RS51812B - Poboljšane grg23 epsp sintaze: smeše i postupci za korišćenje - Google Patents

Abstract

Molekul nukleinske kiseline izdvojen iz grupe, koja se sastoji od:a) molekula nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 28, 30, 32 ili 34; ib) molekula nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29, 31, 33 ili 35.Prijava sadrži još 14 patentnih zahteva.

Description

OBLAST TEHNIKE

Pronalazak se odnosi na molekularnu biologiju bilja, posebno na nove polipeptide EPSP sintaze, koji pružaju poboljšanu otpornost ili toleranciju na herbicid glifosat.

STANJE TEHNIKE

N-fosfonometilglicin, koji se uobičajeno označava kao glifosat, jeste važna hemikalija u poljoprivredi. Glifosat inhibira enzim koji konvertuje fosfoenolpiruvičnu kiselinu (PEP) i 3-fosfošikimsku kiselinu (S3P) u 5-enolpiruvil-3-fosfošikimsku kiselinu. Inhibicijom ovog enzima (5-enolpiruvilšikimat-3-fosfat sintaze; ovde označene kao "ESPS sintaza" ili "EPSPS") uništavaju se biljne ćelije, zatvaranjem puta šikimata, čime se inhibira biosinteza aromatične aminokiseline.

Budući da herbicidi iz klase glifosata inhibiraju biosintezu aromatičnih aminokiselina, oni ne uništavaju samo biljne ćelije, već su, isto tako, toksični za bakterijske ćelije. Glifosat inhibira mnoge EPSP sintaze bakterija, zbog čega je za te bakterije toksičan. Međutim, određene bakterijske EPSP sintaze imaju visoku toleranciju na glifosat.

Biljne ćelije, rezistentne na toksičnost glifosata, mogu se proizvesti transformisanjem biljnih ćelija, tako da ekspresuju bakterijske EPSP sintaze, rezistentne na glifosat. Važno je istaknuti daje korišćen bakterijski gen iz soja CP4Agrobacterium tumefaciens,da bi na biljne ćelije preneo rezistentnost na herbicid, nakon ekspresije u biljkama. Mutirana EPSP sintaza iz soja CT7Salmonelle typhimuriumpruža bakterijskim ćelijama rezistentnost na glifosat, i otpornost na glifosat prenosi na biljne ćelije (U.S.

Patent Nos. 4,535,060; 4,769,061 i 5,094,945).

U.S. patent 6,040,497 prikazuje enzime EPSP sintaze mutanta kukuruza, koji poseduju supstitucije treonina za izoleucin na položaju 102 i prolina za serin na položaju 106 ("TIPS" mutacija). Takve izmene pružaju rezistenciju na glifosat na bazi enzima kukuruza. Mutirana EPSP sintaza iz soja CT7Salmonelletyphimuriumpruža bakterijskim ćelijama rezistentnost na glifosat, a izloženo je i da biljnim ćelijama prenosi rezistenciju na glifosat (U.S. Patent Nos. 4,535,060; 4,769,061 i 5,094945). He i saradnici ((2001) Biochim et Biophvsica Acta 1568:1-6) su razvili EPSP sintaze sa povećanom otpornošću na glifosat, uz pomoć mutageneze i rekombinovanja između gena EPSP sintazeE. coliiSalmonelle typhimurium,i navode na pretpostavku da su mutacije na položaju 42 (T42M) i položaju 230 (Q230K) verovatno odgovorne za zapaženu rezistenciju. Sledeći rad (He i saradnici (2003) Biosci. Biotech. Biochem. 67:1405-1409) pokazuje daje T42M mutacija (treonin za metionin) dovoljna za poboljšanu toleranciju oba enzima iE. coliiSalmonelle typhimurium.Zbog mnogih prednosti koje biljkama pruža rezistencija na herbicid, poželjni su geni herbicidne rezistencije poboljšane aktivnosti glifosatne rezistencije.

Alternativni postupak za mutagenezu jeste postupak "permutacione mutageneze", opisan u U.S. Patent Application No. 60/813,095, koja je prijavljena 13. juna 2006. godine.

IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

Obezbeđene su smeše i postupci za pružanje rezistencije ili tolerancije. Smeše sadrže enzime EPSP sintaze, koji su rezistetni na glifosatni herbicid, i molekule nukleinske kiseline, koji kodiraju takve enzime, vektore, koji sadrže takve molekule nukleinske kiseline i ćelije domaćina, koje sadrže vektore. Smeše obuhvataju molekule nukleinske kiseline, koji kodiraju polipeptide rezistencije na herbicid, uključujući one koji kodiraju polipeptide, koji uključuju SEQ ID NO:29, 31, 33 ili 35, kao i polinukleotidne sekvence SEQ ID NO:28, 30, 32 ili 34.

Stoga, ovaj pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline, koji je odabran iz grupe, koju sačinjava: a) molekul nukleinske kiseline, koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 28, 30, 32 ili 34, i b) molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29, 31, 33 ili 35.

Kodirajuće sekvence se mogu koristiti u konstrukcijama DNK ili ekspresionim kasetama za transformaciju i ekspresiju u organizmima, koji uključuju mikroorganizme i biljke. Smeše, takođe, uključuju transformisane bakterije, biljke, biljne ćelije, tkiva i semenje, koji su rezistentni na glifosat, uvođenjem smeša pronalaska u genom organizma. Kada je organizam biljka, uvođenje sekvence uzima u obzir primenu herbicida, koji sadrže glifosat, na biljkama, kako bi se selektivno uništile glifosat-senzitivne korovske ili druge netransformisane biljke, ali ne i transformisani organizam. Sekvence, pored toga, mogu biti korišćene kao marker za selekciju biljnih ćelija, koje se razvijaju pod glifosatnim uslovima.

Dodatno su obezbeđeni postupci za identifikovanje enzima EPSP sintaze sa aktivnošću rezistencije na glifosat. Postupci obuhvataju identifikovanje dodatnih sekvenci EPSP sintaze, koje su rezistentne na glifosat na osnovu prisustva domena pronalaska.

Tekući pronalazak, takođe, obezbeđuje:

- vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline pronalaska, koji, poželjno, dalje sadrži molekul nukleinske kiseline, koji kodira hetcrologni polipeptid; - ćeliju domaćina, koja sadrži molekul nukleinske kiseline pronalaska, poželjno to je bakterijska ćelija domaćina ili biljna ćelija; - transgensku biljku, koja sadrži biljnu domaćinsku ćeliju pronalaska, pri čemu je, poželjno, navedena biljka odabrana iz grupe, koju sačinjavaju: kukuruz, sirak, pšenica, suncokret, paradajz, krstašice, biber, krompir, pamuk, pirinač, soja, šećerna repa, šećerna trska, duvan, ječam i uljana repica; i - transgensko seme, koje sadrži molekul nukleinske kiseline pronalaska.

Dodatno, pronalazak obezbeđuje rekombinantni polipetid, koji je odabran iz grupe, koju sačinjavaju: a) polipeptid, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29, 31, 33 ili 35; i b) polipeptid, koga kodira nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 28, 30, 32 ili 34, koji poželjno, dalje, sadrži heterolognu aminokiselinsku sekvencu.

Pronalazak, dalje, obezbeđuje postupak koji biljci pruža rezistenciju na herbicid, pri čemu navedeni postupak obuhvata transformisanje navedene biljke sa konstrukcijom DNK, pri čemu navedena konstrukcija sadrži promoter, koji upravlja ekspresijom u biljnoj ćeliji, a koji je operativno povezan sa nukleotidnom sekvencom, koja je odabrana iz grupe, koju sačinjavaju SEQ ID NO: 28, 30, 32 ili 34, i regenerisanje transformisane biljke, pri čemu je navedeni herbicid poželjno glifosat.

Pronalazak obezbeđuje, dalje, biljku, koja poseduje DNK konstrukciju, stabilno inkorporiranu u svoj genom, koja uključuje nukleotidnu sekvencu, koja kodira protein, koji ima aktivnost rezistencije na herbicid, pri čemu je navedena nukleotidna sekvenca odabrana iz grupe, koju sačinjava: a) molekul nukleinske kiseline, koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 28, 30, 32 ili 34; i b) molekul nukleinske kiseline, koji kodira polipeptid, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29, 31, 33 ili 35;

pri čemu je navedena nukleotidna sekvenca operativno povezana sa promoterom, koji upravlja ekspresijom kodirajuće sekvence u biljnoj ćeliji.

Pored navedenog, pronalazak obezbeđuje postupak za uvećavanje vitalnosti ili prinosa biljke, koji obuhvata: a) obezbeđivanje biljke, koja sadrži nukleotidnu sekvencu, navedenu u SEQ ID NO: 28, 30, 32 ili 34; b) dovođenje u kontakt navedene biljke sa efektivnom koncentracijom glifosata; i c) uzgoj navedene biljke pod uslovima u kojima je temperatura viša od ambijentalne temperature okruženja, tokom najmanje dva neprekinuta sata dnevno, u

toku najmanje četiri dana nakon dovođenja u kontakt sa navedenim glifosatom, pri čemu se navedeni dani nakon kontakta nalaze u okviru sezone rasta biljke,

pri čemu je vitalnost ili rod navedene biljke veći od vitalnosti ili roda biljke, koja ekspresuje EPSP sintetazu tolerancije na glifosat, koja nema temperaturni optimum viši od ambijentalne temperature okruženja, pri čemu je poželjno temperatura u koraku (c) oko 32°C do oko 60°C.

Pronalazak, takođe, obezbeđuje postupak za pružanje biljci rezistencije na glifosat, koji obuhvata: a) obezbeđivanje biljke, koja sadrži nukleotidnu sekvencu, navedenu u SEQ ID NO: 28, 30, 32 ili 34; b) dovođenje u kontakt navedene biljke sa efektivnom koncentracijom glifosata; i c) uzgoj navedene biljke pod uslovima u kojima je temperatura viša od ambijentalne temperature okruženja, tokom najmanje dva neprekinuta sata dnevno, u

toku najmanje četiri dana nakon dovođenja u kontakt sa navedenim glifosatom, pri čemu se navedeni dani nakon kontakta nalaze u okviru sezone rasta biljke.

OPIS SLIKA

Slika 1 prikazuje enzimsku aktivnost GRG23(acel) ("M5"; SEQ IDNO:10) u poređenju sa GRG23 divljeg tipa ("WTGRG23"; SEQ ID NO:2), na 37°C, tokom 0 do 25 sati.

Slika 2 prikazuje rezistenciju GRG23 i nekoliko varijanti na glifosat, koja je izražena kao konstanta inhibicije ili Ki.

Slika 3 pokazuje polu-život GRG23 i varijanti GRG23, na 37°C.

DETALJAN OPIS PRONALAZAK

Tekući pronalasci će ovde, u nastavku, biti opisani potpunije, u vezi sa pratećim slikama, u kojima su prikazana neka, ali ne i sva ostvarenja pronalaska. U stvari, ovi pronalasci mogu biti ostvareni u brojnim različitim formama, i ne bi ih trebalo tumačiti kao ograničenje, ovde navedenim, ostvarenjima; pre su ova ostvarenja pružena tako da se ovim izlaganjem zadovolje primenjivi, legalni zahtevi. Slični brojevi se do kraja odnose na slične elemente.

Brojne modifikacije i druga ostvarenja pronalazaka, koji su ovde navedeni, imaće na umu lice, stručno u oblasti kojoj pripadaju ovi pronalasci, a koristiće prikaze, predstavljene u prethodno pomenutim opisima i pridruženim slikama. Iz tih razloga, podrazumevalo bi se da pronalasci ne bi bili ograničeni na specifična izložena ostvarenja, i da su modifikacije i druga ostvarenja određena kako bi bila uključena unutar okvira priključenih patentnih zahteva. Premda su ovde upotrebljavani specifični termini, oni su korišćeni samo u generičkom i deskriptivnom smislu, a ne u svrhu ograničavanja.

