ES2364988T3 - Grg23 epsp sintasas mejoradas: composiciones y métodos de uso. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de: a) una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34; y, b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35.

Description

Campo de la invención

Esta invención se relaciona con biología molecular de plantas, particularmente con nuevos polipéptidos de EPSP sintasa que confieren una resistencia o tolerancia mejoradas al herbicida glifosato.

Antecedentes de la invención

N-fosfonometilglicina, comúnmente denominada como glifosato, en un importante producto químico agronómico. El glifosato inhibe la enzima que convierte al ácido fosfoenolpirúvico (PEP) y al ácido 3-fosfoshiquímico (S3P) en ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico. La inhibición de esta enzima (5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa, denominada aquí como "EPSP sintasa", o "EPSPS") mata células vegetales cerrando la ruta de shiquimato, inhibiendo por lo tanto la biosíntesis de aminoácidos aromáticos.

Ya que los herbicidas de la clase del glifosato inhiben la biosíntesis de aminoácidos aromáticos, ellos no solamente matan células vegetales, sino que también son tóxicos para células bacterianas. El glifosato inhibe muchas EPSP sintasas bacterianas, y por lo tanto es tóxico para estas bacterias. Sin embargo, ciertas EPSP sintasas bacterianas tienen una gran tolerancia al glifosato.

Las células de plantas resistentes a la toxicidad del glifosato pueden ser producidas por medio de la transformación de las células vegetales para expresar EPSP sintasas bacterianas resistentes al glifosato. Notablemente, el gen bacteriano de la cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens ha sido utilizado para conferir resistencia bactericida a células vegetales después de la expresión en plantas. Una EPSP sintasa mutada de la cepa CT7 de Salmonella typhimurium confiere resistencia al glifosato en células bacterianas, y confiere resistencia al glifosato sobre células vegetales (Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.535.060; 4.769.061; y 5.094.945).

La Patente de los Estados Unidos No. 6.040.497 reporta enzimas mutantes de EPSP sintasa del maíz que tienen sustituciones de treonina por isoleucina en la posición 102 y de prolina por serina en la posición 106 (la mutación "TIPS"). Tales alteraciones confieren resistencia al glifosato sobre la enzima del maíz. Un EPSP sintasa mutada de la cepa CT7 de Salmonella typhimurium confiere resistencia al glifosato en células bacterianas, y se reporta que confiere resistencia al glifosato sobre células vegetales (Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.535.060; 4.769.061; y 5.094.945). He et al. ((2001) Biochim et Biophysica Acta 1568: 1 - 6) han desarrollado EPSP sintasas con mayor tolerancia al glifosato por medio de mutagénesis y recombinación entre los genes para la EPSP sintasa de E. coli y de Salmonella typhimurium, y sugiere que mutaciones en la posición 42 (T42M) y en la posición 230 (Q230K) son probablemente las responsables por la resistencia observada. El siguiente trabajo (He et al. (2003) Biosci. Biotech. Biochem. 67: 1405 - 1409) muestra que la mutación T42M (treonina por metionina) es suficiente para mejorar la tolerancia tanto de la enzima de E. coli como de la enzima de Salmonella typhimurium. Debido a las muchas ventajas que proporcionan a las plantas la resistencia a los herbicidas, son deseables genes de resistencia a los herbicidas con actividad mejorada de resistencia al glifosato.

Un método alternativo para mutagénesis es el método de "mutagénesis permutacional" descrito en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 60/813.095, presentada el 13 de junio de 2006.

Resumen de la invención

Se proporcionan composiciones y métodos para conferir resistencia o tolerancia a los herbicidas. Las composiciones incluyen enzimas EPSP sintasas que son resistentes al herbicida glifosato, y moléculas de ácido nucleico que codifican tales enzimas, vectores que contienen aquellas moléculas de ácido nucleico, y células huésped que contienen los vectores. Las composiciones incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de resistencia a los herbicidas, incluidas aquellas que codifican polipéptidos que comprenden las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35, así como las secuencias de polinucleótidos de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34.

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Por lo tanto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de:

a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34; y, b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35.

Las secuencias de codificación pueden ser utilizadas en construcciones de ADN o casetes de expresión para transformación y expresión en organismos, incluidos microorganismos y plantas. Las composiciones también incluyen bacterias, plantas, células de plantas, tejidos, y semillas transformadas que son resistentes al glifosato por medio de la introducción de las composiciones de la invención en el genoma de los organismos. Donde el organismo es una planta, la introducción de la secuencia permite que herbicidas que contienen glifosato sean aplicados a plantas para matar selectivamente malas hierbas sensibles al glifosato u otras plantas no transformadas, pero no el organismo trasformado. Las secuencias pueden ser usadas adicionalmente como marcadoras para selección de células de plantas que crecen bajo condiciones de glifosato.

Se proporcionan adicionalmente métodos para identificar una enzima EPSP sintasa con actividad de resistencia al glifosato. Los métodos comprenden la identificación de secuencias adicionales de EPSP sintasa que son resistentes al glifosato con base en la presencia del dominio de la invención.

La presente invención también provee:

-un vector que contiene la molécula de ácido nucleico de la invención, preferiblemente que contiene además una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo;

-

una célula huésped que contiene la molécula de ácido nucleico de la invención, preferiblemente que sea una célula huésped bacteriana o una célula de una planta;

-

una planta transgénica que contiene la célula huésped de la planta de la invención, preferiblemente en donde se selecciona dicha planta del grupo que consiste de maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza de semillas oleaginosas; y

-

una semilla transgénica que contiene la molécula de ácido nucleico de la invención.

Adicionalmente, la invención proporciona un polipéptido recombinante seleccionado del grupo que consiste de:

a) un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35; y, b) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34, preferiblemente que contiene además una secuencia heteróloga de aminoácidos.

La invención provee además un método para conferir resistencia a un herbicida en una planta, comprendiendo dicho método la transformación de dicha plante con una construcción de ADN, conteniendo dicha construcción un promotor que dirige la expresión en una célula de una planta operativamente enlazada con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34, y regenerar una planta transformada, preferiblemente en donde dicho herbicida es glifosato.

La invención provee además una planta que tiene incorporado en forma estable en su genoma una construcción de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad de resistencia a herbicidas, en donde dicha secuencia de nucleótidos es seleccionada del grupo que consiste de:

a) una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34; y, b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35; en donde dicha secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión de una secuencia de codificación en una célula de una planta.

Adicionalmente, la invención provee un método para incrementar el vigor o la productividad en una planta que comprende:

a) proveer una planta que contiene la secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34; b) poner en contacto dicha planta con una concentración efectiva de glifosato; y, c) cultivar dicha planta bajo condiciones en donde la temperatura es más alta que la temperatura del medio ambiente al menos durante dos horas consecutivas por día durante al menos cuatro días después del contacto con dicho glifosato, en donde dichos días después el contacto están dentro del período vegetativo de la planta, en donde el vigor o la productividad de dicha planta son mayores al vigor o a la productividad de una planta que expresa una EPSP sintasa de tolerancia al glifosato que no tiene una temperatura óptima más alta que la temperatura del medio ambiente, preferiblemente en donde la temperatura en la etapa (c) es aproximadamente de 32°C hasta aproximadamente 60°C.

La invención también provee un método para conferir resistencia al glifosato en una planta que comprende:

a) proveer una planta que contiene la secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34; b) poner en contacto dicha planta con una concentración efectiva de glifosato; y, c) cultivar dicha planta bajo condiciones en donde la temperatura es más alta que la temperatura del medio ambiente al menos durante dos horas consecutivas por día durante al menos cuatro días después el contacto con dicho glifosato, en donde dichos días después el contacto están dentro del período vegetativo de la planta.

Descripción de las figuras

La Figura 1 demuestra la actividad enzimática de GRG23(acel) ("M5"; SEQ ID NO: 10) comparada con GRG23 de tipo silvestre ("WTGRG23"; SEQ ID NO: 2) a 37°C durante 0 a 25 horas. La Figura 2 muestra la resistencia de GRG23 y de diferentes variantes al glifosato, expresada como la constante de inhibición, o K1. La Figura 3 muestra la vida media de GRG23 y variantes de GRG23 a 37°C.

Descripción detallada de la invención

Las presentes invenciones serán descritas de aquí en adelante más completamente con referencia a los dibujos acompañantes, en los cuales se presentan algunas pero no todas las modalidades de las invenciones. En realidad, estas invenciones pueden ser incorporadas en muchas formas diferentes y no deben interpretarse como limitadas a las modalidades expuestas aquí; más bien, se presentan estas modalidades de tal manera que esta divulgación satisfaga los requerimientos legales aplicables. A lo largo de toda la descripción, números similares se refieren a elementos similares.

Muchas modificaciones y otras modalidades de las invenciones expuestas aquí vendrán a la mente de la persona capacitada en el arte a la cual pertenecen estas invenciones teniendo el beneficio de las enseñanzas presentadas en las anteriores descripciones y en los dibujos asociados. Por lo tanto, se entiende que las invenciones no se limitan a las modalidades específicas descritas y que modificaciones y otras modalidades están destinadas a ser incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Aunque aquí se emplean términos específicos, ellos son usados únicamente en sentido genérico y descriptivo y no para propósitos de limitación.

La presente invención está dirigida a composiciones y métodos para regular la resistencia a herbicidas en organismos, particularmente en plantas o en células de plantas. Los métodos involucran la transformación de organismos con secuencias de nucleótidos que codifican un gen de resistencia al glifosato de la invención. Las secuencias de nucleótidos de la invención son útiles para la preparación de plantas que muestran mayor tolerancia al herbicida glifosato. Por lo tanto, por gen de "resistencia al glifosato" o de "tolerancia al glifosato " de la invención se entiende la secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34, y fragmentos y variantes de las mismas que codifican un polipéptido de resistencia o tolerancia al glifosato. Igualmente, un polipéptido de "resistencia al glifosato" o de "tolerancia al glifosato" de la invención es un polipéptido que tiene la secuencia de

aminoácidos expuesta en las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35, y fragmentos y variantes de las mismas, que confieren resistencia o tolerancia al glifosato a una célula huésped.

A. Polinucleótidos aislados, y variantes y fragmentos de los mismos

En algunas modalidades, la presente invención incluye polinucleótidos aislados, recombinantes, o purificados. Un polinucleótido o polipéptido "aislado" o "purificado", o una porción biológicamente activa de los mismos, está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se los produce por medio de técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos o de otros compuestos químicos cuando se los sintetiza químicamente. Por "biológicamente activo" se entienden que posea la actividad biológica deseada del polipéptido nativo, es decir, que retenga la actividad de resistencia al herbicida. Un polinucleótido "aislado" puede estar libre de secuencias (por ejemplo, de secuencias que codifican proteína) que naturalmente flanquean al ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5’ y 3’ del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo a partir del cual se deriva el polinucleótido. Para los propósitos de la invención, " aislado" cuando se lo utiliza para referirse a polinucleótidos excluye cromosomas aislados. Por ejemplo, en diferentes modalidades, el polinucleótido aislado que codifica para resistencia al glifosato puede contener aproximadamente menos de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, o 0,1 kb de la secuencia de nucleótidos que naturalmente flanquea al polinucleótido en el ADN genómico de la célula a partir de la cual se deriva el polinucleótido.

