ES2368843T3 - Implante de tejido de seda biocompatible. - Google Patents

Abstract

Un implante de tela biocompatible, comprendiendo el implante de tela: un hilo, comprendiendo dicho hilo una o mas fibras de fibrofna de seda a las que se les ha extrafdo la sericina que sustancialmente mantienen su estructura proteica nativa y no se han disuelto ni reconstituido, siendo dichas fibras de fibrofna de seda a las que se les ha extrafdo la sericina biocompatibles y estando organizadas de manera no arbitraria, en el que dicho hilo estimula el crecimiento de celulas alrededor de dichas fibras de fibrofna de seda a las que se les ha extrafdo la sericina y en el que dichas fibras de fibrofna de seda a las que se les ha extrafdo la sericina son biodegradables.

Description

Implante de tejido de seda biocompatible Campo de la invenci6n

Las dolencias, el envejecimiento, el desgaste traumatologico o cr6nico a menudo llevan a fallos en tejidos u 6rganos. Al tratar tales fallos, el objetivo de muchos procedimientos clfnicos es la restauraci6n de la funci6n. Un paciente a menudo requiere mayor apoyo, mas alla de los propios medios de curaci6n del cuerpo, tales como cirujfa o la implantaci6n de un dispositivo medico. Tales procedimientos solamente se necesitan para combatir la discapacidad permanente e incluso la muerte. Los campos de ingenierfa de biomateriales y tejidos estan proporcionando nuevas opciones para restaurar gradualmente tejidos nativos y funciones de 6rganos a traves de la busqueda y el desarrollo de andamios, matrices y construcciones (es decir, dispositivos) temporales que inicialmente apoyen un tejido u 6rgano discapacitado, pero que finalmente permitan el desarrollo y la reforma del propio tejido biol6gicamente y mecanicamente funcional del cuerpo.

Las responsabilidades o los requisitos de diseno de tal andamio incluyen: (i) la habilidad para proporcionar estabilizaci6n mecanica inmediata al tejido danado o enfermo, (ii) apoyar el crecimiento interno de celulas y tejidos en el dispositivo, (iii) comunicar el medio mecanico del cuerpo al tejido que se esta desarrollando, (iv) degradar a tal nivel que las celulas y el tejido que estan creciendo hacia dentro tengan suficiente tiempo para reformarse, creando de este modo un nuevo tejido con funci6n aut6loga que pueda sobrevivir la vida del paciente. En ciertos casos, el dispositivo deberfa imitar la correcta estructura tridimensional (por ejemplo, un andamio 6seo) del tejido que esta intentando sujetar. En otros casos, el dispositivo puede servir como una ligadura temporal (por ejemplo, una malla plana para reparaci6n de hernia o un hem6stato para hemorragia) a un tejido tridimensional (musculo de la pared abdominal en el caso de la hernia). A pesar de la aplicaci6n, la presente direcci6n del campo del dispostivo medico es la completa restauraci6n de la funci6n corporal a traves del apoyo del desarrollo de tejidos aut6logos.

Oesafortunadamente, la mayorfa de los biomateriales hoy disponibles no poseen la integridad mecanica de la aplicaciones de alta demanda de carga (por ejemplo, hueso, ligamentos, tendones, musculo) o la apropiada funcionalidad biol6gica; la mayorfa de los biomateriales no se degradan demasiado rapido (por ejemplo, colageno, acido polilactico, acido poliglic6lico o copolfmeros relacionados) o no son degradables (por ejemplo, poliesteres, metal), donde en cualquier caso, el tejido funcional aut6logo falla al desarrollarse y el paciente sufre invalidez. En ciertos casos, un biomaterial puede emplear mal la diferenciaci6n y el desarrollo de tejidos (por ejemplo, la formaci6n 6sea espontanea, tumores) porque carece de biocompatibilidad con las celulas y el tejido circundante. Asf mismo, un biomaterial que falla al degradarse normalmente esta asociado con inflamaci6n cr6nica, donde tal respuesta es realmente perjudicial para (es decir, debilita) el tejido circundante.

Si se disena adecuadamente, la seda puede ofrecer nuevas opciones clfnicas para el diseno de una nueva clase de dispositivos medicos, andamios y matrices. La seda ha demostrado tener la mayor fuerza de cualquier fibra natural, y compite con las propiedades mecanicas de fibras sinteticas de alta actuaci6n. Las sedas tambien son estables a temperaturas fisiol6gicas altas y en una amplia variedad de pH, y son insolubles en los disolventes mas acuosos y organicos. La seda es una protefna, mas que un polfmero sintetico, y los productos de degradaci6n (por ejemplo, peptidos, aminoacidos) son biocompatibles. La seda no se deriva de mamfferos y tiene mucha menos biocarga que otros biomateriales naturales comparables (por ejemplo, colageno derivado de animales bovinosoy porcinos).

La seda, como el termino que es generalmente conocido en la tecinca, significa un producto filamentoso de fibra segregado por un organismo tal como un gusano de seda o una arana. Las sedas producidas por insectos, es decir

(i) los gusanos de seda Bombyx mori, y (ii) las glandulas de aranas, tfpicamente Nephi/ia c/avipes, son las fomas del material estudiadas con mas frecuencia; sin embargo, de cientos a miles de variantes naturales de seda existen en la naturaleza. La fibrofna es producida y segregada por dos glandulas de seda del gusano de seda. Cuando la fibrofna sale de las glandulas, se cubre de sericina, una sustancia similar al pegamento. Sin embargo, la seda de arana es apreciada (y diferenciada de la seda del gusano de seda) porque se produce como un unico filamento que carece de contaminantes inmunogenicos, tales como sericina.

Oesafortunadamente, la seda de arana no puede producirse en masa debido a la incapacidad para domesticar aranas; sin embargo, la seda de arana, asf como otras sedas pueden clonarse y producirse de manera recombinante, pero con resultados extremadamente variados. A menudo, estos procesos introducen biocargas, y de manera costosa, no pueden producir material en cantidades significativas, dando como resultado propiedades variables del material, y no son rigurosamente controlables ni reproducibles.

Como resultado, solamente se ha usado seda de gusano de seda en aplicaciones biomedicas durante mas de 1.000 anos. La especie Bombyx mori de gusano de seda produce una fibra de seda (conocida como una "baba") y usa la fibra para construir su capullo. La baba, cuando se produce, incluye dos filamentos de fibrofnas o "brofnas", que estan rodeados por una capa de goma, conocida como sericina - el filamento de fibrofna de la seda posee una significativa integridad mecanica. Cuando las fibras de seda se cosechan para producir hilos o telas, inlcuyendo suturas, una pluralidad de fibras pueden alinearse juntas, y la sericina se disuelve parcialmente y despues se resolidifica para crear una estructura de fibra de seda mas grande que tiene mas de dos brofnas mutuamente incrustadas en una capa de sericina.

Como aquf se usa, la "fibrofna" incluye firofna de seda (es decir, de Bombyx mori) y fibras del tipo fibrofna obtenidas de aranas (es decir, de Nephi/ia c/avipes). Como alternativa, la protefna de la seda adecuada para su uso en la presente invenci6n puede obtenerse a partir de una soluci6n que contiene una seda producida geneticamente, tal como de bacterias, levadura, celulas de mamfferos, animales transgenicos o plantas transgenicas. Vease, por ejemplo, el documento WO 97/08315 y la Patente de Estados Unidos N° 5.245.012.

Las fibras de seda de gusano de seda, tradicionalmente disponibles en el mercado comercial para aplicaciones textiles y de sutura, a menudos estan "desgomadas" y consisten en multiples brofnas unidas mediante hebras para formar una unica fibra mas grande de multiples filamentos. El "desengome" aquf se refiere a la liberaci6n de la capa de sericina que rodea las dos brofnas por medio de lavado o extracci6n en agua caliente con jab6n. Tal liberaci6n permite que la uni6n medienta hebras de brofnas cree fibras sencillas mas grandes de multiples filamentos. Sin embargo, la completa extracci6n a menudo ni se consigue ni se desea. La seda desgomada a menudo contiene o esta cubierta de sericina y/o impurezas de sericina se introducen durante la uni6n mediante hebras con el fin de espesar la fibra sencilla de multiples filamentos. La capa de sericina protege los filamentos de fibrofna delicada (solamente -5 micrones de diametro) de deshilacharse durante las aplicaciones textiles tradicionales donde se requiere un procesamiento de alto rendimiento. Por lo tanto, la seda desgomada, a menos que se exponga explicftamente como libre de sericina, tfpicamente contiene 10-26% (por peso) de sericina (vease las Tablas 1 y 2).

Cuando tfpicamente se hace referencia a la "seda" en el material publicado, se infiere que las observaciones se centran en la "seda" que se da de manera natural y que solamente esta disponible (es decir, las fibras de fibrofna cubiertas de sericina) que se han usado durante siglos en productos textiles y medicina. La seda de gusano de seda de categorfa medica tradicionalmente se usa solamente de dos formas: (i) como sutura de seda virgen, donde la sericina no se ha retirado, y (ii) la sutura tradicional de seda mas popular, o comunmente referida como sutura de seda negra trenzada, donde la sericina se ha retirado completamente, pero se ha sustituido por una capa de cera o silicona para proporcionar una barrera entre la fibrofna de seda y el tejido o celulas del cuerpo. En el presente, la unica aplicaci6n medica para la que la seda aun se usa es en ligadura de sutura, particularmente porque la seda aun es apreciada por sus propiedades mecanicas en cirugfa (por ejemplo, fuerza de nudo y habilidad manual).

A pesar del uso de la seda viegen como un material de sutura durante cientos de anos, la llegada de nuevos biomateriales (colageno, sinteticos) han permitido las comparaciones entre materiales y han identificado problemas con la sericina. La seda, y mas claramente definida como seda de gusano de seda Bombyx mori, no es biocompatible. La sericina es antigenica y provoca una fuerte respuesta inmune, alergica o del tipo de celula hiper T (frente a la repuesta normal leve a "cuerpos extranos"). La sericina puede retirarse (lavarse/extraerse) de la fibrofna de la seda; sin embargo, la retirada de sericina de la seda cambia la ultraestructura de las fibras de fibrofna, exponiendolas, y da como resultado la perdida de fuerza mecanica, llevando a una estructura fragil.

Las estructuras de seda extrafda (es decir, hilos, matrices) son especialmente susceptibles de deshilacharse y de fallo mecanico durante los procedimientos textiles estandares debido a la naturaleza de multifilamentos de los filamentos de fibrofna de diametro mas pequeno (-5 um). La fragilidad de la fibrofna extrafda es la raz6n por la que cuando se usa seda en el diseno y desarrollo de dispositivos medicos, tras la extracci6n, tfpicamente se ensena (Perez-Rigueiro, J. Appl. Polymer Science, 70, 2439-2447, 1998) que se debe disolver y reconstituir la seda usando metodos estandares (Patente de Estados Unidos N° 5.252.285) para conseguir un biomaterial con el que se pueda trabajar. La incapacidad para manipular fibrofna de seda extrafda con metodos y maquinaria textiles de hoy en dfa ha prevenido que el uso de fibrofna no disuelta libre de sericina no se haya explorado como un dispositivo medico.

Las limitaciones adicionales de la fibrofna de la seda, ya se haya extrafdo de seda de gusano de seda, disuelto y reconstituido, o producido a partir de aranas o insectos diferentes a los gusanos de seda incluyen (i) la naturaleza hidrof6bica de la sdea, un resultado directo de la conformaci6n de cristal de beta-lamina de la protefna de la fibrofna nucleo que da a la seda su fuerza, (ii) la falta de dominios de enlace celular que tfpicamente se encuentran en protefnas mamfferas de matriz extracelular (por ejemplo, la secuencia peptfdica RGO), y (iii) la supeficie suave de la fibrofna de la seda. Como resultado, las celulas (por ejemplo, macr6fagos, neutr6filos) asociadas a una respuesta inflamatoria y del tejido del huesped son incapaces de reconocer la fibrofna de la seda como un material capaz de degradaci6n. Oe este modo, estas celulas optan por encapsular y separar con un muro el cuerpo extrano (vease la Fig. 18A) limitando de este modo (i) la degradaci6n de la fibrofna de la seda, (ii) el crecimiento interno del tejido, y

(iii) la reforma del tejido. Oe este modo, los filamentos de fibrofna de la seda con frecuencia inducen una fuerte respuesta a cuerpos extranos (RCE) que esta asociada a inflamaci6n cr6nica, un granuloma periferico y encapsulaci6n cicatrizal (Fig. 18A).

Ademas de las ventajas biol6gicas de la seda, la naturaleza de multiples filamentos de la seda (por ejemplo, como suturas) asf como el tamano pequeno de los filamentos de fibrofna pueden llevar a una estructura muy comprimida. Como tal, la seda puede degradarse demasiado rapido. Las proteasas (enzimas) producidas desde las celulas estimuladas encontradas dentro de la encapsulaci6n periferica pueden penetrar en la estructura implantada (vease la Fig. 11A y la Fig. 11B), pero las celulas que depositan el nuevo tejido (por ejemplo, fibroblastos) que pueden reforzar el dispositivo (en este caso una sutura negra trenzada) durante la reforma de tejido normal no pueden. Por lo tanto, el interior de los dispositivos de fibrofna no tratada o no modificada no pueden entrar en contacto con la respuesta a cuerpos extranos del huesped y con el tejido (llevado y producido por los fibroblastos) y como resultado, la capacidad del dispositivo para dirigir la reforma del tejido es limitada. El crecimiento celular y del tejido del huesped no esta limitado y la degradaci6n normalmente no es posible.

En el caso de sutura, se piensa que estos problemas pueden controlarse tratando sutruas de fibrofna con agentes cruzados o cubriendo las suturas con cera, silicona o polfmeros sinteticos, protegiendo de este modo el material del cuerpo. Las capas, tales como sericina, cera o silicona, disenadas para anadir estabilidad mecanica a la fibrofna (combatiendo su fragilidad mientras se proporciona una barrera entre el cuerpo y la fibrofna), limitan la uni6n de celulas, el reconocimiento y la infiltraci6n y el crecimiento interno de tejido y la degradaci6n de fibrofna. Como resultado, tradicionalmente se piensa que la seda es un material no degradable.

La clasificaci6n como no degradable puede ser deseable cuando la seda se pretende usar como un dispositivo de ligadura de sutura tradicional, es decir, no se desea el crecimiento interno de la celula y tejido en el dispositivo. Por lo tanto, la uni6n celular y el crecimiento interno (que llevan a la degradaci6n de la matriz y a la reforma del tejido activo) tradicionalmente se previenen mediante la naturaleza biol6gica de la seda y el diseno mecanico de la estrucutra. Oe hecho, una creencia general de que la seda debe protegerse del sistema inmune y la percepci6n de que la seda no es biodegradable han limitado el uso de la seda en cirugfa. Incluso en el campo de suturas, la seda ha sido sustituida en la mayorfa de las aplicaciones por otros materiales sinteticos, ya sean biodegradables o permanentes.

Los documentos US 5849040 y US 6302922 describen un proceso para la fabricaci6n de una tela tejida o tricotada para su uso en ropa textil usando seda cruda fijada con sericina.

El documento US 5598615 se refiere a una tela formada a partir de seda que esta tratada para proporcionar viscosidad, por ejemplo usando vapor por encima de la temperatura a la que la protefna de la seda se desnaturaliza.

El documento US 6175053 describe un material para ap6sitos en el que las fibras de la seda estan disueltas y reconstituidas.

Por lo tanto, existe la necesidad de implantes de tela con fibras de fibrofna de gusano de seda a las que se ha extrafdo la sericina que sean biocompatibles, estimulen el crecimiento interno de las celulas y sean biodegradables.

Resumen

La presente invenci6n proporciona un implante de tela biocompatible como se define en la reivindicaci6n 1.

Las construcciones de fibra de fibrofna de seda natural, aquf desveladas, ofrecen una combinaci6n de elevada fuerza, extensa vida de fatiga y rigidez y alargamiento en propiedades de rotura que coinciden bastante con las de los tejidos biol6gicos. Las fibras en las construcciones estan alineadas de manera no-arbitraria en uno o mas hilos. Las construcciones de fibra son biocompatibles (debido a la extracci6n de sericina de las fibras de seda del gusano de seda) y estan sustancialmente libres de sericina. Las construccionese de fibra son ademas no inmunogenicas; es decir, no provocan una respuesta sustancial alergica, antigenica o de celula hiper T del huesped, reduciendo el efecto perjudicial sobre los tejidos biol6gicos circundantes, tales como aquellos que pueden acompanar las respuestas del sistema inmune en otros contextos. Ademas, las construcciones de fibra estimulan el crecimiento interno de las celulas alrededor de dichas fibras de fibrofna y son biodegradables.

Las indicaciones de que la construcci6n de fibra esta "sustancialmente libre" de sericina significan que la construcci6n de fibra comprende menos del 20% de sericina por peso. Preferentemente, la construcci6n de fibra comprende menos del 10% de sericina por peso. Mas preferentemente, la construcci6n de fibra comprende menos del 1% de sericina por peso (vease Tabla 2). Ademas, "sustancialmente libre" de sericina puede definirse funcionalmente como un contenido de sericina que no provoca una respuesta sustancial alergica, antigenica o de celula hiper T del huesped. Oe la misma manera, la indicaci6n de que hay menos de un 3% de cambio en masa despues de una segunda extraccfon implicarfa que la primera extracci6n "retir6 sustancialmente" la sericina de la construcci6n y que la construcci6n resultante estuvo "libre sustancialmente" de sericina despues de la primera extracci6n (vease Tabla 2 y Fig. 1F).

Los metodos de esta divulgaci6n extraen sericina de la construcci6n mucho mas a fondo que los procedimientos tfpicos de "desengome" que caracterizan las practicas tradicionales de procesamiento para la producci6n de productos textiles de seda para aplicaciones no quirurgicas (vease arriba la definici6n). La Figura 1A muestra una imagen de una fibra desgomada donde los filamentos de fibrofna se unieron mediante hebras formando una fibra mas grande recubierta de sericina. Este fibra "desgomada" contiene -26%, por peso, de sericina. En una realizaci6n preferente, estas fibras de fibrofna de gusano de seda a las que se extrajeron la sericina retienen su estructura proteica nativa y no se han disuelto ni reconstituido.

Las fibras de fibrofna de seda "natural" estan producidas por un insecto, tal como un gusano de seda o una arana y poseen su estructura proteica nativa, como esta formada. Preferentemente, las costrucciones de fibra de fibrofna de seda son no-recombinantes (es decir, no se producen geneticamente) y no se han disuelto ni reconstituido. En una realizaci6n preferente, las fibras de fibrofna a las que se extrajeron la sericina comprendfan fibras de fibrofna obtenidas a partir del gusano de seda Bombyx mori. Ademas, el termino "biodegradable", aquf se usa para queere decir que las fibras se degradan en un ano cuando estan en contacto continuo con un tejido corporal. Ademas, nuestros datos sugieren (Fig. 13 A-E, Fig. 18 A-C y Fig. 19 A-O) que la velocidad de la degradaci6n pueden estar influenciada y aumentada por la modificaci6n de la superficie de la fibrofna (Fig. 13 A-O y Fig. 18 A-C) asf como por la configuraci6n geometrica del hilo y/o tejido (Fig. 19A-O). En una realizaci6n, el hilo de fibrofna de seda perdi6 el 50% de su fuerza maxima de tracci6n en un periodo de dos semanas tras la implantaci6n in vivo (Fig. 12) y el 50% de su masa en un periodo de aproximadamente 30 a 90 dfas in vivo, dependiento del area de implantaci6n (Fig. 13 Ha-O). La elecci6n del area de implantaci6n in vivo (por ejemplo, intramuscular frente a subcutanea) demostr6 influenciar significativamente la velocidad de degradaci6n (Fig. 13 A-O).

La "seda de categorfa textil" es seda que ocurre de manera natural que incluye una capa de sericina de mas del 19%-28% por peso de la fibra. La "seda de sutura" es seda que contiene sericina ("sutura de seda virgen") o esta cubierta de una composici6n hidrof6bica, tal como cera de abeja, cera de parafina, silicona o una capa polimerica sintetica ("sutura de seda negra trenzada"). La composici6n hidrof6bica repele las celulas o inhibe la uni6n de las celulas con la fibra cubierta. La seda negra trenzada es una seda de sutura en la que se ha extrafdo la sericina y se ha sustituido por una capa adicional. La seda de sutra es tfpicamente no-biodegradable.

Oebido a la ausencia de una cera protectora u otra capa hidrof6bica sobre las fibras las construcciones de fibrofna de seda descritas estan disenadas biol6gicamente (uni6n de los dominios de enlace celular) y/o mecanicamente (incremento del area de seda y disminuci6n de la densidad de empaquetamiento) para estimular mayor infiltraci6n celular en comparaci6n con la seda de categorfa textil o la seda de sutura cuando se implanta en el tejido corporal. Como resultado, las construcciones de fibrofna de seda soportan el crecimiento interno/infiltraci6n celular y la uni6n y expansi6n celular mejoradas, lo que lleva a la degradaci6n de la construcci6n de fibrofna de seda creando esencialmente de este modo un nuevo biomaterial biodegradable para su uso en un dispositivo medico y en aplicaciones de ingenierfa de tejidos. La habilidad de la construcci6n de fibra para soportar la uni6n celular y el crecimiento interno/infiltraci6n de las celulas y tejidos en la construcci6n, que a su vez soporta la degradaci6n, pueden ademas mejorarse por medio de la modificaci6n de la superficie de la fibrofna (enlace peptfdico usando RGO, modificaci6n qufmica de especies y aumentando la hidrofilicidad a traves de tratamiento con plasma de gas) y/o el diseno mecanico de la construcci6n incrementando de este modo la area de superficie y de este modo incrementando su susceptibilidad a aquellas celulas y enzimas que poseen la habilidad de degradar la seda. Las fibras de seda estan opcionalmente cubiertas por una composici6n hidrofflica, por ejemplo, colageno o una composic6n peptfdica, o combinadas mecanicamente con un biomaterial que soporta el crecimiento interno de las celulas y tejidos para formar una estructura compuesta. La elecci6n del biomaterial, la cantidad y la interacci6n mecanica (por ejemplo, envuelto o trenzado alrededor de un nucleo de fibrofna de seda) puede usarse para alterar y/o mejorar las velocidades del crecimiento interno celular y la degradaci6n de las construcciones.

Las fibras en las construcciones estan alineadas unas con otras de manera no arbitraria en uno o mas hilos. Tal estructura puede ser en paralelo, trenzada, texturizada u organizada helicoidalmente (con una disposic6n de enrollado, cableado (por ejemplo, cuerda metalica)) para formar un hilo. Un hilo puede definirse por consistir al menos en una fibra de fibrofna. Preferentemente, un hilo consiste al menos en tres fibras alineadas de fibrofna. Un hilo es un montaje de fibras enrolladas o de otra manera unidas juntas en una hebra continua. Puede generarse un numero casi infinito de hilos a traves de varios medios de producir y combinar fibras. Una fibra de seda se ha descrito anteriormente; sin embargo, el termino fibra es un termino generico que indica que la estructura tiene una longitud 100 veces mas grande que su diametro.