Tekući pronalazak se odnosi na smeše i postupke za regulisanje rezistencije na herbicide u organizmima, posebno biljkama ili biljnim ćelijama. Postupci obuhvataju transformaciju organizama sa nukleotidnim sekvencama koje kodiraju gen rezistencije na glifosat pronalaska. Nukleotidne sekvence pronalaska su korisne za izradu biljaka koje pokazuju povećanu toleranciju na glifosatni herbicid. Tako se pod genom "rezistencije na glifosat" ili "tolerancije na glifosat" pronalaska podrazumeva nukleotidna sekvenca, navedena u SEQ ID NO: 28, 30, 32 ili 34, i njihovi fragmenti i varijante, koji kodiraju polipeptid rezistencije ili tolerancije na glifosat. Isto tako, polipeptid "rezistencije na glifosat" ili "tolerancije na glifosat" iz pronalaska jeste polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu, navedenu u SEQ ID NO:29, 31, 33 ili 35, i njegovi fragmenti i varijante, koji ćeliji domaćina pružaju rezistenciju ili toleranciju na glifosat.

A. Izolovani polinukleotidi i njihove varijante i fragmenti

U nekim ostvarenjima, ovaj pronalazak uključuje izolovane, rekombinantne ili prečišćene polinukleotide. "Izolovani" ili "prečišćeni" polinukleotid ili polipeptid, ili njegov biološki aktivni deo, je u suštini oslobođen prisustva drugog celularnog materijala, ili medijuma kulture, kada se proizvodi rekombinantnim postupcima, ili je suštinski bez prisustva hemijskih prekursora ili drugih hemikalija, kada se sintetiše hemijski. "Biološki aktivan" znači da poseduje željenu biološku aktivnost nativnog polipeptida, to jest, zadržava aktivnost herbicidne rezistencije. "Izolovani" polinukleotid može biti bez sekvenci (na primer, sekvence koje kodiraju protein), koje u prirodi zaposedaju nukleinsku kiselinu (t.j., sekvence, locirane na 5' i 3' krajevima nukleinske kiseline) u genomskoj DNK organizma, iz koje je polinukletid dobijen. Za potrebe pronalaska, izraz "izolovan" kada se koristi u vezi sa polinukleotidima, isključuje izolovane hromosome. Primera radi, u raznim ostvarenjima, izolovani polinukleotid koji kodira rezistenciju na glifosat može sadržavati manje od oko 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb ili 0.1 kb nukleotidne sekvence koja prirodno zaposeda polinukleotid u genomskoj DNK ćelije, iz koje je polinukleotid dobijen.

Polinukleotidi pronalaska uključuju one koji kodiraju polipeptide rezistentne na glifosat, koji obuhvataju SEQ ID NO: 29, 31, 33 ili 35, kao i polinukleotidne sekvence SEQ IDNO: 28, 30, 32 ili 34.

Pod "glifosatom" se podrazumeva bilo koja herbicidna forma N-fosfonometilglicina (uključujući bilo koju njihovu so) i drugi oblici koji dovode do prozvodnje glifosatnog anjonainplanta."Protein rezistencije na herbicid" ili protein koji proističe iz ekspresije "molekula nukleinske kiseline koji kodira herbicidnu rezistenciju" uključuje proteine koji ćeliji prenose sposobnost da toleriše veću koncentraciju herbicida, nego ćelije koje ne ekspresuju protein, ili da određenu koncentraciju herbicida tolerišu tokom dužeg vremenskog perioda nego ćelije koje ne ekspresuju protein. "Protein rezistencije na glifosat" uključuje protein koji ćeliji prenosi sposobnost da toleriše veću koncentraciju glifosata, nego ćelije koje ne ekspresuju protein, ili da određenu koncentraciju glifosata tolerišu tokom dužeg vremenskog perioda, nego ćelije koje ne ekspresuju protein. Pod "toleresiti" ili "tolerancija" označava se ili preživljavanje ili vršenje suštinskih ćelijskih funkcija, kao što je sinteza proteina i respiracija, na način koji se ne može lako razlučiti od ćelija koje nisu tretirane.

Ovaj pronalazak dalje razmatra varijante i fragmente, ovde opisanih, polinukleotida. "Fragment" polinukleotida može kodirati biološki aktivan deo polipeptida, ili može biti fragment, koji se može koristiti kao hibridizaciona proba ili PCR prajmer, koristeći postupke, koji su izloženi ovde u drugom delu. Polinukleotidi, koji su fragmenti polinukleotida, sadrže najmanje oko 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950 susednih nukleotida, ili sve do broja nukleotida koji su prisutni u polinukleotidu pune dužine, koji je ovde izložen, u zavisnosti od nameravane upotrebe (npr., polinukleotid EPSP sintaze, koji sadrži SEQ ID NO: 1). "Susednim" nukleotidima se označavaju nukleotidni ostaci, koji su u neposrednoj blizini jedan u odnosu na drugoga.

Fragmenti polinukleotida tekućeg pronalaska uopšteno će kodirati polipeptidne fragmente, koji zadržavaju biološku aktivnost proteina pune dužine, sa rezistencijom na glifosat, t.j., aktivnost rezistencije na herbicid. Pod "zadržavanjem aktivnosti rezistencije na herbicid" podrazumeva se da će fragment imati najmanje oko 30%, najmanje oko 50%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, najmanje oko 300% ili više aktivnosti herbicidne rezistencije proteina pune dužine, sa rezistencijoim na glifosat, koji je ovde izložen kao SEQ ID NO:2, 3 ili 5. Postupci za merenje aktivnosti rezistencije na herbicid dobro su poznati u ovoj oblasti. Vidi, primera radi, U.S. Patent Nos. 4,535,060 i 5,188,642.

Fragment polinukleotida, koji kodira biološki aktivan deo polipeptida pronalaska kodiraće najmanje oko 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 susednih aminokiselina, ili sve do ukupnog broja aminokiselina, prisutnih u polipeptidu pronalaska, koji je pune dužine.

Pronalazak, takođe, obuhvata varijante polinukleotida. "Varijante" polinukleotida uključuju one sekvence koje kodiraju polipeptide, koji su ovde izloženi, ali se konzervativno razlikuju, zbog degeneracije genetskog koda, kao i one koje su u dovoljnoj meri identične.

Izraz "dovoljno identičan" utvrđenje kako bi se odnosio na polipeptidnu ili polinukleotidnu sekvencu, koja ima najmanje oko 60% ili 65% identiteta sekvence, oko 70% ili 75% identiteta sekvence, oko 80% ili 85% identiteta sekvence, oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence u poređenju sa referentnom sekvencom, koristeći jedan od programa slaganja, uz upotrebu standardnih parametara. Stručno lice u ovoj oblasti prepoznaće da ove vrednosti mogu biti na pogodan način podešene, kako bi se utvrdila odgovarajuća istovetnost polipeptida, kodiranih od strane dva polinukleotida, uzimajući u obzir: degeneraciju kodona, sličnost aminokiselina, pozicioniranje okvira za čitanje i slično.

Bakterijski geni veoma često poseduju višestruke metioninske kodone incijacije u blizini početka okvira otvorenog za čitanje. Često će inicijacija translacije na jednom ili više ovih start kodona dovesti do proizvodnje funkcionalnog proteina. Ovi start kodoni mogu uključiti ATG kodone. Međutim, bakterije, kao što jeBacillussp., takođe prepoznaju GTG kodon, kao start kodon, a proteini, koji iniciraju translaciju na GTG kodonima sadrže metionin u prvoj aminokiselini. Pored toga, često nijea prioriodređeno koji od ovih kodona u prirodi koristi bakterija. Stoga se podrazumeva da korišćenje jednog od alternativnih metioninskih kodona može dovesti do proizvodnje varijanti koje pružaju rezistenciju na herbicid. Ovi proteini s rezistencijom na herbicid obuhvaćeni su tekućim pronalaskom i mogu se koristiti u postupcima ovog pronalaska.

Alelske varijante, koje postoje u prirodi, mogu se identifikovati korišćenjem dobro-poznatih tehnika molekularne biologije, kao što je lančana polimeraza reakcija

(PCR) i hibridizacione tehnike, kao što su u nastavku prikazane. Varijante polinukleotida, takođe, uključuju sintetski dobijene polinukleotide, koji su bili proizvedeni, primera radi, korišćenjem mutageneze usmerene ka položaju ili drugih strategija mutageneze, ali koji još kodiraju polipeptid, koji poseduje željenu biološku aktivnost.

Stručnjak će, pored toga, proceniti da se izmene mogu uvesti daljom mutacijom polinukleotida pronalaska, dovodeći tako do daljih promena u sekvenci aminokiselina kodiranih polipeptida, bez izmene biološke aktivnosti polipeptida. Tako, varijante izolovanih polinukleotida mogu biti kreirane uvođenjem jedne ili više dodatnih nukleotidnih supstitucija, adicija ili delecija u odgovarajući polinukleotid, koji kodira, ovde izloženi, domen EPSP sintaze, tako da se jedna ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija uvode u kodirani polipepti. Dalje mutacije se mogu uvesti standardnim postupcima, kao što su mutatageneza, usmerena ka položaju ili mutageneza posredovana PCR-om, ili tehnike mešanja gena. Takve varijante polinukleotida su, takođe, obuhvaćene ovim pronalaskom.

Varijante polinukleotida mogu biti izrađene uvođenjem mutacija nasumično, duž celokupne ili delimične kodirajuće sekvence, kao na primer putem saturacione mutageneze, a nastalim mutantima se može ispitati sposobnost da daju aktivnost rezistencije na herbicid, kako bi se identifikovali mutanti koji zadržavaju aktivnost.

Postupci mešanja gena ili "sexual" PCR (na primer, Smith (1994) Nature 370:324-325; U.S. Pat. Nos. 5,837,458; 5,830,721; 5,81 1,238 i 5,733,731) mogu se koristiti za dalje modifikovanje ili uvećavanje polinukleotida i polipeptida, koji poseduju domen EPSP sintaze ovog pronalaska (primera radi, polipeptidi, koji daju rezistenciju na glifosfat). Mešanje gena uključuje nasumičnu fragmentaciju nekoloko mutanata DNK, nakon čega je sledilo njihovo ponovno sastavljanje uz pomoć PCR-a, u molekule pune dužine. Primeri raznih postupaka mešanja gena uključuju, ali se njima ne ograničavaju, sastavljanje nakon obrade DNazom, postupak cik-cak istezanja (STEP) i nasumično prajmingin vitrorekombinovanje. U postupku, posredovanom DNazom, segmenti DNK, koji su izolovani iz pula pozitivnih mutanata, cepaju se u nasumične fragmente sa DNazelom i podvrgavaju višestrukim rundama PCR-a, bez dodavanja prajmera. Dužine nasumičnih fragmenata približavaju se dužini neotcepljenog segmena, kako se ciklusi PCR-a nastavljaju, što dovodi do toga se izmešaju mutacije na različitim klonovima, i akumuliraju u nekim od nastalih sekvenci. Višestruki ciklusi selekcije i mešanja dovode do funkcionalnog uvećavanja nekoliko enzima (Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Crameri i saradnici (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319; Zhang i saradnici (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504-4509 i Crameri i saradnici (1997) Nat. Biotechnol. 15:436-438). Takvi postupci su mogli biti izvršeni, primera radi, na polinukleotidima, koji kodiraju polipeptide, koji poseduju domen sekvence tekućeg pronalaska, da bi se proizveli polipeptidi koji pružaju rezistenciju na glifosat.