Los polinucleótidos de la invención incluyen aquellos que codifican polipéptidos de resistencia al glifosato que contienen las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35, así como las secuencias de polinucleótidos de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34.

Por "glifosato" se entiende cualquier forma herbicida de N-fosfonometilglicina (incluida cualquier sal de la misma) y otras formas que resultan en la producción del anión glifosato en la planta. Una "proteína de resistencia al herbicida"

o una proteína que resulta de la expresión de una "molécula de ácido nucleico que codifica resistencia al herbicida" incluye proteínas que le confieren a una célula de la habilidad para tolerar una mayor concentración de un herbicida que células que no expresen la proteína, o para tolerar una cierta concentración de un herbicida durante un período de tiempo más largo que las células que no expresan la proteína. Una "proteína de resistencia al glifosato" incluye una proteína que le confiere a una célula la habilidad para tolerar una concentración más alta de glifosato que las células que no expresan la proteína, o para tolerar una cierta concentración de glifosato durante un periodo de tiempo más largo que las células que no expresan la proteína. Por "tolerar" o "tolerancia" se entiende ya sea sobrevivir, o llevar a cabo funciones celulares esenciales tales como síntesis de proteína y respiración en una forma que no sea fácilmente discernible a partir de células no tratadas.

La presente invención contempla además variantes y fragmentos de los polinucleótidos descritos aquí. Un "fragmento" de un polinucleótido puede codificar una porción biológicamente activa de un polipéptido, o puede ser un fragmento que puede ser utilizado como una sonda de hibridación o un iniciador para la PCR utilizando métodos divulgados aquí en otra parte. Los polinucleótidos que son fragmentos de un polinucleótido incluyen aproximadamente menos 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en un polinucleótido de longitud completa divulgado aquí dependiendo del uso pretendido (por ejemplo, un polinucleótido de EPSP sintasa que comprende la SEQ ID NO: 1). Por nucleótidos "contiguos" se entienden residuos de nucleótidos que están inmediatamente adyacentes entre sí.

Fragmentos de los polinucleótidos de la presente invención generalmente codificarán fragmentos de polipéptidos que retienen la actividad biológica de la proteína de longitud completa de resistencia al glifosato; es decir, actividad de resistencia al herbicida. Por "retiene actividad de resistencia al herbicida" se entiende que el fragmento tenga aproximadamente al menos 30%, aproximadamente al menos 50%, aproximadamente al menos 70%, aproximadamente al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, aproximadamente al menos 300% o más de la actividad de resistencia al herbicida de la proteína de longitud completa de resistencia al glifosato divulgada aquí como las SEQ ID NOs: 2, 3, ó 5. Los métodos para medir la actividad de resistencia al herbicida son bien conocidos en arte. Ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.535.060, y 5.188.642.

Un fragmento de un polinucleótido que codifica una porción biológicamente activa de un polipéptido de la invención codificará aproximadamente al menos 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en un polipéptido de longitud completa de la invención.

La invención también abarca variantes de los polinucleótidos. Las "variantes" de polinucleótidos incluyen aquellas secuencias que codifican los polipéptidos divulgados aquí pero que difieren de manera conservadora debido a la degeneración del código genético, así como aquellas que son suficientemente idénticas.

El término "suficientemente idéntica" abarca un polipéptido o secuencia de polinucleótidos que tiene aproximadamente al menos 60% o 65% de identidad de secuencia, aproximadamente 70% o 75% de identidad de secuencia, aproximadamente 80% u 85% de identidad de secuencia, aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia comparado con una secuencia de referencia utilizando uno de los programas de alineación usando parámetros estándar. Alguien capacitado en el arte se dará cuenta que estos valores pueden ser apropiadamente ajustados para determinar la identidad correspondiente de los polipéptidos codificados por dos polinucleótidos teniendo en cuenta la degeneración del codón, la similitud de los aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura, y similares.

Los genes bacterianos muy a menudo poseen múltiples codones de iniciación de metionina en la proximidad del inicio del marco de lectura abierto. A menudo, la iniciación de la traducción en uno o más de estos codones de inicio conducirá a la generación de una proteína funcional. Estos codones de inicio pueden incluir codones ATG. Sin embargo, bacterias tales como Bacillus sp. también reconocen el codón GTG como un codón de inicio, y las proteínas que inician la traducción en los codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. Además, a menudo no se determina a priori cuál de estos codones se usan en forma natural en la bacteria. Por lo tanto, se entiende que el uso de uno de los codones alternativos de metionina puede conducir a la generación de variantes que confieren resistencia a los herbicidas. Estas proteínas de resistencia a los herbicidas están incluidas en la presente invención y pueden ser utilizadas en los métodos de la presente invención.

Las variantes alélicas de origen natural pueden ser identificadas con el uso de técnicas bien conocidas de biología molecular, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación como se indica a continuación. Las variantes de polinucleótidos también incluyen polinucleótidos de origen sintético que han sido generados, por ejemplo, por medio del uso de estrategias de mutagénesis dirigida al sitio u otras estrategias de mutagénesis pero que aún codifican al polipéptido que tiene la actividad biológica deseada.

El experto se dará cuenta además que se pueden introducir cambios por medio de una mutación adicional de los polipéptidos de la invención conduciendo por lo tanto a cambios adicionales en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados, sin alterar la actividad biológica de los polipéptidos. Por lo tanto, se pueden crear variantes de polinucleótidos aislados por medio de la introducción de una o más sustituciones, adiciones o supresiones adicionales de nucleótidos en el correspondiente polinucleótido que codifica el dominio de la EPSP sintasa divulgado aquí, de tal manera que se introducen una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos en el polipéptido codificado. Se pueden introducir mutaciones adicionales por medio de técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR, o técnicas de intercambio de genes. Tales variantes del polinucleótidos son también abarcadas por la presente invención.

Las variantes de polinucleótidos pueden ser elaboradas por medio de la introducción de mutaciones al azar a lo largo de toda o parte de la secuencia de codificación, por ejemplo por mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes pueden ser seleccionados por la habilidad para conferir actividad de resistencia a los herbicidas para identificar a los mutantes que retienen la actividad.

Se pueden utilizar procedimientos de reordenamiento de genes o PCR sexual (por ejemplo, Smith (1994) Nature

370: 324 - 325; las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.837.458; 5.830.721; 5.811.238; y 5.733.731), para modificar adicionalmente o mejorar polinucleótidos y polipéptidos que tienen al dominio de la EPSP sintasa de la presente invención (por ejemplo, polipéptidos que confieren resistencia al glifosato). El reordenamiento de genes involucra fragmentación aleatoria de diferentes ADN mutantes seguido por su nuevo montaje por PCR en moléculas de longitud completa. Los ejemplos de diferentes procedimientos de reordenamiento de genes incluyen, pero no se limitan al montaje seguido por tratamiento con ADNasa, el proceso de extensión escalonada (STEP), y recombinación in vitro de cebado aleatorio. En el método mediado por ADNasa, se escinden segmentos de ADN aislados de un reservorio de mutantes positivos en fragmentos al azar con ADNasa I y se los somete a rondas múltiples de PCR sin adición de iniciador. Las longitudes de los fragmentos aleatorios se aproximan a aquellos del segmento no escindido en la medida que avanzan los ciclos de la PCR, resultando en mutaciones en diferentes clones mezclándose y acumulándose en algunas de las secuencias resultantes. Ciclos múltiples de selección y ordenamiento han conducido al mejoramiento funcional de diferentes enzimas (Stemmer (1994) Nature 370: 389 391; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747 - 10751; Crameri et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 315 319; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504 - 4509; y Crameri et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15: 436

- 438). Tales procedimientos se podrían llevar a cabo, por ejemplo, sobre polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen el dominio de la secuencia de la presente invención para generar polipéptidos que confieren resistencia al glifosato.

Utilizando métodos tales como PCR, hibridación, y similares, se pueden identificar las correspondientes secuencias de resistencia a los herbicidas mediante la búsqueda de dominios de EPSP sintasa de la presente invención. Ver, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods y Applications (Academic Press, NY).

B. Proteínas aisladas y variantes y fragmentos de las mismas pudo

Los polipéptido para resistencia a los herbicidas también están abarcados dentro de la presente invención. Un polipéptido para resistencia a los herbicidas que está sustancialmente libre de material celular incluye en preparaciones de polipéptidos que tienen aproximadamente menos de 30%, 20%, 10%, ó 5% (en peso seco) de un polipéptido que no es para resistencia a los herbicidas (también denominado aquí como una "contaminante"). En la presente invención, "proteína para resistencia a los herbicidas" incluye un polipéptido de EPSP sintasa que tiene el dominio de secuencia de la invención. También se suministran fragmentos, porciones biológicamente activas, y variantes que los mismos, y pueden ser utilizados para llevar a cabo los métodos de la presente invención.

Los "fragmentos" o las "porciones biológicamente activas" incluyen fragmentos de polipéptido que contienen una porción de una secuencia de aminoácidos que codifica una proteína para resistencia los herbicidas y que retiene actividad de resistencia a los herbicidas. Una porción biológicamente activa de una proteína para resistencia a los herbicidas pueden ser un polipéptido que sea, por ejemplo, de 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de longitud. Tales porciones biológicamente activas pueden ser preparadas por medio de técnicas recombinantes y evaluadas por la actividad de resistencia a los herbicidas.

Por "variantes" se entiende proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 60%, 65%, aproximadamente 70%, 75%, aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a un polipéptido de EPSP sintasa que tiene al dominio de EPSP sintasa de la presente invención. Alguien capacitado en el arte reconocerá que estos valores pueden ser apropiadamente ajustados para determinar la identidad correspondiente de polipéptidos codificados por dos polinucleótidos teniendo en cuenta la degeneración del codón, la similitud de los aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura, y similares.

Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno o más residuos aminoácidos no esenciales. Un residuo aminoácido "no esencial" es un residuo que puede ser alterado a partir de la secuencia de tipo silvestre de un polipéptido sin alterar la actividad biológica, mientras que se requiere de un residuo aminoácido "esencial" para la actividad biológica. Una "sustitución conservadora de aminoácidos " es una en la cual el residuo aminoácido es reemplazado con un residuo aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En el arte se han definido familias de residuos aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Las sustituciones de aminoácidos pueden hacerse en regiones no conservadas que retienen la función. En general, tales sustituciones no serían hechas para residuos aminoácidos conservados, o para residuos aminoácidos que residen dentro de un motivo conservado, donde tales residuos son esenciales para la actividad del polipéptido. Sin embargo, alguien capacitado en el arte comprendería que variantes funcionales pueden tener alteraciones menores conservadas o no conservadas en los residuos conservados.

También están incluidos anticuerpos para los polipéptido de la presente invención, o para variantes o fragmentos de los mismos. Los métodos para producir anticuerpos son bien conocidos en el arte (ver, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Patente de los Estados Unidos No. 4.196.265).

