ES2368208T3

ES2368208T3 - Procedimiento de producción de proteínas por electropulsación.

Info

Publication number: ES2368208T3
Application number: ES01982525T
Authority: ES
Inventors: Justin Teissie; Valentina Ganeva; Bojidar Galutzov
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2000-10-19
Filing date: 2001-10-19
Publication date: 2011-11-15
Anticipated expiration: 2021-10-19
Also published as: EP1334185A2; JP4027796B2; AU2002214085A1; JP2004511257A; FR2815640A1; CA2426698C; US20040097715A1; FR2815640B1; WO2002033065A3; CA2426698A1; WO2002033065A2; ATE522604T1; EP1334185B1

Abstract

Procedimiento de producción de proteínas en el cual un flujo de medio líquido que comprende al menos una levadura o una bacteria, en suspensión a una concentración comprendida entre 10 6 y 5 x 10 9 células/ml en el medio líquido, se somete a electropulsación, realizándose la electropulsación con intensidades de campo de al menos 1 kV/cm, la duración de los impulsos es superior a unos 0,01 ms y siendo la duración del tratamiento de electropulsación de 0,01 a 100 s, la etapa de electropulsación va seguida de una etapa de incubación, y se recuperan las proteínas liberadas.

Description

Procedimiento de producción de proteínas por electropulsación.

La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de proteínas de interés.

Los microorganismos que son bacterias, hongos, células vegetales, células de insectos y células de animales, y en particular las levaduras, pueden producir proteínas. Sin embargo, es difícil recuperar algunos productos de estos microorganismos y, en particular, recuperar las macromoléculas tales como las proteínas.

Para extraer proteínas de interés de levadura, que son proteínas que se producen de forma natural, se sabe que se pueden utilizar, por una parte, métodos mecánicos y, por otra parte, métodos químicos.

Cuando se utilizan los métodos mecánicos habituales que constituyen moler y lisar a presión, es imposible no destruir las vacuolas de las levaduras, y la liberación de las proteasas contenidas en las vacuolas plantea problemas de pureza y, por lo tanto, de purificación del producto acabado.

Adicionalmente, los métodos químicos conducen igualmente a la destrucción de las vacuolas y utilizan detergentes o agentes de proteólisis que se añaden a los productos químicos utilizados, como contaminantes del medio. Por lo tanto, esto también desemboca en problemas de purificación posteriores.

Además, algunos agentes químicos inactivan las enzimas.

La presente invención se refiere a una estrategia nueva en la que se aplica un tratamiento de electropulsación sobre una suspensión de células en flujo, seguido de una incubación en un medio adaptado. Las células pueden ser levaduras, pero también bacterias, a las que se les puede aplicar la electropulsación en una suspensión de agua pura, por ejemplo, seguida de una incubación relativamente larga en medio salino, y esto sin que tenga lugar ningún tratamiento previo del cultivo bacteriano con el objetivo de modificarlo mecánica, química o biológicamente. Asimismo, el tratamiento se puede adaptar a las células de mamíferos, lo que se describe a título de información en la presente solicitud y no forma parte de la presente invención.

La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de proteínas en el que un flujo de medio líquido que comprende al menos una levadura o una bacteria en suspensión a una concentración comprendida entre 106 y 5 x 109 células/ml en el medio líquido, se somete a electropulsación, realizándose la electropulsación con intensidades de campo de al menos 1 kV/cm, siendo la duración de los impulsos superior a unos 0,01 ms, durando el tratamiento de electropulsación de 0,01 a 100 s, y la etapa de electropulsación va seguida de una etapa de incubación, y se recuperan las proteínas liberadas.

Tal y como aparecerá más adelante, por «electropulsación» se entiende un procedimiento en el que las células se someten a una serie de impulsos eléctricos.

Así, la presente invención resuelve los problemas mencionados más arriba. Efectivamente, según la invención, el tratamiento eléctrico no provoca la desintegración de las células y, por lo tanto, no se obtienen fragmentos celulares en el medio después del tratamiento. No se libera todo el contenido de la célula: la pared celular retiene los orgánulos así como la mayor parte de las proteínas grandes citoplasmáticas. Las vacuolas no se ven afectadas y no se liberan las proteasas. La purificación de las proteínas de interés se simplifica y el procedimiento de la invención permite una mayor selectividad de los productos liberados.