Cuando las fibras se enrollan o de otra manera se entrelazan para formar un hilo, se enrollan/entrelazan lo suficiente para esencialmente cerrarse en las posiciones relativas de fibra y retirarse flojas pero no tanto como para deformar plasticamente las fibras (es decir, no exceden el lfmite de elasticidad del material), que comprende su vida de fatiga (es decir, reduce el numero de ciclos de tensi6n antes del fallo). Las construcciones de fibra de fribrofna libre de sericina pueden tener una fuerza maxima de tracci6n seca (UTS) de al menos 0,52 N/fibra (Tabla 1, 4), y una rigidez entre aproximadamente 0,27 y aproximadamente 0,5 N/mm por fibra. Oependiendo de la organizaci6n y la jerarqufa de las fibras, hemos mostrado que las fuerzas maximas de tracci6n de la construcci6n de fibrofna pueden oscilar entre aproximadamente 0,52 N/fibra y aproximadamente 0,9 N/fibra. Las construcciones de fibra aquf descritas retuvieron aproximadamente el 80% de su fuerza maxima de tracci6n seca y aproximadamente el 38% de su rigidez seca, cuando se testaron mojadas (Tabla 5). Los alargamientos de rotura entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 50% fueron tfpicos para las construcciones de fibrofna testadas en estados tanto secos como mojados. Las construcciones de fibrofna tfpicamente produjeron en aproximadamente del 40 al 50% de sus fuerzas maximas de tracci6n y tuvieron una vida de fatiga de al menos 1 mill6n de ciclos en una carga de aproximadamente 20% de la fuerza maxima de tracci6n de los hilos.

En una realizaci6n de la presente invenci6n, las fibras alineadas de fibrofna de gusano de seda a las que se les extrajeron la sericina estan enrolladas unas con otras en 0 a 11,8 rollos por cm (vease la Tabla 6 y 7).

El numero de jerarqufas en la estructura geometica de la construcci6n de fira asf como el numero de fibras/grupos/paquetes/hebras/cuerdas dentro de un nivel jerarquico, la manera de entrelazare en los diferentes niveles, el numero de niveles y el numero de fibras en cada nivel pueden todos variarse para cambiar las propiedades mecanicas de la construcci6n de fibra (es decir, el hilo) y por lo tanto, la tela (Tabla 4 y 8). En una realizaci6n de la presente invenci6n, la construcci6n de fibra (es decir, el hilo) esta organizada en una organizaci6n jerarquica de un unico nivel, comprendiendo dicha organizaci6n jerarquica de un unico nivel un gurpo de hilos paralelos o entrelazados. Como alternativa, la construcci6n de fibra (es decir, hilo) esta organizada en una organizaci6n jerarquica de dos niveles, comprendiendo dicha organizaci6n jerarquica de dos niveles un paquete de grupos entrelazados. En otra realizaci6n de la presente invenci6n, la construcci6n de fibra (es decir, hilo) esta organizada en una organizaci6n jerarquica de tres niveles, comprendiendo dicha organizaci6n jerarquica de tres niveles una hebra de grupos entrelazados. Finalmente, otra realizaci6n de la presente invenci6n, la construcci6n de fibra (es decir, hilo) esta organizada en una organizaci6n jerarquica de cuatro niveles, comprendiendo dicha organizaci6n jerarquica de cuatro niveles una cuerda de hebras entrelazadas.

La sericina puede retirarse del las fibras de fibrofna antes de la alineaci6n en una hebra o en un nivel mas alto en la geometrfa jerarquica de la construcci6n de fibra. La hebra se manipula a tensi6n baja (es decir, la fuerza aplicada a la construcci6n nunca excedera el lfmite de elasticidad durante ninguna etapa del procesamiento) y con general cuidado y delicadeza despues de que se haya retirado la sericina. El equipo del procesamiento esta configurado de la misma manera para reducir la abrasi6n y los angulos afilados en partes integrantes gufas que entran en contacto

o dirigen el hilo durante el procesamiento para proteger las fibras fragiles de fibrofna del dano; los tiempos de residencia de extracci6n de 1 hora son suficientes para extraer la sericina pero son lo suficientemente lentos como para no danar los filamentos expuestos. Oe manera interesante, cuando una construcci6n de fibra de seda que consiste en multiples fibras organizadas en paralelo se ha extrafdo bajo estas condiciones, result6 un "unico" hilo mas grande libre de sericina (es decir, las fibras individuales no se pueden separar echadas hacia atras de la construcci6n debido a la interacci6n mecanica entre los filamentos de fibrofna mas pequenos una vez expuestos durante la extracci6n). Ademas, como resultado de la interacci6n mecanica entre los microfilamentos libres de sericina, la extracci6n de los hilos enrollados o cableados tfpicamente ha dado como resultado hilos y estructuras menos "animados". Como resultado de este fen6meno, existi6 un mayor grado de flexibilidad en el diseno de los hilos y las telas resultantes; por ejemplo, pueden usarse niveles de mayor giro por pulgada (TPI), que normalmente crearfan hilos animados que serfan diffciles de formar telas. El beneficio anadido de los mayores giros por pulgada fue la reducci6n en rigidez de hilo y tela (es decir, la elasticidad de la matriz puede incrementarse) (Tablas 6 y 7; Fig. 6A y Fig. 6B).

Una pluralidad de hilos se entrelazan para formar un implante de tela. Los implantes de tela se generan a traves de la uni6n de uno mas hilos individuales por los que los hilos individuales se tranforman en telas para un dispositivo medico textil. En una realizaci6n de la presente invenci6n, el hilo se enrolla en o por debajo de 30 giros por pulgada. Las telas se producen o forman combinando hilos de manera no arbitraria: tejiendo, tricotando o cosiendo por cadeneta para producir tejios completados. En una realizaci6n, esta combinaci6n de hilos para formar una tela se hace sobre una maquina. Sin embargo, es muy importante senalar que el producto final del implante de tela es distinto en base al tipo de hilo usado para hacerlo proporcionando de este modo una enorme fuerza a traves del diseno del hilo para cumplir necesidades clfnicas. Un implante de tela puede estar, aunque no se limita a, tejido, tricotado, tricotado con urdimbre, reconstituido, tejido con telar de Jacquard, laminado, con malla o combinaciones de los mismos.

Cabe destacar que los metodos textiles de trenzado, ademas de hacer hilos, tambien pueden usarse para hacer telas, tales como tela trenzada plana o una trenza circular mas grande (Fig. 4A). Por el contrario, tejer y tricotar, dos metodos de formar telas, aunque no se usan comunmente, pueden tambien usarse para hacer hilos. En tales casos, la diferenciaci6n entre "hilo" y "tela" no es completamente aparente, y deberfa usarse la homogeneidad para hacer claras distinciones, es decir, un hilo es tfpicamente mas homogeneo en composici6n y estructura que una tela.

En una realizaci6n de la presente invenci6n, multiples fibras de seda de gusano de seda pueden estar organizadas helicoidalmente (por ejemplo, enrolladas o cableadas) o en paralelo, en un unico nivel jerarquico o en multiples niveles jerarquicos, pueden extaerse y usarse para crear una sutura trenzada para ligadura de tejido. En otra realizaci6n, la interacci6n mecanica de los filamentos de fibrofna extrafdos en una configuraci6n enrollada o cableada tras la extracci6n puede usarse como una sutura medica.

Los implantes de tela no tejida pueden estar formados organizando arbitrariamente una pluralidad de hilos, o un unico hilo cortado en muchas piezas de pequena longitud. Los ejemplos no limitativos inlcuyen un implante de tela para hem6stato o andamio 6seo. Todos los implantes de tela pueden derivar de una construcci6n de un unico hilo (homogenea) o de construciones de multiples hilos (heterogeneas). La habilidad para disenar una variedad de estructuras de hilo de fibrofna de seda, coom se describe con detalle mas abajo, aumenta de manera espectacular el potencial del diseno de la tela cuando se considera una estructura heterogenea de tela.

En una realizaci6n de la presente invenci6n, el implante de tela es un compuesto de las fibras o hilos de fibrofna a las que se ha extrafdo sericina y uno o mas polfmeros degradables seleccionados del grupo consistente en Colagenos, acido Polilactico o sus copolfmeros, acido Poliglic6lico o sus copolfmeros, Polianhfdridos, Elastina, Glicosaminoglicanos y Polisacaridos. Ademas, el implante de tela de la presente invenci6n puede estar modificado para comprender un farmaco asociado con un factor de uni6n celular asociado con la tela (por ejemplo, RGO). En una realizaci6n de la presente invenci6n, el implante de tela esta tratado con plasma de gas o sembrado con celulas biol6gicas.

Los aspectos adicionales de esta divugaci6n se refieren a la reparaci6n de tejidos corporales especfficos, tales como reparaci6n de hernia, tejidos de la vejiga urinaria y cabestrillos, reconstrucci6n de suelo pelvico, tejidos de la pared peritoneal, vasos (por ejemplo, arterias), tejido muscular (por ejemplo, musculo liso abdominal, cardiaco), hem6statos, y ligamentos y tendones de la rodilla y/o hombro asf como otras estructuras frecuentemente danadas debido al desgaste traumatol6gico o cr6nico. Los ejemplos de ligamentos y tendones que pueden producirse incluyen ligamentos cruzados anteriores, ligamentos cruzados posteriores, tendones del manguito del rotador, ligamento colateral medial del codo y rodilla, tendones flexores de la mano, ligamentos laterales del tobillo y tendones y ligamentos de la mandfbula o articulaci6n temporomandibular. Otros tejidos que pueden producirse mediante metodos de esta divulgaci6n incluyen cartflago (articular y del menisco), hueso, piel, vasos sangufneos, pr6tesis para soporte y/o reparaci6n de vasos y tejido conectivo laxo general.

En otros aspectos, las fibras de fibrofna de gusano de seda, en la forma de un hilo o de una construcci6n mas grande de hilos, ahora denominada un dispositivo, esta despojada de sericina, y hecha (por ejemplo, tejida, tricotada, fibra humeda no tejida, trenzada, reconstituida con puntadas, etc) tela, esterilizada y usada como un soporte implantable o un material de reparaci6n que ofrece una vida controlable (es decir, velocidad de degradaci6n) y un grado controlable de deposici6n de colageno y/o matriz extracelular. El material de soporte o reparaci6n pueden usarse para cualquiera de tales fines en el cuerpo, y en particular puede usarse para reparaci6n de hernia, reconstrucci6n de paredes corporales, particularmente en la cavidad toracica y abdominal, y soporte, posicionamiento o inmovilizaci6n de 6rganos internos, que incluyen, sin limitaci6n, la vejiga, el utero, los intestinos, la uretra y los ureteres. Como alterantiva, las fibras de fibrofna de gusano de seda pueden estar despojadas de sericina y organizadas en una tela no tejida como un soporte implantable o material de reparaci6n como anteriormente, pero mas especfficamente para aplicacionese donde serfa util la formaci6n de una esponja.

La seda purificada puede purificarse mediante cualquiera de una variedad de tratamientos que retiran las protefnas de sericina encontradas en las fibrillas nativas. La sericina se ha retirado lo suficiente cuando los implantes de seda purificada provocan solamente una reacci6n a un cuerpo extrano leve y pasajera en ausencia de una respuesta antigenica (celula B, celula T), es decir, son biocompatibles. Una reacci6n a un cuerpo extrano esta caracterizada por una capa interna de macr6fagos y/o celulas gigantes con una zona secundaria de fibroblastos y tejido conectivo. El grado de respuesta a un cuerpo extrano ha demostrado ser controlable a traves de la modificaci6n de fibrofna (Fig. 13 A-O y Fig. 18 A-C) y el diseno del hilo (Fig. 19 A-O). La sericina puede retirarse de las fibras individuales de fibrofnas de gusano de seda, un grupo de fibras de fibrofna de gusano de seda (es decir, un hilo), que tienen una orientaci6n organizada (por ejemplo, paralelas o enrolladas), o formar una tela que comprende una pluralidad de hilos. El implante puede despues esterilizarse e implantase en un organismo como un dispositivo medico.

Otras caracterfsticas y ventajas de la invenci6n seran aparentes a partir de la siguiente descripci6n de las realizaciones preferentes de la misma.

Breve descripci6n de las figuras

La Fig. 1A es una imagen de un microscopio electr6nico de barrido (SEM) de una fibra sencilla de seda nativa desgomada y con hebras de 20/22 denier que tiene una capa de sericina.

La Fig. 1B ilustra una SEM de la fibra de seda de la Fig. 1A extrafda durante 60 minutos a 37 °C.

La Fig. 1C ilustra una SEM de la fibra de seda de la Fig. 1A extrafda durante 60 minutos a 90 °C y que ilustra la retirada conpleta de la capa de sericina.

La Fig. 1O es una tabla que muestra la fuerza maxima de tracci6n (UTS) y la rigidez (N/mm para una matriz de 3 cm de longitud) como una funci6n de las condiciones de extracci6n.

La Fig. 1E ilustra una SEM de una fibrofna de seda cruda. La Fig. 1F ilustra una primera extracci6n a 90 °C durante 60 minutos. La Fig. 1G ilustra una segunda extracci6n bajo condiciones identicas. Estas figuras muestran el dano mecanico a los filamentos que da como resultado una perdida de masa tfpica del 30% tras la segunda extracci6n. Por lo tanto, siempre y cuando el porcentaje de perdida de masa no cambie mas del 3% desde la primera a la segunda extracci6n (90 °C, 1 hora, detergente y sal estandares), se asume que se ha conseguido la extracci6n completa. La utilidad de una perdida del 3% en la perdida de masa total refleja la variabilidad en las medidas, ensayos y dano mecanico dando como resultado una perdida de masa del hilo tras la segunda extracci6n.

La Fig. 2A es un modelo representativo en 3-O de un hilo (de cable o enrollado) que representa su jerarqufa de 5 niveles (no se muestra el nivel de fibra sencilla). Oependiendo del numero de fibras usadas en cada nivel, la cuerda podrfa servir bien como un hilo para tricotar una malla para reparar una hernia o como una cuerda para usarse en paralelo con otras cuerdas para formar una matriz LCA.

La Fig. 2B es un esquema que representa la generaci6n de un hilo enrollado o cableado de la jerarqufa de dos niveles que contiene 36 fibras antes de unirse con hebras en paralelo para formar una matriz LCA o usado para generar una tela tejida o tricotada para ingenierfa de tejidos y reparaci6n de tejidos (por ejemplo, malla de hernia). Las representaciones esquematicas definen visualmente dos formas muy populares de formaciones de tela: un "tejido" y un "tricotado".

La Fig. 2C ilustra una cuerda sencilla de hilo que tiene una geometrfa que esta helicoidalmente organizada alrededor de un eje central y compuesta por dos niveles de jerarqufa que se enrollan. Cuando se usan seis cuerdas en paralelo (por ejemplo, Matriz 1), el hilo tiene propiedades mecanicas simliares a las de un ligamento nativo.

La Fig. 2O iulstra una cuerda sencilla de hilo que tiene una geometrfa que esta helicoidalmente organizada alrededor de un eje central y compuesta por tres niveles de jerarqufa que se enrollan. Cuando se usan seis cuerdas en paralelo (por ejemplo, Matriz 2), la matriz tiene propiedades mecanicas simliares a las de un ligamento nativo.

La Fig. 3A ilustra curvas de carga-alargamiento para cinco muestras (n=5) de la Matriz 1 formada por seis cuerdas paralelas de fibrofna de seda ilustradas en la Fig. 2A.

La Fig. 3B es un grafico de ciclos hasta fallo en UTS, cargas de 1680N y 1200N (n=5 para cada carga) que ilustra los datos de fatiga de la Matriz 1. El analisis de regresi6n de los datos de fatiga de la Matriz 1, cuando se extrapolan a los niveles de carga fisiol6gica (400 N) para predecir el numero de ciclos hasta fallo ii vivo, indica una vida de matriz de 3,3 millones de ciclos.

La Fig. 3C ilustra curvas carga-alargamiento para tres muestras (n=3) de la Matriz 2 (n=3) formada a partir de seis cuerdas paralelas de fibrofna de seda como se ilustra en la Fig. 2B.

La Fig. 3O es un grafico de ciclos hasta fallo en UTS, cargas 2280N, 2100N y 1800N (n=3 para cada carga) que ilustra los datos de fatiga de la Matriz 2. El analisis de regresi6n de los datos de fatiga de la Matriz 2, cuando se extrapolan a los niveles de carga fisiol6gica (400 N) para predecir el numero de ciclos hasta fallo ii vivo, indica una vida de matriz de mas de 10 millones de ciclos.

La Fig. 4A muestra imagenes de mutiples formas de hilo y tela generados en nuestros laboratorios. Varias estructuras diferentes de hilo, que inlcuyen varios tipos de trenzas (i, ii, iv), una trenza plana (iii), trenza de diametro variado o estrechada (v), un paquete cableado mas grande (-250 fibras) de dos niveles, un hilo paralelo unido con hebras y reconstituido (estampado) que consiste en hilos texturizados de 24-12 fibras (vii), una variedad de hilos enrollados (viii-xi), y un hilo paralelo unido con hebras y reconstituido (estampado) que consite en hilos cableados de dos niveles de 24-12 fibras (xii).

La Fig. 4B es un grafico de curvas carga-alargamiento para (I) una trenza (48 fibras, una trenza con 4 portadores que usa hilo enrollado extrafdo de 12 fibras) e hilos texturizados (48 fibras en total) y (II) enrollados en comparaci6n con hilos cableados, 12 fibras en total -todas las muestras tuvieron 3 cm de longitud.

La Fig. 4C es un un grafico de datos de fatigua para hilos pequenos, 3 cm de longitud, en comparaci6n con 3B y 3O para (I) un cable pequeno de 36 fibras y (II) un hilo pequeno texturizados de 60 fibras.

La Fig. 5A proporciona datos de fuerza y rigidez para un hilo de 36 fibras como una funci6n de 6 velocidades diferentes de tensi6n en los que fueron testados (N=5 por grupo).

La Fig. 5B muestra curvas carga-alargamiento para un hilo de 36 fibras, de 3 cm de largo, testado en 2 de las 6 velocidades diferentes de tensi6n. Los datos representan el efecto de los procedimientos de las pruebas (aquf, especfficamente velocidad de tensi6n) sobre las propiedades mecanicas presentadas (por ejemplo, UTS) de la estructura del hilo.

La Fig. 6A es un grafico de UTS como una funci6n de giros por pulgada (TPI); las lfneas de tendencia se generaron para extrapolar los datos a un 4° orden polinomial -se muestran TPIs de 0-15. Se observ6 un maximo que indica una estructura ordenada en la que los filamentos individuales estan trabajando al unfsono.

La Fig. 6B es un grafico de rigidez (para una muestra de 3 cm de longitud) como una funci6n de giros por pulgada (TPI); las lfneas de tendencia se generaron para extrapolar los datos a un 5° orden polinomial -se muestran TPIs de 0-15. Se observ6 un maximo que indica que TPI podrfa usarse como una herramienta para disenar una UTS o rigidez especffica.

La Fig. 7A ilustra una SEM de fibrofna de seda extrafda antes de la siembra con celulas.

La Fig. 7B ilustra una SEM de celulas estomales de medula 6sea sembradas y agregadas sobre la fibrofna de seda inmediatamente despues de la siembra.

La Fig. 7C ilustra una SEM de celulas de medula 6sea agregadas y extendidas sobre la fibrofna de seda 1 dfa despues de la siembra.

La Fig. 7O ilustra una SEM de celulas estomales de medula 6sea sembradas sobre fibrofna de seda 14 dfas despues de la siembra formando una lamina intacta de matriz celular-extracelular.

La Fig. 8A ilustra una longitud de 3 cm de la cuerda de fibrofna de seda ilustrada en la Fig. 2C y sembrada con celulas estomales de medula 6sea, cultivadas durante 14 dfas en un medio estatico y tenidas con MTT para mostrar inlcuso la cobertura celular de la matriz tras el periodo de crecimiento.

La Fig. 8B ilustra una hebra de control de cuerda de fibrofna de seda de 3 cm de longitud tenida con MMT.

La Fig. 9A es un grafico que ilustra la proliferaci6n de celula estomal de medula 6sea sobre la Matriz 1 de fibrofna de seda determinada por el AON celular total sobre un periodo de cultivo de 21 dfas que indica un significativo incremento en la proliferaci6n celular tras 21 dfas de cultivo.

La Fig. 9B es un grafico de barras que ilustra la proliferaci6n de celula estomal de medula 6sea sobre la Matriz 2 de fibrofna de seda determinada por el AON celular total sobre un periodo de cultivo de 14 dfas que indica un significativo incremento en la proliferaci6n celular tras 14 dfas de cultivo.

La Fig. 10 ilustra la fuerza maxima de tracci6n de una construcci6n extrafda de seda de 30 fibras que esta sembrada con celulas estomales de medula 6sea o no se ha sembrado durante 21 dfas de cultivo en condiciones fisiol6gicas de crecimiento.

La Fig. 11A es un grafico de UTS como una funci6n de degradaci6n enzimatica ii vitro; no se observ6 pedida de fuerza en el control negativo, PBS. La seda perdi6 el 50% de su fuerza tras 21 dfas en cultivo. Se us6 una soluci6n 1 mg/ml de Proteasa XIV de Sigma.

La Fig. 11B es un grafico de perdida de masa como una funci6n de degradaci6n enzimatica ii vitro; no se observ6 pedida de fuerza en el control negativo, PBS. Se observ6 una perdida de masa del 50% despues de 41 dfas en cultivo.

La Fig. 12 es un grafico de perdida de UTS como una funci6n de degradaci6n ii vivo despues de la implantaci6n de matriz modificada con RGO en un modelo de rata subcutanea no cargada durante 10, 20 y 30 dfas. Se observ6 una perdida de masa del 50% despues de -10 dfas ii vivo en un ambiente no cargado.

La Fig. 13A muestra secciones histol6gicas de matrices de fibrofna de seda libres de sericina de 12(0) x 3(8) no modificadas y modificadas con RGO despues de 30 dfas de implantaci6n subcutanea en una rata Lewis. La fila I es la tinci6n H/E a 40X, la fila II es la tinci6n H/E a 128X, la fila III es la tinci6n tricr6mica de colageno a 128X, la fila IV es colageno echado hacia atras de las imagenes de la fila III para tener en cuenta la cuantificaci6n del crecimiento interno del colageno y la fila V son los pfxeles asociados a las secciones transversales del resto de las fibrofnas de seda echadas hacia atras para tener en cuenta la cuantificaci6n de la degradaci6n. Tras el analisis cualitativo, en el medio subcutaneo, tanto los grupos no tratados como los modificados soportaron en crecimiento interno celular y la deposici6n de colageno dentro de la propia matriz con encapsulaci6n periferica limitada.

La Fig. 13B representa cuantitativamente un descenso del 36% en el area en secci6n transversal de seda modificada con RGO despues de 30 dfas de implantaci6n subcutanea lo que indica una significativa mejora en la habilidad del huesped para degradar las matrices de fibrofnas de seda con superficie modificada en comparaci6n con los controles no tratados.

