2H), 7,36 y 7,40 (2 x s, 2H); EIMS m/z 646 ([M]++Na).

Compuesto 11. Se suspendi6 N-terc-butoxicarbonil-N,N-di[2-(4-metoxicarbonil-2-metoxi-5-nitro-feniloxi)etil]amina, compuesto 10 (2,11 g, 3,39 mmol) en THF-MeOH-H2O (3:1:1, 65 ml) y se trat6 con LiOH ac. 1 M (14 ml) a ta durante 3 h. Despues de la retirada de los disolventes volatiles, el residuo se diluy6 con H2O (25 ml). La disoluci6n acuosa resultante se acidific6 a pH -1 con HCl concentrado. La N-terc-butoxicarbonil-N,N-di[2-(4-carboxi-2-metoxi-5-nitrofeniloxi)etil]amina que precipit6, compuesto 11, se recogi6 por filtraci6n, se lav6 con H2O y se sec6 adicionalmente a vacfo elevado: 1H RMN (300 MHz, CDCl3, rotameros) < 1,39 (s, 9H), 3,70 (m, 4H), 3,88 y 3,89(2 x s, 6H), 4,29 (m, 4H), 7,29 y 7,31 (2 x s, 2H), 7,63 (s, 2H), 13,60 (s a, 2H); 13 CNMR < 27,8, 46,2 y 46,6, 56,3 y 56,4, 67,2, 79,2, 107,9 y 108,0, 111,3, 141,4 y 141,5, 149,1, 151,7, 154,5, 165,9; HRMS m/z calc. para C25H29N3O14Na 618,1547, encontrado 618,1552 ([M]++Na).

Compuesto 12. Se anadi6 una cantidad catalftica de DMF (2 gotas) a una disoluci6n de la N-terc-butoxicarbonil-N,Ndi[2-(4-carboxi-2-metoxi-5-nitro-feniloxi)etil]amina 11 (194 mg, 0,33 mmol) y cloruro de oxalilo (72,7 ml, 0,81 mmol) en THF anhidro (6,5 ml) y la mezcla resultante se agit6 a ta durante una noche. El exceso de THF y cloruro de oxalilo se retir6 con un evaporador rotatorio. El cloruro de acetilo se suspendi6 de nuevo en THF recien preparado (4 ml) y se anadi6 gota a gota a una disoluci6n de ester metflico de 4-metileno-L-prolina 5 (206,7 mg, 0,81 mmol), Et3N (0,19 ml, 1,39 mmol) y H2O (0,4 ml) en THF (1 ml) a 0°C en una atm6sfera de arg6n. La mezcla de reacci6n se dej6 calentar a ta y la agitaci6n se mantuvo durante 2 h. Despues de la retirada del THF, el residuo se reparti6 entre H2O y EtOAc (10/10 ml). La capa acuosa se extrajo de nuevo con EtOAc (2 x 8 ml). Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera (10 ml), se secaron (MgSO4) y se concentraron. La purificaci6n del residuo por cromatograffa ultrarrapida (gel de sflice, 2:8 de hexanos/EtOAc) produjo ester terc-butflico del acido bis{2-[5-metoxi-2-nitro-4-[(S)-4metileno-2-metoxicarbonil-1-pirrolidinilcarbonil]-feniloxi]-etil}-carbamico 12 en forma de un aceite amarillo claro (rotameros): 1H RMN (300 MHz, CDCl3, rotameros) < 1,46 (s, 9H), 2,68 -2,75 (m, 2H), 2,99 -3,10 (m, 2H), 3,60 4,28 (m, 24H), 4,56 -5,12 (m, 6H), 6,78 -6,83 (m, 2H), 7,63 -7,71 (m, 2H); EIMS m/z 864 ([M]++Na).

Compuesto 13. A una disoluci6n agitada vigorosamente de ester terc-butflico del acido bis{2-[5-metoxi-2-nitro-4-[(S)4-metileno-2-metoxicarbonil-1-pirrolidinilcarbonil]feniloxi]-etil}-carbamico 12 (100 mg, 0,12 mmol) en tolueno anhidro (2,4 ml) se le anadi6 gota a gota una disoluci6n de DIBAL-H (480 Il de una disoluci6n 1 M en tolueno) a -78°C en una atm6sfera de arg6n. Despues de agitar la mezcla durante 45 min mas, el exceso de reactivo se descompuso mediante la adici6n de cinco gotas de metanol seguido de HCl al 5� (4 ml). La mezcla resultante se dej6 calentar a 0°C. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo de nuevo con CH2Cl2 (3 x 3 ml). Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron (MgSO4) y se concentraron. La purificaci6n del residuo por cromatograffa ultrarrapida (gel de sflice, 95:5 de CHCl3/MeOH) produjo ester terc-butflico del acido bis{2-[5-metoxi-2nitro-4-[(S)-4-metileno-2-formil-1-pirrolidinilcarbonil]feniloxi]-etil}-carbamico 13 en forma de un aceite amarillo claro (84 mg, 91�).

Compuesto 14. Una mezcla de ester terc-butflico del acido bis{2-[5-metoxi-2-nitro-4-[(S)-4-metileno-2-formil-1pirrolidinilcarbonil]feniloxi]-etil}-carbamico 13 (180 mg, 0,23 mmol), Na2S2O4 (1,84 mmol, 8 equiv.), 3,5 ml de THF y 2,2 ml de H2O se agit6 a ta durante 20 h. Los disolventes se retiraron a vacfo elevado. El residuo se suspendi6 de nuevo en MeOH (30 ml) y se anadi6 gota a AcCl hasta un valor de pH de -2. La mezcla resultante se agit6 a ta durante 1 h. La reacci6n se trat6 mediante la retirada de la mayor parte del MeOH y despues se diluy6 con EtOAc (25 ml). La disoluci6n de EtOAc se lav6 con NaHCO3 ac. sat. y salmuera, se sec6 (MgSO4) y se concentr6. La purificaci6n del residuo por cromatograffa ultrarrapida (gel de sflice, 97:3 de CHCl3/MeOH) produjo ester terc-butflico del acido bis-{2-[(S)-2-metileno-7-metoxi-5-oxo-1,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-iloxi]-etil}carbamico 14 en forma de un s6lido blanco (86 mg, 50�).

