ES2360596T3

ES2360596T3 - Moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas del ciclo celular de las plantas y usos de las mismas.

Info

Publication number: ES2360596T3
Application number: ES01949824T
Authority: ES
Inventors: Dirk Inze; Veronique Boudolf; Lieven De Veylder; Juan Antonio Torres Acosta; Zoltan Magyar
Original assignee: CropDesign NV
Current assignee: CropDesign NV
Priority date: 2000-05-12
Filing date: 2001-05-14
Publication date: 2011-06-07
Anticipated expiration: 2021-05-14
Also published as: US20080207449A1; US20120216320A1; CA2408038A1; JP2003532421A; EP1311680B1; AU2001270936B2; DE60144021D1; US8193414B2; AU2001270936C1; CA2408038C; WO2001085946A3; EP1311680A2; AU7093601A; WO2001085946A2; ATE498013T1

Abstract

Método para incrementar el rendimiento de un cultivo, mejorando la tasa de crecimiento o el tamaño de tejidos u órganos específicos en la planta, mejorando la tolerancia a las condiciones de estrés ambiental, o mejorando la tolerancia a los patógenos de la planta que comprende la modificación de la expresión en células particulares, tejidos u órganos de una planta de una secuencia genética que codifica una CCP, en donde dicha secuencia genética se selecciona del grupo que consiste de: (i) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 27 o en la SEQ ID NO: 56; (ii) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 93 o en la SEQ ID NO: 122; (iii) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más, idéntica a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 27 o de la SEQ ID NO: 56, o un complemento de las mismas, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido capaz de interactuar con el dominio del cuello de KLPNT2; (iv) una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 50 nucleótidos de la SEQ ID NO: 27 o de la SEQ ID NO: 56, o un complemento de las mismas, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido capaz de interactuar con el dominio del cuello de KLPNT2; (v) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 60% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 93 o de la SEQ ID NO: 122, en donde dicho polipéptido es capaz de interactuar con el dominio del cuello de KLPNT2; (vi) una molécula de ácido nucleico que hibrida a la molécula de ácido nucleico de cualquiera de (i) hasta (v) bajo condiciones rigurosas, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido capaz de interactuar con el dominio del cuello de KLPNT2; (vii) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de cualquiera de (i) hasta (vi); y (viii) una molécula de ácido nucleico que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de (i) hasta (vii), y una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido heterólogo.

Description

Moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas del ciclo celular de las plantas y usos de las mismas.

Antecedentes de la invención

La división celular juega un papel crucial durante todas las fases del desarrollo de la planta. La continuación de la organogénesis y las respuestas al crecimiento para un ambiente cambiante requieren de una regulación espacial, temporal y de desarrollo precisas de la división celular.

Los mecanismos básicos que controlan el progreso a través del ciclo celular parece que se conservan en todos los eucariotas superiores, aunque el control espacial y temporal de la división celular puede diferir marcadamente entre los diferentes organismos. Las plantas tienen características únicas de desarrollo que no se encuentran ni en los animales ni en los hongos. En primer lugar, debido a la presencia de una pared celular rígida, las células de las plantas no se puede mover y por lo tanto la organogénesis depende de la división celular y de la expansión celular en el sitio de la formación de nuevos organismos. En segundo lugar, las divisiones celulares están confinadas a regiones especializadas, llamadas meristemas. Estos meristemas producen continuamente nuevas células las cuales, a medida que se van moviendo fuera del meristema, se van diferenciado. La identidad del meristema en sí mismo puede cambiar de una fase vegetativa a una reproductiva, resultando en la formación de flores. En tercer lugar, el desarrollo de una planta es en gran medida pos embrionario. Durante la embriogénesis, el principal evento de desarrollo es el establecimiento del eje de brote de la raíz. La mayor parte del crecimiento de la planta se presenta después de la germinación, por medio de desarrollo iterativo en los meristemas. Por último, como consecuencia de la vida sésil de las plantas, el desarrollo y la división celular son, en gran medida, influenciadas por factores ambientales tales como la luz, gravedad, lesiones, nutrientes, y condiciones de estrés. Todas estas características se reflejan en una regulación específica de la planta de los factores que controlan la división celular.

El potencial sin precedentes de las plantas para organogénesis continua y crecimiento y crecimiento plástico también se basa en el estado competente o activo del aparato de división celular. El descubrimiento de un mecanismo común subyacente a la regulación del ciclo celular en levaduras y en animales ha conducido a esfuerzos para extender estos hallazgos al reino vegetal y está conduciendo a investigación destinada a la conversión del conocimiento reunido en rasgos útiles introducidos en plantas transgénicas.

Cuando las células eucariotas y, por lo tanto, también las células vegetales se dividen pasan a través de una secuencia altamente ordenada de eventos colectivamente llamada como el "ciclo celular". En resumen, la replicación o la síntesis del ADN (S) y la segregación mitótica de los cromosomas (M) se presentan con la intervención de las fases de intervalo (G1 y G2) y las fases siguen la secuencia G1-S-G2-M. La división celular se completa después de la citoquinesis, la última etapa de la fase M. Las células que han salido del ciclo celular y han pasado al reposo se dice que están en la fase G0. Las células en la etapa G0 pueden ser estimuladas para entrar nuevamente al ciclo celular en la fase G1. La transición entre las diferentes fases del ciclo celular se rigen básicamente por la activación/inactivación secuencia de una quinasa (llamada "quinasa dependiente de la ciclina", "CDC" o "CDK") por diferentes agonistas.

Se requieren proteínas llamadas ciclinas para la activación de la quinasa. Las ciclinas son también importantes para dirigir la actividad de la quinasa hasta un subconjunto dado de sustrato(s). Otros factores que regulan la actividad de las CDK incluyen inhibidores de las CDK (los CKI o los ICK, los KIP, los CIP, los INK), quinasa activadora de CDK (CAK) y CDK fosfatasa (CDC25) (Mironov et al. (1999) Plant Cell 11, 509 - 522 y Won K. et al. (1996) EMBO J. 15, 4182 - 4193).

Resumen de la invención

La presente invención proporciona el contenido según lo expuesto en cualquiera y en todos los numerales (1) a (14) a continuación:

1. Método para incrementar el rendimiento de cultivos, mejorando la tasa de crecimiento o el tamaño de tejidos u órganos específicos en la planta, mejorando la tolerancia a las condiciones de estrés ambiental, o mejorando la tolerancia a los patógenos de la planta que comprende la modificación de la expresión en células particulares, tejidos u órganos de una planta de una secuencia genética que codifican una CCP, en donde dicha secuencia genética se selecciona del grupo que consiste de:

(i) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 27 o en la SEQ ID NO: 56;

(ii) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 93 o en la SEQ ID NO: 122;

(iii) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más, idéntica a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 27 o de la SEQ ID NO: 56, o un complemento de las mismas, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido capaz de interactuar con el dominio del cuello de KLPNT2;

(iv) una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 50 nucleótidos de la SEQ ID NO: 27 o de la SEQ ID NO: 56, o un complemento de las mismas, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido capaz de interactuar con el dominio del cuello de KLPNT2;

(v) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 60% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 93 o de la SEQ ID NO: 122, en donde dicho polipéptido es capaz de interactuar con el dominio del cuello de KLPNT2;

(vi) una molécula de ácido nucleico que hibrida a la molécula de ácido nucleico de cualquiera de (i) hasta (v) bajo condiciones rigurosas, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido capaz de interactuar con el dominio del cuello de KLPNT2;

(vii) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de cualquiera de (i) hasta (vi); y

(viii) una molécula de ácido nucleico que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de (i) hasta (vii), y una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido heterólogo.

2. Método como el expuesto en el numeral 1 anterior, en donde dicha secuencia genética está operativamente conectada a una secuencia promotora operable por la planta.

3. Método como el expuesto en el numeral 1 ó 2 anterior, en donde la modulación de la expresión de dicha secuencia genética resulta en la modificación de una o más características morfológicas, bioquímicas o fisiológicas incluida: (i) una modificación de la longitud de la fase G1 y/o la fase S y/o la fase G2 y/o la fase M del ciclo celular de una planta; (ii) una modificación de la transición de fase G1/S y/o S/G2 y/o G2/M y/o M/G1 de una célula de la planta; (iii) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la división celular; (iv) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la replicación del ADN; (v) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora del conjunto de semillas y/o tamaño de la semilla y/o desarrollo de la semilla; (vi) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la formación de tubérculos; (vii) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la formación de frutos; (viii) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la formación de hojas; (ix) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la iniciación y/o desarrollo de brotes; (x) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la iniciación y/o el desarrollo de las raíces; (xi) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la iniciación y/o el desarrollo de las raíces laterales; (xii) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la formación del nódulo; (xiii) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de lo tupido de la planta; (xiv) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora del enanismo en la planta; (xv) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la senectud; (xvi) una modificación del grosor del tallo y/o de las características de resistencia y/o de resistencia al viento del tallo y/o de la longitud del tallo; (xvii) de modificación de la tolerancia y/o de la resistencia a estreses bióticos tales como infección por patógenos; y (xviii) de modificación de la tolerancia y/o de la resistencia a estreses abióticos tales como estrés por sequía estrés por salinidad.

4. Un método como el expuesto el numeral 1 anterior, en donde dichas condiciones de estrés ambiental incluyen sequía, salinidad, temperatura, o falta de nutrientes.

5. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de (i) hasta (viii) como se expone en el numeral 1 anterior.

6. Una célula huésped transfectada con el vector como se expone en el numeral 5 anterior, en donde dicha célula huésped comprende al menos un ácido nucleico como se define en cualquiera de (i) hasta (viii) como se expone en el numeral 1 anterior.

7. Una planta transgénica que comprende un polinucleótido heterólogo que contiene una molécula de ácido nucleico como se define en cualquiera de (i) hasta (viii) como se expone en el numeral 1 anterior.

8. La planta transgénica como se expone en el numeral 7 anterior, en donde la planta es una planta monocotiledónea.

9. La planta transgénica como se expone en el numeral 7 anterior, en donde la planta es una planta dicotiledónea.

10. La planta transgénica como se expone en el numeral 7 anterior, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de Arabidopsis thaliana, arroz, trigo, maíz, tomate, alfalfa, colza de semilla oleaginosa, soja, girasol, y canola.

11. Un método como el expuesto en el numeral 1 anterior, que comprende la introducción en la planta de una molécula de ácido nucleico CCP o de un polipéptido como el expuesto en el numeral 1 anterior.

12. El método como se expone en el numeral 1 a 4 u 11 anterior, en donde la planta es una planta monocotiledónea.

13. El método como el expuesto en el numeral 1 a 4 u 11 anterior, en donde la planta es una planta dicotiledónea.

14. El método como el expuesto en los numerales 1 a 4 u 11 anteriores, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de Arabidopsis thaliana, arroz, trigo, maíz, tomate, alfalfa, colza de semilla oleaginosa, soja, girasol, y canola.

El objetivo suministrado por la invención pertenece por lo tanto específicamente a la divulgación, descripción y enseñanzas de la presente especificación.

La presente especificación describe el descubrimiento de nuevas moléculas de ácido nucleico de la planta y polipéptidos codificados por tales moléculas de ácido nucleico, denominados aquí como "proteínas del ciclo celular" o "CCP". El ácido nucleico para CCP y las moléculas de polipéptido descritos aquí son útiles como agentes moduladores en la regulación del progreso del ciclo celular, por ejemplo, en plantas. Por lo tanto, está especificación describe moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican polipéptidos CCP, así como fragmentos de ácido nucleico adecuados como iniciadores o sondas de hibridación para la detección de "ácidos nucleicos que codifican para CCP".

Como se describe aquí, una molécula de ácido nucleico para CCP pueden ser al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más, idéntica a la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, a la longitud completa de la secuencia de nucleótidos) de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, o un complemento de las mismas.

La molécula aislada de ácido nucleico puede incluir la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, un complemento de las mismas. Como se describe aquí, una molécula aislada de ácido nucleico puede codificar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido CCP de una planta.

La presente especificación describe moléculas de ácido nucleico, preferiblemente moléculas de ácido nucleico para CCP, que específicamente detectan moléculas de ácido nucleico para CCP con relación a moléculas de ácido nucleico que codifican por péptidos que no son CCP. Por ejemplo, tal molécula de ácido nucleico puede tener al menos 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, u 800 nucleótidos de longitud y puede hibridar bajo condiciones rigurosas a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, o un complemento de las mismas.

La molécula de ácido nucleico descrita aquí puede codificar una variante alélica de ocurrencia natural de un polipéptido CCP de una planta, en donde la molécula de ácido nucleico hibrida a la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239 bajo condiciones rigurosas.

La especificación también describe una molécula aislada de ácido nucleico que es antisentido a una molécula de ácido nucleico para CCP, por ejemplo, la hebra codificadora de una molécula de ácido nucleico para CCP.

La especificación también describe un vector que comprende una molécula de ácido nucleico para CCP. El vector puede ser un vector de expresión recombinante. La especificación también describe una célula huésped que contiene un vector como se describe aquí. La especificación también describe un método para producir un polipéptido CCP, por medio del cultivo en un medio adecuado de una célula huésped como se describe aquí, por ejemplo, una célula huésped de una planta tal como una célula huésped de una planta monocotiledónea (por ejemplo, arroz, trigo o maíz) o una célula huésped dicotiledónea (por ejemplo, Arabidopsis thaliana, colza de semilla oleaginosa, o soja) que contiene un vector de expresión recombinante, de tal manera que se produzca el polipéptido.

La especificación también describe polipéptidos CCP aislados o recombinantes. Los polipéptidos CCP aislados como se describe aquí pueden tener uno o más de los siguientes dominios: una "caja de destrucción de ciclina", un "motivo 1 de una caja de ciclina", un "motivo 2 de una caja de ciclina", un "motivo CDC2 ", un "sitio de fosforilación de CDK", una "señal de localización nuclear", una "caja tipo Cy", un "dominio de enlazamiento de Rb", un "dominio de DEF", un "dominio de enlazamiento de ADN", un "dominio de DCB1", un "dominio de DCB2" y/o un "dominio de SAP".

Un polipéptido CCP como se describe aquí puede incluir al menos uno o más de los siguientes dominios: una "caja de destrucción de ciclinas", un "motivo 1 de caja de ciclina", un "motivo 2 de caja de ciclina", un "motivo CDC2", un "sitio de fosforilación de CDK", una "señal de localización nuclear", una "caja tipo Cy", un "dominio de enlazamiento de Rb", un "dominio de DEF", un "dominio de enlazamiento de ADN", un "dominio de DCB1", un "dominio de DCB2" y/o un "dominio de SAP", y tiene una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más, idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 67 - 132, 205, 211, 215 - 216, ó 220 - 227.

Un polipéptido CCP como el descrito aquí puede incluir al menos uno o más de los siguientes dominios: una "caja de destrucción de ciclina", un "motivo 1 de caja de ciclina", un "motivo 2 de caja de ciclina", un "motivo CDC2", un "sitio de fosforilación de CDK", una "señal de localización nuclear", una "caja tipo Cy", un "dominio de enlazamiento de Rb", un "dominio de DEF", un "dominio de enlazamiento de ADN", un "dominio de DCB1", un "dominio de DCB2" y/o un dominio de SAP y tiene actividad de CCP (como se describe aquí).

Un polipéptido CCP como el descrito aquí puede incluir al menos uno o más de los siguientes dominios: una "caja de destrucción de ciclina", un "motivo 1 de caja de ciclina", un "motivo 2 de caja de ciclina", un "motivo CDC2", un "sitio de fosforilación de CDK", una "señal de localización nuclear", una "caja tipo Cy", un "dominio de enlazamiento de Rb", un "dominio de DEF", un "dominio de enlazamiento de ADN", un "dominio de DCB1", un "dominio de DCB2" y/o un dominio de SAP y está codificado por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239.

La especificación también describe fragmentos del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 67 - 132, 205, 211, 215 - 216, ó 220 - 227, en donde el fragmento comprende al menos 15 aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos contiguos) de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 67 - 132, 205, 211, 215 - 216, ó 220 - 227. La especificación también describe un polipéptido CCP que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 67 - 132, 205, 211, 215 - 216, ó 220 - 227.

La especificación también describe una proteína CCP que es codificada por una molécula de ácido nucleico que consiste de una secuencia de nucleótidos aproximadamente al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más, idéntica a una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, o un complemento de las mismas. La especificación también describe un polipéptido CCP, que es codificado por una molécula de ácido nucleico que consiste de una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas a una molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, o un complemento de las mismas.

La especificación también describe plantas transgénicas (por ejemplo, plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas) que contienen una molécula aislada de ácido nucleico como se describe aquí. Por ejemplo, se describen plantas transgénicas que contienen un casete de expresión recombinante que incluye un promotor de una planta operativamente enlazado a una molécula aislada de ácido nucleico como se describe aquí. La especificación también describe semilla transgénica de las plantas transgénicas. La especificación también describe métodos de modulación, en una planta transgénica, la expresión de los ácidos nucleicos como se describe aquí.

Las proteínas como se describe aquí o porciones de las mismas, por ejemplo, porciones biológicamente activas de las mismas, pueden estar operativamente enlazadas a un polipéptido que no es CCP (por ejemplo, secuencias heterólogas de aminoácidos) para formar proteínas de fusión. La especificación también describe anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales o policlonales, que específicamente se enlazan al polipéptido como se describe aquí, preferiblemente al polipéptido CCP. Además, el polipéptido CCP o porciones biológicamente activas del mismo pueden ser incorporadas en composiciones farmacéuticas, que incluyen opcionalmente portadores farmacéuticamente aceptables.

La especificación también describe un método para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico para CCP, de un polipéptido en una muestra biológica poniendo en contacto la muestra biológica con un agente capaz de detectar una molécula de ácido nucleico para CCP, un polipéptido de tal manera que se detecta la presencia de una molécula de ácido nucleico para CCP, de un polipéptido en una muestra biológica.

La especificación también describe un método para detectar la presencia de actividad de CCP en una muestra biológica poniendo en contacto la muestra biológica con un agente capaz de detectar un indicador de actividad de CCP de tal manera que se detecta la presencia de actividad de CCP en la muestra biológica.

La especificación también describe un método para modular la actividad de CCP que comprende poner en contacto una célula capaz de expresar CCP con un agente que modula la actividad de CCP de tal manera que se modula la actividad de CCP en la célula. El agente puede inhibir la actividad de CCP, o el agente puede estimular la actividad de CCP. El agente puede ser un anticuerpo que se enlaza específicamente a un polipéptido CCP. El agente puede modular la expresión de CCP modulando la transcripción de un gen para CCP o la traducción de un ARNm para CCP. El agente puede ser una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que es antisentido de la hebra de codificación de un ARNm para CCP o un gen para CCP.

Los métodos como se describe aquí pueden ser utilizados para incrementar el rendimiento de un cultivo, mejorar las características de crecimiento de una planta (tales como la tasa de crecimiento o el tamaño de tejidos u órganos específicos en la planta), modificar la arquitectura o morfología de una planta, mejorar la tolerancia a condiciones de estrés ambiental (tales como sequía, salinidad, temperatura, nutrientes o privación), o mejorar la tolerancia patógenos de la planta (por ejemplo, patógenos que abusan del ciclo celular) modulando la actividad de CCP en una célula. La actividad de CCP se puede modular modulando la expresión de una molécula de ácido nucleico para CCP. La actividad de CCP se puede modular modulando la actividad de un polipéptido CCP. Los moduladores de la actividad de CCP incluyen, por ejemplo, un ácido nucleico para CCP o un polipéptido.

La especificación también describe ensayos de diagnóstico para identificar la presencia o la ausencia de una alteración genética caracterizada por al menos uno de (i) una modificación aberrante o mutación de un gen que codifica un polipéptido CCP; (ii) una regulación deficiente del gen; y (iii) una modificación aberrante posterior a la traducción de un polipéptido CCP, en donde una forma de tipo silvestre del gen codifica una proteína con una actividad de CCP.

La especificación también describe métodos para identificar un compuesto que se enlaza a o que modula la actividad de un polipéptido CCP, suministrando una composición indicadora que comprende un polipéptido CCP que tiene una actividad de CCP, poniendo en contacto la composición indicadora con un compuesto de prueba, y determinando el efecto del compuesto de prueba sobre la actividad de CCP en la composición indicadora para identificar un compuesto que modula la actividad de un polipéptido CCP. Los compuestos identificados se pueden utilizar como herbicidas o como reguladores del crecimiento de la planta.

Otras características y ventajas de la inversión serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP1 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 1A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 1715 de la SEQ ID NO: 39. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 1B) corresponde a los aminoácidos 1 a 460 de la SEQ ID NO: 105. Subrayados en la Figura 1A y en la Figura 1B están los nucleótidos parcialmente caracterizados (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos parcialmente predicha (SEQ ID NO: 67), respectivamente. Adicionalmente se indica en la Figura 1A los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP1 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III. En la Figura 1B se indican en la caja de instrucción de ciclina (caja sombreada de color negro) y los motivos 1 y 2 de la caja de ciclina (ambos en cajas sombreadas de color gris).

La Figura 2 describe la secuencia de ADNc de la CCP2 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 2195 de la SEQ ID NO: 40. La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 2) parcialmente caracterizada está subrayada. Se describen las diferencias en las secuencias de nucleótidos entre las SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 2. Se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP2 por medio de la PCR. En la Tabla III pueden encontrarse las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados.

La Figura 3 describe La secuencia predicha de aminoácidos de la CCP2 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de aminoácidos corresponde a los aminoácidos 1 a 664 de la SEQ ID NO: 106. La secuencia parcial predicha de aminoácidos está subrayada (SEQ ID NO: 68).

La Figura 4 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP3 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 3A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 1413 de la SEQ ID NO: 41. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 3B) corresponde a los aminoácidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 69. Subrayadas en la Figura 3A y en la Figura 3B están las secuencias de nucleótidos parcialmente caracterizadas (SEQ ID NO: 3) y las secuencias de aminoácidos parcialmente predichas (SEQ ID NO: 69), respectivamente. En la Figura 3A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP3 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados se pueden encontrar en la Tabla III. Se describen las diferencias en las secuencias de nucleótidos entre la SEQ ID NO: 41 y la SEQ ID NO: 3. En la Figura 3B se indican la caja de destrucción de ciclina (caja sombreada de color negro) y los motivos 1 y 2 de la caja de ciclina (ambos en cajas sombreadas de color gris).

La Figura 5 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP4 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 5A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 672 de la SEQ ID NO: 4. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 5B) corresponde a los aminoácidos 1 a 223 de la SEQ ID NO: 70. En la Figura 5A se indican el codón de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP4 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III. En la Figura 5B se indica el sitio de fosforilación de CDK (caja sombreada de color negro).

La Figura 6 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP5 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 6A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 1287 de la SEQ ID NO: 5. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 6B) corresponde a los aminoácidos 1 a 429 de la SEQ ID NO: 71. En la Figura 6A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP5 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III. En la Figura 6B se indican la caja de destrucción de ciclina (caja sombreada de color negro) y los motivos 1 y 2 de la caja de ciclina (ambas en cajas sombreadas de color gris).

La Figura 7 describe la secuencia de ADNc de la CCP6 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 2766 de la SEQ ID NO: 42. La secuencia de nucleótidos parcialmente caracterizada (SEQ ID NO: 6) está subrayada. Se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP6 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III. Se describen las diferencias en las secuencias de nucleótidos entre la SEQ ID NO: 42 y la SEQ ID NO: 6.

La Figura 8 describe la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP6 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de aminoácidos corresponde a los aminoácidos 1 a 901 de la SEQ ID NO: 108. La secuencia parcial predicha de aminoácidos está subrayada (SEQ ID NO: 72).

La Figura 9 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP7/CCP8 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 9A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 1260 de la SEQ ID NO: 43. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 9B) corresponde a los aminoácidos 1 a 358 de la SEQ ID NO: 109. En la Figura 9A y en la Figura 9B están la secuencia parcial predicha de aminoácidos (SEQ ID NO: 73) y la secuencia de nucleótidos parcialmente caracterizada (SEQ ID NO: 7) subrayadas, respectivamente. Las secuencias en cursiva en la Figura 9A y en la Figura 9B corresponden a la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 74) y a la secuencia de nucleótidos parcialmente caracterizada (SEQ ID NO: 8), respectivamente, de otro clon encontrado independientemente para interactuar con una proteína AtE2F en un tamiz doble híbrido en levadura. En la Figura 9A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP7/8 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III. Se describen las diferencias en las secuencias de nucleótidos entre la SEQ ID NO: 43 y la SEQ ID NO: 7 - 8.

La Figura 10 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP9 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 10A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 1308 de la SEQ ID NO: 9. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 10B) corresponde a los aminoácidos 1 a 436 de la SEQ ID NO: 75. En la Figura 10A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP9 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III. En la Figura 10B se indican la caja de destrucción de ciclina (caja sombreada de color negro) y los motivos 1 y 2 de la caja de ciclina (ambas en cajas sombreadas de color gris).

La Figura 11 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP10 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 11A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 1006 de la SEQ ID NO: 10. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 11B) corresponde a los aminoácidos 1 a 254 de la SEQ ID NO: 76. En la Figura 11A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP10 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla
III.

La Figura 12 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP11 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 12A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 653 de la SEQ ID NO: 44. En la Figura 12A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP11 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III. Sin embargo, durante la predicción del marco de lectura abierto se introdujo un marco que afectó al marco de lectura abierto de CCP11. El codón de detención indicado en cursiva en una caja sombreada de color negro es el codón de detención putativo correcto. La secuencia de aminoácidos en la Figura 12B corresponde a los aminoácidos 1 a 86 de la SEQ ID NO: 77, la proteína codificada por el marco de lectura abierto inicialmente identificado de la SEQ ID NO: 11. La secuencia putativa completa correcta de aminoácidos en la Figura 12C corresponde a los aminoácidos 1 a 98 de la SEQ ID NO: 110.

La Figura 13 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de las CCP12/13 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 13A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 1266 de la SEQ ID NO: 45. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 13B) corresponde a los aminoácidos 1 a 385 de la SEQ ID NO: 111. En la Figura 13A y en la Figura 13B aparecen doblemente subrayadas las secuencias del aminoácido parcial predicho C-terminal (SEQ ID NO: 78) y del nucleótido 3' parcialmente caracterizado (SEQ ID NO: 12), respectivamente. En la Figura 13A y en la Figura 13B aparecen con subrayado sencillo las secuencias del aminoácido parcial predicho N-terminal (SEQ ID NO: 79) y del nucleótido 5' parcialmente caracterizado (SEQ ID NO: 13), respectivamente. En la Figura 13A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) y los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP12/13 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III. Se describen las diferencias en las secuencias de nucleótidos entre la SEQ ID NO: 45 y la SEQ ID NO:
12.

La Figura 14 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP14 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 14A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 1520 de la SEQ ID NO: 46. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 14B) corresponde a los aminoácidos 1 a 465 de la SEQ ID NO: 112. En la Figura 14A y en la Figura 14B aparecen subrayadas la secuencia parcial de aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 80) y de nucleótidos parcialmente caracterizada (SEQ ID NO: 14), respectivamente. En la Figura 14A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP14 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III.

La Figura 15 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP15 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 15A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 1142 de la SEQ ID NO: 47. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 1B) corresponde a los aminoácidos 1 a 313 de la SEQ ID NO: 113. En la Figura 15A y en la Figura 15B aparecen subrayadas la secuencia parcial de aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 81) y de nucleótidos parcialmente caracterizada (SEQ ID NO: 15), respectivamente. En la Figura 15A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP 15 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III. Se describen las diferencias en las secuencias de nucleótidos entre la SEQ ID NO: 47 y la SEQ ID NO: 15. En la Figura 15B están el motivo PSTTLRE (en una caja) característico para la subclase de quinasas del CDC2 del PSTTLRE de la planta. Además, en la Figura 15B se indican tres motivos CDC2 (caja sombreada de color negro, caja sombreada de color gris y subrayado doble). Otros residuos conservados en los CDC2 están subrayados por "*" (residuos en común con el dominio ProDom PD198850), "+" (residuos en común con el dominio ProDom PD05684), "-" (residuos en común con el dominio ProDom PD063669), y "1" (residuos en común con el dominio ProDom PD 195780).