La Fig. 13C muestra cuantitativamente un significativo incremento del 63% en la deposici6n de colageno dentro de las matrices de fibrofna modificadas con RGO en comparaci6n con los contrales no tratando demostrando de nuevo la habilidad de la matriz de seda modificada para soportar el crecimiento interno de celulas y tejidos del huesped.

La Fig. 13O muestra la tinci6n H/E de un hilo de fibrofna extrafdo de 36 fibras implantado intramuscularmente en el area abdominal de una rata Lewis. Las imagenes se muestran a 40X y 128X para matrices no modificada y modificadas con RGO. Los resultados muestran, cualitativamente, que la modificaci6n con RGO increment6 de manera espectacular la infiltraci6n de celulas y tejidos en un plazo de 30 dfas ii vivo. A diferencia de la sutura con seda negra trenzada o sutura con seda virgen, no se observaron encapsulaci6n periferica o celulas de plasma. En comparaci6n con los implantes subcutaneos, se observ6 poca o ninguna infiltraci6n celular y deposici6n de colageno en los controles no tratados lo que indica el efecto del area de implantaci6n ademas de la modificaci6n de la superficie.

La Fig. 13E es una representaci6n numerica de perdida de masa ii vivo de los dos grupos diferentes de modificaci6n en comparaci6n con los controles no tratados. La modificaci6n con RGO, seguida de la modificaci6n con plasma de gas inrement6 significativamente (p<0,05) la extensi6n de la degradaci6n despues de 90 dfas de implantaci6n intramuscular. Sin embargo, parece que la degradaci6n fue mas agresiva en el medio subcutaneo en comparaci6n con el medio intramuscular, como se esper6.

La Fig. 14 ilustra un analisis electroforetico en gel de amplificaci6n RT-RGO de marcadores seleccionados conforme avanzaba el tiempo. El gel muestra la regulaci6n por incremento en ambos niveles de expresi6n I y II de tipos de colageno normalizados para el gen domestico, GAPOH por la celula estomal de medula 6sea cultivada sobre la Matriz 2 durante 14 dfas en cultivo. No se detectaron colageno de tipo II (como un marcado para cartflago) ni sialoprotefna 6sea (como un marcador de formaci6n de tejido 6seo) lo que indica una respuesta por BMSCs de diferenciaci6n especffica de ligamentos cuando se cultiv6 con la Matriz 2.

Las Figs. 15A y 15B ilustran una cuerda sencilla de Matriz 1 (no sembrada en el momento de la implantaci6n) tras seis semanas de implantaci6n ii vivo y usada para recontruir el ligamento colateral medial (LCM) en un modelo de conejo. La Fig. 15A muestra las fibras de fibrofna de la Matriz 1 rodeadas por el crecimiento interno de las celulas y el tejido del huesped progenitor en la matriz y alrededor de las fibras individuales de fibrofna visualizadas mediante tinci6n de hematoxilina y eosina. La Fig. 15B muestra el crecimiento interno del tejido colagenoso en la matriz y alrededor de las fibras individuales de fibrofna visualizadas mediante tinci6n tricr6mica.

Las Figs. 16A, 16B y 16C ilustran celulas estomales de medula 6sea sembradas y cultivadas sobre fibras de colageno durante 1 dfa (Fig. 16A) y 21 dfas (Fig. 16B); RT-PCR (Fig. 16C) y analisis electroforetico en gel de colageno de expresi6n I y III frente al gen domestico GAPOH; a=Colageno I, dfa 14; b=Colageno I, dfa 18; c=Colageno III, dfa 14; d=Colageno III, dfa 18; e=GAPOH, dfa 14; f=GAPOH, dfa 18. No se detectaron colageno de tipo II (como un marcador para cartflago) ni sialoprotefna 6sea (como un marcador de formaci6n de tejido 6seo) lo que indica una respuesta de diferenciaci6n especffica de ligamento.

La Fig. 17 ilustra RT-PCR cuantitativo a tiempo real en 14 dfas que produjo una proporci6n de transcripci6n de colageno I a colageno III, normalizada a GAPOH, de 8,9:1.

La Fig. 18A y Fig. 18B son seciones transversales tenidas con H/E de 6 paquetes de (A) 2-0 sutura con seda negra trenzada y (B) seda modificada con superficie RGO (36 fibras/paquete), respectivamente, 30 dfas despues de la implantaci6n intramuscular. La figura 18C es la seda modificada con RGO pre-sembrada con BMSCs durante 4 semanas antes de la implantaci6n. La Fig. 18A muestra una reacci6n a cuerpo extrano tfpica y extensa a sutura con seda negra trenzada disponible en el mercado (Ethicon, Inc.) donde no se puede observar ni crecimiento interno ni infiltraci6n celular. La Fig. 18B demuestra la habilidad de la seda obtenida por ingenierfa para estimular el crecimiento interno de celulas y tejidos. Las figs. 18A, 18B y 18C ilustran la respuesta del tejido a las construcciones de fibra de seda que estan cubiertas de cera (Fig. 18A), despojadas de sericina y cubiertas con RGO (Fig. 18B), y despojadas de sericina y sembradas con celulas madres del adulto progenitor (Fig. 18C).

Las Figs. 19A-O muestran imagenes en secci6n transversal tenidas con H/E a 40X (fila superior, Fig. 19A y Fig. 19B) y 128X (fila inferior, Fig. 19C y 19O) de dos hilos (4x3x3 y 12x3), conteniendo cada uno el mismo numero de fibras, pero organizados de manera diferente con jerarqufas especfficas tras la implantaci6n en un modelo de rata durante 30 dfas. Los resultados indican que el diseno y la estructura del hilo pueden influenciar la extensi6n del crecimiento interno de las celulas y tejidos cuando la construcci6n de hilo de 12x3 tuvo en cuenta el crecimiento interno, mientras que parece que 4x3x3 lo impidi6.

La Fig. 20A, B y C son fotos de (A) una tela no tejida mojada de una unica fibra extraida tras la formaci6n de la tela (las fibras pueden primero extraerse y formarse en el no tejido - datos no mostrados), (B) una tela tricotada producida a partir de una forma de puntadas en cadena usando hilo de 12 fibras extraido tras la formaci6n de la tela, y (C) una tela tejida producida a partir del hilo de 12 fibras pre-extrafdo con hilo de 36 fibras pre-extrafdo que corre en la direcci6n de la trama.

La Fig. 21 es un organigrama esquematico de los varios metodos y secuencias que pueden emplearse para crear una matriz de firofna de seda biocompatible y biodegradable. Por ejemplo, extraer una unica fibra, enrollarla en hilos y tricotarla en telas o unir hilos mediante hebras, enrollar los hilos unidos mediante hebras, formar la tela y despues extraerla. Existe un numero casi infinito de combinaciones, pero todas dependeran de la jerarqufa del hilo, el numero de fibras por nivel y el TPI por nivel como se muestra en las Tablas 4, 6, 7 y 8.

Descripci6n detallada

En metodos descritos con mas detalle, mas abajo, las fibras de fibrofna de seda estan alineadas en una orientaci6n paralela; las fibras pueden permanecer en una orientaci6n estrictamente paralela o pueden enrollarse o de otra manera entrelazarse para formar un hilo. El hilo puede incluir cualquier numero de jerarqufas, comenzando en el nivel de la fibra y expandiendose a traves del paquete, hebra, cuerda, etc, niveles. El entrecruzado puede proporcionarse en cualquier nivel. Ademas, la sericina se extrae de las fibras de seda en cualquier punto en la jerarqufa hasta le punto en el que el numero de fibras excede aquel en el que la soluci6n extractora puede penetrar a traves del hilo. El numero maximo de fibras de fibrofna de gusano de seda (20/22 denier como se compran) que pueden combinarse y extraerse satisfactoriamente es aproximadamente 50 (Tabla 4). Estos hilos forman una construcci6n de fibra que esta incorporada a un implante de tela para su uso, por ejemplo, en la generaci6n de una malla de tejido suave para reparaciones tales como reparaci6n de hernia, reconstrucci6n de suelo abdominal y cabestrillos de vejiga. La formaci6n de construcciones de fibra se analizara en el contexto de aplicaciones ejemplares, mas abajo.

Aunque mucho de la discusi6n que sigue esta dirigida a una matriz basada en fibra de seda (es decir, construcci6n, andamio) para producir un ligamento cruzado anterior (LCA), puede formarse una variedad de otros tejidos, tales como otros ligamentos y tendones, cartflago, musculo, hueso, piel y vasos sangufneos, usando un nueva matriz basada en fibra de seda. En el caso de LCA, se describi6 un hilo grande (540-3900 fibras por hilo, antes de unirse mediante hebras en paralelo; vease Tabla 8 y 11) con multiples nivles jerarquicos de entrecruzado y propiedades fisiol6gicas relevantes. Aemas de una matriz LCA basada en fibra de seda, multiples configuraciones de hilo mas pequeno (seda de 1-50 fibras) (Tabla 1, 4 y 5) con propiedades fisiol6gicas relevantes despues de combinarse bien en paralelo o en una formaci6n especffica de tela, pueden servir como matrices de tejido para una formaci6n guiada de tejido (Fig. 2A-B). Ademas de las matrices de seda para la formaci6n guiada de tejido o ingenierfa, este trabajo esta especfficamente dirigido para producir una variedad de estructuras de soporte de tejido de matrices basadas en fibra de seda para la reparaci6n guiada de tejido (por ejemplo, reparaci6n de hernia, cabestrillos de vejiga para incontinencia urinaria por estres) (Fig. 2A-B y Fig. 20A-C).

Las construcciones (es decir, telas o hilos) pueden tener la superficie modificada o pueden estar sembradas con las celulas apropiadas (Fig. 7A-O, Fig. 8A-B y Fig. 16A-C) y expuestas a la estimulaci6n mecanica apropiada, si es necesario, para la proliferaci6n y diferenciaci6n en el ligamento, tend6n u otro tejido deseado de acuerdo con las tecnicas anteriormente descritas.

Ademas, la presente invenci6n no esta limitada a usar celulas estomales de medula 6sea para sembrar sobre la construcci6n de fibra, y otras celulas del progenitor, pluripotentes o madres, tales como aquella en el hueso, musculo y piel por ejemplo, pueden tambien usarse para diferenciar en ligamentos y otros tejidos.

Las telas tambien pueden formarse a partir de construcciones similares de filamentos purificados, y usarse en varias aplicaciones. Las telas pueden dividirse en varias clases, incluyendo tejida, no tejida, telas tricotadas, y telas cosidas por cadeneta, cada una con numerosos subtipos. Cada uno de esto tipos es util como un implante en circunstancias particulares. Al hablar de estas telas basadas en seda, describimos la seda natural, por ejemplo, de Bombyx mori, como una &quot;fibra de fibrofna&quot;. Las fibras deberfan al menos tener un metro de longitud, y su longitud deberfa mantenerse a lo largo del proceso para facilitar su manipulaci6n durante su procesamiento e incorporaci6n en una tela. Oado que un hilo puede definirse como un montaje de fibras enrolladas o de otra manera mantenidas unidas en una hebra continua y que una fibra sencilla de fibrofna, como se ha definido anteriormente, comprende multiples brofnas unidas mediante hebras, algunas veces de multiples capullos, una fibra sencilla de fibrofna puede denominarse un &quot;hilo&quot;. Asf mismo, las fibras de fibrofna estan enrolladas juntas o de otra manera entrelazadas para formar un &quot;hilo&quot;. Los hilos se usan para tejer o tricotar telas para su uso en la invenci6n. En un procedimiento alternativo, los hilos de seda estan dispersados en longitudes mas cortas (5 mm a 100 mm) o en filamentos de fibrofna de seda. Estos filamentos pueden despues colocarse (mojados) para formar una tela no tejida (Fig. 20A).

Cuando los hilos se forman en un tejido, la tensi6n (fuerza) ejercida sobre los hilos (tfpicamente, a traves de maquinarfa) no es superior al lfmite de elasticidad del hilo (Fig. 3A-O). Por consiguiente, los hilos se manipulan a velocidades mas bajas y bajo cargas mas pequenas que los hilos que tfpicamente se usan en, por ejemplo, la fabricaci6n textil cuando se forma la tela para preservar la integridad de las fibras fragiles de fibrofna expuestas. Oe la misma manera, los puntos de contacto entre la maquinaria de manipulaci6n y el hilo estan disenados para evitar angulos afilados e interacciones de alta fricci6n para prevenir que las fibras se estropeen o desilachen alrededor del perfmetro del hilo (Fig. 4A-C).

Se conocen numerosas aplicaciones de implantes de tela en la tecnica medica y quirurgica. Un ejemplo es un soporte en la reparaci6n de hernia. Para tal reparaci6n, una tela, mas tfpicamente tejida con urdimbre con una puntada deseada (por ejemplo, punto atlas disenado para prevenir que la malla se deshaga durante el corte), se cose (o a veces se grapa o pega) o simplemente se colca en su lugar sin tensionar, en el interior de la pared abdominal despues de que se haya reparado con suturas convencionales. Una fuci6n de la tela tricotada con urdimbre es proporcionar soporte a corto plazo a la reparaci6n. En una realizaci6n preferente de la presente invenci6n, las fibras de fibrofna dentro de la tela estimulan el crecimiento interno de celulas y el posterior crecimiento del tejido en la propia tela (Fig. 13A y 13O) asf como a traves de los intersticios de la tela formados durante el tricotado y en la regi6n que necesita repararse. Esta realizaci6n ayuda a fortalecer permanentemente el area danada a traves del crecimiento interno y la reforma del tejido funcional cuando la matriz de la seda se degrada (Fig. 13A, B y C).

Las telas que fortalecen la reparaci6n se usan en situaciones similares para reparar o soportar cualquier parte de la pared abdominal, particularmente en la reparaci6n de hernia y reconstrucci6n de suelo abdominal, o en reparaci6n y soporte de otras paredes y septos en el cuerpo, por ejemplo del pecho, o de 6rganos tales como el coraz6n o la vejiga, particularmente despues de cirugfa o retirada de tumor. Las telas implantables pueden tambien usarse para soportar vejigas u otros 6rganos internos (inclufdos pero no limitados a los intestinos, los ureteres o uretra y el utero) para mantenerlos en sus posiciones normales despues de cirugfa, dano o desgaste natural como resultado de la edad o embarazo, o para posicionarlos en una localizaci6n apropiada. El &quot;6rgano&quot; aquf incluye 6rganos &quot;s6lidos&quot;, tales como un hfgado, y 6rganos tubulares tales como un intestino o un ureter. Las telas, especialmente las telas gruesas tales como algunos tipos no tejidos o aquellas que pueden crearse a traves de tricotado o trenzado tridimensional (Fig. 4A-C), pueden usarse para llenar cavidades dejadas por la cirugfa para proporcionar una construcci6n de fibra a la que las celulas pueden migrar o a las que las celulas pueden pre-acoplarse (por ejemplo, para aumentar la velocidad de la reparaci6n). Las areas de uso incluyen cavidades tanto en tejidos blandos como en tejidos duros tales como hueso. En otros casos, los implantes de tela se usan para prevenir adhesiones, o para prevenir el acoplamiento y/o crecimiento interno de celulas; esto puede conseguirse por medio de la modificaci6n de la superficie de la matriz de fibrofna de seda o por medio del acoplamiento de un farmaco o factor a la matriz.

Los implantes de tela basados en fibrofna de seda de la invenci6n pueden modificarse facilmente de varias maneras para mejorar la curaci6n o reparaci6n en el area. Estas modificaciones pueden usarse de manera individual o en combinaci6n. Los implantes de telas basados en fibrofna de seda de la invenci6n pueden tener la superficie modificada para soportar el acoplamientoy la expansi6n celular, el crecimiento interno y la reforma de las celulas y tejidos, y la degradaci6n del dispositivo a traves del uso del enlace peptfdico RGO o irradiaci6n de plasma de gas (Figs. 13A-E). Los implantes de tela pueden modificarse para tener factores de acoplamiento celular, tales como el peptido bien conocido &quot;RGO&quot; (arginina-glicina-acido aspartico) o cualquiera de los muchos materiales naturales o sinteticos que estimulan el acoplamiento, tales como suero, factores y protefnas de suero que incluyen fibronectina, sangre, medula, grupos, determinantes, etc., conocidos en la bibliograffa. Tales materiales pueden estar en cualquiera de las clases bioqufmicas usuales de tales materiales, incluyendo sin limitaci6n protefnas, peptidos, carbohidratos, polisacaridos, proteoglicanos, acidos nucleicos, lfpidos, moleculas organicas pequenas (menos de aproximadamente 2000 Oaltons) y combinaciones de estos. Tal modificaci6n de plasma puede mejorar la funcionalidad de la superficie de la tela y/o cargar sin afectar las propiedades mecanicas del volumen a granel de materiales. Los implantes de tela pueden estar irradiados por plasma de gas despues de la extracci6n de sericina sin comprometer la integridad de las fibras de fibrofna de seda a las que se les ha extrafdo la sericina (Tabla 9).

Ademas, el implante de tela puede tratarse para que envfe un farmaco. El acoplamiento del farmaco a la tela puede ser covalente, o covalente por medio de enlaces degradables, o por cualquier tipo de enlace (por ejemplo, atracci6n de carga) o absorci6n. Cualquier farmaco puede usarse potencialmente; ejemplos no limitativos de farmacos incluyen antibi6ticos, factores del crecimiento tales como protefnas morfogeneticas 6seas (BMPs) o factores de diferenciaci6n del crecimiento (GOFs), inhibidores del crecimiento, quimioatractantes, acidos nucleicos para la trasnsformaci6n, con o sin materiales encapsulantes.

En otra modificaci6n, las celulas pueden anadirse al implante de tela antes de su implantaci6n (Fig. 7A-O, Fig. 8A-B, y Fig. 9A-B). Las celulas pueden sembrarse/absorberse sobre o en el implante de tela. Las celulas pueden tambien

o ademas cultivarse sobre el implante de tela como una primera etapa hacia la sustituci6n o la mejora de tejido. Las celulas pueden ser de cualquier tipo, pero las celulas al6genas, preferentemente de los tipos &quot;inmunoprotegidas&quot;, &quot;inmunoprivilegiadas&quot; o celulas madre son preferenets, y las celulas aut6logas son particularmente preferentes. Las celulas se seleccionan para ser capaces de proliferar en los tipos celulares requeridos sobre o en la contrucci6n de fibra (Fig. 9A-B).

Otra clase de modificaci6n es la incorporaci6n de otros polfmeros (por ejemplo, en forma de fibra o gel) al implante de tela para proporcionar propiedades estructurales especfficas o para modificar las superficies nativas de la fibrofna de seda y sus caracterfsticas biol6gicas (vease Fig. 16A-C: siembra de fibras de colageno con BMSCs). En un tipo de incorporaci6n, las fibras o hilos de seda y de otro material se mezclan en el proceso de hacer el hilo. En otro tipo, las fibras, hilos o telas basadas en seda estan cubiertos o recubiertos con una soluci6n o con fibras de otro polfmero. La mezcla puede hacerse (i) arbitrariamente, por ejemplo uniendo mediante hebras (1 o multiples fibras de) tanto seda como el polfmero juntos en paralelo antes de girarlos o (ii) de una manera organizada tal como en trenzado donde las fibras o hilos que estan entrando en el hilo o tela mas grande pueden alternar posiciones de alimentaci6n en la maquina creando un resultado previsible. La acci6n de cubrir o envolver puede realizarse mediante trenzado o cableado sobre un nucleo central, donde el nucleo puede ser el polfmero, la fibrofna de seda o un compuesto de ambos, dependiendo del efecto deseado. Como alternativa, un hilo puede envolverse de una manera controlada sobre el otro polfmero, donde el hilo que se envuleve puede usarse para estabilizar la estrucutra. Cualquier polfmero biocompatible se puede usar potencialmente. Ejemplos de polfmeros adecuados incluyen protefnas, particularmente protefnas estructurales tales como colageno y fibrina, y polfmeros sinteticos degradables que proporcionan fuerza, tales como polfmeros que comprenden anhfdridos, acidos hidroxi y/o carbonatos. Las capas pueden proporcionarse como geles, particularmente geles degradables, formados por polfmeros naturales o por polimeros sinteticos degradables. Pueden usarse geles que comprenden fribrina, colageno y/o protefnas con membrana de base. Los geles pueden usarse para enviar celulas o nutrientes, o para proteger la superficie del acoplamiento celular. Ademas, las protefnas o peptidos pueden acoplarse covalentemente a las fibras o las fibras puden modificarse con plasma en un gas cargado (por ejemplo, nitr6geno) para depositar grupos amino; cada una de estas capas soporta el acoplamiento y el crecimiento interno celular, cuando la seda es normalmente hidrof6bica, y estas capas hacen que las fibras sean mas hidrofflicas.

Ejemplos no limitativos de algunas de estas realizaciones se describen en ejemplos, mas abajo.

Se seleccion6 el trazado mojado para un prototipo de formaci6n de tela porque es el procedimiento mas simple. El producto no tejido (Fig. 20A) se cre6 a partir de una fibra sencilla de fibrofna de seda antes de la extracci6n en el nivel de la tela. El producto es correpondientemente un material realtivamente econ6mico, y puede usarse en aplicaciones en las que su baja fuerza de tracci6n serfa satisfactoria. Cuando se necesita mas fuerza de tracci6n, podrfa unirse un material no tejido, como es bien conocido para telas y papel o mineralizado para reparaci6n de hueso. Como alternativa, el material de hilo de seda producido mediante extracci6n de sericina puede formarse en una variedad de hilos mas complejos, como se ha descrito anteriormente. El tamano y el diseno del hilo pueden usarse para controlar la porosidad, con independencia de las capacidades de la maquina del no tejido. Los hilos tambien pueden tricotarse (Fig. 20B) o tejerse (Fig. 20C) en una tela. Un tipo de tela de interes es una malla simple, similar a una gasa, que puede usarse sola (por ejemplo, como un hem6stato), o para enviar celulas o farmacos (por ejemplo, un factor coagulante) a un area, en una situaci6n en la que la flexibilidad es importante.

Cuanod la fuerza es importante, una tela tejida con urdimbre (Fig. 20B) que incluye las familiares prendas de punto y jerseys, que tienen una elasticidad que puede controlarse a traves del diseno helicoidal del hilo usado en la tela, y tfpicamente con sustancial fuerza de tracci6n, puede ser util para aplicaciones (por ejemplo, reparaci6n de hernia, cabestrillos de vejiga, reconstrucciones de suelo pelvico, etc.) que requieren la provisi6n de soporte mecanico durante una significativa duraci6n en el tiempo, tal como meses.

En otras aplicaciones, el material deberfa tener poca elasticidad y gran fuerza. Para tales telas, una trama densa de hilos gruesos es apropiada, produciendo un material que es similar a las telas tejidas estandares (Fig. 20C). Tal material puede estar opcionalmente complementado con un tratamiento de capa o tratamiento de calor para unir los cruces de los segmentos del hilo, previniendo de este modo que se enreden o se estiren. Los tratamientos de calor no deben desnaturalizar completamente la protefna de seda. La tela pueden opcionalmente coserse, pegarse o graparase en su sitio, como se hace actualmente con la malla de polipropileno. El implante, como cualquiera de otros tipos tratados, puede cubrirse con varios materiales para mejorar la curaci6n local y el proceso de crecimiento interno del tejido, y/o con una capa para prevenir la adhesi6n del area de reparaci6n a la vfscera.