Ejemplo 14 : (11aS)-7-(5-bromopentiloxi)-2-metilen-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2, 1-c][1,4]benzodiazepin-5ona (este compuesto no esta reivindicado)

Esquema 2

K2CO3 (27,64 g, 200 mmol) y 1,5-dibromopentano (20,4 ml, 150 mmol). La mezcla resultante se calent6 a reflujo. Despues de 6 h, el analisis por TLC no mostr6 ningun material de partida restante. La mezcla se enfri6 a ta y el s6lido se retir6 por filtraci6n. El filtrado se concentr6. La purificaci6n por cromatograffa ultrarrapida (gel de sflice, 8:2 de hexanos/EtOAc) produjo ester metflico del acido 4-(5-bromopentiloxi)-3-metoxi-benzoico 15 en forma de un s6lido blanco (13,65 g, 82�): 1H RMN (300 MHz, CDCl3) < 1,60 -1,66 (m, 2H), 1,85 -1,97 (m, 4H), 3,42 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 3,87 (s, 3H), 3,89 (s, 3H), 4,06 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 6,85 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 7,52 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 7,63 (dd, J = 6,3, 1,5 Hz, 1H); EIMS m/z 353 y 355 ([M]++Na).

Compuesto 16. Se anadi6 Cu(NO3)2·xH2O s6lido (3,64 g, 19,42 mmol) a una disoluci6n agitada del ester metflico del acido 4-(5-bromopentiloxi)-3-metoxi-benzoico 15 (5,36 g, 16,18 mmol) en anhfdrido acetico (81 ml) a 0°C. La mezcla de reacci6n se agit6 a 0°C durante 1 h y a ta durante 2 h y despues se verti6 en 200 ml de hielo-agua. La agitaci6n se mantuvo durante 1 h mas. El precipitado amarillo resultante se recogi6 por filtraci6n y se lav6 con agua. Se sec6 adicionalmente a vacfo elevado proporcionando ester metflico del acido 4-(5-bromopentiloxi)-5-metoxi-2-nitrobenzoico, compuesto 16 como un s6lido amarillo claro (5,98 g), que se us6 directamente en la siguiente etapa: 1HNMR (300 MHz, CDCl3) < 1,59-1,70 (m, 2H), 1,85 -1,98 (m, 4H), 3,43 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 3,89 (s, 3H), 3,94 (s, 3H), 4,08 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 7,05 (s, 1 H), 7,42 (s, 1H). EIMS m/z 398 y 400 ([M]++Na).

Compuesto 17. Se suspendi6 ester metflico del acido 4-(5-bromopentiloxi)-5-metoxi-2-nitro-benzoico 16 (5,98 g, 15,9 mmol) en THF-MeOH-H2O (3:1:1, 157 ml) y se trat6 con LiOH ac. 1 M (31 ml) a ta durante 5 h. Despues de la retirada de los disolventes volatiles, el residuo se diluy6 con H2O (70 ml). La disoluci6n acuosa resultante se acidific6 a un valor de pH de -2 con HCl concentrado. El acido 4-(5-bromopentiloxi)-5-metoxi-2-nitro-benzoico precipitado 17 se recogi6 por filtraci6n, se lav6 con H2O y se sec6 de nuevo a vacfo elevado (5,47 g): 1H RMN (300 MHz, CDCl3) < 1,64 -1,68 (m, 2H), 1,87 -1,98 (m, 4H), 3,43 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 4,08 (s, 3H), 4,10 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 7,21 (s, 1H), 7,35 (s, 1H), 13,60 (s a, 1H); EIMS m/z 384 y 386 ([M]++Na).

Compuesto 18. Se anadi6 una cantidad catalftica de DMF (2 gotas) a una soluci6n del acido 4-(5-bromopentiloxi)-5metoxi-2-nitro-benzoico 17 (270 mg, 0,74 mmol) y cloruro de oxalilo (80 Il, 0,89 mmol) en THF anhidro (7,5 ml) y la mezcla resultante se agit6 a ta durante una noche. El exceso de THF y cloruro de oxalilo se retiraron con un evaporador rotatorio. El cloruro de acetilo se suspendi6 de nuevo en THF recien preparado (6 ml) y se anadi6 gota a gota a una disoluci6n de ester metflico de 4-metileno-L-prolina 5 (228 mg, 0,89 mmol), Et3N (0,32 ml, 2,31 mmol) y H2O (0,15 ml) en THF (1,5 ml) a 0°C en una atm6sfera de arg6n. La mezcla de reacci6n se dej6 calentar a ta y la agitaci6n se mantuvo durante 4 h. Despues de la retirada de THF, el residuo se reparti6 entre H2O y EtOAc (20/20 ml). La capa acuosa se extrajo de nuevo con EtOAc (3 x 10 ml). Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera (20 ml), se secaron (MgSO4) y se concentraron. La purificaci6n del residuo por cromatograffa ultrarrapida (gel de sflice, 6:4 de hexanos/EtOAc) produjo ester metflico de 1-[4-(5-bromopentiloxi)-5-metoxi-2-nitro-benzoil]-4metileno-L-prolina 18 en forma de un aceite amarillo claro (rotameros): 1HNMR (300 MHz, CDCl3, rotameros) < 1,621,68 (m, 2H), 1,86-1,98 (m, 4H), 2,64 -2,75 (m, 1 H), 2,99 -3,08 (m, 1 H), 3,43 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 3,59 -3,96 (m, 7H), 4,05 -4,21 (m, 3H), 4,57 -4,61 y 4,90 -5,12 (m, 3H), 6,80 y 6,83 (2 s, 1 H), 7,64 y 7,67 (2 s, 1 H); EIMS m/z 507 y 509 ([M]++Na).