C. Construcciones de polinucleótidos

Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la EPSP sintasa de la presente invención pueden ser modificados para obtener o mejorar la expresión en células de plantas. Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos identificados aquí pueden ser suministrados en casetes de expresión para expresión en la planta de interés. Un "casete de expresión de la planta" incluye una construcción de ADN, que incluye una construcción recombinante de ADN, que es capaz de resultar en la expresión de un polinucleótido en una célula de una planta. El casete puede incluir en la dirección 5’ - 3’ de transcripción, una región de iniciación transcripcional (es decir, promotora, particularmente una promotora heteróloga) enlazada operativamente a uno o más polinucleótidos de interés, y/o una región de terminación transcripcional y de la traducción (es decir, una región de terminación) funcional en plantas. El casete puede contener adicionalmente al menos un polinucleótido adicional para ser introducido en el organismo, tal como un gen marcador seleccionable. Alternativamente, el(los) polinucleótido(s) adicionales pueden ser suministrados sobre múltiples casetes de expresión. Tal casete de expresión cuenta con una pluralidad de sitios de restricción para inserción del(de los) polinucleótido(s) para estar bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.

"Heterólogos" generalmente se refiere al polinucleótido o polipéptido que no es endógeno a la célula o que no es endógeno a la ubicación en el genoma nativo en el cual está presente, y ha sido añadido a la célula por infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección, o similares. Por "operativamente enlazado" se entiende un enlace funcional entre dos polinucleótidos. Por ejemplo, cuando un promotor está operativamente enlazado a una secuencia de ADN, la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN. Se reconoce que los polinucleótidos operativamente enlazados pueden o no ser contiguos y, donde se los utiliza como referencia la unión de dos regiones que codifican un polipéptido, los polipéptidos se expresan en el mismo marco de lectura.

El promotor puede ser cualquier secuencia de polinucleótidos que muestre actividad transcripcional en las células de la planta, partes de la planta, o plantas escogidas. El promotor puede ser nativo o análogo, o externo o heterólogo, a la planta huésped y/o a la secuencia de ADN de la invención. Donde el promotor sea "nativo" o "análogo" a la planta huésped, se entiende que el promotor se encuentre dentro de la planta nativa dentro de la cual se introduce el promotor. Donde el promotor es "externo" o "heterólogo" a la secuencia de ADN de la invención, se entiende que el promotor no sea el promotor nativo o de origen natural para la secuencia de ADN operativamente enlazada de la invención. El promotor puede ser inducible o constitutivo. Puede ser de origen natural, puede estar compuesto de porciones de diferentes promotores de origen natural, o puede ser parcial o totalmente sintético. La orientación para el diseño de promotores es proporcionada por los estudios de la estructura del promotor, tal como aquellos de Harley y Reynolds (1987) Nucleic Acids Res. 15: 2343 - 2361. También, se puede optimizar la ubicación del promotor con relación al inicio de la transcripción. Ver, por ejemplo, Roberts et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

76: 760 - 764. Se conocen bien en el arte muchos promotores adecuados para uso en plantas.

Por ejemplo, los promotores constitutivos adecuados para uso en plantas incluyen: a los promotores de virus de la planta, tales como el promotor del caulimovirus de veta clorótica de cacahuete (PClSV) (Patente de los Estados Unidos No. 5.850.019); el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Odell et al. (1985) Nature 313: 810 - 812); promotores de los genes para metiltransferasa del virus Chlorella (Patente de los Estados Unidos No. 5.563.328) y el promotor del transcripto de longitud completa del virus del mosaico de escrofularia (FMV) (Patente de los Estados Unidos No. 5.378.619); los promotores de genes tales como actina del arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163 - 171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619 - 632 y Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675 - 689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581 - 588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3: 2723 - 2730); histona H3 del maíz (Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231: 276 - 285 y Atanassova et al. (1992) Plant J. 2(3): 291 - 300); ALS3 de Brassica napus (Solicitud PCT WO 97/41228); y promotores de diferentes gens de Agrobacterium (ver las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.771.002; 5.102.796; 5.182.200; y 5.428.147).

Los promotores inducibles adecuados para uso en plantas incluyen: al promotor del sistema ACE 1 que responde al cobre (Mett et al. (1993) PNAS 90: 4567 - 4571); al promotor del gen In2 del maíz que responde a los protectores del herbicida benceno sulfonamida (Hershey et al. (1991) Mol. Gen. Genetics 227: 229 - 237 y Gatz et al. (1994) Mol. Gen. Genetics 243: 32 - 38); y el promotor del represor Tet de Tn10 (Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227: 229 - 237). Otro promotor inducible para uso en plantas es uno que responde a un agente de inducción para el cual las plantas normalmente no responden. Un ejemplo de un promotor inducible de este tipo es el promotor inducible de un gen para una hormona esteroide, cuya actividad transcripcional es inducida por una hormona glucocorticosteroide (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10421) o la aplicación reciente de un activador de transcripción quimérico, XVE, para uso en un sistema de expresión inducible de una planta con base en el receptor del estrógeno activado por estradiol (Zuo et al. (2000) Plant J., 24: 265 - 273). Otros promotores inducibles para uso en plantas están descritos en EP 332104, PCT WO 93/21334 y PCT WO 97/06269. También se pueden utilizar promotores compuestos de porciones de otros promotores y promotores total o parcialmente sintéticos. Ver, por ejemplo, Ni et al. (1995) Plant J. 7: 661 - 676 y PCT WO 95/14098 que describen tales promotores para uso en plantas.

El promotor puede incluir, o ser modificado para incluir, uno o más elementos reforzadores. En algunas modalidades, el promotor puede incluir una pluralidad de elementos reforzadores. Los promotores que contienen elementos precursores proporcionan niveles más altos de transcripción comparado con los promotores que no los incluyen. Los elementos reforzadores adecuados para uso en plantas incluyen al elemento reforzador del PClSV (Patente de los Estados Unidos No. 5.850.019), al elemento reforzador 35S del CaMV (Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.106.739 y 5.164.316) y al elemento reforzador del FMV (Maiti et al. (1997) Transgenic Res. 6: 143 - 156). Ver también la PCT WO 96/23898.

A menudo, tales construcciones pueden contener regiones no traducidas 5’ y 3’. Tales construcciones pueden contener una "secuencia señal " o "secuencia líder" para facilitar el transporte al tiempo con la traducción o después de la traducción del péptido de interés a ciertas estructuras intracelulares tales como el cloroplasto (u otro plástido), al retículo endoplasmático, o al aparato de Golgi, o para ser secretado. Por ejemplo, la construcción puede ser modificada por ingeniería genética para contener un péptido señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplasmático. Por "secuencia señal" se entiende una secuencia que se sepa o se sospeche que resulte en el trasporte del péptido al tiempo con la traducción o después de la traducción a través de la membrana celular. En eucariotas, esto involucra típicamente secreción en el aparato de Golgi, con alguna glicosilación resultante. Por "secuencia líder" se entiende cualquier secuencia que, cuando es traducida, resulte en una secuencia de aminoácidos suficiente para activar el trasporte al tiempo con la traducción de la cadena del péptido a un organelo subcelular. Por lo tanto, esto incluye secuencias líder que dirigen el transporte y/o la glicosilación por medio del paso dentro del retículo endoplasmático, el paso a las vacuolas, plástidos incluidos cloroplastos, mitocondria, y similares. También puede ser preferible modificar por ingeniería genética el casete de expresión de la planta para contener un intrón, de tal manera que se requiere el procesamiento del ARNm del intrón para expresión.

Por "región no traducida 3’" se entiende un polinucleótido localizado secuencia debajo de una secuencia de codificación. Las secuencias de la señal de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar la adición de tractos de ácido poliadenílico al extremo 3’ del precursor del ARNm son regiones no traducidas 3’. Por "región no traducida 5’" se entiende un polinucleótido localizado secuencia arriba de una secuencia de codificación.

Otros elementos no traducidos secuencia arriba y secuencia abajo incluyen reforzadores. Los reforzadores son polinucleótidos que actúan para incrementar la expresión de una región promotora. Los reforzadores son bien conocidos en el arte e incluyen, pero no se limitan a, la región reforzadora del SV40 y el elemento reforzador de 35S.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de la presente invención, o puede derivarse de otra fuente. Regiones de terminación convenientes están disponibles a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de octopina sintasa y de nopalina sintasa. Ver también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141 - 144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671 - 674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141 - 149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261 - 1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151 - 158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891 - 7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627 - 9639.

En un aspecto de la invención, se diseñan secuencias sintéticas de ADN para un polipéptido dado, tal como los polipéptidos de la invención. La expresión del marco de lectura abierta de la secuencia sintética de ADN en una célula resulta en la producción del polipéptido de la invención. Las secuencias sintéticas de ADN pueden ser útiles para remover simplemente sitios no deseados de endonucleasas de restricción, para facilitar estrategias de clonación de ADN, para alterar o remover cualquier sesgo potencial del codón, para alterar o modificar el contenido de GC, para remover o alterar marcos de lectura alternantes, y/o para alterar o remover sitios de reconocimiento de empalme del intrón/exón, sitios de poliadenilación, secuencias de Shine-Delgarno, elementos del promotor no deseados y similares que pueden estar presentes en una secuencia nativa de ADN. También es posible que se puedan utilizar secuencias sintéticas de ADN para introducir otras mejoras a una secuencia de ADN, tales como la introducción de una secuencia de intrón, la creación de una secuencia de ADN que se exprese como una fusión de proteína con secuencias objetivo del organelo, tales como péptidos de transito del cloroplasto, péptidos objetivo del apoplasto/vacuolares, o secuencias de péptido que resultan en la retención del péptido resultante en el retículo endoplasmático. También se pueden sintetizar genes sintéticos utilizando codones preferidos de la célula huésped para expresión mejorada, o pueden ser sintetizados utilizando codones con una frecuencia de uso del codón preferida por el huésped. Ver, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1 - 11; Patentes de los Estados Unidos Nos. 6.320.100; 6.075.185; 5.380.831; y 5.436.391, Solicitudes Estadounidenses Publicadas Nos. 20040005600 y 20010003849, y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477 - 498.

En una modalidad, los polinucleótidos de interés son dirigidos al cloroplasto para expresión. En esta forma, donde el polinucleótido de interés no está directamente insertado en el cloroplasto, el casete de expresión contendrá adicionalmente un polinucleótido que codifica un péptido de transito para dirigir el nucleótido de interés a los cloroplastos. Tales péptidos de transito son conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104 - 126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544 - 17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965 - 968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414 - 1421; y Shah et al. (1986) Science 233: 478 - 481.

Los polinucleótidos de interés que son dirigidos al cloroplasto pueden ser optimizados para expresión en el cloroplasto para dar cuenta de las diferencias en el uso del codón entre el núcleo de la planta y este organelo. De esta forma, los polinucleótidos de interés pueden ser sintetizados utilizando codones preferidos del cloroplasto. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5.380.831.

Este casete de expresión de la planta puede ser insertado en un vector de transformación de la planta. Por "vector de transformación" se entiende una molécula de ADN que permita la transformación de una célula. Tal molécula puede consistir de uno o más casetes de expresión, y puede ser organizada en más de una molécula de ADN del vector. Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación de la planta que utilizan dos vectores de ADN no contiguos para codificar todas las funciones indispensables que actúan en forma cis y trans para la transformación de células de plantas (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5: 446 - 451). "Vector" se refiere a una construcción de polinucleótido diseñada para transferencia entre diferentes células huésped. "Vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la habilidad para incorporar, integrar y expresar secuencias heterólogas de ADN o fragmentos en una célula extraña.