Koristeći postupke, kao što je PCR, hibridizacija i slično, odgovarajuće sekvence sa rezistencijom na herbicid mogu biti identifikovane traženjem domena EPSP sintaze ovog pronalaska. Vidi, primera radi, Sambrook i Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual (Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, NY) i Innis i saradnici (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).

B. Izolovani proteini i njihove varijante i fragmenti

Polipeptidi sa rezistencijom na herbicid su takođe uključeni unutar okvira ovog pronalaska. Polipeptid sa rezistencijom na herbicid, koji je suštinski bez ćelijskog materijala, uključuju preparate polipeptida, koji imaju manje od oko 30%, 20%, 10% ili 5% (po suvoj težini) polipeptida bez rezistencije na herbicid (ovde, takođe, označen kao "kontaminirajući protein"). U tekućem pronalasku, "protein rezistencije na herbicid" se odnosi na polipeptid EPSP sintaze, koji poseduje domen sekvence ovog pronalaska. Takođe su obezbeđeni njihovi fragmenti, biološki aktivni delovi i varijante, koji se mogu koristiti za praktikovanje postupaka ovog pronalaska.

"Fragmenti" ili "biološki aktivni delovi" uključuju fragmente polipeptida, koji sadrže deo aminokiselinske sekvence, koji kodira protein rezistencije na herbicid i koji zadržava aktivnost herbicidne rezistencije. Biološki aktivan deo proteina sa rezistencijom na herbicid može biti polipeptid, koji, primera radi, ima dužinu od 10, 25, 50, 100 ili više aminokiselina. Takvi biološki aktivni delovi mogu se pripremiti rekombinantnim postupcima, i može im biti procenjena aktivnost rezistencije na herbicid.

Pod "varijantama" se podrazumevaju proteini ili polipeptidi, koji poseduju aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 60%, 65%, oko 70%, 75%, oko 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa polipeptidom EPSP sintaze, koji poseduje domen EPSP sintaze ovog pronalaska. Stručno lice u ovoj oblasti prepoznaće da ove vrednosti mogu biti na pogodan način podešene, kako bi se utvrdila odgovarajuća istovetnost polipeptida, kodiranih od strane dva polinukleotida, uzimajući u obzir: degeneraciju kodona, sličnost aminokiselina, pozicioniranje okvira za čitanje i slično.

Na primer, konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu biti izvršene na jednom ili više ostataka ne-esencijalnih aminokiselina. "Ne-esencijalni" aminokiselinski ostatak je ostatak koji može biti izmenjen iz sekvence polipeptida divljeg tipa, bez izmene biološke aktivnosti, dok je "esencijalni" aminokiselinski ostatak neophodan za biološku aktivnost. "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom, koji poseduju sličan bočni lanac. Familije aminokiselinskih ostataka, koji poseduju slične bočne lance definisane su u struci. Ove familije uključuju aminokiseline sa: bazičnim bočnim lancima (npr., lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr., asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), polarnim bočnim lancima bez naboja (npr., glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarnim bočnim lancima (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranatim bočnim lancima (npr., treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Supstitucije aminokiselina mogu biti izvršene u nekonzervisanim regionima, koji zadržavaju funkciju. Uopšteno, takve supstitucije ne bi bile izvršene na konzervisanim aminokiselinskim ostacima ili na ostacima aminokiselina, koji se nalaze unutar konzervisanog motiva, gde su takvi ostaci od suštinskog značaja za aktivnost polipeptida. Međutim, stručno lice u ovoj oblasti bi shvatalo da funkcionalne varijante mogu posedovati manje konzervisane ili nekonzervisane izmene u konzervisanim ostacima.

Antitela na polipeptide ovog pronalaska ili na njihove varijante ili fragmente, takođe su obuhvaćeni. Postupci proizvodnje antitela dobro su poznati u struci (vidi, primera radi, Harlovv i Lane (1988) Antibodies: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; U.S. Patent No. 4,196,265).

C. Polinukleotidne konstrukcije

Polinukleotidi, koji kodiraju polipeptide EPSP sintaze ovog pronalaska, mogu biti modifikovani kako bi se postigla ili povećala ekspresija u biljnim ćelijama. Polinukleotidi, koji kodiraju, ovde identifikovane, polipeptide, mogu biti obezbeđeni u ekspresionim kasetama za ekspresiju u biljci od značaja. "Biljna ekspresiona kaseta" sadrži konstrukciju DNK, uključujući rekombinantnu DNK konstrukciju, koja je u stanju da dovede do ekspresije polinukleotida u biljnoj ćeliji. Kaseta može uključiti, u 5'-3' smeru transkripcije, region inicijacije transkripcije (t.j., promoter, posebno heterologni promoter), koji je operativno povezan na jedan ili više polinukleotida od značaja i/ili terminacioni region translacije i transkripcije (t.j., terminacioni region), funkcionalan u biljkama. Kaseta može, pored toga, sadržavati najmanje jedan dodatni polinukleotid koji bi se uvodio u organizam, kao što je selektivni marker gen. Alternativno, dodatni polinukleotid(polinukleotidi) može biti obezbeđen u multiplim ekspresionim kasetama. Takva ekspresiona kaseta je obezbeđena sa mnoštvom restrikcionih položaja za uvođenje u polinukleotid(polinukleotide), koji bi bili pod transkripcionom regulacijom regulatornih regiona.

"Heterologan" se uopšteno odnosi na polinukleotid ili polipeptid, koji nije endogen ćeliji ili nije endogen lokaciji u nativnom genomu u kome je prisutan, a ćeliji je dodat putem infekcije, transfekcije, mikroinjekcije, elektroporacije, mikroprojekcije ili sličnog. Pod "operativno vezanim" se misli na funkcionalno povezivanje između dva polinukleotida. Na primer, kada se promoter operativno povezuje na sekvencu DNK, sekvenca promotera inicira i posreduje u transkripciji sekvence DNK. Podrazumeva se da operativno povezani polinukleotidi mogu, ali ne moraju biti susedni, a kada se koriste u vezi sa povezivanjem kodirajućih regiona dva polipeptida, polipeptidi se ekspresuju u istom okviru za čitanje.

Promoter može biti bilo koja polinukleotidna sekvenca koja pokazuje transkripcionu aktivnost u izabranim biljnim ćelijama, biljnim delovima ili biljkama. Promoter može biti nativan ili analogan, ili stran ili heterologan, u odnosu na biljku domaćina i/ili DNK sekvencu pronalaska. Kada je promoter "nativan" ili "analogan" biljnom domaćinu, smatra se da se promoter nalazi u nativnoj biljci, u koju se promoter uvodi. Kada je promoter "stran" ili "heterologan" DNK sekvenci pronalaska, smatra se da promoter nije nativan ili da promoter ne postoji u prirodi za operativno vezane sekvence DNK pronalaska. Promoter može biti inducibilan ili konstitutivan. On može postojati u prirodi, može biti sastavljen od delova raznih promotera, koji se nalaze u prirodi, ili može delimično ili potpuno biti sintetski. Vodič za dizajniranje promotera obezbeđen je studijama strukture promotera, kao što je studija Harleva i Revnoldsa (1987) Nucleic Acids Res. 15:2343-2361. Isto tako, može biti optimiziran položaj promotera u odnosu na početak transkripcije. Vidi, npr., Roberts i saradnici (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:760-764. Brojni pogodni promoteri za korišćenje na biljkama dobro su poznati u struci.

Na primer, pogodni konstitutivni promoteri za korišćenje na biljkama obuhvataju: promotere iz biljnih virusa, kao što je promoter kaulimovirusa hlorotskih pruga kikirikija (PCISV) (U.S. Pat. Br. 5,850,019), 35S promoter iz virusa mozaika karfiola (CaMV) (Odell i saradnici (1985) Nature 313:810-812); promoteri gena metiltransferaze Chlorella virusa (U.S. Pat. Br. 5,563,328) i transkripcioni promoter pune dužine iz virusa mozaika gljivnjače (FMV) (U.S. Pat. Br. 5,378,619); promoteri iz gena, kao što je aktin pirinča (McElrov i saradnici (1990) Plant Cell 2:163-171); ubikvitin (Christensen i saradnici (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 i Christensen i saradnici

(1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last i saradnici (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten i saradnici (1984) EMBO J. 3:2723-2730), H3 histona kukuruza (Lepetit i saradnici (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-285 i Atanassova i saradnici (1992) Plant J. 2(3):291-300); ALS3 Brassica napusa (PCT application WO 97/41228) i promoteri raznih genaAgrobacteriuma(vidi U.S. Pat. Nos. 4,771,002; 5,102,796; 5,182,200 i 5,428,147).

Pogodni inducibilni promoteri za korišćenje na biljkama obuhvataju: promoter iz ACE 1 sistema, koji odgovara na bakar (Mett i saradnici (1993) PNAS 90:4567-4571); promoter ln2 gena kukuruza, koji odgovara na zaštitu benzensulfonamidnog herbicida (Hershev i saradnici (1991) Mol. Gen. Genetics 227:229-237 i Gatz i saradnici (1994) Mol. Gen. Genetics 243:32-38) i promoter Tet represora iz TnlO (Gatz i saradnici (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237). Drugi inducibilni promoter za korišćenje na biljkama jeste onaj koji reaguje na induktivni agens, na koje biljke normalno ne reaguju. Primer inducibilnog promotera ovog tipa jeste inducibilni promoter iz gena steroidnog hormona, čija transkripciona aktivnost se indukuje glukokortikosteroidnim hormonom (Schena i saradnici (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421) ili skorašnja primena himeričnog transkripcionog aktivatora, XVE, za korišćenje u inducibilnom biljnom ekspresionom sistemu, na bazi estrogenskog receptora, koji se aktivira estradiolom (Zuo i saradnici (2000) Plant J., 24:265-273). Drugi inducibilni promoteri za korišćenje na biljkama opisani su u EP 332104, PCT WO 93/21334 i PCT WO 97/06269. Takođe se mogu koristiti promoteri, sastavljeni od delova drugih promotera i delimično ili potpuno sintetski promoteri. Vidi, npr., Ni i saradnici

(1995) Plant J. 7:661-676 i PCT WO 95/14098, koji opisuju takve promotere za korišćenje na biljkama.

Promoter može uključiti ili se može modifikovati kako bi uključio jedan ili više elemenata za pojačavanje. U nekim ostvarenjima, promoter može uključiti brojne elemente za pojačavanje. Promoteri, koji sadrže elemente za pojačavanje, obezbeđuju više nivoe transkripcije u poređenju sa promoterima koji ih ne sadrže. Pogodni elementi za pojačavanje za korišćenje na biljkama uključuju: PCISV element za pojačavanje (U.S. Pat. No. 5,850,019), CaMV 35S element za pojačavanje (U.S. Pat. No. 5,106,739 i 5,164,316) i FMV element za pojačavanje (Maiti i saradnici (1997) Transgenic Res. 6:143-156). Vidi, takođe, PCT WO 96/23898.