Compuesto 19. A una soluci6n agitada vigorosamente de ester metflico de 1-[4-(5-bromopentiloxi)-5-metoxi-2-nitrobenzoil]-4-metileno-L-prolina 18 (61 mg, 0,12 mmol) en tolueno anhidro -CH2Cl2(3:1, 2,5 ml) se le anadi6 gota a gota una soluci6n de DIBAL-H (188 Il de una soluci6n 1 M en tolueno) a -78°C en una atm6sfera de arg6n. Despues de agitar la mezcla durante 45 min mas, el exceso de reactivo se descompuso mediante la adici6n de tres gotas de metanol seguido de HCl al 5� (2 ml). La mezcla resultante se dej6 calentar a 0°C. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo de nuevo con CH2Cl2 (3 x 2 ml). Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron (MgSO4) y se concentraron. La purificaci6n del residuo por cromatograffa ultrarrapida (gel de sflice, 1:1 de hexanos/EtOAc) produjo (S)-1-[4-(5-bromopentiloxi)-5-metoxi-2-nitro-benzoil]-4-metileno-2-pirrolidinacarboxaldehfdo 19 en forma de un aceite amarillo claro (44 mg, 80�).

Compuesto 20. Una mezcla del (S)-1-[4-(5-bromopentiloxi)-5-metoxi-2-nitro-benzoil]-4-metileno-2pirrolidinacarboxaldehfdo 19 (43,7 mg, 0,096 mmol), Na2S2O4 (0,58 mmol, 6 equiv.), 1,5 ml de THF y 0,9 ml de H2O se agit6 a ta durante 18 h. Los disolventes se retiraron a vacfo elevado. El residuo se suspendi6 de nuevo en MeOH (6 ml) y se anadi6 gota a gota AcCl hasta un valor de pH de -2. La mezcla resultante se agit6 a ta durante 1 h. La reacci6n se trat6 mediante la retirada de la mayor parte del MeOH y despues se diluy6 con EtOAc (20 ml). La disoluci6n de EtOAc se lav6 con NaHCO3 ac. sat. y salmuera, se sec6 (MgSO4) y se concentr6. La purificaci6n del residuo por cromatograffa ultrarrapida (gel de sflice, 98:2 de CHCl3/MeOH) produjo (11aS)-7-(5-bromopentiloxi)-2metileno-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona 20 en forma de un aceite amarillo claro (31 mg, 74�): 1HNMR (300 MHz, CDCl3). < 1,58-1,66 (m, 2H), 1,84-1,99 (m, 4H), 2,91-2,95 (m, 1 H), 3,08 -3,14 (m, 1 H), 3,42 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 3,93 (s, 3H), 3,87-4,27 (m, 5H), 5,15 (br s, 1 H), 5,18 (br s, 1 H), 6,84 (s, 1 H), 7,49 (s, 1 H), 7,71 (d, J = 4,0 Hz, 1 H); EIMS m/z 429 y 431 ([M]++Na).

El compuesto 20 se puede acoplar a continuaci6n a (11aS)-8-hidroxi-7-metoxi-2-metilen-1,2,3,11a-tetrahidro-5Hpirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona :

para proporcionar el compuesto 4 del ejemplo 11.

• Ejemplo 15: 8,8'-[3-(2-acetiltioetil)-1,5-pentanediilbis(oxi)]-bis[(S)-2-metilen-7-metoxi-1,2,3,11 a-tetrahidro5H-pirrolo[2, 1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona] (este compuesto no esta reivindicado)

A una disoluci6n de trifenilfosfina (1,77 g, 6,8 mmol) en THF anhidro (15 ml) se le anadi6 gota a gota azodicarboxilato de dietilo (2,2 M en tolueno, 2,4 ml, 5,4 mmol) a 0°C. Despues de agitar a 0°C durante 55 minutos, se anadi6 gota a gota una disoluci6n de 3-(2-hidroxietil)pentano-1,5-diol (740 mg, 5 mmol) y acido tioacetico (335 Il, 4,5 mmol) en THF seco (7 ml). Despues de 1 hora, el bano de hielo/agua se retir6 y la reacci6n se agit6 a temperatura ambiente durante 16 horas. Los disolventes se retiraron por evaporaci6n rotatoria al vacfo. El residuo se purific6 por cromatograffa ultrarrapida (CHCl3/MeOH, 20:1, 15:1, 10:1, 4:1) para dar 3-(2-acetiltioetil)pentano-1,5-diol en forma de un s6lido blanco (350 mg) y se recuper6 el material de partida triol (406 mg). 1H RMN (400 Hz, CDCl3): < 3,65-3,63 (m, 4H), 3,45 (s a, 2H), 2,84-2,80 (m, 2H), 2,28 (s, 3H), 1,73-1,67 (m, 1H), 1,55-1,49 (m, 6H). MS (ESI): m/z 229,0 (M + Na)+.