El vector de transformación de una planta comprende uno o más vectores de ADN para lograr la transformación de la planta. Por ejemplo, es una práctica común en el arte utilizar vectores de transformación de la planta que incluyan más de un segmento contiguo de ADN. Estos vectores a menudo son conocidos en el arte como vectores binarios. Los vectores binarios así como los vectores con plásmidos auxiliares son más a menudo utilizados para transformación mediada por Agrobacterium, donde el tamaño y la complejidad de los elementos de ADN necesarios para lograr una transformación eficiente es bastante grande, y es conveniente separar funciones sobre moléculas separadas de ADN. Los vectores binarios contienen típicamente un vector plásmido que contiene secuencias que actúan en forma cis requeridas para la transferencia de T-ADN (tal como el borde izquierdo y el borde derecho), un marcador seleccionable que es modificado por ingeniería genética para poder expresarse en una célula de una planta, y un "polinucleótido de interés" (un polinucleótido modificado por ingeniería genética para poder expresarse en una célula de una planta para la cual se desea la generación de plantas transgénicas). También están presentes sobre este vector plásmido las secuencias requeridas para la replicación bacteriana. Las secuencias que actúan en forma cis se disponen en una forma que permita una transferencia eficiente dentro de las células de una planta y su expresión en ellas. Por ejemplo, la secuencia del marcador seleccionable y la secuencia de interés están localizadas entre los bordes izquierdo y derecho. A menudo un segundo vector plásmido contiene los factores que actúan en forma trans que median la transferencia de T-ADN de Agrobacterium a las células de la planta. Este plásmido contiene a menudo las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de células de la planta por Agrobacterium, y la transferencia del ADN por medio de escisión en las secuencias del borde y la transferencia de ADN mediada por vir, como se entiende en el arte (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5: 446 - 451). Se pueden utilizar diferentes tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para la transformación de la planta. El segundo vector plásmido no es necesario para la introducción de polinucleótidos dentro de las plantas por medio de otros métodos tales como microproyección, microinyección, electroporación, polietilén glicol, etc.

D. Transformación de la planta

Los métodos de la invención involucran la introducción de una construcción nucleótidos en una planta. Por "introducción" se entiende presentar a la planta la construcción de nucleótido de tal forma que la construcción gane acceso hacia el interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren que se use un método particular para introducir una construcción de nucleótidos a una planta, únicamente que la construcción de nucleótidos gane acceso al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir construcciones de nucleótidos en plantas son conocidos en el arte incluyendo, pero sin limitarse a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitorios, y métodos mediados por virus.

En general, los métodos de transformación de plantas involucran la transferencia de ADN heterólogo dentro de células de plantas objetivo (por ejemplo embriones maduros o inmaduros, cultivos en suspensión, callo no diferenciado, protoplastos, etc.), seguido por la aplicación de un nivel de umbral máximo de selección apropiada (dependiendo del gen marcador seleccionable y en este caso "glifosato") para recubrir las células de la planta transformadas de un grupo de una masa no transformada de células. Los explantes típicamente son transferidos a un suministro fresco del mismo medio y cultivados en forma rutinaria. Posteriormente, las células transformadas se diferencian en brotes después de colocarlos sobre medio de regeneración suplementado con un nivel de umbral máximo de agente de selección (por ejemplo "glifosato"). Los brotes son luego transferidos a un medio selectivo de enraizamiento para recuperar los brotes o las plántulas enraizadas. Las plántulas transgénicas crecen luego hasta plantas maduras y producen semillas fértiles (por ejemplo Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6: 271 - 282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745 - 750). Los explantes son típicamente transferidos a un suministro fresco del mismo medio y cultivados en forma rutinaria. Una descripción general de las técnicas y métodos para generar plantas transgénicas se encuentra en Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13: 219 - 239 y Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42: 107 - 120. Ya que el material transformado contiene muchas células, tanto células transformadas como no transformadas están presentes en cualquier pedazo de callo o tejido o grupo de células objetivo sometido. La habilidad para matar células no transformadas y permitir que las células transformadas proliferen resulta en cultivos de plantas transformadas. A menudo, la habilidad para remover células transformadas es una limitación para recuperar rápidamente las células de plantas transformadas y la generación exitosa de plantas transgénicas. Se pueden utilizar métodos moleculares y bioquímicos para confirmar la presencia del gen heterólogo integrado de interés en el genoma de plantas transgénicas.

La generación de plantas transgénicas se puede formar por medio de uno de diferentes métodos, incluyendo, pero sin limitarse a, la introducción de ADN heterólogo por medio de Agrobacterium en células de plantas (transformación mediada por Agrobacterium), bombardeo de células de plantas con ADN foráneo heterólogo adherido a partículas, y otros métodos diferentes no mediados directamente por partículas (por ejemplo Hiei et al. (1994) The Plant Journal

6: 271 - 282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745 - 750; Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13: 219 - 239; Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42: 107 - 120) para transferir ADN.

Los métodos para transformación de cloroplastos son conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526 - 8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913 - 917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12: 601 - 606. El método se basa en el suministro por medio de una pistola de partículas de ADN que contiene un marcador seleccionable y dirigir el ADN al genoma del plástido a través de recombinación homóloga. Adicionalmente, la transformación del plástido puede lograrse por medio de transactivación de un transgén transmitido por un plástido silencioso por expresión preferida en el tejido de una ARN polimerasa dirigida al plástido y codificada en el núcleo. Tal sistema ha sido reportado en McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA

91: 7301 - 7305.

Las células que han sido transformadas pueden desarrollarse hasta plantas de acuerdo con métodos convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81 - 84. Estas plantas pueden ser luego cultivadas, y o bien polinizadas con la misma cepa transformada o con diferentes cepas, e identificado el híbrido resultante que tiene expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para garantizar que la expresión de la característica fenotípica deseada sea mantenida en una forma estable, y heredada y luego cosechadas las semillas para garantizar que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. En esta forma, la presente invención provee semillas transformadas (también llamadas "semillas transgénicas") que tiene una construcción de nucleótidos de la invención, por ejemplo, un casete de expresión de la invención, incorporado en forma estable en su genoma.

E. Evaluación de la transformación de la planta

Después de la introducción del ADN foráneo heterólogo en células de plantas, se confirma la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma de la planta por medio de diferentes métodos tales como el análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado.

El análisis por medio de la PCR es un método rápido para seleccionar células, tejido o brotes transformados por la presencia del gen incorporado en la etapa temprana antes de trasplantarlos en el suelo (Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)). La PCR se lleva a cabo utilizando iniciadores oligonucleótidos específicos para el gen de interés o con el respaldo del vector de Agrobacterium, etc.

La transformación de la planta puede sr confirmada por medio de un análisis de transferencias tipo Southern del ADN genómico (Sambrook y Russell (2001), ver más arriba). En general, se extrae el ADN del transformante, de digiere con enzimas de restricción apropiadas, se lo fracciona en un gel de agarosa y transfiere a una membrana de nitrocelulosa o de nylon. La membrana o la "transferencia" puede ser probada luego, por ejemplo, con un fragmento de ADN objetivo marcado en forma radioactiva con 32P para confirmar la integración del gen introducido en el genoma de la planta de acuerdo con técnicas estándar (Sambrook y Russell, 2001, ver más arriba).

En análisis tipo Northern, se aísla ARN de tejidos específicos del transformante, fraccionado en un gel de agarosa/ formaldehido, y transferido sobre un filtro de nylon de acuerdo con procedimientos estándar que son rutinariamente utilizados en el arte (Sambrook y Russell (2001), ver más arriba). Se analiza luego la expresión del ARN codificado por secuencias grg de la invención por medio de hibridación del filtro con una sonda radioactiva derivada de un GDC por medio de métodos conocidos en el arte (Sambrook y Russell (2001), ver más arriba).

Se pueden llevar a cabo transferencia tipo Western y ensayos bioquímicos y similares sobre las plantas transgénicas para determinar la presencia de proteína codificada por el gen de resistencia al herbicida por medio de procedimientos estándar (Sambrook y Russell (2001), ver más arriba) utilizando anticuerpos que se unen a uno o más epítopos presentes sobre la proteína de resistencia al herbicida.

En un aspecto de la invención, los genes grg descritos aquí son útiles como marcadores para evaluar la transformación de células bacterianas o de plantas.

F. Plantas y partes de plantas

Por "planta" se entiende plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células de plantas, propágulos, embriones y progenie de los mismos. Las células de las plantas pueden ser diferenciadas o no diferenciadas (por ejemplo, callo, células en cultivo en suspensión, protoplastos, células de hojas, células de raíces, células de floema, polen). La presente invención puede ser utilizada para la introducción de polinucleótidos en cualquier especie de planta, incluyendo, pero sin limitarse a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas de interés incluyen, pero sin limitarse a, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza de semillas oleaginosas, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, cártamo, cacahuetes, camote, yuca, café, coco, piña, cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, olivo, papaya, marañón, macadamia, almendras, avena, hortalizas, plantas ornamentales, y coníferas.

Las hortalizas incluyen, pero sin limitarse a, tomates, lechuga, judías verdes, habas, guisantes, y los miembros del género Curcumis tales como pepino, cantalupo y melón. Las plantas ornamentales incluyen, pero sin limitarse a, azalea, hortensia, hibiscos, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, claveles, flor de pascua, y crisantemo. También son de interés plantas de cultivo, incluyendo, por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza de semillas oleaginosas, etc.

Esta invención es adecuada para cualquier miembro de la familia de las plantas monocotiledóneas incluyendo, pero sin limitarse a, maíz, arroz, cebada, avena, trigo, sorgo, centeno, caña de azúcar, piña, estambres, cebolla, plátano, coco, y dátiles.

G. Métodos para incrementarla productividad de las planta

Se proveen métodos para incrementar la productividad de las plantas. Los métodos comprenden la introducción en una planta o en una célula de una planta de un polinucleótido que contiene una secuencia grg divulgada aquí. Como se define aquí, la "productividad" de la planta se refiere a la calidad y/o cantidad de biomasa producida por la planta. Por "biomasa" se entiende cualquier producto vegetal medible. Un incremento en la producción de biomasa es cualquier mejora en la productividad del producto vegetal medido. El incremento de la productividad vegetal tiene diferentes aplicaciones comerciales. Por ejemplo, el incremento en biomasa de hojas de la planta puede incrementar la productividad de hortalizas de hoja para consumo humano o animal. Adicionalmente, se puede utilizar el incremento en biomasa de hojas para incrementar la producción de productos industriales o farmacéuticos derivados de las plantas. Un incremento en la productividad puede incluir cualquier incremento estadísticamente significativo incluyendo, pero sin limitarse a, al menos un incremento del 1%, al menos un incremento del 3%, al menos un incremento del 5%, al menos un incremento del 10%, al menos un incremento del 20%, al menos un incremento del 30%, al menos un incremento del 50%, al menos un incremento del 70%, al menos un incremento del 100% o un incremento superior.