Se han llevado a cabo trabajos dedicados a la electropulsación en lecho fijo, pero las condiciones descritas en V. Ganeva, B. Galutzov FEMS Microbiology Letters 174 (1999) 279-284 no permiten realizar el presente procedimiento con los resultados esperados.

En efecto, el procedimiento en lecho fijo no permite la permeabilización irreversible de todas las células tratadas. Así, la solicitante ha constatado que algunas condiciones de las empleadas en el procedimiento en lecho fijo podían presentar algunos inconvenientes cuando se aplican en flujo.

Se trata especialmente de condiciones relativas a la conductividad del medio de electropulsación. Finalmente, los tratamientos de electropulsación aplicados provocan efectos diferentes sobre las levaduras, según tengan lugar, por una parte, en lecho fijo y, por otra parte, en flujo, y en especial sus efectos sobre el nivel de permeabilización de las células.

Además, la inactivación de las enzimas se puede evitar en el procedimiento en flujo, lo que permite evitar el calentamiento excesivo de la suspensión celular. Esto presenta un gran interés, en particular desde el punto de vista de la productividad, al no necesitar una etapa posterior de enfriamiento ni la utilización de los dispositivos necesarios en dicha etapa.

Así, según la invención, el tratamiento de una suspensión de las células a una concentración elevada permite obtener una liberación óptima sin provocar el calentamiento del medio.

Finalmente, es posible aplicar el procedimiento según la invención sobre volúmenes importantes y obtener grandes cantidades de la proteína de interés con un grado de pureza imposible de obtener hasta ahora mediante otros métodos y, en particular, sin añadir inhibidores de proteasas, con la utilización de medios con una composición simple.

En el procedimiento de la invención, la aplicación de un campo eléctrico externo de densidad elevada sobre las células, y en especial sobre las células en suspensión, provoca la aparición de un potencial que se añade al potencial transmembranario. En cuanto se sobrepasa un determinado umbral crítico, la membrana celular se vuelve permeable. Cuando las células están en movimiento (en flujo), su posición cambia con respecto a los electrodos. Los impulsos tendrán por destino diferentes regiones de la superficie. Se acaba obteniendo una superficie permeabilizada más grande y un nivel local de cambio estructural diferente del que se obtiene con las células estáticas (por lotes). Con determinados parámetros del campo eléctrico aplicado, como la intensidad, la duración o el número de impulsos, los cambios de la membrana provocados por los pulsos se pueden volver irreversibles, a lo que sigue una liberación del contenido intracelular.

Para las levaduras, que tienen pared, este flujo está controlado por la porosidad de la pared, y la permeabilidad de las diferentes moléculas depende de su tamaño.

Los inventores han observado que las membranas de las bacterias se permeabilizan con unos valores del campo eléctrico similares a los valores empleados para las levaduras.

La permeabilización es un procedimiento muy rápido que se desarrolla durante algunos milisegundos después de la aplicación de los impulsos eléctricos, y permanece durante un intervalo de tiempo que va de algunos minutos a unas horas después del tratamiento eléctrico.

Se ha podido constatar que el tratamiento impuesto a las levaduras puede provocar la liberación de la enzima invertasa, situada en el espacio periplasmático. Parece ser que la pared celular ve aumentada su porosidad por la influencia del campo sobre la membrana plasmática.

El procedimiento según la invención permite la salida y también la liberación, y la recuperación posterior de las proteínas secretadas por la célula, que se acumulan en el espacio periplasmático.

Según otros aspectos, la invención se refiere igualmente a las proteínas obtenidas por el procedimiento descrito aquí y las composiciones que las comprenden.

Desde el punto de vista de las células que se pueden tratar por el procedimiento de la invención, se pueden tratar todas las especies capaces de sintetizar proteínas heterólogas u homólogas, sin que sean limitantes lo los ejemplos que aparecerán más adelante.

Para las levaduras, se pueden citar en particular las Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Candida y Hansenula.

Desde el punto de vista de las bacterias, se pueden citar entre otras las bacterias gramnegativas, y en particular E. coli.

Desde el punto de vista de las células de mamíferos, se pueden citar entre otros los fibroblastos, y en particular las células de los hámsteres chinos.

Según la invención, las células se ponen en cultivo, luego se lavan para eliminar los iones del medio, después se someten al tratamiento eléctrico y se ponen a incubar en medio de incubación. A continuación, estas células se separan del sobrenadante. La purificación de las proteínas se realiza según los medios habituales.