A una disoluci6n de trifenilfosfina (53 mg, 0,2 mmol) en THF anhidro (0,4ml) se le anadi6 gota a gota azodicarboxilato de disopropilo (36 Il, 0,17 mmol) a 0°C. Despues de agitar a 0°C durante 25 minutos, se anadi6 una disoluci6n de (11aS)-8-hidroxi-7-metoxi-2-metileno-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona, el mon6mero PBD (38 mg, 0,14 mmol, co-evaporado con benceno seco y secado a vacfo elevado durante dos horas antes del uso) en THF seco (0,2 ml). La mezcla se mantuvo en agitaci6n durante 10 minutos antes de que se anadiera el compuesto tioacetato (12 mg, 0,058 mmol, coevaporado con benceno seco y secado a vacfo elevado durante dos horas antes del uso) en THF seco (0,2 ml). La mezcla de reacci6n se dej6 en agitaci6n a 0°C durante 35 minutos. El bano de hielo/agua se retir6 y la disoluci6n se agit6 a temperatura ambiente durante 12 horas. Los disolventes se retiraron por evaporaci6n rotatoria al vacfo. El residuo se purific6 por cromatograffa ultrarrapida

(CHCl3/MeOH, 100:1, 50:1, 25:1, 20:1) para formar 8,8'-[3-(2-acetiltioetil)-1,5-pentanodiilbis(oxi)]-bis[(S)-2-metileno7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] (19 mg, r = 47�). 1H RMN (400 Hz, CDCl3): < 7,66 (d, J = 4,4 Hz, 2H), 7,46 (s, 2H), 6,78 (s, 2H), 5,17 (s, 2H), 5,14 (s, 2H), 4,26 (s, 4H), 4,17-4,09 (m, 4H), 3,88 (s, 6H), 3,87-3,83 (m, 2H), 3,13-3,06 (m, 2H), 2,94-2,90 (m, 4H), 2,29 (s, 3H), 1,95 (s a, 3H), 1,68 (s a, 4H). MS (ESI, con H2O): m/z 745,3 (M + 2H2O + Na)+, 727,3 (M + H2O + Na)+, 709,2 (M + Na)+.

• Ejemplo 16: Procedimiento general para la preparacion de conjugados:

Para la conjugaci6n con derivados de tomaimicina se selecciona el anticuerpo anti-B4 que se une al antfgeno CD19 expresado preferentemente en la superficie de celulas de linfoma humano.

En la primera etapa, el anticuerpo se hace reaccionar con el agente modificador 5-nitro-2-piridilditiobutanoato de Nsulfosuccinimidilo (SSNPB) para introducir grupos nitropiridilditio. Una disoluci6n de anticuerpo huC242 a una concentraci6n de 8 mg/ml en un tamp6n acuoso que contiene fosfato potasico 0,05 M, cloruro s6dico 0,05 M y acido etilendiaminatetraacetico 2 mM (EDTA), pH 6,5 (65,6 ml) se trata con un exceso molar de 8 veces de una disoluci6n de SSNPB en dimetilacetamida (DMA). La mezcla de reacci6n se agita a temperatura ambiente durante 90 min. y despues se introduce en una columna de exclusi6n molecular Sephadex G25 (50 mm x 35,5 mm, columna) que previamente se ha equilibrado en un tamp6n acuoso que contiene fosfato potasico 0,05 M, cloruro s6dico 0,05 M y EDTA 2 mM, pH 7,5. Las fracciones modificadas que contienen anticuerpo se recogen y se reunen para producir el producto. Una pequena alfcuota del anticuerpo modificado se trata con ditiotreitol para escindir el disulfuro de nitropiridilo y la nitro-piridina-2-tiona liberada se ensaya espectrofotometricamente (£323nm = 4.299 M-1cm-1,£280nm = 565 M1cm-1 para el compuesto y £280nm = 217.560 M-1cm-1 para el anticuerpo). Por molecula de anticuerpo tfpicamente se une una media de 4 a 6 moleculas de nitro-piridildisulfuro.

El anticuerpo modificado se diluye a 2,5 mg/ml en el tamp6n anterior a pH 7,5 y despues se trata con una disoluci6n del derivado de tomaimicina en DMA, de tal forma que la concentraci6n final de DMA en el tamp6n sea 20�. La mezcla de conjugaci6n se agita a temperatura ambiente durante 16 h. La mezcla de reacci6n se purifica por su paso a traves de una columna de exclusi6n molecular Sephacril S300 (50 mm x 42 cm, columna que previamente se ha equilibrado en tamp6n de disoluci6n salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 6,5. Las fracciones que contienen anticuerpo monomerico-derivado de tomaimicina se reunen y se dializan en el tamp6n PBS. El conjugado final se ensaya espectrofotometricamente usando los coeficientes de extinci6n que se determinan por separado para cada derivado de tomaimicina.

• Ejemplo 17 : Ensayo de Union

Las afinidades de uni6n relativas del anticuerpo anti-B4 y su conjugado de tomaimicina en celulas Ramos que expresan el antfgeno se determinan usando un ensayo basado en fluorescencia. Se anaden el conjugado anticuerpo -tomaimicina y el anticuerpo desnudo en concentraciones iniciales de 1 a 10-7 M, en placas de 96 pozos y se valoran utilizando diluciones en serie de 3 veces, a fin de que haya duplicados para cada concentraci6n. Se anaden celulas Ramos 50.000 celulas por pozo, a cada pozo conteniendo distintas concentraciones del anticuerpo o conjugado, asf como a los pozos de control. Las placas se incubaron en hielo durante 3 horas. Despues del periodo de incubaci6n, se lavaron las celulas en la placa y se anade un anticuerpo secundario marcado para fluorescencia que se une a IgG humanizada, como anti-B4 y se incubaron las placas durante 1 hora en hielo. Se lavaron las placas de nuevo despues del periodo de incubaci6n y se fijaron las celulas con disoluci6n de formaldehfdo al 1�/PBS . Se ley6 la fluorescencia en cada pozo de las placas utilizando un analizador de fluorescencia FACSCalibur Becton Dickinson. Los datos se representaron graficamente como un porcentaje de la fluorescencia maxima obtenida para la concentraci6n mas alta de anticuerpo o conjugado.