En métodos específicos, se trata la planta con una concentración efectiva de un herbicida, donde la aplicación del herbicida resulta en una mayor productividad planta. Por "concentración efectiva" se entiende la concentración que permite la mayor productividad en la planta. Tales concentraciones efectivas para herbicidas de interés son generalmente conocidas en el arte. Se puede aplicar el herbicida ya sea antes o después de que emerjan las plantas de acuerdo con técnicas usuales para aplicación de herbicidas a los campos que contienen los cultivos que se han hecho resistentes a los herbicidas por medio de expresión heteróloga de un gen grg de la invención.

Se proporcionan también métodos para conferir resistencia a los herbicidas en una planta o parte de una planta. En tales métodos, se introduce en la planta un polinucleótido grg divulgado aquí, en donde la expresión del polinucleótido resulta en tolerancia o resistencia al glifosato. Las plantas producidas a través de este método pueden ser tratadas con una concentración efectiva de un herbicida y mostrar una mayor tolerancia al herbicida. Una "concentración efectiva" de un herbicida en esta solicitud es una cantidad suficiente para disminuir o detener el crecimiento de plantas o partes de plantas que no son naturalmente resistentes o que se volvieron resistentes al herbicida.

H. Métodos para controlar malas hierbas en un campo

Se proporcionan también métodos para controlar selectivamente malas hierbas en un campo que contiene una planta. En una modalidad, las semillas de una planta o las plantas son resistentes al glifosato como resultado de la inserción de un polinucleótidos grg divulgado aquí en la semilla de la planta o en la planta. En métodos específicos, se trata la planta con una concentración efectiva de un herbicida, donde la aplicación del herbicida resulta en un control selectivo de malas hierbas o de otras plantas no transformadas. Por " concentración efectiva" se entiende la concentración que controla el crecimiento o la propagación de malas hierbas o de otras plantas no transformadas sin afectar significativamente la semilla de la planta o la planta resistente al glifosato. Tales concentraciones efectivas para herbicidas de interés son generalmente conocidas en el arte. El herbicida puede ser aplicado ya sea antes o después de que emerja la planta de acuerdo con técnicas usuales para aplicación de herbicidas a los campos que contienen las plantas o las semillas de las plantas que se han vuelto resistentes al herbicida.

1. Espectro de temperatura

Se han llevado a cabo diferentes estudios del metabolismo del glifosato en plantas, y revelaron que el glifosato no es metabolizado por las plantas o es metabolizado muy lentamente. El glifosato penetra rápidamente la cutícula, y se desplaza a lo largo de las plantas durante un período de tiempo considerable (revisado en Kearney y Kaufman, Eds (1988) Herbicides; Chemistry, Degradation & Mode of Action Marcel Dekker , Inc., New York, 3: 1 - 70 y Grossbard y Atkinson, Eds. (1985) The Herbicide Glifosato Butterworths, London, páginas 25 - 34). Por lo tanto, es probable que sea necesaria la tolerancia al glifosato durante un período de tiempo prolongado seguido por exposición al glifosato en plantas agronómicamente importantes. Donde las temperaturas frecuentemente exceden los 30°C durante el período vegetativo, sería conveniente emplear una EPSP sintasa de tolerancia que mantiene su actividad a temperaturas elevadas.

En una modalidad de la presente invención, la EPSP sintasa exhibe estabilidad térmica a una temperatura que es mayor o menor que la temperatura ambiental. Por " estabilidad térmica" se entiende que la enzima es activa a una temperatura mayor o menor que la temperatura ambiente durante un período más prolongado tiempo que una EPSP sintasa que no es térmicamente estable a esa temperatura. Por ejemplo, EPSP sintasa térmicamente estable tiene actividad enzimática aproximadamente durante más de 1 hora, aproximadamente durante más de 2 horas, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25 horas, o más, a una temperatura que es mayor o menor que la temperatura ambiente. Para los propósitos de la presente invención, la temperatura "ambiente" es aproximadamente de 30°C. En algunas modalidades, una temperatura superior a la ambiental es una temperatura aproximadamente de o superior a 32°C, aproximadamente 34°C, aproximadamente 37°C, aproximadamente 40°C, aproximadamente 45°C, aproximadamente 50°C, aproximadamente 55°C, aproximadamente 60°C, aproximadamente 65°C, o superior. Una temperatura inferior a la ambiental es una temperatura aproximadamente de o inferior a 28°C, aproximadamente inferior a 27°C, aproximadamente 26°C, aproximadamente 25°C, aproximadamente 23°C, aproximadamente 20°C, aproximadamente 18°C, aproximadamente 15°C, aproximadamente 10°C, aproximadamente de o inferior a 5°C, o alrededor de 0°C. Los métodos para analizar la actividad de la EPSP sintasa son discutidos con más detalle aquí en otra parte. Para los propósitos de la presente invención, se considera a una EPSP sintasa térmicamente activa cuando funciona aproximadamente del 90% al 100%, aproximadamente del 80% hasta aproximadamente el 90%, aproximadamente del 70% hasta aproximadamente el 80%, aproximadamente del 60% hasta aproximadamente el 70% o aproximadamente del 50% hasta aproximadamente el 60% del nivel de actividad máximo observado a la temperatura óptima para esa enzima.

Por lo tanto, aquí se proporcionan métodos y composiciones para incrementar la tolerancia al glifosato a temperaturas superiores a la temperatura ambiente. En una modalidad, los métodos comprenden la introducción en una planta de una secuencia de nucleótidos que codifica a la enzima EPSP sintasa para tolerancia al glifosato expuesta en las SEQ ID NOs: 8, 10, 14, 28, 30, 32, ó 34, y el cultivo de la planta a una temperatura superior a la temperatura ambiente. En modalidades específicas, la temperatura del cultivo es superior a la temperatura ambiente durante un promedio de al menos aproximadamente 2 horas por día, al menos aproximadamente 3 horas por día, al menos aproximadamente 4 horas por día, al menos aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 14, aproximadamente 16, aproximadamente 18, aproximadamente 20, al menos aproximadamente 22 horas por día, o hasta aproximadamente 24 horas por día durante el período vegetativo de la planta.

En otro modalidad, el método comprende la introducción en una planta de una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima EPSP sintasa para tolerancia al glifosato expuesta en las SEQ ID NOs: 8, 10, 14, 28, 30, 32, ó 34, poniendo en contacto la planta con una concentración efectiva de herbicida de glifosato, y cultivando la planta a una temperatura que excede la temperatura ambiente durante al menos 1 hora, aproximadamente al menos 2 horas, aproximadamente al menos 3, aproximadamente al menos 4, o más horas por día durante al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20 o más días después de aplicar el glifosato a la planta, en donde los días en los cuales la temperatura excede la temperatura ambiente se presentan durante el período vegetativo de la planta.

Se ofrecen los siguientes ejemplos a manera de ilustración y no como una limitación.

Parte experimental

Ejemplo 1. Diseño y expresión de syngrg 23

GRG23 (SEQ ID NO: 2) es una EPSP sintasa que posee excelentes valores cinéticos para Km, Ki y Vmáx (Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 60/ 741.166 presentada en diciembre 1 de 2005). Se diseñó y sintetizó una nueva secuencia de genes que codifica la proteína GRG23 (Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 60/741.166 presentada en diciembre 1 de 2005). Se suministra aquí la secuencia resultante como la SEQ ID NO: 6, y denominada aquí como "syngrg23". Se clonó el marco de lectura abierto en el vector de expresión pRSF1b (Invitrogen) por medio de métodos conocidos en el arte.

El gen syngrg23 que codifica GRG23 fue clonado en un vector pUC19 para crear pAX748. Se utilizaron iniciadores para la PCR que flanqueaban a syngrg23 en este vector para amplificar syngrg23 a partir del pAX748 utilizando el sistema Mutazyme II (Stratagene) para introducir mutaciones al azar en la región de codificación de syngrg23. Se diluyó la plantilla 1:50 en la reacción PCR propensa a errores, y se llevó a cabo la aplicación durante 30 ciclos. Se digirió el producto PCR resultante con las enzimas de restricción BamHI y Sgs I, se purificó en gel, y ligó dentro del vector pRSF1b para crear una biblioteca multada de syngrg23.

Las bibliotecas multadas de syngrg23 fueron transformadas en la cepa BL21*DE3 star de E. coli (Invitrogen). Después de la transformación, se sembraron en placas colonias individuales sobre medio 1 x M63 que contenía glifosato 150 mM para seleccionar los clones que tenían actividad enzimática retenida y tolerancia al cultivo.

Ejemplo 2. Detección de resistencia al glifosato sobre placas

Se transformaron ligaciones de bibliotecas dentro de células de E. coli competentes de BL21*DE3 (Invitrogen). Se llevaron a cabo las transformaciones de acuerdo con las instrucciones del fabricante con las siguientes modificaciones. Después de incubación durante 1 hora a 37°C en medio SOC, se sedimentaron las células por medio de centrifugación (5 minutos, 1000 x g, 4°C). Se lavaron las células con 1 ml de M63+, se centrifugó nuevamente, y se decantó el sobrenadante. Se lavaron las células una segunda vez con 1 ml de M63+ y se resuspendió en 200 ul de M63+.

5

Para la selección de enzimas GRG23 mutantes que confieren resistencia al glifosato en E. coli, se sembraron en placa las células sobre medio agar M63+ que contenía glifosato 150 mM, IPTG 0,05 mM (isopropil-beta-Dtiogalactopiranósido), y 50 μg/ml de kanamicina. El medio M63+ contiene KH2PO4 100 mM, (NH4)2SO4 15 mM, CaCl2 50 μM, FeSO4 1 μM, MgCl2 50 μM, glucosa 55 mM, 25 mg/litro de L-prolina, 10 mg/litro de clorhidrato de tiamina,

10 suficiente NaOH para ajustar el pH en 7,0, y 15 g/litro de agar. Se incubaron las placas durante 36 horas a 37°C.

Se seleccionaron colonias individuales y dispuso en placas de 384 pozos. Se crearon dos placas de 384 pozos de esta manera. Se seleccionó una tercera placa de 384 clones a partir de las colonias que crecieron sobre placas que carecían de glifosato.

15

Ejemplo 3. Aislamiento y análisis de variantes de GRG23 resistentes al glifosato

Se identificaron las células BL21*DE3 transformadas con variantes mutadas de syngrg23 y/ o grg23 por medio de cultivo sobre placas de glifosato. Se prepararon extractos de variantes mutadas de syngrg23 y grgr23 y se los 20 analizó por la actividad enzimática mejorada. Se inmovilizaron las colonias identificadas sobre placas de glifosato en bloques de 96 pozos que contenían medio LB y se las cultivó hasta una O.D. aproximadamente de 0,6. Se añadió luego IPTG (0,5 mM) y se incubaron los bloques durante la noche a 20°C para inducir la expresión de la proteína. Se prepararon extractos de proteína a partir de los precipitados celulares utilizando reactivo de cultivo POP (Novagen) y Lysonase (Novagen), y se midió la actividad enzimática en los lisados crudos después de calentar los extractos

25 durante 30 min a 37°C. Se seleccionaron los extractos con una actividad mayor a dos desviaciones estándar por encima de la media de un grupo de extractos que contenía la proteína apropiada de control (por ejemplo GRG23) para análisis adicionales.