La Figura 16 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP16 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 16A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 1189 de la SEQ ID NO: 48. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 16B) corresponde a los aminoácidos 1 a 292 de la SEQ ID NO: 114. En la Figura 16A están los tres posibles codones de inicio y el de detención (todos en caja sombreada de color negro) y los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP16 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III. Se describen las diferencias en las secuencias de nucleótidos entre la SEQ ID NO: 48 y la SEQ ID NO: 16. En la Figura 16B están el dominio de enlazamiento de ADN (caja sombreada de color negro), el dominio de DEF (caja sombreada de color gris), el dominio de DCB1 (subrayado sencillo) y el dominio de DCB2 (subrayado doble), todos dominios característicos para una proteína DP.

La Figura 17 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP17 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 17A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 794 de la SEQ ID NO: 17. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 17B) corresponde a los aminoácidos 1 a 173 de la SEQ ID NO: 83. En la Figura 17A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP17 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla
III.

La Figura 18 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP18 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 18A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 805 de la SEQ ID NO: 49. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 18B) corresponde a los aminoácidos 1 a 165 de la SEQ ID NO: 115. En la Figura 15A y en la Figura 15B aparecen subrayadas la secuencia parcial de aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 84) y de nucleótidos parcialmente caracterizada (SEQ ID NO: 18), respectivamente. En la Figura 18A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP 18 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III.

La Figura 19 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP19 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 19A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 1152 de la SEQ ID NO: 19. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 1B) corresponde a los aminoácidos 1 a 383 de la SEQ ID NO: 85. En la Figura 19A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP 19 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III.

La Figura 20 describe la secuencia de ADNc de la CCP20/21 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 1539 de la SEQ ID NO: 50. Aparecen subrayadas la secuencia de nucleótidos 5' parcialmente caracterizada (SEQ ID NO: 20) y de nucleótidos 3' parcialmente caracterizada (SEQ ID NO: 21). En la Figura 20 se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP20/21 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III. Se describen las diferencias en las secuencias de nucleótidos entre las SEQ ID NOs: 20 - 21 y la SEQ ID NO: 50.

La Figura 21 describe la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP20/21 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de aminoácidos corresponde a los aminoácidos 1 a 432 de la SEQ ID NO: 116. Aparecen subrayadas la secuencia parcial de aminoácidos predicha N-terminal (SEQ ID NO: 50) parcialmente caracterizada y la secuencia parcial de aminoácidos predicha C-terminal parcialmente caracterizada (SEQ ID NO: 87). Se indican otras diferencias en la secuencia de aminoácidos entre la SEQ ID NO: 87 y la SEQ ID NO: 116.

La Figura 22 describe la secuencia de ADNc de la CCP22 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 1977 de la SEQ ID NO: 51. La secuencia de nucleótidos parcialmente caracterizada está subrayada (SEQ ID NO: 22). Se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP22 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III.

La Figura 23 describe la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP22 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de aminoácidos corresponde a los aminoácidos 1 a 559 de la SEQ ID NO: 117. Aparece subrayada la secuencia parcial de aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 88).

La Figura 24 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP23 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 24A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 525 de la SEQ ID NO: 52. En la Figura 24A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP23 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III. Se describen las diferencias en las secuencias de nucleótidos entre las SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 52. La secuencia de aminoácidos en la Figura 24B corresponde a los aminoácidos 1 a 98 de la SEQ ID NO: 89. La secuencia completa de aminoácidos en la Figura 24C corresponde a los aminoácidos 1 a 86 de la SEQ ID NO: 118.

La Figura 25 describe la secuencia de ADNc de la CCP24 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 2610 de la SEQ ID NO: 53. La secuencia de nucleótidos parcialmente caracterizada está subrayada (SEQ ID NO: 24). Se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP24 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III.

La Figura 26 describe la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP24 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de aminoácidos corresponde a los aminoácidos 1 a 784 de la SEQ ID NO: 119. Aparece subrayada la secuencia parcial de aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 90).

La Figura 27 describe la secuencia de ADNc de la CCP25 Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 2235 de la SEQ ID NO: 54. La secuencia de nucleótidos parcialmente caracterizada está subrayada (SEQ ID NO: 25). Aparecen indicados el codón de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP25 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III.

La Figura 28 describe la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP25 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de aminoácidos corresponde a los aminoácidos 1 a 724 de la SEQ ID NO: 120. La secuencia parcial de aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 91) está subrayada.

La Figura 29 describe la secuencia de ADNc de la CCP26 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 4002 de la SEQ ID NO: 55. La secuencia de nucleótidos parcialmente caracterizada está subrayada (SEQ ID NO: 26). Aparecen indicados el codón de inicio y el de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP26 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III. Se describen las diferencias en las secuencias de nucleótidos entre las SEQ ID NOs: 26 y la SEQ ID NO: 55.

La Figura 30 describe la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP26 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de aminoácidos corresponde a los aminoácidos 1 a 1313 de la SEQ ID NO: 121. La secuencia parcial de aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 92) está subrayada. Se describen las diferencias en las secuencias de aminoácidos entre las SEQ ID NOs: 92 y la SEQ ID NO: 121.

La Figura 31 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP27 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 31A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 1251 de la SEQ ID NO: 56. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 31B) corresponde a los aminoácidos 1 a 310 de la SEQ ID NO: 122. En la Figura 31A y en la Figura 31B aparecen subrayadas la secuencia parcial de aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 93) y de nucleótidos parcialmente caracterizada (SEQ ID NO: 27), respectivamente. En la Figura 31A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP27 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III. Se describen las diferencias en las secuencias de nucleótidos entre la SEQ ID NO: 27 y la SEQ ID NO: 56 en la Figura 31A.

La Figura 32 describe la secuencia de ADNc de la CCP28 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 2955 de la SEQ ID NO: 56. La secuencia de nucleótidos parcialmente caracterizada está subrayada (SEQ ID NO: 28). Se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP28 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III. Se describen las diferencias en las secuencias de nucleótidos entre la SEQ ID NO: 28 y la SEQ ID NO: 57.

La Figura 33 describe la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP28 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de aminoácidos corresponde a los aminoácidos 1 a 964 de la SEQ ID NO: 123. La secuencia parcial de aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 94) está subrayada.

La Figura 34 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP29 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 34A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 546 de la SEQ ID NO: 29. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 34B) corresponde a los aminoácidos 1 a 181 de la SEQ ID NO: 95. En la Figura 34A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP29 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III.

La Figura 35 describe la secuencia de los ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP30 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 35A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 492 de la SEQ ID NO: 30. En la Figura 35A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro), el iniciador sentido completo y parte del iniciador antisentido (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP30 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III. Sin embargo, después de la secuenciación del producto PCR, se detectó una secuencia de error en la SEQ ID NO: 30 (el nucleótido en la caja "a" en la Figura 35A no presente) que provocó que se llevara a cabo un desplazamiento del marco del marco de lectura abierto de CCP30. El la Figura 35B se presenta la secuencia correcta putativa de ADNc (ácidos nucleicos 1 a 865 de la SEQ ID NO: 58) en donde los tres codones de inicio putativos están marcados por una caja sombreada de color negro. El codón de inicio originalmente identificado está indicado en negrilla. El codón de inicio está inalterado. La secuencia de aminoácidos en la Figura 35C corresponde a los aminoácidos 1 a 163 de la SEQ ID NO: 96, la proteína codificada por el marco de lectura abierto inicialmente identificado de la SEQ ID NO: 30. La secuencia de aminoácidos correcta, putativa, corregida en la Figura 35D corresponde a los aminoácidos 1 a 222 de la SEQ ID NO: 124 que comprende el marco de lectura abierto más largo posible. Los residuos Met correspondientes a los tres posibles codones de inicio en la SEQ ID NO: 58 (Figura 35B) están en negrilla.

La Figura 36 describe la secuencia de ADNc de la CCP31 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 723 de la SEQ ID NO: 31. En la Figura 1A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro).

La Figura 37 describe la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP31 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de aminoácidos corresponde a los aminoácidos 1 a 148 de la SEQ ID NO: 125.

La Figura 38 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP32 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 38A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 426 de la SEQ ID NO: 60. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 38B) corresponde a los aminoácidos 1 a 70 de la SEQ ID NO: 126. En la Figura 38A está subrayada la secuencia de nucleótidos parcialmente caracterizada (SEQ ID NO: 32). En la Figura 38A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP32 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III. La Figura 38C presenta secuencia de aminoácidos erróneamente predicha originalmente de CCP32 (aminoácidos 1 a 38 de la SEQ ID NO: 98).

La Figura 39 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP33 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 39A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 1442 de la SEQ ID NO: 61. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 39B) corresponde a los aminoácidos 1 a 385 de la SEQ ID NO: 127. En la Figura 39A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP33 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III. En la Figura 39B están el dominio de enlazamiento del ADN (caja sombreada de color negro), el dominio de DEF (caja sombreada de color gris), el dominio de DCB 1 (subrayado en forma sencilla) y el dominio de DCB2 (doblemente subrayado), todos dominios característicos para una proteína DP.

La Figura 40 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP34 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 40A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 1506 de la SEQ ID NO: 62. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 40B) corresponde a los aminoácidos 1 a 437 de la SEQ ID NO: 128. En la Figura 40A y en la Figura 40B aparecen subrayadas la secuencia parcial de aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 62) y la de nucleótidos parcialmente caracterizada (SEQ ID NO: 34), respectivamente. En la Figura 40A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP34 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III.

La Figura 41 describe la secuencia de ADNc de la CCP35 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 2631 de la SEQ ID NO: 63. La secuencia de nucleótidos parcialmente caracterizada está subrayada (SEQ ID NO: 35). Se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) y de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP35 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III. Se describen las diferencias en las

\hbox{secuencias de nucleótidos  entre la SEQ ID NO: 33 y la
SEQ ID NO: 63.}

La Figura 42 describe la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP35 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de aminoácidos corresponde a los aminoácidos 1 a 749 de la SEQ ID NO: 129. La secuencia parcial de aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 101) está subrayada.

La Figura 43 describe la secuencia de ADNc de la CCP36 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 2743 de la SEQ ID NO: 64. La secuencia de nucleótidos parcialmente caracterizada está subrayada (SEQ ID NO: 36). Se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro). Se describen las diferencias en las secuencias de nucleótidos entre la SEQ ID NO: 36 y la SEQ ID NO: 64.

La Figura 44 describe la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP36 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de aminoácidos corresponde a los aminoácidos 1 a 742 de la SEQ ID NO: 130. La secuencia parcial de aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 102) está subrayada.

La Figura 45 describe la secuencia de ADNc de la CCP37 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 2959 de la SEQ ID NO: 65. La secuencia de nucleótidos parcialmente caracterizada está subrayada (SEQ ID NO: 37). Se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) y los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP45 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III.

La Figura 46 describe la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP37 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de aminoácidos corresponde a los aminoácidos 1 a 911 de la SEQ ID NO: 131. La secuencia parcial de aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 103) está subrayada. En una caja sombreada de color negro está indicado un dominio tipo SAP.

La Figura 47 describe la secuencia de ADNc y la secuencia predicha de aminoácidos de la CCP38 de Arabidopsis thaliana. La secuencia completa de nucleótidos (Figura 47A) corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 1295 de la SEQ ID NO: 66. La secuencia completa de aminoácidos (Figura 47B) corresponde a los aminoácidos 1 a 357 de la SEQ ID NO: 132. En la Figura 47A y en la Figura 47B está subrayada la secuencia parcial de aminoácidos (SEQ ID NO: 104) predicha y la de nucleótidos parcialmente caracterizada (SEQ ID NO: 38), respectivamente. En la Figura 47A se indican los codones de inicio y de detención (ambos en cajas sombreadas de color negro) que son parte de los iniciadores (cajas sombreadas de color gris) utilizados para amplificar la región de codificación de CCP38 por medio de la PCR. Las SEQ ID NOs de los iniciadores utilizados pueden encontrarse en la Tabla III.

La Figura 48 describe la fosforilación de la CCP4 de Arabidopsis thaliana por las CDK. La proteína CDC2bDN-IC26M (SEQ ID NO: 70) contiene un sitio de fosforilación de consenso CDK (TPWK, residuos 54 - 57 de la SEQ ID NO: 263). El gen correspondiente (SEQ ID NO: 4) se expresó en E. coli y se purificó la proteína a partir de los extractos crudos. Se demostró posteriormente que la proteína purificada es fosforilada por las CDK en un ensayo in vitro de fosforilación de CDK. -: sin adición de IC26M; +: se añadió IC26M.

La Figura 49 representa esquemáticamente la organización del dominio de AtE2Fa y de AtE2Fb. El dominio de enlazamiento de ADN (DB), el dominio de dimerización (DIM), la caja marcada (MB), y el dominio de enlazamiento de Rb (RB) están indicados por medio de cajas marcadas, los dominios N-terminales están indicados por medio de cajas marcadas. La numeración al lado derecho se refiere a la secuencia de aminoácidos contenida en las diferentes construcciones de AtE2F, que fueron utilizadas en los ensayos de enlazamiento in vitro.

La Figura 50 describe interacciones de AtDPa in vitro con AtE2Fa y AtE2Fb. La AtDPa marcada con c-myc (c-myc-AtDPa) fue traducida in vitro y utilizado como control. Las proteínas inferiores de migración observadas en el caso de c-myc-AtDPa son más probablemente debidas a la iniciación de la traducción en codones internos de metionina (panel A, carril izquierdo no numerado). El c-myc-AtDPa fue cotraducido in vitro con HA-AtE2Fb (paneles A y B, carril 1), HA-AtE2Fa (paneles B, carril 2), la forma suprimida del C-terminal de HA-AtE2Fb (paneles A y B, carril 3), HA-AtE2Fa 1 - 420 (paneles A y B, carril 4) y la forma truncada N-terminal de HA-AtE2Fa 162 - 485 (paneles A y B, carril 5) como se indicó. Los números en el caso de las AtE2F mutantes se refieren a la secuencia de aminoácidos contenida en estas construcciones (ver la Figura 49). Se analizó una alícuota de cada muestra directamente por medio de SDS-PAGE y de autorradiografía (panel A; IVT total, traducción total in vitro). Se sometió otra alícuota de las mismas muestras a inmunoprecipitación con anticuerpos monoclonales anti-c-myc (panel B), los carriles están indicados por medio de numeración. La posición de las proteínas c-myc-AtDPa está marcada por medio de flechas en ambos paneles. Los marcadores de masa molecular están indicados a la izquierda.

La Figura 51 muestra interacciones in vitro de AtDPb con AtE2Fa y AtE2Fb. La AtDPb marcado con c-myc (c-myc-AtDPb, paneles A y B, carril 2) y la AtE2Fb marcado con HA (HA-AtE2Fb, paneles A y B, carril 1) fueron traducidos in vitro y usados como controles. Las proteínas de menor migración observadas en el caso de c-myc-AtDPb son probablemente debidas a la iniciación de la traducción en codones internos de metionina (panel A, carril 2). El c-myc-AtDPb fue cotraducido in vitro con HA-AtE2Fb (paneles A y B, carril 3), HA-AtE2Fa (paneles A y B, carril 4), HA-AtE2Fa 1 - 420 (paneles A y B, carril 5) y la forma truncada N-terminal de HA-AtE2Fa 162 - 485 (paneles A y B, carril 6) como se indicó. Los números en el caso de las AtE2F mutantes se refieren a la secuencia de aminoácidos contenida en estas construcciones (ver la Figura 49). Se analizó una alícuota de cada muestra directamente por medio de SDS-PAGE y de autorradiografía (panel A; IVT total, traducción total in vitro). Se sometió otra alícuota de las mismas muestras a inmunoprecipitación con anticuerpos monoclonales anti-c-myc (panel B), los carriles están indicados por medio de numeración. El c-myc-AtDPb (paneles A y B, carriles 2 - 6; indicados con "y") migraron conjuntamente casi exactamente con el mutante HA-AtE2Fa 1 - 420 (paneles A y B, carril 5; indicado con "x") y HA-AtE2Fa 162 - 485 (paneles A y B, carril 6; indicado con "z") en el sistema del gel. Estos polipéptidos así como la posición de las proteínas c-myc-AtDPa y de c-myc-AtDPb están marcadas por medio de flechas marcadas con "y", "x" y "z", respectivamente (véase más arriba). Los marcadores de masa molecular están indicados a la izquierda.

La Figura 52 representa esquemáticamente AtDPa y mutantes. El dominio de enlazamiento del ADN (DB) y el dominio de dimerización (DIM) están indicados por medio de cajas marcadas, las regiones N y C-terminales están indicadas por cajas abiertas. La numeración sobre el lado derecho se refiere a la secuencia de aminoácidos contenida en las diferentes construcciones de AtDP, que fueron utilizadas en los ensayos de enlazamiento in vitro.

La Figura 53 representa esquemáticamente AtDPb y mutantes. El dominio de enlazamiento del ADN (DB) y el dominio de dimerización (DIM) están indicados por medio de cajas marcadas, las regiones N y C-terminales están indicadas por cajas abiertas. La numeración sobre el lado derecho se refiere a la secuencia de aminoácidos contenida en las diferentes construcciones de AtDP, que fueron utilizadas en los ensayos de enlazamiento in vitro.

La Figura 54 muestra el mapeo de regiones en AtDPa requerido para enlazamiento in vitro con AtE2Fb. Se tradujo en forma conjunta HA-AtE2Fb con series de mutantes de c-myc-AtDPa. Se analizó una alícuota de cada muestra directamente por medio de SDS-PAGE y de autorradiografía (panel A). Se sometió otra alícuota de las mismas muestras a inmunoprecipitación con anticuerpos monoclonales anti-HA (panel B) o anti-c-myc (panel C). Los mutantes de c-myc-AtDPa están marcados por puntos. Las posiciones de las proteínas HA-AtE2Fb están indicadas por flechas. Los marcadores de masa molecular están indicados a la izquierda.

La Figura 55 muestra el mapeo de las regiones en AtDPb requerido para enlazamiento in vitro con AtE2Fb. Se tradujo en forma conjunta HA-AtE2Fb con series de mutantes de c-myc-AtDPb. Se analizó una alícuota de cada muestra directamente por medio de SDS-PAGE y de autorradiografía (panel A). Se sometió otra alícuota de las mismas muestras a inmunoprecipitación con anticuerpos monoclonales anti-Ha (panel B) o anti-c-myc (panel C). Los mutantes de c-myc-AtDPb están marcados por puntos. Las posiciones de las proteínas HA-AtE2Fb están indicadas por flechas. Los marcadores de masa molecular están indicados a la izquierda.

La Figura 56 muestra el mapeo de las regiones en AtDPb requerido para enlazamiento in vitro con AtE2Fb. Se tradujo en forma conjunta HA-AtE2Fb con c-myc-AtDPb 182 - 263. Debido al pequeño tamaño de esta proteína, fue difícilmente detectable cuando fue analizada directamente por medio de SDS-PAGE (datos no mostrados). Se sometió una alícuota de esta muestra a inmunoprecipitación con anticuerpos monoclonales anti-c-myc. El mutante de c-myc-AtDP está marcado por puntos. La posición de la proteína HA-AtE2Fb está indicada por una flecha. Los marcadores de masa molecular están indicados a la izquierda.

La Figura 57 muestra la expresión específica del ciclo celular y del órgano de AtE2Fa y AtDPa. La expresión específica en el tejido de los genes para AtDPa y AtE2Fa. El ADNc preparado a partir de los tejidos indicados fue sometido a análisis por RT-PCR semicuantitativo. Se uso el gen Arath;CDKB1;1 como marcador para tejidos altamente proliferativos. Se utilizó el gen para la actina 2 (ACT2) como control de carga.

La Figura 58 muestra la expresión específica del ciclo celular y del órgano de AtE2Fa y AtDPa. Transcripción que depende de la fase del ciclo celular regulada en forma conjunta de AtE2Fa y AtDPa. Se preparó el ADNc de células de Arabidopsis parcialmente sincronizadas cosechadas en el momento indicado después de la remoción del bloqueador del ciclo celular que fue sometido a análisis por RT-PCR semicuantitativo. Se utilizaron Histona H4 y Arath;CDKB 1;1 como marcadores para la fase S y G2/M, respectivamente, y ROC5 y Arath;CDKA;1 como controles de carga.

La Figura 59 es una representación fotográfica del análisis de transferencias de Northern de la expresión de DPa en líneas independientes que sobreexpresan DPa de Arabidopsis thaliana (líneas 16 - 27 como se indicó) y una línea de control no transformada (indicada por C).

La Figura 60 describe las moléculas definidas en las SEQ ID NOs: 199 - 204 y 240 - 290.

Descripción detallada de la invención

La presente especificación describe el descubrimiento de nuevas moléculas, denominadas de ahora en adelante como "proteínas del ciclo celular" o ácido nucleico para "CCP" y moléculas de polipéptido. Las moléculas CCP como se las describe aquí fueron identificadas con base en su habilidad, según se determinó utilizando ensayos de doble híbrido en levadura (descritos en detalle en el Ejemplo 1), para interactuar con proteínas involucradas en el ciclo celular, tales como quinasas dependientes de la ciclina de la planta (por ejemplo, una forma negativa dominante de CDC2b, CDC2bAt.N161), subunidades de quinasa dependientes de la ciclina denominadas aquí como "CKS" (tales como CKSlAt), inhibidores de la quinasa dependientes de la ciclina denominados aquí como "CKI" (tales como CKI4), proteínas del tipo PHO80 denominadas aquí como "PLP", E2F, y diferentes dominios de proteínas del tipo de la quinesina denominados aquí como "KLPNT".

Debido a su habilidad para interactuar con (por ejemplo, para enlazarse con) las quinasas que dependen de la ciclina, las moléculas de CCP como se describe aquí modulan, por ejemplo, favorecen o reducen la expresión, de la actividad de las CDK de la planta, tales como CDC2a o CDC2b; las CKS, las CKI, las PLP y las KLPNT. Además, debido a su habilidad para interactuar con (por ejemplo, para enlazarse con) las proteínas anteriormente mencionadas que son proteínas involucradas en la regulación del ciclo celular, las moléculas de CCP como se describe aquí pueden jugar también un papel en, o una función en la regulación del ciclo celular, por ejemplo, regulación del ciclo celular de un animal o una planta.

Como se lo utiliza aquí, el término "proteína del ciclo celular" incluye un polipéptido que está involucrado en el control o la regulación del ciclo celular, o en parte del mismo, en una célula, tejido, órgano u organismo completo. Las proteínas del ciclo celular pueden también ser capaces de enlazamiento con, regulación, o ser reguladas por quinasas que dependen de la ciclina, tales como quinasas que dependen de la ciclina de la planta, por ejemplo, CDC2a o CDC2b, o sus subunidades. El término proteína del ciclo celular también incluye péptidos, polipéptidos, fragmentos, variantes, homólogos, alelos o precursores (por ejemplo, pre-proteínas o pro-proteínas) de los mismos.

Como se lo utiliza aquí, el término "ciclo celular" incluye eventos estructurales y bioquímicos cíclicos asociados con el crecimiento, la división y la proliferación de células, y en particular con la regulación de la replicación de ADN y la mitosis. El ciclo celular se divide en períodos llamados: Go, Gap, (G1), síntesis de ADN (S), Gap2 (G2), y mitosis (M). Este estas cuatro fases se presentan en forma secuencial, sin embargo, el ciclo celular también incluye ciclos modificados en donde una o más fases están ausentes resultando en un ciclo celular modificado tal como endomitosis, acitocinesis, poliploidía, politenia, y endoreduplicación.

Como se lo utiliza aquí, el término "planta" incluye referencia a plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces), tejidos de la planta, semillas, y células de la planta y progenie de las mismas. Las células de la planta, como se lo utiliza aquí incluye, sin limitación, semillas, por ejemplo, cultivos en suspensión de semillas, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callos, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen, y microesporas. La clase de plantas que pueden ser utilizadas en los métodos descritos aquí es generalmente tan amplia como la clase de las plantas superiores que pueden ser sometidas a técnicas de transformación, incluidas tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Las plantas particularmente preferidas son Arabidopsis thaliana, arroz, trigo, maíz, tomate, alfalfa, colza de semilla oleaginosa, soja, algodón, girasol o canola. El término planta también incluye plantas monocotiledóneas (monocot) y plantas dicotiledóneas (dicot) incluida una forrajera o leguminosa forrajera, una planta ornamental, cultivo alimenticio, árbol, o arbusto seleccionado de la lista que comprende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza; Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, Indigo incarnata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesii, Lotus Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago sativa, Metasequoia glyptostroboides, spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys verticillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp. Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofa, esparrago, brócoli, bretones, col, canola, zanahoria, coliflor, apio, col rizada, lino, col verde, lenteja, colza de semilla oleaginosa, quimbombo, cebolla, patata, arroz, soja, paja, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, tomate, calabaza, y té, entre otras, o las semillas de cualquier planta mencionada específicamente más arriba o un tejido, cultivo de un órgano o célula de cualquiera de las especies anteriores.

Las proteínas del ciclo celular como se describe aquí están involucradas en la regulación del ciclo celular que es en gran medida, pero no completamente, similar en plantas y animales. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico y de polipéptido como se describe aquí, o derivados de las mismas, pueden ser utilizadas para modular el ciclo celular en una planta o en un animal tal como por medio de la modulación de la actividad o del nivel o de la expresión de CCP, alterando la velocidad del ciclo celular o las fases del ciclo celular, y la entrada en y la salida de las diferentes fases del ciclo celular. En las plantas, se pueden utilizar moléculas como las descritas aquí también en agricultura, por ejemplo, para mejorar características de crecimiento de la planta tales como la tasa de crecimiento o el tamaño de tejidos u órganos específicos, la arquitectura o la morfología de la planta, incrementar el rendimiento del cultivo, mejorar la tolerancia a condiciones de estrés ambiental (tales como sequía, salinidad, temperatura, o la falta de nutrientes), mejorar la tolerancia a los patógenos de la planta que abusan del ciclo celular o como objetivos para facilitar la identificación de inhibidores o activadores de las CCP que pueden ser útiles como compuestos fitofarmacéuticos tales como herbicidas o reguladores del crecimiento de la planta.

Como se lo utiliza aquí, el término "trastornos asociados al ciclo celular" incluye un trastorno, enfermedad o condición que es causado o caracterizado por una regulación deficiente (por ejemplo, favorecimiento o reducción de la expresión), abuso, detención, o modificación del ciclo celular. En plantas los trastornos asociados al ciclo celular incluyen endomitosis, acitocinesis, poliploidía, politenia, y endoreduplicación que puede ser causada por factores externos tales como patógenos (nemátodos, virus, hongos, o insectos), químicos, estrés ambiental (por ejemplo, sequía, temperatura, nutrientes, o UV) resultando por ejemplo en tejido neoplásico (por ejemplo, agallas, nódulos en la raíz) o inhibición de la división/proliferación celular (por ejemplo, retraso en el crecimiento). Los trastornos asociados al ciclo celular en animales incluyen trastornos proliferativos o trastornos en la diferenciación, tales como cáncer, por ejemplo, melanoma, cáncer de próstata, cáncer cervical, cáncer de mama, cáncer de colon o sarcoma.

La presente especificación describe el descubrimiento de nuevas moléculas, denominadas como moléculas de ácido nucleico y de proteína CCP, que comprenden una familia de moléculas que tienen ciertos rasgos estructurales y funcionales conservados. El término "familia" cuando se refiere a las moléculas de ácido nucleico y de proteína como se describe aquí pretenden la a entender dos o más moléculas de ácido nucleico y le proteínas que tienen un dominio o motivo estructural común y que tienen suficiente homología de secuencia de nucleótidos o de aminoácidos como se define aquí. Tales miembros de la familia pueden ser de ocurrencia natural o no natural y pueden ser ya sea de la misma o de diferente especie. Por ejemplo, una familia puede contener una primera proteína de una planta, por ejemplo de originaria de Arabidopsis, así como otras proteínas diferentes de planta, por ejemplo, originaria de Arabidopsis, o alternativamente, puede contener homólogos de otras plantas, por ejemplo, originarias de arroz, o de origen no vegetal. Los miembros de una familia pueden tener también características funcionales comunes.