-: Ejemplo 18: Potencia y especificidad in vitro del derivado de tomaimicina o de conjugados del derivado de tomaimicina. Protocolo general a usar:

Se anaden muestras de un derivado libre de tomaimicina o de un conjugado de derivado de tomaimicina a una placa de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo plano y se valoran usando diluciones en serie que varfan de 1 x 10-12 M a 3 x 10-7 M. Se anaden celulas tumorales antfgeno-positivas o celulas tumorales antfgeno-negativas a los pocillos de tal manera que haya muestras por triplicado para cada concentraci6n de farmaco para cada lfnea celular. Las placas se incuban a 37°C en una atm6sfera con 5� de CO2 durante 4 dfas.

Al final del periodo de incubaci6n, se anadieron 20 Il del reactivo de tetrazolio WST-8 sal monos6dica de (2-(2metoxi-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2-tetrazolio) a cada pozo y las placas se devuelven a la incubadora, durante 2 horas. Despues se mide la absorbancia en cada pozo de las placas utilizando el lector de placas de Molecular Devices a 450 nm. Se represent6 graficamente la fracci6n de supervivencia de celulas en cada concentraci6n de derivado de tomaimicina o conjugado.

Compuestos: A549 (CI50) �B (CI50) MC�7 (CI50)

Ejemplo 5: 7 x 10-11 M 1 x 10-10 M 1 x 10-10 M

Ejemplo 1: �10-12 M �10-12 M �10-12 M

Ejemplo 2: �10-12 M �10-12 M �10-12 M

• Ejemplo 19: Eficacia in vivo de derivados de tomaimicina o de conjugados de derivados de tomaimicina.

Los ensayos pueden realizarse por medio de la aplicaci6n y/o adaptaci6n del protocolo descrito en el documento WO 2004/103272, con huB4 como anticuerpo y lfneas celulares antfgeno-positivas apropiadas tales como Ramos y lfneas de linfoma de Rajii Burkitt.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Compuestos de f6rmula (I):

donde:

----

representa un enlace sencillo opcional;

----

representa o un enlace sencillo o un doble enlace ;

con la condici6n de que cuando ----represente un enlace sencillo, U y U', iguales o diferentes, representen independientemente H y W y W, iguales o diferentes, se seleccionan independientemente del grupo que consiste en OH, -OR, -OCOR, -OCOOR, -OCONRR', un carbamato cfclico tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -NRCONRR', -OCSNHR, un tiocarbamato cfclico tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -SH, -SR, -SOR, -SOOR, -SO3, -OSO3, -NRSOOR, -NRR', amina opcionalmente cfclica tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -NROR', -NRCOR, -N3, un ciano, un halo, un trialquil o triarilfosfonio ;

y cuando ----represente un doble enlace, U y U' estan ausentes y W y W' representan H;

R1, R2, R1', R2' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre un Haluro o Alquilo opcionalmente sustituido con uno o mas Hal, CN, NRR', CF3, OR, Arilo, Het, S(O)qR, o R1 y R2 y R1' y R2' forman juntos un grupo que contiene un doble enlace =B y =B' respectivamente.

B y B' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre alquilo opcionalmente sustituido con uno o mas de Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR, Arilo, Het;

-

A y A' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre Alquilo o Alquenilo estando cada uno opcionalmente sustituido con uno o mas de Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR, Arilo, Het, Alquilo, Alquenilo.

-

Y e Y' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre H, OR;

-q es 0, 1 6 2; n, n', iguales o diferentes, son 0 6 1 ; R y R' son iguales o diferentes y se seleccionan independientemente de H, Alquilo, Arilo, estando cada uno

opcionalmente sustituido con Hal, CN, NRR', CF3, OR, Arilo, Het;

-

T es -NR-o un arilo o heteroarilo de 4 a 10 miembros, estando cada uno opcionalmente sustituido con uno o mas Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR, alquilo y sustituidos con uno o mas sustituyente(s) que contienen tiol-, sulfuro-o disulfuro de f6rmula:

-

(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ' ;

-

(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)y(OCH2CH2)ySZ';

-

(CR13R14)t(NT19CO)(CR15R18)u(OCH2CH2)ySZ';

-

(CR13R14)t(OCO)(R15R16)u(OCH2CH2)ySZ';

-

(CR13R14)t(CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ' :

-

(CR13R14)t(CONR19)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ' ;

-

(CR13R14)t-fenil-CO(CR15R16)uSZ'; -(CR13R14)t-furil-CO(CR15R16)uSZ';

-

(CR13R14)t-oxazolil-CO(CR15R16)uSZ'; -(CR13R14)t-tiazolil-CO(CR15R16)uSZ';

-

(CR13R14)t-tienil-CO(CR15R16)uSZ'; -(CR13R14)t-imidazolil-CO(CR15R16)uSZ', -(CR13R14)t-morfolino-CO(CR15R16)uSZ'; -(CR13R14)t-piperazino-CO(CR15R16)uSZ'; -(CR13R14)t-N-metil-piperazino-CO(CR15R16)uSZ'; -(CR13R14)t-fenil-QSZ'; -(CR13R14)t-furil-QSZ'; -(CR13R14)t-oxazolil-QSZ';

5 -(CR13R14)t-tiazolil-QSZ'; -(CR13R14)t-tienil-QSZ'; -(CR13R14)t-imidazolil-QSZ'; -(CR13R14)t-morfolino-QSZ'; -(CR13R14)t-piperazino-QSZ'; -(CR13R14)t-N-metilpiperazino-QSZ'; -O(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ'; -O(CR13R14)t-NR19CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';