Cesto, takve konstrukcije mogu sadržavati 5' i 3' netranslatovane regione. Takve konstrukcije mogu sadržavati "signalnu sekvencu" ili "lider sekvencu" za olakšavanje ko-translacionog ili post-translacionog transporta peptida od značaja u određene unutarćelijske strukture, kao što je hloroplast (ili drugi plastid), endoplazmatski retikulum ili Golđijev aparat, ili kako bi bili sekretovani. Na primer, može biti izgrađena takva konstrukcija koja sadrži signalni peptid za olakšavanje prenosa peptida do endoplazmatskog retikuluma. Pod "signalnom sekvencom" se misli na sekvencu za koju se zna ili se pretpostavlja da dovodi od ko-translacionog ili post-translacionog transporta peptida kroz ćelijsku membranu. Kod eukariota, ovo obično uključuje sekreciju u Golđijev aparat, sa nešto proistekle glikozilacije. "Liderskom sekvencom" se smatra bilo koja sekvenca, koja, kada se translatuje, daje aminokiselinsku sekvencu, koja je dovoljna da pokrene ko-translacioni transport peptidnog lanca do sub-ćelijske organele. Iz tih razloga, ovo uključuje liderske sekvence, koje ciljano navode transport i/ili glikozilaciju prolaskom u endoplazmatski retikulum, prolaskom u vakuuole, plastide, uključujući hloroplaste, mitohondrije i slično. Takođe može biti poželjno da se konstruiše biljna ekspresiona kaseta koja bi sadržavala intron, tako daje prenos mRNK introna neophodan za ekspresiju.

Pod "3' netranslatovanim regionom" se podrazumeva polinukleotid, lociran nishodno od kodirajuće sekvence. Poliadenilacione signalne sekvence i druge sekvence, koje kodiraju regulatorne signale, i koje su u stanju da utiču na adiciju nizova poliadenilne kiseline na 3' kraj prekursora mRNK su 3' netranslatovani regioni. Pod "5' netranslatovanim regionom" se smatra polinukleotid, lociran ushodno od kodirajuće sekvence.

Drugi ushodni ili nishodni netranslatovani elementi obuhvataju pojačivače. Pojačivači su polinukleotidi, koji deluju tako da pojačavaju ekspresiju regiona promotera, Pojačivači su dobro poznati u struci, a uključuju, ali bez ograničavanja na njih, SV40 region pojačivača i 35S element pojačivača.

Terminacioni region može biti nativan sa inicijacionim regionom transkripcije, može biti nativan sa sekvencom ovog pronalaska ili može biti dobijen iz drugog izvora. Pogodni terminacioni regioni su raspoloživi iz Ti-plazmidaA. tumefaciens,kao što su terminacioni regioni oktopin sintaze i nopalin sintaze. Vidi, takođe, Guerineau i saradnici (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon i saradnici (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen i saradnici

(1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe i saradnici (1990) Gene 91:151-158; Ballas i saradnici (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 i Joshi i saradnici (1987) Nucleic AcidRes. 15:9627-9639.

U jednom aspektu pronalaska, sintetske sekvence DNK su dizajnirane za dati polipeptid, kao što su polipeptidi pronalaska. Ekspresija okvira otvorenog za čitanje sintetske DNK sekvence u ćeliji dovodi do proizvodnje polipeptida pronalaska. Sintetske sekvence DNK mogu biti korisne za jednostavno odstranjivanje neželjenih restrikcionih položaja endonukleaze, da bi se olakšale strategije kloniranja DNK, kako bi se izmenili ili uklonili bilo koji potencijalni biasi kodona, da bi se izmenio ili poboljšao sadržaj GC, da bi se odstranili ili izmenili alternativni okviri čitanja i/ili kako bi se izmenili ili uklonili položaji prepoznavanja spoja intron/egzon, poliadenilacioni položaji, Shine-Delgarno sekvence, neželjeni promoterski elementi i slično, koji mogu biti prisutni u nativnoj sekvenci DNK. Takođe je mogućno da sintetske DNK sekvence budu korišćene za uvođenje drugih poboljšanja sekvenci DNK, kao što je uvođenje sekvence introna, kreiranje DNK sekvence tako daje ekspresovana kao fuzija proteina sa sekvencama koje ciljaju organele, kao što su peptidi za prenos hloroplasta, peptidi sa ciljanim delovanjem na apoplast/vakuole ili peptidne sekvence koje dovode do zadržavanja nastalog peptida u endoplazmatskom retikulumu. Takođe se mogu sintetisati sintetski geni, korišćenjem kodona, preferiranih od strane ćelije domaćina, kako bi se poboljšala ekspresija ili se mogu sintetisati korišćenjem kodona sa frekvencijom upotrebe kodona, poželjnih za domaćina. Vidi, primera radi, Campbell i Gowri (1990) Plant Phvsiol. 92:1-11; U.S. Patent Nos. 6,320,100; 6,075,185; 5,380,831 i 5,436,391; U.S. Published Application Nos. 20040005600 i 20010003849 i Murray i saradnici (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.

U jednom ostvarenju, polinukleotidi od značaja su ciljano usmereni na hloroplast za ekspresiju. Na ovaj način, kada polinukleotid od značaja nije direktno umetnut u hloroplast, ekspresiona kaseta će dodatno sadržavati polinukleotid, koji kodira tranzitni peptid da usmeri nukleotid od značaja na hloroplaste. Takvi tranzitni peptidi su poznati u struci. Vidi, na primer, Von Heijne i saradnici (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark i saradnici (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa i saradnici (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer i saradnici (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421 i Shah i saradnici (1986) Science 233:478-481.

Polinukleotidi od značaja, koji se ciljano usmeravaju na hloroplast, mogu biti optimizovani za ekspresiju u hloroplastu, da bi se napravile razlike u upotrebi kodona između nukleusa biljke i ove organele. Na ovaj način, polinukleotidi od značaja mogu biti sintetisani korišćenjem kodona poželjnih od strane hloroplasta. Vidi, primera radi, U.S.

Patent No. 5,380,831.

Ova biljna ekspresiona kaseta može biti umetnuta u biljni transformacioni vektor. "Transformacionim vektorom" se smatra DNK molekul koji omogućuje transformaciju ćelije. Takav molekul može biti sastavljen od jedne ili više ekspresionih kaseta, a može biti organizovan u više od jednog vektorskog DNK molekula. Na primer, binarni vektori su biljni transformacioni vektori, koji koriste dva DNK vektora, koji nisu susedni, kako bi kodirali sve potrebne funkcije sa cis- i trans-delovanjem, za transformaciju biljnih ćelija (Hellens i Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Vektor" se odnosi na polinukleotidnu konstrukciju, koja je dizajnirana za transfer između različitih ćelija domaćina. "Ekspresioni vektor" se odnosi na vektor koji poseduje sposobnost za inkorporiranje, integrisanje i ekspresovanje heterolognih DNK sekvenci ili fragmenata u stranoj ćeliji.

Biljni transformacioni vektor sadrži jedan ili više DNK vektora za izvođenje biljne transformacije. Na primer, uobičajena je praksa u ovoj oblasti da se koriste biljni transformacioni vektori koji sadrže više od jednog susednog DNK segmenta. Ovi vektori se često u struci označavaju kao binarni vektori. Binarni vektori, kao i vektori sa helper plazmidima, najčešće se koriste za transformaciju posredovanuAgrobacteriumom,kada je veličina i kompleksnost segmenata DNK, koji su potrebni za izvođenje efikasne transformacije, stvarno velika, i pogodno je da se funkcije razdvoje na zasebne DNK molekule. Binarni vektori obično sadrže plazmid vektor, koji sadrži cis-delujuće sekvence, potrebne za prenos T-DNK (kao što je levi rub i desni rub), selektivni marker, koji je konstruisan kako bi bio u stanju da se ekspresuje u biljnoj ćeliji, i "polinukleotid od značaja" (polinukleotid, konstruisan da bi bio u stanju da se ekspresuje u biljnoj ćeliji, za šta je poželjna proizvodnja transgenskih biljaka). Takođe su na ovom plazmid vektoru prisutne sekvence, potrebne za bakterijsku replikaciju. Cis-delujuće sekvence su raspoređene na način, koji omogućuje efikasan prenos u biljne ćelije i ekspresiju u njima. Primera radi, selektivna marker sekvenca i sekvenca od značaja su locirane između levih i desnih rubova. Često drugi plazmid vektor sadrži trans-dejstvujuće faktore, koji posreduju u transferu T-DNK izAgrobacteriumau biljne ćelije. Ovaj plazmid često sadrži funkcije virulencije (Vir geni), koji omogućuje inficiranje biljnih ćelija pomoćuAgrobacteriuma,i transfer DNK, putem cepanja na graničnim sekvencama i vir-om posredovani transfer DNK, kao što se u struci podrazumeva (Hellens i Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5:446-451). Nekoliko tipova sojevaAgrobacteriuma(npr., LBA4404, GV3101, EHA 101, EHA 105, itd.) može biti korišćeno za transformaciju biljaka. Drugi plazmid vektor nije neophodan za uvođenje polinukleotida u biljke drugim postupcima, kao što je mikroprojekcija, mikroinjekcija, elektroporacija, polietilen glikol, itd.

D. Transformacija biljke

Postupci pronalaska obuhvataju uvođenje nukleotidne konstrukcije u biljku. Pod "uvođenjem" se smatra ulazak u biljku nukleotidne konstrukcije, na takav način da konstrukcija dobije pristup u unutrašnjost ćelije biljke. Postupci pronalaska ne zahtevaju da se koristi poseban postupak za uvođenje nukleotidne konstrukcije u biljku, već samo da nukleotidna konstrukcija dobije pristup u unutrašnjost najmanje jedne ćelije biljke. Postupci za uvođenje nukleotidne konstrukcije u biljke poznati su u struci, a uključuju, ali bez ograničavanja istima, postupke stabilne transformacije, postupke prolazne transformacije i postupke, posredovane virusima.

Uopšteno, postupci transformisanja biljke obuhvataju prenošenje heterologne DNK u ciljane biljne ćelije (npr., nezreli ili zreli embrioni, suspenzione kulture, nediferentovani kalus, protoplasti, itd.), nakon čega je sledilo aplikovanje maksimalnog praga nivoa odgovarajuće selekcije (u zavisnosti od selektivnog marker gena, u ovom slučaju "glifosata"), da bi se oslobodile transformisane biljne ćelije iz grupe netransformisane ćelijske mase. Eksplanti se obično prenose u svežu količinu istog medijuma i uzgajaju se rutinski. Sledstveno tome, transformisane ćelije se diferenciraju u mladice nakon postavljanja na regenerativni medijum, dopunjen maksimalnim pragom koncentracije selektivnog agensa (npr., "glifosat"). Mladi izdanci su, zatim, preneseni na selektivni medijum za ukorenjivanje, za povraćaj ukorenjenog izdanka ili mladice. Transgenske mladice su, zatim, izrasle u zrele biljke i proizvele fertilno semenje (npr., Hiei i saradnici (1994) The Plan Journal 6:271-282; Ishida i saradnici (1996) Nature Biotechnologv 14:745-750). Eksplanti se obično prenose u svežu količinu istog medijuma i uzgajaju se rutinski. Opšti opis tehnika i postupaka za proizvodnju transgenskih biljaka nalaze se u Ayres i Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 i Bommineni i Jauhar (1997) Mavdica 42:107-120. Od tada transformisani materijal sadrži brojne ćelije; obe vrste ćelije, i transformisane i ne-transformisane, prisutne su u bilo kom delu podvrgnutog ciljnog kalusa ili tkiva ili grupe ćelija. Sposobnost da se unište ne-transformisane ćelije i omogućavanje transformisanim ćelijama da proliferiraju dovodi do stvaranja kultura transformisanih ćelija. Često, sposobnost uklanjanja ne-transformisanih ćelija predstavlja ograničenje brzom povraćaju transformisanih biljnih ćelija i uspešnoj proizvodnji transgenskih biljaka. Za potvrdu prisustva integrisanog heterolognog gena od značaja u genomu transgenske biljke mogu se koristiti molekularni i biohemijski postupci.