Una proteína CCP como se describe aquí puede ser identificada con base en la presencia de al menos uno o más de los siguientes dominios:

A. Caja de destrucción de ciclina

Como se lo utiliza aquí, el término "caja de destrucción de ciclina" incluye un dominio de 9 - 10 residuos aminoácidos de longitud que típicamente contiene el siguiente patrón de consenso:

R - X_{2} - L - X_{2} - [I/V] -X_{1-2} - N: (SEQ ID NO: 267),

en donde X puede ser cualquier aminoácido, X_{n} es un tramo de n Xs, X_{n-m} es un tramo de n hasta m Xs, y en donde [I/V] significa que un residuo de Ile o de Val puede estar presente en esa posición. La SEQ ID NO: 267 describe la secuencia mínima de consenso de la caja de destrucción de ciclina y

es la razón fundamental de la destrucción proteolítica mediada por ubiquitina de las ciclinas que soportan este motivo (Yamano et al. (1998), EMBO J. 17: 5670 - 5678; Renaudin et al. (1998) en Plant Cell Division (Francis, Dudits and Inzé, eds.), Portland Press Research Monograph, Portland Press Ltd. London (1998), páginas 67 - 98).

B. Motivo 1 de la caja de ciclina

Como se lo utiliza aquí, el término "motivo 1 de la caja de Ciclina" incluye un dominio de 8 residuos aminoácidos de longitud y que típicamente contiene el siguiente patrón de consenso:

MRXIL[I/V]DW: (SEQ ID NO: 268),

en donde X puede ser cualquier aminoácido en donde [I/V] significa que un residuo de Ile o de Val puede estar presente en esa posición. Este motivo forma parte de la hélice H1 el primer pliegue de la ciclina y es el motivo mejor conservado en la familia de la ciclina A/B (Renaudin et al. (1998) en Plant Cell Division (Francis, Dudits and Inzé, eds.), Portland Press Research Monograph, Portland Press Ltd. London (1998), páginas 67 - 98).

C. Motivo 2 de la caja de ciclina

Como se lo utiliza aquí, el término "motivo 2 de la caja de Ciclina" incluye un dominio de 8 residuos aminoácidos de longitud y que típicamente contiene el siguiente patrón de consenso:

KYEE - X_{3} - P: (SEQ ID NO: 269),

en donde X puede ser cualquier aminoácido en donde X_{n} es un tramo de n Xs. Este motivo forma parte de la hélice H3 del primer pliegue de la ciclina en donde los 2 residuos ácidos son parte del sitio de enlazamiento de CDK (Renaudin et al. (1998) en Plant Cell Division (Francis, Dudits and Inzé, eds.), Portland Press Research Monograph, Portland Press Ltd. London (1998), páginas 67 - 98).

D. Motivos CDC2

Como se lo utiliza aquí, el término "motivos CDC2" incluye dominios de aproximadamente 9 - 12 residuos aminoácidos de longitud y que típicamente contienen uno de los siguientes patrones de consenso:

GXG -X_{2}- GXVY: (SEQ ID NO: 270)

HRDXK-X_{2}- NXL: (SEQ ID NO: 271)

D-X_{1-2}-[W/Y]SXG -X_{4}- E: (SEQ ID NO: 272)

en donde X puede ser cualquier aminoácido, X_{n} es un tramo de n Xs, X_{n-m} es un tramo de n hasta m Xs, y en donde [W/Y] significa que un residuo de Trp o Tyr puede estar presente en esa posición.

E. Sitio de fosforilación de CDK

Como se lo utiliza aquí, el término "sitio de fosforilación de CDK" incluye un dominio de aproximadamente 5 - 7 aminoácidos de longitud y que contiene uno o más de los siguientes dominios de consenso:

TPX_{1-2}[R/K]: (SEQ ID NO: 273)

SPX[R/K]: (SEQ ID NO: 274)

SPX(Hu): (SEQ ID NO: 275)

SP(Hu)X: (SEQ ID NO: 276)

siendo Hu un aminoácido no cargado hidrófobo (M, I, L, V) y X cualquier aminoácido. Los anteriores se encuentran típicamente en sustratos de quinasa que dependen de ciclina tal como histona quinasa, factores de transcripción tales como E2F o reguladores de transcripción tales como Rb. Los sitios de fosforilación de CDK están descritos, por ejemplo, en Tamrakar et al. 2000, Frontiers Biosci 5, d121 - 137.

Las proteínas CCP como se describe aquí que contienen un sitio de fosforilación de CDK pueden ser mutadas en dicho sitio de fosforilación de CDK de tal manera que dichas proteínas CCP ya no puedan ser fosforiladas sobre el sitio de fosforilación de CDK. Las mutaciones de un sitio de fosforilación de CDK incluyen todas las mutaciones del residuo de ser o de thr en cualquiera de las SEQ ID NOs: 273 - 276 en un residuo aminoácido que no puede ser fosforilado, por ejemplo, un residuo de ala o de glu. La mutación de uno o más sitios de fosforilación de CDK en una proteína CCP como se describe aquí, se espera que module las modificaciones de la proteína CCP por las CDK y, por lo tanto, que module la función bioquímica o biológica de la proteína CCP.

F. Señal de localización nuclear E (NLS)

Como se lo utiliza aquí, el término "señal de localización nuclear" o "NLS" incluye un dominio que confiere a una proteína que contiene al dominio de NLS la habilidad para ser importado dentro del núcleo y, por ejemplo, para acumularse dentro del núcleo. Los dominios de NLS incluyen uno o más de los siguientes patrones de consenso:

PKKKRKV: (SEQ ID NO: 277)

KRX_{10}KKKK: (SEQ ID NO: 278)

KRPRP: (SEQ ID NO: 279)

PAAKRVKLD: (SEQ ID NO: 280)

Los dominios de NLS han sido encontrados en el antígeno T de SV40, en nucleoplasmina (NLS bipartita), en un Adeno EIA, y en c-Myc. Los dominios de NLS están descritos, por ejemplo, en Laskey et al. (1998) Biochem. Soc. Trans. 26, 561 - 567.

G. Cajas de tipo Cy

Como se lo utiliza aquí, el término "caja de tipo Cy" incluye un dominio de 3 - 6 residuos aminoácidos de longitud que tiene el motivo de consenso R-X-X-F (SEQ ID NO: 281) siendo X cualquier aminoácido y siendo preferiblemente uno de dos Xs un residuo hidrófobo.

H. Dominio de enlazamiento de Rb

Como se lo utiliza aquí, el término "dominio de enlazamiento de Rb" incluye un dominio que cuando está presente en una proteína le confiere a la proteína la habilidad para enlazar a la proteína Rb. Los dominios de enlazamiento de Rb incluyen uno o más de los siguientes patrones de consenso:

LXCXE: (SEQ ID NO: 282)

LXSXE: (SEQ ID NO: 283)

DYX_{7}EX_{3}DLFD: (SEQ ID NO: 284)

DYX_{6}DX_{4}DMWE: (SEQ ID NO: 285)

Los dominios de enlazamiento de Rb han sido encontrados en ciclinas D, en proteína fosfatasa 1, en E2F-1 humana, y en E2F vegetal. Los dominios de enlazamiento de Rb están descritos, por ejemplo, en Rubin et al. (1998) Frontiers Biosci 3, d1209 - 1219; Phelps et al. (1992) J. Virol. 66, 2418 - 2427, y en Cress et al. (1993) Mol. Cell Biol. 13, 6314 - 6325.

I. Dominio de DEF

Como se lo utiliza aquí, el término "dominio de DEF" incluye un dominio de proteína que es requerido para la formación de heterodímeros entre las proteínas DP y las proteínas E2F. Los dominios de DEF incluyen el siguiente patrón de consenso:

1

J. Dominio de Enlazamiento de ADN

Como se lo utiliza aquí, el término "dominio de enlazamiento de ADN" incluye un dominio que está involucrado en el enlazamiento de proteínas DP y/o heterodímeros DP-E2F al ADN. Los dominios de enlazamiento de ADN incluyen el siguiente patrón de consenso:

2

Los dominios de enlazamiento de ADN están descritos, por ejemplo, en Hao et al. (1995) J. Cell Sci. 108, 2945 - 2954; Bandara et al. (1993) EMBO J. 12, 4317 - 4324; y en Girling et al. (1994) Mol. Biol. Cells, 1081 - 1092.

K. Dominio de DCB

Como se lo utiliza aquí, el término "dominio de DCB 1" incluye un dominio de proteína que está conservado entre proteínas DP y tiene los siguientes patrones de consenso:

[R/S][IN]X[Q/K]KX_{3}[L/S]XE: (SEQ ID NO: 288)

[R/S][I/V]X[Q/K]KX_{3}[L/S]XE[L/M]X_{2-3}[Q/H]X_{4-5}NL[V/I/M][Q/E]RN: (SEQ ID NO: 289)

Los dominios DCB 1 están descritos, por ejemplo, en Hao et al. (1995) J. Cell Sci.108, 2945 - 2954; Bandara et al. (1993) EMBO J. 12,4317 - 4324; y en Girling et al. (1994) Mol. Biol. Cell 5, 1081 - 1092.

L. Dominio de DCB2

Como se lo utiliza aquí, el término "dominio de DCB2" incluye un dominio de proteína que está conservado entre proteínas DP y tiene el siguiente patrón de consenso:

[L/I]PFI[L/I][V/L]XTX_{3-4}[TNIVX_{12-14}FX_{3-4}F[E/S][Hu]HDDX_{2}[V/I]L[R/K]XM: (SEQ ID NO: 290)

\newpage

Los dominios de DCB2 están descritos, por ejemplo, en Hao et al. (1995) J. Cell Sci.108, 2945 - 2954; Bandara et al. (1993) EMBO J. 12, 4317 - 4324; y en Girling et al. (1994) Mol. Biol. Cell 5, 1081 - 1092.

M. Dominio de SAP

Como se lo utiliza aquí, el término motivo SAP incluye un motivo de proteína de aproximadamente 35 residuos aminoácidos que se encuentra en una variedad de proteínas nucleares involucradas en la transcripción, reparación de ADN, procesamiento de ADN o degradación apoptótica de la cromatina. Fue llamado después SAF-A/B, Acinus y PIAS, tres proteínas que se sabe que lo contienen. El motivo SAP revela una distribución bipartita de aminoácidos voluminosos y polares, hidrófobos fuertemente conservados, separados por una región que contiene una glicina. Se ha propuesto que el dominio de SAP sea un motivo de enlazamiento de ADN (Aravind y Koonin (2000) Trends Biochem. Sci. 25: 112 - 114).

Las proteínas CCP aisladas como se describe aquí tienen una secuencia de aminoácidos suficientemente idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 67 - 132, 205, 211, 215 - 216, ó 220 - 227 o son codificadas por una secuencia de nucleótidos suficientemente idéntica a la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239. Como se lo utiliza aquí, el término "suficientemente idéntica" se refiere a un primer aminoácido o secuencia de nucleótidos que contiene un número mínimo o suficiente de residuos aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, un residuo aminoácido que tienen una cadena lateral similar) a una segunda secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de tal manera que la primera o la segunda secuencia de nucleótidos o de aminoácidos comparte dominios o motivos estructurales comunes y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos que comparten dominios estructurales comunes tienen al menos 30%, 40%, o 50% de homología, preferiblemente 60% de homología, más preferiblemente 70% - 80%, e incluso más preferiblemente 90 - 95% de homología a través de la secuencia de aminoácidos de los dominios y contienen al menos uno y preferiblemente dos dominios o motivos estructurales, se detienen aquí como suficientemente idénticas. Además, las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos que comparten al menos 30%, 40%, ó 50%, preferiblemente 60%, más preferiblemente 70 - 80%, o 90 - 95% de homología y comparten una actividad funcional común se detienen aquí como suficientemente
idénticas.

Como se utiliza aquí en forma intercambiable, una "actividad de CCP", "actividad biológica de CCP" o "actividad funcional de CCP", se refieren a una actividad ejercida por una proteína CCP, polipéptido o molécula de ácido nucleico sobre una célula o tejido sensibles a CCP, o sobre un sustrato de proteína CCP, como se determinó in vivo, o in vitro, de acuerdo con técnicas estándar. Una actividad de CCP puede ser una actividad directa, tal como una asociación con una molécula objetivo de CCP. Como se lo utiliza aquí, una "molécula objetivo" o "compañera de enlazamiento" es una molécula con la cual se enlaza o interactúa una proteína CCP en la naturaleza, de tal manera que se logra una función mediada por CCP. Una molécula objetivo de CCP puede ser una molécula diferente de una molécula CCP o una proteína CCP o polipéptido como se describe aquí, por ejemplo, una quinasa que depende de la ciclina de la planta, tal como CDC2b. Una molécula objetivo de CCP puede ser un ligando de CCP. Alternativamente, una actividad de CCP es una actividad indirecta, tal como una actividad de señalización celular mediada por la interacción de la proteína CCP con un ligando de CCP. Se describen aquí las actividades biológicas de CCP. Por ejemplo, las proteínas CCP como se describe aquí pueden tener una o más de las siguientes actividades: (1) pueden interactuar con una molécula de proteína diferente de CCP, por ejemplo, un ligando de CCP; (2) pueden modular una ruta de transducción de señal que depende de CCP; (3) pueden modular la actividad de una quinasa que depende de la ciclina de la planta, tal como CDC2a, CDC2b, o CDC2c, y (4) pueden modular el ciclo
celular.

La presente especificación también describe proteínas CCP aisladas y polipéptidos que tienen actividad de CCP. Las proteínas preferidas son proteínas CCP que tienen al menos uno o más de los siguientes dominios: una "caja de destrucción de ciclina", un "motivo 1 de la caja de ciclina", un "motivo 2 de la caja de ciclina", un "motivo CDC2", un "sitio de fosforilación de CDK", una "señal de localización nuclear", una "caja tipo Cy", un "dominio de enlazamiento de Rb", un "dominio de DEF", un "dominio de enlazamiento de ADN", un "dominio de DCB1", un "dominio de DCB2" y/o un dominio de SAP, y, preferiblemente, una actividad de CCP.

Las proteínas adicionales preferidas tienen al menos uno o más de los siguientes dominios: una "caja de destrucción de ciclina", un "motivo 1 de caja de ciclina", un "motivo 2 de caja de ciclina", un "motivo CDC2", un "sitio de fosforilación de CDK", una "señal de localización nuclear", una "caja tipo Cy", un "dominio de enlazamiento de Rb", un "dominio de DEF", un "dominio de enlazamiento de ADN", un "dominio de DCB1", un "dominio de DCB2" y/o un dominio de SAP y son, preferiblemente, codificados por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239.

Secuencias como las descritas aquí están resumidas a continuación, en la Tabla I.

3

4

5

6

Estudios detallados de interacciones entre las AtDP (formas a y b, SEQ ID NO: 114 y SEQ ID NO: 127, respectivamente) y las AtE2Fs (formas a y b; números acceso del GenBank AJ294534 y AJ294533, respectivamente) revelaron que las regiones de AtDPa y AtDPb involucradas en el enlazamiento de AtE2Fb son diferentes.

El enlazamiento de AtDPa a AtE2Fb requiere al menos del dominio de dimerización de AtDPa y del dominio C-terminal completo (o posiblemente parte del mismo) de AtDPa. El dominio N-terminal y el dominio de enlazamiento de ADN de AtDPa no parecen contribuir a la interacción de AtDPa con AtE2Fb (Ejemplos 11, 12, Tabla 5, Figura
54).

El enlazamiento de AtDPb a AtE2Fb, sin embargo, únicamente requiere de un dominio de dimerización de AtDPb intacto. Ni la región que incluye los dominios de enlazamiento de ADN y N-terminal de AtDPb, ni la región C-terminal de AtDPb parecen contribuir a la interacción de AtDPb con AtE2Fb (Ejemplos 11, 12, Tabla 5, Figura 55). Estas observaciones indican que la modulación de la formación de complejos de E2F/DP específicos puede ser útil en la modulación del ciclo celular recorrido y la regulación del mismo.

AtDPa y AtDPb, respectivamente, no forman homodímeros pero ambos interactúan ya sea con AtE2Fa o con AtE2Fb (Ejemplo 12, Tabla 5). En experimentos de reciprocidad se demostró que no se requiere del dominio N-terminal de AtE2Fa para el enlazamiento de AtDPa o de AtDPb. Igualmente, los dominios de enlazamiento de Rb de AtE2Fa y de AtE2Fb, respectivamente, no parecen contribuir al enlazamiento ya sea de AtDPa o de AtDPb. La región de AtE2Fa que abarca el dominio de dimerización y la caja marcada es suficiente para el enlazamiento con AtDPa y con AtDPb (Ejemplos 11,12, Fig. 50, Fig. 51, Tabla 5). El dominio de dimerización de las AtE2F parece ser suficiente para el enlazamiento con las AtDP.

Por lo tanto, se demuestra aquí por primera vez (para las DP de la planta y las E2F de la planta) que las proteínas DP y E2F mínimas o correspondientes a las secuencias de ADN que pueden ser utilizadas en procesos de modificación relacionados con E2F/DP, por ejemplo, regulación de la expresión génica por E2F/DP, incluyen:

(A) Al dominio de dimerización de DP de la planta con o sin (parte de) el dominio de DP C-terminal. Estos dominios incluyen las proteínas AtDPa143-292 y AtDPa143-21 (la numeración indica los aminoácidos incluidos en dicho fragmento con relación a la proteína AtDPa de longitud completa) expuestas en la SEQ ID NO: 221 y en la SEQ ID NO: 222, respectivamente. Las secuencias de codificación correspondientes a la secuencia de aminoácidos anterior expuesta en la SEQ ID NO: 232 y en la SEQ ID NO: 233, respectivamente. También están incluidas las regiones correspondientes de la proteína AtDPb caracterizada por AtDPb182-385 y AtDPb182-263 (partes de la proteína AtDPb de longitud completa). Las regiones anteriores de AtDPb están expuestas en la SEQ ID NO: 216 y en la SEQ ID NO: 215, respectivamente, y las secuencias de codificación correspondientes a las mismas están expuestas en la SEQ ID NO: 231 y en la SEQ ID NO: 230, respectivamente. El dominio AtDPb1-263 (SEQ ID NO: 223) y el dominio correspondiente AtDPa1-214 (SEQ ID NO: 220) codificados por las secuencias de ácido nucleico SEQ ID NO: 234 y SEQ ID NO: 239, respectivamente, pueden ser utilizados también. Además se incluyen las secuencias de ácido nucleico que hibridan a las SEQ ID NOs: 229 - 234 o a la SEQ ID NO: 239 o que codifican una proteína al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más, idénticas a las SEQ ID NOs: 211, 215 - 216 y 220 - 223.

(B) Al dominio de dimerización de E2F de la planta con o sin (parte de) la caja marcada. Estos dominios incluyen las proteínas AtE2Fa232-282, AtE2Fa232-352 y AtE2Fa226-356 expuestas en la SEQ ID NO: 224, la SEQ ID NO: 225 y la SEQ ID NO: 205, respectivamente. Las correspondientes secuencias de codificación de ADN están expuestas en la SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 236 y SEQ ID NO: 228, respectivamente. También están incluidas las regiones correspondientes de la proteína AtE2Fb caracterizadas por AtE2Fb194-243 y AtE2Fb194-311 expuestas en la SEQ ID NO: 226 y la SEQ ID NO: 227, respectivamente. Las correspondientes secuencias de codificación de ADN están expuestas en la SEQ ID NO: 237 y la SEQ ID NO: 238, respectivamente. Se incluyen además la secuencias de ácido nucleico que hibridan a la SEQ ID NO: 228 o las SEQ ID NOs: 235 - 238 o que codifican una proteína al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% idéntica a la SEQ ID NO: 205 o las SEQ ID NOs: 224 -
227.

(C) También se pueden utilizar proteínas E2F de la planta y DP de la planta de longitud completa o las correspondientes secuencias de ADN para modificar dichos procesos relacionados con E2F/DP. Además, se pueden utilizar las proteínas E2F de la planta y DP de la planta o las correspondientes secuencias de ADN, o partes de las mismas, ya sea en forma separada o en combinación para modificar dichos procesos relacionados con E2F/DP. Esto se pone de relieve por la demostración de que las AtDP y las AtE2F son coexpresadas en células que se dividen activamente y en al menos algunos tejidos de la planta (Ejemplo 13 y Figuras 57 y 58).

La especificación describe detalles adicionales en las siguientes subsecciones:

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I. Moléculas Aisladas de Ácido Nucleico

La especificación describe moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican proteínas CCP o porciones de las mismas biológicamente activas, así como fragmentos de ácido nucleico en cantidad suficiente para ser usados como sondas de hibridación para la identificación de ácidos nucleicos que codifican CCP (por ejemplo, ARNm para CCP) y fragmentos para ser usados como iniciadores para PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico para CCP. Como se lo utiliza aquí, el término "molécula de ácido nucleico" pretende incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generado utilizando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario.

Una molécula "aislada" de ácido nucleico es una que es separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, con relación al ADN genómico, el término "aislada" incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas del cromosoma con el cual está naturalmente asociado el ADN genómico. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias que flanquean en forma natural al ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo a partir del cual se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diferentes modalidades, la molécula aislada de ácido nucleico para CCP puede contener aproximadamente menos de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ó 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que naturalmente flanquean a la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula a partir de la cual se deriva el ácido nucleico. Además, una molécula "aislada" de ácido nucleico, tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se la produce por medio de técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros compuestos químicos cuando se la sintetiza químicamente.

Una molécula de ácido nucleico como la descrita aquí, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, o una porción de la misma, pueden ser aislada utilizando técnicas estándar de biología molecular y la información de la secuencia suministrada aquí. Por ejemplo, utilizando toda o una porción de la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, como sonda de hibridación, se pueden aislar moléculas de ácido nucleico para CCP utilizando técnicas estándar de hibridación y de clonación (por ejemplo, como se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Además, se pueden aislar una molécula de ácido nucleico que abarca toda o una porción de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239 por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando iniciadores sintéticos de oligonucleótido diseñados con base en la secuencia de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, respectivamente.

Se puede amplificar un ácido nucleico como se describe aquí utilizando ADNc, ARNm o alternativamente, ADN genómico, como molde e iniciadores apropiados de oligonucleótido de acuerdo con técnicas estándar de amplificación por PCR. El ácido nucleico así amplificado puede ser clonado en un vector apropiado y caracterizado por medio de análisis de secuencia del ADN. Además, se pueden preparar los oligonucleótidos correspondientes a la secuencia de nucleótidos para CCP por medio de técnicas estándar de síntesis, por ejemplo, utilizando un sintetizador automatizado de ADN.

Una molécula aislada de ácido nucleico como la descrita aquí puede incluir la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239.

Una molécula aislada de ácido nucleico como la descrita aquí puede incluir una molécula de ácido nucleico que sea un complemento de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, o una porción de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos. Una molécula de ácido nucleico que sea complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, es una que sea suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, respectivamente, de tal manera que puede ser hibridada a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, respectivamente, formando así un dúplex estable.

Una molécula aislada de ácido nucleico como la descrita aquí puede incluir una secuencia de nucleótidos que sea aproximadamente al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más, homologa a la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, a la longitud completa de la secuencia de nucleótidos) mostrada en la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, o una porción de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos.

Además, la molécula de ácido nucleico como se describe aquí puede incluir únicamente una porción de la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, por ejemplo un fragmento que puede ser utilizado como sonda o iniciador o un fragmento que codifica una porción biológicamente activa de una proteína CCP. La secuencia de nucleótidos determinada a partir de la clonación del gen para CCP permite la generación de sondas y de iniciadores diseñados para uso en la identificación y/o clonación de otros miembros de la familia de CCP, así como homólogos de CCP de otras especies. La sonda/iniciador contiene típicamente un oligonucleótido sustancialmente purificado. El oligonucleótido contiene típicamente una región de la secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones rigurosas hasta aproximadamente al menos 12 ó 15, preferiblemente aproximadamente 20 ó 25, más preferiblemente aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, ó 75 nucleótidos consecutivos de una secuencia sentido de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, o de una variante alélica de ocurrencia natural o mutante de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239. Una molécula de ácido nucleico como la descrita aquí puede incluir una secuencia de nucleótidos que tenga al menos 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, u 800 nucleótidos de longitud e hibrida bajo condiciones rigurosas de hibridación a una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 - 66
ó 228 - 239.

Las sondas con base en la secuencia de nucleótidos para CCP pueden ser utilizadas para detectar transcriptos o secuencias genómicas que codifican las mismas proteínas o proteínas homólogas. Preferiblemente, la sonda incluye además un grupo marcador unido a la misma, por ejemplo, el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o cofactor enzimático. Tales sondas pueden ser utilizadas como parte de un kit para pruebas de diagnóstico para la identificación de células o tejidos que expresan en forma incorrecta una proteína CCP, por ejemplo midiendo un nivel de ácido nucleico que codifica CCP en una muestra de células de un individuo por ejemplo, detectando los niveles de ARNm para CCP o determinando si un gen para CCP genómico ha sido mutado o
suprimido.

Un fragmento de ácido nucleico que codifica una "porción biológicamente activa de una proteína CCP" puede ser preparado por medio del aislamiento de una porción de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, que codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica de CCP (las actividades biológicas de las proteínas CCP son descritas aquí), expresando la porción codificada de la proteína CCP (por ejemplo, por medio de expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la porción codificada de la proteína CCP.

La especificación describe además moléculas de ácido nucleico que se diferencian de las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, debido a la degeneración del código genético y, por lo tanto, codifican las mismas proteínas CCP que aquellas codificadas por la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239. Una molécula aislada de ácido nucleico como la descrita aquí puede tener una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína CCP.

Además de la secuencia de nucleótidos para CCP mostrada en la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, aquellos capacitados en el arte se darán cuenta que los polimorfismos de la secuencia de ADN que conducen a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas CCP pueden existir dentro de una población (por ejemplo, una población de plantas de arroz o de Arabidopsis). Tan polimorfismo genético en los genes para CCP puede existir entre individuos dentro de una población debido a una variación alélica natural. Como se los utiliza aquí, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que incluyen un marco de lectura abierto que codifica una proteína CCP, preferiblemente una proteína CCP de una planta, y puede incluir además secuencias reguladoras no codificadoras, e intrones. Tales variaciones alélicas naturales incluyen tanto proteínas CCP funcionales como no funcionales y pueden resultar típicamente en una varianza del 1 - 5% en la secuencia de nucleótidos de un gen para CCP. Se escriben aquí todas y cada una de las variaciones de tales nucleótidos y los polimorfismo de aminoácidos resultantes en genes para CCP que son el resultado de una variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional de una proteína CCP. Las diferencias en el uso del codón preferido se ilustran más adelante para Agrobacterium tumefaciens (una bacteria), Arabidopsis thaliana, Medicago sativa (dos plantas dicotiledóneas) y Oryza sativa (una planta monocotiledónea). Estos ejemplos fueron extractados de htt://www.kazusa.or jp/codon. Por ejemplo, el codón GGC (para glicina) es el codón más frecuentemente utilizado en A. tumefaciens (36,2 \textperthousand), es el segundo codón más frecuentemente utilizado en O. sativa pero se utiliza en frecuencias mucho más bajas en A. thaliana y M sativa (9 \textperthousand y 8,4 \textperthousand, respectivamente). De los cuatro posibles codones que codifican glicina el codón GGC es el más preferiblemente utilizado en A. tumefaciens y O. sativa. Sin embargo, en A. thaliana el codón GGA (y GGU) es el más preferiblemente utilizado, mientras que en M sativa el codón GGU (y GGA) es el más preferiblemente
utilizado.