En otra alternativa, la tela, la malla, el material no tejido, tricotado u otro material de reparaci6n puede estar hecho de seda no extrafda, y despues la tela acabada puede extraerse como aquf se describe (Fig. 21) (por ejemplo, con soluci6n de jab6n alcalino a temperatura elevada) para retirar las sericinas inmunomoduladoras del material. Como una alternativa adicional, la extracci6n de la sericina puede tener lugar en una fase intermedia, tal como la extracci6n del hilo, grupo o hebra formada, siempre y cuando el numero de fibras no exceda aquel en el que la soluci6n extractora puede penetrar a traves de las fibras (vease la Fig. 21 para opciones no limitadoras).

La discusi6n anterior ha descrito la realizaci6n de telas compuestas por hilos, donde la forma mas tfpica de hilo tratada en las formaciones de telas derivarfa de girar fibras de fibrofna de gusano de seda juntas de una manera organizada y extaer la sericina. Tambien pueden usarse muchas geometrfas de hilo y metodos de formaci6n de hilo como se ha descrito (Tablas 4, 5, 6, 7 y 8). Tales metodos pueden incluir la formaci6n de paquetes no enrollados de fibras de fibrofna, unidas juntas envolviendo paquetes con seda u otro material como se ha tratado anteriormente. Cualquiera de estos hilos podrfa formarse, como se ha descrito anteriormente, mezclando fibras de seda con otros materiales. Incluso ademas, las fibras pueden entrelazarse, por ejemplo, formar un cable, enrollarse, trenzarse, formar una malla, tricotarse, etc. (vease Fig. 2A y B y 21). El termino &quot;entrelazado&quot; aquf se usa para indicar una estructura repetitiva organizada (es decir, no arbitraria) en terminos de c6mo las fibras contactan y se unen unas con otras.

La mezcla tambien podrfa hacerse a niveles mas altos de organizaci6n, tales como el uso de filamentos de diferentes materiales para formar un hilo mas grueso, o usando hilos de diferentes materiales para tejer o tricotar. En cada caso, el material final incluirfa seda purificada, esencialmente libre de sericina como un componente significativo, usado para una o todas de sus caracterfsticas de fuerza y compatibilidad (es decir, a largo plazo) y degradaci6n (Fig. 11A-B). El otro polfmero u otros polfmeros se seleccionan por su biocompatibilidad, soporte (o inhibici6n a traves de la rapida formaci6n de tejido en la zona deseada) del acoplamiento o infiltraci6n celular (Fig. 16A-C), prefil de degradaci6n in vivo, y propiedades mecanicas. Los polfmeros biodegradables incluyen cualquiera de los polfmeros biodegradables conocidos, incluyendo productos naturales tales como protefnas, polisacaridos, glicosaminoglicanos, y polfmeros naturales derivados, por ejemplo, celulosas; y polfmeros y copolfmeros sinteticos biodegradables que incluyen acidos polihidroxi, policarbonatos, polinahfdridos, algunos poliamidos y copolfmeros y mezclas de los mismos. En particular, el colageno y la elastina son protefnas adecuadas.

Las construcciones/matrices de tela que contienen seda usadas para la reparaci6n de tejidos peuden tratarse para que contengan celulas en el momento de la implantaci6n (Fig. 7A-O, Fig. 8A-B, Fig. 9A-B y Fig. 18C) para mejorar el resultado del tejido in vivo. Las celulas pueden ser xenogenicas, mas preferentemente alogenicas, y lo mas preferentemente aut6logas. Cualquier tipo de celula es potencialmente de uso, dependiendo de la localizaci6n y la funci6n prevista del implante. Las celulas pluripotentes son preferentes cuando las senales apropiadas de diferenciaci6n estan presentes o se proporcionan en el ambiente. Otros tipos de celulas incluyen celulas osteogenicas, fibroblastos, y celulas del tipo de tejido del area de implantaci6n.

Mientras se ha descrito seda de Bombyx mori y otras sedas de gusano convencionales, cualquier fuente de seda o protefnas derivadas de seda pueden usarse en la invenci6n, siempre y cuando provoque no mas que una respuesta leve a un cuerpo extrano sobre la implantaci6n (es decir, sea biocompatible) (vease Fig. 18B y C). Estas incluyen sin limitaci6n sedas de gusanos de seda, aranas, y celulas cultivadas, particularmente celulas obtenidas geneticamente, y plantas y animales transgenicos. La seda producida por clonaci6n puede ser de secuencias completas o parciales de genes nativos del tipo seda, o de genes sinteticos que codifican secuencias del tipo seda.

Mientras en muchos casos solamente se usara un unico tipo de tela en la formaci6n de un dispositivo medico o pr6tesis, en algunos casos podrfa ser util usar dos o mas tipos de tela en un unico dispositivo. Por ejemplo, en la reparaci6n de hernia, es deseable que el lado orientado al tejido de la tela de reparaci6n atraiga las celulas, mientra que la cara peritoneal deberfa repeler las celulas para prevenir adhesiones. Este efecto puede conseguirse teniendo una capa de seda que no atraiga celulas, y otra capa que lo haga (por ejemplo, una capa no tratada y una capa que contenga RGO, como en el ejemplo, mas abajo). Otro ejemplo incluye la formaci6n de un cabestrillo de vejiga. El cabestrillo basico deberfa ajustarse y ser de alguna manera elastico, y tener una larga vida pronosticada. Sin embargo, la cara del cabestrillo mas cercana a la vejiga deberfa tener la menor consistencia posible. Esto puede conseguirse colocando una capa de tela fina pero ajustadamente tejida, no tejida o tricotada, fabricada de un hilo que tiene un diametro mas pequeno (por ejemplo, una unica fibra) de la invenci6n en el cabestrillo donde estara en contacto con la vejiga. La tela no tejida deberfa ser de una medida (denier) lo mas pequena posible. Son posibles otras numerosas situaciones que neceistan dos o mas tipos de tela.

Los ejemplos de estructuras anteriormente descritas se fabricaron y evaluaron en una serie de pruebas. En un primer ejemplo, se form6 una tela a partir de fibrillas de seda purificada. En primer lugar, la seda cruda se proces6 en fibrillas de fibrofna purificada. Las fibras crudas de gusano de seda se extrajeron en una soluci6n acuosa de 0,02 M Na2CO3 y 0,3% por peso de soluci6n de jab6n IVORY durante 60 minutos a 90 °C. Las fibras extrafdas se enjuagaron con agua para completar la extracci6n de la protefna de sericina similar al pegamento. La suspensi6n resultante de fibrilas se coloc6 mojada sobre una pantalla, se perfor6 con una aguja y se sec6 (Fig. 20 A). El material afelpado resultante fue de alguna manera como la lana al tacto, y fue muy poroso. Estuvo lo suficientemente unido mediante enredo y agujas que se manipul6 facilmente y se cort6 a la forma deseada.

En otro ejemplo, las fibrillas de fibrofna de seda purificada se trataron con agentes que atraen las celulas (Tabla 9). Primero, los hilos se hicieron enrollando fibras purificadas de fibrofna de seda. Algunos hilos estaban hechos de filamentos que se derivatizaron con el peptido RGO para atraer celulas, usando procedimientos descritos en Sofia y col, J. Biomed. Mater. Res. 54: 139-148, 2001. Las secciones de hilos tratados y no tratados (sutura de seda negra trenzada) se implantaron en la pared abdominal de ratas (Fig. 18A-C). Oespues de 30 dfas de implantaci6n, las suturas negras trenzadas contenfan grupos compactos de fibrilla, con infiltraci6n celular entre los grupos de fibrilla pero no dentro de ellos. Sin embargo, los grupos de fibrilla tratados con RGO estaban extensamente invadidos por celulas huespedes, y estaban expandidos pero no compactos (Fig. 13A-E, 18B), pero no estaban significativamente degradados (Fig. 13A-E).

Este ejemplo ilustra el uso de la derivatizaci6n para controlar la velocidad de degradaci6n de fibillas de fibrofna de seda implantadas, asf como la demostraci6n de la habilidad de fibrillas derivatizadas para reclutar celulas para una estructura del tipo tela. Calramente, puede obtenerse una mayor especificidad de reclutamiento usando un atractante mas especffico. Pueden usarse tecnicas similares (derivatizaci6n qufmica) o metodos mas simples tales como absorci6n, adsorci6n, cobertura, bebidas, para proporcionar otros materiales en el area de implantaci6n.

Cada una de las muestras presentadas en las Tablas mas abajo, se prepar6 de acuerdo con la descripci6n anterior, donde la sericina se retir6 mas de 60 minutos a una temperatura de 90 ° +/-2 °C. Se ha descubierto que usando una temperatura en este nivel durante un periodo suficiente de tiempo se producen fibras de las cuales la sericina se ha retirado sustancialmente (Fig. 1 A-C, Tabla 1, 2, 3) (para producir una construcci6n de fibra que esta sustancialmente libre de sericina con el fin de producir una significativa respuesta inmunol6gica y para no impedir de manera significativa la biodegradabilidad de la fibra) mientras se preserva sustancialmente la integridad mecanica de la fibrofna (Tabla 1). Hay que tener en cuenta que cuando las temperaturas alcanzan los 94 °C (Tabla 1), la UTS no estuvo afectada de manera espectacular; sin embargo, la rigidez disminuy6 de manera significativa lo que indica una sensibilidad termica de la seda a temperaturas de 94 °C o superiores. Las fibras de cada grupo se estiraron manualmente (es decir, se pusieron paralelas) tirando de los extremos de las fibras; como alternativa, el estiramiento podfa haberse hecho facilmente por medio de un proceso automatizado. La fuerza aplicada fue ligeramente mayor que la requerida para estirar el grupo.

Las designaciones de geometrfa de la muetra en todas las Tablas reflejan las siguientes construcciones: # de fibras (tpi en en el nivel de fibra en direcci6n S) x # de grupos (tpi en el nivel de grupo en direcci6n Z) x # de paquetes (tpi en el nivel de paquete en direcci6n S) x # de hebra (tpi en el nivel de hebra en direcci6n Z) x etc., donde las muestras estan enrolladas entre niveles a menos que se indique de otra manera. La designaci6n giro-por-pulgada, tal como 10s x 9z tpi, refleja (el numero de giros de las fibras/pulgada dentro del grupo) x (el numero de giros de los grupos/pulgada dentro del paquete). En cada muestra, la inclinaci6n del giro es sustancialmente mas alta que la encontrada normalmente en hilos convencionales que estan enrollados en una inclinaci6n baja meramente para sujetar las fibras juntas. Aumentando la inclinaci6n de los giros (es decir, aumentando los giros por pulgada) disminuye la fueza de tracci6n, pero tambien disminuye la rigidez y aumenta el alargamiento de rotura de la construcci6n.

La fuerza maxima de tracci6n (UTS), porcentaje de alargamiento de rotura (% Elong), y rigidez se midieron todos usando una maquina de pruebas de material servohidraulico INSTRON 8511 con software FAST-TRAC�, que torci6 la muestra a la alta velocidad de -100% longitud de la muestra por segundo en un analisis de tirar de ella-hasta-fallo. En otras palabras, hasta el punto de fallo, la muestra se estira para doblar su longitud cada segundo, lo que restringe en gran medida la capacidad de la muestra para relajarse y rebotar hasta del fallo. Sin embargo, la Fig. 5A-B demuestra el efecto que la velocidad de tensi6n puede tener sobre las propiedades mecanicas observadas asf como las condiciones de las pruebas en mojado y seco que demostraron tener (Fig. 6A-B) un efecto espectacular sobre la UTS y la rigidez de la matriz de seda. Se necesita consistencia si las comparaciones se van a hacer entre conjuntos de datos. Los datos resultantes se analizaron usando el software Instron Series IX. La fuerza maxima de tracci6n es la tensi6n maxima de la curva resultante tensi6n/presi6n, y la rigidez es la pendiente tensi6n/presi6n trazada hasta el lfmite de elasticidad. A menos que se especifique, se us6 al menos N=5 para todos los grupos testados para generar promedios y desviaciones estandares. Se emplearon metodos estadfsticos estandares para determinar si existfan diferencias estadfsticamente significativas entre los grupos, por ejemplo, la prueba t de Student, ANOVA de un factor.

Las fibras de fibrofna en las muestras en todas las Tablas y Figuras anteriores (y a lo largo de esta divulgaci6n) son nativas (es decir, las fibras no estan disueltas ni reformadas); la disoluci6n y reformulaci6n de las fibras da como resultado una estructura diferente de fibra con diferentes propiedades mecanicas tras la reforma. Sorprendentemente, estas muestran demuestran que los hilos de fibras de fibrofna de seda, de los cuales la sericina se ha retirado completamente o casi completamente, pueden poseer fuerzas altas u otras propiedades mecanicas que hacen que los hilos sean adecuados para varias aplicaciones biomedicas (Tabla 4, Fig. 2A-O y Fig. 20A-C), tales como la formaci6n de una construcci6n o soporte de fibra para sustituci6n de ligamento, reparaci6n de hernia o reconstrucci6n de suelo pelvico. Previamente, se crefa que la fibrofna tenfa que disolverse y extrudirse en una fibra reformulada para proporcionar las propiedades mecanicas deseadas. Generalmente se ha encontrado que en tales fibras de fibrofna reformada se sufre de fuerza de fatiga. Los metodos de la presente invenci6n tienen en cuenta la retirada de sericina sin una perdida significativa de fuerza (Tablas 1 y 4; Figs. 3A-O y 4A-B).

En la Tabla 8, las muestras 1 y 2 comparan las propiedades de un grupo de 3 fibras (muestra 1) con las de un grupo de 4 fibras (muestra 2). La muestra 2 tenfa una configuraci6n cuadrada de fibras, mientras que las fibras de la muestra 1 tenfan una configuraci6n triangular. Como se muestra en la Tabla, la adici6n de la fibra extra en la muestra 2 disminuy6 la rigidez por fibra de la muestra lo que demuestra la habilidad para controlar las propiedades del hilo y tela a traves del diseno jerarquico.

La Tabla 4 ilustra los efectos de diferentes configuraciones de construcciones de fibra con cable y una geometrfa de fibra enrollada. Hay que tener en cuenta, en particular, que las muestras 7 y 8 incluyen el mismo numero de fibras y el mismo numero de niveles geometricos. La geomterfa de fibra enrollada de la muestra 8 ofrece una mayor UTS y una mayor rigidez, mientras que la geometrfa cableada de la muestra 7 tiene menos fuerza y menor rigidez. Oe las muestras 7-9, la geometrfa cableada de la muestra 7 tiene la mayor proporci6n fuerza-a-rigidez; para su uso como una construcci6n de fibra de LCA, se desea una alta proporci6n fuerza-a-rigidez (es decir, que posea una elevada fuerza y una baja rigidez).

Las Tablas 1 y 4 demuestran el efecto de la extracci6n de sericina sobre las fibras. Todas las muestras se sumergieron en una soluci6n de extracci6n, como se describe en la Tabla 1. Las muestras 1-5 se sumergieron en un bano a temperatura ambiente, a 33 °C y 37 °C. Se cree que estas temperaturas son demasiado bajas para proporcionar una significativa extracci6n de sericina. Las muestras 6-9 se extrajeron a 90 °C, donde se cree que la completa extracci6n de sericina fue alcanzable, pero durante tiempos variados. Similarmente, la muestra 10 se extrajo a la temperatura ligeramente mas alta de 94 °C. Los datos sugieren que de 30 a 60 minutos a 90 °C es suficiente para retirar de manera significativa la sericina (vease Tablas 2 y 3) y que 94 °C podrfan ser perjudiciales para la estructura proteica de la seda como se muestra por el espectacular descenso en rigidez.

Finalmente, las muestras 11 a 16 tienen geometrfas cableadas comparables; las fibras de las muestra 12, 14 y 16 se extrajeron, mientras que las fibras de las muestras 11, 13 y 15 no. Como se puede ver en la Tabla, la extracci6n parece haber tenido poco efecto sobre las maximas fuerzas de tracci6n (altas) por fibra.

Las fibras de la muestra 10 de la Tabla 4 se sometieron a un procedimiento de encogimiento con espirales, en el que las fibras se enrollan en una direcci6n y despues en la direcci6n opuesta, rapidamente; las fibras despues se calentaron para cerrarse en la estructura de giro y se probaron no extrafdas. La fuerza y rigidez del hilo resultante fueron comparativamente inferiores a las de la mayorfa de los otros hilos no extrafdos testados. Sin embargo, las Tablas 7 y 8 muestran la notable habilidad de las fibrofnas, tras la extracci6n, de soportar hasta 30 TPI. La Tabla 6 muestra el efecto de ordenamiento que TPI tiene sobre las matrices de seda probablemente debido al ordenamiento de la estructura con multifilmentos tras la extracci6n.

La Fig. 10 demuestra las propiedades de un grupo de 39 fibras paralelas de fibrofna sembradas y no sembradas en condiciones de cultivo durante 21 dfas. Estas tres muestras mostraron propiedades mecanicas muy similares, reflejando de este modo poca degradaci6n, si hubo alguna, de matrices de seda debido al crecimiento celular de las mismas o debido a tiempo in vitro. Los valores de rigidez son probablemente mucho mas bajos en este experimento en comparaci6n con las otras muestras como resultado de la incubaci6n mojada de 21 dfas antes de las pruebas mecanicas (vease Tabla 5).

La Tabla 4, muestras 14-16 son todas muestras trenzadas. Las fibras de la muestra 14 se trenzaron a partir de ocho portadores, con un carrete montado sobre cada portador, en el que se extrajeron dos fibras de cada carrete. Las fibras de la muetra 15 se extrajeron de 16 portadores, con un carrete montado sobre cada portador; de nuevo, se extrajeron dos fibras de cada carrete. Finalmente, la muestra 16 se form6 a partir de 4 hilos, comprendiendo cada hilo 3 grupos enrollados de cuatro fibras (proporcionando un total de 12 fibras por hilo); cada uno de los hilos se extrajo de un carrete y un portador separado.

La Tabla 9 demuestra el efecto de la modificaci6n de superficie. La designaci6n, &quot;PBS&quot;, refleja que las muestras se sumergieron en una soluci6n de tamp6n fosfato salino durante aproximadamente 24 horas antes de las pruebas. Se midi6 el efecto de exponer estas muestras a la soluci6n de salino y se proporcion6 una indicaci6n de que la construcci6n de fibra puede mantener sus propiedades mecanicas y sustancialmente preservar la estructura proteica inherente en un medio de salino (por ejemplo, dentro de un cuerpo humano). La designaci6n &quot;RGO&quot; refleja que las muestras se sumergieron en una soluci6n de salino arg-gli-asp (RGO) durante aproximadamente 24 horas antes de las pruebas. RGO puede aplicarse a la construcci6n para atraer celulas a la construcci6n y de este modo estimular el crecimiento celular en la misma. Por consiguiente, cualquier efecto de RGO sobre las propiedades mecanicas de la construcci6n es tambien de interes, aunque no estuvo claro que hubiera una significativa degradaci6n de la construcci6n. Por consiguiente, estas muestras ofrecen evidencia de que la exposici6n prolongada a una soluci6n de salino o esterilizacfon con gas de 6xido de etileno o a una soluci6n RGO dio como resultado poca, si hubo alguna, degradaci6n de las propiedades del material de las construcciones de fibra. A pesar de ello, los datos asociados a las muestras 28 y 29, en los que la jerarqufa geometrica se extendi6 a un nivel mas alto, revelan que UTS/fibra desciende cuando se alcanzan niveles mas altos (y aument6 el c6mputo total de fibra). Este es un efecto del diseno jerarquico (Tabla 8) mas que de la modificaci6n de superficie.

La Tabla 4, las muestras 18 a 23 se tensaron bajo 6 libras de fuerza constante durante 1, 2, 3, 4, 5 y 6 dfas, respectivamente, antes de las pruebas para evaluar el efecto de tesni6n sobre las propiedades mecanicas con el paso del tiempo. Oe estos datos, no parece que haya habido mucho cambio, si hubo alguno, en las propiedades del material de la construcci6n cuando el procedimiento de pre-tensi6n se extendi6 durante periodos mas largos de tiempo. La muestra 25 tambien se &quot;pre-tens6&quot; (despues de enrollarse) a una fuerza de 6 libras durante un dfa antes de las pruebas; para comparaci6n, la muestra 24, que tenfa una configuraci6n geometrica identica no se pre-tens6. Las muestras 24 y 25 revelan por lo tanto el efecto de la pre-tensi6n de la construcci6n para retirar la parte floja en la estructura, lo que da como resultado una ligera reducci6n tanto en la UTS de la construcci6n como en su alargamiento de rotura.

La construcci6n basada en fibra de seda sirve como una matriz para infiltrarse en celulas o que ya este infiltrada o sembrada con celulas, tales como celulas de progenitor, fibroblastos de ligamento o tend6n o celulas musculares, que pueden proliferar y/o diferenciar para formar un ligamento cruzado anterior (LCA) u otro tipo de tejido deseado. La nueva construcci6n basada en fibra de seda esta disenada para tener fibras en cualquiera de una variedad de geometrfas de fibra, tales como un cable, o en una estructura entrelazada, tal como un hilo enrollado, trenza, hilo del tipo malla o hilo del tipo tricotado. El hilo muestra propiedades mecanicas que son identicas o casi identicas a las de un tejido natural, tales como un ligamento cruzado anterior (vease Tabla 4, 1, mas abajo); y variciones simples en la organizaci6n y geometrfa de la construcci6n de fibra pueden dar como resultado la formaci6n de cualquier tipo de tejido deseado (vease Tabla 10, mas abajo). Como alternativa, puede formarse una pluralidad de hilos en un implante de tejido que esta implantado para posicionar o soportar un 6rgano. Ademas, el implante puede usarse para llenar cavidades internas tras cirugfa o para prevenir las adhesiones de tejidos o estimular el acoplamiento o el crecimiento interno de celulas.

Las celulas estromales pluripotentes de medula 6sea (BMSCs) que estan aisladas y cultivadas como se describe en el siguiente ejemplo pueden sembrarse sobre la contrucci6n de fibra de seda y cultivarse en un bioreactor bajo condiciones estaticas. Las celulas sembradas en la construcci6n de fibras, si se dirigen adecuadamente, sufriran una diferenciaci6n especffica de ligamento y tend6n formando un tejido viable y funcional. Ademas, las propiedades histomorfol6gias de un tejido producido in vitro por bioingenierfa generado a partir de celulas pluripotentes dentro de una construcci6n de fibra estan afectadas por la aplicaci6n directa de fuerza mecanica a la construcci6n de fibra durante la generaci6n del tejido. Este descubrimiento proporciona nuevas percepciones en la relaci6n entre tensi6n mecanica, metodos bioqufmicos y de inmovilizaci6n celular y diferenciaci6n celular, y tiene aplicaciones en la producci6n de una amplia variedad de ligamentos, tendones y tejidos in vitro a partir de celulas pluripotentes.