10 -O(CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)t (OCH2CH2)ySZ'; -O-fenil-OSZ'; -O-furil-QSZ'; -O-oxazolil-QSZ'; -O-tiazolil-QSZ'; -O-tienil-QSZ'; -O-imidazolil-QSZ'; -O-morfolino-QSZ'; -O-piperazino-QSZ'; -O-N-metilpiperazino-QSZ'; -OCO-(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';

15 -OCONR12(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ'; -OCO-fenil-QSZ'; -OCO-furil-QSZ'; -OCO-oxazolil-QSZ'; -OCO-tiazolil-QSZ'; -OCO-tienil-QSZ'; -OCO-imidazolil-QSZ'; -OCO-morfolino-QSZ' ; -OCO-piperazino-QSZ'; -OCO-N-metilpiperazino-QSZ'; -CO(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)y SZ';

20 -CO-(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ'; -CONR12(CR13R14)tCR15R16)u (OCH2CH2)ySZ'; -CO-fenil-QSZ'; -CO-furil-QSZ'; -CO-oxazolil-QSZ'; -CO-tiazolil-QSZ'; -CO-tienil-QSZ'; -CO-imidazolil-QSZ'; -CO-morfolino-QSZ' ; -CO-piperazino-QSZ'; -CO-piperidino-QSZ'; -CO-N-metilpiperazino-QSZ';

25 -NR19(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';

-NR19CO(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ'; -NR19(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)ySZ'; -NR19CO(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)ySZ'; -NR19CONR12(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';

30 -NR19CONR12(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)ySZ'; -NR19CO-fenil-QSZ'; -NR19CO-furil-OSZ'; -NR19CO-oxazolil-QSZ'; -NR19CO-tiazolil-QSZ'; -NR19CO-tianil-QSZ'; -NR19CO-imidazolil-QSZ'; -NR19CO-morfolino-QSZ'; -NR19CO-piperazino-QSZ'; -NR19CO-piperidino-QSZ'; -NR19CO-N-metilpiperazino-QSZ';

35 -NR19-fenil-QSZ'; -NR19-furil-QSZ'; -NR19-oxazolil-QSZ'; -NR19-tiazolil-QSZ'; -NR19-tienil-QSZ'; -NR19-imidazolil-QSZ'; -NR19-morfolino-QSZ'; -NR19-piperazino-QSZ'; -NR19-piperidino-QSZ'; -NR19-N-metilpiperazino-QSZ';

-NR19CO-NR12-fenil-QSZ'; -NR19CO-NR12-oxazolil-QSZ'; -NR19CO-NR12-tiazolil-QSZ'; -NR19CO-NR12-tienil-QSZ'; -NR19CO-NR12-piperidino-QSZ';

-

S(O)q(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';

5 -S(O)q(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)ySZ';

-

SCONR12(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)ySZ';

-SCO-morfolino-QSZ'; -SCO-piperazino-QSZ'; -SCO-piperidino-QSZ'; -SCO-N-metilpiperazino-QSZ' donde:

10 � �' es H, Ac, R19' o SR19';

�

Q es un enlace directo o un alquilo lineal o alquilo ramificado que tiene de 1-10 atomos de carbono o un espaciador de polietilenglicol con 2 a 20 unidades repetitivas etilenoxi;

�

R19' y R12 son iguales o diferentes y son alquilo lineal, alquilo ramificado o alquilo cfclico que tiene de 1 a 10 atomos de carbono o arilo simple o sustituido o heterociclo y R12 puede ser ademas H ;

15 � R13, R14, R15 y R16 son iguales o diferentes y son H o un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 atomos de carbono,

�

R17, R18 y R19 son H o alquilo;

�

u es un numero entero de 1 a 10 y tambien puede ser 0,

� t es un numero entero de 1 a 10 y tambien puede ser 0, 20 � y es un numero entero de 1 a 20 y tambien puede ser 0.

o sus sales, hidratos o sales hidratadas aceptables farmaceuticamente o las estructuras cristalinas polim6rficas de estos compuestos o sus is6meros 6pticos, racematos, diastere6meros o enanti6meros.
2.

Compuestos segun la reivindicaci6n 1 en donde n=n'=1.
3.

Compuestos segun la reivindicaci6n 1 6 2 de f6rmula (II) :
4.

Compuestos segun las reivindicaciones 1 a 3, en donde � y � son iguales o diferentes y son -OH, -OMe, -OEt, -NHCONH2, -SMe.
5.

Compuestos de acuerdo con la reivindicaci6n 1 6 2 de f6rmula:

30 o
6.

Compuestos segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde A�A'.
7.

Compuestos segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que A�A'= alquilo no sustituido lineal.
8.

Compuestos segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que ��'.
9.

Compuestos segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que ��'=OAlquilo.
10.

Compuestos segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que ��'=OMe.
11.

Compuestos segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde T es un fenilo o piridilo.
12.

Un conjugado que comprende al menos un compuesto de f6rmula :

donde:

-

representa un enlace sencillo opcional;

----

representa o un enlace sencillo o un doble enlace ;

con la condici6n de que cuando ----represente un enlace sencillo, U y U', iguales o diferentes, representen independientemente H y W y W, iguales o diferentes, se seleccionan independientemente del grupo que consiste en OH, -OR, -OCOR, -OCOOR, -OCONRR', un carbamato cfclico tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -NRCONRR', -OCSNHR, un tiocarbamato cfclico tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -SH, -SR, -SOR, -SOOR, -SO3, -OSO3, -NRSOOR, -NRR', amina opcionalmente cfclica tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -NROR', -NRCOR, -N3, un ciano, un halo, un trialquil o triarilfosfonio ;

y cuando ----represente un doble enlace, U y U' estan ausentes y W y W' representan H;

-

R1, R2, R1', R2' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre un Haluro o Alquilo opcionalmente sustituido con uno o mas Hal, CN, NRR', CF3, OR, Arilo, Het, S(O)qR, o R1 y R2 y R1' y R2' forman juntos un grupo que contiene un doble enlace =B y =B' respectivamente.