Según la presente invención, a la etapa de electropulsación le precede una etapa de cultivo. Se puede mantener el crecimiento hasta la fase exponencial o hasta la fase estacionaria. Preferentemente, la fase del cultivo es la exponencial, pero se han obtenido resultados positivos también en la fase estacionaria. Por lo tanto, se puede elegir el medio de cultivo para permitir una expresión máxima de la proteína buscada, ya sea homóloga o heteróloga. La solicitante ha puesto de manifiesto que la eficacia de la electroextracción no se ve influida por la composición del medio de cultivo.

La transferencia de las células del medio de cultivo al medio de pulsación se realiza después de centrifugar las suspensiones.

Preferentemente, las células están en suspensión en el medio líquido sometido a electropulsación. La concentración de las levaduras o de las bacterias en suspensión en el medio líquido de electropulsación está comprendida entre unas 106 y 5 x 109 células/ml, preferentemente entre unas 5 x 108 y unas 2 x 109 células/ml. La concentración de las células de mamíferos es preferentemente unas 50 veces más débil.

Desde el punto de vista de las condiciones del tratamiento de electropulsación, esto se puede realizar con intensidades de campo de al menos 1 kV/cm, en particular entre 1 y 10 kV/cm, preferentemente comprendida entre 1 y 5 kV/cm y en particular entre 2 y 4 kV/cm.

La duración de los impulsos se elige para que sea superior a 0,01 ms, en particular superior a 1 ms. Puede alcanzar hasta 100 ms. Preferentemente, se escoge entre unos 0,5 y 15 ms, en particular entre 1 y 15 ms.

Cuando se aplican campos eléctricos de alta densidad, se aplica en general un solo impulso. También se puede aplicar una serie de impulsos consecutivos, teniendo dicha serie una duración que va de algunos microsegundos a algunos milisegundos. Así, el tratamiento aplicado a cada célula dura de unos 0,01 a 100 s, preferentemente de 0,15 a 15 s.

El número de impulsos recibidos por cada célula de levadura, de bacteria o de mamífero es del orden de 1 a 100, preferentemente entre 5 y 20, de forma preferente entre 12 y 20, por ejemplo, del orden de 10.

Por ejemplo, en el caso de 2 Hz, la duración del impulso sería de 3 ms y la intensidad del campo de 3 kV/cm, en el caso de 6 Hz, la duración es de 2 ms y la intensidad de 3,2 kV/cm, o de 1 ms por 4,3 kV/cm.

Tal y como aparecerá en los ejemplos, también se pueden aplicar los impulsos en serie y, por ejemplo, en una serie de quince impulsos, un impulso que puede durar de 0,1 a 4 ms, en particular de 2 a 4 ms.

En lo que se refiere a la frecuencia de los impulsos, según la invención es preferentemente superior a 0,1 Hz, preferentemente a 1 Hz. Puede alcanzar 100 Hz, incluso 500 Hz. De modo más particularmente preferente, está comprendida entre 1 y 100 Hz, en particular 1 y 10 Hz. Por otro lado, el producto de la duración de cada impulso por la frecuencia debe permanecer inferior a 1.

En lo que se refiere a las células de mamíferos, la intensidad del campo eléctrico aplicada debe ser suficiente para permitir la salida de las proteínas citoplasmáticas. Es necesario, en el caso de los parámetros eléctricos ilustrados en el ejemplo, utilizar intensidades de campo eléctrico superiores a 1 kV/cm para que las proteínas citoplasmáticas se liberen al medio externo. Se ha destacado que la viabilidad de las células es del 50% en las condiciones en las que se produce la mejor liberación (1,25 kV/cm).

En lo que se refiere al perfil de los impulsos del campo eléctrico, se pueden considerar ondas cuadradas, trapezoidales, triangulares, sinusoides, sinusoides rectificadas con mono-y bialternancia, o de caída exponencial, unipolares, bipolares, simétricas, asimétricas; se utilizan, preferentemente, las ondas cuadradas.

Según la invención, el medio de electropulsación tiene una conductividad baja, preferentemente inferior a 2 mS/cm. Se elige de este modo para limitar la amplitud del efecto Joule asociado a los impulsos eléctricos. Por lo tanto, puede ser un medio salino simple. El medio de electropulsación puede ser así agua desionizada para las levaduras y para las bacterias.