Una construcci6n de fibra que comprende fibras de seda que tienen una geometrfa de cable, se ilustra en las Figs. 2C y 2O. La construcci6n de fibra comprende una jerarqufa en terminos de la manera en la que las fibras estan agrupadas en paralelo y enrollada y c6mo el grupo resultante se agrupa y enrolla, etc, a traves de una pluralidad de niveles en la jerarqufa, como se explica con mas detalle, mas abajo. Las fibras de seda se tensan primero en paralelo usando, por ejemplo, un estante que tiene pinzas cargadas con un muelle que sirven como anclas para las fibras. El estante puede estar sumergido en la soluci6n de extracci6n de sericina para que las pinzas puedan mantener una tensi6n constante sobre las fibras durante la extracci6n, aclarado y secado.

La soluci6n de extracci6n puede ser una soluci6n alcalina de jab6n o detergente y se mantiene aproximadamente a 90 °C. El estante esta sumergido en la soluci6n durante un periodo de tiempo (por ejemplo, al menos 0,5 a 1 hora, dependiendo del flujo de la soluci6n y de las condiciones de mezcla) que es suficiente para retirar toda (+/-0,4% del resto, por peso) o sustancialmente toda la sericina (contando con un posible residuo de rastro) de las fibras. Oespues de la extracci6n, el estante se retira de la soluci6n y las fibras se aclaran y secan. Se usan maquinas de giro controladas por ordenador, cada una de las cuales monta las fibras o las construcciones de fibra alrededor de un perfmetro de un disco y rota el disco alrededor de un eje central para girar las fibras (es decir, cableado) o construcciones de fibras giradas una alrededor de otra de acuerdo con los procesos estandares usados en la industria textil, aunque a una velociad de inclinaci6n mas alta para los giros (por ejemplo, entre aproximadamente 0 y aproximadamente 11,8 giros por cm) que la tradicionalmente producida en hilos tradicionales. La velocidad de cableado o giro, sin embargo, no deberfa ser tan alta para causar deformaci6n plastica de las fibras como resultado de la tensi6n de globo creada cuando el hilo se descarga del carrete antes del giro o cableado.

La extracci6n puede realizarse en cualquier nivel de la construcci6n siempre y cuando la soluci6n pueda penetrar a traves de la construcci6n para retirar la sericina de todas las fibras. Se cree que el lfmite superior para el numero de fibras en una disposici6n compacta que todavfa puede impregnarse completamente con la soluci6n es aproximadamente 20-50 fibras. Sin embargo, por supuesto, aquellas fibras pueden disponerse como un grupo de 20 fibras paralelas o, por ejemplo, como 4 grupos de 5 fibras paralelas, en los que los grupos pueden estar enrollados,

o incluso una construcci6n que comprende un nivel aun mas alto tal como 2 paquetes de 2 grupos de 5 fibras, en los que los grupos y paquetes pueden estar enrollados. Aumentar el numero de niveles jerarquicos en la estructura tambien puede aumentar el espacio vacfo, aumentado de este modo potencialmente el numero maximo de fibras de las que la sericina puede extraerse completamente de 20 a 50 fibras.

Oebido a que la sericina, en algunos casos, se retira de la construcci6n despues de que las fibras se hayan agrupado o despues de que se haya formado una construcci6n de un nivel mas alto, no hay necesidad de aplicar cera u otro tipo de capa mecanicamente protectora sobre las fibras o con el fin de formar tambien una barrera para prevenir el contacto con sericina sobre las fibras; y la construcci6n puede estar libre de capas, en general (particulamente estar libre de capas que el cuerpo no degrada completamente o que causan una respuesta inflamatoria).

Como se describe en los ejemplos mas abajo, se caracterizaron las propiedades mecanicas de la fibrofna de seda (como se ilustra en la Fig. 1A, 1B y 1C), y las geometrfas para formar matirces aplicables para producir LCA se derivaron usando un modelo computacional te6rico (vease Fig. 1O). Se eligi6 una construcci6n de seis cuerdas para su uso como una sustituci6n de LCA para aumentar el area de superficie de matriz y para mejorar el soporte para el crecimiento interno del tejido. Oos jerarqufas geometricas de construcci6n para reparaci6n de LCA comprenden lo siguiente:

Matriz 1: 1 hilo LCA = 6 cuerdas paralelas; 1 cuerda = 3 hebras enrolladas (3 giros/cm); 1 hebra = 6 paquetes enrollados (3 giros/cm); 1 paquete = 30 fibras paralelas lavadas; y

Matriz 2: 1 hilo LCA = 6 cuerdas paralelas; 1 cuerda = 3 hebras enrolladas (2 giros/cm); 1 hebra = 3 paquetes enrollados (2,5 giros/cm); 1 paquete = 3 grupos (3 giros/cm); 1 grupo = 15 fibras paralelas de fibrofna de seda extrafdas.

El numero de fibras y geometrfas para la Matriz 1 y Matriz 2 se seleccionaron de tal manera que las pr6tesis de seda son similares a las propiedades biomecanicas de LCA en fuerza maxima de tracci6n, rigidez lineal, lfmite de elasticidad y % de alargamiento de rotura, sirviendo como un s6lido punto de inicio para el desarrollo de un LCA producido con tejido. Los efectos de aumentar el numero de fibras, numero de niveles y cantidad de giros en cada una de estas propiedades biomecanicas se muestran en la Tabla 8 y Tablas 6 y 7, respectivamente.

La habilidad para generar dos matrices con diferentes geometrfas ambas dando como resultado propiedades mecanicas que imitan las propiedades de LCA indica que existe una amplia variedad de configuraciones geometricas para conseguir las propiedades mecanicas deseadas. Las geometrfas alternativas para cualquier tejido de ligamento o tend6n deseado pueden comprender cualquier numero, combinaci6n u organizaci6n de cuerdas, hebras, paquetes, grupos y fibras (vease Tabla 10, mas abajo) que dan como resultado una construcci6n de fibra con propiedades mecanicas aplicables que imitan aquellas del ligamento o tend6n deseado. Por ejemplo, una protesis de LCA (1) pueden tener cualquier numero de cuerdas en paralelo siempre y cuando haya un medio para asegurar la construcci6n final de fibra ii vitro o ii vivo. Ademas, pueden emplearse varios numeros de niveles de giros (donde un unico nivel se define como un grupo, paquete, hebra o cuerda) para una geometrfa determinada siempre y cuando la construcci6n de fibra de como resultado las propiedades mecanicas deseadas. Ademas, existe un gran grado de libertad en el diseno de la geometrfa y organizaci6n de la construcci6n de fibra en la producci6n de una pr6tesis de LCA; por consiguiente, el modelo computacional te6rico desarrollado puede usarse para pronosticar el diseno de construcci6n de fibra de un tejido de ligamento o tend6n deseado (vease el ejemplo, mas abajo). Por ejemplo, cuando se desean multiples paquetes de matriz mas pequena (por ejemplo, un total de 36 fibras) con solamente dos niveles de jerarqufa para estimular el crecimiento interno, se necesita un TPI de 8-11 o -3-4 giros por cm y puede pronosticarse por el modelo sin necesidad de trabajo empfrico.

Como consecuencia, puede usarse una variaci6n en geometrfa (es decir, el numero de cuerdas usadas para hacer una pr6tesis o el numero de fibras en un grupo) para generar matrices aplicables a la mayorfa de ligamentos y tendones. Por ejemplo, para ligamentos o tendones mas pequenos de la mano, la geometrfa y organizaci6n usadas para generar una unica cuerda de Matriz 1 (o dos cuerdas o tres cuerdas, etc.) pueden ser apropiadas dado que la organizaci6n de la construcci6n de fibra da como resultado propiedades mecanicas adecuadas para el medio fisiol6gico particular. Especfficamente, para alojar un ligamento o tend6n mas pequeno comparado con la Matriz 1 o Matriz 2, se usarfan menos fibras por nivel para generar paquetes o hebras mas pequenas. Oespues podrfan usarse multiples paquetes en paralelo. En el caso de un ligamento mas grande tal como LCA, podrfa ser deseable tener mas paquetes mas pequenos girados en TPIs mas altos para reducir la rigidez y estimular el crecimiento interno en lugar de tener menos paquetes mas grandes donde el crecimiento interno no puede darse por lo que hay una degradaci6n limitada de la matriz.

Sin embargo, la invenci6n no esta limitada con respecto a la geometrfa de cable como la descrita, y puede usarse cualquier geometrfa o combinaci6n de geometrfas (por ejemplo, paralela, trenzada, del tipo malla) que de como resultado propiedades mecanicas de la construcci6n de fibra similares a las de LCA (es decir, mas de 2000 N de fuerza maxima de tracci6n, entre 100-600 N/mm de rigidez lineal para un LCA nativo o injerto de sustituci6n comunmente usado tal como tend6n patelar con una longitud de entre26 y 30 mm) o al ligamento y tend6n deseado que se va a producir. El numero de fibras y la geomterfa de la Matriz 1 y Matriz 2 se seleccionaron para generar mecanicamente las matrices apropiadas de LCA, u otras matrices del ligamento o tend6n deseado �por ejemplo, el ligamento cruzado posterior (LCP)�. Por ejemplo, se us6 una aunica cuerda de la construcci6n de Matriz 1 de seis cuerdas para reconstruir el ligamento colateral medial (LCM) en un conejo (vease Fig. 15A y Fig. 15B). Las propiedades mecanicas de las contrucciones de seda de seis cuerdas de la Matriz 1 y Matriz 2 estan descritas en la Tabla 10 y en las Figs. 3A-3O, como se describe con mas detalle en el ejemplo, mas abajo. Las geometrfas adicionales y sus propiedades mecanicas relacionadas estan enumeradas en la Tabla 11 como un ejemplo del alto grado de libertad del diseno que darfa como resultado una construcci6n de fibra aplicable en la producci6n de tejido de LCA de acuerdo con los metodos aquf descritos.

Oe manera ventajosa, la construcci6n de fibra basada en fibra de seda puede consistir solamente en seda. Los tipos y fuentes de seda incluyen los siguientes: sedas de gusanos de seda, tales como Bombyx mori y especies relacionadas; sedas de aranas, tales como Nephila clavipes; sedas de bacterias producidas geneticamente, de levadura, de celulas de mamfferos, celulas de insectos, y plantas y animales transgenicos; sedas obtenidas a partir de celulas cultivadas a partir de gusanos de seda o aranas; sedas nativas; secuencias totales o parciales clonadas de sedas nativas; y sedas obtenidas a partir de genes sinteticos que codifican seda o secuencias del tipo seda. En su forma cruda, las fibrofnas de seda nativa obtenidas a partir de gusanos de seda Bombyx mori estan cubiertas por una protefna similar al pegamento llamada sericina, que se extrae completamente o esencialmente completamente de las fibras antes de que las fibras que forman la construcci6n de fibra se siembren con celulas.

La construcci6n de fibra pueden comprender un compuesto de: (1) seda y fibras de colageno; (2) seda y espumas, mallas o esponjas de colageno; (3) fibras de fibrofna de seda y espumas, mallas o esponjas de seda; (4) seda y polfmeros biodegradables �por ejemplo, celulosa, algod6n, gelatina, polilactida, poliglic6lico, poli(lactida-co-glic6lido), policaprolactona, poliamidas, polianhfdridos, poliaminoacidos, poliortoesteres, poliacetales, protefnas, poliuretanos degradables, polisacaridos, policianoacrilatos, glicosaminoglicanos (por ejemplo, sulfato de condroitina, heparina, etc.), polisacaridos (nativos, reprocesados o versiones producidas geneticamente: por ejemplo, acido hialur6nico, alginatos, xantanos, pectina, chitosan, chitina y similares), elastina (nativa, reprocesada o versiones producidas geneticamente y qufmicas), y colagenos (nativos, reprocesados o versiones producidas geneticamente), o (5) seda y polfmeros no biodegradables (por ejemplo, poliamida, poliester, poliestireno, polipropileno, poliacrilato, polivinilo, policarbonato, politetrafluoroetileno, o material de nitrocelulosa. El compuesto generalmente mejora las propiedades de la construcci6n de fibra tales como la porosidad, degradabilidad, y tambien mejora la siembra celular, proliferaci6n, diferenciaci6n o desarrollo del tejido. Las Figs. 16A, 16B y 16C ilustran la habilidad de las fibras de colageno para soportar el crecimiento de BMSC y la diferenciaci6n especffica del ligamento.

La construcci6n de fibra tambien puede tratarse para aumentar la proliferaci6n celular y/o diferenciaci6n de tejido en la misma. Los tratamientos ejemplares de construcci6n de fibra para aumentar la proliferaci6n celular y la diferenciaci6n de tejido incluyen, pero no se limitan a, metales, irradiaci6n, entrelazado, modificaci6n qufmica de superficie �por ejemplo, capa peptfdica RGO (arg-gli-asp), capa de fibronectina, combinaci6n de factores de crecimiento�, y modificaciones de la superficie ffsica.

Un segundo aspecto de esta divulgaci6n se refiere a un LCA mecanicamente y biol6gicamente funcional formado a partir de una construcci6n nueva de fibra basada en fibra de seda y celulas estromales de medula 6sea (BMSCs) aut6logas o alogenicas (dependiendo del receptor del tejido) sembradas sobre la contrucci6n de fibra. La construcci6n de fibra basada en fibra de seda induce a la diferenciaci6n de celula estromal hacia el linaje del ligamento sin necesidad de ninguna estimulaci6n mecanica durante el cultivo con el bioreactor. Las BMSCs sembradas sobre la construcci6n de fibra basada en fibra de seda y que se cultivaron en una placa de Petri comienzan a unirse y extenderse (vease Fig. 7A-O); las celulas proliferan para cubrir la construcci6n de fibra (vease Figs. 8A-B, Fig. 9A y Fig. 9B) y se diferencian, como muestra la expresi6n de marcadores especfficos de ligamento (vease Fig. 14). Los marcadores para cartflago (colageno tipo III) y para hueso (sialoprotefna 6sea) no se expresaron (vease Fig. 14). Los datos que ilustran la expresi6n de los marcadores especfficos de ligamento se establecen en un ejemplo, mas abajo.

Otro aspecto de esta divulgaci6n se refiere a un metodo para producir un LCA ex vivo. Las celulas capaces de diferenciarse en celulas de ligamento crecen bajo condiciones que estimulan los movimientos y fuerzas experimentados por un LCA in vivo durante el curso del desarrollo embri6nico en la funci6n de ligamento maduro. Especfficamente, bajo condiciones esteriles, las celulas pluripotentes se siembran dentro de una construcci6n de fibra badas en fibra de seda tridimensional a la que las celulas pueden adherirse y que ventajosamente tiene forma cilfndrica. La construcci6n de fibra basada en fibra de seda tridimensional usada en el metodo sirve como una construcci6n de fibra preliminar, que esta complementada y posiblemente incluso sustituida por componentes extracelulares de la construcci6n de fibra producidos por las celulas diferenciadoras. El uso de la nueva construcci6n de fibra basada en fibra de seda puede mejorar o acelerar el desarrollo del LCA. Por ejemplo, la nueva construcci6n de fibra basada en fibra de seda puede estar disenada para poseer propiedades mecanicas especfficas (por ejemplo, mayor fuerza de tracci6n) para que pueda soportar fuerzas resistentes antes del refuerzo de los componentes extracelulares de la construcci6n de fibra (por ejemplo, colageno y tenascina). Otras propiedades ventajosas de la nueva construcci6n de fibra preliminar basada en fibra de seda incluyen, sin limitaci6n, la biocompatibilidad y la susceptibilidad a la biodegradaci6n.

Las celulas pluripotentes pueden estar sembradas dentro de la construcci6n de fibra preliminar bien antes o despues de la formaci6n de la construcci6n de fibra, dependiendo de la construcci6n de fibra particular usada y del metodo de formaci6n de la construcci6n de fibra. La siembra uniforme es normalmente preferible. En teorfa, el numero de celulas sembradas no limita el ligamento final producido; sin embargo, la siembra 6ptima puede aumentar la velocidad de generaci6n. Las cantidades 6ptimas de siembra dependeran de las condiciones especfficas del cultivo. La construcci6n de fibra puede sembrarse con desde aproximadamente 0,05 a 5 veces la densidad celular fisiol6gica de un ligamento nativo.

Se usan uno o mas tipos de celulas pluripotentes en el metodo. Tales celulas tiene la habilidad de diferenciarse en una amplia variedad de tipos de celulas en respuesta a las senales apropiadas de diferenciaci6n y de expresar marcadores especfficos de ligamento. Mas especfficamente, el metodo usa celulas, tales como celulas estromales de medula 6sea, que tienen la habilidad de diferenciarse en celulas de tejido de ligamento y tend6n. Si el ligamento resultante generado por bioingenierfa va a transplantarse en un paciente, las celulas deberfan derivarse de una fuente que sea compatible con el receptor previsto. Aunque el receptor sera generalmente un humano, las aplicaciones en medicina veterinaria tambien existene. Las celulas pueden obtenerse del receptor (aut6logas), aunque las celulas de un donante compatible tambien pueden usarse para hacer ligamentos alogenicos. Por ejemplo, cuando se hacen ligamentos alogenicos (por ejemplo, usando celulas de otro humano tales como celulas estromales de medula 6sea aisladas de medula 6sea donada o fibroblastos de LCA aislados de tejido donado de LCA), podrfan usarse celulas de fibroblasto de ligamento cruzado anterior humano aisladas del tejido intacto de LCA del donante (por ejemplo, cadaverico o de trasplantes totales de rodilla), tejido de LCA desgarrado (por ejemplo, cosechado en el momento de cirujfa de un paciente que esta sufriendo reconstrucci6n de LCA) o celulas estromales de medula 6sea. La determinaci6n de la compatibilidad esta dentro de los medios del medico experto.

Los ligamentos y tendones que incluyen, aunque no se limitan a, el ligamento cruzado posterior, los tendones del manguito del rotador, el ligamento colateral medial del codo y rodilla, los tendones flexores de la mano, ligamentos laterales del tobillo y tendones y ligamentos de la mandfbula o articulaci6n temporomandibular diferentes de LCA, cartflago, hueso y otros tejidos pueden generarse mediante ingenierfa con la construcci6n de fibra de acuerdo con los metodos de esta divulgaci6n. Oe esta manera, las celulas que van a sembrarse sobre la construcci6n de fibra se seleccionan de acuerdo con el tejido a ser producido (por ejemplo, pluripotente o del tipo de tejido deseado). Las celulas sembradas sobre la construcci6n de fibra, como aquf se describe, pueden ser aut6logas o alogenicas. El uso de celulas aut6logas crea eficazmente un aloinjerto o autoinjerto para implantaci6n en un receptor.

Como se vuelve a mencionar, para formar un LCA, se siembran celulas tales como celulas estromales de medula 6sea sobre la construcci6n de fibra. Las celulas estromales de medula 6sea son un tipo de celulas pluripotentes y tambien son referidas en la tecnica como celulas madre mesenquimales o simplemente celulas estromales. Como se vuelve a mencionar, la fuente de estas celulas puede ser aut6loga o alogenica. Ademas, celulas de adulto o celulas madre embri6nicas o celulas pluripotentes pueden usarse si el medio apropiado (bien in vivo o in vitro), sembrado sobre la construcci6n de fibra basada en fibra de seda, puede recapitular un ALC o cualquier otro ligamento o tejido deseado en la composici6n extracelular de construcci6n de fibra (por ejemplo, protefna, contenido de glicoprotefna), organizaci6n, estructura o funci6n.

Las celulas de fibroblasto tambien pueden sembrarse sobre la construcci6n de fibra inventiva. Oebido a que las celulas de fibroblasto no son a menudo referidas como celulas pluripotentes, los fibroblastos pretenden incluir fibroblastos de LCA de humano maduro (aut6logos o alogenicos) aislados del tejido de LCA, fibroblastos de otro tejido de ligamento, fibroblastos de tejido de tend6n, de prepucio neonatal, de sangre del cord6n umbilical, o de cualquier celula, ya sea madura o pluripotente, desdiferenciada madura, o producida geneticamente, de manera que cuando se cultivan en el medio apropiado (bien in vivo o in vitro), y se siembran sobre la construcci6n de fibra basada en fibra de seda, puedan recapitular un LCA o cualquier otro ligamento o tejido deseado en la composici6n extracelular de la construcci6n de fibra (por ejemplo, protefna, contenido de glicoprotefna), organizaci6n, estructura o funci6n.

Las caras del cilindro de la construcci6n de fibra estan individualmente acopladas a anclas, a traves de las cuales se ejercera una variedad de fuerzas a la construcci6n de fibra. Para facilitar el envfo de fuerza a la construcci6n de fibra, la superficie completa de cada respectiva cara de la construcci6n de fibra puede estar en contacto con la cara de las respectivas anclas. Las anclas con un forma que refleja el area de acoplamiento (por ejemplo, cilfndrica) son las mas adecuadas para su uso en este metodo. Una vez montadas, las celulas en la construcci6n de fibra fijada se cultivan bajos condiciones apropiadas para el crecimiento celular y la regeneraci6n. La construcci6n de fibra se somete a una o mas fuerzas mecanicas aplicadadas a traves de las anclas acopladas (por ejemplo, por medio de movimiento de una o ambas de las anclas acopladas) durante el curso del cultivo. Las fuerzas mecanicas se aplican durente el periodo de cultivo para imitar las condiciones experimentadas por el ALC nativo u otros tejidos in vivo.

Las anclas deben estar hechas de un material adecuado para el acoplamiento de la construcci6n de fibra, y el acoplamiento resultante deberfa ser lo sufiencientemente fuerte como para soportar la tensi6n de las fuezas mecanicas aplicadas. Ademas, las anclas pueden ser de un material que sea adecuado para el acoplamiento de la construcci6n de fibra extracelular que las celulas diferenciadoras producen. Las anclas soportan tejido 6seo en crecimiento (bien in vitro o in vivo) mientras sujetan el ligamento que se esta desarrollando. Algunos ejemplos de material adecuado para ancla incluyen, sin limitaci6n, hidroxiapatita, coral Goniopora, hueso desmineralizado, hueso (alogenico o aut6logo). Los materiales del ancla tambien pueden incluir titanio, acero inoxidable, polietileno de alta densidad, OACRON y TEFLON.

Como alternativa, el material del ancla puede crearse o ademas mejorarse impregnando un material seleccionado con un factor que estimule bien el enlace de construcci6n de fibra del ligamento o el enlace de construcci6n de fibra del hueso o ambos. Se considera que el termino &quot;impregnar&quot; incluye cualquier metodo de aplicaci6n que distribuye apropiadamente el factor en el ancla (por ejemplo, cubriendo, extendiendose, contactando). Ejemplos de tales factores incluyen sin limitaci6n laminina, fibronectina, cualquier protefna extracelular de la construcci6n de fibra que estimule la adhesi6n, seda, factores que contengan regiones de enlace peptidico de arginina-glicina-aspartato (RGO)

o los propios peptidos RGO. Los factores de crecimiento o la protefna morfogenica 6sea tambien pueden usarse para mejorar el acoplamiento del ancla. Ademas, las anclas pueden pre-sembrarse con celulas (por ejemplo, celulas madre, celulas de ligamento, osteoblastos, celulas progenitoras osteogenicas) que se adhieren a las anclas y se unen a la construcci6n de fibra, para producir un acoplamiento mejorado de construcci6n de fibra tanto in vitro como in vivo.