Además, se describen aquí las moléculas de ácido nucleico que codifican otros miembros de la familia de la CCP y, por lo tanto, que tienen una secuencia de nucleótidos que se diferencian que las secuencias de CCP de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239. Por ejemplo, se puede identificar otro ADNc para CCP con base en la secuencia de nucleótidos de las moléculas de CCP de la planta descritas aquí. Además, se describen aquí moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas CCP de diferentes especies, y por lo tanto que tienen una secuencia de nucleótidos que se diferencia de las secuencias de CCP de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239. Por ejemplo, se puede identificar un ADNc para CCP humana con base en la secuencia de nucleótidos de una CCP de la planta.

Las moléculas de ácido nucleico correspondientes a variantes alélicas naturales y homólogos de los ADNc para CCP como se describen aquí pueden ser aisladas con base en su homología con los ácidos nucleicos para CCP divulgados aquí utilizando los ADNc divulgados aquí, o una porción de los mismos, como sonda de hibridación de acuerdo con técnicas estándar de hibridación bajo condiciones de hibridación rigurosas.

Por lo tanto, una molécula aislada de ácido nucleico como la descrita aquí puede tener al menos 15, 20, 25, 30 ó más nucleótidos de longitud e hibridar bajo condiciones rigurosas a la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239. El ácido nucleico puede tener al menos 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, ó 600 nucleótidos de longitud. Como se lo utiliza aquí, el término "hibrida bajo condiciones rigurosas" pretende describir condiciones para hibridación y lavado bajo las cuales las secuencias de nucleótidos que son al menos 30%, 40%, 50%, ó 60% homóloga entre sí, permanecen típicamente hibridadas entre sí. Preferiblemente, las condiciones son tales que las secuencias que son aproximadamente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, incluso más preferiblemente aproximadamente al menos 85%, ó 90% homólogas entre sí, permanecen típicamente hibridadas entre sí. Tales condiciones rigurosas son conocidas por aquellos capacitados en el arte y pueden ser encontradas en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6. Un ejemplo preferido no limitante de condiciones de hibridación rigurosas son la hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) aproximadamente a 45ºC, seguido por uno o más lavados en 0,2 X SSC, SDS al 0,1% aproximadamente a 45ºC, seguido por uno o más lavados en 0,2 X SSC, SDS al 0,1% a 50ºC, preferiblemente a 55ºC, más preferiblemente a 60ºC, e incluso más preferiblemente a 65ºC. Rangos intermedios a los valores anteriormente mencionados, por ejemplo, a 60 - 65ºC o a 55 - 60ºC también pueden ser abarcados por la presente invención. Preferiblemente, una molécula aislada de ácido nucleico como la descrita aquí que híbrida bajo condiciones rigurosas a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239 corresponde a una molécula de ácido nucleico de ocurrencia natural. Como se lo utiliza aquí, una molécula de ácido nucleico de "ocurrencia natural" se refiere a una molécula de ADN o ARN que tiene una secuencia de nucleótidos que se presenta en la naturaleza (por ejemplo, que codifica una proteína natural).

Además de las variantes alélicas de ocurrencia natural de las secuencias de CCP que pueden existir en la naturaleza, el experto se dará cuenta además que se pueden introducir cambios por medio de mutación en las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, conduciendo por lo tanto a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas CCP, sin alterar la habilidad funcional de las proteínas CCP. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" en la secuencia de una proteína CCP. Un residuo aminoácido "no esencial" es un residuo que puede ser alterado a partir del a secuencia de tipo silvestre de la CCP sin alterar la actividad biológica, mientras que se requiere un residuo aminoácido "esencial" para la actividad biológica. Por ejemplo, los residuos aminoácidos que se conservan entre las proteínas CCP como se escribe aquí, se predice que son particularmente no sensibles de la alteración. Además, no es probable que residuos aminoácidos adicionales que se conservan entre las proteínas CCP como se describe aquí y otros miembros de la familia de las CCP sean sensibles a la
alteración.

Por lo tanto, la especificación también describe moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas CCP que contienen cambios en residuos aminoácidos que no son esenciales para la actividad.

Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica una proteína CCP homologa a las proteínas CCP descritas aquí puede ser creada por medio de la introducción de una o más sustituciones, adiciones o supresiones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, de tal manera que se introducen una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos dentro de la proteína codificada. Se pueden introducir mutaciones en la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239 por medio de técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, se hacen sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno o más residuos aminoácidos predichos no esenciales. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la cual se reemplaza el residuo aminoácido con un residuo aminoácido que tienen una cadena lateral similar. Las familias de residuos aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en el arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, se reemplaza preferiblemente un residuo aminoácido no esencial predicho en una proteína CCP con otro residuo aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, en otra modalidad, se pueden introducir mutaciones en forma aleatoria a lo largo de toda o de una parte de una secuencia de codificación de CCP, por ejemplo por medio de mutagénesis de saturación, y se pueden seleccionar los mutantes resultantes por la actividad biológica de la CCP para identificar mutantes que retengan la actividad. Después de la mutagénesis de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239, se puede expresar la proteína codificada en forma recombinante y se puede determinar la actividad de la proteína. Otra modalidad alternativa incluye una corrección o modificación dirigida in vivo que puede ser lograda por medio de oligonucleótidos quiméricos de ARN/ADN (por ejemplo, Yoon et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2071 - 2076; Arntzen et al. (1999) WO99/07865).

Preferiblemente, una proteína CCP mutante puede ser evaluada por la habilidad para: (1) regular la transmisión de señales a partir de receptores celulares, por ejemplo receptores hormonales; (2) controlar los puntos de control del ciclo celular, por ejemplo la entrada de las células en la mitosis; (3) modular el ciclo celular; (4) modular la muerte celular, por ejemplo, apoptosis; (5) modular la función del cicloesqueleto, por ejemplo agrupación de actina; (6) fosforilación de un sustrato; (7) crear efectos positivos dominantes o efectos negativos dominantes en plantas transgénicas; (8) interactuar con otras proteínas del control del ciclo celular, por ejemplo, en un ensayo de doble híbrido en levadura; (9) modular la actividad de CDK (por ejemplo, la actividad de ciclina-CDK); (10) regular el montaje del complejo ciclina-CDK; (11) regular el compromiso de las células a dividirse, por ejemplo, integrando señales mitogénicas y antimitogénicas; (12) regular el progreso del ciclo celular; (13) regular la replicación del ADN y/o reparar ADN; (14) modular la transcripción génica, por ejemplo, regular la transcripción de los genes que depende de E2F/DP; (15) regular la degradación de la ciclina; (16) modular el retiro del ciclo celular y/o la diferenciación celular; (17) controlar el tamaño del órgano (por ejemplo, órgano de la planta) y/o del organismo (por ejemplo, organismo de la planta); (18) controlar el crecimiento o la tasa de crecimiento del órgano (por ejemplo, órgano de la planta) y/o del organismo (por ejemplo, organismo de la planta); y (19) regular la endorredupli-
cación.

Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas CCP descritas anteriormente, la especificación también describe moléculas aisladas de ácido nucleico que son antisentido a las mismas. Un ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico "sentido" que codifica una proteína, por ejemplo, complementaria a la cadena codificadora de una molécula bicatenaria de ADNc o complementaria a una secuencia de ARNm. Por lo tanto, un ácido nucleico antisentido puede enlazarse por medio de un enlace de hidrógeno a un ácido nucleico sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una cadena codificadora entera de CCP, o únicamente a una porción de la misma. Una molécula de ácido nucleico antisentido puede ser antisentido a una "región de codificación" de la cadena de codificación de una secuencia de nucleótidos que codifica CCP. El término "región de codificación" se refiere a la región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que son traducidos en residuos aminoácidos. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser antisentido a una "región no codificadora" de la cadena de codificación de una secuencia de nucleótidos que codifican CCP. El término "región no codificadora" se refiere a secuencias 5' y 3' que flanquean la región de codificación que no son traducidas en aminoácidos (es decir, también denominadas como regiones no traducidas 5' y
3').

Dadas las secuencias de la cadena de codificación que codifican CCP divulgadas aquí, se pueden diseñar ácidos nucleicos antisentido como se describe aquí de acuerdo con las reglas de apareamiento de basas de Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la región entera de codificación del ARNm para CCP, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es antisentido solamente con una porción de la región de codificación o no codificadora del ARNm para CCP. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que rodea el sitio de inicio de la traducción del ARNm para CCP. Un oligonucleótido antisentido puede ser, por ejemplo, aproximadamente de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos de longitud. Se puede construir un ácido nucleico antisentido como se describe aquí utilizando reacciones de síntesis química y de ligación enzimática usando procedimientos conocidos en el arte. Por ejemplo, se puede sintetizar químicamente un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) usando nucleótidos de ocurrencia natural o nucleótidos modificados de diferentes maneras diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos sentido y antisentido, por ejemplo, derivados de fosforotioato y se pueden utilizar nucleótidos sustituidos con acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que pueden ser utilizados para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-iodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, el ácido nucleico antisentido puede ser producido biológicamente utilizando un vector de expresión dentro del cual se ha subclonado ácido nucleico en orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado será de orientación antisentido a un ácido nucleico objetivo de interés, descrito adicionalmente en la siguiente subsección). Preferiblemente, la producción de ácidos nucleicos antisentido en plantas ocurre por medio de un transgén integrado en forma estable que comprende un promotor operativo en plantas, un oligonucleótido antisentido, y un
terminador.

Otras modificaciones conocidas de nucleótidos incluyen metilación, ciclización y "casquetes" y sustitución de uno o más de los nucleótidos de ocurrencia natural con un análogo tal como inosina. Las modificaciones de nucleótidos incluyen modificaciones generadas por la adición a nucleótidos de acridina, amina, biotina, azul cascada, colesterol, Cy3®, Cy5®, Cy5.5® Dabcyl, digoxigenina, dinitrofenilo, Edans, 6-FAM, fluoresceina, 3'-glicerilo, HEX, IRD-700, IRD-800, JOE, fosfato de psoraleno, rodamina, ROX, tiol (SH), espaciadores, TAMRA, TET, AMCA-S®, SE, BODIPY®, Marina Blue®, Pacific Blue®, Oregon Green®, Rhodamine Green®, Rhodamine Red®, Rhodol Green® y Texas Red®. Las modificaciones de la columna vertebral del polinucleótido incluyen metilfosfonato, 2'-OMe-ARN metilfosfonato, fosforotiorato, ARN, 2'-OMeARN. Las modificaciones de bases incluyen 2-amino-dA, 2-aminopurina, 3'-(ddA), 3'dA(cordicepina), 7-deaza-dA, 8-Br-dA, 8-oxodA, N6-Me-dA, un sitio básico (dSpacer), biotina dT, 2'-OMe-5Me-C, 2'-OMe-propinil-C, 3'-(5-Me-dC), 3'-(ddC), 5-Br-dC, 5-1-dC, 5-Me-dC, 5-F-dC, carboxi-dT, dA convertible, dC convertible, dG convertible, dT convertible, dU convertible, 7-deaza-dG, 8-Br-dG, 8-oxo-dG, O6-Me-dG, S6-DNP-dG, 4-metil-indol, 5-nitroindol, 2'-OMe-inosina, 2'-dI, O6-fenil-dI, 4-metil-indol, 2'-desoxinebularina, 5-nitroindol, 2-aminopurina, dP(análogo de purina), dK(análogo de pirimidina), 3-nitropirrol, 2-tio-dT, 4-tio-dT, biotina-dT, carboxi-dT, O4-Me-dT, O4-triazol dT, 2'-OMe-propinil-U, 5-Br-dU, 2'-dU, 5-F-dU, 5-I-dU, O4-triazol dU.

Las moléculas de ácido nucleico antisentido como las descritas aquí se introducen típicamente en una planta o se las administra a un individuo o se generan in situ de tal manera que hibridan con o se enlazan a ARNm celular y/o ADN genómico que codifica una proteína CCP para inhibir así la expresión de la proteína, por ejemplo, por medio de la inhibición de la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser por medio de complementariedad convencional de nucleótidos para formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula antisentido de ácido nucleico que se enlaza a dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco principal de la doble hélice. Un ejemplo de una ruta de introducción o de administración de moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención incluye la transformación en una planta o una inyección directa en un sitio de un tejido en un individuo. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico antisentido pueden ser modificadas para dirigir células seleccionadas y luego administrarlas sistémicamente. Por ejemplo, para administración sistémica, se pueden modificar moléculas antisentido de tal manera que se enlacen específicamente a receptores o antígenos expresados sobre la superficie de la célula seleccionada, por ejemplo, enlazando las moléculas de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se enlacen a receptores o antígenos de la superficie de la célula. Las moléculas de ácido nucleico antisentido pueden ser suministradas también a las células utilizando los vectores descritos aquí. Para lograr concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, se prefieren las construcciones de vectores en las cuales se coloca la molécula de ácido nucleico antisentido bajo el control de un promotor constitutivo o un promotor pol II o pol III fuerte. La molécula de ácido nucleico antisentido como se describe aquí puede ser una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérico. Una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérico forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario en los cuales, contrario a las unidades \beta usuales, las cadenas corren paralelas entre sí (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15: 6625 - 6641). La molécula de ácido nucleico antisentido puede incluir también un 2'-o-metilribonucleótido (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131 - 6148) o un análogo de ARN - ADN quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215: 327 - 330).

La molécula de ácido nucleico antisentido puede incluir además una molécula de ácido nucleico sentido complementaria a la molécula de ácido nucleico antisentido. Los métodos de silenciamiento de genes basados en tales moléculas de ácido nucleico son bien conocidos por un experto en la materia (por ejemplo, Grierson et al. (1998) WO 98/53083; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050).

Un ácido nucleico antisentido como el descrito aquí puede ser un ribozima. Los ribozimas son moléculas de ARN catalítico con actividad de ribonucleasa que son capaces de escindir un ácido nucleico monocatenario, tal como un ARNm, con el cual tienen una región complementaria. Por lo tanto, se pueden utilizar ribozimas (por ejemplo, ribozimas cabeza de martillo (descritos en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334: 585 - 591)) para escindir catalíticamente transcriptos de ARNm para CCP para inhibir así la traducción de ARNm para CCP. Se puede diseñar un ribozima que tiene especificidad por un ácido nucleico que codifica CCP con base en la secuencia de nucleótidos de un ADNc para CCP divulgada aquí (es decir, SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239). Por ejemplo, se puede construir un derivado de un ARN de Tetrahimena L-19 IVS en el cual la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos que van a ser escindidos en un ARN que codifica CCP. Ver, por ejemplo, Cech et al., Patente Estadounidense No. 4.987.071; y Cech et al., Patente Estadounidense No. 5.116.742. Alternativamente, se puede utilizar ARNm para CCP para seleccionar un ARN catalítico que tiene actividad específica de ribonucleasa a partir de un reservorio de moléculas de ARN. Ver, por ejemplo, Bartel, D. y Szostak, J.W. (1993) Science 261: 1411 -
1418.

El uso de ribozimas para silenciamiento de genes en plantas es conocido en el arte (por ejemplo, Atkins et al. (1994) WO 94/00012; Lenne et al. (1995) WO 95/03404; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 y Scott et al. (1997) WO/97/38116).

Alternativamente, la expresión del gen para CCP puede ser inhibida dirigiendo las secuencias de nucleótidos complementarias a la región reguladora de la CCP (por ejemplo, el promotor de CCP y/o reforzadores) para formar estructuras helicoidales triples que previenen la transcripción del gen para CCP en células objetivo. Ver generalmente, Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6): 569 - 84; Helene, C. et al. (1992) Ann. N.Y. Acad Sci. 660: 27 - 36; y Maher, L.J. (1992) Bioassays 14(12): 807 - 15.

Las moléculas de ácido nucleico para CCP como se describe aquí pueden ser modificadas en la unidad estructural base, la unidad estructural del azúcar o en la columna vertebral de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación, o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, la columna vertebral del fosfato de desoxirribosa de las moléculas de ácido nucleico puede ser modificada para generar ácidos nucleico peptídicos (ver Hyrup B. et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4 (1): 5 - 23). Como se lo utiliza aquí, los términos "ácidos nucleicos peptídicos" o los "PNA" se refieren a imitaciones de ácido nucleico, por ejemplo, imitaciones de ADN, en las cuales la columna vertebral del fosfato de desoxirribosa es reemplazada por una columna vertebral de pseudopéptido y únicamente se retienen las cuatro nucleobases naturales. La columna vertebral neutra de los PNA ha mostrado que permite la hibridación específica a ADN y ARN bajo condiciones de fuerza iónica baja. La síntesis de oligómeros de PNA puede ser realizada utilizando protocolos estándar de síntesis de péptidos en fase sólida como se describe en Hyrup B. et al. (1996) más arriba; Perry-O'Keefe et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 14670 -
675.

Los PNA de moléculas de ácido nucleico para CCP pueden ser utilizados para incrementar el rendimiento de un cultivo en plantas o en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Por ejemplo, se pueden utilizar los PNA como agentes antigénicos o antisentido para modulación específica de la secuencia de expresión génica, por ejemplo, induciendo la detención de la transcripción o de la traducción o inhibiendo la replicación. Los PNA de las moléculas de ácido nucleico para CCP pueden ser utilizados también en el análisis de mutaciones de pares de bases individuales en un gen, (por ejemplo, por medio de represión de la PCR dirigida por PNA); como "enzimas artificiales de restricción" cuando se las utiliza en combinación con otras enzimas, (por ejemplo, nucleasas S1 (Hyrup B. (1996), ver más arriba)); o como sondas o iniciadores para secuenciación o hibridación de ADN (Hyrup B. et al. (1996), ver más arriba; Perry-O'Keefe, ver más arriba).

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Los PNA de CCP pueden ser modificados, (por ejemplo, para mejorar su estabilidad o la captación celular), uniendo grupos lipofílicos u otros grupos auxiliares a PNA, por medio de la formación de quimeras de PNA-ADN o por medio del uso de liposomas u otras técnicas de suministro de fármacos conocidas en el arte. Por ejemplo, se pueden generar quimeras de PNA-ADN de moléculas de ácido nucleico para CCP que pueden combinar las propiedades ventajosas del PNA y del ADN. Tales quimeras permiten enzimas de reconocimiento de ADN, (por ejemplo, ARNase H y ADN polimerasas), para interactuar con la porción de ADN mientras la porción de PNA proporcionaría alta afinidad y especificidad de enlazamiento. Las quimeras de PNA-ADN pueden ser enlazadas utilizando enlazadores de longitudes apropiadas seleccionados en términos del apilamiento de bases, del número de enlaces entre las nucleobases, y la orientación (Hyrup B. (1996), ver más arriba). La síntesis de quimeras de PNA-ADN se puede llevar a cabo como se describe en Hyrup B. (1996), ver más arriba, y Finn P.J. et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24 (17): 3357 - 63. Por ejemplo, se puede sintetizar una cadena de ADN sobre un soporte sólido utilizando química estándar de acoplamiento de fosforamidita y análogos de nucleósidos modificados, por ejemplo, se puede utilizar 5'-(4-metoxitritil)amino-5'-desoxi-timidina fosforamidita, como entre el PNA y el extremo 5' del ADN (Mag, M. et al. (1989) Nucleic Acid Res. 17: 5973 - 88). Se acoplan luego monómeros de PNA en una forma paso a paso para producir una molécula quimérica con un segmento 5' del PNA y un segmento 3' del ADN (Finn P.J. et al. (1996), ver más arriba). Alternativamente, se pueden sintetizar moléculas quiméricas con un segmento 5' de ADN y un segmento 3' del PNA (Peterser, K.H. et al. (1975) Bioorganic Med Chem. Lett. 5: 1119 -
11124).

El oligonucleótido puede incluir otros grupos añadidos tales como péptidos (por ejemplo, para dirigir receptores de células huésped in vivo), o agentes que facilitan el trasporte a través de la membrana de la célula (ver, por ejemplo, Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. US 86: 6553 - 6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci. USA 84: 648 - 652; Publicación PCT No. W088/09810) o la barrera hematoencefálica (ver, por ejemplo, la Publicación PCT No. W089/10134). Además, se pueden modificar oligonucleótidos con agentes de escisión activados por hibridación (Ver, por ejemplo, Krol et al. (1988) Bio-Techniques 6: 958 - 976) o agentes de intercalación. (Ver, por ejemplo, Zon (1988) Pharm. Res. 5: 539 - 549). Con este fin, se puede conjugar el oligonucleótido con otra molécula, (por ejemplo, un péptido, agente de entrecruzamiento activado por hibridación, agente de trasporte, o agente de escisión activado por hibridación).

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II. Proteínas CCP aisladas y anticuerpo anti-CCP

La especificación también describe proteínas CCP aisladas (por ejemplo, las secuencias de aminoácidos expuestos en la SEQ ID N0: 67-132, 205, 211, 215 - 216, ó 220 - 227) y porciones biológicamente activas de las mismas, así como fragmentos de polipéptido adecuados para uso como inmunógenos para elevar los anticuerpos anti-CCP. Se pueden aislar las proteínas CCP nativas a partir de fuentes de células o de tejidos por medio de un esquema apropiado de purificación utilizando técnicas estándar de purificación de proteína. Se pueden producir proteínas CCP por medio de técnicas de ADN recombinante. En forma alternativa a la expresión recombinante, se puede sintetizar químicamente un polipéptido o una proteína CCP utilizando técnicas estándar de síntesis de
péptidos.

Una proteína "aislada" o "purificada" o una porción biológicamente activa de la misma está sustancialmente libre de material celular o de otras proteínas contaminantes de la fuente de células o de tejido a partir de la cual se deriva la proteína CCP, o sustancialmente libre de precursores químicos o de otros compuestos químicos cuando se la sintetiza químicamente. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de proteína CCP en las cuales se separa la proteína de componentes celulares de las células a partir de los cuales se aísla o se produce en forma recombinante. En una modalidad, la expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de proteína CCP que tienen aproximadamente menos del 30% (en peso seco) de proteína que no es CCP (también denominada aquí como una "proteína contaminante"), más preferiblemente aproximadamente menos del 20% de proteína que no es CCP, aún más preferiblemente aproximadamente menos del 10% de proteína que no es CCP, y lo más preferiblemente aproximadamente menos del 5% de proteína que no es CCP. Cuando la proteína CCP o una porción biológicamente activa de la misma es producida en forma recombinante, también es preferiblemente sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa aproximadamente menos del 20%, más preferiblemente aproximadamente menos del 10%, y lo más preferible aproximadamente menos del 5% del volumen de la preparación de proteína.

La expresión "sustancialmente libre de precursores químicos o de otros compuestos químicos" incluye preparaciones de proteína CCP en las cuales se prepara la proteína de los precursores químicos o de otros compuestos químicos que están involucrados en la síntesis de la proteína. La expresión "sustancialmente libre de precursores químicos o de otros compuestos químicos" puede incluir preparaciones de proteína CCP que tienen aproximadamente menos del 30% (en peso seco) de precursores químicos o de compuestos químicos que no son CCP, más preferiblemente aproximadamente menos del 20% de precursores químicos o de compuestos químicos que no son CCP, aún más preferiblemente aproximadamente menos del 10% de precursores químicos o de compuestos químicos que no son CCP, y lo más preferible aproximadamente menos del 5% de precursores químicos o de compuestos químicos que no son CCP.

Las porciones biológicamente activas de una proteína CCP incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente homólogas a o derivadas de la secuencia de aminoácidos de la proteína CCP, que incluye menos aminoácidos que las proteínas CCP de longitud completa, y exhibe al menos una actividad de una proteína CCP. Típicamente, las porciones biológicamente activas incluyen un dominio o motivo con al menos una actividad de la proteína CCP. Una porción biológicamente activa de una proteína CCP puede ser un polipéptido que es, por ejemplo, de al menos 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de longitud.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico, se alinean las secuencias para propósitos de una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o en ambas de una primera y una segunda secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos para alineación óptima y se pueden ignorar las secuencias no homólogas para propósitos de comparación). Preferiblemente, la longitud de la secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación es al menos del 30%, preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, incluso más preferiblemente al menos 60%, e incluso más preferiblemente al menos 70%, 80%, ó 90% de la longitud de la secuencia de referencia. Se comparan luego los residuos aminoácidos o los nucleótidos en las correspondientes posiciones de los aminoácidos o posiciones de los nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo aminoácido o nucleótido que la correspondiente posición en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se utiliza aquí "identidad" de aminoácidos o de ácidos nucleicos es equivalente a "homología" de aminoácidos o de ácidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que necesita ser introducido para una alineación óptima de las dos secuencias.

La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden lograr utilizando un algoritmo matemático. Preferiblemente, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444 - 453 (1970)) que ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando ya sea una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y un peso por hueco de 16,14,12,10, 8, 6, ó 4 y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6. Preferiblemente, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso por hueco de 40, 50, 60, 70, ó 80 y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6. Un ejemplo preferido no limitante de parámetros que son utilizados junto con el programa GAP incluye una matriz de puntuación de Blosum 62 con una penalización por hueco de 12, una penalización por extensión del hueco de 4, y una penalización por hueco por cambio de marco de 5.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11 - 17 (1988)) ha sido incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0 o versión 2.0U), utilizando una tabla de residuos por peso PAM120, una penalización por longitud del hueco de 12 y una penalización por hueco de 4.

Las secuencias del polipéptido y del ácido nucleico como las divulgadas aquí pueden ser utilizadas adicionalmente como una "secuencia de pregunta" para llevar a cabo una búsqueda contra bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Tales búsquedas se pueden llevar a cabo utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 - 10. Las búsquedas de nucleótidos con BLAST se pueden llevar a cabo con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a moléculas de ácido nucleico de Quinasa y de Fosfatasa de la invención. Las búsquedas de proteína con BLAST se pueden llevar a cabo con el programa XBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 3, y una matriz Blosum62 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de polipéptido de Quinasa y de Fosfatasa de la invención. Para obtener alineaciones que tienen un hueco para propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389 - 3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

La especificación describe además proteínas de fusión o quiméricas CCP. Como se lo utiliza aquí, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" CCP comprende un polipéptido CCP operativamente enlazado a un polipéptido que no es CCP. Un "polipéptido CCP" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a CCP, mientras que un "polipéptido que no es CCP" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína que no es sustancialmente homóloga a la proteína CCP, por ejemplo, una proteína que es diferente de la proteína CCP y que se deriva del mismo o de un organismo diferente. Dentro de una proteína de fusión CCP, el polipéptido CCP puede corresponder a toda o a una porción de una proteína CCP. Preferiblemente, una proteína de fusión CCP incluye al menos una porción biológicamente activa de una proteína CCP. Preferiblemente, una proteína de fusión CCP comprende al menos dos porciones biológicamente activas de una proteína CCP. Dentro de la proteína de fusión, el término "operativamente enlazada" pretende indicar que el polipéptido CCP y el polipéptido que no es CCP se fusionan entre sí en el marco. El polipéptido que no es CCP se puede fusionar al terminal N o al terminal C del polipéptido CCP o puede ser insertado dentro del polipéptido CCP. El polipéptido que no es CCP puede ser, por ejemplo, etiqueta de (histidina)_{6}, glutationa S-transferasa, proteína A, proteína de enlazamiento de maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo de Tag\cdot 100 (EETARFQPGYRS; SEQ ID NO: 199), epítopo de cmyc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 200), epítopo de FLAG® (DYKDDDK; SEQ ID NOs: 201), lacZ, CMP (péptido de enlazamiento de calmodulina), epítopo de HA (YPYDVPDYA; SEQ ID NO: 202), epítopo de proteína C (EDQVDPRLIDGK; SEQ ID NO: 203) o epítopo de VSV (YTDIEMNRLGK; SEQ ID NO: 204).

Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser una proteína de fusión GST-CCP en la cual las secuencias CCP se fusionan con el terminal C de las secuencias GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de CCP recombinante.

La proteína de fusión puede ser una proteína CCP que contiene una secuencia de señal heteróloga en su terminal N. En ciertas células huésped (por ejemplo, células huésped de planta o de mamífero), se puede incrementar la expresión y/o secreción de CCP a través del uso de una secuencia de señal heteróloga.