Después del tratamiento con el campo eléctrico, el medio líquido que comprende las células tratadas se incuba para la favorecer la salida de las proteínas de interés.

El medio de incubación puede ser el mismo que el medio de pulsación, pero también se puede modificar. La transición del medio de pulsación al de incubación se puede realizar por transferencia de las células pulsadas en un tampón que contiene un estabilizador osmótico.

Como medio de incubación, se puede utilizar según la invención un medio salino simple, que comprende al menos una sal, por ejemplo, fosfato de potasio. De esta forma se puede utilizar un medio de incubación que comprende al menos un tampón, como el fosfato de potasio, a razón de 10 mM a 0,2 M, preferentemente 50-150 mM, un estabilizador osmótico como glicerol a razón de 0,05 a 1 M, preferentemente 0,2-0,5 M, también puede comprender un reductor como el ditiotreitol a razón de 0,01 a 0,2 mM —a título de conservante de la estabilidad de las proteínas extraídas—, también se pueden utilizar otros productos que contienen grupos tiol (sulfhídrico) como el mercaptoetanol o la mercaptoetilamina.

A menudo se utiliza glicerol como protector osmótico, pero en unas concentraciones del 10 al 20%. En el procedimiento presente, como su presencia tiene por objetivo preservar las vacuolas intactas, su concentración es mucho más baja (por ejemplo, 2,8%), lo que facilita la purificación posterior de las proteínas liberadas.

Al finalizar la incubación, se pueden purificar las proteínas mediante cualquier método conocido de separación de proteínas de un medio líquido y, por ejemplo, mediante centrifugación de volumen fijo, o en flujo continuo, filtración, decantación o precipitación, preferentemente centrifugación o filtración.

En cuanto a la elección de los medios de cultivo, de incubación y de extracción, el especialista del tratamiento de las levaduras, de las bacterias y de las células de mamíferos podrá adaptar en particular la composición de estos medios según la especie.

Para las levaduras y las bacterias, el medio sometido a electropulsación puede ser agua pura y el medio de cultivo puede ser salino. Para las células de mamíferos, el medio de cultivo debe estar equilibrado desde el punto de vista osmótico, preferentemente, y el medio de cultivo puede ser similar al medio de electropulsación. Por lo tanto, se puede utilizar un medio con un contenido iónico débil, donde la sacarosa, por ejemplo, garantiza la protección frente al choque osmótico.

El procedimiento de la invención se puede aplicar con las levaduras para la extracción de enzimas citoplasmáticas tales como la ADH (alcohol deshidrogenasa), PGK (fosfoglicerato cinasa), HK (hexocinasa), GAPDH (gliceraldehído fosfato deshidrogenasa), GLR (glutatión reductasa), SOD ( superóxido dismutasa), así como la β -galactosidasa, en el caso de Kluyveromyces lactis.

Según la invención, con las levaduras, las diferentes etapas de cultivo, incubación y extracción pueden tener en particular duraciones del orden de:

− cultivo hasta la fase exponencial: unas 15 h;

− cultivo hasta la fase estacionaria: 24 a 48 h;

− separación de las células del medio de cultivo, lavado y dilución: 1 h;

− tratamiento eléctrico de cada volumen que atraviesa la cámara de pulsación: algunos segundos;

− incubación para liberar las proteínas después de la electropulsación para obtener lo máximo: entre 3 y 8 h;

− separación de las proteínas: 10 min de centrifugación a 2000 xg. Según la invención, con las bacterias, las diferentes etapas de cultivo, incubación y extracción pueden tener en particular duraciones del orden de:

− precultivo durante la noche;

− cultivo hasta la fase exponencial: de 4 a 10 horas;

− separación de las células del medio de cultivo, lavado y dilución: 1 h;

− incubación para liberar las proteínas después de la electropulsación para obtener lo máximo: entre 2 y 8 h;

− separación de las proteínas: 10 min de centrifugación a 2000 xg. Con las células de mamíferos, las diferentes etapas de cultivo, incubación y extracción pueden tener en particular duraciones del orden de:

− cultivo hasta la fase exponencial de varios días para tener suficiente biomasa;

− separación de las células del medio de cultivo, lavado y dilución: 1 h;

− incubación para liberar las proteínas después de la electropulsación para obtener lo máximo: en torno a 30 min;

− separación de las proteínas: 10 min de centrifugación a 100 xg. Desde el punto de vista del material empleado para la realización del procedimiento, una cámara de electropulsación se conecta a un reservorio donde las células después de su cultivo, lavado y dilución son aspiradas por la cámara, y el flujo las hace pasar entre los electrodos conectados a un electropulsador. Se pueden adaptar la cámara y el material de electropulsación: los impulsos eléctricos se pueden aplicar con una frecuencia que está en función de la velocidad del flujo, aunque las células reciben un número de impulsos definido previamente cuya intensidad y duración se ha adaptado, por ejemplo, de 2 a 5 kV/cm y de una duración de 0,1 a 15 ms, por ejemplo, de 1 a 15 ms.