Un sistema de ancla ejemplar se desvela en la solicitud co-pendiente del solicitante U.S.S.N. 09/950.561. La construcci6n de fibra esta acoplada a las anclas por medio de un contacto con la cara del ancla o alternativamente por medio de una penetraci6n real del material de la construcci6n de fibra a traves del material del ancla. Oebido a que la fuerza aplicada a la construcci6n de fibra por medio de las anclas dicta el ligamento final producido, el tamano del ligamento final producido es, en parte, dicatado por el tamano del area de acoplamiento del ancla. Oeberfa usarse un ancla del tamano apropiado para el ligamento final deseado. Un ejemplo de forma de ancla para la formaci6n de un LCA es un cilindro. Sin embargo, otros tamanos y formas de ancla tambien funcionaran adecuadamente. Por ejemplo, las anlclas pueden tener el tamano y la composici6n apropiados para la inserci6n directa en tuneles 6seos en el femur y tibia de un receptor del ligamento producido por bioingenierfa.

Como alternativa, las anclas pueden usarse solamente temporalmente durante el cultivo in vitro, y despues retirarse cuando la construcci6n de fibra se implante sola in vivo.

Incluso ademas, la construcci6n nueva de fibra basada en fibra de seda puede sembrarse con BMSCs y cultivarse en un bioreactor. Actualmente existen dos tipos de medios de crecimiento que pueden usarse de acuerdo con los metodos de esta divulgaci6n: (1) el sistema del aparato bioreactor in vitro, y (2) la articulaci6n de la rodilla in vivo, que sirve como un &quot;bioreactor&quot; ya que proporciona el ambiente fisiol6gico que incluye celulas del progenitor y estfmulos (tanto qufmicos como ffsicos) necesarios para el desarrollo de un LCA viable dada una construcci6n de fibra con propiedades biocompatibles y mecanicas apropiadas. El aparato bioreactor proporciona condiciones 6ptimas de cultivo para la formaci6n de un ligamento en terminos de diferenciaci6n y producci6n de construcci6n de fibra extracelular (MEC), y que de este modo proporciona el ligamento con propiedades mecanicas y biol6gicas 6ptimas antes de la implantaci6n en un receptor. Ademas, cuando la construcci6n de fibra basada en fibra de seda se siembra y cultiva in vitro, una placa de Petri puede considerarse el bioreactor dentro de la cual existen las condiciones apropiadas para el crecimiento celular y la regeneraci6n, es decir, un medio estatico.

Las celulas tambien pueden cultivars sobre la construcci6n de fibra sin la aplicaci6n de ninguna fuerza mecanica, es decir, en un medio estatico. Por ejemplo, la construcci6n de fibra basada en fibra de seda sola, sin fuerzas mecanicas ni estimulaci6n aplicadas in vitro, cuando se siembra y cultiva con BMSCs, induce a las celulas a proliferar y expresar marcadores especfficos de ligamento y tend6n (vease los ejemplos, aquf descritos). La articulaci6n de la rodilla puede servir como un medio de crecimiento y desarrollo fisiol6gico que puede proporcionar las celulas y las senales ambientales correctas (qufmicas y ffsicas) a la construcci6n de fibra de manera que tecnicamente se desarrolla un LCA. Por lo tanto, la articulaci6n de rodilla (como su propia forma de bioreactor) mas las construcci6n de fibra (bien no sembrada, sembrada y no diferenciada in vitro, o sembrada y diferenciada in vitro antes de la implantaci6n) dara como resultado el desarrollo de un LCA, u otro tejido deseado dependiendo del tipo de celula sembrada sobre la construcci6n de fibra y la localizaci6n anat6mica de la implantaci6n de la construcci6n de fibra. La Fig. 15 A-B ilustra los efectos del medio de la articulaci6n de rodilla colateral medial sobre el desarrollo del ligamento colateral medial (LCM) cuando solamente una construcci6n de fibra basada en seda no sembrada con las propiedades mecanicas apropiadas de LCM se impanta durante 6 semanas in vivo. Ya se hayan cultivado las celulas en un medio estatico sin aplicarse estimulaci6n mecanica, o en un medio dinamico, tal como en un aparato bioreactor, las condiciones apropiadas para el crecimiento celular y la regeneraci6n estan ventajosamente presentes para la producci6n del ligamento o tejido deseado.

En los experimentos descritos en los ejemplos, mas abajo, la estimulaci6n mecanica aplicada demostr6 influir en la morfologfa, y organizaci6n celular de las celulas progenitoras dentro del tejido resultante. Los componentes extracelulares de la construcci6n de fibra segregados por las celulas y la organizaci6n de la construcci6n de fibra extracelular en todo el tejido tambien estuvieron significativamente influenciados por las fuerzas aplicadas a la construcci6n de fibra durante la generaci6n del tejido. Ourante la generaci6n del tejido in vitro, las celulas y la construcci6n de fibra extracelular se alinearon a lo largo del eje de carga, reflejando la organizaci6n in vivo de un LCA nativo que tambien esta a lo largo de varios ejes de carga producidos por el movimiento y la funci6n de la articulaci6n natural de rodilla. Estos resultados sugieren que los estfmulos ffsicos experimentados en esencia por las celulas del tejido que se esta desarrollando, tal como LCA, juegan un papel significativo en la diferenciaci6n de celulas progenitoras y formaci6n de tejidos. Ademas indican que este papel puede duplicarse eficazmente in vitro mediante manipulaci6n mecanica para producir un tejido similar. Cuanto mas se parezcan las fuerzas producidas por la manipulaci6n mecanica a las fuerzas experimentadas por un LCA in vivo, mas se parecera el tejido resultante a un LCA nativo.

Cuando la estimulaci6n mecanica se aplica in vitro a la construcci6n de fibra por medio de un bioreactor, existe un control independiente pero concurrente sobre la tensi6n cfclica y de rotaci6n cuando se aplica a un ancla con respecto a la otra ancla. Como alternativa, la construcci6n de fibra sola pueden implantarse in vivo, sembrarse con celulas de LCA del paciente y exponerse in vivo a las senalizaci6n mecanica a traves del paciente.

Cuando la construcci6n de fibra se siembra con celulas antes de la implantaci6n, las celulas se cultivan dentro de la construcci6n de fibra bajo condiciones apropiadas para el crecimiento y diferenciaci6n celular. Ourante el proceso de cultivo, la construcci6n de fibra puede estar sometida a una o mas fuerzas mecanicas a traves del movimiento de una o ambas anclas acopladas. Las fuerzas mecanicas de tensi6n, compresi6n, torsi6n y rotura, y combinaciones de las mismas, se aplican en las combinaciones, magnitudes y frecuencias apropiadas para imitar los estfmulos mecanicos experimentados por un LCA in vivo.

Varios factores influiran en la cantidad de fuerza que la construcci6n de fibra puede tolerar (por ejemplo, la composici6n de construcci6n de fibra, densidad de fibra). Se espera que la fuerza de la construcci6n de fibra cambie a lo largo del curso del desarrollo del tejido. Por lo tanto, las fuerzas mecanicas o tensiones aplicadas aumentaran, disminuiran o permaneceran constantes en magnitud, duraci6n, frecuencia y variedad durante el periodo de generaci6n del ligamento, para corresponder apropiadamente con la fuerza de construcci6n de fibra en el momento de la aplicaci6n.

Cuando se produce un LCA, cuanto mas precisan sean la intensidad y la combinaci6n de estfmulos aplicados a las construcci6n de fibra durante el desarrollo del tejido, mas se parecera el ligamento resultante a un LCA nativo. Oeben considerarse dos tejidos en lo que respecta a la funci6n natural del LCA cuando se concibe el regimen de fuerza mecanica in vitro que imita mucho el medio in vivo: (1) los diferentes tipos de movimiento experimentados por el LCA y las respuestas del LCA a los movimientos de la articulaci6n de la rodilla y (2) la extensi6n de las tensiones mecanicas experimentadas por el ligamento. Las combinaciones especfficas de los estfmulos mecanicos estan generadas por los movimientos naturales de la estructura de la rodilla y se transmiten al LCA nativo.

Para describir brevemente los movimientos de la rodilla, la conexi6n de la tibia y el femur por el LCA proporciona seis grados de libertad cuando se consideran los movimientos de los dos huesos uno en relaci6n con el otro. La tibia puede moverse en tres direccionese y puede rotar en relaci6n con los ejes para cada una de estas tres direcciones. Se impide que la rodilla alcance los niveles completos de estos seis grados de libertad debido a la presencia de ligamentos y fibras capilares y las propias superficies de las rodillas (Biden y col., &quot;Experimental Methods Used to Evaluate �nee Ligament Function&quot;, �nee Ligaments: Structure, Function, Injury and Repair, Ed. O. Oaniel y col.,

Raven Press, pags. 135-151, 1990). Tambien son posibles pequenos movimientos traslacionales. Las areas de acoplamiento del LCA son responsables de sus papeles estabilizadores en la articulaci6n de la rodilla. El LCA funciona como un estabilizador primario de traslaci6n anterior-tibial, y como un estabilizador secundario de angulaci6n valgus-varus y rotaci6n tibial (Shoema�er y col, &quot;The Limits of �nee Motion&quot;, �nee Ligaments: Structure, Function, Injury and Repair, Ed. O. Oaniel y col., Raven Press, pags. 1534-161, 1990). Por lo tanto, el LCA es responsable de estabilizar la rodilla en tres de los seis posibles grados de libertad. Como resultado, el ALC ha desarrollado una organizaci6n especffica de fibra y una estructura general para realizar estas funciones estabilizadoras. Estas condiciones se estimulan in vitro para producir un tejido con una estructura y una organizaci6n de fibra similares.

La extensi6n de las tensiones mecanicas experimentadas por el LCA puede resumirse de manera similar. El LCA sufre cargas cfclicas de aproximadamente 400 N entre uno y dos millones de ciclos por ano (Chen y col., J. Biomed. Mat. Res. 14: 567-586, 1980). Tambien se consideran la rigidez lineal (-182 N/mm), la deformaci6n maxima (100% de LCA) y la energfa absorbida en fallo (12,8 N-m) (Woo y col., The tensile properties of human anterior cruciate ligament (ACL) and ACL graft tissues, �nee Ligaments: Structure, Function, Injury and Repair, Ed. O. Oaniel y col., Raven Press, pags. 279-289, 1990) cuando se desarrolla una sustituci6n quirurgica de LCA.

La secci6n de ejemplos, mas abajo, detalla la producci6n de un ligamento cruzado anterior (LCA) prototipo producido por bioingenierfa ex vivo. Las fuerzas mecanicas que imitan un subconjunto de los estfmulos mecanicos experimentados por un LCA nativo in vivo (deformaci6n rotacional y deformaci6n lineal) se aplicaron en combinaci6n, y se estudi6 el ligamento resultante que se form6 para determinar los efectos de las fuerzas aplicadas sobre el desarrollo del tejido. La exposici6n del ligamento en desarrollo a la carga fisiol6gica durante la formaci6n in vitro indujo a las celulas a adoptar una orientaci6n definida a lo largo de los ejes de carga, y tambien a generar matrices extracelulares a lo largo de los ejes. Estos resultados indican que la incorporaci6n de fuerzas mecanicas complejas multi-dimensionales en el regimen para producir una red mas compleja de ejes de carga que imite el entorno del LCA nativo producira un ligamento producido por bioingenierfa que se parezca mucho a un LCA nativo.

Las diferentes fuerzas mecanicas que pueden aplicarse incluyen, sin limitaci6n, tensi6n, compresi6n, torsi6n y rotura. Estas fuerzas se aplican en combinaciones que estimulan las fuerzas experimentadas por un LCA en el curso de los movimientos y la funci6n natural de una articulaci6n de rodilla. Estos movimientos incluyen, sin limitaci6n, extensi6n y flexi6n de la articulaci6n de la rodilla como se define en el plano coronal y sagital, y flexi6n de la articulaci6n de la rodilla. �ptimamente, la combinaci6n de fuerzas aplicadas imita los estfmulos mecanicos experimentados por un ligamento cruzado anterior in vivo de manera tan precisa como lo es experimentalmente posible. Se espera que la variaci6n del regimen especffico de aplicaci6n de fuerza durante el curso de generaci6n del ligamento influya en la velocidad y resultado del desarrollo del tejido, con condiciones 6ptimas que se determinaran empfricamente. Las variables potenciales en el regimen incluyen, sin limitaci6n: (1) velocidad de tensi6n, (2) porcentaje de tensi6n, (3) tipo de tensi6n (por ejemplo, traslaci6n y rotaci6n), (4) frecuencia, (5) numero de ciclos dentro de un regimen dado,

(6) numero de regfmenes diferentes, (7) duraci6n en puntos extremos de deformaci6n de ligameno, (8) niveles de fuerza, y (9) diferentes combinaciones de fuerza. Existe una amplia variedad de variaciones. El regimen de fuerzas mecanicas aplicadas puede producir fibras helicoidalmente organizadas similares a las del ligamento nativo, descrito mas abajo.

Los paquetes de fibra de un ligamento nativo estan dispuestos en una organizaci6n helicoidal. El modo de acoplamiento y la necesidad de la articulaci6n de la rodilla para rotar -140° de flexi6n ha dado como resultado que el LCA nativo herede un giro de 90° y que los paquetes perifericos de fibra desarrollen una organizaci6n helicoidal. Esta caracterfstica biomecanica unica permite que el LCA mantenga una carga extremadamente alta. En el LCA funcional, esta organizaci6n helicoidal de fibras permite que las fibras anteriores-posteriores y posteriores-anteriores permanezcan relativamente isometricas unas con respecto a otras para todos los grados de flexi6n, por lo que la carga puede distribuirse igualmente a todos los paquetes de fibra en cualquier grado de flexi6n de la articulaci6n de la rodilla, estabilizando la rodilla en todos los niveles de movimiento de la articuladi6n. Las fuerzas mecanicas que estimulan una combinaci6n de flexi6n de articulaci6n de rodilla y extensi6n de articulaci6n de rodilla pueden aplicarse al ligamento en desarrollo para producir un LCA producido por ingenierfa que posee esta misma organizaci6n helicoidal. El aparato mecanico usado en el experimento presentado en los ejemplos, mas abajo, proporciona control sobre la tensi6n y las velocidades de tensi6n (tanto traslacional como rotacional). El aparato mecanico controlara la carga real experimentada por los ligamentos que estan creciendo, que sirve para &quot;ensenar&quot; a los ligamentos con el paso del tiempo a traves del control y el aumento de los regfmenes de carga.

Otro aspecto de esta divulgaci6n se refiere al ligamento curzado anterior generado por bioingenierfa producido por los metodos anteriormente descritos. El ligamento generado por bioingenierfa producido por estos metodos esta caracterizado por el patr6n de rizo de la orientaci6n celular y/o construcci6n de fibra en la direcci6n de las fuerzas mecanicas aplicadas durante su generaci6n. El ligamento tambien esta caracterizado por la producci6n/presencia de componentes celulares de la construcci6n de fibra (por ejemplo, colageno de tipo I y tipo III, fibronectina y protefnas tenascina-C) a lo largo del eje de carga mecanica experimentada durante el cultivo. Los paquetes de fibra de ligamento pueden estar dispuestos en una organizaci6n helicoidal, como se ha tratato anteriormente.

Los metodos anteriores que usan la nueva construcci6n de fibras basada en fibra de seda no estan limitados a la producci6n de un LCA, sino que tambien pueden usarse para producir otros ligamentos y tendones encontrados en la rodilla (por ejemplo, ligamento cruzado posterior) u otras partes del cuerpo (por ejemplo, mano, muneca, tobillo, codo, mandfbula y hombro), tales como por ejemplo, pero sin limitar a, ligamento cruzado posterior, tendones del manguito del rotador, ligamento colateral medial del codo y rodilla, tendones flexores de la mano, ligamentos laterales del tobillo y tendones y ligamentos de la mandfbula o articulaci6n temporomandibular. Todas las articulaciones m6viles en un cuerpo humano tiene ligamentos especializados que conectan las extremidades articulares de los huesos en las articulaci6n. Cada ligamento en el cuerpo tiene una estructura y organizaci6n especffica que esta dictada por su funci6n y entorno. Los varios ligamentos del cuerpo, sus localizaciones y funciones estan enumeradas en Anatomy, Oescriptive and Surgical (Gray, H., Eds. T. P., Howden, R., Bounty Boo�s, New Yor�, 1977). Oeterminando los estfmulos ffsicos experimentados por un ligamento o tend6n dado, e incorporando fuerzas que imitan estos estfmulos, el metodo anteriormente descrito para producir un LCA ex vivo puede adaptarse para producir ligamentos y tendones generados por bioingenierfa ex vivo que estimula cualquier ligamento o tend6n en el cuerpo.

El tipo especffico de ligamento o tend6n a ser producido se predetermina antes de la generaci6n del tejido ya que varios aspectos del metodo varfan con las condiciones especfficas experimentadas in vivo por el ligamento o tend6n nativo. Las fuerzas mecanicas a las que el ligamento o tend6n en desarrollo esta sometido durante el cultivo celular se determinan para el tipo particular de ligamento o tend6n que se esta cultivando. Las condiciones especfficas pueden determinarse estudiando el ligamento o tend6n nativo y su entorno y funci6n. Una o mas fuerzas mecanicas experimentadas por el ligamento o tend6n in vivo se aplican a la construcci6n de fibra durante el cultivo de las celulas en la construcci6n de fibra. El medico experto reconocera que un ligamento o tend6n que es superior a aquellos actualmente disponibles puede producirse mediante la aplicaci6n de un subconjunto de fuerzas experimentadas por el ligamento o tend6n nativo. Sin embargo, 6ptimamente, la completa variedad de fuerzas in vivo se aplicaran a la construcci6n de fibra en las magnitudes y combinaciones apropiadas para producir un producto final que se parezca lo mas posible al ligamento o tend6n nativo. Estas fuerzas incluyen, sin limitaci6n, las fuerzas descritas anteriormente para la producci6n de un LCA. Oebido a que las fuerzas mecanicas aplicadas varfan con el tipo de ligamento o tend6n, y el tamano final del ligamento o tend6n estara influenciado por las anclas usadas, el medico experto determinara la composic6n 6ptima del ancla, el tamano y las areas de acoplamiento de la construcci6n de fibra para cada tipo de ligamento o tend6n. El tipo de celulas sembradas sobre la construcci6n de fibra obviamente se determina en base al tipo de ligamento o tend6n a ser producido.

Pueden producirse ex vivo otros tipos de tejido usando metodos similares a los descritos anteriormente para la generaci6n de ligamentos o tendones ex vivo. Los metodos anteriormente descritos tambien pueden aplicarse para producir una variedad de productos de ingenierfa de tejidos que implican la deformaci6n mecanica como una parte principal de su funci6n, tales como musculo (por ejemplo, musculo liso, musculo 6seo, musculo cardfaco), hueso, cartflago, discos vertebrales, y algunos tipos de vasos sangufneos. Las celulas estromales de medula 6sea poseen la habilidad de diferenciarse entre estos asf como otros tejidos. La geometrfa de la construcci6n de fibra basada en seda o construcci6n compuesta de fibra puede adapatarse facilmente a la correcta configuraci6n anat6mica geometrica del tipo de tejido deseado. Por ejemplo, las fibras de fibrofna de seda pueden reformarse en un tubo cilfndrico para recrear arterias.

Los resultados presentes en los ejemplos, mas abajo, indican que el crecimiento en un entorno que imita el entorno mecanico especffico de un tipo de tejido dado inducira a la apropiada diferenciaci6n celular para producir un tejido generado por bioingenierfa que se parece significativamente al tejido nativo. Las variedades y tipos de deformaci6n mecanica de la construcci6n de fibra pueden extenderse para producir una amplia variedad de organizaci6n estructural de tejido. El ambiente del cultivo celular puede reflejar el ambiente in vivo experimentado por el tejido nativo y las celulas que contiene, durante el curso del desarrollo embri6nico a la funci6n madura de las celulas dentro del tejido nativo, de la manera mas precisa posible. Los factores a considerar cuando se disenan condiciones especfficas de cultivo para producir un tejido dado incluyen, sin limitaci6n, la composici6n de la construcci6n de fibra, el metodo de inmovilizaci6n celular, el metodo de fijaci6n de la construcci6n de fibra o tejido, las fuezas especfficas aplicadas, y el medio del cultivo celular. El regimen especffico de estimulaci6n mecanica depende del tipo de tejido a producirse, y se establece variando la aplicaci6n de fuerzas mecanicas (por ejemplo, solamente tensi6n, solamente torsi6n, combinaci6n de tensi6n y torsi6n, con o sin rotura, etc.), la amplitud de la fuerza (por ejemplo, angulo o alargamiento), la frecuencia y duraci6n de la aplicaci6n, y la duraci6n de los periodos de estimulaci6n y descanso.

El metodo para producir el tipo especffico de tejido ex vivo es una adaptaci6n del metodo anteriormente descrito para producir un LCA. Los componentes implicados incluyen celulas pluripotentes, una construcci6n de fibra tridimensional a la que las celulas pueden adherirse, y una pluralidad de anclas que tienen una cara adecuada para el acoplamiento de la construcci6n de fibra. Las celulas pluripotentes (tales como celulas estromales de medula 6sea) se siembran en la construcci6n de fibra tridimensional por medio de la inmovilizaci6n uniforme de las celulas dentro de la construcci6n de fibra. El numero de celulas sembradas tampoco se ve como limitativo, sin embargo, sembrar la construcci6n de fibra con una alta densidad de celulas podrfa acelerar la generaci6n de tejido.

Las fuerzas especfficas aplicadas se determinaran para cada tipo de tejido producido a traves del examen de tejido nativo y los estfmulos mecanicos experimentados in vivo. Un tipo dado de tejido experimenta fuerzas caracterfsticas que estan dictadas por la localizaci6n y funci6n del tejido dentro del cuerpo. Por ejemplo, el cartflago es conocido por experimentar una combinaci6n de rotura y compresi6n/tensi6n in vivo; el hueso experimenta compresi6n.

Tambien pueden incorporarse estfmulos adicionales (por ejemplo, estfmulos qufmicos, estfmulos electromagneticos) a los metodos anteriormente mencionados para producir ligamentos, tendones y otros tejidos generados por bioingenierfa. La diferenciaci6n celular es conocida por estar influenciada por estfmulos qufmicos del entorno, a menudo producidos por celulas circundantes, tales como factores segregados de crecimiento o diferenciaci6n, contacto celula-celula, gradientes qufmicos y niveles especfficos de pH, por nombrar unos pocos. Los tipos de tejido mas especializados experimentan otros estfmulos mas unicos (por ejemplo, la estimulaci6n electrica del musculo cardfaco). Se espera que la aplicaci6n de tales estfmulos especfficos de tejido (por ejemplo, 1-10 ng/ml factor transformador del crecimiento beta-1 (TGF-�1) independientemente o junto con las fuerzas mecanicas apropiadas facilite la diferenciaci6n de las celulas en un tejido de la manera que mas se aproxime al tejido natural especffico.