�

B y B' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre alquilo opcionalmente sustituido con uno o mas de Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR, Arilo, Het;

�

A y A' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre Alquilo o Alquenilo estando cada uno opcionalmente sustituido con uno o mas de Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR, Arilo, Het, Alquilo, Alquenilo.

-

�e �' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre H, OR;

-

q es 0, 1 6 2;

-

n, n' iguales o diferentes, son 0 6 1 ;

-

R y R' son iguales o diferentes y se seleccionan independientemente de H, Alquilo, Arilo, estando cada uno opcionalmente sustituido con Hal, CN, NRR', CF3, OR, Arilo, Het;

-

T es -NR-o un arilo o heteroarilo de 4 a 10 miembros, estando cada uno opcionalmente sustituido con uno o mas Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR, alquilo y sustituidos con uno o mas enlazador(es) que contienen tiol-, sulfuro-o disulfuro de f6rmula:

-

(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ' ;

-(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)y(OCH2CH2)ySZ'; -(CR13R14)t(NR19CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)y SZ'; -(CR13R14)t(OCO)(R15R16)u(OCH2CH2)ySZ'; -(CR13R14)t(CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';

5 -(CR13R14)t(CONR19)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ' ; -(CR13R14)t-fenil-CO(CR15R16)uSZ'; -(CR13R14)t-furil-CO(CR15R16)uSZ'; -(CR13R14)t-oxazolil-CO(CR15R16)uSZ'; -(CR13R14)t-tiazolil-CO(CR15R16)uSZ'; -(CR13R14)t-tienil-CO(CR15R16)uSZ'; -(CR13R14)t-imidazolil-CO(CR15R16)uSZ', -(CR13R14)t-morfolino-CO(CR15R16)uSZ';

10 -(CR13R14)t-piperazino-CO(CR15R16)uSZ'; -(CR13R14)t-N-metil-piperazino-CO(CR15R16)uSZ'; -(CR13R14)t-fenil-QSZ'; -(CR13R14)t-furil-QSZ'; -(CR13R14)roxazolil-QSZ'; -(CR13R14)t-tiazolil-QSZ'; -(CR13R14)t-tienil-QSZ'; -(CR13R14)t-imidazolil-QSZ'; -(CR13R14)t-morfolino-QSZ'; -(CR13R14)t-piperazino-QSZ';

15 -(CR13R14)t-metilpiperazino-QSZ'; -O(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ'; -O(CR13R14)t(NR19CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ'; -O(CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)t (OCH2CH2)ySZ'; -O-fenil-QSZ'; -O-furil-QSZ'; -O-oxazolil-QSZ'; -O-tiazolil-QSZ'; -O-tienil-OSZ';

20 -O-imidazolil-QSZ'; -O-morfolino-OSZ'; -O-piperazino-QSZ'; -O-N-metilpiperazino-QSZ'; -OCO-(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ'; -OCONR12(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ'; -OCO-fenil-QSZ'; -OCO-furil-QSZ'; -OCO-oxazolil-QSZ'; -OCO-tiazolil-OSZ';

25 -OCO-tienil-QSZ'; -OCO-imidazolil-QSZ'; -OCO-morfolino-QSZ' ; -OCO-piperazino-QSZ'; -OCO-N-metilpiperazino-QSZ'; -CO(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ'; -CO-(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ'; -CONR12(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';

30 -CO-fenil-QSZ'; -CO-furil-QSZ'; -CO-oxazolil-QSZ'; -CO-tiazolil-QSZ'; -CO-tienil-QSZ'; -CO-imidazolil-QSZ'; -CO-morfolino-QSZ' ; -CO-piperazino-OSZ'; -CO-piperidino-QSZ'; -CO-N-metilpiperazino-QSZ'; -NR19(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';

-

NR19CO(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';

35 -NR19(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)ySZ'; -NR19CO(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)ySZ'; -NR19CONR12(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';

-

NR19CO NR12(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R18)t (OCH2CH2)ySZ';

-

NR19CO-fenil-QSZ'; -NR19CO-furil-QSZ'; -NR19CO-oxazolil-QSZ'; -NR19CO-tiazolil-QSZ'; -NR18CO-tienil-QSZ'; -NR19CO-imidazolil-QSZ'; -NR19CO-morfolino-QSZ'; -NR19CO-piperazino-QSZ'; -NR19CO-piperidino-QSZ'; -NR19CO-N-metilpiperazino-QSZ'; -NR19-fenil-QSZ'; -NR19-furil-QSZ'; -NR19-oxazolil-QSZ'; -NR19-tiazolil-QSZ'; -NR19-tienil-QSZ'; -NR19-imidazolil-QSZ'; -NR19-morfolino-QSZ'; -NR19-piperazino-QSZ'; -NR19-piperidino-QSZ'; -NR19-N-metilpiperazino-QSZ'; -NR19CO-NR12-fenil-QSZ'; -NR19CO-NR12-oxazolil-QSZ'; -NR19CO-NR12-tiazolil-QSZ'; -NR19CO-NR12-tienil-QSZ'; -NR19CO-NR12-piperidino-QSZ';

-

S(O)q(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)ySZ';

-

S(O)q(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)ySZ';

-

SCONR12(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)ySZ';