Los clones que muestran mayor actividad después de incubación como extractos crudos fueron cultivados en 250

30 mL de cultivos de LB, y se indujo expresión de la proteína con IPTG. Después de la inducción, se purificó la proteína mutante GRG23 de cada cultivo por medio de cromatografía de afinidad utilizando una resina de cobalto (Novagen). Se analizaron luego las proteínas purificadas por la actividad enzimática después del calentamiento durante 0, 2, 4, y aproximadamente 16 horas a 37°C.

35 Ejemplo 4. Variantes mejoradas de GRG23.

A partir de una biblioteca de ADN de syngrg23 mutado, se identificaron diferentes clones con actividad mejorada a 37°C. Se determinaron las secuencias de ADN de los clones correspondientes a estos extractos. La Tabla 1 muestra los cambios de aminoácidos identificados en seis variantes de GRG23 que retuvieron la resistencia al glifosato:

40 grg23(L3P1.B20) (SEQ ID NO: 20) que codifica la secuencia de aminoácidos GRG23(L3P1.B20) (SEQ ID NO: 21), grg23(L3P1.B3) (SEQ ID NO: 22) que codifica la secuencia de aminoácidos grg23(L3P1B3) (SEQ ID NO: 23); GRG23(L3P1F18) (SEQ ID NO: 24) que codifica la secuencia de aminoácidos GRG23(L3P1.F18) (SEQ ID NO: 25); y, grg23(L3P1.O23) (SEQ ID NO: 26) que codifica la secuencia de aminoácidos GRG23(L3P1.O23) (SEQ ID NO: 27).

45 Tabla 1. Mutaciones identificadas en variantes de GRG23 resistentes al glifosato

Clon

Aminoácido (AA) en GRG23

L3P1B20

V206I

L3P1B3

D75H, E217K

L3P1F18

T274I

L3P1O23

R5H

Se cultivaron los clones en 250 mL de cultivos de LB, y se aisló la expresión de la proteína inducida como se describe más arriba. Se analizaron luego las proteínas purificadas por la actividad enzimática después de

16

calentamiento durante 0, 2, 4, y aproximadamente 16 horas a 37°C. Se encontró que uno de los clones, llamado "M5", retenía una proporción mayor de su actividad enzimática después de una incubación prolongada a 37°C (Tabla 2). Se determinó la secuencia de ADN de estos clones, y se denominó aquí al gen como grg23(ace1) (SEQ ID NO: 8). La proteína expresada a partir de grg23(ace1) se denominó como GRG23(ACE1) (SEQ ID NO: 9).

Tabla 2. Vida media de GRG23(ACE1) vs. GRG23 a temperatura elevada

Proteína

Vida media a 37°C (horas)

GRG23

7

GRG23(ACE1)

15,5

GRG23(ACE1) contiene 2 sustituciones de aminoácidos con relación a la proteína GRG23 de tipo silvestre: A49→T y S276→T. El vector pRSFIb que contiene este gen se denomina pAX3801. La Figura 1 muestra la estabilidad relativa de GRG23 (ACE1) vs. GRG23 a temperaturas elevadas.

Ejemplo 5. Determinación de la actividad de EPSPS de variantes de GRG-23

Se analizaron los extractos que contenían proteínas de la variante GRG23 por la actividad de EPSP sintasa como se describe en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Número 60/741.166 presentada el 1 de diciembre de 2005. Se llevaron a cabo análisis en un volumen final de 50 ul que contenía shiquimato-3-fosfato 0,5 mM, fosfoenolpiruvato (PEP) 200 uM, 1 U/ml de xantina oxidasa, 2 U/ml del nucleósido fosforilasa, inosina 2,25 mM, 1 U/ml de peroxidasa de rábano, glifosato 2 mM, HEPES/KOH 50 mM pH 7,0, KCl 100 mM, y AMPLEX® Red (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se incubaron los extractos con todos los componentes del ensayo excepto shiquimato-3-fosfato durante 5 minutos a temperatura ambiente, y se iniciaron los ensayos por medio de la adquisición de shiquimato-3-fosfato. Se midió la actividad de la EPSP sintasa utilizando un espectrómetro de fluorescencia Spectramax Gemini XPS (Molecular Dynamics, excitación: 555 nm; emisión: 590 nm).

Se llevó a cabo una determinación completa de los parámetros cinéticos sobre proteína purificada como se describió previamente (Solicitud de Patente D de los Estados Unidos Número 60/ 741.166 presentada en diciembre 1 de 2005) ajustando la cantidad de proteína determinada por medio del ensayo de Bradford como se conoce en el arte. Para cualquier concentración de glifosato, se midió la actividad de la EPSP sintasa en función de un amplio rango de concentraciones de PEP. Los datos se ajustaron a la ecuación de Michaelis-Menten utilizando el software KALEIDAGRAPH® (Synergy Software) y se la utilizó para determinar el Km (Km aparente) de la EPSP sintasa con esa concentración de glifosato. Se determinaron los valores de Km aparente con no menos de cuatro concentraciones de glifosato, y se calculó el Ki de la EPSPS para glifosato a partir del gráfico de Km aparente vs. la concentración de glifosato, utilizando la ecuación (ml*x/(m2+x); ml = 1; m2 = 1) como se conoce en el arte.

Tabla 3. Cinéticas de GRG23(ACE1) vs. GRG23

Km (uM)

Ki (uM) Vmáx (nmol/min/ug)

GRG23

12,2 13.800 14,77

GRG23(ACE1)

9,7 14.620 13,73

Ejemplo 6. Identificación de grg23 (ace2).

GRG23(ACE1) contiene dos cambios de aminoácidos con relación a GRG23. Para determinar si sustituciones adicionales en estas posiciones podrían mejorar adicionalmente la actividad, se generó una bibliotecaria de ADN que resultó en clones que expresan proteínas que estaban sustancialmente multadas en las posiciones 49 y 276 correspondientes a GRG23 (SEQ ID NO: 2). Se seleccionaron los clones que confieren resistencia al glifosato por medio del cultivo sobre placas de glifosato, y se los cultivó y analizó por las propiedades cinéticas descritas.

Sorprendentemente, un clon, denominado aquí grg23(ace2) (SEQ ID NO: 10), que codifica la proteína GRG23(ACE2) (SEQ ID NO: 11) fue identificado o tener una mejor estabilidad térmica. La secuencia de ADN de grg23(ace2) muestra que GRG23(ACE2) contiene un solo cambio de aminoácido (el residuo 276 de GRG23 por arginina).

Ejemplo 7. Comparación de GRG23 y GRG51, y mutagénesis de diferentes residuos.

5

Se generaron dos bibliotecas para evaluar las permutaciones de posibles secuencias de aminoácidos a partir de la comparación de las secuencias de aminoácidos de GRG23 y de GRG51. La primera biblioteca introdujo una variación a partir de la secuencia de aminoácidos de GRG51 en una región de codificación de grg23(ace2). La segunda biblioteca introdujo la variación a partir de la secuencia de aminoácidos de GRG23(ACE2) dentro de la

10 región de codificación de grg51.

Se evaluaron los clones de las bibliotecas resultantes por (1) la habilidad para conferir resistencia al glifosato en una célula, y (2) la actividad después de una incubación prolongada a 37°C. A menudo se secuenció y analizó con más detalle un total de clones. Un clon particular, denominado aquí grg51.4 (SEQ ID NO: 12), que codifica la proteína

15 GRG51.4 (SEQ ID NO: 13), contiene varios cambios de aminoácidos con relación tanto a GRG23(ACE2) como a GRG51. Los cambios de aminoácidos presentes en GRG51.4 con relación a GRG23(ACE2) fueron posteriormente introducidos en el gen grg23(ace2), para producir grg23(ace3) (SEQ ID NO: 14), que codifica la proteína GRG23(ACE3) (SEQ ID NO: 15). GRG23(ACE3) exhibe actividad superior y estabilidad térmica con relación a GRG23, y GRG23(ACE2).

20 Se mutó GRG23(ace1), y se analizaron los clones para identificar los clones que expresan variantes con estabilidad térmica y/o actividad mejoradas. Un clon, grg23(L5P2.J2) (SEQ ID NO: 16), que codifica GRG23(L5P2.J2) (SEQ ID NO: 17), fue identificado en virtud de sus propiedades cinéticas mejoradas. GRG23(L5P2.J2) contiene tres cambios de aminoácidos con relación a GRG23 (ACE1), como se muestra en la siguiente Tabla 4.

25

Tabla 4. Cambios de aminoácidos en GRG23(L5P2.J2)

Aminoácido (AA) en GRG23(L5P2.J2) con relación a GRG23(ACE1)

V101F

A213S

D284N

Se utilizó mutagénesis de oligonucleótidos para modificar la región de codificación de grg23(ace3) para contener

30 cada uno de los cambios de aminoácidos identificados en GRG23(L5P2.J2). Se identificó un clon con un gen que contiene estas modificaciones, y se encontró que codifica una proteína que tiene propiedades cinéticas alteradas sobre GRG23(ACE3). Este gen fue denominado grg23(ace4) (SEQ ID NO: 18). La proteína codificada por grg23(ace4) y denominada como GRG23(ACE4) (SEQ ID NO: 19) contiene un solo cambio de aminoácidos con relación a GRG23(ACE3) (Valina 101 por fenilalanina). Con base en este resultado, se llevó a cabo la mutagénesis

35 de un oligonucleótido separado para analizar las cinéticas de cada sustitución posible de aminoácidos en la posición

101. Ninguno de los cambios de aminoácidos resultó en una mejora adicional en las propiedades cinéticas comparado con GRG23(ACE4). Ver la Tabla 5.

Tabla 5. Cinéticas de variantes mejoradas

40

Km (μM)

Ki (μM) Vmáx (nmol/min/μg)

GRG23

14 10.800 13

GRG51

15 21.048 13

GRG23(ACE1)

10 14.620 14

GRG23(ACE2)

11 18.104 15

GRG51.4

19 26.610 17

GRG23(ACE3)

15 20.000 17

GRG23(L5P2.J2)

15 2.500 23

GRG23(ACE4)

14 5.010 24

Ejemplo 8. Estabilidad térmica mejorada de variantes de GRG23

La estabilidad térmica de GRG23 y de diferentes variantes se determinó por medio de incubación de muestras de proteína a 37°C para un rango de tiempos, determinando luego la actividad residual de EPSPS como se describe aquí, y comparando la actividad con aquella de una muestra de control incubada a 4°C. La Tabla 6 muestra que las variantes de GRG23, GRG23(ACE1), GRG23(ACE2), y GRG23(ACE3) tienen una mejor estabilidad térmica.