Para duraciones similares, se pueden utilizar intensidades más débiles de 0,5 a 5 kV/cm, preferentemente de 1 a 4

kV/cm, para las células de mamíferos. A la salida de la cámara de flujo, el flujo de las células se diluye en el medio de incubación y puede tener lugar la salida de las proteínas a través de la membrana. Entonces se separan las proteínas de las levaduras, bacterias o células de mamíferos por centrifugación o filtración. Luego se purifican.

La detección de la salida de las proteínas del microorganismo se puede obtener mediante la tinción con azul de Coomassie, que permite una evaluación global de las proteínas presentes en el extracto, método de referencia para hacer un balance de las proteínas solubles en un extracto soluble. En los ejemplos realizados, las proteínas membranarias se han sedimentado al centrifugarlas. Ya no están presentes en el extracto.

Las enzimas se pueden concentrar y purificar posteriormente mediante los métodos conocidos. La separación de las enzimas liberadas de las células del sobrenadante es una etapa usual antes de proceder a una purificación posterior. En el caso de la electropulsación, como no hay fragmentación de las células, basta con una centrifugación a 1500-2000 xg para las levaduras y para las bacterias, y a 100 xg para las células de mamíferos. A escala industrial, esta separación se puede realizar mediante centrifugación continua o mediante filtración.

La puesta en marcha del procedimiento de electropulsación se ha realizado con flujos continuos de cultivo celular en las condiciones que vienen a continuación.

Ejemplos

EJEMPLOS DE PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE ELECTROPULSACIÓN DE LAS LEVADURAS:

Ejemplo a): se ha cultivado Saccharomyces cerevisiae (cepa FY-86) en medio YPD (10 g/l de extracto de levadura, 20 g/l de peptona, 20 g/l de glucosa) a 30 ºC y 240 rpm. Se ha mantenido el crecimiento hasta la fase exponencial y hasta la fase estacionaria.

Después del cultivo de las levaduras, se han separado las células del medio de cultivo mediante centrifugación a 2000 g durante 5 min, se han lavado dos veces con agua desionizada y se han diluido en agua desionizada hasta una concentración de 109 células/min.

Se han elegido los parámetros de pulsación del modo siguiente: una serie de quince impulsos, cada uno de una duración de 3 ms, con una frecuencia de 4 Hz, siendo el caudal de 3 ml/min.

Justo después del tratamiento, se ha diluido la suspensión 5 veces en el medio de extracción, que en el caso presente es igualmente el medio de incubación. Comprendía una concentración final de tampón de fosfato de potasio (0,1 M), glicerol (0,3 M ) y DTT (1 mM).

La permanencia en el medio de extracción ha sido del orden de 6 horas. El procedimiento de electropulsación y la incubación siguiente para la extracción se han llevado a cabo a la temperatura ambiente.

A continuación se ha evaluado mediante una prueba específica la actividad de las proteínas recuperadas. Con el ensayo de BioRad se ha evaluado la cantidad total de proteínas liberadas.

Para Saccharomyces cerevisiae, se ha constatado que la liberación del 80% de las proteínas citoplasmáticas, tales como gliceraldehído fosfato deshidrogenasa, la hexocinasa, la fosfoglicerato cinasa, ha durado 4 horas en un medio que comprende fosfato de potasio (0,084 M), glicerol (0,24 M) y DTT (0,8 mM).

Ejemplo b): se ha realizado un ensayo similar, en las mismas condiciones anteriores, manteniéndose el crecimiento en fase estacionaria. Se han obtenido unos resultados similares a los de a).

Ejemplo c): se ha cultivado Kluyveromyces lactis (cepa 2209) en medio YPL (10 g/l de extracto de levadura, 20 g/l de peptona, 20 g/l de lactosa) y en las mismas condiciones.