Los tejidos producidos por los metodos anteriormente descritos proporcionan un conjunto ilimitado de equivalentes de tejido para implantaci6n quirurgica en un receptor compatible, particularmente para sustituci6n o reparaci6n de tejido danado. Los tejidos producidos por ingenierfa tambien pueden utilizarse para estudios in vitro de funci6n de tejido normal o patol6gica, por ejemplo, para prueba in vitro de respuestas a nivel de celula y tejido a manipulaciones moleculares, mecanicas o geneticas. Por ejemplo, pueden usarse tejidos basados en celulas normales o transfectadas para evaluar respuestas de tejidos a estfmulos bioqufmicos o mecanicos, identificar las funciones de genes especfficos o productos geneticos que pueden estar sobreexpresados o noqueados, o para estudiar los efectos de agentes farmacol6gicos. Tales estudios probablemente permitiran comprender mejor el desarrollo del ligamento, tend6n y tejido, funci6n normal y patol6gica, y finalmente llevar hacia sustituciones por ingenierfa de tejidos completamente funcionales, basadas en parte en enfoques de ingenierfa de tejidos ya establecidos, nuevos elementos de comprensi6n en la diferenciaci6n celular y desarrollo de tejido, y el uso de senales mecanicas reguladoras junto con factores bioqufmicos derivados de celulas y ex6genos para mejorar las propiedades estructurales y funcionales del tejido.

La producci6n de tejidos por ingenierfa, tales como ligametnos y tendones, tambien tiene el potencial para aplicaciones tales como cosecha de celulas estromales de medula 6sea de individuos a un alto riesgo de lesi6n de tejido (por ejemplo, ruptura de LCA) antes de la lesi6n. Estas celulas podrfan almacenarse hasta necesitarse o sembrarse en la construcci6n de fibra adecuada y diferenciarse in vitro bajo estfmulos mecanicos para producir una variedad de tejidos protesicos producidos por bioingenierfa que se mantendran en reserva hasta que el donante los necesite. El uso de pr6tesis de tejido vivo producido por bioingenierfa que mejor se ajusta al entorno biol6gico in vivo y que proporciona la carga fisiol6gica requerida para mantener, por ejemplo, el equilibrio dinamico de un ligamento normal completamente funcional, deberfa reducir el tiempo de rehabilitaci6n para un receptor de una pr6tesis de meses a semanas, particularmente si el tejido se ha pre-cultivado y almacenado. Los beneficios incluyen una recuperaci6n mas rapida de la actividad funcional, estancias mas cortas en el hospital, y menos problemas con los rechazos y fallos del tejido.

Los aspectos adicionales de esta invenci6n se ejemplifican con mas detalle en los siguientes ejemplos. Para aquellos expertos en la tecnica resultara aparente que pueden practicarse muchas modificaciones, tanto a los materiales como a los metodos, sin partir de la invenci6n.

En un primer ejemplo, las fibras crudas del gusano de seda Bombys mori, mostradas en la Fig. 1A, se extrajeron para retirar la sericina, la protefna similar al pegamento que cubre la fibrofna de seda nativa (vease Figs. 1A-C). El numero apropiado de fibras por grupo se dispusieron en paralelo y se extrajeron en una soluci6n acuosa de 0,02 M Na2CO3 y 0,3% (por peso) de soluci6n de jab6n IVORY durante 60 minutos a 90 °C, despues se aclararon completamente con agua para extraer las protefnas de sericina similares al pegamento.

Se deriv6 la ecuaci6n de Costello para una geometrfa de cuerda helicoidal con tres hebras para pronosticar las propiedades mecanicas de la construcci6n basada en fibra de seda. El modelo derivado es una serie de ecuaciones que cuando se combinan tienen en cuenta las propiedades de material de fibra de seda extrafda y la jerarqufa geometirca de la construcci6n de fibra deseada para computar la fuerza y rigidez totales de la construcci6n de fibra como una funci6n del angulo de inclinaci6n para un nivel dado de jerarqufa geometrica.

Las propiedades del material de una fibra sencilla de seda incluyen diametro de fibra, m6dulo de elasticidad, relaci6n de Poisson, y la fuerza maxima de tracci6n (UTS). La jerarqufa geometrica puede definirse como el numero de niveles de giro en un nivel de construcci6n de fibra dada. Cada nivel (por ejemplo, grupo, paquete, hebra, cuerda, ligamento) se define ademas por el numero de grupos de fibras enrolladas una alrededor de la otra y el numero de fibras en cada grupo del primer nivel enrollado donde el primer nivel se define como un grupo, el segundo nivel como un paquete, el tercero como una hebra y el cuarto como una cuerda, el quinto como el ligamento.

El modelo asume que cada grupo de multiples fibras actua como una unica fibra con un radio efectivo determinado por el numero de fibras individuales y su radio inherente, es decir, el modelo reduce la fricci6n entre las fibras individuales debido a su limitado papel en un angulo dado con inclinaci6n relativamente alta.

Oos geometrfas aplicables (Matriz 1 y Matriz 2) de las muchas configuraciones geometricas de construcci6n de fibra (vease Tabla 10, arriba) calculadas para producir propiedades mecanicas que imitan las de un LCA nativo se derivaron para un analisis mas detallado. Se seleccion6 una construcci6n de seis cuerdas para su uso como la sustituci6n de LCA. Las configuraciones de la matriz son las siguientes: Matriz 1: 1 pr6tesis LCA = 6 cuerdas paralelas; 1 cuerda = 3 hebras enrolladas (3 giros/cm); 1 hebra = 6 paquetes enrollados (3 giros/cm); 1 paquete = 30 fibras paralelas lavadas; y Matriz 2: 1 matriz LCA= 6 cuerdas paralelas; 1 cuerda = 3 hebras enrolladas (2 giros/cm); 1 hebra = 3 paquetes enrollados (2,5 giros/cm); 1 paquete = 3 grupos (3 giros/cm); 1 grupo = 15 fibras paralelas de fibrofna de seda extrafda. El numero de fibras y geometrfas se seleccionaron de manera que las pr6tesis de seda fueran similares a las propiedades biomecanicas de LCA en UTS, rigidez lineal, lfmite de elasticidad y % de alargamiento de rotura (vease Tabla 10, arriba), sirviendo de este modo como un s6lido punto de inicio para el desarrollo de un LCA producido por ingenierfa de tejidos.

Las propiedades mecanicas de la fibrofna de seda se caracterizaron usando un sistema servohidraulico de tensi6n/compresi6n Instron 8511 con software Fast-Trac� (Instron Corp., Canton, Massachusetts, USA) (vease Fig. 1O). Los analisis individuales de tirar-hasta-fallo y fatiga se realizaron sobre fibras de seda sencilla, fibrofna extrafda y cuerdas organizadas. Las fibras y la fibrofna se organizaron en las geometrfas helicoidales paralelas de la Matriz 1 (vease Fig. 2C) y de la Matriz 2 (vease Fig. 2O) para su caracterizaci6n. La prueba individual de tirar hasta fallo se realiz6 a una velocidad de tensi6n de 100%/seg; se generaron los histogramas de alargamiento de fuerza y los datos se analizaron usando el software Instron Series IX. Tanto la Matriz 1 como la Matriz 2 produjeron propiedades mecanicas y de fatiga similares a las del LCA en UTS, rigidez lineal, lfmite de elasticidad y porcentaje de alargamiento de rotura (vease Tabla 10 y Figs. 3A-O).

Los analisis de fatiga se realizaron usando un sistema servohidraulico de tensi6n/compresi6n Instron 8511 con software Wavema�er sobre cuerdas individuales tanto de la Matriz 1 como de la Matriz 2. Los datos se extrapolaron para representar la pr6tesis de LCA de 6 cuerdas, que se muestra en la Fig. 3B y 3O. Los extremos de la cuerda se insertaron en un molde de epoxi para generar una construcci6n de 3 cm de largo entre las anclas. Los ciclos hasta fallo en UTS de 1.680 N y 1.200 N (n=5 para cada carga) para la Matriz 1 (vease Fig. 3B) y UTS de cargas de 2280 N, 2100 N y 1800 N (n=3 para cada carga) para la Matriz 2 (vease Fig. 3O) se determinaron usando una funci6n de onda senoidal H a 1 Hz generada por el software Wavema�er 32 versi6n 6.6 (Instron Corp.). La prueba de fatiga se realiz6 en una soluci6n de tamp6n fosfato salino (PBS) a temperatura ambiente.

La retirada completa de sericina se observ6 despues de 60 minutos a 90 °C como lo determin6 SEM (vease Figs. 1A-C). La retirada de sericina de las fibras de seda alter6 la ultraestructura de las fibras, dando como resultado una superficie mas lisa de fibra, y la fibrofna de seda subyacente se revel6 (mostrada en la Fig. 1A-C), con un diametro medio que oscilaba entre 20 y 40 �m. La fibrofna mostr6 una significativo descenso del 15,2% en la fuerza maxima de tracci6n (1,033 +/-0,042 N/fibra a 0,876 +/-0,1 N/fibra) (p<0,05, prueba t de Student pareada) (vease Fig. 1O). Las propiedades mecanicas de las matrices de seda optimizada (vease Fig. 2A-O y Fig. 3A-O) estan resumidas en la Tabla 11 y en la Fig. 3A (para Matriz 1) y Fig. 3C (para Matriz 2). A partir de estos resultados es evidente que la matrices de seda optimizada mostraron valores comparables a los de LCA nativo, que han confirmado tener una fuerza maxima de tracci6n media (UTS) de -2100 N, rigidez de -250 N/nm, lfmite de elasticidad -2100 N y 33% de alargamiento de rotura (Vease Woo, SL-Y, y col, The Tensile Properties of Human Anterior Cruciate Ligament (ACL) and ACL Graft Tissue in �nee Ligaments: Structure, Function, Injury and Repair, 279-289, Ed. O. Oaniel y col., Raven Press 1990).

Los analisis de regresi6n de los datos de fatiga de la construcci6n de fibra, mostrados en la Fig. 3B para la Matriz 1 y Fig. 3O para la Matriz 2, cuando se extrapolan a niveles de carga fisiol6gica (400 N) pronostican el numero de ciclos hasta fallo in vivo, indican una vida de construcci6n de fibra de 3,3 millones de ciclos para la Matriz 1 y una vida de mas de 10 millones de ciclos para la Matriz 2. El diseno de construcci6n de fibra helicoidal que utiliza fibras de seda lavada dio como resultado una construcci6n de fibra con propiedades estructurales fisiol6gicamente equivalentes, lo que confirma su idoneidad como un andamio para ingenierfa de tejidos de ligamento.

En otro ejemplo que implica el aislamiento y cultivo celular, se eligieron celulas estromales de medula 6sea (BMSC), celulas pluripotentes capaces de diferenciarse entre linajes osteogenicos, condrogenicos, tendonogenicos, adipogenicos y miogenicos, ya que la formaci6n de las condiciones apropiadas puede dirigir su diferenciaci6n a la lfnea celular de fibroblasto de ligamento deseado (Mar�olf y col., J. Bone Joint Surg. 71A: 887-893, 1989; Caplan y col., Mesenchymal stem cells and tissue repair, The Anterior Cruciate Ligament: Current and Future Concepts, Ed. O.

W. Jac�son y col., Raven Press, Ltd, New Yor�, 1993; Young y col., J. Orthopaedic Res. 16: 406-413, 1998).

Las BMSCs humanas se aislaron de la medula 6sea de la cresta ilfaca de donantes que dieron el consentimiento de al menos 25 anos de edad por un proveedor comercial (Cambrex, Wal�ersville, MO). Veintidos milfmetros de medula humana se aspiraron asepticamente en una jeringa de 25 ml que contenfa tres milfmetros de soluci6n de salino heparinizado (1000 unidades por milfmetro). La soluci6n heparinizada de medula se envi6 en hielo durante la noche al laboratorio para el aislamiento y cultivo de las celulas estromales de medula 6sea. Tras la llegada del proveedor, las aspiraciones de veinticinco milfmetros se volvieron a suspender en Medio de Eagle modificado por Oulbecco (OMEM) complementado con 10% de suero fetal bovino (SFB), 0,1 mM de aminoacidos no esenciales, 100 U/ml penicilina, 100 mg/L estreptomicina (P/S) y 1 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblasto basico (bFGF) (Life Technologies, Roc�ville, MO) y se colocaron enplacas en 8-10 microlitros de aspirado/cm2 en frascos de cultivo de tejido. El medio fresco se anadi6 a los aspirados de medula dos veces a la semana durante nueve dfas de cultivo. Las BMSCs se seleccionaron en base a su habilidad para adherirse al plastico de cultivo del tejido; las celulas hematopoyeticas no adherentes se retiraron durante la sustituci6n del medio despues de 9-12 dfas de cultivo. El medio se cambi6 dos veces por semana a partir de entonces. Cuando las BMSC primarias se hicieron casi confluentes (12-14 dfas), se separaron usando 0,25% tripsina/1 mM EOTA y se volvieron a colocar en placas en 5x103 celulas/cm2. Las hBMSCs del primer paso (P1) se tripsinizaron y congelaron en 8% OMSO/10%SFB/OMEM para futuro uso.

Las hBMSCs P1 congeladas se descongelaron, se volvieron a colocar en platas en 5x103 celulas/cm2 (P2), se tripsinizaron cuando estuvieron cerca de la confluencia, y se usaron para sembrar la construcci6n de fibra. Las matrices de seda esterilizada (6xido de etileno) (especfficamente, cuerdas sencillas de Matrices 1 y 2, paquetes de 30 fibras paralelas de seda extrafda, y cuerdas helicoidales de fibras de colageno) se sembraron con celulas en camaras de cultivo customizadas (volumen total de 1 ml) y se trabajaron con maquina en bloques de Tefl6n para minimizar el volumen del medio celular y aumentar el contacto entre la construcci6n de fibra y la celula. Las matrices sembradas, despues de un periodo de incubaci6n de 4 horas con la suspensi6n celular (3,3x106 BMSC/ml) se transfectaron a una placa de Petri que contenfa una cantidad apropiada de medio de cultivo celular durante la duraci6n de los experimentos.

Para determinar la velocidad de degradaci6n de la fibrofna de seda, se midi6 la fuerza maxima de tracci6n (UTS) como una funci6n del periodo de cultivo en condiciones de crecimiento fisiol6gico, es decir, en el medio de cultivo celular. Se extrajeron grupos de 30 fibras paralelas de seda de 3 cm de longitud, se sembraron con hBMSCs, y cultivaron sobre la fibrofna durante 21 dfas a 37 °C y 5% CO2. Los grupos de control no sembrados se cultivaron en paralelo. La UTS de la fibrofna de seda se determin6 como una funci6n de duraci6n de cultivo para grupos sembrados y no sembrados.

Tambien se examin6 la respuesta de las celulas estromales de medula 6sea a la construcci6n de fibra de seda.

Las BMSCs se unieron y crecieron sobre las matrices de seda y colageno despues de 1 dfa en cultivo (Vease Fig. 7A-C y Fig. 16A) y formaron extensiones celulares para tender un puente sobre las fibras vecinas. Como se muestra en la Fig. 7O y Fig. 16B, se observ6 una lamina uniforme de celulas que cubrfa la construcci6n los dfas 14 y 21 del cultivo, respectivamente. El analisis MTT confirm6 la completa cobertura de la construcci6n de fibra por BMSCs sembradas despues de 14 dfas en cultivo (vease Fig. 8A-B). La cuantificaci6n de AON total de celulas cultivadas sobre la Matriz 1 (vease Fig. 9A) y Matriz 2 (vease Fig. 9B) confirm6 que las BMSCs proliferaron y crecieron sobre la construcci6n de seda con la cantidad mas alta de AON medida despues de 21 y 14 dfas, respectivamente, en cultivo.

Los grupos de 30 fibras de fibrofna de seda de control extrafda tanto de BMSC sembrada como no sembrada, mantuvieron su integridad mecanica como una funci6n del periodo de cultivo durante 21 dfas (vease Fig. 10).

El analisis RT-PCR de BMSCs sembradas sobre cuerdas de la Matriz 2 indic6 que tanto el colageno I como el II se regularon por incremento durante 14 dfas en cultivo (Fig. 14). El colageno de tipo II y la sialoprotefna 6sea (como indicadores de diferenciaci6n especffica de cartflago y hueso, respectivamente) no fueron detectables ni se expresaron mfnimamente durante el periodo de cultivo. El RT-PCR cuantitativo a tiempo real a los 14 dfas produjo una proporci6n de transcripci6n de colageno I con colageno III, normalizado a GAPOH, de 8,9:1 (vease Fig. 17). La alta proporci6n de colageno I con respecto a colageno III indica que la respuesta no es la curaci6n de heridas ni la formaci6n de tejido cicatrizal (como se observa con altos niveles de colageno de tipo III), sino mas bien el ligamento especffico; la proporci6n relativa de colageno I con colageno III en LCA nativo es -6,6:1 (Amiel y col., �nee Ligaments: Structure, Function, Injury, and Repair, 1990).

Ademas, se llevan a cabo estudios para permitir comprender la influencia de la estimulaci6n mecanica dirigida multidimensional sobre la formaci6n de ligamento a partir de celulas estromales de medula 6sea en el sistema del bioreactor. El bioreactor es capaz de aplicar tensiones cfclicas multidimensionales independientes pero concurrentes (pro ejemplo, translaci6n, rotaci6n) a los ligamentos en desarrollo. Oespues de un periodo de descanso estatico de 7 a 14 dfas (tiempo despues de la siembra), las velocidades de tensi6n rotacional y traslacional y la deformaci6n lineal y rotacional se mantienen constantes durante 1 a 4 semanas. La tensi6n traslacional (3,3%-10%, 1-3 mm) y la tensi6n rotacional (25%, 90°) se aplican simultaneamente a una frecuencia de 0,0167 Hz (un ciclo completo de tensi6n y relajaci6n por minuto) a las matrices basadas en seda sembradas con BMSCs; lo que de otra forma serfa un conjunto identico de bioreactores con matrices sembradas sin carga mecanica sirve como control. Los ligamentos se exponen a las tensiones cfclicas constantes durane la duraci6n de los dfas del experimento.

Oespues del periodo de cultivo, las muestras de ligamento, tanto las cuestionadas mecanicamente como los controles (estaticas) se caracterizan para: (1) la apariencia histomorfol6gica general (mediante inspecci6n visual); (2) la distribuci6n celular (procesamiento de imagen de secciones histol6gicas y tenidas con MTT); (3) la morfologfa y orientaci6n celular (analisis histol6gico); y (4) la producci6n de marcadores especfficos de tejido (RT-PCR, inmunotinci6n).

La estimulaci6n mecanica afecta considerablemente a la morfologfa y organizaci6n de las BMSCs y la construcci6n de fibra extracelular recien desarrollada, la distribuci6n de las celulas a lo largo de la construcci6n de fibra, y la regulaci6n por incremento de una cascada de diferenciaci6n especffica del ligamento; las BMSCs se alinean a lo largo del eje largo de la fibra, adquieren una morfologfa de esferoide similar a la de los fibroblastos de ligamento/tend6n y regulan por incremento los marcadores especfficos de ligamento/tend6n. Se espera que la construcci6n de fibra extracelular recien formada (es decir, la composici6n de protefnas producidas por las celulas) se alinee a lo largo de las lfneas de carga asf como del eje largo de la construcci6n de fibra. Se espera que la estimulaci6n mecanica dirigida mejore el desarrollo y la formaci6n del ligamento in vitro en un bioreactor siendo el resultado de las BMSCs sembradas sobre la construcci6n nueva de fibra basada en seda. La orientaci6n longitudinal de las celulas y la construcci6n de fibra recien formada es similar a los fibroblastos de ligamento encontrados dentro de un LCA in vivo (Woods et al., Amer. J. Sports Med. 19: 48-55, 1991). Ademas, la estimulaci6n mecanica mantiene la correcta proporci6n de expresi6n entre las transcripciones de colageno tipo I y las transcripciones de colageno tipo III (por ejemplo, mayor que 7:1) lo que indica la presencia de un tejido de ligamento recien formado frente a la formaci6n de tejido cicatrizal. Los resultados anteriores indicaran que el aparato mecanico y el sistema del bioreactor proporcionan un entorno adecuado (por ejemplo, tensiones multidimensionales) para la formaci6n in vitro de ligamentos producidos por ingenierfa de tejidos que se inician a partir de celulas estromales de medula 6sea y la construcci6n nueva de fibra basada en seda.

Las condiciones de cultivo usadas en estos experimentos preliminares pueden ademas extenderse para reflejar de manera mas precisa el entorno fisiol6gico de un ligamento (por ejemplo, aumentando los diferentes tipos de fuerzas mecanicas) para la creaci6n in vitro de equivalentes funcionales de LCA nativo para un potencial uso clfnico. Estos metodos no estan limitados a la generaci6n de un LCA producido por bioingenierfa. Aplicando la magnitud y variedad apropiada de fuerzas experimentadas in vivo, cualquier tipo de ligamento en el cuerpo asf como otros tipos de tejidos pueden producirse ex vivo mediante los metodos de esta divulgaci6n.

Tabla 1. Fuerza maxima de tracci6n y rigidez (N/mm dada una muestra de 3 cm de largo) como una funci6n de extracci6n de sericina de un hilo de seda de gusano de seda de 10 fibras con 0 giros por pulgada (es decir, paralelo) y (i) temperatura y (ii) tiempo. Las muestras de repetici6n se procesaron dos anos despues de las muestras iniciales sin cambio significativo en las propiedades. N=5 para todas las muestras.