Tabla 6. Estabilidad térmica de las variantes GRG23 y GRG23

Proteína

t1/2 a 37°C

GRG23

10,1

GRG23(ACE1)

15,3

GRG23(ACE2)

34,2

GRG23(ACE3)

65,4

10

Ejemplo 9. Variantes de grg23(ace3)

Se utilizó mutagénesis de oligonucleótidos para generar variantes de grg23(ace3) que resulta en la expresión de proteínas con modificaciones para los residuos aminoácidos correspondientes a las posiciones 169 a 174 de la SEQ 15 ID NO: 15. Las reacciones de mutagénesis fueron llevadas a cabo utilizando el kit de QuickChange® (Stratagene)de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transformaron los clones del plásmido en la línea de células BL21*DE3 de E. coli, y se indujo la expresión de proteínas por medio de IPTG como se conoce en el arte. Se purificaron las proteínas por medio de enlazamiento de afinidad con una columna de níquel (resina de afinidad con metal TALON, Clontech). La proteína nativa GRG23(ace3) fue también expresada y purificada para uso como

20 control. Después de la purificación de cada enzima, se midió la concentración de proteína por medio del ensayo de Bradford como se conoce en el arte.

Ejemplo 10. Análisis cinético de las variantes de GRG23(ace3)

25 Las variantes de GRG23(ace3), GRG23(ace3) R173K (SEQ ID NO: 29, codificada por la SEQ ID NO: 28), GRG23(ace3) G169V/L170V (SEQ ID NO: 31, codificada por la SEQ ID NO: 30), GRG23(ace3) R173Q (SEQ ID NO: 33, codificada por la SEQ ID NO: 32), y GRG23(ace3) I174V (SEQ ID NO: 35, codificada por la SEQ ID NO: 34) fueron caracterizadas por medio de ensayos enzimáticos como se describe aquí, y comparadas con la enzima nativa GRG23(ace3). Para cada enzima se determinó la Km(aparente) para cada una de las diferentes concentraciones de

30 glifosato, y se utilizó un gráfico de Km(aparente) vs. la concentración de glifosato para calcular la Ki para cada enzima. Se evaluó la estabilidad térmica para cada enzima por incubación de la enzima a 37°C durante 16 horas, y luego se cuantificó la actividad enzimática restante (como Vmáx) vs. la enzima de control que fue incubada a 4°C.

El análisis cinético revela que GRG23(ace3)R173K, GRG23(ace3)R173Q, GRG23(ace3)I174V y GRG23

35 (ace3)G169V/L170V son virtualmente indistinguibles de la GRG23(ace3) nativa y muestra una velocidad catalítica casi idéntica, una resistencia extremadamente alta al glifosato, y muy buena afinidad por PEP. La Km observada para PEP de 19 μM para G169V/L170V (vs. 15 μM para GRG23(ace3) puede representar una afinidad de enlazamiento ligeramente menor para PEP con relación a GRG23(ace3). Cada una de las cuatro variantes tenía una estabilidad térmica superior al 95% después de 16 horas a 37°C. Los valores cinéticos determinados para las

40 variantes de GRG23(ace3), GRG23(ace3) R173K, GRG23(ace3) R173Q, y GRG23(ace3) I174V se muestran en la Tabla 6.

Tabla 7. Cinéticas de variantes de GRG23(ace3)

Km (μM)

Ki (mM) Vmáx (nmol/min/μg)

GRG23(ace3)

16 14 16

GRG23(ace3) R173K

16,6 14,7 17,7

GRG23(ace3) R173Q

14,3 14,2 15,8

GRG23(ace3) 1174V

15,5 15,0 15,5

Ejemplo 11. Clonación de las variantes syngrg23 y grg23 en un casete de expresión de la planta.

5

Para syngrg23, y cada una de las variantes de grg23 descritas aquí (incluyendo, por ejemplo, grg23(ace1), grg23 (ace2), grg23(ace3), grg23(ace4), grg23(ace3)R173K, grg23(ace3)R173Q, grg23(ace3)I174V, grg23(ace3)G169V/ L170V y grg23(L5P2.J2)), se amplifica el marco de lectura abierto (ORF) por medio de la PCR de una plantilla de ADN de longitud completa. Se añaden sitios de restricción de Hind III a cada extremo de los ORF durante la PCR.

10 Adicionalmente, se añade la secuencia de nucleótidos ACC inmediatamente 5’ al codón de inicio del gen para incrementar la eficiencia de la traducción (Kozak (1987) Nucleic Acids Research 15: 8125 - 8148; Joshi (1987) Nucleic Acids Research 15: 6643 - 6653). El producto de la PCR se clona y secuencia utilizando técnicas bien conocidas en el arte para garantizar que no se introduzcan mutaciones durante la PCR.

15 El plásmido que contiene el producto de la PCR se digiere con Hind III y se aísla el fragmento que contiene el ORF intacto. Este fragmento se clona dentro del sitio de Hind III de un plásmido tal como pAX200, un vector de expresión de una planta que contiene al promotor de actina del arroz (McElroy et al. (1991) Molec. Gen. Genet. 231: 150 - 160) y al terminador de PinII (An et al. (1989) The Plant Cell 1:115-122). El fragmento promotor - gen - terminador de este plásmido intermedio es luego subclonado dentro del plásmido pSB11(Japan Tobacco, Inc.) para formar un plásmido

20 final con base en pSB11. En algunos casos, puede ser preferible generar una construcción alterna en la cual se codifica una secuencia líder de cloroplasto como una fusión con el terminal N de las construcciones syngrg23, grg23(ace1), grg23(ace2), grg23(ace3), grg23(ace4), grg23(L5P2.J2), grg23(ace3)R173K, grg23(ace3) R173Q, grg23(ace3)I174V, o grg23(ace3)G169V/L170V. Estos plásmidos con base en pSB11 están típicamente organizados de tal manera que el fragmento de ADN que contiene la construcción promotor - gen - terminador, o la construcción

25 promotor - gen líder de cloroplasto - terminador puede ser cortada por medio de una digestión doble por parte de enzimas de restricción, tales como Kpn I y Pme I, y usadas para la transformación en plantas por medio de inyección de un haz de aerosol. La estructura de los clones resultantes con base en pSB11 se verifica por medio de digestión de restricción y electroforesis en gel, y por medio de secuenciación a través de las diferentes uniones de la clonación.

30 El plásmido se moviliza dentro de la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens que también alberga al plásmido pSB1 (Japan Tobacco, Inc.), utilizando procedimientos de conjugación triparental bien conocidos en el arte, y sembrando en placa sobre medio que contiene espectinomicina. El clon del plásmido con base en pSB11 tiene resistencia a la espectinomicina pero es un plásmido de rango estrecho como huésped y no puede replicarse en

35 Agrobacterium. Las colonias resistentes a espectinomicina surgen cuando los plásmidos con base en pSB 11 se integran dentro del plásmido de rango amplio como huésped pSB1 a través de recombinación homóloga. El producto integrado en forma conjunta de pSB1 y el plásmido con base en pSB11 se verifica por medio de hibridación tipo Southern. La cepa de Agrobacterium que alberga al integrado en forma conjunta es utilizada para transformar maíz por medio de métodos conocidos en el arte, tales como, por ejemplo, el método PureIntro (Japan Tobacco).

40

Ejemplo 12. Transformación células de plantas por medio de transformación mediada por Agrobacterium

Las espigas de maíz son recolectadas preferiblemente 8 - 12 días después de la polinización. Se aíslan los embriones de las espigas, y se prefieren aquellos embriones con un tamaño de 0,8 - 1,5 mm para uso en la 45 transformación. Se siembran los embriones en placa con el escutelo hacia arriba sobre un medio adecuado de incubación, tal como el medio DN62A5S (3,98 g/L de Sales N6; 1 ml/L (de Patrón 1000x) de Vitaminas N6; 800 mg/L de L-Asparagina; 100 mg/L de Myo-inositol; 1,4 g/L de L-Prolina; 100 mg/L de ácidos Casamino; 50 g/L de sacarosa; 1 ml/L (de un patrón de 1 mg/ml) de 2,4-D). Sin embargo, se conocen en el arte medios y sales adecuadas y

diferentes a DN62A5S. Se incuban los embriones durante la noche a 25°C en la oscuridad. Sin embargo, realmente no es necesario incubar los embriones durante la noche.

Los explantes son transferidos a mallas cuadradas (30 - 40 por placa), transferidos sobre medio osmótico 5 aproximadamente durante 30 - 45 minutos, luego transferidos a una placa radiante (ver, por ejemplo, la Publicación PCT No. WO/0138514 y la Patente de los Estados Unidos No. 5.240.842).

Las construcciones de ADN diseñadas para expresar las proteínas GRG de la presente invención en células de plantas son aceleradas dentro del tejido de la planta utilizando un acelerador de un haz en aerosol, utilizando 10 condiciones esencialmente como las descritas en la Publicación PCT No. WO/0138514. Después de irradiación, se incuban los embriones aproximadamente durante 30 min sobre medio osmótico, y se colocan sobre medio de incubación durante la noche a 25°C en la oscuridad. Para evitar dañar en forma indebida a los explantes irradiados, si los incuba al menos durante 24 horas antes de transferirlos a un medio de recuperación. Se esparcen luego los embriones sobre un medio durante el período de recuperación, aproximadamente durante 5 días, 25°C en la 15 oscuridad, luego son transferidos a un medio de selección. Se incuban los explantes en un medio de selección hasta por ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y características de la selección particular utilizada. Después del periodo de selección, se transfiere el callo resultante al medio de maduración del embrión, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Se colocan luego los embriones somáticos resultantes maduros bajo una luz tenue, y se inicia el proceso de regeneración por medio de métodos conocidos en el arte. Se permite que los

20 brotes resultantes formen raíces sobre medio de enraizamiento, y se transfieren las plantas resultantes a macetas y se propagan como plantas transgénicas.

Materiales

25 Medio DN62A5S

Componentes

por litro Fuente

Mezcla de Sal Basal N6 de Chu (Prod. No. C 416)

3,98 g/L Phytotechnology Labs

Solución de Vitamina N6 de Chu (Prod. No. C 149)

1ml/L (de 1000x Stock) Phytotechnology Labs

L-Asparagina

800 mg/L Phytotechnology Labs

Myo-inositol

100mg/L Sigma

L-Prolina

1,4 g/L Phytotechnology Labs

Ácidos de Casamino

100 mg/L Fisher Scientific

Sacarosa

50 g/L Phytotechnology Labs

2, 4-D (Prod. No. D-7299)

1m/L (de Patrón de 1 mg/ml) Sigma

Ajustar el pH de la solución a pH 5,8 con KOH 1 N/KCl 1 N, añadir Gelrita (Sigma) hasta 3 g/L, y autoclavar. Después de enfriar hasta 50°C, añadir 2 ml/L de una solución patrón de 5 mg/ml de Nitrato de Plata

30 (Phytotechnology Labs). La receta produce aproximadamente 20 placas.

Ejemplo 13. Transformación de enzimas EPSP sintasa en Células de Planta de Maíz por medio de transformación mediada por Agrobacterium

35 Se recolectan mejor las espigas 8 - 12 días después de la polinización. Se aíslan los embriones de las espigas, y se prefieren aquellos embriones con un tamaño de 0,8 - 1,5 mm para uso en la transformación. Se siembran los embriones en placa con el escutelo hacia arriba sobre un medio adecuado de incubación, y se incuba durante la noche a 25°C en la oscuridad.