Proizvodnja transgenskih biljaka može se izvršiti uz pomoć jednog od nekolicine postupaka, koji uključuju, ali se njima ne ograničavaju, uvođenje heterologne DNK posredstvomAgrobacteriumau biljne ćelije (transformacija posredovanaAgrobacteriumom),bombardovanje biljnih ćelija heterolognom stranom DNK, adheriranom na čestice, i razne druge postupke koji nisu direktno posredovani česticama (npr., Hiei i saradnici (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida i saradnici (1996) Nature Biotechnologv 14:745-750; Ayres i Park (1994) Vritical Revievvs in Plant Science 13:219-239; Bommineni i Jauhar (1997) Mavdica 42:107-120), za prenos DNK.

Postupci za transformaciju hloroplasta su poznati u struci. Vidi, primera radi, Svab i saradnici (1990) Proc. Natl Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab i Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab i Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. Postupak se oslanja na oslobađanje čestičnim pištoljem DNK, koja sadrži selektivni marker i ciljano usmeravanje DNK na genom plastida posredstvom homologne rekombinacije. Pored toga, transformacija plastida može biti izvršena preko transaktivacije transgena, koji nosi tihi plastid, posredstvom za tkivo poželjne ekspresije RNK polimeraze, koja je nuklearno kodirana i usmerena na plastid. Takav sistem je bio izložen u McBride i saradnici (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.

Iz ćelija, koje se transformišu, mogu se uzgojiti biljke u skladu sa uobičajenim postupcima. Vidi, primera radi, McCormick i saradnici (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Ove biljke se, zatim, mogu uzgojiti i oprašiti ili sa istim transformisanim sojem ili sa različitim sojevima, a nastali hibrid, koji poseduje konstitutivnu ekspresiju željene fenotipske karakteristike, se identifikuje. Mogu biti uzgojene dve ili više generacija, kako bi se osiguralo da se ekspresija željene fenotipske karakteristike stabilno održava i nasleđuje, a zatim se sakuplja seme, da bi se potvrdilo da je izvršena ekspresija željene fenotipske karakteristike. Na ovaj način, tekući pronalazak obezbeđuje transformisano seme (takođe označeno kao "transgensko seme"), koje sadrži nukleotidnu konstrukciju pronalaska, na primer, ekspresionu kasetu pronalaska, koja je stabilno inkorporirana u njihov genom.

E. Procena biljne transformacije

Nakon uvođenja heterologne strane DNK u biljne ćelije, transformacija ili integracija heterolognog gena u genomu biljke potvrđuje se raznim postupcima, kao što analiza nukleinskih kiselina, proteina i metabolita, povezanih sa integrisanim genom.

PCR analiza je brzi postupak za ispitivanje transformisanih ćelija, tkiva ili mladica na prisustvo inkorporiranog gena u ranijem stadijumu pre presađivanja na zemljište (Sambrook i Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual (Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, NY)). PCR se izvodi uz korišćenje oligonukleotidnih prajmera, specifičnih za gen od značaja, ili vektorskeAgrobacteriumpozadine, itd..

Transformacija biljke se može potvrditi Southern blot analizom genomske DNK (Sambrook i Russell (2001)supra).Uopšteno, ukupna DNK se ekstrahuje iz transformisane biljke, svari se sa pogodnim restrikcionim enzimima, frakcioniše se na agaroza gelu i prenosi na nitroceluloznu ili najlonsku membranu. Membrana ili "blot" može se, zatim, ispitati sa, primera radi, radioobeleženim<32>P ciljanim fragmentima DNK, kako bi se potvrdilo integrisanje uvedenog gena u biljni genom, u skladu sa standardnim postupcima (Sambrook i Russell, 2001,supra).

U Northern analizi, RNK se izoluje iz specifičnih tkiva transformisane biljke, frakcioniše se u formaldehidnom agaroza gelu, i nanosi u vidu mrlje na najlonski filter, u skladu sa standardnim postupcima, koji se u ovoj oblasti koriste rutinski (Sambrook i Russell (2001)supra).Ekspresija RNK, kodirane od stranegrgsekvenci pronalaska, ispituje se, zatim, posredstvom hibridizacije filtera na radioaktivnu probu, dobijenu iz GDC, uz pomoć postupaka, poznatih u struci (Sambrook i Russell (2001)supra)

Western blot, biohemijske analize i slično, mogu biti izvršene na transgenskim biljkama, kako bi se utvrdilo prisustvo proteina, kodiranog od strane gena herbicidne rezistencije, putem standardnih postupaka (Sambrook i Russell (2001)supra),koristeći antitela, koja se vezuju za jedan ili više epitopa, prisutnih na proteinu sa rezistencijom na herbicid.

U jednom aspektu pronalaska, ovde opisanigrggeni su korisni kao markeri za procenu transformacije bakterijskih ili biljnih ćelija.

F. Biljke i biljni delovi

Pod "biljkom" se podrazumevaju cele biljke, biljni organi (npr., listovi, stabla, korenje, itd.), semenje, biljne ćelije, organi za reprodukciju, embrioni i mladi izdanci iste biljke. Biljne ćelije mogu biti diferentovane ili nediferentovane (npr., kalus, ćelije kulture suspenzije, protoplasti, ćelije lista, ćelije korena, ćelije floema, polen). Ovaj pronalazak se može koristiti za uvođenje polinukleotida u bilo koju biljnu vrstu, uključujući, ali bez ograničenja, monokotiledone i dikotiledone. Primeri biljaka od značaja uključuju, ali bez ograničavanja istima, kukuruz, sirak, pšenicu, suncokret, paradajz, krstašice, biber, krompir, pamuk, pirinač, soju, šećernu repu, šećernu trsku, duvan, ječam i uljanu repicu,Brassicasp., lucerku, raž, proso, šafraniku, kikiriki, slatki krompir, manioku, kafu, kokos, ananas, stabla limuna, kakao, čaj, bananu, avokado, smokvu, guavu, mango, maslinu, papaju, indijski orah, makadamiju, badem, zob, povrće, ukrasno bilje i četinare

Povrće uključuje, ali bez ograničavanja istima, paradajz, zelenu salatu, zeleni grašak, lima semenke, grašak i članove rodaCurcumis,kao što je krastavac, krastava dinja i dinja. Ukrasno bilje uključuje, ali bez ograničavanja na njih, azaleju, hortenziju, hibiskus, ruže, lale, narcise, petunije, karanfil, mlečiku i hrizantemu. Kulture useva su, takođe, od značaja uključujući, primera radi, kukuruz, sirak, pšenicu, suncokret, paradajz, krstašice, biber, krompir, pamuk, pirinač, soju, šećernu repu, šećernu trsku, duvan, ječam, uljanu repicu, itd..

Ovaj pronalazak je pogodan za bilo kog člana biljne familije monokotiledone, uključujući, ali bez ograničavanja istima, kukuruz, rižu, ječam, ovas, pšenicu, sirak, raž, šećernu trsku, ananas, konoplju, crni luk, bananu, kokos i urme.

G. Postupci za povećavanje biljnog prinosa

Dati su postupci za povećavanje biljnog prinosa. Postupci obuhvataju uvođenje u biljku ili biljnu ćeliju polinukleotida, koji sadrži, ovde izloženu,grgsekvencu. Kao što je ovde definisano, "prinos" biljke se odnosi na kvalitet i/ili kvantitet biomase, koju biljka proizvodi. Pod "biomasom" se podrazumeva bilo koji izmereni biljni proizvod. Povećanje proizvodnje biomase je bilo koje poboljšanje u prinosu izmerenog biljnog proizvoda. Povećanje biljnog prinosa ima nekoliko komercijalnih primena. Na primer, povećanje biomase biljnog lista može uvećati rod lisnatog povrća za ljudsku ili životinjsku ishranu. Pored toga, povećanje lisnate biomase može biti iskorišćeno za povećanje proizvodnje farmaceutskih ili industrijskih proizvoda, dobijenih iz biljaka. Povećanje prinosa može obuhvatiti bilo koje statistički značajno povećanje, uključujući, ali bez ograničenja na njih, povećanje od najmanje 1%, povećanje od najmanje 3%, povećanje od najmanje 5%, povećanje od najmanje 10%, povećanje od najmanje 20%, povećanje od najmanje 30%, povećanje od najmanje 50%, povećanje od najmanje 70%, povećanje od najmanje 100% ili veće povećanje.

U specifičnim postupcima, biljka se tretira efektivnom koncentracijom herbicida, pri čemu primena herbicida dovodi do povećanog biljnog prinosa. "Efektivnom koncentracijom" se smatra koncentracija, koja omogućuje povećanje prinosa biljke. Takve efektivne koncentracije za herbicide od značaja uopšteno su poznate u struci. Herbicidi se mogu primeniti ili pre ili posle nicanja, u skladu sa uobičajenim postupcima za primenu herbicida na poljima, koja sadrže useve, koji su učinjeni rezistentnim na herbicid, pomoću heterologne ekspresijegrggena pronalaska.

Takođe su obezbeđeni postupci za pružanje rezistencije na herbicid biljci ili biljnom delu. U tim postupcima, ovde izloženigrgpolinukleotid se uvodi u biljku, pri čemu ekspresija polinukleotida dovodi do tolerancije ili rezistencije na glifosat. Ovim postupkom proizvedene biljke mogu biti obrađene efektivnom koncentracijom herbicida i ispoljavati povećanu toleranciju na herbicid. "Efektivna koncentracija" herbicida u ovoj prijavi je količina, koja je dovoljna da uspori ili zaustavi rast biljaka ili biljnih delova, koji nisu prirodno otporni na herbicid ili nisu učinjeni rezistentnima na herbicid.

H. Postupci obuzdavanja korova na polju

Takođe su dati postupci za selektivno obuzdavanje korova na polju, na kome se nalazi biljka. U jednom ostvarenju, rezistencija na glifosat biljnog semena ili biljke jeste posledica umetanjagrgpolinukleotida, koji je ovde prikazan, u biljno seme ili biljku. U specifičnim postupcima, biljka se tretira efektivnom koncentracijom herbicida, pri čemu primena herbicida dovodi do selektivne kontrole korova ili drugih netransformisanih biljaka. "Efektivnom koncentracijom" se smatra koncentracija, koja obuzdava razvoj ili širenje korova ili drugih netransformisanih biljaka, bez značajnog uticaja na glifosat-rezistentnu biljku ili biljno seme. Takve efektivne koncentracije za herbicide od značaja uopšteno su poznate u struci. Herbicid se može primeniti ili pre ili posle nicanja, u skladu sa uobičajenim postupcima za primenu herbicida na poljima, na kojima se nalaze biljke ili biljno semenje, koji su učinjeni rezistentnima na herbicid.

/. Temperaturni spektar

Urađeno je nekoliko studija glifosatnog metabolizma u biljkama, koje su pokazale da biljke ne metabolišu glifosat ili ga metabolišu vrlo slabo. Glifosat brzo prodire kroz kutikulum, i prenosi se kroz biljku tokom značajnog vremenskog perioda (objavljeno u Kearnev i Kaufman, Eds (1988) Herbicides; Chemistrv, Degradation & Mode of Action Marcel Dekker, Inc., New York, 3:1-70 i Grossbard i Atkinson, Eds.

(1985) The Herbicide Glvphosate Buttenvorths, London, p. 25-34). Stoga je verovatno da je tolerancija na glifosat tokom produženog vremenskog perioda, nakon izlaganja glifosatu, neophodna biljkama od značaja u poljoprivredi. Kada temperature često prelaze 30°C tokom sezone rasta, bilo bi pogodno da se koristi EPSP sintaza s tolerancijom na glifosat, koja zadržava aktivnost na povišenim temperaturama.