Hilo % de fibras

Temp Tiempo UTS (N) devest Rig (N/mm) devest UTS/fibra (N) Rigidez/ fibra (N/mm)

10(0) 10 10(0) 10

TA 60 min TA 60 min (repetici6n) 10,74 0,83 10,83 0,28 6,77 0,65 6,36 0,14 1,07 0,68 1,08 0,64

10(0) 10

33C 60 min 10,44 0,17 6,68 0,55 1,04 0,67

10(0) 10

37C 60 min 9,60 0,84 6,09 0,59 0,96 0,61

10(0) 10

37C 60 min 9,54 0,74 5,81 0,67 0,95 0,58

(repetici6n)

10(0) 10

90C 15 min 9,22 0,55 4,87 0,62 0,92 0,49

10(0) 10

90C 30 min 8,29 0,19 4,91 0,33 0,83 0,49

10(0) 10

90C 60 min 8,60 0,61 4,04 0,87 0,86 0,40

10(0) 10

90C 60 min 8,65 0,67 4,55 0,69 0,87 0,46

(repetici6n)

10(0) 10

94C 60 min 7,92 0,51 2,42 0,33 0,79 0,24

9(12s) x 3(9z) 27

noextrafda 24,50 0,38 8,00 0,49 0,91 0,30

9(12s) x 3(9z) 27

90C 60 min 21,88 0,18 7,38 0,34 0,81 0,27

9(6s) x 3(3z) 27

noextrafda 24,94 0,57 9,51 0,57 0,92 0,35

9(6s) x 3(3z) 27

90C 60 min 21,36 0,40 7,95 1,00 0,79 0,29

9(12s) x 3(6z) 27

noextrafda 24,69 0,65 9,08 0,56 0,91 0,34

9(12s) x 3(6z) 27

90C 60 min 21,80 0,47 7,48 0,97 0,81 0,28

Tabla 2. Perdida de masa como una funci6n de extracci6n de sericina. +/-0,43% de desviaci6n estandar de un N=5, refleja la mayor precisi6n que puede conseguirse cuando se confirma la retirada de sericina, es decir, 0,87 o 1% de error siempre estara inherente a estos metodos usados y una perdida de masa de aproximadamente 24% representa construcciones sustancialmente libres de sericina

hilo no extrafdo y secado (mg) extrafdo y secado (mg) % de perdida de masa

9(12) x 3(6) 57,6 43,6 24,31 9(12) x 3(6) 58,3 43,9 24,70 9(12) x 3(6) 57,0 42,9 24,74 9(12) x 3(6) 57,2 42,7 25,35

promedio 57,53 43,28 24,77

devest 0,57 0,57 0,43

Tabla 3. Ilustra el cambio en masa como una funci6n de una segunda extracci6n de sericina. En correlaci6n con las Figs. 1E-1G, menos de un 3% de perdida de masa es probablemente indicativo de la perdida de masa de fibrofna debido al dano mecanico durante la 2� extracci6n.

hilo masa despues de 1x masa despues de 2x % de perdida de masa extracci6n, secada (mg) extracci6n, secada (mg)

9(12) x 3(6)

42,5 41,7 1,88

9(12) x 3(6)

43,1 42 2,55

9(12) x 3(6)

43,1 42,1 2,32

9(12) x 3(6)

42,5 41,7 1,88

9(12) x 3(6)

42,6 42,4 0,47

9(12) x 3(6)

43,7 42,4 2,97

9(12) x 3(6)

43,4 42,9 1,15

9(12) x 3(6)

43,7 43,1 1,37

9(12) x 3(6)

44 43,2 1,82

promedio devest

43,18 0,56 42,39 0,57 1,82 0,76

�eometr�a

��todo�ebra Condici6n denivelesde�ebras Total defibras PromedioUTS (N) DevestUTS (N) Promediode % clargg Devestdeclargg Promediode rigidez(N/mm) Devest derigidez(N/mm) UTSporfibra Rigidezpor fibra

1(0) x 3(10)

cable extrafda 2 3 1,98 0,05 10,42 1,63 2,17 0,51 0,66 0,72

1(0) x 4(10)

cable extrafda 2 4 2,86 0,14 11,98 1,54 2,08 0,31 0,72 0,52

3(0) x 3(3)

cable extrafda 2 9 6,72 0,17 12,30 0,72 4,54 0,16 0,75 0,50

1(0) x 3(10) x 3(9)

cable extrafda 3 9 6,86 0,23 13,11 1,45 4,06 0,36 0,76 0,45

2(0) x 6(11)

cable 2 12 7,97 0,26 10,05 0,91 0,66

4(6) x 3(3)

giro no extrafda 2 12 10,17 0,18 19,86 1,16 0,85

1(0) x 3(10) x 4(9)

cable extrafda 3 12 9,29 0,19 14,07 0,98 5,10 0,31 0,77 0,43

1(0) x 4(11) x 3(11)

giro extrafda 3 12 9,70 0,14 12,56 1,03 7,60 0,33 0,81 0,63

1(0) x 4(10) x 3(9)

cable extrafda 3 12 8,78 0,17 14,25 1,09 5,10 0,32 0,73 0,43

15 (texturizado)

texturizado no extrafda,seca 1 15 10,62 0,68 10,76 1,70 4,75 0,30 0,71 0,316

30(0)

paralelo extrafda, mojada 1 30 20,24 1,46 26,32 3,51 1,14 0,15 0,67 0,038

30(0)

paralelo incubada 21 dfas, mojada 1 30 19,73 2,10 20,70 6,03 0,66

30(0)

paralelo sembrada encelula 21 dfas,mojada 1 30 20,53 1,02 29,68 7,08 0,68

30 31

eometr�a

��todo�ebra Condici6n denivelesde�ebras Totaldefibras PromedioUTS (N) DevestUTS (N) Promediode % clargg Devestdeclargg Promediode rigidez(N/mm) Devest derigidez(N/mm) UTSporfibra Rigidezpor fibra

2 fibras/portador en un 8

trenza extrafda, seca 2 16 10,93 0,13 6,96 1,14 0,68 0,435

4 fibras/portador en un 8

trenza extrafda, seca 2 32 24,60 0,22 12,39 0,53 0,77 0,387

4(6) x 3(3) en portador 4

trenza extrafda, seca 3 48 37,67 0,18 22,38 0,98 0,78

15(0) x 3(12)

cable seca 2 45 27,39 0,62 31,68 1,35 4,63 0,49 0,61 0,102889

15(0) x 3(12) x 3(10)

cable no extrafda, 1 dfa tras lafabricaci6n 3 135 73,61 6,00 33,72 5,67 12,33 1,53 0,55 0,091333

15(0) x 3(12) x 3(10)

cable no extrafda, 2 dfas tras la fabricaci6n 3 135 72,30 5,68 31,18 4,35 0,54

15(0) x 3(12) x 3(10)

cable no extrafda, 3 dfas tras la fabricaci6n 3 135 70,74 2,97 29,50 4,47 0,52

15(0) x 3(12) x 3(10)

cable no extrafda, 4 dfas tras la fabricaci6n 3 135 75,90 1,57 34,57 4,12 0,58

15(0) x 3(12) x 3(10)

cable no extrafda, 5 dfas tras la fabricaci6n 3 135 71,91 5,71 38,72 3,75 0,53

15(0) x 3(12) x 3(10)

cable no extrafda, 6 dfas tras la fabricaci6n 3 135 74,57 1,45 37,67 4,27 0,55

eometr�a

��todo�ebra Condici6n denivelesde�ebras Totaldefibras PromedioUTS (N) DevestUTS (N) Promediode % clargg Devestdeclargg Promediode rigidez(N/mm) Devest derigidez(N/mm) UTSporfibra Rigidezpor fibra

13(0) x 3(11) x 3(10) x 3(0)

cable no extrafda,seca 4 351 189,01 14,00 45,87 3,72 0,54

13(0) x 3(11) x 3(10) x 3(0)

cable no extrafda,ciclos 30x a pretensi6n, seca 4 351 170,12 7,37 39,95 1,37 0,48

Tabla 5. Comparaci6n de UTS y rigidez entre condiciones de pruebas mecanicas mojadas (2 hr de incubaci6n en PBS a 37 °C) y secas. N=5. Los resultados muestran aproximadamente un descenso del 17% en UTS como una funci6n de prueba en mojado.

Hilo

# de fibras Condiciones de la Prueba de Hilo UTS (N) Oevest UTS Rigidez (N/mm) Oevest de Rigidez UTS/fibra (N) Rigidez/fibra (N/mm)

9(12s) x 3(9z)

27 extrafdoseco 21,88 0,18 7,38 0,34 0,81 0,27

9(12s) x 3(9z)

27 extrafdomojado 18,52 0,25 2,56 0,31 0,69 0,09

9(6s) x 3(3z)

27 extrafdoseco 21,36 0,40 7,95 1,00 0,79 0,29

9(6s) x 3(3z)

27 extrafdomojado 17,94 0,30 2,40 0,28 0,66 0,09

9(12s) x 3(6z)

27 extrafdoseco 21,80 0,47 7,48 0,97 0,81 0,28

9(12s) x 3(6z)

27 extrafdomojado 18,74 0,22 2,57 0,11 0,69 0,10

12(0) x 3(10s)

36 extrafdoseco 30,73 0,46 16,24 0,66 0,85 0,45

12(0) x 3(10s)

36 extrafdomojado 25,93 0,29 6,68 0,70 0,72 0,19

4(0) x 3(10s) x

36 extrafdo 30,07 0,35 15,49 1,06 0,84 0,43

3(9z)

seco

4(0) x 3(10s) x

36 extrafdo 22,55 0,66 7,63 1,00 0,63 0,21

3(9z)

mojado

Tabla 6. Efecto de TPI sobre UTS y Rigidez. N=5

Hilo

TPI UTS (N) devest Rigidez (N/mm) devest UTS/fibra (N) Rigidez/fibra (N/mm)

12(0) x 3(2)

2 23,27 0,28 6,86 0,60 0,65 0,19

12(0) x 3(4)

4 24,69 0,31 7,61 1,17 0,69 0,21

12(0) x 3(6)

6 25,44 0,42 6,51 1,35 0,71 0,18

12(0) x 3(8)

8 25,21 0,23 5,80 0,67 0,70 0,16

12(0) x 3(10)

10 25,94 0,24 6,45 0,77 0,72 0,18

12(0) x 3(12)

12 25,87 0,19 6,01 0,69 0,72 0,17

12(0) x 3(14)

14 22,21 0,58 5,63 0,71 0,62 0,16

Tabla 7. Oatos adicionales de tpi para verificar que pueden usarse hasta 30tpi sin causar dano al hilo que darfa como resultado una disminuci6n espectacular en UTS y rigidez; nota, todas las matrices (N=5 por grupo) estaban 10 enrolladas.

Hilo

# de fibras UTS (N) Oevest (N) Rigidez (N/mm) Oevest (N/mm) UTS/fibra (N) Rigidez/fibra (N/mm) Condiciones

1(30) x 6(20) x 3(4,5) 1(30) x 6(20) x 3(10) 1(30) x 6(6) 15(20)

18 18 6 15 10,92 11,48 3,83 13,19 0,44 0,37 0,24 0,27 1,21 1,25 0,37 6,03 0,02 0,06 0,04 0,67 0,61 0,64 0,64 0,88 0,07 0,07 0,06 0,40 no extrafda, mojada no extrafda, mojada no extrafda, mojada extrafda,seca

Tabla 8. Efecto de la jerarqufa del hilo en las propiedades mecanicas, es decir, el numero de niveles y el numero de fibras por nivel pueden tener una influencia significativa sobre el hilo y los resultados de la tela.

Geometrfa

Condici6n # de niveles de uni6n con hebras # total de Fibras UTS (N) Oevest UTS (N) Promedio % Alarg. Oevest % Alarg. Promedio rigidez (N/mm) Oevest Rigidez (N/mm) UTS por fibra

1(0) x 3(10)

extrafdo 2 3 1,98 0,05 10,42 1,63 2,17 0,51 0,66

1(0) x 3(10) x 3(9)

extrafdo 3 9 6,86 0,23 13,11 1,45 4,06 0,36 0,76

1(0) x 3(10) x 4(9)

extrafdo 3 12 9,29 0,19 14,07 0,98 5,10 0,31 0,77

1(0) x 4(10)

extrafdo 2 4 2,86 0,14 11,98 1,54 2,08 0,31 0,72

1(0) x 4(10) x 3(9)

extrafdo 3 12 8,78 0,17 14,25 1,09 5,10 0,32 0,73

15(0) x 3(12)

seco no extrafdo 2 45 27,39 0,62 31,68 1,35 4,63 0,49 0,61

15(0) x 3(12) x 3(10)

seco no extrafdo 3 135 73,61 6,00 33,72 5,67 12,33 1,53 0,55

Tabla 9. Efectos de la modificaci6n de superficie (esterilizaci6n de gas RGO y ETO) sobre las propiedades mecanicas de la matriz de seda extrafda; se us6 PBS como un control negativo durante los tratamientos de modificaci6n.

Hilo # de fibras

Modificaci6n de Superficie/Esterilizaci6n UTS (N) devest Rigidez (N/mm) devest UTS/fibra (N) Rigidez/fibra (N/mm)

12(0) x 36

No tratada 25,94 0,24 6,45 0,77 0,72 0,18

3(10s)

12(0) x 36

RGO 23,82 2,10 3,79 2,06 0,66 0,11

3(10s)

12(0) x 108

No tratada 48,89 4,84 9,22 0,84 0,45 0,09

3(10s)

x3(9z)

12(0) x 108

RGO 55,28 3,28 8,17 0,81 0,51 0,08

3(10s)

x3(9z)

4(11s) x 36

ETO 18,72 0,45 5,52 0,42 0,52 0,15

3(11z) x

3(10s)

4(11s) x 36

RGO + ETO 19,30 0,62 4,67 0,3 0,54 0,13

3(11z) x

3(10s)

Tabla 10

UTS (N)

Rigidez (N/mm) Lfmite de Elasticidad Alargamiento (%)

(N)

Matriz 1 de seda

2337+/-72 354+/-26 1262+/-36 38,6+/-2,4

Matriz 2 de seda

3407+/-63 580+/-40 1647+/-214 29+/-4

LCA humano

2160+/-157 242+/-28 -1200 -26-32%

Propiedades mecanicas para dos cuerdas diferentes en base a una longitud de cuerda de 3 cm en comparaci6n con las propiedades de LCA humano

Tabla 11:

Nivel de Giro (#

Matriz 1 Matriz 2 Matriz 3 Matriz 4 Matriz 5 Matriz 6 Matriz 7

giros/cm)

# fibras por grupo

30 15 1300 180 20 10 15

(0)

(0)

(0)

(0)

(0)

(0)

(0)

# grupos por paquete

6 3 3 3 6 6 3

(3)

(3)

(2) (3,5)

(3)

(3)

(3)

# paquetes por hebra

3 6 1 3 3 3 3

(3)

(2,5) (0) (2) (2) (2,5) (2,5)

# hebras por cuerda

6 3 - 2 3 3 3

(0)

(2,0) (0) (1) (2) (2)

# cuerdas por LCA

- 6 - - 3 6 12

(0)

(0)

(0)

(0)

UTS (N)

2337 3407 2780 2300 2500 2300 3400

Rigidez (N/mm)

354 580 300 350 550 500 550

Ejemplos de varias jerarqufas geometricas que darfan como resultado propiedades mecanicas adecuadas para sustituci6n de LCA. Nota: la Matriz 1 y 2 se han desarrollado como se muestra en los ejemplos; la Matriz 3 producirfa una protesis de un unico paquete, la Matriz 4 producirfa una pr6tesis de 2 hebras, la Matriz 5 poducirfa una pr6tesis de 3 cuerdas, la Matriz 6 es otra variaci6n de una pr6tesis de 6 cuerdas, y la Matriz 7 producira una pr6tesis de 12 cuerdas.

Claims (46)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un implante de tela biocompatible, comprendiendo el implante de tela: un hilo, comprendiendo dicho hilo una o mas fibras de fibrofna de seda a las que se les ha extrafdo la sericina que sustancialmente mantienen su estructura proteica nativa y no se han disuelto ni reconstituido, siendo dichas fibras de fibrofna de seda a las que se les ha extrafdo la sericina biocompatibles y estando organizadas de manera no arbitraria, en el que dicho hilo estimula el crecimiento de celulas alrededor de dichas fibras de fibrofna de seda a las que se les ha extrafdo la sericina y en el que dichas fibras de fibrofna de seda a las que se les ha extrafdo la sericina son biodegradables.

2. 2.

   El implante de tela como el citado en la reivindicaci6n 1, en el que las fibras de fibrofna a las que se les ha extrafdo la sericina comprenden fibras de fibrofna obtenidas a partir del gusano de seda Bombyx mori.

3. 3.

   El implante de tela de la reivindicaci6n 1, en el que el implante de tela es no inmunogenico.

4. 4.

   El implante de tela de la reivindicaci6n 1, en el que las fibras de fibrofna a las que se les ha extrafdo la sericina incluyen menos del 20% de sericina por peso.

5. 5.

   El implante de tela de la reivindicaci6n 1, en el que las fibras de fibrofna a las que se les ha extrafdo la sericina incluyen menos del 10% de sericina por peso.

6. 6.

   El implante de tela de la reivindicaci6n 1, en el que las fibras de fibrofna a las que se les extrafdo la sericina incluyen menos del 1% de sericina por peso.

7. 7.

   El implante de tela de la reivindicaci6n 1, en el que el hilo tiene una fuerza maxima de tracci6n de al menos 0,52 N por fibra.

8. 8.

   El implante de tela de la reivindicaci6n 7, en el que el hilo tiene una rigidez de entre aproximadamente 0,27 y aproximadamente 0,5 N/mm por fibra.

9. 9.

   El implante de tela de la reivindicaci6n 8, en el que el hilo mantiene el 80% de su UTS cuando se testa mojado.

10. 10.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 8, en el que el hilo tiene un alargamiento de rotura de entre aproximadamente 10% y aproximadamente 50%.

11. 11.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 10, en el que el hilo tiene una vida de fatiga de al menos 1 mill6n de ciclos en una carga de aproximadamente 20% de la fuerza maxima de tracci6n del hilo.

12. 12.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 1, en el que el hilo comprende fibras paralelas o entrelazadas de fibrofna a las que se les ha extrafdo la sericina.

13. 13.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 12, en el que el hilo comprende al menos tres fibras alineadas de fibrofna a las que se les ha extrafdo la sericina.

14. 14.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 13, en el que las fibras alineadas de fibrofna a las que se le ha extrafdo la sericina estan entrelazadas.

15. 15.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 14, en el que el hilo es una trenza, hilo texturizado, hilo enrollado, hilo cableado, y combinaciones de los mismos.

16. 16.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 15, en el que las fibras alineadas de fibrofna a las que se les ha extrafdo la sericina estan enrolladas o formando un cable una alrededor de la otra en 0 a 11,8 giros por cm.

17. 17.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 1, que ademas comprende un hilo que tiene una organizaci6n jerarquica de un unico nivel, comprendiendo dicha organizaci6n jerarquica de un unico nivel un grupo de hilos paralelos o entrelazados.

18. 18.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 1, que ademas comprende una organizaci6n jerarquica de dos niveles, comprendiendo dicha organizaci6n jerarquica de dos niveles un paquete de grupos entrelazados.

19. 19.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 1, que ademas comprende una organizaci6n jerarquica de tres niveles, comprendiendo dicha organizaci6n jerarquica de tres niveles una hebra de paquetes entrelazados.

20. 20.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 1, que ademas comprende una organizaci6n jerarquica de cuatro niveles, comprendiendo dicha organizaci6n jerarquica de cuatro niveles una cuerda de hebras entrelazadas.

21. 21.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 1, en el que el hilo esta enrollado en o por debajo de 11,8 giros por cm (30 giros por pulgada).

22. 22.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 1, en el que una pluralidad de hilos estan entrelazados para formar una tela.

23. 23.

    El implante de tela como el citado en la reivindicaci6n 1, en el que el implante de tela comprende un compuesto de fibras de fibrofna a las que se les ha extrafdo la sericina y uno o mas polfmeros degradables seleccionados del grupo consistente en Colagenos, acido Polilactico y sus copolfmeros, acido poliglic6lico o sus copolfmeros, Polianhfdridos, Elastina, Glicosaminoglicanos, y Polisacaridos.

24. 24.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 19, en el que una pluralidad de hilos estan organizados de manera no arbitraria en una tela seleccionada del grupo consistente en tela tejida, telas tricotadas, telas tricotadas con urdimbre, telas reconstitufdas, telas con telar de Jacquard, telas laminadas, malla y combinaciones de las mismas.

25. 25.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 19, en el que una pluralidad de hilos estan organizados de manera arbitraria en una tela no tejida.

26. 26.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 1, que ademas comprende un farmaco asociado al implante de tela.

27. 27.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 1, que ademas comprende un factor de acoplamiento celular asociado al implante de tela.

28. 28.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 27, en el que el factor de acoplamiento celular es RGO.

29. 29.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 1, en el que el implante de tela se trata con plasma de gas.

30. 30.

    El implante de tela de la reivindicaci6n 1, que ademas comprende celulas biol6gicas sembradas sobre el implante de tela.

31. 31.

    Un metodo para formar un implante de tela que comprende:

    a) alinear las fibras de fibrofna de seda en paralelo o entrecruzadas con otras fibras de fibrofna de seda para formar un hilo,

    b) retirar sustancialmente la sericina de las fibras de fibrofna de seda sin alterar sustancialmente la estructura nativa de la fibrofna en las fibras,

    c) y organizar una pluralidad de hilos para formar un implante de tela biocompatible para su implantaci6n, siendo las fibras de fibrofna de seda biocompatibles y no habiendo sido disueltas ni reconstituidas, y en el que la pluralidad de hilos son biodegrables y estimulan el crecimiento interno de celulas alrededor de las fibras de fibrofna de seda.

32. 32.

    El metodo de la reivindicaci6n 31, que ademas comprende entrelazar las fibras paralelas de seda antes de extraer la sericina.

33. 33.

    El metodo de la reivindicaci6n 31, que ademas comprende entrelazar las fibras paralelas de seda despues de extraer la sericina.

34. 34.

    El metodo de la reivindicaci6n 31, que ademas comprende alinear multiples fibras de fibrofna en hilos, en el que cada hilo comprende al menos tres fibras paralelas o entrelazadas.

35. 35.

    El metodo de la reivindicaci6n 34, en el que las fibras de fibrofna de cada hilo estan enrolladas una alrededor de otra en 0 a 11,8 giros por cm.

36. 36.

    El metodo de la reivindicaci6n 31, en el que multiples hilos estan enrollados uno alrededor del otro en 0 a 11,8 giros por cm.

37. 37.

    El metodo de la reivindicaci6n 31, en el que la sericina se extrae de no mas de aproximadamente 50 fibras de fibrofna paralelas o entrelazadas.

38. 38.

    El metodo de la reivindicaci6n 31, en el que el hilo esta enrollado en o por debajo de 11,8 giros por cm (30 giros por pulgada).

39. 39.

    El metodo de la reivindicaci6n 31, que ademas comprende formar una tela tricotada o tejida a partir de una pluralidad de hilos organizados de manera no arbitraria.

40. 40.

    El metodo de la reivindicaci6n 31, que ademas comprende formar una tela no tejida a partir de una pluralidad de hilos organizados de manera arbitraria.

41. 41.

    El metodo de las reivindicaciones 39 y 40, en el que la tela esta formada despues de extraer la sericina de las fibras en los hilos.

42. 42.

    El metodo de las reivindicaciones 39 y 40, en el que la tela esta formada antes de extraer la sericina de las fibras en los hilos.

43. 43.

    El metodo de las reivindicaciones 39 a 40, en el que el hilo esta expuesto a una fuerza que no es superior a su lfmite de elasticidad.

    5 44. El metodo de la reivindicaci6n 31, que ademas comprende asociar un farmaco a la tela.

44. 45.

    El metodo de la reivindicaci6n 31, que ademas comprende asociar un factor de acoplamiento celular al implante de tela.

45. 46.

    El metodo de la reivindicaci6n 45, que ademas comprende asociar RGO al implante de tela.

46. 47. El metodo de la reivindicaci6n 31, que ademas comprende tratar el implante de tela con plasma de gas. 10 48. El metodo de la reivindicaci6n 31, que ademas comprende: esterilizar el implante de tela.