40 Sin embargo, realmente no es necesario incubar los embriones durante la noche. Se ponen en contacto los embriones con una cepa de Agrobacterium que contiene los vectores apropiados que tienen un enzima EPSP sintasa de la presente invención para transferencia mediada por el plásmido Ti aproximadamente durante 5 - 10 min, y luego se siembran en placa sobre un medio de cultivo conjunto aproximadamente durante 3 días (25°C en la oscuridad). Después del cultivo conjunto, se transfieren los explantes a un medio durante el periodo de recuperación

45 aproximadamente durante cinco días (a 25°C en la oscuridad). Se incuban los explantes en medio de selección hasta por ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y características de la selección particular utilizada. Después del período de selección, se transfiere el callo resultante a un medio de maduración de embriones, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Se colocan luego los embriones somáticos maduros resultantes bajo una luz tenue, y se inicia el proceso de regeneración como se conoce en el arte. Se permite que los brotes resultantes formen raíces sobre un medio de enraizamiento, y se transfieren las plantas resultantes a macetas y se propagan como plantas transgénicas.

LISTADOS DE SECUENCIA

<110> Laura C. Schouten Cheryl L. Peters Brian Vande Berg Todd K. Hinson

<120> GRG23 EPSP SINTASAS MEJORADAS: COMPOSICIONES Y MÉTODOS DE USO

<130> 45600/336802

<150> 60/972.502

<151> 2007-09-14

<150> 60/872.200

<151> 2006-12-01

<150> 60/861.455

<151> 2006-11-29

<160> 35

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 1892

<212> ADN

<213> Arthrobacter globiformis

<220>

<221> CDS

<222> (178)...(1417)

<221> característica nueva

<222> 1801

<223> n = A,T,C o G

<400> 1

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<210> 2

<211> 413

<212> PRT

<213> Arthrobacter globiformis

<400> 2

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<210> 3

<211> 436

<212> PRT

<213> Arthrobacter globiformis

<400> 3

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<210> 4

<211> 1242

<212> ADN 5 <213> iDesconocida

<220>

<223> aislada de muestra de suelo

<221> CDS

<222> (1)...(1242) 10 <400> 4

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<210> 5

<213> iDesconocida

<220>

<223> aislada de una muestra de suelo

<400> 5

10

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<210> 6

<211> 1242

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> grg23 sintético

<221> CDS

<222> (1)...(1242)

<400> 6

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<210> 7

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> GRG23 sintética

<400> 7

10

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<210> 8

<211> 1242 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> grg23(ace1)

<221> CDS 10 <222> (1)...(1292)

<400> 8

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<210> 9

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> GRG23(ACE1)

<400> 9

10

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<210> 10

<211> 1242

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> grg23(ace2)

<221> CDS

<222> (1)...(1242) 10 <400> 10

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<210> 11

<211> 413

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> GRG23(ACE2)

<400> 11

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<210> 12

<211> 1242 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> grg51.4

<221> CDS 10 <222> (1)...(1242)

<400> 12

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<210> 13

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> GRG51.4

<400> 13

10

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<210> 14

<211> 1242

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> grg23(ace3)

<221> CDS

<222> (1)...(1242) 10 <400> 14

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<210> 15

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> GRG23(ACE3)

<400> 15

10

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<210> 16

<211> 1242

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> grg23(L5P2.J2)

<221> CDS

<222> (1)...(1242) 10 <400> 16

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<210> 17

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> GRG23(L5P2.J2)

<400> 17

10

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<210> 18

<211> 1242 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> grg23(ace4)

<221> CDS 10 <222> (1)...(1292)

<400> 18

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<210> 19

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> GRG23(ACE4)

<400> 19

10

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<210> 20

<211> 1244

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> grg23(L3P1.B20)

<221> CDS

<222> (1)...(1242) 10 <400> 20

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<210> 21

<211> 413

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> GRG23(L3P1.B20)

<400> 21

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<210> 22

<211> 1244 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> grg23(L3Pl.B3)

<221> CDS 10 <222> (1)...(1242)

<400> 22

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<210> 23

<211> 413

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> GRG23(L3P1.B3)

<400> 23

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<210> 24

<211> 1244

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> grg23(L3P1.F18)

<221> CDS

<222> (1)...(1242) 10 <400> 24

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<210> 25

<211> 413

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> GRG23(L3P1.F18)

<400> 25

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<210> 26

<211> 1244 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> grg23(L3P1.023)

<221> CDS 10 <222> (1)...(1242)

<400> 26

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<210> 27

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> GRG23(L3P1.023)

<400> 27

10

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<210> 28

<211> 1244 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia de una variante de grg23(ace3), (grg23(ace3) R173K)

<221> CDS 10 <222> (1)...(1242)

<400> 28

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<210> 29

<211> 413

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia de una variante de GRG23(ace3), (GRG23(ace3) R173K)

<400> 29 <210> 30

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<211> 1244

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia de una variante de grg23(ace3), (grg23(ace3) G169V/L170V)

<221> CDS

<222> (1)...(1242) 10 <400> 30

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<210> 31

<211> 413

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia de una variante de GRG23(ace3), (GRG23(ace3) G169V/L170V)

<400> 31 <210> 32

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<211> 1244 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia de una variante de grg23(ace3), (grg23(ace3) R173Q)

<221> CDS 10 <222> (1)...(1292)

<400> 32

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<210> 33

<211> 413

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia de una variante de GRG23(ace3), (GRG23(ace3) R173Q)

<400> 33 <210> 34

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<211> 1244 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia de una variante de grg23(ace3), (grg23(ace3) 1174V)

<221> CDS 10 <222> (1)...(1242)

<400> 34

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<210> 35

<211> 413

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia de una variante de GRG23(ace3), (GRG23(ace3) I174V)

<400> 35

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REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

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US 4535060 A [0004] [0005] [0025] • WO 9321334 A [0044]

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US 4769061 A [0004] [0005] • WO 9706269 A [0044]

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US 5094945 A [0004] [0005] • WO 9514098 A [0044]

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US 6040497 A [0005] • US 5106739 A [0045]

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US 81309506 P [0006] • US 5164316 A [0045]

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US 5811238 A [0033] • US 5380831 B [0050]

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US 5850019 A [0043] [0045] • US 20010003849 A [0050]

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US 5563328 A [0043] • US 5380831 A [0052]

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US 5378619 A [0043] • US 74116605 P [0078] [0089] [0090]

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WO 9741228 A [0043] • WO 0138514 A [0105] [0106]

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US 4771002 A [0043] • US 5240842 A [0105]

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US 5102796 A [0043] • US 60972502 B [0111]

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US 5182200 A [0043] • US 60872200 B [0111]

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US 5428147 A [0043] • US 60861455 B [0111]

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EP 332104 A [0044]

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McCormick et al. Plant Cell Reports, 1986, vol. 5, 81 - 84 [0059]

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Herbicides; Chemistry, Degradation & Mode of Action. Marcel Dekker, Inc, 1988, vol. 3, 1 - 70 [0073]

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The Herbicide Glifosato. Butterworths, 1985, 25 - 34 [0073]

•

Kozak. Nucleic Acids Research, 1987, vol. 15, 8125 - 8148 [0101]

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Joshi. Nucleic Acids Research, 1987, vol. 15, 6643 - 6653 [0101]

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McElroy et al. Molec. Gen. Genet., 1991, vol. 231, 150 - 160 [0102]

•

An et al. The Plant Cell, 1989, vol. 1, 115 - 122 [0102]

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una molécula de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de:

   a) una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34; y, b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35.

2. 2.

   La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un promotor capaz de dirigir la expresión de una secuencia de codificación en una célula de una planta.

3. 3.

   La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia sintética que ha sido diseñada para expresión en una planta.

4. 4.

   Un vector que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, 2, ó 3, preferiblemente que contiene adicionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo.

5. 5.

   Una célula huésped que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2 ó 3, preferiblemente que es una célula huésped bacteriana o una célula de una planta.

6. 6.

   Una planta transgénica que contiene la célula huésped de la planta de la reivindicación 5, preferiblemente en donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste de maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza de semillas oleaginosas.

7. 7.

   Una semilla transgénica que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, 2, ó 3.

8. 8.

   Un polipéptido recombinante seleccionado del grupo que consiste de:

   a) un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35; y, b) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 28, 30, 32, ó 34, preferiblemente que contiene adicionalmente una secuencia heteróloga de aminoácidos.

9. 9.

   Un método para producir un polipéptido con actividad de resistencia a los herbicidas, que comprende el cultivo de las célula huésped de la reivindicación 5 bajo condiciones en las cuales se expresa una molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido, siendo dicho polipéptido seleccionado del grupo que consiste de:

   a) un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35; y, b) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34.

10. 10.

    Un método para conferir resistencia a un herbicida en una planta, comprendiendo dicho método la transformación de dicha planta con una construcción de ADN, comprendiendo dicha construcción un promotor que dirige la expresión en una célula de una planta operativamente enlazada con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34, y la regeneración de una planta transformada, preferiblemente en donde dicho herbicida es glifosato.

11. 11.

    Una planta que tiene incorporada en forma estable dentro de su genoma una construcción de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad de resistencia los herbicidas, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste de:

    a) una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34; y, b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35; en donde dicha secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión de una secuencia de codificación en una célula de una planta.

12. 12.

    La planta de la reivindicación 11, en donde dicha planta es una célula de una planta, una planta de soja, o una planta de maíz.

13. 13.

    La planta de la reivindicación 11, en donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste de maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza de semillas oleaginosas.

14. 14.

    Un método para incrementar el vigor o la productividad en una planta que comprende un producto: a) proveer una planta que contiene la secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34; b) poner en contacto dicha planta con una concentración efectiva de glifosato; y, c) cultivar dicha planta bajo condiciones en donde la temperatura es más alta que la temperatura del medio ambiente al menos durante dos horas consecutivas por día durante al menos cuatro días después del contacto con dicho glifosato, en donde dichos días después el contacto están dentro del período vegetativo de la planta,

    en donde el vigor o la productividad de dicha planta son mayores al vigor o a la productividad de una planta que expresa una EPSP sintasa de tolerancia al glifosato que no tiene una temperatura óptima más alta que la temperatura del medio ambiente, preferiblemente en donde la temperatura en la etapa (c) es aproximadamente de 32°C hasta aproximadamente 60°C.

15. 15.

    Un método para conferir resistencia al glifosato en una planta que comprende:

    a) proveer una planta que contiene la secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34; b) poner en contacto dicha planta con una concentración efectiva de glifosato; y, c) cultivar dicha planta bajo condiciones en donde la temperatura es más alta que la temperatura del medio ambiente al menos durante dos horas consecutivas por día durante al menos cuatro días después el contacto con dicho glifosato, en donde dichos días después el contacto están dentro del período vegetativo de la planta.

16. 16.

    El método de la reivindicación 14, en donde la temperatura en la etapa (c) es aproximadamente de 32°C hasta aproximadamente 60°C, preferiblemente en donde la temperatura en la etapa (b) es aproximadamente de 37°C.