-SCO-morfolino-QSZ'; -SCO-piperazino-QSZ'; -SCO-piperidino-QSZ'; -SCO-N-metilpiperazino-QSZ' donde: � �' es H, Ac, R19' o SR19';

�

Q es un enlace directo o un alquilo lineal o alquilo ramificado que tiene de 1-10 atomos de carbono o un espaciador de polietilenglicol con 2 a 20 unidades repetitivas etilenoxi;

�

R19' y R12 son iguales o diferentes y son alquilo lineal, alquilo ramificado o alquilo cfclico que tiene de 1 a 10 atomos de carbono o arilo simple o sustituido o heterociclo y R12 puede ser ademas H ;

�

R13, R14, R15 y R16 son iguales o diferentes y son H o un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 atomos de carbono,

�

R17, R18 y R19 son H o alquilo;

�

u es un numero entero de 1 a 10 y tambien puede ser 0,

�

t es un numero entero de 1 a 10 y tambien puede ser 0,

�

y es un numero entero de 1 a 20 y tambien puede ser 0.

o sus sales farmaceuticamente aceptables, hidratos o sales hidratadas, o las estructuras polim6rficas cristalinas de estos compuestos o sus is6meros 6pticos, racematos, diastereois6meros o enanti6meros,

estando dicho compuesto unido covalentemente a un agente de uni6n a las celulas a traves de dicho enlazador.
13.

Un conjugado segun la reivindicaci6n 12 en donde U, U', W, W, T, R1, R2, R1', R2', Y, Y', A, A', n, n', -, ---son como se definen en las reivindicaciones 2 a 11.
14.

Un conjugado segun la reivindicaci6n 12 o 13 en donde dicho agente de uni6n a celula se elige entre anticuerpos, fragmento de un anticuerpo que contiene al menos un sitio de uni6n, linfoquinas, hormonas, factores de crecimiento, moleculas de transporte de nutrientes.
15.

Un conjugado segun las reivindicaciones 12 a 14 en donde el agente de uni6n a la celula se elige de anticuerpos monoclonales; anticuerpos monocatenarios; Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, interferones; peptidos; IL-2, IL-3, IL4, IL-6; insulina, TRH (hormoas liberadores de tirotropina), MSH (hormonas estimuladores de melanocito), hormonas esteroides, andr6genos, estr6genos; EGF, TGFa, factor de crecimiento similar a insulina (IGF-I, IGF-II) G-CSF, M-CSF, GM-CSF; folato, transferrina.
16.

Una composici6n farmaceutica que comprende un conjugado segun se define en las reivindicaciones 12 a 15 o un compuesto como se define en las reivindicaciones 1 a 11 junto con un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
17.

Proceso de preparaci6n de un conjugado segun una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, que comprende la etapa en la que un compuesto de f6rmula (I) como se ha definido en la reivindicaci6n 1, en el que T comprende un grupo sulfuro, disulfuro o tiol, o un precursor del mismo, se hace reaccionar con un agente de uni6n a las celulas que comprende una funci6n reactiva con disulfuro o tiol de manera que el compuesto y el agente de uni6n a las celulas se unen entre sf a traves de un enlace covalente.
18.

Proceso de preparaci6n de un conjugado en donde un agente de uni6n a la celula que contiene un tiol libre

o protegido se hace reaccionar con un compuesto que contiene disulfuro o tiol de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, siendo el agente de uni6n a la celula un peptido o un anticuerpo modificado con un agente de reticulaci6n.
19.

Proceso segun la reivindicaci6n 18 en donde el agente de reticulaci6n es 3-(2-piridilditio)propionato de Nsuccinimidilo, 4-(2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidilo, 4-succinimidil-oxicarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)tolueno, butirato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio), butirato de N-sulfosuccinimidil-3-(2-(5-nitro-piridilditio), 2iminotiolano o anhfdrido S-acetilsuccfnico.
20.

Proceso segun la reivindicaci6n 17, en donde :

-

el grupo tiopiridilo de un anticuerpo monoclonal modificado por piridilditiopropionato de succinimidilo se desplaza por tratamiento con un compuesto que contiene tiol segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para producir un conjugado unido a disulfuro;

-

el grupo aril-tiol de un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 es desplazado por grupos sulfhidrilo previamente introducidos en un anticuerpo para producir un conjugado unido a disulfuro.
21.

Proceso segun la reivindicaci6n 17 en donde un compuesto que contiene tiol de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 se une vfa un enlace tioeter, a un anticuerpo o un agente de uni6n a la celula modificado por 4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato de N-succinimidilo, N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1carboxi-(6-amidocaproato).
22.

Proceso segun la reivindicaci6n 17 en donde el agente de reticulaci6n comprende un resto basado en haloacetilo y se elige entre succinimidil-4-(iodoacetil)-aminobenzoato, iodoacetato de N-succinimidilo, bromoacetato de N-succinimidilo o 3-(bromo-acetamido)propionato de N-succinimidilo.
23.

Proceso segun las reivindicaciones 17 a 22 en donde el conjugado se purifica :

-

mediante una tecnica de cromatograffa estandar seleccionada entre HPLC, cromatograffa de exclusi6n de tamano, cromatograffa de adsorci6n, cromatograffa de intercambio i6nico, cromatograffa de interacci6n hidrof6bica o cromatograffa de afinidad, cromatograffa sobre hidroapatita ceramica ;

• o por dialisis ;

• o por diafiltraci6n.
24.

Uso de una cantidad eficaz de un conjugado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 o un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la preparaci6n de un medicamento para el tratamiento de cancer.
25.

Un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para uso como un agente anticanceroso.
26.

Un conjugado segun una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 para uso como un agente anticanceroso.