Las proteínas de fusión de CCP como se describe aquí pueden ser incorporadas en las composiciones farmacéuticas y administradas a una planta o a un individuo in vivo. Las proteínas de fusión de CCP se pueden utilizar para afectar la biodisponibilidad de un sustrato de CCP. El uso de proteínas de fusión de CCP puede ser útil para la agricultura para incrementar el rendimiento de los cultivos o terapéuticamente para el tratamiento de trastornos relacionados con el crecimiento celular, por ejemplo, cáncer. Además, las proteínas de fusión de CCP como se describe aquí pueden ser utilizadas como inmunógenos para producir anticuerpos anti-CCP en un individuo, para purificar ligandos de CCP y en los ensayos de selección para identificar moléculas que inhiben la interacción de CCP con un sustrato de CCP, por ejemplo, una quinasa tal como CDC2b.

Preferiblemente, una CCP quimérica o proteína de fusión como la descrita aquí es producida por medio de técnicas estándar de ADN recombinante. Por ejemplo, se ligan fragmentos de ADN que codifican para las diferentes secuencias de polipéptidos en el marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo empleando terminales para ligación de extremo romo o de extremo escalonado, digestión con enzima de restricción para establecer terminales apropiados, llenando de extremos cohesivos según sea conveniente, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una unión indeseable, y ligación enzimática. El gen de fusión puede ser sintetizado con técnicas convencionales incluyendo sintetizadores automatizados de ADN. Alternativamente, la aplicación por PCR de fragmentos de genes puede ser llevada a cabo utilizando iniciadores ancla que dan lugar a proyecciones complementarias entre dos fragmentos consecutivos de genes que pueden posteriormente hibridarse y amplificarse nuevamente para generar una secuencia génica quimérica (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Además, se encuentran comercialmente disponibles muchos vectores de expresión que ya codifican una unidad estructural de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST). Se puede clonar un ácido nucleico que codifica CCP en tal vector de expresión de tal manera que la unidad estructural de fusión está enlazada en el marco a la proteína
CCP.

La presente especificación también describe variantes de las proteínas CCP que funcionan ya sea como agonistas de CCP (miméticos) o como antagonistas de CCP. Se pueden generar variantes de las proteínas CCP por mutagénesis, por ejemplo, mutación puntual discreta o truncamiento de una proteína CCP. Un agonista de las proteínas CCP puede retener sustancialmente la misma, o un subconjunto, de las actividades biológicas de la forma de ocurrencia natural de una proteína CCP. Un antagonista de una proteína CCP puede inhibir una o más de las actividades de la forma de ocurrencia natural de la proteína CCP, por ejemplo, por medio de modulación competitiva de una actividad celular de una proteína CCP. De este modo, se pueden obtener efectos biológicos específicos por tratamiento con una variedad de función limitada. El tratamiento de un individuo con una variante que tiene un subconjunto de actividades biológicas de la forma de ocurrencia natural de la proteína puede tener menos efectos secundarios en un individuo con relación al tratamiento con la forma de ocurrencia natural de la proteína CCP.

Las variantes de una proteína CCP que funcionan ya sea como agonistas de CCP (miméticos) o como antagonistas de CCP pueden ser identificadas por selección de bibliotecas de combinación de mutantes, por ejemplo, mutantes de truncamiento, de una proteína CCP para actividad agonista o antagonista de proteína CCP. Se puede generar una biblioteca abigarrada de variantes de CCP por medio de mutagénesis de combinación a nivel de ácido nucleico y se codificada por una abigarrada biblioteca de genes. Se puede producir una biblioteca abigarrada de variantes de CCP, por ejemplo, por medio de ligación enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas de tal manera que un conjunto degenerado de secuencias potenciales de CCP puede ser expresada como polipéptidos individuales, o alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión mayores (por ejemplo, para exhibición de fagos) que contienen el conjunto de secuencias de CCP allí dentro. Existen una variedad de métodos que pueden ser utilizados para producir bibliotecas de variantes potenciales de CCP a partir de una oligosecuencia degenerada de nucleótidos. La síntesis química de una secuencia génica degenerada puede ser llevada a cabo en un sintetizador automático de ADN, y luego se liga el gen sintético en un vector de expresión apropiado. El uso de un conjunto degenerado de genes permite el suministro, en una mezcla, de todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de secuencias potenciales de CCP. Los métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados son conocidos en el arte (ver, por ejemplo, Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:
477.

Además, se pueden utilizar bibliotecas de fragmentos de una secuencia que codifica proteína CCP para generar una población abigarrada de fragmentos de CCP para tamizaje y posterior selección de variantes de una proteína CCP. Se puede generar una biblioteca de fragmentos de secuencia por tratamiento de un fragmento bicatenario de PCR de una secuencia que codifica CCP con una nucleasa bajo condiciones en donde se presenta amellamiento únicamente aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando al ADN bicatenario, renaturalizando el ADN para formar ADN bicatenario que puede incluir pares sentido/antisentido de diferentes productos amellados, removiendo porciones monocatenarias de dúplex reformados por tratamiento con S1 nucleasa, y ligando la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Por medio de este método, se puede derivar una biblioteca de expresión que codifica fragmentos N-terminales, C-terminales e internos de diferentes tamaños de la proteína
CCP.

Se conocen diferentes técnicas en el estado del arte para seleccionar productos génicos de bibliotecas de combinación elaboradas por medio de mutaciones o truncamientos puntuales, y para selección de bibliotecas de ADNc por productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Tales técnicas pueden adaptarse para selección rápida de las bibliotecas de genes generadas por la mutagénesis de combinación de proteínas CCP. Las técnicas más ampliamente utilizadas, que son susceptibles a análisis de alto rendimiento, para seleccionar grandes bibliotecas génicas incluyen típicamente clonación de la biblioteca de genes en vectores de expresión replicable, transformando células apropiadas con la biblioteca resultante de vectores, y expresando los genes de combinación bajo condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica al gen cuyo producto fue detectado. La mutagénesis de ensamble recursivo (REM), una nueva técnica que mejora la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, puede ser utilizada en combinación con los ensayos de selección para identificar variantes de CCP (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 7811 - 7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3): 327 - 331).

Se pueden aprovechar los ensayos basados en células para analizar una biblioteca abigarrada de CCP. Por ejemplo, se puede transfectar una biblioteca de vectores de expresión en una línea de células que ordinariamente sintetiza y secreta CCP. Se cultivan luego las células transfectadas de tal manera que se segregan CCP y en particular CCP mutante y se puede detectar el efecto de la expresión del mutante sobre la actividad de CCP en sobrenadantes de células, por ejemplo, por medio de cualquiera entre una cantidad de ensayos enzimáticos. Se puede recuperar luego el ADN del plásmido de las células que cuentan para la inhibición, o alternativamente, potenciación de la actividad de CCP, y los clones individuales caracterizados adicionalmente.

Una proteína aislada CCP, o una porción o fragmento de la misma, puede ser utilizada como un inmunógeno para generar anticuerpos que enlacen CCP utilizando técnicas estándar para preparación de anticuerpo policlonal y monoclonal. Se puede utilizar una proteína CCP de longitud completa o, alternativamente, la especificación describe fragmentos peptídicos antigénicos de CCP para uso como inmunógenos. El péptido antigénico de CCP incluye al menos 8 residuos aminoácidos y abarca un epítopo de CCP de tal manera que un anticuerpo surgido contra el péptido forma un complejo inmunoespecífico con CCP. Preferiblemente, el péptido antigénico incluye al menos 10 residuos aminoácidos, más preferiblemente al menos 15 residuos aminoácidos, incluso más preferiblemente al menos 20 residuos aminoácidos, y lo más preferible al menos 30 residuos aminoácidos.

Los epítopos preferidos abarcados por el péptido antigénico son regiones de CCP que están localizadas sobre la superficie de la proteína, por ejemplo, regiones hidrofílicas.

Se utiliza típicamente un inmunógeno de CCP para preparar anticuerpos por inmunización de un individuo adecuado, (por ejemplo, un conejo, cabra, ratón u otros mamíferos) con el inmunógeno. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, proteína CCP expresada en forma recombinante o un polipéptido CCP sintetizado químicamente. La preparación puede incluir adicionalmente un adyuvante, tal como un adyuvante completo o incompleto de Freund, o agente inmunoestimulador similar. La inmunización de un individuo adecuado con una preparación inmunogénica de CCP induce una respuesta de anticuerpo policlonal anti-CCP.

Por lo tanto, la especificación también describe anticuerpos anti-CCP. El término "anticuerpo" como se lo utiliza aquí se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de enlazamiento de antígeno que específicamente enlaza (inmunorreacciona con) un antígeno, tal como CCP. Los ejemplos de porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')_{2} que pueden ser generados por tratamiento del anticuerpo con una enzima tal como pepsina. La invención proporciona anticuerpos policlonales y monoclonales que enlazan CCP. El término "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se lo utiliza aquí, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contiene únicamente una especie de un sitio de enlazamiento de antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular de CCP. Una composición de anticuerpo monoclonal despliega típicamente por lo tanto una única afinidad de enlazamiento por una proteína CCP particular con la cual inmunoreacciona.

Los anticuerpos policlonales anti-CCP se pueden preparar como se describió anteriormente inmovilizando a un individuo adecuado con un inmunógeno de CCP. El título del anticuerpo anti-CCP en el individuo inmunizado puede ser monitoreado a través del tiempo por medio de técnicas estándar, tales como con un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) utilizando CCP inmovilizada. Si se desea, se pueden aislar moléculas de anticuerpo dirigidas contra CCP del mamífero (por ejemplo, de la sangre) y purificar las adicionalmente por medio de técnicas bien conocidas, tales como cromatografía de proteína A para obtener la fracción IgG. En un momento apropiado después de la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos de los anticuerpos anti-CCP sean más altos, se pueden obtener células productoras de anticuerpo del individuo y utilizadas para preparar anticuerpos monoclonales por medio de técnicas estándar, tales como la técnica del hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495 - 497) (ver también, Brown et al. (1981) J. Immunol. 127: 539 - 46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255: 4980 - 83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad Sci. USA 76: 2927 - 31; y Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29: 269 - 75), la técnica más reciente de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4: 72), la técnica del hibridoma de EBV (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77 - 96) o técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas de anticuerpo monoclonal es bien conocida (ver generalmente R. H. Kenneth, en Monoclonal Antibodies: A New Dimension En Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54: 387 - 402; M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3: 231 - 36). En resumen, una línea de células inmortales (típicamente un mieloma) se fusiona a linfocitos (típicamente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con un inmunógeno de CCP como se describió anteriormente, y se seleccionan los sobrantes del cultivo de las selvas de hibridoma resultantes para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se enlaza a
CCP.

Cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos utilizados para fusionar linfocitos y líneas de células inmortalizadas puede ser aplicado con el propósito de generar un anticuerpo monoclonal anti-CCP (ver, por ejemplo, G. Galfre et al. (1977) Nature 266: 55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet., citado más arriba; Lerner, Yale J. Biol. Med., citado más arriba; Kenneth, Monoclonal Antibodies, citado más arriba). Además, la persona ordinariamente capacitada se dará cuenta que existen muchas variaciones de tales métodos que también serían útiles. Típicamente, la línea de células inmortales (por ejemplo, una línea de células de mieloma) se deriva de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, se pueden elaborar hibridomas de múrido fusionando linfocitos de un ratón inmunizado con una preparación inmunogénica de la presente invención con una línea inmortalizada de células ratón. Las líneas preferidas de células inmortalizadas son líneas de células de mieloma de ratón que son sensibles al medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Se puede utilizar cualquiera entre una cantidad de líneas de células de mieloma como compañera de fusión de acuerdo con técnicas estándar, por ejemplo, las líneas de mieloma, P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas líneas de mieloma se encuentran disponibles a partir de la ATCC. Típicamente, se fusionan las líneas de mieloma de ratón sensibles a HAT a esplenocitos de ratón utilizando polietilén glicol ("PEG"). Se seleccionan luego las células de hibridoma resultantes de la fusión utilizando un medio HAT, que mata las células de mieloma fusionadas en forma no productiva y las no fusionadas (los esplenocitos no fusionados mueren después de varios días porque no se transforman). Las células de hibridoma que producen anticuerpo monoclonal de la invención se detectan por selección de los sobrantes del cultivo de hibridoma por anticuerpos que enlazan CCP, por ejemplo, utilizando un ensayo estándar de
ELISA.

En forma alternativa a la preparación de hibridomas que segregan anticuerpo monoclonal, se puede identificar y aislar un anticuerpo monoclonal anti-CCP seleccionando una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria recombinante (por ejemplo, una biblioteca que despliega un fago anticuerpo) con CCP para aislar así miembros de una biblioteca de inmunoglobulina que enlazan CCP. Los kits para la generación y selección de bibliotecas que exhiben fagos se encuentran comercialmente disponibles (por ejemplo, el Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catálogo No. 27-9400-01; y el Stratagene SurfZAP^{TM} Phage Display Kit, Catálogo No. 240612). Adicionalmente, se pueden encontrar ejemplos de métodos y de reactivos particularmente sensibles para uso en la generación y selección de bibliotecas que exhiben anticuerpos, por ejemplo, en Ladner et al., Patente Estadounidense No. 5.223.409; Kang et al., Publicación Internacional PCT No. WO 92/18619; Dower et al., Publicación Internacional PCT No. WO 91/17271; Winter et al., Publicación Internacional PCT WO 92/20791; Markland et al., Publicación Internacional PCT No. WO 92/15679; Breitling et al., Publicación Internacional PCT WO 93/01288; McCafferty et al., Publicación Internacional PCT No. WO 92/01047; Garrard et al., Publicación Internacional PCT No. WO 92/09690; Ladner et al., Publicación Internacional PCT No. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370 - 1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod Hybridomas 3: 81 - 85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275 - 1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725 - 734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889 -896; Clarkson et al. (1991) Nature 352: 624 - 628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 3576 - 3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373 - 1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19: 4133 - 4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88: 7978 - 7982; y McCafferty et al. Nature (1990) 348: 552 - 554.

Adicionalmente, anticuerpos anti-CCP recombinantes, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que contienen tanto porciones humanas como no humanas, que pueden ser elaborados utilizando técnicas estándar de ADN recombinante, son descritos aquí. Tales anticuerpos monoclonales humanizados y quiméricos pueden ser producidos por medio de técnicas de ADN recombinante conocidas en el arte, por ejemplo utilizando métodos descritos en Robinson et al., Solicitud Internacional No. PCT/US86/02269; Akira, et al., Solicitud de Patente Europea 184,187; Taniguchi, M., Solicitud de Patente Europea 171,496; Morrison et al., Solicitud de Patente Europea 173.494; Neuberger et al., Publicación Internacional PCT No. WO 86/01533; Cabilly et al., Patente Estadounidense No. 4.16.567; Cabilly et al., Solicitud de Patente Europea 125.023; Better et al. (1988) Science 240: 1041 - 1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci. USA 84: 3439 - 3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139: 3521 - 3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci. USA 84: 214 - 218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47: 999 - 1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446 - 449; y Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553 - 1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229: 1202 - 1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214; Winter, Patente Estadounidense No. 5.225.539; Jones et al..(1986) Nature 321: 552 - 525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534; y Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141: 4053 - 4060.

Un anticuerpo anti-CCP (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) puede ser utilizado para aislar CCP por medio de técnicas estándar, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Un anticuerpo anti-CCP puede facilitar la purificación de CCP natural de las células y de CCP producida en forma recombinante expresada en células huésped. Además, se puede utilizar un anticuerpo anti-CCP para detectar proteína CCP (por ejemplo, en un lisado celular o sobrante celular) con el propósito de evaluar la abundancia y el patrón de expresión de la proteína CCP. Estos anticuerpos también pueden ser utilizados, por ejemplo, para la inmunoprecipitación e inmunolocalización de proteínas como se describe aquí así como para el monitoreo de la síntesis de tales proteínas, por ejemplo, en organismos recombinantes, y para la identificación de compuestos que interactúan con la proteína como se describe
aquí.

Se pueden utilizar anticuerpos anti-CCP para uso diagnóstico para monitorear niveles de proteína en tejido como parte de un procedimiento de análisis clínico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. Se puede facilitar la detección por medio del acoplamiento (es decir, enlazando físicamente) el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diferentes enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminescentes, y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina, y los ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S o ^{3}H.

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III. Medios legibles por un ordenador

Las secuencias de nucleótidos para CCP (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239) o secuencias de aminoácidos como las descritas aquí (por ejemplo, las SEQ ID NO: 67 - 132, 205, 211, 215 - 216, ó 220 - 227) son también suministradas en una variedad de medios para facilitar el uso de las mismas. Como se lo utiliza aquí, "suministradas" se refiere a una fabricación, que no sea un ácido nucleico aislado o molécula de aminoácido, que contienen secuencias de aminoácidos o de nucleótidos como se describen aquí. Tal fabricación proporciona las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos, o un subconjunto de las mismas (por ejemplo, un subconjunto de marcos de lectura abierto (ORI)) en una forma que le permita a una persona capacitada examinar la fabricación utilizando medios no directamente aplicables al examen de secuencias de aminoácidos o de nucleótidos, o un subconjunto de las mismas, tal como se presentan en la naturaleza o en forma purificada.

Una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos como la descrita aquí puede ser grabada en un medio legible por un ordenador. Como se lo utiliza aquí, "medio legible por un ordenador" incluye cualquier medio que pueda ser leído y accesado directamente por un ordenador. Tales medios incluyen, pero no se limitan a: un medio magnético de almacenamiento, tal como disquetes, un medio de almacenamiento en disco duro, y una cinta magnética; un medio óptico de almacenamiento tal como un CD-ROM; un medio eléctrico de almacenamiento tal como RAM y ROM; e híbridos de estas categorías tales como medios de almacenamiento magnético/óptico. La persona capacitada se dará cuenta fácilmente cómo cualquiera de los medios actualmente conocidos legibles por un ordenador pueden ser utilizados para crear un producto que incluya un medio legible por un ordenador que tenga grabado allí una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos como se describe aquí.

Como se lo utiliza aquí, "grabado" se refiere a un proceso para almacenar información en un medio legible por un ordenador. La persona capacitada en el arte puede adoptar fácilmente cualquiera de los métodos conocidos actualmente para grabar información en un medio legible por un ordenador para generar productos que contengan la información de la secuencia de aminoácidos o de nucleótidos como la descrita aquí.

Se encuentran disponibles para un experto en la materia una variedad de estructuras para almacenamiento de datos para crear un medio legible por un ordenador que tenga grabada sobre el mismo una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos como se describe aquí. La escogencia de la estructura para almacenamiento de datos generalmente se basará en los medios escogidos para acceder a la información almacenada. Además, se pueden utilizar una variedad de programas para procesamiento de datos y de formatos para almacenar la información de la secuencia de nucleótidos como se describe aquí sobre un medio legible por un ordenador. La información de la secuencia puede ser representada en un archivo de texto para procesamiento de palabra, formateada en un software comercialmente disponible tal como WordPerfect y Microsoft Word, o representada en la forma de un archivo ASCII, almacenada en una aplicación de una base de datos, tal como DB2, Sybase Oracle, o similar. El experto en la materia puede adaptar fácilmente cualquier cantidad de formatos para estructuración del procesador de datos (por ejemplo, archivo de texto o base de datos) con el propósito de obtener un medio legible por un ordenador que tenga grabada allí la información de la secuencia de nucleótidos como se describe aquí.

Por medio del suministro de la secuencias de aminoácidos o de nucleótidos de la invención en una forma legible por un ordenador, el experto en la materia puede acceder rutinariamente a la información de la secuencia para una variedad de propósitos. Por ejemplo, una persona capacitada en el arte puede utilizar las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos como se describe aquí en una forma legible por un ordenador para comparar una secuencia objetivo o un motivo estructural objetivo con la información de la secuencia almacenada en el medio para almacenamiento de datos. Se utilizan medios de búsqueda para identificar fragmentos o regiones de las secuencias como se describe aquí que coinciden con una secuencia objetivo particular o un motivo objetivo.

Como se lo utiliza aquí, una "secuencia objetivo" puede ser cualquier secuencia de aminoácidos o de ADN de seis o más nucleótidos o de dos o más aminoácidos. Un experto en la materia puede reconocer fácilmente que entre más larga sea una secuencia objetivo, es menos probable que esté presente una secuencia objetivo en forma aleatoria en la base de datos. La longitud más preferida de la secuencia de una secuencia objetivo es aproximadamente de 10 hasta 100 aminoácidos o aproximadamente desde 30 hasta 300 residuos de nucleótidos. Sin embargo, es bien sabido que fragmentos comercialmente importantes, tales como los fragmentos de una secuencia involucrados en expresión génica y en procesamiento de proteína, pueden ser de menor longitud.

Como se lo utiliza aquí, "un motivo estructural objetivo" o un "motivo objetivo", se requieren a cualquier secuencia seleccionada en forma racional o combinación de secuencias en la cual la(s) secuencia (s) se escoge(n) con base en una configuración tridimensional que se forma después del plegado del motivo objetivo. Existen una variedad de motivos objetivo conocidos en el arte. Los motivos objetivo de proteína incluyen, pero no se limitan a, sitios activos de la enzima y secuencias señal. Los motivos objetivo de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras, estructuras en

\hbox{forma de horquilla y elementos de expresión inducible 
(secuencias de enlazamiento de proteína).}

El software de ordenador que se encuentra públicamente disponible le permite a una persona experta en la materia acceder a la información de la secuencia suministrada en un medio legible por un ordenador para análisis y comparación con otras secuencias. Públicamente se han divulgado una variedad de algoritmos conocidos y existe y puede ser utilizado una variedad de software comercialmente disponible para llevar a cabo las búsquedas en los sistemas basados en un ordenador como se describe aquí. Los ejemplos de tal software incluyen, pero no se limitan a, MacPatter (EMBL), BLASTN y BASTX (NCBIA).

Por ejemplo, se puede utilizar el software que implementa los algoritmos de búsqueda de BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 - 410) y de BLAZE (Brutlag et al. (1993) Comp. Chem. 17: 203 - 207) sobre un sistema Sybase para identificar marcos de lectura abiertos (los ORF) de las secuencias como se describe aquí que contienen homología con los ORF o con las proteínas de otras bibliotecas. Tales ORF son fragmentos que codifican proteína y son útiles en la producción de proteínas comercialmente importantes tales como las enzimas utilizadas en diferentes reacciones y en la producción de metabolitos comercialmente útiles.

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IV. Vectores de expresión recombinante y células huésped

La especificación también describe vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína CCP (o una porción de la misma). Como se lo utiliza aquí, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular dentro del cual se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos adicionales de ADN dentro del genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped dentro de la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamífero) se integran en el genoma de una célula huésped después de la introducción en la célula huésped, y por lo tanto se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se encuentran operativamente enlazados. Tales vectores son denominados aquí como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en la forma de plásmidos. En la presente especificación, los términos "plásmido" y "vector" pueden ser utilizados en forma intercambiable ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, también se describen otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados de replicación defectuosa), que cumplen una función equivalente.

Los vectores de expresión recombinante como se describe aquí comprenden un ácido nucleico como el descrito aquí en una forma adecuada para expresión del ácido nucleico en la célula huésped, por ejemplo, una célula vegetal, lo que significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas con base en las células huésped que van a ser utilizadas para expresión, que están operativamente enlazadas a la secuencia de ácido nucleico que va a ser expresada. Dentro de un vector de expresión recombinante, "operativamente enlazada" pretende dar a entender que la secuencia de nucleótidos de interés están enlazada a la(s) secuencia(s)
reguladora(s) en una forma que permita la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando se introduce el vector en la célula huésped). El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, reforzadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras son descritas, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos únicamente en ciertas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas del tejido). Se apreciará por parte de aquellos capacitados en el arte que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la escogencia de la célula huésped que va a ser transformada, el nivel de expresión de proteína deseada, y similares. Los vectores de expresión como se describe aquí pueden ser introducidos en células huésped para producir así proteínas o péptidos, incluidas las proteínas o péptido de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe aquí (por ejemplo, proteínas CCP, formas mutantes de proteínas CCP, proteínas de fusión, y similares).

Los vectores como los descritos aquí incluyen un marcador seleccionable y/o puntuable. Los genes marcadores seleccionable útiles para la selección de células de plantas transformadas, callos, tejidos de plantas y plantas son bien conocidos por aquellos capacitados en el arte e incluyen, por ejemplo, resistencia a antimetabolitos como la base de selección para dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143 - 149); npt, que confiere resistencia a los aminoglicósidos de neomicina, kanamicina y paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987 - 995) e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481 - 485). Se han descrito genes seleccionables adicionales, a saber trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano; hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad Sci. USA 85 (1988), 8047); mannose-6-fosfato isomerasa que permite que las células utilicen manosa (WO 94/20627) y ODC (ornitina descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, 1987, En: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) o desaminasa de Aspergillus terreus que confiere resistencia a Blasticidin S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336 - 2338).

Los marcadores puntuables útiles son también conocidos por aquellos capacitados en el arte y se encuentran comercialmente disponibles. Convenientemente, el marcador es un gen que codifica luciferasa (Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59 - 72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), proteína fluorescente verde (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44 - 47) o \beta-glucuronidasa (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901 - 3907). Esto es particularmente útil para una selección rápida y simple de células, tejidos y organismos que contienen un vector como el descrito aquí.

Un "promotor de una planta" es un promotor capaz de iniciar la transcripción en células vegetales. Los ejemplos de promotores de la planta incluyen, pero no se limitan a, aquellos que se obtienen a partir de plantas, virus de plantas, y bacterias. Los promotores preferidos pueden contener copias adicionales de uno o más elementos reguladores específicos, para mejorar adicionalmente la expresión y/o para alterar la expresión espacial y/o la expresión temporal de una molécula de ácido nucleico a la cual está operativamente conectada. Por ejemplo, elementos reguladores sensibles al cobre, sensibles a los glucocorticoides o sensibles a dexametasona pueden ser colocados en forma adyacente a una secuencia promotora heteróloga que dirige la expresión de una molécula de ácido nucleico para conferir expresión inducible por cobre, inducible por glucocorticoides, o inducible por dexametasona respectivamente, sobre dicha molécula de ácido nucleico. Los ejemplos de promotores bajo control de desarrollo incluyen promotores que inician preferencialmente la transcripción en ciertos tejidos, tales como hojas, raíces, semillas, endospermo, embriones, fibras, vasos del xilema, traqueidas, o esclerénquima. Tales promotores se denominan como "preferidos del tejido". Los promotores que inician la transcripción únicamente en cierto tejido se denominan como "específicos del tejido". Un promotor específico de un "tipo de célula" dirige la expresión principalmente en ciertos tipos de células en uno o más órganos, por ejemplo, células vasculares en raíces u hojas. Un promotor "inducible" es un promotor que está bajo control ambiental. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden efectuar la transcripción por medio de promotores inducibles incluyen condiciones anaeróbicas o la presencia de luz. Los promotores específicos del tejido, preferidos del tejido, específicos del tipo de célula, y los promotores inducibles constituyen la clase de promotores "no constitutivos". Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo bajo la mayoría de las condiciones ambientales.

La presente especificación también describe células huésped dentro de las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante como el descrito aquí. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se usan en forma intercambiable aquí. Se entiende que tales términos se refieren no solamente a la célula del individuo particular sino a la progenie o a la progenie potencial de tal célula. Debido a que pueden presentarse ciertas modificaciones en sucesivas generaciones ya sea debido a una mutación o a influencias ambientales, tal progenie, en realidad puede no ser idéntica a la célula originaria, sino incluso estar incluida dentro del alcance del término como se lo utiliza aquí.

Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, una proteína CCP puede ser expresada en células de plantas, células bacterianas tales como E. coli, células de insectos, células de levadura o de mamífero (tal como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS). Otras células huésped adecuadas son conocidas por aquellos capacitados en el arte.