U jednom ostvarenju tekućeg pronalaska, EPSP sintaza pokazuje termičku stabilnost na temperaturi, koja je viša ili niža od ambijentalne temperature okruženja. Pod "termičkom stabilnošću" se podrazumeva da je enzim aktivan na višoj ili nižoj temperaturi od ambijentalne temperature okoline, tokom dužeg vremenskog perioda, nego EPSP sintaza, koja nije termički stabilna na toj temperaturi. Primera radi, termički stabilna EPSP sitetaza ima enzimsku aktivnost tokom više od oko 1 sata, duže od oko 2 sata, oko 3, oko 4, oko 5, oko 6, oko 7, oko 8, oko 9, oko 10, oko 11, oko 12, oko 13, oko 14, oko 15, oko 20, oko 25 sati ili duže, na temperaturi, koja je viša ili niža od ambijentalne temperature okoline. Za potrebe ovog pronalaska, "ambijentalna" temperatura okoline je oko 30°C. U nekim ostvarenjima, temperatura viša od ambijentalne temperature je temperatura od ili iznad približno 32°C, približno 34°C, približno 37°C, približno 40°C, približno 45°C, približno 50°C, približno 55°C, približno 60°C, približno 65°C ili viša. Temperatura niža od ambijentalne temperature je temperatura od ili ispod oko 28°C, ispod oko 27°C, oko 26°C, oko 25°C, oko 23°C, oko 20°C, oko 18°C, oko 15°C, oko 10°C, temperatura od ili ispod približno 5°C, ili oko 0°C. Postupci za ispitivanje aktivnosti EPSP sintaze ovde su detaljnije razmotreni na drugom mestu. Za potrebe tekućeg pronalaska, termički stabilna EPSP sintaza se smatra aktivnom kada ona funkcioniše na oko 90% do 100%, oko 80% do oko 90, oko 70% do oko 80%, oko 60% do oko 70% ili oko 50% do oko 60% maksimalnog nivoa aktivnosti, koja se zapaža na temperaturi, koja je optimalna za taj enzim.

Tako su ovde obezbeđeni postupci i smeše za povećavanje tolerancije na glifosat, na temperaturama, koje su više od ambijentalnih temperatura okoline. U jednom ostvarenju, postupci obuhvataju uvođenje u biljku nukleotidne sekvence koja kodira enzim EPSP sintetazu s tolerancijom na glifosat, koja je navedena u SEQ ID NO;8, 10, 14, 28, 30, 32 ili 34, i uzgoj biljke na temperaturi, koja je viša od ambijentalne temperature okruženja. U specifičnim ostvarenjima, temperatura uzgoja je veća od temperature sredine tokom prošeka od najmanje oko 2 sata dnevno, najmanje oko 3 sata dnevno, najmanje oko 4 sata dnevno, najmanje oko 5, oko 6, oko 7, oko 8, oko 9, oko 10, oko U, oko 12, oko 14, oko 16, oko 18, oko 20, najmanje oko 22 sata na dan ili sve do oko 24 sata dnevno, tokom sezone rasta biljke.

U drugom ostvarenju, postupak obuhvata uvođenje u biljku nukleotidne sekvence koja kodira enzim EPSP sintetazu, tolerantnu na glifosat, koja je navedena u SEQ ID NO:8, 10, 14, 28, 30, 32 ili 34, dovođenje biljke u kontakt sa herbicidno-efektivnom koncentracijom glifosata, i uzgoj biljke na temperaturi, koja prelazi ambijentalnu temperaturu okoline, tokom najmanje 1 sata, najmanje oko 2 sata, najmanje oko 3, najmanje oko 4 ili više sati na dan, u toku najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više dana, nakon aplikovanja glifosata na biljku, pri čemu su dani, u kojima se dešavaju temperaturna prekoračenja ambijentalne temperature okoline, u toku sezone rasta biljke.

Primeri koji slede dati su kao ilustracija, a ne kao ograničenje.

OGLEDI

Primer 1.syngrg23dizajn i ekspresija

GRG23 (SEQ ID NO:2) je EPSP sintaza koja ima odlične kinetičke vrednosti zaKm, KiiVmax(U.S. Patentna prijava br. 60/741,166, podnesena 1. decembra 2005.). Dizajnirana je i sintetisana nova genska sekvenca koja kodira GRG23 protein (U.S. Patentna prijava br. 60/741,166 podnesena 1. decembra 2005.). Dobijena sekvenca je ovde obezbeđena kao SEQ ID NO:6 i označena kao" syngrg23".Okvir otvoren za čitanje je kloniran u ekspresioni vektor pRSFlb (Invitrogen) postupcima koji su poznati u struci.

syngrg23gen koji kodira GRG23 je kloniran u vektor pUC19 kako bi se kreirao pAX748. Korišćeni su PCR prajmeri koji zauzimajusyngrg23u ovaj vektor kako bi se amplifikovaosyngrg23iz pAX748 upotrebom Mutazvme II sistema (Stratagene) da bi se uvele nasumične mutacije usyngrg23kodirajući region. Templat se razblaži 1:50 u "error-prone" (moguće pravljenje greške, prim. prev.) PCR reakciji i amplifikacija se izvodi kroz 30 ciklusa. Nastali PCR proizvod je svaren restrikcionim enzimimaBamHliSgsI, prečišćen na gelu i povezan u vektor pRSF lb kako bi se kreirala mutagenizovanasyngrg23biblioteka.

Mutagenizovanesyngrg23biblioteke su transformisane uE. colisoj BL21<*>DE3 star (Invitrogen). Nakon transformisanja, pojedinačne kolonije se stavljaju na 1 X M63 medijum koji sadrži 150 mM glifozatada bi se izdvojili klonovi koji zadržavaju enzimsku aktivnost i toleranciju rasta.

Primer 2. Skrinin<g>na glifosatnu rezistenciju na pločama

Veze biblioteke su transformisane u BL21<*>DE3 kompetentneE. colićelije (Invitrogen). Transformacije su izvedene u skladu sa uputstvima proizvođača sa sledećim modifikacijama. Nakon inkubacije tokom 1 sata na 37°C u SOC medijumu, ćelije se sedimentiraju centrifugiranjem (5 minuta, 1000 x g, 4°C). Ćelije se isperu sa 1 ml M63+, ponovo centrifugiraju i dekantuje se supernatant. Ćelije se isperu i drugi put sa 1 ml M63+ i resuspenduju se u 200 u.1 M63+.

Za izbor mutantnih GRG23 enzima koji prenose rezistenciju na glifosat uE. coli,ćelije se polažu na ploče sa M63+ agarnim medijumom i sadrže 150 mM glifosata, 0.05 mM IPTG (izopropil-beta-D-tiogalaktopiranozid) i 50 (J-g/ml kanamicina. M63+ medijum sadrži 100 mM KH2P04, 15 mM (NH4)2S04, 50 uM CaCl2, 1^iM FeS04, 50 u,M MgCb, 55 mM glukoze, 25 mg/litru L-prolina, 10 mg/litar tiamin HC1, dovoljno NaOH da se podesi pH na 7.0 i 15 g/litar agara. Ploče se inkubiraju tokom 36 sati na 37°C.

Pojedinačne kolonije su sakupljene i raspoređene u ploče sa 384 reakciona mesta. Dve ploče sa 384 reakciona mesta su kreirana na ovaj način. Treća ploča sa 384 klona je popunjena iz kolonija koje su uzgajane na pločama bez glifosata.

Primer 3. Izolacija i analiza GRG23 varijanti rezistentnih na glifosat

BL21<*>DE3 ćelije transformisane mutagenizovanimsyngrg23i/iligrg23varijantama, identifikovane su uzgajanjem na glifosatnim pločama. Pripreme se ekstrakti mutagenizovanihsyngrg23igrg23varijanti i testiraju na unapređenu enzimsku aktivnost. Kolonije koje su identifikovane na glifosatnim pločama su unesene u blokove sa 96 reakcionih mesta koja sadrže LB medijum i uzgajane su do O.D. (optička gustina, prim. prev.) od oko 0.6. Zatim se dodaje IPTG (0.5 mM) i blokovi se inkubiraju preko noći na 20°C da bi se indukovala ekspresija proteina. Iz ćelijskih kuglica se pripreme ekstrakti proteina upotrebom POP culture reagensa (Novagen) i Lvsonase (Novagen), a enzimska aktivnost u sirovim lizatima se meri posle grejanja ekstrakata u toku 30 minuta na 37°C. Ekstrakti sa aktivnošću koja je veća od dve standardne devijacije iznad srednje vrednosti seta ekstrakata koji sadrže odgovarajući kontrolni protein (na primer, GRG23) izdvajaju se za dalje ispitivanje.

Klonovi koji su pokazivali povećanu aktivnost nakon inkubacije u vidu sirovih ekstrakata su uzgajani u 250 mL LB kultura i indukovana je ekspresija proteina sa IPTG. Posle indukcije, mutantni GRG23 protein je prečišćen iz svake kulture afinitetnom hromatografijom, upotrebom kobaltne smole (Novagen). Prečišćeni proteini su onda testirani na enzimsku aktivnost nakon grejanja od 0, 2, 4 i otprilike 16 sati na 37°C.

Primer 4. Unapredene GRG23 varijante.

Iz DNK biblioteke mutagenizovanog syngrg23, identifikovano je nekoliko klonova sa poboljšanom aktivnosti na 37°C. Određene su DNK sekvence klonova koji odgovaraju ovim ekstraktima. Tabela 1 prikazuje aminokiselinske izmene identifikovane u šest varijanti GRG23 koje zadržavaju rezistenciju na glifosat:grg23( L3Pl. B20)(SEQ ID NO:20) koja kodira aminokiselinsku sekvencu GRG23(L3P1.B20) (SEQ ID NO:21),grg23( L3Pl. B3)(SEQ ID NO:22) koja kodira aminokiselinsku sekvencu grg23 (L3P1.B3) (SEQ ID NO:23),grg23( L3Pl. F18)(SEQ ID NO:24) koja kodira aminokiselinsku sekvencu GRG23(L3P1.F18) (SEQ ID NO:25); igrg23( L3P1. 023)

(SEQ ID NO:26) koja kodira aminokiselinsku sekvencu GRG23(L3P1.023) (SEQ ID NO:27).

Klonovi su rasli u 250 mL LB kultura i izolovano je indukovanje ekspresije proteina, kako je prethodno opisano. Zatim su testirani prečišćeni proteini na enzimsku aktivnost posle zagrevanja tokom 0, 2, 4 i otprilike 16 sati na 37°C. Nađeno je da jedan od klonova, nazvan "M5", zadržava povećan odnos svoje enzimske aktivnosti nakon produžene inkubacije na 37°C (Tabela 2). Određena je DNK sekvenca ovih klonova i gen je ovde označen kaogrg23( acel)(SEQ ID NO:8). Protein koji nastaje ekspresijomgrg23( acel)označen je kao GRG23(ACE1) (SEQ ID NO:9).

GRG23(ACE1) sadrži 2 amino kiselinske supstitucije u odnosu na divlji tip GRG23 proteina: A49—>T i S276—>T. Vektor pRSFIb koji sadrži ovaj gen je označen kao pAX3801. Slika 1 prikazuje relativnu stabilnost GRG23(ACE1) prema GRG23 na povišenim temperaturama.