Se ha seguido un protocolo muy similar al de a).

Después del cultivo de las levaduras, se han separado las células mediante centrifugación a 2000 g durante 5 min, se han lavado dos veces con agua desionizada y se han diluido en agua desionizada hasta una concentración de 109 células/ml.

Se han escogido los parámetros de pulsación del modo siguiente: una serie de quince impulsos, cada uno con una duración de 3 ms, con una frecuencia de 4 Hz, por lo que se puede alcanzar un caudal de 3 ml/min. Se puede obtener un aumento del caudal mediante una modificación sencilla de las características geométricas de la cámara de pulsación y de las prestaciones del electropulsador.

Justo después de su tratamiento, se diluye la suspensión 5 veces en el medio de extracción, que en el caso presente es igualmente el medio de incubación, y comprende una concentración inicial de tampón de fosfato de potasio (0,1 M), glicerol (0,3 M) y DTT (1 mM). La permanencia en el medio de extracción está en el orden de 8 horas. El procedimiento de electropulsación y la incubación siguiente para la extracción se han llevado a cabo a temperatura ambiente.

Para Kluyveromyces lactis, la liberación de la β-galactosidasa citoplasmática en un medio (fosfato [0,084 M], glicerol [0,24 M] y DTT [1,6 mM]) ha durado de 7 a 8 horas.

Después de la incubación, las células se han separado por centrifugación del líquido que contiene las proteínas liberadas.

Ejemplo d): en las mismas condiciones, se ha reproducido el ejemplo a) con los parámetros de pulsación siguientes: una serie de 15 impulsos, cada uno con una duración de 3 ms, con una frecuencia de 50 Hz, siendo el caudal de 60 ml/min.

Ejemplo e): se ha reproducido el ejemplo c), excepto que los parámetros de las pulsaciones se han elegido del modo siguiente: una serie de 15 impulsos, cada uno con una duración de 3 ms, con una frecuencia de 6 Hz, por lo tanto se puede alcanzar un caudal de 7,2 ml/min.

Estos datos se han comparado con los resultados de una lisis clásica de las levaduras: se ha constatado para a), así como para b), c), d) y e), la ausencia de degradación proteolítica, mientras que sí tenía lugar con los otros procedimientos. Se ha desactivado menos del 5 al 10% de las enzimas. Este resultado demuestra la superioridad del método eléctrico con respecto al que se utiliza actualmente a escala de laboratorio o en el proceso industrial.

Los perfiles después de la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en el que aparecen bandas netas sin arrastre han confirmado la ausencia de degradación proteolítica en el transcurso del procedimiento de extracción.

Se han obtenido los resultados cuantitativos siguientes para a), así como para b), c), d) y e).

− el balance de las proteínas recuperadas representa del 45 al 50% de las proteínas totales celulares (que se pueden obtener mediante lisis celular enzimática o desintegración mecánica);

− el balance de las enzimas liberadas y analizadas es: fosfoglicerato cinasa, gliceraldehído fosfato deshidrogenasa y hexocinasa del orden del 80 al 90% de su contenido en las células.

La actividad específica de las enzimas en el sobrenadante de las células pulsadas es de 1,7 a 2 veces superior que la obtenida mediante trituración mecánica o mediante la lisis enzimática de las células. Por lo tanto, se constata que, en el estadio de incubación, ha tenido lugar una purificación de las enzimas funcionales recuperadas.

EJEMPLOS DE PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE ELECTROPULSACIÓN DE BACTERIAS

− Cultivo

Se han resuspendido 50 ml de un cultivo durante toda una noche de E. coli (BL 21) en 450 ml del medio LB. Se ha incubado el cultivo durante 2 horas a 37 ºC en agitación. El cultivo presentaba una densidad óptica de E660 = 0,7. Se ha centrifugado a 4000 rpm durante 10 minutos. Se ha

resuspendido el sedimento en 500 ml de agua milliQ (Millipore). Le ha seguido una incubación de 30 min a la

temperatura ambiente (25 ºC). Se ha aplicado una centrifugación a 4000 rpm durante 10 min y se ha resuspendido el sedimento en 45 ml de agua milliQ. Los dos lavados sucesivos han permitido eliminar una gran parte de los iones del medio en el que se encuentran las bacterias.