Se puede introducir ADN del vector en células procariotas o eucariotas a través de técnicas de transformación convencional o de transfección. Como se los utiliza aquí, los términos "transformación" y "transfección" pretenden referirse a una variedad de técnicas reconocidas en el arte para la introducción de ácido nucleico foráneo (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, incluida coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por dextrano - DEAE, lipofección, o electroporación. Los métodos adecuados para transformación o transfección de células huésped pueden encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), y otros manuales de laboratorio.

Los medios para introducir un vector de expresión recombinante de esta invención en células o en un tejido vegetal incluyen, pero no se limitan a, transformación utilizando CaCl_{2} y variaciones del mismo, en particular el método descrito por Hanahan (J. Mol.Biol. 166, 557 - 560,1983), captación directa de ADN en los protoplastos (Krens et al, Nature 296: 72 - 74, 1982; Paszkowski et al, EMBO J. 3: 2717 - 2722, 1984), captación mediada por PEG a protoplastos (Armstrong et al, Plant Cell Reports 9: 335 - 339, 1990), bombardeo de micropartículas, electroporación (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 5824 - 5828, 1985), microinyección de ADN (Crossway et al., Mol. Gen. Genet. 202: 179 - 185, 1986), bombardeo con micropartículas de explantes de tejido o de células (Christou et al, Plant Physiol 87: 671 - 674, 1988; Sanford, Particulate Science and Technology 5: 27 - 37, 1987), infiltración al vacío de tejido con ácido nucleico, o en al caso de plantas, transferencia mediada por T-ADN de Agrobacterium al tejido de la planta como lo describen esencialmente An et al.(EMBO J 4: 277 - 284, 1985), Herrera-Estrella et al. (Nature 303: 209 - 213,1983a; EMBO J. 2: 987 - 995, 1983b; En: Plant Genetic Engineering, Cambridge University Press, N.Y., páginas 63 - 93, 1985), o el método in planta utilizando Agrobacterium tumefaciens tal como aquel descrito por Bechtold et al., (C.R. Acad. Sci. (Paris, Sciences de la vie/Life Sciences) 316: 1194 - 1199, 1993), Clough et al (Plant J. 16: 735 - 743, 1998), Trieu et al. (Plant J. 22: 531 - 541, 2000) o Kloti (WO01/12828, 2001). Los métodos para transformación de plantas monocotiledóneas son bien conocidos en el arte e incluyen transformación mediada por Agrobacterium (Cheng et al. (1997) WO 97/48814; Hansen (1998) WO 98/54961; Hiei et al. (1994) WO 94/00977; Hiei et al. (1998) WO 98/17813; Rikiishi et al. (1999) WO 99/04618; Saito et al. (1995) WO 95/06722), bombardeo de microproyectiles (Adams et al. (1999) US 5.969.213; Bowen et al. (1998) US 5.736.369; Chang et al. (1994) WO 94/13822; Lundquist et al. (1999) US 5.874.265/US 5.990.390; Vasil and Vasil (1995) US 5.405.765; Walker et al. (1999) US 5.955.362), captación de ADN (Eval et al. (1993) WO 93/181,168), microinyección de células de Agrobacterium (von Holt 1994 DE 4309203), sonicación (Finer et al. (1997) US 5.693.512) e inmersión de flores o transformación in planta (Kloti, WO01/12828,
2001).

El ADN del vector puede incluir además un gen marcador seleccionable para facilitar la identificación y/o la selección de células que son transfectadas o transformadas con una construcción genética. Los genes marcadores seleccionables adecuados contemplados aquí incluyen al gen de resistencia a la ampicilina (Amp^{r}), de resistencia a la tetraciclina Tc^{r}), al gen de resistencia a la kanamicina bacteriana (Kan^{r}), al gen de resistencia a la fosfinotricina, al gen de la neomicina fosfotransferasa (nptII), al gen de resistencia a la higromicina, al gen de la \beta-glucuronidasa (GUS), al gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), al gen de la proteína fluorescente verde (gfp) (Haseloff et al, 1997), y al gen de la luciferasa.

Para el bombardeo con micropartículas de las células, se propulsa una micropartícula dentro de una célula para producir una célula transformada. Cualquier metodología balística adecuada de transformación de las células y aparatos pueden ser utilizados en la realización de la presente divulgación. Los ejemplos de aparatos y procedimientos son divulgados por Stomp et al. (Patente Estadounidense No. 5.122.466) y Sanford y Wolf (Patente Estadounidense No. 4.945.050). Cuando se utilizan procedimientos de transformación balística, la construcción génica puede incorporar un plásmido capaz de replicarse en la célula que va a ser transformada. Los ejemplos de micropartículas adecuadas para uso en tales sistemas incluyen 1 a 5 \mum de esferas de oro. La construcción de AND puede ser depositada sobre la micropartícula por medio de cualquier técnica adecuada, tal como por medio de precipita-
ción.

Se puede regenerar una planta completa a partir de la célula transformada o transfectada, de acuerdo con procedimientos bien conocidos en el arte. El tejido de la planta capaz de una propagación clonal posterior ya sea por medio de organogénesis o de embriogénesis, puede ser transformado con una construcción génica como se describe aquí y regenerar una planta completa a partir de allí. El tejido particular escogido varía dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles para, y más adecuados para, la especie particular que está siendo transformada. Los ejemplos de tejidos objetivo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotiledones, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemo apical, yemas axilares, y meristemos de la raíz), y tejido de meristemo inducido (por ejemplo, meristemo de cotiledón y meristemo de hipo-
cotiledón).

El término "organogénesis", como se lo utiliza aquí, incluye un proceso por medio del cual brotes y raíces se desarrollan en forma secuencial a partir de centros meristemáticos.

El término "embriogénesis", como se lo utiliza aquí, incluye un proceso por medio del cual brotes y raíces se desarrollan al mismo tiempo en una forma concertada (no secuencial), ya sea a partir de células somáticas o de gametos.

Preferiblemente, se produce la planta de acuerdo con los métodos descritos aquí por medio de transfección o transformación de la planta con una secuencia genética, o por medio de la introducción a la planta de una proteína, por cualquier medio reconocido en el estado del arte, tanto como bombardeo de microproyectiles, microinyección, transformación mediada por Agrobacterium (incluida una transformación in planta), fusión de protoplastos, o electroporación, entre otros. Más preferiblemente se produce la planta por medio de transformación mediada por Agrobacterium. La transformación mediada por Agrobacterium o la transformación agrolística de plantas, levaduras, mohos u hongos filamentosos se basa en la transferencia de parte de las secuencias del vector de transformación, llamadas el T-ADN, al núcleo y a la integración de dicho T-ADN en el genoma de dicho eucariota.

El término "Agrobacterium" como se lo utiliza aquí, incluye un miembro de las Agrobacteriaceae, más preferiblemente Agrobacterium o Rhizobacterium y lo más preferible Agrobacterium tumefaciens.

El término "T-ADN", o "ADN transferido", como se lo utiliza aquí, incluye la transformación del vector flanqueado por bordes de T-ADN que es, después de la activación de los genes vir de Agrobacterium, cortado en los bordes del T-ADN y es transferido como una cadena monocatenaria al núcleo de una célula eucariota.

Como se lo utiliza aquí, los términos "bordes de T-ADN", "región del borde del T-ADN", o "región del borde" incluye ya sea los bordes del lado derecho del T-ADN (RB) o los bordes del lado izquierdo del T-ADN (LB), que incluyen una secuencia central flanqueada por una región interna del borde como parte del T-ADN que flanquea el borde y/o una región exterior del borde como parte de la columna vertebral del vector que flanquea el borde. Las secuencias centrales incluyen 22 pb en el caso de vectores del tipo octopina y 25 pb en el caso de vectores del tipo nopalina. Las secuencias centrales en la región del borde derecho y la región del borde izquierdo forman repeticiones imperfectas.

Como se lo utiliza aquí, el término "vector de transformación de T-ADN" o "vector de T-ADN" incluye cualquier vector que abarque una secuencia de T-ADN flanqueada por un borde derecho y un borde izquierdo de T-ADN que consiste de al menos de las secuencias centrales del borde izquierdo y del borde derecho, respectivamente, y es utilizado para la transformación de cualquier célula eucariota.

Como se lo utiliza aquí, el término "secuencia de la columna vertebral del vector de T-ADN " o "secuencias de la columna vertebral del vector de T-ADN" incluye todo el ADN de un vector que contiene T-ADN que se encuentra por fuera de los bordes del T-ADN y, más específicamente, por fuera de los sitios de corte de las repeticiones imperfectas del centro del borde.

La presente especificación describe vectores optimizados de T-ADN de tal manera que la se minimiza o está ausente la integración de la columna vertebral del vector en el genoma de una célula eucariota. El término "vector optimizado de T-ADN " como se lo utiliza aquí incluye un vector de T-ADN diseñado ya sea para disminuir o para eliminar la transferencia de las secuencias de la columna vertebral del vector del genoma de una célula eucariota. Tales vectores de T-ADN son conocidos por una persona capacitada en el arte e incluyen a aquellos descritos por Hanson et al. (1999) y por Stuiver et al. (1999 - WO9901563).

La actual especificación considera claramente la inclusión de una secuencia de ADN codifica una CCP, un homólogo, un análogo, un derivado o un fragmento inmunológicamente activo de los mismos como se define más arriba, en cualquier vector de T-ADN que contiene vectores binarios de transformación, vectores superbinarios de transformación, vectores de transformación cointegrados, vectores de transformación derivados de Ri así como vectores que trasportan T-ADN utilizados en transformación agrolística.

Como se lo utiliza aquí, el término "vector binario de transformación" incluye un vector de transformación de T-ADN que comprende: una región de T-ADN que comprende al menos un gen de interés y/o al menos un marcador activo seleccionable en la célula eucariota que va a ser transformada; y una región de la columna vertebral del vector que comprende al menos orígenes de replicación activos en E. coli y Agrobacterium y marcadores para selección en E. coli y Agrobacterium. Alternativamente, la replicación del vector binario de transformación en Agrobacterium depende de la presencia de un plásmido auxiliar separado. El vector binario pGreen y el plásmido auxiliar pSoup forman un ejemplo de tal sistema (Hellens et al. (2000), Plant Mol. Biol. 42, 819 - 832; http: //www.pgreen.
ac.uk).

Los bordes del T-ADN de un vector binario de transformación pueden derivarse de plásmidos Ti tipo octopina o tipo nopalina o de ambos. El T-ADN de un vector binario es transferido únicamente a una célula eucariota junto con un plásmido auxiliar. Como se lo utiliza aquí, el término "plásmido auxiliar" incluye un plásmido que es mantenido en forma estable en Agrobacterium y transporta al menos el conjunto de los genes vir necesarios para permitir la transferencia del T-ADN. El conjunto de los genes vir puede derivarse ya sea de plásmidos Ti tipo octopina o tipo nopalina o de ambos.

Como se lo utiliza aquí, el término "vector superbinario de transformación" incluye un vector binario de transformación que transporta adicionalmente en la región de la columna vertebral del vector una región vir del plásmido Ti pTiBo542 de la cepa supervirulenta A281 de A. tumefaciens (EP0604662, EP0687730). Los vectores superbinarios de transformación se utilizan en conjunto con un plásmido auxiliar.

Como se lo utiliza aquí, el término "vector cointegrado de transformación" incluye un vector T-ADN que comprende al menos: una región de T-ADNA que comprende al menos un gen de interés y/o al menos un marcador seleccionable activo en plantas; y una región de la columna vertebral del vector que comprende al menos orígenes de replicación activos en Escherichia coli y en Agrobacterium, y marcadores para selección en E. coli y en Agrobacterium, y un conjunto de genes vir necesarios para permitir la transferencia del T-ADN. Los bordes del T-ADN y el conjunto de genes vir del vector de T-ADN puede derivarse ya sea de plásmidos Ti tipo octopina o tipo nopalina o de ambos.

El término "vector de transformación de la planta derivado de Ri" incluye un vector binario de transformación en el cual los bordes del T-ADN se derivan de un plásmido Ti y el vector binario de transformación se utiliza junto con un plásmido Ri "auxiliar" que transporta el conjunto necesario de genes vir.

Los términos "agrolísticos", "transformación agrolística" o "transferencia agrolística" incluyen un método de transformación que combina características de transformación mediadas por Agrobacterium y de suministro biolístico de ADN. Como tal, se suministra conjuntamente un plásmido objetivo que contiene T-ADN con ADN/ARN permitiendo la producción in planta de VirD1 y VirD2 con o sin VirE2 (Hansen y Chilton 1996; Hansen et al. 1997; Hansen y Chilton 1997 - WO9712046.

Una célula huésped de la invención, tal como una célula huésped procariota o eucariota en cultivo, puede ser utilizada para producir (es decir, para expresar) una proteína CCP. Por lo tanto, la especificación describe además métodos para producir una proteína CCP que utiliza células huésped como se describe aquí. En un ejemplo, el método comprende el cultivo de la célula huésped de la invención (dentro de la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica una proteína CCP) en un medio adecuado de tal manera que se produce una proteína CCP. En otro ejemplo, el método incluye además el aislamiento de una proteína CCP del medio o de la célula
huésped.

Las células huésped como se describe aquí pueden ser utilizadas también para producir una planta transgénica o animales transgénicos no humanos en las cuales se han introducido secuencias exógenas de CCP en su genoma o plantas recombinantes homólogas o animales en los cuales se han alterado secuencias endógenas de CCP. Tales plantas y animales son útiles para estudiar la función y/o la actividad de una CCP y para identificar y/o evaluar moduladores de la actividad de CCP.

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Plantas Transgénicas

Como se lo utiliza aquí, "planta transgénica" incluye una planta que contiene dentro de su genoma un polinucleótido heterólogo. Generalmente, el polinucleótido heterólogo está integrado en forma estable dentro del genoma de tal manera que el polinucleótido es pasado a generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede ser integrado dentro del genoma solo o como parte de un casete de expresión recombinante. "Transgénico" se utiliza aquí para incluir cualquier célula, línea celular, callo, tejido, parte de una planta o planta, cuyo genotipo ha sido alterado por la presencia de ácido nucleico heterólogo que incluye aquellos transgénicos inicialmente alterados así como aquellos creados por medio de cruzamientos sexuales como propagación asexual a partir del transgénico inicial. El término "transgénico" como se lo utiliza aquí no incluye la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) por medio de métodos convencionales de fitomejoramiento de plantas o por medio de un evento de ocurrencia natural tal como fertilización cruzada al azar, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no recombinante, o mutación espontánea.

Una planta transgénica como la descrita aquí puede ser creada por medio de la introducción de un ácido nucleico que codifica para CCP dentro de la planta colocándolo bajo el control de elementos reguladores que garantizan la expresión en células vegetales. Estos elementos reguladores pueden ser heterólogos u homólogos con respecto a la molécula de ácido nucleico que va a ser expresada así como con respecto a la especie de planta que va a ser transformada. En general, tales elementos reguladores incluyen un promotor activo en células vegetales. Estos promotores pueden ser utilizados para modular (por ejemplo incrementar o disminuir) el contenido y/o la composición de CCP en un tejido deseado. Para obtener expresión en todos los tejidos de una planta transgénica, se usan preferiblemente promotores constitutivos, tales como el promotor 35 S de CaMV (Odell, Nature 313 (1985), 810 - 812) o promotores de genes tales como la actina el arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163 - 171) histona H3 del maíz (Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet 231: 276 - 285) o promotores de los genes de poliubiquitina de maíz (Christensen, Plant Mol. Biol. 18 (1982), 675 - 689). Con el propósito de lograr expresión en tejidos específicos de una planta transgénica, es posible utilizar promotores específicos del tejido (ver, por ejemplo, Stockhaus, EMBO J. 8 (1989), 2245 - 2251 o la Tabla II, a continuación).

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TABLA II

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TABLA II (continuación)

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TABLA II (continuación)

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Los promotores enlistados en la tabla anterior se suministran únicamente como ejemplo y la presente especificación no está limitada por la lista suministrada allí. Aquellas personas capacitadas en la que están en capacidad de suministrar promotores adicionales que sean útiles en la realización de la presente especificación. Los promotores enlistados también pueden ser modificados para proveer especificidad de expresión según se requiera.

También se conocen promotores que son específicamente activos en tubérculos de patatas o en semillas de diferentes especies de plantas, tales como maíz, Vicia, trigo, cebada y similares. Los promotores inducibles pueden ser utilizados con el propósito de poder controlar exactamente la expresión bajo ciertas condiciones ambientales o de desarrollo tales como patógenos, anaerobios, o luz. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen los promotores de genes que codifican proteínas de choque térmico o elementos reguladores específicos de microesporas (WO96/16182). Además, se pueden emplear sistemas Tet químicamente inducibles (Gatz, Mol. Gen. Genes. 227 (1991); 229 - 237). Otros promotores adecuados son conocidos por las personas capacitadas en el arte y están descritos, por ejemplo, en Ward (Plant Mol. Biol. 22 (1993), 361 - 366). Los elementos reguladores pueden incluir además reforzadores transcripcionales y/o de traducción que operan en células vegetales. Adicionalmente, los elementos reguladores pueden incluir señales de terminación de la transcripción, tales como una señal poli A, que conduce a la adición de una cola de poli A al transcripto lo que puede mejorar su estabilidad.

En el caso de que una molécula de ácido nucleico como la descrita aquí se exprese en la orientación sentido, la secuencia de codificación puede ser modificada de tal manera que la proteína se localice en cualquier compartimiento deseado de la célula vegetal, por ejemplo, el núcleo, el retículo endoplasmático, la vacuola, la mitocondria, los plástidos, el apoplasto, o el citoplasma.

Los métodos para la introducción de ADN foráneo en plantas son también conocidos en el arte. Estos incluyen, por ejemplo, la transformación de células vegetales o de tejidos con T-ADN utilizando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes, la fusión de protoplastos, transferencia génica directa (ver, por ejemplo, EP-A 164 575), inyección, electroporación, métodos biolísticos como el bombardeo de partículas, transformación mediada por polen, transformación mediada por ARN virus de la planta, transformación mediada por liposomas, transformación utilizando embriones inmaduros lesionados o degradados por enzima, o callos embriogénicos lesionados o degradados por enzima y otros métodos conocidos en el arte. Los vectores utilizados en el método como se describe aquí pueden contener elementos funcionales adicionales, por ejemplo secuencias del "borde izquierdo" y del "borde derecho" del T-ADN de Agrobacterium que permite la integración en forma estable dentro del genoma e la planta. Además, la persona capacitada en el arte conoce métodos y vectores que permiten la generación de plantas transgénicas libres de marcador, es decir, el marcador génico puntuable o seleccionable se pierde en una cierta etapa del desarrollo de la planta. Esto se puede lograr, por ejemplo, por cotransformación (Lyznik, Plant Mol. Biol. 13 (1989), 151 - 161; Peg, Plant Mol. Biol. 27 (1995), 91 - 104) y/o por medio del uso de sistemas que utilizan enzimas capaces de promover recombinación homóloga por medio del uso de sistemas que utilizan enzimas capaces de promover recombinación homóloga en plantas (ver, por ejemplo, WO97/08331; Bayley, Plant Mol. Biol. 18 (1992), 353 - 361); Lloyd, Mol. Gen. Genet 242 (1994), 653 - 657; Maeser, Mol. Gen. Genet. 230 (1991), 170 - 176; Onouchi, Nucl. Acids Res. 19 (1991), 6373 - 6378). Los métodos para la preparación de vectores apropiados son descritos, por ejemplo, de Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Las cepas adecuadas de Agrobacterium tumefaciens y los vectores, así como la transformación de Agrobacteria, y el crecimiento apropiado y los medios de selección son descritos, por ejemplo, en GV3101 (pMK90RK), Koncz, Mol. Gen. Genet. 204 (1986), 383 - 396; C58C1 (pGV 3850kan), Deblaere, Nucl. Acid Res. 13 (1985), 4777; Bevan, Nucleic. Acid Res. 12 (1984), 8711; Koncz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 8467 - 8471; Koncz, Plant Mol. Biol. 20 (1992), 963 - 976; Koncz, Specialized vectors for gene tagging and expression studies. En: Plant Molecular Biology Manual Vol 2, Gelvin and Schilperoort (Eds.), Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publ. (1994), 1 - 22; EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1 - 46; An, EMBO J. 4 (1985), 277 - 287). Aunque se prefiere el uso de Agrobacterium tumefaciens en el métrodo descrito aquí, se pueden utilizar otras cepas de Agrobacterium, tales como Agrobacterium rhizogenes, por ejemplo, si se desea un fenotipo conferido por dicha cepa.

Los métodos para la transformación utilizando métodos biolísticos son conocidos por la persona capacitada en el arte; ver, por ejemplo, Wan, Plant Physiol. 104 (1994), 37 - 48; Vasil, Bio/Technology 11 (1993), 1553 - 1558 y Christou (1996) Trends in Plant Science 1, 423 - 431. La microinyección puede ser realizada como se describe en Potrykus y Spangenberg (eds.), Gene Transfer To Plants. Springer Verlag, Berlin, NY (1995).

La transformación de la mayoría de las plantas dicotiledóneas puede ser realizada utilizando los métodos descritos más arriba o utilizando transformación a través de métodos biolísticos, por ejemplo, como se describe más arriba así como transformación de protoplastos, electroporación de células parcialmente permeabilizadas, o introducción de ADN utilizando fibras de vidrio.

En general, las plantas que son modificadas como se describe aquí pueden derivarse de cualquier especie de planta deseada. Ellas pueden ser plantas monocotiledóneas o plantas dicotiledóneas, preferiblemente pertenecientes a especies de plantas de interés en agricultura, cultivos de interés para madera u horticultura, tales como plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, arroz, cebada, trigo, centeno, avena), patatas, plantas productoras de aceite (por ejemplo, colza de semilla oleaginosa, girasol, cacahuete, soja), algodón, remolacha azucarera, caña de azúcar, leguminosas (por ejemplo, frijoles y guisantes), o plantas para la producción de madera, preferiblemente árboles.

La presente especificación también describe una célula de una planta transgénica que contiene (preferiblemente integrada en forma estable en su genoma) una molécula de ácido nucleico como la descrita aquí enlazada a elementos reguladores que permiten la expresión de la molécula de ácido nucleico en células vegetales. La presencia y la expresión de la molécula de ácido nucleico en las células de las plantas transgénicas conduce a la síntesis de una proteína CCP y puede conducir a cambios fisiológicos y fenotípicos en las plantas que contienen tales células.

Las células de plantas transformadas obtenidas por medio de cualquiera de las técnicas de transformación anteriores pueden ser cultivadas para regenerar una planta completa que posea el genotipo transformado. Tales técnicas de regeneración a menudo se basan en la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento para cultivo de tejidos, típicamente se basan en un marcador biocida y/o herbicida que ha sido introducido con un polinucleótido como se describe aquí.

Las células de plantas transformadas con un vector de expresión de planta pueden ser regeneradas, por ejemplo, a partir de células individuales, tejido de callo o discos de hojas de acuerdo con técnicas estándar de cultivo de tejidos de plantas. Es bien sabido en el arte que diferentes células, tejidos, y órganos de casi cualquier planta pueden ser cultivados exitosamente para regenerar una planta completa. La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados es descrita en Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, Macmillilan Publishing Company, New York, pp. 124 - 176 (1983); y en Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, CRC Press, Boca Raton, páginas 21 - 73 (1985).

Las células de plantas transformadas, callos o explantes pueden ser cultivadas en un medio de regeneración en la oscuridad durante varias semanas, generalmente aproximadamente de 1 a 3 semanas para permitir que los embriones somáticos maduren. Los medio de regeneración preferidos incluyen medios que contienen sales MS, tales como medios PHI-E y PHI-F. Las células de plantas, callos o explantes son luego cultivados típicamente en medio de enraizamiento en un ciclo de luz/oscuridad hasta que se desarrollen brotes y raíces. Los métodos para regeneración de plantas son conocidos en el arte y los métodos preferidos son suministrados por Kamo et al., (Bot. Gaz. 146(3): 324 - 334, 1985), West et al., (The Plant Cell 5: 1361 - 1369. 1993), y Duncan et al. (Planta 165: 322 - 332, 1985).

Las plántulas pequeñas pueden ser transferidas luego a tubos que contienen medio de enraizamiento y se permite que crezcan y desarrollen más raíces aproximadamente durante otra semana. Las plantas pueden ser luego trasplantadas a una mezcla de suelo en macetas en el invernadero.

La regeneración de plantas que contienen el gen foráneo introducido por Agrobacterium a partir de explantes de hojas puede ser lograda como lo describen Horsch et al., Science, 227: 1229 - 1231 (1985). En este procedimiento, se cultivan los transformantes en presencia de un agente de selección y en un medio que induce la regeneración de en las especies de plantas que están siendo transformadas como lo describen Fraley et al., Proc. Natl. Acad Sci, U.S.A. 80: 4803 (1983). Este procedimiento produce típicamente brotes en el lapso de dos a cuatro semanas y estos brotes de transformantes son luego transferidos a un medio apropiado que induce raíces que contiene el agente selectivo y un antibiótico para prevenir el crecimiento de bacterias. Las plantas transgénicas descritas aquí pueden ser fértiles o estériles.

La regeneración también puede lograrse a partir de callos de plantas, explantes, órganos, o partes de los mismos. Tales técnicas de regeneración son descritas generalmente en Klee et al., Ann. Rev. of Plant Phys., 38: 467 - 486(1987). La regeneración de plantas ya sea a partir de protoplastos individuales de plantas o de diferentes explantes es bien conocida en el arte. Ver, a partir del ejemplo, Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach and H. Weissback, eds., Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1988). Esta regeneración y proceso de crecimiento incluye las etapas de selección de células y brotes de transformantes, enraizamiento en brotes de transformantes y crecimiento de las plántulas en el suelo. Para el cultivo y regeneración de células de maíz ver generalmente, The Maize Handbook, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994); Corn and Corn Improvement, 3rd edition, Sprague and Dudley Eds., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1988).

Una persona con experiencia en el oficio se dará cuenta que después de que se incorpore en forma estable el casete de expresión recombinante en plantas transgénicas y se confirme que es operativo, puede ser introducido en otras plantas por medio de cruzamiento sexual. Se puede utilizar una cualquiera entre una cantidad de técnicas estándar de fitomejoramiento, dependiendo de las especies que van a ser cruzadas.

En cultivos propagados en forma vegetativa, se pueden propagar plantas transgénicas maduras tomando los esquejes o por medio de técnicas de cultivo de tejidos para producir múltiples plantas idénticas. Se hace la selección de transgénicos deseables y se obtienen y propagan nuevas variedades en forma vegetativa para uso comercial. En cultivos propagados por semillas, las plantas transgénicas maduras pueden ser autocruzadas para producir una planta endogámica homocigota. La planta endogámica produce semilla que contiene al ácido nucleico heterólogo recientemente introducido. Estas semillas pueden ser cultivadas para producir plantas que producirían el fenotipo seleccionado, (por ejemplo, contenido o composición alterada del ciclo celular).

Las partes obtenidas a partir de la planta regenerada, tales como flores, semillas, hojas, ramas, fruto y similares están incluidas en la especificación, con tal de que estas partes contengan células que incluyan el ácido nucleico aislado como se describe aquí. La progenie y la variante, y los mutantes de las plantas regeneradas están también incluidos dentro del alcance de la invención, con tal de que esas partes incluyan las secuencias introducidas de ácido nucleico.