Primer 5. Određivanje EPSPS aktivnosti GRG- 23 varijanti

Ekstrakti koji sadrže GRG23 varijantne proteine su ispitani na aktivnost EPSP sintaze, kako je opisano u U.S. Patentnoj prijavi br. 60/741,166 podnesenoj 1. decembra 2005. Testovi se izvode u konačnoj zapremini od 50 uJ koja sadrži 0.5 mM šikimat-3-fosfata, 200 \ xM fosfoenolpiruvata (PEP), 1 IJ/ml ksantin oksidaze, 2 IJ/ml nukleozid fosforilaze, 2.25 mM inozina, 1 IJ/ml peroksidaze rena, 2 mM glifosata, 50 mM HEPES/KOH pH 7.0, 100 mM KC1 i AMPLEX®Red (Invitrogen) prema preporukama proizvođača. Ekstrakti su inkubirani sa svim sastojcima testa osim šikimat-3-fosfata u toku 5 minuta na sobnoj temperaturi i test se startuje dodavanjem šikimat-3-fosfata. Aktivnost EPSP sintaze se meri korišćenjem Spectramax Gemini XPS fluorescentnog spektrometra (Molecular Dvnamics, ekscitacija na 555 nm; emisija na 590 nm).

Potpuno određivanje kinetičkih parametara je izvedeno na prečišćenom proteinu kako je prethodno objašnjeno (U.S. Patentna prijava br. 60/ 741,166 podnesena 1. decembra 2005.), podešavanjem za količinu određenog proteina pomoću Bradford testa kako je poznato u struci. Za ma koliku koncentraciju glifosata, aktivnost EPSP sintaze je izmerena u funkciji širokog opsega PEP koncentracija. Podaci se postavljaju u Michaelis-Mentenovu jednačinu korišćenjem KALEIDA-GRAPH® softvera (Synergy Softvvare) i koriste za određivanje Km (prividna Km) EPSP sintaze za tu koncentraciju glifosata. Vrednosti prividne Km su određene za ne više od četiri koncentracije glifosata i Ki za EPSPS za glifosat je izračunata iz krive prividna Km prema koncentraciji glifosata, korišćenjem jednačine (ml<*>x/(m2+x); ml=l; m2=l), poznate u struci.

Primer 6. Identifikacija grg23 ( ace2).

GRG23(ACE1) sadrži dve aminokiselinske izmene u odnosu na GRG23. Kako bi se odredilo da li dodatne supstitucije na ovim položajima mogu dalje poboljšati aktivnost, generiše se DNK biblioteka kojom se dobijaju klonovi koji ekspresuju proteine koji su suštinski bili mutirani na položajima 49 i 276 što odgovara GRG23 (SEQ ID NO:2). Klonovi koji su pokazali rezistenciju na glifosat su izdvojeni uzgajanjem na glifosatnim pločama, a dalje su uzgajani i ispitani na kinetička svojstva kako je opisano.

Iznenađujuće, jedan klon, ovde označen kaogrg23( ace2)(SEQ ID NO: 10), koji kodira GRG23(ACE2) protein (SEQ ID NO:l 1) identifikovan je da ima poboljšanu termostabilnost. DNK sekvencagrg23( ace2)pokazuje da GRG23(ACE2) sadrži jednu aminokiselinsku izmenu (ostatak 276 u GRG23 zamenjen argininom).

Primer 7. Poređenje GRG23 i GRG51 i mutageneza nepodudaraiućih ostataka.

Generisane su dve biblioteke da bi se postigle permutacije aminokiselinskih sekvenci, moguće iz poređenja aminokiselinskih sekvenci GRG23 i GRG51. Prva biblioteka uvodi varijaciju iz GRG51 aminokiselinske sekvence ugrg23( ace2)kodirajući region. Druga biblioteka uvodi varijaciju iz GRG23(ACE2) aminokiselinske sekvence ugrg51kodirajući region.

Klonovi nastalih biblioteka su ispitani na (1) mogućnost da potvrde rezistenciju na glifosat u ćeliji i, (2) aktivnost posle produžene inkubacije na 37°C. Detaljnije su analizirani i sekvencionirani ukupni češći klonovi. Jedan naročiti klon, ovde označen kaogrg51. 4(SEQ ID NO: 12), koji kodira protein GRG51.4 (SEQ ID NO: 13) sadrži nekoliko aminokiselinskih izmena u odnosu i na GRG23(ACE2) i GRG51. Aminokiselinske izmene koje su prisutne u GRG51.4 u odnosu na GRG23(ACE2) onda se uvode ugrg23( ace2)gen, sa ciljem dobijanjagrg23( ace3)(SEQ ID NO: 14), koji kodira GRG23(ACE3) protein (SEQ ID NO: 15). GRG23(ACE3) ispoljava superiornu aktivnost i termostabilnost u odnosu na GRG23 i GRG23(ACE2).

GRG23(acel) je mutagenizovan, a klonovi su testirani sa ciljem identifikacije klonova koji ekspresuju varijante koje imaju poboljšanu termostabilnost i/ili aktivnost. Jedan klon,grg23( L5P2J2)(SEQ ID NO: 16), koji kodira GRG23(L5P2.J2) (SEQ ID NO: 17), identifikovanje zahvaljujući svojim poboljšanim svojstvima. GRG23(L5P2.J2) ima tri aminokiselinske izmene u odnosu na GRG23(ACE1), kako je prikazano u sledećoj Tabeli 4.

Oligonukleotidna mutageneza je korišćena da se modifikujegrg23( ace3)kodirajući region kako bi obuhvatio svaku od amino kiselinskih izmena identifikovanih u GRG23(L5P2.J2). Identifikovanje klon sa genom koji sadrži ove modifikacije i, nađeno je da kodira protein koji ima izmenjena kinetička svojstva u odnosu na GRG23(ACE3). Ovaj gen je označenkao grg23( ace4)(SEQ ID NO: 18). Protein kojegkodira grg23( ace4)i koji je obeležen kao GRG23(ACE4) (SEQ ID NO: 19) sadrži kao jednu amino kiselinsku izmenu u odnosu na GRG23(ACE3) (valin 101 u fenilalanin). Na osnovu ovog rezultata, izvedena je zasebna mutageneza oligonukleotida kako bi se testirala kinetika svake moguće amino kiselinske supstitucije na položaju 101. Nijedna od amino kiselinskih izmena nije dovela do daljeg unapređenja kinetičkih svojstava u poređenju sa GRG23(ACE4). Vidi Tabelu 5.

Primer 8. Poboljšana termostabilnost GRG23 varijanti

Termostabilnost GRG23 i nekoliko varijanti je određena inkubacijom uzoraka proteina na 37°C tokom opsega vremena, a zatim je određena zaostala EPSPS aktivnost, na način kako je ovde opisano i, upoređena je aktivnost sa onom koju ima kontrolni uzorak, koji je inkubiran na 4°C. Tabela 6 pokazuje da GRG23 varijante GRG23(ACE1), GRG23(ACE2) i GRG23(ACE3) imaju poboljšanu termostabilnost.

Primer 9.Varijante grg23 ( ace3 )

Oligonukleotidna mutageneza je korišćena da bi se stvorile varijantegrg23( ace3)što dovodi do ekspresije proteina sa modifikacijama na aminokiselinske ostatke koji odgovaraju položajima 169 do 174 u SEQ ID NO: 15. Reakcije mutageneze su izvedene upotrebom QuickChange® kita (Stratagene) prema uputstvima proizvođača. Plazmidni klonovi su transformisani uE. colićelijsku liniju BL21<*>DE3 i ekspresija proteina je indukovana pomoću IPTG, kako je poznato u struci. Proteini su prečišćeni pomoću afinitetnog vezivanja na koloni nikla (TALON metalna afinitetna smola, Clontech). Nativni GRG23(ace3) protein je, isto tako, ekspresovan i prečišćen za upotrebu kao kontrola. Nakon prečišćavanja svakog enzima, izmerena je koncentracija proteina Bradford testom, kako je poznato u struci.

Primer 10. Analiza kinetike GRG23( ace3") varijanti

GRG23(ace3) varijante GRG23(ace3) R173K (SEQ ID NO:29, koju kodira SEQ ID NO:28), GRG23(ace3) G169V/L170V (SEQ ID NO:31, koju kodira SEQ ID NO:30), GRG23(ace3) R173Q (SEQ ID NO:33, koju kodira SEQ ID NO:32) i GRG23(ace3) I174V (SEQ ID NO:35, koju kodira SEQ ID NO:34) su opisane pomoću enzimskih testova, na način kako su ovde opisani i, upoređene su sa nativnim GRG23(ace3) enzimom. Za svaki enzim je određena Km(app) pri svakoj od nekoliko koncentracija glifosata, a stavljanje Km(app) u funkciju prema koncentraciji glifosata korišćeno je za izračunavanje Ki za svaki enzim. Termostabilnost je za svaki enzim ispitana inkubiranjem enzima na 37°C u toku 16 sati i zatim, merenjem zaostale enzimske aktivnosti (kao Vmax) u odnosu na kontrolni enzim koji je inkubiran na 4°C.

Kinetička analiza otkriva da se GRG23(ace3)R173K, GRG23(ace3)R173Q, GRG23(ace3)I174V i GRG23(ace3)G169V/L170V u biti ne razlikuju od nativnog GRG23(ace3) i pokazuju praktično identičnu katalitičku brzinu, ekstremno visoku rezistenciju na glifosat i, veoma dobar afinitet za PEP. Zapažena Km za PEP od 19u.M za G169V/L170V (prema 15u,M za GRG23(ace3)) može predstavljati neznatno niži afinitet vezivanja za PEP u odnosu na GRG23(ace3). Svaka od četiri varijante ima termostabilnost veću od 95% nakon 16 sati na 37°C. Kinetičke vrednosti određene za GRG23(ace3) varijante GRG23(ace3)R173K, GRG23(ace3)R173Q i GRG23(ace3) I174V su prikazane u Tabeli 6.

Primer 11. Kloniranjes<y>ngrg23i varijantisrs23u ekspresionu kasetu biljke.

Zasyngrg23i svaku od varijantigrg23koje su ovde opisane (uključujući, na primer,grg23( acel), grg23( ace2), grg23( ace3), grg23( ace4), grg23( ace3) R173K,

grg23( ace3) R173Q, grg23( ace3) U74V, grg23( ace3) G169V/ L170Vigrg23( L5P2. J2)),

okvir otvoren za čitanje (ORF) se amplifikuje PCR-om od pune dužine DNK templata. Na svaki kraj okvira otvorenih za čitanje tokom PCR dodaju seHindIII restrikcioni položaji. Sem toga, nukleotidna sekvenca ACC se dodaje neposredno 5' prema start kodonu gena kako bi se povećala translaciona efikasnost (Kozak (1987) Nucleic Acids Research 15:8125-8148; Joshi (1987) Nucleic Acids Research 15:6643-6653). PCR proizvod se klonira i sekvencionira upotrebom tehnika dobro poznatih u struci kako bi se osiguralo da se ne unesu mutacije u toku PCR.

Plazmid koji sadrži PCR proizvod se svari saHindIII i izoluje se fragment koji sadrži intaktni ORF. Ovaj fragment se klonira uHindIII položaj plazmida, kao što je pAX200, biljni ekspresioni vektor koji sadrži aktinski promoter pirinča (McElrov et al.

(1991) Molec. Gen. Genet. 231:150-160) i Pinll terminator (An et al. (1989) The Plant Cell 1:115-122). Fragment promoter - gen - terminator se iz ovog intermedijernog plazmida zatim subklonira u plazmid pSBll (Japan Tobacco, Inc.) kako bi se formirao konačni plazmid na bazi pSBl 1. U nekim slučajevima, može biti poželjnije da se stvori izmenjena konstrukcija u kojoj se sekvenca hloroplasta upravljača kodira kao fuzija za N-kraj u:syngrg23, grg23( acel), grg23( ace2), grg23( ace3), grg23( ace4), grg23( L5P2. J2),grg23( ace3) R173K, grg23( ace3) R173Q, grg23( ace3) I174V,iligrg23( ace3) G169V/ LI70V konstrukcijama.Ovi plazmidi na bazi pSBll su obično tako organizovani da se DNK fragment, koji sadrži konstrukciju promoter -gen- terminator, ili konstrukciju promoter - hloroplast upravljač - gen - terminator, može izrezati dvostrukom digestijom restrikcionim enzimima kao što suKpnI iPmeI i, koristiti za transformaciju u biljkama putem injekcije aerosolnog zraka. Struktura dobijenih klonova na bazi pSBll se potvrđuje restrikcionom digestijom i gel elektroforezom, kao i sekvencioniranjem kroz brojne klonirajuće spojnice.