− Condiciones de tratamiento:

La cámara de pulsación presenta un volumen de 0,3 ml y una distancia de 3 mm entre los electrodos (planos paralelos de acero inoxidable). Se ha fijado el caudal a 2,4 ml/min mediante una bomba peristáltica. Se han aplicado series de impulsos en la que cada uno dura 2 ms con una frecuencia de 3 Hz en continuo. Esto

corresponde a la aplicación de 22 impulsos a cada bacteria. La tensión del generador se ha fijado a 1500 V, es decir, una intensidad de campo de 5 kV/cm. Después del tratamiento eléctrico, se han resuspendido 100 μl de la suspensión bacteriana electrotratada en 400 μl de

tampón PBS a 0,105 M, pH = 7. Entonces se ha incubado la muestra a 37 ºC. Las células de control se han tratado de la misma manera, pero la tensión del generador se ha fijado a 0 V. Después de una incubación de 5 h, se han centrifugado las células en una centrifuga Eppendorf durante 3 min (13 000

xg). Se ha determinado la concentración de proteínas en el sobrenadante. − Determinación de las proteínas

A continuación, mediante un ensayo colorimétrico, se ha realizado una valoración global de las proteínas presentes en el sobrenadante.

Se ha evaluado la muestra midiendo la densidad óptica a 595 nm de la mezcla de 100

μl de sobrenadante, 700 μl de agua milliQ y 200 μl de reactivo de Bradford (BioRad, EE.UU.).

La referencia del espectrofotómetro es la mezcla de 800 μl de agua milliQ y 200 μl de reactivo de Bradford.

Se ha realizado una gama de referencia de proteínas con la albúmina bovina (Sigma, EE.UU.).

En conclusión, se ha determinado que el sobrenadante de la muestra problema poseía una densidad óptica de 0,570, es decir, 11,4 μg de proteínas, mientras que el del control era de 0,103, es decir, 2,4 μg de proteínas. En estas condiciones de medición, se han extraído 9 μg de proteínas de la muestra de bacterias, evaluación realizada por el tratamiento eléctrico seguido de una incubación de 5 h.

La cantidad de proteínas (9 µg) correspondía al volumen de la muestra, es decir, 0,1 ml del sobrenadante, o bien 25 µl de la suspensión bacteriana electrotratada.

No ha tenido lugar ningún tratamiento previo del cultivo bacteriano para modificarlo mecánica, química o biológicamente.

EJEMPLO DE PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE ELECTROPULSACIÓN DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS

− Cultivo:

Las células de hámsteres chinos (CHO, clon WTT) son células parcialmente transformadas. Se han cultivado a 37 ºC en suspensión en frascos de vidrio de tipo giratorio mantenidos en agitación suave (100 rpm) para evitar la adhesión de las células al soporte. El medio de cultivo utilizado era el medio mínimo esencial de Eagle: MEM 0111 (Eurobio) complementado con suero de ternera fetal (Seromed) al 8%, antibióticos (penicilina a 100 unidades por mililitro, estreptomicina a 100 µg/ml), L-glutamina (0,58 mg/ml).

− Electropulsación

En el momento de la electropulsación de las células, se ha reemplazado el medio de cultivo por el medio de pulsación. Para las células CHO, consiste en tampón fosfato (10 mM, pH 7,2), sacarosa (250 mM) y MgCl2 (1 mM) (conductancia de 1400 µS/cm ± 200 µS/cm; osmolaridad de ~0,317 osmol/kg). Este medio isoosmótico y de poca fuerza iónica permite limitar, gracias a su baja conductancia, el efecto Joule asociado a los impulsos eléctricos.

Se han centrifugado las células a 100 xg durante 5 minutos. Se ha eliminado el sobrenadante y después se ha recuperado el sedimento en el medio de pulsación.

Se han electropulsado las células en campos variables mediante 10 impulsos de 1 ms, administrados con la frecuencia de 1 Hz. El caudal del flujo es de 1,2 ml/min. En la cámara, los electrodos estaban formados por 2 láminas paralelas separadas por una distancia entre los electrodos de 0,4 cm. El volumen de la cámara de pulsación era de 0,2 ml, y la dirección del campo era perpendicular a la del flujo medio.