Se pueden seleccionar plantas transgénicas que expresan al marcador seleccionable para transmisión del ácido nucleico como se describe aquí, por ejemplo, por medio de técnicas de inmunotransferencia estándar y técnicas de detección de ADN. Las líneas transgénicas son también típicamente evaluadas sobre los niveles de expresión del ácido nucleico heterólogo. La expresión a nivel del ARN puede ser determinada inicialmente para identificar y cuantificar plantas positivas para la expresión. Se pueden emplear técnicas estándar para análisis del ARN e incluir ensayos de amplificación por PCR utilizando iniciadores oligonucleótidos diseñados para amplificar únicamente los moldes de ARN heterólogo y ensayos de hibridación en solución utilizando sondas específicas de ácido nucleico heterólogo. Las plantas positivas para ARN pueden ser luego analizadas por expresión de la proteína por medio de análisis de transferencias tipo Western utilizando anticuerpos específicamente reactivos como los descritos aquí. Además, puede hacerse una hibridación in situ e inmunocitoquímica de acuerdo con protocolos estándar utilizando ácido nucleico heterólogo, sondas de polinucleótido específico y anticuerpos, respectivamente, para localizar sitios de expresión dentro del tejido transgénico. Generalmente, se seleccionan usualmente una cantidad de líneas transgénicas para el ácido nucleico incorporado para identificar y seleccionar plantas con los perfiles de expresión más apropiados.

También se describe aquí una planta transgénica que es homocigota para el ácido nucleico heterólogo añadido; es decir, una planta transgénica que contiene dos secuencias del ácido nucleico añadido, un gen en el mismo locus sobre cada cromosoma de un par de cromosomas. Una planta transgénica homocigota puede ser obtenida apareando sexualmente (autofecundación) una planta transgénica heterocigoto que contiene un único ácido nucleico heterólogo añadido, germinando alguna de la semilla producida y analizando las plantas producidas por la división celular alterada con relación a una planta de control (es decir, nativa, no transgénica). El retrocruzamiento con una planta progenitora y el cruzamiento con una planta no transgénica también están contemplados.

La presente especificación también describe plantas transgénicas y tejido de plantas que contienen células de plantas transgénicas de acuerdo con la invención. Debido a la (sobre)expresión de una molécula de CCP, por ejemplo, en etapas de desarrollo y/o en tejido de plantas que no se presentan en forma natural, estas plantas transgénicas pueden mostrar diferentes modificaciones fisiológicas, de desarrollo y/o morfológicas en comparación con las plantas de tipo silvestre.

Por lo tanto, parte de esta especificación es el uso de las moléculas de CCP para modular el ciclo celular y/o la división celular de la planta y/o el crecimiento en células de plantas, tejidos de plantas, órganos de la planta y/o plantas completas. La especificación también describe un método para influenciar la actividad de las CDK tales como CDC2a, o CDC2b, las CKS, las CKI, las PLP y las KLPNT en una célula de una planta por medio de la transformación de la célula de la planta con una molécula de ácido nucleico como se describió aquí y/o la manipulación de la expresión de la molécula.

Además, la especificación también describe una célula de una planta transgénica que contiene (preferiblemente integrada en forma estable en su genoma) una molécula de ácido nucleico de la invención o parte de la misma, en donde la transcripción y/o expresión de la molécula de ácido nucleico o parte de la misma conduce a una reducción de la síntesis de una CCP. La reducción puede ser lograda por medio de un efecto mutante dominante y/o de cosupresión, de ribosoma, sentido, sentido-antisentido. La reducción de la síntesis de una proteína como se describe aquí en las células de la planta transgénica puede resultar en una alteración, por ejemplo, en la división celular. En plantas transgénicas que contienen tales células esto puede conducir a varios cambios fisiológicos, de desarrollo y/o morfológicos.

En aún otro aspecto, las partes cosechables y el material para propagación de las plantas transgénicas como se describe aquí que o bien contienen células de plantas transgénicas que expresan una molécula de ácido nucleico como se describe aquí o que contienen células que muestran un nivel reducido de la proteína descrita. Las partes cosechables pueden ser en principio cualquiera de las partes útiles de una planta, por ejemplo, flores, polen, plántulas, tubérculos, hojas, tallos, frutos, semillas, raíces, etc. El material de propagación incluye, por ejemplo, semillas, frutos, esquejes, plántulas, tubérculos, porta injertos, y similares.

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Animales transgénicos

Como se lo utiliza aquí, un "animal transgénico" es un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un roedor tal como una rata o un ratón, en el cual una o más de las células del animal incluyen un transgén. Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, gallinas, anfibios, y similares. Un transgén es ADN exógeno que está integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro, dirigiendo así la expresión de un producto génico codificado en uno o más tipos de células o tejidos del animal transgénico. Como se lo utiliza aquí, un "animal recombinante homólogo" es un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ratón, en el cual un gen endógeno para CCP ha sido alterado por medio de recombinación homóloga entre el gen endógeno y una molécula de ADN exógeno introducida dentro de una célula del animal, por ejemplo, una célula embrionaria del animal, antes del desarrollo del animal.

Un animal transgénico como el descrito aquí puede ser creado por medio de la introducción de un ácido nucleico que codifica CCP en los pronúcleos macho de un oocito fertilizado, por ejemplo, por medio de microinyección, infección retroviral, y permitiendo que el oocito se desarrolle en un animal de crianza hembra pseudopreñado. La secuencia de ADNc para CCP de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239 puede ser introducida como un transgén dentro del genoma de un animal no humano. Alternativamente, un homólogo no humano de un gen humano para CCP, tal como un gen de rata o de ratón para CCP, puede ser utilizado como un transgén. Alternativamente, un homólogo de un gen para CCP, tal como otro miembro de la familia para CCP, puede ser aislado con base en hibridación a las secuencias de ADNc para CCP de la SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239 (descrita además en la subsección I más arriba) y usado como un transgén. Las secuencias intrónicas y las señales de poliadenilación pueden también ser incluidas en el transgén para incrementar la eficiencia de la expresión del transgén. Una(s) secuencia(s) reguladora(s) específica(s) del tejido puede(n) ser operativamente enlazada(s) a un trasgén de CCP para dirigir la expresión de una proteína CCP a células particulares. Los métodos para generar animales transgénicos a través de manipulación de embriones y microinyección, particularmente animales tales como ratones, se han hecho convencionales en el arte y están descritos en, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos. 4.736.866 y 4.870.009, ambas de Leder et al., Patente Estadounidense No. 4.873.191 de Wagner et al., y en Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Se utilizan métodos similares para la producción de otros animales transgénicos. Un animal fundador transgénico puede ser identificado con base en la presencia de un transgén para CCP en su genoma y/o la expresión del ARNm para CCP en tejidos o células de los animales. Un animal fundador transgénico puede ser utilizado entonces para reproducir animales adicionales que transportan el transgén. Además, los animales transgénicos que portan un transgén que codifica una proteína CCP pueden ser reproducidos adicionalmente con otros animales transgénicos que portan otros transgenes.

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V. Composiciones agrícolas, fitofarmacéuticas y farmacéuticas

Las moléculas de ácido nucleico para CCP, las proteínas CCP, y los anticuerpos anti-CCP (también denominados aquí como "compuestos activos") como se describe aquí pueden ser incorporados en composiciones útiles para la agricultura y en el cultivo de células vegetales y tejidos. Las composiciones para protección de las plantas pueden ser preparadas por medios convencionales comúnmente utilizados para la aplicación de, por ejemplo, herbicidas y pesticidas. Por ejemplo, se pueden utilizar ciertos aditivos conocidos por aquellos capacitados en el arte, estabilizadores o sustancias que facilitan la captación por parte de la célula de la planta, el tejido de la planta, o la plata.

Las moléculas de ácido nucleico para CCP, las proteínas CCP, y los anticuerpos anti-CCP (también denominados aquí como "compuestos activos") como se describe aquí pueden ser incorporados también en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración en animales. Tales composiciones contienen típicamente la molécula de ácido nucleico, proteína, o anticuerpo y un portador farmacéuticamente aceptable. Como se lo utiliza aquí, la expresión "portados farmacéuticamente aceptable" tiene por objeto incluir todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antihongos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción, y similares, compatibles con una administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en el arte. Excepto en la medida en que cualquier medio convencional o agente sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones. También se pueden incorporar compuestos suplementarios actives en las composiciones.

Las moléculas de ácido nucleico como se describe aquí pueden ser insertadas en vectores y utilizadas como vectores para terapia génica. Los vectores para terapia génica pueden ser suministrados a una planta o a un individuo, por ejemplo, por medio de inyección, de administración local (ver la Patente Estadounidense No. 5.328.470) o por medio de una inyección estereotáctica (ver, por ejemplo, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad Sci. USA 91: 3054 - 3057). La preparación agrícola o farmacéutica del vector para terapia génica puede incluir al vector para terapia génica en un diluyente aceptable, o puede incluir una matriz de liberación lenta en la cual se embebe en vehículo para suministro del gen. Alternativamente, donde se puede producir el vector para suministro del gen completo en forma intacta a partir de células recombinantes, por ejemplo, los vectores retrovirales, la preparación agrícola o farmacéutica pueden incluir una o más células que producen el sistema para suministro del gen.

Las composiciones agrícolas y farmacéuticas pueden estar incluidas en un contenedor, empaque, o dispensador junto con las instrucciones para su administración.

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VI. Usos y métodos de la invención

Las moléculas de ácido nucleico, proteínas, homólogos de proteína, y anticuerpos descritos aquí pueden ser utilizados en uno o más de los siguientes métodos: a) usos agrícolas (por ejemplo, para incrementar el rendimiento de la planta y para desarrollar compuestos fitofarmacéuticos); b) ensayos de selección; c) medicinas predictivas (por ejemplo, ensayos de diagnóstico, ensayos de pronóstico, ensayos clínicos para monitoreo); d) métodos de tratamiento (por ejemplo, fitoterapéuticos, terapéuticos y profilácticos); e) transcriptómicos; f) proteómicos; g) metabolómicos; h) ligandómicos; y i) farmacogenéticos o farmacogenómicos. Las moléculas asiladas de ácido nucleico como se describe aquí pueden ser utilizadas, por ejemplo, para expresar una proteína CCP (por ejemplo, a través de un vector de expresión recombinante en una célula huésped o en aplicaciones de terapia génica), para detectar ARNm para CCP (por ejemplo, en una muestra biológica) o una alteración genética en un gen para CCP, y para modular la actividad de CCP, como se describe adicionalmente más adelante. Las proteínas CCP pueden ser utilizadas para tratar trastornos caracterizados por una producción insuficiente o excesiva de un sustrato de CCP o producción de inhibidores de CCP. Además, las proteínas CCP pueden ser utilizadas para seleccionar sustratos de CCP de ocurrencia natural, para seleccionar medicamentos o compuestos que modulan la actividad de CCP, así como para tratar trastornos caracterizados por una producción insuficiente o excesiva de proteínas CCP o la producción de formas de la proteínas CCP que tienen una actividad menor o aberrante comparadas con la proteína CCP de tipo silvestre. Además, se pueden utilizar los anticuerpos anti-CCP como se describe aquí para detector y aislar proteínas CCP, regular la biodisponibilidad de las proteínas CCP, y modular la actividad de CCP.

A. Usos agrícolas

La especificación también describe un método para modificar el destino de la célula y/o el desarrollo de la planta y/o la morfología de la planta y/o la bioquímica y/o la fisiología que comprende la modificación de la expresión en células particulares, tejidos u órganos de una planta, de una secuencia genética que codifica una CCP, por ejemplo, una CCP operativamente conectada con una secuencia promotora operable de la planta.

La modulación de la expresión en una planta de una CCP o un homólogo, análogo o derivado de la misma como se define aquí puede producir un rango de fenotipos deseables en las plantas, tales como, por ejemplo, la modificación de una o más características morfológicas, bioquímicas, o fisiológicas incluyendo: (i) la modificación de la longitud de la fase G1 y/o de la fase S y/o la G2 y/o la fase M del ciclo celular de una planta; (ii) la modificación de la transición de la fase G1/S y/o S/G2 y/o G2/M y/o M/G1 de una célula de la planta; (iii) la modificación de la iniciación, promoción, estimulación o refuerzo de la división celular; (iv) la modificación de la iniciación, promoción, estimulación o reforzamiento de la replicación del ADN; (v) la modificación de la iniciación, promoción, estimulación o refuerzo del grupo de semillas y/o del tamaño de las semillas y/o del desarrollo de las semillas; (vi) la modificación de la iniciación, promoción, estimulación o refuerzo de la formación de tubérculos; (vii) la modificación de la iniciación, promoción, estimulación o refuerzo de formación los frutos; (viii) la modificación de la iniciación, promoción, estimulación o refuerzo de la formación de hojas; (ix) la modificación de la iniciación, promoción, estimulación o refuerzo de iniciación y/o el desarrollo de brotes; (x) la modificación de la iniciación, promoción, estimulación o refuerzo de la iniciación y/o el desarrollo de las raíces; (xi) la modificación de la iniciación, promoción, estimulación o refuerzo de la iniciación y/o el desarrollo de raíces laterales; (xii) la modificación de la iniciación, promoción, estimulación o refuerzo de la formación de nódulos y/o de la función de los nódulos; (xiii) la modificación de la iniciación, promoción, estimulación o refuerzo de la tupidez de la planta; (xiv) la modificación de la iniciación, promoción, estimulación o refuerzo del enanismo en la planta; (xv) la modificación de la iniciación, promoción, estimulación o refuerzo de la senectud; (xvi) la modificación de las características de espesor y/resistencia del tallo y/o la resistencia al viento del tallo y/o de lo largo del tallo; (xvii) la modificación de la tolerancia y/o resistencia a estreses bióticos tales como una infección por patógenos; y (xviii) la modificación de la tolerancia y/o de la resistencia a estreses abióticos tales como estrés por sequía o estrés por salinidad.

Los métodos para efectuar la expresión de una CCP o una homóloga, análogo o derivado de la misma como se define en la presente especificación en una célula, tejido u órgano de la planta, incluyen ya sea la introducción de la proteína directamente en una célula, tejido u órgano tal como por medio de microinyección de medios balísticos o, alternativamente, la introducción de una molécula aislada de ácido nucleico que codifica la proteína dentro de la célula, tejido u órgano en un formato expresable. Los métodos para efectuar la expresión de una CCP una homóloga, análogo o derivado de la misma como se define en la actual especificación en plantas completas incluyen la regeneración de plantas completas a partir de las células transformadas en las cuales se introdujo una molécula aislada de ácido nucleico que codifica la proteína en un formato expresable.

La presente especificación se extiende claramente a cualquier planta producida por medio del método descrito aquí, y en todas y cada una de las partes de la planta y propágulos de la misma. La presente especificación se extiende adicionalmente para abarcar la progenie derivada de una célula, tejido, órgano o planta complete transformada o transfectada en forma básica que ha sido producida por medio del método de la invención, siendo el único requisito que la progenie exhiba la(s) misma(s) característica(s) genotípica(s) y/o fenotípica(s) que aquella(s) característica(s) que (han) sido producidas en los padres llevando a cabo el método de la invención.

Por "destino de la célula y/o desarrollo de la planta y/o morfología de la planta y/o bioquímica y/o fisiología" se entiende que una o más características de desarrollo y/o morfológicas y/o bioquímicas y/o fisiológicas de una planta se alteran por medio de la realización de una o más de las etapas relacionadas con la invención descrita aquí. El "destino de la célula" incluye el tipo de célula o las características celulares de una célula particular que son producidas durante el desarrollo de la planta o un proceso celular del mismo, en particular durante el ciclo celular o como consecuencia de un proceso del ciclo celular.

El término "desarrollo de la planta" o el término "característica del desarrollo de la planta" o términos similares deben ser tomados, cuando se los utiliza aquí, para significar cualquier proceso celular de una planta que esté involucrado en la determinación del destino del desarrollo de una célula de la planta, en particular, el tejido específico o el tipo de órgano dentro del cual se desarrollará una célula progenitora. Los procesos celulares relevantes para el desarrollo de la planta serán conocidos por aquellas personas capacitadas en el arte. Tales procesos incluyen, por ejemplo, morfogénesis, fotomorfogésis, desarrollo de brotes, desarrollo de la raíz, desarrollo vegetativo, desarrollo vegetativo, alargamiento del tallo, floración, y mecanismos reguladores involucrados en la determinación del destino de la célula, en particular un proceso o un proceso regulador que involucra al ciclo celular.

El término "morfología de la planta" o el término "característica morfológica de la planta" o un término similar, cuando se lo utiliza aquí, se entenderá por aquellas personas capacitadas en el arte que incluye la apariencia externa de una planta, incluida una o más características estructurales o de combinación de rasgos estructurales de la mismas. Tales características estructurales incluyen la forma, el tamaño, la cantidad, la posición, el color, la textura, la disposición, y el patronamiento de cualquier célula, tejido u órgano o grupos de células, tejidos u órganos de una planta, incluida la raíz, el tallo, las hojas, los brotes, el pecíolo, el tricoma, las flores, los pétalos, el estigma, el estilo, el estamen, el polen, los óvulos, las semillas, los embriones, el endospermo, el recubrimiento de las semillas, la aleurona, la fibra, los frutos, el cambium, la madera, el duramen, el parénquima, el aerénquima, el elemento de criba, el floema o el tejido vascular.

El término "bioquímica de la planta" o el término "característica bioquímica de la planta" un término similar, cuando se lo utiliza aquí, se entenderá por aquellas personas capacitadas en el arte que incluye los procesos metabólicos y catalíticos de una planta, incluido el metabolismo primario y secundario y los productos del mismo, incluyendo cualquiera de las moléculas pequeñas, macromoléculas o compuestos químicos, tales como, pero sin limitarse a, almidones, azúcares, proteínas, péptidos, enzimas, hormonas, factores de crecimiento, moléculas de ácido nucleico, celulosas, hemicelulosas, callos, lectinas, fibras, pigmentos tales como antocianinas, vitaminas, minerales, micronutrientes, o macronutrientes que sean producidos por la plantas.

El término "fisiología de la planta" o el término "característica fisiológica de la planta" o un término similar, cuando se lo utiliza aquí, se entenderá que incluye el proceso funcional de una planta, incluidos los procesos de desarrollo tales como crecimiento, expansión y diferenciación, desarrollo sexual, reproducción sexual, grupo de semillas, desarrollo de las semillas, el llenado del grano, reproducción asexual, división celular, inactividad, germinación, adaptación a la luz, fotosíntesis, expansión de la hoja, producción de fibra, crecimiento secundario o producción de madera, entre otros; respuestas de una planta a factores aplicados externamente tales como metales, químicos, hormonas, factores de crecimiento, factores de estrés ambientales y del medio ambiente (por ejemplo, anoxia, hipoxia, alta temperatura, baja temperatura, deshidratación, luz, duración del día, inundaciones, sal, metales pesados, entre otros), incluidas respuestas adaptativas de plantas a dichos factores aplicados externamente.

Las moléculas de CCP como se describe aquí son útiles en agricultura. Las moléculas de ácido nucleico, proteínas, homólogos de proteína, y anticuerpos descritos aquí pueden ser utilizados para modular los niveles de proteína o actividad de una proteína involucrada en el ciclo celular, por ejemplo, proteínas involucradas en la transición G1/S y/o la transición G2/M en el ciclo celular debido a condiciones ambientales, incluido estrés abiótico tal como frío, privación de nutrientes, estrés por calor, sequía, salinidad, o estrés biótico tal como un ataque de patógenos.

Por lo tanto, las moléculas de CCP como las descritas aquí pueden ser utilizadas para modular, por ejemplo, mejorar, los rendimientos de los cultivos; modular, por ejemplo, atenuar, el estrés, por ejemplo por calor o privación de nutrientes; modular la tolerancia a las plagas y a las enfermedades; modular la arquitectura de la planta; modular los rasgos cualitativos de la planta; o modular la reproducción de la planta y el desarrollo de semilla.

Las moléculas de CCP como las descritas aquí pueden ser utilizadas para modular la endorreduplicación en células de almacenamiento, tejidos de almacenamiento, y/o órganos de almacenamiento de plantas o partes de las mismas. El término "endorreduplicación" incluye replicación recurrente de ADN sin la consecuente mitosis y citoquinesis. Los órganos y partes de almacenamiento objetivo preferidas de los mismos para la modulación de endorreduplicación son, por ejemplo, semillas (tales como de cereales, cultivos de semillas oleaginosas), raíces (tal como en la remolacha azucarera), tubérculos (tal como en patatas) y frutos (tal como en especies vegetales y frutales). La mayor endorreduplicación en órganos de almacenamiento, y partes de los mismos, se correlaciona con mayor capacidad de almacenamiento y, por lo tanto, con mayor rendimiento. En otra modalidad de la invención, se modula la endorreduplicación de una planta completa.

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B. Ensayos de selección

La especificación describe un método (también denominado aquí como "ensayo de selección") para identificación de moduladores, es decir, compuestos o agentes candidatos o de prueba (por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas u otros fármacos) que se enlazan a proteínas CCP, tienen un efecto estimulador o inhibidor, por ejemplo, sobre la expresión de CCP o la actividad de CCP, o tienen un efecto estimulador o inhibidor, por ejemplo, sobre la expresión o actividad de un sustrato de CCP.

La especificación también describe ensayos para selección de compuestos candidatos o de prueba que son sustratos de una proteína o polipéptido CCP o una porción biológicamente activa de la misma. La especificación también describe ensayos para selección de compuestos candidatos o de prueba que se enlazan a o modulan la actividad de una proteína o polipéptido CCP o una porción biológicamente activa de la misma, por ejemplo, modulan la habilidad de CCP para interactuar con su ligando cognato. Los compuestos de prueba como se describe aquí pueden ser obtenidos utilizando cualquiera de los numerosos enfoques en métodos de biblioteca combinatorial conocidos en el arte, incluyendo: bibliotecas biológicas; fase sólida paralela espacialmente dirigible o bibliotecas en fase de solución; métodos de bibliotecas sintéticas que requieren de deconvolución; el método de biblioteca "un compuesto, una cuenta"; y métodos de bibliotecas sintéticas utilizando selección por cromatografía de afinidad. El enfoque de biblioteca biológica está limitada a bibliotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a péptidos, oligómeros no peptídicos o bibliotecas de moléculas pequeñas de compuestos (Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145).

Los ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares pueden encontrarse en el arte, por ejemplo en: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; y en Gallop et al. (1994) J. Med Chem. 37: 1233.

Las bibliotecas de compuestos pueden ser presentadas en solución (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13: 412 - 421), o sobre cuentas (Lam (1991) Nature 354: 82 - 84), chips (Fodor (1993) Nature 364: 555 - 556), bacterias (Ladner USP 5.223.409), esporas (Ladner USP'409), plásmidos (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865 - 1869) o sobre fagos (Scott y Smith (1990) Science 249: 386 - 390); (Devlin (1990) Science 249: 404 - 406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad Sci. 87: 6378 - 6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301 - 310); (Ladner
supra.).

La especificación también describe un ensayo con base en la célula que comprende poner en contacto una célula que expresa una molécula objetivo CCP (por ejemplo, una quinasa que depende de la ciclina de la planta) con un compuesto de prueba y determinar la habilidad del compuesto para modular (por ejemplo estimular o inhibir) la actividad de la molécula objetivo CCP. La determinación de la habilidad del compuesto de prueba para modular la actividad d una molécula objetivo CCP puede logarse, por ejemplo, determinando la habilidad de la proteína CCP para enlazarse o interactuar con la molécula objetivo CCP, o determinando la habilidad de la molécula objetivo, por ejemplo, la quinasa que depende de la ciclina, para fosforilar una proteína.

La habilidad de la molécula objetivo, por ejemplo, la quinasa que depende de la ciclina de la planta, para fosforilar una proteína se puede determinar, por ejemplo, por medio de un ensayo de quinasa in vitro. En resumen, una proteína puede ser incubada con la molécula objetivo, por ejemplo, la quinasa que depende de la ciclina de la planta, y ATP radioactiva, por ejemplo, [\gamma-^{32}P] ATP, en un amortiguador que contiene MgCl_{2} y MnCl_{2}, por ejemplo, MgCl_{2} 10 mM y MnCl_{2} 5 mM. Después de la incubación, se puede separar la proteína inmunoprecipitada por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida SDS bajo condiciones reductoras, se la transfiere a una membrana, por ejemplo, un membrana PVDF, y se la somete a autorradiografía. La apariencia de bandas detectables sobre la autorradiografía indica que la proteína ha sido fosforilada. El análisis de fosfoaminoácidos del sustrato fosforilado puede ser realizado también con el propósito de determinar qué residuos sobre la proteína están fosforilados. En resumen, la banda de la proteína radiofosforilada puede ser cortada del gel de SDS y sometida a hidrólisis ácida parcial. Los productos pueden ser luego separados por medio de electroforesis unidimensional y analizados, por ejemplo, en un Phosphoimager y comparados con estándares de fosfoaminoácido coloreados con ninhidrina.

La determinación de la habilidad de la proteína CCP para enlazarse o interactuar con una molécula objetivo CCP se puede lograr determinando el enlazamiento directo. La determinación de la habilidad de la proteína CCP para enlazarse o interactuar con una molécula objetivo CCP se puede lograr, por ejemplo, acoplando la proteína CCP con un radioisótopo o marcador enzimático de tal manera que el enlazamiento de la proteína CCP con una molécula objetivo CCP se puede determinar por medio de la detección de la proteína CCP marcada en un complejo. Por ejemplo, las moléculas de CCP, por ejemplo, proteínas CCP, pueden ser marcadas con ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C, o ^{3}H, ya sea directa o indirectamente, y se detecta el radioisótopo por medio de recuento directo de radioemisión o por recuento del centelleo. Alternativamente, las moléculas de CCP pueden ser marcadas enzimáticamente, por ejemplo, con peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, o luciferasa, y se detecta la etiqueta enzimática por medio de la determinación de la conversión de un sustrato apropiado al producto.

También se encuentra dentro de la descripción de esta especificación determinar la habilidad de un compuesto para modular la interacción entre CCP y su molécula objetivo, sin la marcación de alguno de los interactuantes. Por ejemplo, se puede utilizar un microfisiómetro para detectar la interacción de CCP con su molécula objetivo sin la marcación ya sea de CCP o de la molécula objetivo. McConnell, H. M. et al. (1992) Science 257: 1906 - 1912. Como se lo utiliza aquí, un "microfisiómetro" (por ejemplo, Cytosensor) es un instrumento analítico que mide la velocidad a la cual una célula acidifica su ambiente utilizando un sensor potenciométrico de luz direccionable (LAPS). Los cambios en la velocidad de esta acidificación pueden ser utilizados como un indicador de la interacción entre el compuesto y el receptor.

La determinación de la habilidad de la proteína CCP para enlazarse o interactuar con una molécula objetivo CCP se puede lograr por medio de la determinación de la actividad de la molécula objetivo. Por ejemplo, la actividad de la molécula objetivo se puede determinar por medio de la detección de la inducción de un segundo mensajero celular del objetivo (por ejemplo, Ca^{2+} intracelular, diacilglicerol, IP3, etc.), detectando la actividad catalítica/enzimática del objetivo en un sustrato apropiado, detectando la inducción de un gen reportero (que comprende un elemento regulador sensible al objetivo operativamente enlazado a un ácido nucleico que codifica un marcador detectable, por ejemplo, cloranfenicol acetil transferasa), o detectando una respuesta celular regulada por el objetivo.

Un ensayo como el descrito aquí puede ser un ensayo libre de células en el cual una proteína CCP o una porción biológicamente activa de la misma es puesta en contacto con un compuesto de prueba y se determina de esta manera la habilidad del compuesto de prueba para enlazarse con la proteína CCP o una porción biológicamente activa de la misma. El enlazamiento del compuesto de prueba con la proteína CCP se puede determinar ya se directa o indirectamente como se describió anteriormente. Preferiblemente, el ensayo incluye poner en contacto la proteína CCP o una porción biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se enlaza con CCP para formar una mezcla de prueba, poniendo en contacto la mezcla de prueba con un compuesto de prueba, y determinando la habilidad del compuesto de prueba para interactuar con una proteína CCP, en donde la determinación de la habilidad del compuesto de prueba para interactuar con una proteína CCP comprende la determinación de la habilidad del compuesto de prueba para enlazarse preferencialmente con CCP o con una porción biológicamente activa de la misma comparado con el compuesto conocido.