Plazmid se mobiliše uAgrobacterium tumefacienssoj LBA4404, koji takođe usidrava plazmid pSBl (Japan Tobacco, Inc.), korišćenjem procedura tro-izvornog sparivanja («triparental mating» je oblik bakterijske konjugacije, prim. prev.) koje su dobro poznate u struci, i postavlja na ploče sa medijumom koji sadrži spektinomicin. Plazmidni klon na bazi pSBl 1 nosi rezistenciju na spektinomicin ali je plazmid sa uskim opsegom domaćina i ne može se umnožavati uAgrobacterium- u.Klonovi sa rezistencijom na spektinomicin se pojavljuju kada se plazmidi na bazi pSBl 1 integrišu u plazmid pSBl u širokom rasponu domaćina putem homologne rekombinacije. Kointegrisani proizvod pSBl i plazmida na bazi pSBll se potvrđuje Southern hibridizacijom. SojAgrobacterium- akoji usidrava kointegrat se koristi za transformaciju kukuruza postupcima poznatim u struci, kao što je na primer, Purelntro postupak (Japan Tobacco).

Primer 12. Transformacija biljnih ćelija pomoćuAgrobacterium - posredovane

transformacije

Najbolje je klipove kukuruza sakupljati 8-12 dana posle oprašivanja. Embrioni se izoluju iz klipova i ovi embrioni, veličine 0.8-1.5 mm, najbolji su za upotrebu u transformaciji. U pogodan medijum za inkubaciju kao što je DN62A5S medijum (3.98 g/L N6 soli; 1 ml/L (od 1000 x matični) N6 vitamina; 800 mg/L L-asparagina; 100 mg/L mio-inozitola; 1.4 g/L L-prolina; 100 mg/L kaz-amino kiselina; 50 g/L saharoze; 1 ml/L (od 1 mg/ml matičnog) 2,4-D), embrioni se polože tako da na gore bude postavljen scutellum i, inkubiraju se preko noći na 25°C u mraku. Ipak, nije neophodnoper seinkubirati embrione preko noći.

Dobijeni eksplanti se prenose na kvadratna sita (30-40 po ploči), prenose na osmotski medijum tokom otprilike 30-45 minuta, a onda se prenose na ploču za ozračivanje (vidi, na primer, PCT Publikaciju br. NVO/138514 i U.S. Patent br. 5,240,842).

DNK konstrukcije namenjene ekspresovanju GRG proteina ovog pronalaska u ćelijama biljaka, ubrzavaju se u tkivu biljke upotrebom akceleratora sa aerosolnim zrakom, koji suštinski koristi uslove kao što su opisani u PCT Publikaciji br. WO/0138514. Posle ozračivanja, embrioni se inkubiraju otprilike tokom 30 min na osmotskom medijumu i polažu na inkubacioni medijum preko noći na 25°C, u mraku. Kako bi se izbeglo neprikladno oštećenje ozračenih eksplanata, inkubiraju se najmanje 24 sata pre prenosa u medijum za obnavljanje. Embrioni se onda rašire po medijumu za period obnavljanja tokom otprilike 5 dana, 25°C u mraku, zatim se prenose u medijum za izdvajanje. Eksplanti se inkubiraju u medijumu za izdvajanje do osam nedelja, što zavisi od prirode i karakteristika za te prilike korišćenog izdvajanja. Posle perioda izdvajanja, dobijeni kalus se prenosi u medijum za sazrevanje embriona sve dok se ne zapazi formiranje zrelih somatskih embriona. Dobijeni zreli somatski embrioni se onda polažu pod slabo svetio, i inicira se proces regeneracije postupcima poznatim u struci. Nastajućim izdancima se omogućava da puste korenje na medijumu za okorenjivanje, a dobijene biljke se prenose u saksije i razmnožavaju se kao transgenske biljke.

Materijali

DN62A5S Medijum

pH rastvora se podesi na pH 5,8 sa IN KOH/1N KC1, doda Gelrite (Sigma) do 3 g/L i, autoklavira. Posle hlađenja na 50°C, doda se 2 ml/L matičnog rastvora srebro nitrata (Phytotechnology Labs) od 5 mg/ml. Propisani prinosi otprilike 20 ploča.

Primer 13. Transformacija enzima EPSP sintaze u ćeli je biljke kukuruza pomoću

Agrobacterium - posredovanetransformacije

Klipovi se najbolje sakupljaju 8-12 dana posle oprašivanja. Embrioni se izoluju iz klipova i ovi embrioni, veličine 0.8-1.5 mm, najbolji su za upotrebu u transformaciji. U pogodan medijum za inkubaciju, embrioni se polože tako da na gore bude postavljen scutellum i, inkubiraju se preko noći na25°C u mraku.

Ipak, nije neophodnoper seinkubirati embrione preko noći. Embrioni se dovode u kontakt sa sojemAgrobacteriumkoji sadrži odgovarajuće vektore koji imaju enzim EPSP sintazu ovog pronalaska za Ti plazmidom posredovani transfer tokom 5-10 min, a zatim se polažu na medijum za ko-uzgajanje tokom 3 dana (25°C, u mraku). Posle ko-uzgajanja, eksplanti se prenose u medijum za period obnavljanja tokom otprilike pet dana (25°C, u mraku). Eksplanti se inkubiraju u selekcionom medijumu do ukupno osam nedelja, što zavisi od prirode i karakteristika za te prilike korišćenog izdvajanja. Posle perioda izdvajanja, dobijeni kalus se prenosi u medijum za sazrevanje embriona sve dok se ne zapazi formiranje zrelih somatskih embriona. Dobijeni zreli somatski embrioni se onda polažu pod slabo svetio, i inicira se proces regeneracije, kako je već poznato u struci. Nastajućim izdancima se omogućava da puste korenje na medijumu za okorenjivanje, a dobijene biljke se prenose u saksije i razmnožavaju se kao transgenske biljke.

NABRAJANJE SEKVENCI

Claims (16)

1. Molekul nukleinske kiseline izdvojen iz grupe, koja se sastoji od: a) molekula nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 28, 30, 32 ili 34; i b) molekula nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29, 31, 33 ili 35.

2. Molekul nukleinske kiseline, kao u patentnom zahtevu 1, pri čemu je navedena nukleotidna sekvenca operativno povezana sa promoterom koji može usmeriti ekspresiju kodirajuće sekvence u biljnoj ćeliji.

3. Molekul nukleinske kiseline, kao u patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu je navedena nukleotidna sekvenca sintetska sekvenca koja je dizajnirana za ekspresiju u biljkama.

4. Vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline, kao u patentnom zahtevu 1, 2 ili 3, poželjno dalje obuhvata molekul nukleinske kiseline koji kodira heterologe polipeptide.

5. Ćelija domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline, kao u patentnom zahtevu 2 ili 3, poželjno je to bakterijska domaćinska ćelija ili biljna ćelija.

6. Transgenska biljka koja sadrži biljnu domaćinsku ćeliju, kao u patentnom zahtevu 5, poželjno, pri tome, navedena biljka je izdvojena iz grupe koja se sastoji od: kukuruza, sirka, pšenice, suncokreta, paradajza, krstašica, bibera, krompira, pamuka, pirinča, soje, šećerne repe, šećerne trske, duvana, ječma i uljane repice.

7. Transgensko seme koje sadrži molekul nukleinske kiseline, kao u patentnom zahtevu 1,2 ili 3.

8. Rekombinantni polipeptid koji je izdvojen iz grupe, koja se sastoji od: a) polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29, 31, 33 ili 35; i b) polipeptid koji je kodiran nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 28, 30, 32 ili 34, koji poželjno dalje obuhvata heterolognu aminokiselinsku sekvencu.

9. Postupak za proizvodnju polipeptida sa aktivnošću rezistencije na herbicide, koji obuhvata uzgajanje ćelije domaćina, kao u patentnom zahtevu 5, u uslovima u kojima se ekspresuje molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid, navedeni polipeptid je izdvojen iz grupe koja se sastoji od: a) polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29, 31, 33 ili 35; i b) polipeptid koji je kodiran nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 28, 30, 32 ili 34.

10. Postupak za prenos rezistencije na herbicide u biljci, navedeni postupak obuhvata transformisanje navedene biljke sa DNK konstrukcijom, navedena konstrukcija sadrži promoter koji upravlja ekspresijom u biljnoj ćeliji, koji je operabilno povezan sa nekleotidnom sekvencom koja je izdvojena iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO: 28, 30, 32 ili 34 i regenerisanje transformisane biljke, poželjno gde je navedeni herbicid glifosat.

11. Biljka koja ima u svom genomu stabilno inkorporiranu DNK konstrukciju, koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji ima aktivnost rezistencije na herbicid, pri čemu je navedena nukleotidna sekvenca izdvojena iz grupe koja se sastoji od: a) molekula nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 28, 30, 32 ili 34; i b) molekula nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29, 31, 33 ili 35.

12. Biljka, kao u patentnom zahtevu 11, pri čemu je navedena biljka biljna ćelija, biljka soje ili kukuruzna biljka.

13. Biljka, kao u patentnom zahtevu 11, pri čemu je navedena biljka izdvojena iz grupe, koja se sastoji od: kukuruza, sirka, pšenice, suncokreta, paradajza, krstašica, bibera, krompira, pamuka, pirinča, soje, šećerne repe, šećerne trske, duvana, ječma i uljane repice.

14. Postupak za povećavanje vitalnosti ili prinosa u biljci, koji obuhvata: a) obezbeđivanje biljke koja sadrži nukleotidnu sekvencu izloženu u SEQ ID "NO: 28, 30, 32 ili 34; b) dovođenje u kontakt navedene biljke sa efektivnom koncentracijom glifosata; i c) uzgajanje navedene biljke u uslovima gde je temperatura viša od temperature sredine okoline tokom najmanje dva uzastopna sata dnevno, u toku najmanje četiri dana nakon kontakta sa pomenutim glifosatom, pri čemu su navedeni dani nakon kontakta u okviru perioda rasta biljke, pri čemu su vitalnost ili prinos navedene biljke veći od vitalnosti ili prinosa biljke koja ekpresuje EPSP sintazu tolerancije na glifosat koja nema temperaturni optimum veći od temperature sredine okoline, poželjno u kome je temperatura u koraku (c) oko 32°C do 60°C.

15. Postupak za prenos rezistencije na glifosat u biljci, koji obuhvata: a) obezbeđivanje biljke koja sadrži nukleotidnu sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 28, 30,32 ili 34; b) dovođenje u kontakt navedene biljke sa efektivnom koncentracijom glifosata; i c) uzgajanje navedene biljke u uslovima gde je temperatura viša od temperature sredine okoline tokom najmanje dva uzastopna sata dnevno, u toku najmanje četiri dana nakon kontakta sa pomenutim glifosatom, pri čemu su navedeni dani nakon kontakta u okviru perioda rasta biljke.

16. Postupak kao u patentnom zahtevu 14, u kome je temperatura u koraku (c) otprilike 32°C do oko 60°C, u kome je poželjno temperatura u koraku (b) oko 37°C.