Después de la electropulsación, se han puesto las células a la temperatura ambiente para permitir que las membranas de las células recuperen su estado nativo. Se han recuperado 1,5 ml de suspensión celular (1 x 106 células/ml) por cada ensayo. Se han incubado las células 10 minutos a la temperatura ambiente y luego se han colocado a 4 ºC. A continuación se han centrifugado las células durante 5 minutos a 100 xg (800 rpm, centrifuga C500, Jouan). Se ha retirado el sobrenadante (~1 ml) y se ha conservado a 4 ºC.

− Dosificación

Se ha efectuado la dosificación de las proteínas en tampón de pulsación con el kit BioRad. Se ha realizado una gama

patrón en paralelo utilizando la seroalbúmina bovina (SAB, 1 mg/ml). Una solución diluida de SAB (0,1 mg/ml) ha

servido para preparar las diferentes diluciones de la gama patrón. Se han añadido 800 µl de las soluciones de la gamma patrón y de los diferentes problemas a 200 µl del reactivo de BioRad. Se ha realizado la lectura de la densidad óptica (DO) con la ayuda de un espectrofotómetro a 595 nm. Se obtiene una valoración global de las proteínas electroextraídas.

− Valoración

Los resultados sobre la liberación de las proteínas intracelulares en función de la intensidad del campo eléctrico E (kV/cm) han demostrado que para una intensidad de campo de 1,25 kV/cm, la concentración de las proteínas liberadas es de 25 µg/ml y el 50% de las células siguen viables. La viabilidad se evalúa 24 h después del tratamiento eléctrico mediante la técnica de coloración con cristal violeta. La inoculación de placas de cultivo para cuantificar la viabilidad se ha realizado con el mismo número de células (~0,75 x 106 células/ml). Se ha expresado el 100% de la viabilidad en función de la DO obtenida a 595 nm para las células que no se han sometido a ningún tratamiento eléctrico, pero que se han tratado en flujo continuo.

Claims

REIVINDICACIONES

1.-Procedimiento de producción de proteínas en el cual un flujo de medio líquido que comprende al menos una levadura

o una bacteria, en suspensión a una concentración comprendida entre 106 y 5 x 109 células/ml en el medio líquido, se somete a electropulsación, realizándose la electropulsación con intensidades de campo de al menos 1 kV/cm, la duración de los impulsos es superior a unos 0,01 ms y siendo la duración del tratamiento de electropulsación de 0,01 a 100 s, la etapa de electropulsación va seguida de una etapa de incubación, y se recuperan las proteínas liberadas.
2.-Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que la concentración de levadura(s) o de bacteria(s) en suspensión en el medio líquido está comprendida entre 5 x 108 y 5 x 109 células/ml.
3.-Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que la levadura se escoge entre las especies Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Candida y Hansenula.
4.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que las proteínas liberadas se separan de las levaduras o de las bacterias mediante filtración o centrifugación.
5.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la intensidad de campo está comprendida entre 1 y 10 kV/cm.
6.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la intensidad de campo está comprendida entre 1 y 5 kV/cm.
7.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que la duración de los impulsos es inferior a 100 ms.
8.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que la duración de los impulsos está comprendida entre 0,5 y 15 ms.
9.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que la duración del tratamiento de electropulsación es de 0,15 a 15 s.
10.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que la frecuencia de los impulsos es superior a 0,1 Hz.
11.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que la frecuencia de los impulsos es superior a 1 Hz.
12.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que la frecuencia de los impulsos está comprendida entre 1 y 500 Hz.
13.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por que el número de impulsos recibidos por cada célula de levadura o de bacteria está comprendido entre 1 y 100.
14.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado por que el número de impulsos recibidos por cada célula está comprendido entre 5 y 20.
15.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por que el número de impulsos recibidos por cada célula de levadura o de bacteria es del orden de 10.
16.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado por que el medio de incubación comprende al menos una sal.
17.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado por que el medio de incubación comprende fosfato de potasio.
18.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado por que el medio de extracción comprende al menos un agente que mantiene la estabilidad de las proteínas extraídas.
19.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado por que el medio de extracción comprende al menos un agente reductor.
20.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado por que el medio de extracción comprende ditiotreitol.
21.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado por que el medio de electropulsación es agua desionizada.
22.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado por que el perfil de los impulsos del campo eléctrico es en ondas cuadradas, trapezoidales, triangulares, sinusoides, sinusoides rectificadas con mono-y bialternancia, o en caída exponencial, unipolares, bipolares, simétricas o asimétricas.
23.-Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado por que el perfil de los impulsos 5 es en ondas cuadradas.