El ensayo puede ser un ensayo libre de células en el cual una proteína CCP o una porción biológicamente active de la misma es puesta en contacto con un compuesto de prueba y se determina la habilidad del compuesto de prueba para modular (por ejemplo, para estimular o inhibir) la actividad de la proteína CCP o una porción biológicamente activa de la misma. La determinación de la habilidad del compuesto de prueba para modular la actividad de una proteína CCP se puede lograr, por ejemplo, determinando la habilidad de la proteína CCP para enlazarse con una molécula objetico CCP por medio de uno de los métodos descritos anteriormente para determinar el enlazamiento directo. La determinación de la habilidad de la proteína CCP para enlazarse con una molécula objetivo CCP se puede lograr también utilizando una tecnología tal como el Análisis de Interacción Biomolecular (BIA) en tiempo real. Sjolander, S. y Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63: 2338 - 2345 y Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699 - 705. Como se lo utiliza aquí, "BIA" es una tecnología para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar a ninguno de los interactuantes (por ejemplo, BIAcore). Los cambios en el fenómeno óptico de resonancia del plasmón superficial (SPR) pueden ser utilizados como una indicación de las reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.

La determinación de la habilidad del compuesto de prueba para modular la actividad de una proteína CCP se puede lograr determinando la actividad de la proteína CCP para modular adicionalmente la actividad de una molécula objetivo CCP (por ejemplo, un componente de la ruta de transducción de la señal mediado por CCP). Por ejemplo, se puede determinar la actividad de la molécula efectora sobre un objetivo apropiado, o se puede determinar el enlace del efector con un objetivo apropiado como se describió previamente.

El ensayo libre de células pude involucrar poner en contacto una proteína CCP o una porción biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que enlaza la proteína CCP para formar una mezcla para ensayo, poniendo en contacto la mezcla para ensayo con un compuesto de prueba, y determinando la habilidad del compuesto de prueba para interactuar con la proteína CCP, en donde la determinación de la habilidad del compuesto de prueba para interactuar con la proteína CCP comprende la determinación de la habilidad de la proteína CCP para enlazarse preferencialmente con, o para modular la actividad de una molécula objetivo CCP.

Los ensayos libres de células como se describe aquí son susceptibles de utilizar ya sea formas enlazadas a la membrana y/o solubles de proteínas (por ejemplo, proteínas CCP o porciones biológicamente activas de la misma). En el caso de ensayos libres de células en los cuales se utiliza una forma enlazada a una membrana de una proteína puede ser deseable utilizar un agente de solubilización de tal manera que la forma enlazada a la membrana de la proteína se mantiene en solución. Los ejemplos de tales agentes de solubilización incluyen detergentes no iónicos tales como noctilglucosida, n-dodecilglucosida, n-dodecilmaltosida, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, Triton® X-100, Triton® X-114, Thesit®, Isotridecipoli(éter de etilén glicol)_{n}, sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilaminio]-1-propano (CHAPS), sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilaminio]-2-hidroxi-1-propano (CHAPSO), o sulfonato de N-dodecil=N,N-dimetil-3-amonio-1-propano.

En los métodos de ensayo anteriores como los descritos aquí, puede ser deseable inmovilizar ya sea CCP o su molécula objetivo para facilitar la separación de las formas que formaron complejo de las que no formaron complejo de una o ambas proteínas, así como para dar cabida a la automatización del ensayo. El enlazamiento de un compuesto de prueba con una proteína CCP, o la interacción de una proteína CCP con una molécula objetivo en presencia y en ausencia de un compuesto candidato, se puede lograr en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Los ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo y, tubos de microcentrífuga. Se puede suministrar una proteína de fusión que añada un dominio que permita que una o ambas de las proteínas se enlacen a la matriz. Por ejemplo, las proteínas de fusión de glutationa-S-transferasa/CCP o proteínas de fusión de glutationa-S-transferasa/objetivo pueden ser absorbidas sobre cuentas de glutationa Sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación que forman derivados de glutationa, que son luego combinadas con el compuesto de prueba o el compuesto de prueba y o bien la proteína objetivo adsorbida o la proteína CCP, y se incuba la muestra bajo condiciones propicias para la formación del complejo (por ejemplo, en condiciones fisiológicas de salinidad y pH). Después de la incubación, se lavan las cuentas o los pozos de la placa de microtitulación para remover cualquiera de los componentes no enlazados, se inmoviliza la matriz en el caso de las cuentas, se determina los complejos directa o indirectamente, por ejemplo como se describió anteriormente. Alternativamente, se pueden disociar los complejos de la matriz, y determinar el nivel de enlazamiento o actividad de CCP utilizando técnicas
estándar.

Otras técnicas para la inmovilización de proteínas sobre matrices pueden ser utilizadas también en el ensayo de selección como se describe aquí. Por ejemplo, se puede inmovilizar ya sea una proteína CCP o una molécula objetivo CCP utilizando conjugación de biotina y estreptavidina. Se pueden preparar moléculas objetivo o proteína CCP biotiniladas a partir de biotina-NHS (N-hidroxisuccinimida) utilizando técnicas conocidas en el arte (por ejemplo, un kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL), e inmovilizarlas en los pozos de las placas de 96 pozos recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, los anticuerpos que reaccionan con proteínas CCP o con moléculas objetivo pero que no interfieren con el enlazamiento de la proteína CCP con su molécula objetivo pueden derivarse con los pozos de las placas, y la proteína CCP u objetivo no enlazadas atrapadas en los pozos por conjugación con el anticuerpo. Los métodos para detector tales complejos, además de aquellos descritos anteriormente para los complejos inmovilizados de GST, incluyen inmunodetección de complejos utilizando anticuerpos que reaccionan con la proteína CCP o una molécula objetivo, así como ensayos que se basan en la detección de una actividad enzimática asociada con la proteína CCP o una molécula objetivo.

Los moduladores de la expresión de CCP pueden ser identificados en un método en donde se pone en contacto una célula con un compuesto candidato y se determina la expresión del ARNm para CCP o de la proteína en la célula. Se compara el nivel de expresión del ARNm para CCP o de la proteína en presencia del compuesto candidato con el nivel de expresión del ARNm para CCP o de la proteína en ausencia del compuesto candidato. Se puede identificar luego el compuesto candidato como un modulador de la expresión de CCP con base en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión del ARNm para CCP o de la proteína es mayor (significativamente mayor estadísticamente) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, se identifica el compuesto candidato como un estimulador de la expresión del ARNm para CCP o de la proteína. Alternativamente, cuando la expresión del ARNm para CCP o de la proteína es menor (significativamente menor estadísticamente) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, se identifica al compuesto candidato como un inhibidor de la expresión del ARNm para CCP o de la proteína. El nivel de expresión del ARNm para CCP o de la proteína en las células se puede determinar por medio de los métodos descritos aquí para la detección del ARNm para CCP o de la proteína.

La especificación también describe que las proteínas CCP pueden ser utilizadas como "proteínas cebo" en un ensayo de doble híbrido o en un ensayo de triple híbrido (ver, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72: 223 - 232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12046 - 12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920 - 924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693 - 1696; y Brent WO94/10300), para identificar otros proteínas, que se enlazan o interactúan con CCP ("proteínas para enlazamiento de CCP" o "CCP-pb") y están involucradas en la actividad de CCP. Tales proteínas para enlazamiento de CCP también están probablemente involucradas en la propagación de señales por parte de las proteínas CCP o de objetivos de CCP, por ejemplo, como elementos secuencia debajo de una ruta de señalización mediada por CCP. Alternativamente, tales proteínas para enlazamiento de CCP es probable que sean inhibidoras de CCP. Alternativamente, se puede utilizar un sistema de híbrido doble de mamífero que incluye por ejemplo un gen reportero que codifica una proteína verde quimérica (Shioda et al. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5520 - 5224). Aún otra alternativa consiste de un sistema de doble híbrido bacteriano utilizando por ejemplo HIS como gen reportero (Joung et al. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7382 - 7387).

El sistema de doble híbrido se basa en la naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción, que consiste de dominios separables de activación y de enlazamiento de ADN. En resumen, el ensayo utiliza dos diferentes construcciones de ADN. En una construcción, el gen que codifica para una proteína CCP está fusionado a un gen que codifica el dominio de enlazamiento de ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En la otra construcción, una secuencia de ADN, de una biblioteca de secuencias de ADN, que codifica una proteína no identificada ("presa" o "muestra") está fusionada a un gen que codifica al dominio de activación del factor de transcripción conocido. Si las proteínas "cebo" y "presa" son capaces de interactuar, in vivo, formando un complejo que depende de CCP, los dominios de activación y de enlazamiento de ADN del factor de transcripción son colocados en forma muy cercana. Esta proximidad permite la transcripción de un gen reportero (por ejemplo, LacZ) que está operativamente enlazado a un sitio regulador de la transcripción al factor de transcripción. La Expresión del gen reportero puede ser detectada y las colonias de células que contienen al factor de transcripción funcional pueden ser aisladas y utilizadas para obtener el gen clonado que codifica la proteína que interactúa con la proteína
CCP.

La especificación también describe nuevos agentes identificados por medio de los ensayos de selección descritos anteriormente. Por lo tanto, dentro de la descripción de esta especificación está el uso adicional de un agente identificado como se describe aquí en una planta apropiada o en un modelo animal. Por ejemplo, un agente identificado como se describe aquí (por ejemplo, un agente de modulación de CCP, una molécula de ácido nucleico para CCP antisentido, un anticuerpo específico para CCP, o un compañero de enlazamiento de CCP) pueden ser utilizados en una planta o en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad, o efectos secundarios del tratamiento con tal agente. Alternativamente, un agente identificado como el descrito aquí puede ser utilizado en una planta o en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de tal agente. La especificación también describe los usos de nuevos agentes identificados por medio de los ensayos de selección descritos anteriormente para usos agrícolas y terapéuticos descritos aquí.

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C. Ensayos de detección

Las porciones o los fragmentos de las secuencias de ADNc identificadas aquí (y las correspondientes secuencias completas de genes) pueden ser utilizados en numerosas formas como reactivos polinucleótidos. Por ejemplo, estas secuencias pueden ser utilizadas para: mapear sus genes respectivos sobre un cromosoma; y, por lo tanto localizar regiones de genes asociadas con una enfermedad genética; identificar un individuo a partir de una muestra biológica diminuta (tipificación tisular); y ayuda en identificación forense de una muestra biológica. Una vez que ha sido aislada la secuencia (o una porción de la secuencia) de un gen, se puede utilizar esta secuencia para mapear la localización del gen sobre un cromosoma. Este proceso es llamado mapeo del cromosoma. Por lo tanto, se pueden utilizar las porciones o fragmentos de las secuencias de nucleótidos para CCP, descritos aquí, para mapear la localización de los genes para CCP sobre un cromosoma. El mapeo de las secuencias para CCP en cromosomas es una primera etapa importante en la correlación de estas secuencias con los genes asociados con una enferme-
dad.

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En resumen, se pueden mapear los genes para CCP en cromosomas por medio de la preparación de iniciadores para PCR (preferiblemente de 15 - 25 pb de longitud) a partir de las secuencia de nucleótidos para CCP. En análisis por ordenador de las secuencias para CCP puede ser utilizado para predecir iniciadores que no abarquen más de un exón en el ADN genómico, complicando de esta manera el proceso de amplificación. Estos iniciadores pueden ser utilizados luego para selección por PCR de híbridos celulares que contienen cromosomas individuales de plantas o de humanos. Únicamente aquellos híbridos que contienen el gen humano o de la planta correspondiente a las secuencias para CCP producirá u fragmento amplificado.

Otras estrategias de mapeo que pueden ser utilizadas en forma similar para mapear una secuencia se CCP en su cromosoma incluyen hibridación in situ (descrita en Fan, Y. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6223 - 27), preselección con cromosomas etiquetados de flujo ordenado, y preselección por hibridación en bibliotecas de ADNc específicas del cromosoma.

La hibridación fluorescente in situ (FISH) de una secuencia de ADN para una propagación cromosómica de la metafase puede ser utilizada adicionalmente para proveer una localización cromosómica precisa en una etapa. La propagación del cromosoma se puede hacer utilizando células cuya división ha sido bloqueada en la metafase por un compuesto químico tal como colcemida que interrumpe el huso mitótico. Los cromosomas pueden ser tratados brevemente con tripsina, y luego coloreados con Giemsa. Un patrón de bandas de luz y oscuridad se desarrolla sobre cada cromosoma, de manera que los cromosomas pueden ser identificados en forma individual. La técnica FISH puede ser utilizada con una secuencia de ADN tan cortas como 500 ó 600 bases. Sin embargo, los clones mayores a 1.000 bases tienen una mayor probabilidad de enlazamiento con una localización cromosómica única con intensidad de señal suficiente para detección simple. Preferiblemente 1.000 bases, y más preferiblemente 2.000 bases serán suficientes para obtener buenos resultados en una cantidad razonable de tiempo. Para una revisión de esta técnica, ver Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, New York
1988).

Se pueden utilizar reactivos para mapeo de cromosomas en forma individual para marcar un cromosoma individual o un solo sitio sobre ese cromosoma, o se pueden utilizar paneles de reactivos para marcar múltiples sitios y/o múltiples cromosomas. Los reactivos correspondientes a regiones no codificadoras de los genes realmente son los preferidos para propósitos de mapeo. Las secuencias de codificación son más probablemente conservadas dentro de familias de genes, incrementando así la probabilidad de hibridaciones cruzadas durante el mapeo cromo-
sómico.

Una vez ha sido mapeada una secuencia en una ubicación cromosómica precisa, se puede correlacionar la posición física de la secuencia sobre el cromosoma con datos del mapa genético. (Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, disponible en línea a través de la Johns Hopkins University Welch Medical Library). La relación entre un gen y una enfermedad, mapeada en la misma región cromosómica, puede ser luego identificada a través de análisis de enlazamiento (co-herencia de genes físicamente adyacentes), descrito, por ejemplo, en Egeland, J. et al. (1987) Nature, 325: 783 - 787.

Además, se pueden determinar las diferencias en las secuencias de ADN entre plantas afectadas y no afectadas con una enfermedad asociada con el gen para CCP. Si se observa una mutación en algunas o en todas las plantas afectadas pero no en algunas de las plantas no afectadas, entonces probablemente la mutación sea el agente causante de la enfermedad particular. La comparación de las plantas afectadas y no afectadas generalmente involucra primero buscar alteraciones estructurales en los cromosomas, tales como supresiones o translocaciones que sean visibles a partir de propagaciones del cromosoma o detectables utilizando PCR con base en esa secuencia de ADN. Por último, se puede llevar a cabo la secuenciación complete de los genes de diferentes plantas para confirmar la presencia de una mutación y para distinguir mutaciones de polimorfismos.

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D. Medicina predictiva

La presente especificación también se relaciona con el campo de la medicina predictiva en la cual se utilizan ensayos de diagnóstico, ensayos de pronóstico, y ensayos clínicos de monitoreo para propósitos de pronóstico (predicción) para tratar así a un individuo en forma profiláctica. Por lo tanto, la especificación también describe ensayos de diagnóstico para determinar la expresión de proteína CCP y/o ácido nucleico así como la actividad de la CCP, en el contexto de una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, células, tejido) para determinar así si un individuo está afectado con una enfermedad o trastorno, o está en riesgo de desarrollar un trastorno, asociado con expresión o actividad aberrante de CCP. La especificación también describe ensayos de pronóstico (o predictivo) para determinar si un individuo está en riegos de desarrollar un trastorno asociado con proteína CCP, la expresión o actividad de ácido nucleico. Por ejemplo, se pueden ensayar mutaciones en un gen para CCP en una muestra biológica. Tales ensayos pueden ser utilizados para propósitos de pronóstico o predictivos para tratar así en forma profiláctica a un individuo antes del inicio de un trastorno caracterizado por o asociado con una proteína CCP, la expresión o actividad de ácido nucleico.

La especificación también describe el monitoreo de la influencia de agentes (por ejemplo, fármacos, compuestos) sobre la expresión o la actividad de CCP en ensayos clínicos.

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E. Métodos de tratamiento

La presente especificación también describe tanto métodos profilácticos como terapéuticos para tratar a un individuo en riesgo de (o susceptible a) un trastorno o que tiene un trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante de CCP. Con respecto tanto a los métodos profilácticos como terapéuticos de tratamiento, tales tratamientos pueden ser específicamente confeccionados o modificados, con base en el conocimiento obtenido a partir del campo de los farmacogenómicos. "Farmacogenómicos", como se lo utiliza aquí, se refiere a la aplicación de tecnologías genómicas tales como la secuenciación de genes, genética estadística, y análisis de expresión génica a fármacos en el desarrollo clínico y en el mercado. Más específicamente, el término se refiere al estudio de cómo los genes de un paciente determinan su respuesta a un fármaco (por ejemplo, un "fenotipo de respuesta a un fármaco" de un paciente, o un "genotipo de respuesta a un fármaco"). Por lo tanto, la especificación también describe métodos para confeccionar un tratamiento terapéutico o profiláctico de un individuo ya sea con las moléculas de CCP como se describe aquí o los moduladores de CCP de acuerdo con ese genotipo de respuesta a un fármaco del individuo. Los farmacogenómicos le permiten a un especialista clínico o médico dirigir los tratamientos profilácticos o terapéuticos a pacientes que se beneficiarán más del tratamiento y evitar el tratamiento de pacientes que experimentarán efectos secundarios relacionados con toxicidad.

Esta invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos que no deben considerarse como limitantes.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Identificación de polipétidos CCP de la planta utilizando el sistema de doble híbrido con CDC2b como cebo

Se llevó a cabo una selección de doble híbrido utilizando como cebo una fusión entre el dominio de enlazamiento de ADN GAL4 y uno de los siguientes: CDC2bAt.N161 (número de acceso del GenBank D10851; residuo Asp161 convertido en Asn161); CKS1At (número de acceso del GenBank AJ000016); E2Fa (= E2F5) (número de acceso del GenBank AJ294534) dominio de dimerización (226 - 356 aa; SEQ ID NO: 205); CKI4 (SEQ ID NO: 264); PLP1 (número de acceso del GenBank T01601); KLPNT1 (número de acceso del GenBank AB011479; número de ID de la proteína BAB 11568) dominio motor (36 - 508 aa); KLPNT1 (número de acceso del GenBank AB011479; número de ID de la proteína BAB11568) dominio de tallo (427 - 867 aa); KLPNT2 = TH65 (número de acceso del GenBank AJ001729) dominio de cuello (3 - 186 aa); KLPNT2 = TH65 (número de acceso del GenBank AJ001729) dominio de tallo (73 - 608 aa); E2Fb (= E2F3) (número de acceso del GenBank AJ294533) dominio N-terminal (1 - 385 aa; SEQ ID NO: 206), respectivamente.

CDC2bAt.N161 es una forma negativa dominante de la proteína CDC2bAt. El residuo D161 en CDC2bAt es crucial para el enlazamiento de ATP y, por lo tanto, la mutación de este residuo resulta en una quinasa inactiva. Las interacciones entre esta CDK mutada y sus sustratos y proteínas reguladoras están también más estabilizadas como resultado de esta mutación.

En levadura los genes PHO son parte de una red reguladora compleja que enlaza la disponibilidad del sulfato con la expresión de fosfatasas. Cuando los niveles de fosfato son altos, el complejo ciclina/CDK PHO80/PHO85 fosforila un factor de transcripción. Este factor de transcripción de genes de fosfatasa se hace así inactivo. La proteína PHO85 de S. cerevisiae puede interactuar con las ciclinas PCL1 y PCL2 específicas de G1 (homólogos cercanos con la PHO80). En una cepa de levadura deficiente para las ciclinas CLN1 y CLN2 de G1, se requiere PHO80 para el progreso de G1. Este resultado sugiere que PHO85 está involucrado en una ruta reguladora que enlaza el estado de nutrición de la célula con la actividad de la división celular. Los cinco PLP de A. thaliana muestran similitud con el gen PHO80 tipo ciclina de la levadura.

Las quinesinas utilizan el citoesqueleto para moverse alrededor de vesículas, organelos, cromosomas y similares en la célula. Ellas pueden estar involucradas también en la formación del huso. Las quinesinas consisten de tres dominios funcionales no relacionados: el dominio motor (involucrado en el enlazamiento del microtúbulo; contiene el dominio de ATPasa), la región del tallo (involucrada en homo o heterodimerización de las quinesinas), y la cola (involucrada en la interacción con los "sustratos" de la quinesina). Se llevaron a cabo selecciones de doble híbrido utilizando diferentes partes de dos proteínas relacionadas con quinesina (KLPNT1 y KLPNT2 (siendo más del 80% idéntica a KLPNT1). Otra información obtenida por el enfoque del doble híbrido es la dimerización de las quinesinas: la KLPNT1 y la KLPNT2 interactúan (tallos y la cola de los tallos) con y entre ellas mismas.

Los vectores y las cepas utilizadas fueron suministrados por Matchmaker Two-Hybrid System (Clontech, Palo Alto, CA). El cebo fue construido por medio de la inserción del CDC2bAt.N161 (número de acceso del GenBank D10851; residuo Asp161 convertido en Asn161); CKS1At (número de acceso del GenBank AJ000016); E2Fa (= E2F5) (número de acceso del GenBank AJ294534) dominio de dimerización (226 - 356aa; SEQ ID NO: 205); CKI4 (SEQ ID NO: 264); PLP1 (número de acceso del GenBank T01601); KLPNT1 (número de acceso del GenBank AB011479; número de ID de la proteína BAB11568) dominio motor (36 - 508 aa); KLPNT1 (número de acceso del GenBank AB011479; número de ID de la proteína BAB 11568) dominio del tallo (427 - 867 aa); KLPNT2 = TH65 (número de acceso del GenBank AJ001729) dominio del cuello (3 - 186 aa); KLPNT2 = TH65 (número de acceso del GenBank AJ001729) dominio del tallo (73 - 608 aa); E2Fb (= E2F3) (número de acceso del GenBank AJ294533) dominio N-terminal (1 - 385 aa; SEQ ID NO: 206), respectivamente, en el vector pGBT9. Los vectores cebo fueron construidos por medio de la introducción del fragmento PCR creado a partir del ADNc correspondiente utilizando iniciadores para incorporar sitios de la enzima de restricción EcoRI y BamH1. Se cortó el fragmento de PCR con EcoRI y BamH1 y se clonó dentro de los sitios EcoRI y BamH1 de pGBT9, resultando en el plásmido deseado. La biblioteca de fusión del ADNc del dominio de activación GAL4 fue construida como se describe en De Veylder et al 1999, 208(4) p 453 - 62 a partir del ARNm de suspensiones de células de Arabidopsis thaliana cosechadas en diferentes etapas de crecimiento: fase exponencial temprana, exponencial, estacionaria temprana, y estacionaria.

Para la selección de un cultivo de 1 litro de la cepa HF7c de Saccharomyces cerevisiae (MATa ura3-52 his3-200 ade2-101 lys2-801 trp1-901 leu2-3,112 gal4-542 gal80-538 LYS2::GAL1_{UAS}-GAL1_{TATA}-HIS3 URA3::GAL4_{17mers}(_{3x})-CyC1_{TATA}-LacZ) fue secuencialmente transformada con el plásmido cebo y 20 \mug de ADN de la biblioteca utilizando el método de acetato de litio (Geitz et al. (1992), ver más arriba). Para estimar el número de cotransformates independientes, se sembró en placa 1/1000 de la mezcla de transformación sobre medio de Leu y Trp. El resto de la mezcla de transformación fue sembrada en placa sobre un medio para seleccionar prototrofia de histidina (Trp, Leu, His). Después de 5 días de crecimiento a 30ºC, las colonias mayores a 2 mm fueron esparcidas sobre medio que carecía de histidina. En total para cada selección, se seleccionaron al menos 107 cotransformantes independientes por su habilidad para crecer sobre medio libre de histidina. De las colonias de His^{+} se aislaron los plásmidos del dominio de activación como se describe en (Hoffman y Winston, 1987, Gene 57, 267 - 272). Los insertos hybriZAP^{TM} fueron amplificados por medio de PCR y los fragmentos de PCR fueron digeridos con AluI y se fraccionaron sobre un gel de agarosa al 2%. El ADN del plásmido a partir del cual los insertos dieron lugar a diferentes patrones de restricción fue sometido a electroporación en XL1-Blue de Escherichia coli, y se determinó la secuencia de ADN de los insertos. El ADN extraído fue utilizado también para retransformar HF7c para probar la especificidad de la interacción.

Utilizando la técnica anterior, se identificaron 61 ADNc, se determinaron sus secuencias y se encontró que contenían marcos de lectura abiertos denominados CCP1 hasta CCP61 (Figuras 1 - 61).

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Ejemplo 2

Extensión de polinucleótidos que codifican CCP hasta longitud completa o hasta recuperación de los elementos reguladores

Las secuencias de ácido nucleico que codifican CCP (SEQ ID NO: 1 - 66 ó 228 - 239) son utilizadas para diseñar iniciadores oligonucleótidos para extender una secuencia parcial de nucleótidos hasta longitud completa o para obtener secuencias 5' a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc. Se sintetiza un iniciador para iniciar la extensión en la dirección antisentido (XLR) y se sintetiza el otro para extender la secuencia en la dirección sentido (XLF). Los iniciadores permiten la extensión de la secuencia conocida de codificación de CCP "hacia afuera" generando amplicones que contienen una secuencia desconocida nueva de nucleótidos para la región de interés. Los iniciadores iniciales se diseñan a partir del ADNc utilizando Primer Analysis Software OLIGO® 4.06 (National Biosciences), u otro programa adecuado, que tenga preferiblemente 22 - 30 nucleótidos de longitud, para que tenga un contenido de GC preferiblemente del 50% o más, y para hibridarlo con la secuencia objetivo a temperaturas preferiblemente aproximadamente de 68º - 72ºC. Se evita cualquier tramo de nucleótidos que resultara en estructuras de bucle y en dimerizaciones iniciador - iniciador. Las bibliotecas de ADNc seleccionadas originales, preparadas a partir de ARNm aislado de células que se dividen activamente o de una biblioteca genómica de una planta son utilizadas para extender la secuencia; la última es la más útil para obtener regiones secuencia arriba de 5'. Si se requiere o se desea más extensión, se diseñan conjuntos adicionales de iniciadores para extender adicionalmente la región conocida.

Los iniciadores XLF sentido pueden ser diseñados también con base en secuencias genómicas públicamente disponibles. Se puede utilizar por ejemplo un software GENEMARK.hmm (modelo oculto de Markov) versión 2.2a (parámetros predeterminados) para predecir marcos de lectura abiertos. El extremo 5' del marco de lectura abierto predicho es utilizado posteriormente para diseñar el iniciador XLF sentido. Se utilizan luego dicho iniciador XLF y el iniciador XLR apropiado en una reacción RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa - transcripción inversa) para amplificar el ADNc predicho. Se clona el producto PCR resultante en un vector adecuado y se lo somete a un análisis de secuencia de ADN para verificar la predicción.

Los iniciadores utilizados para amplificar las regiones de codificación de las CCP de la invención se diseñan de tal manera que el producto PCR puede ser clonado en el vector pDONR201 (sistema de clonación Gateway^{TM}, Invitrogen). De este modo, un iniciador sentido tiene el sitio attB1 (SEQ ID NO: 246) en su extremo 5'. Para los propósitos actuales, el sitio attB1 es seguido por una secuencia de consenso de Kozak (SEQ ID NO: 247; Kozak (1989) J Cell Biol 108: 229 - 241; Lütck et al. (1987) EMBO J 6: 43 - 48). El extremo 3' del iniciador sentido comprende las partes específicas del gen como se indica en las Figuras 1 - 46. Un iniciador antisentido tiene en el extremo 5' el sitio attB2 (SEQ ID NO: 248) seguido por el complemento inverso del gen/región de codificación de interés como se indica en las Figuras 1 - 46. Los iniciadores utilizados para la amplificación de CCP por medio de la PCR se suministran con sus SEQ ID NOs en la Tabla 3. La secuencia de productos PCR clonados de CCP fue o se determina utilizando el iniciador sentido prm1024 (SEQ ID NO: 265) y el iniciador antisentido prm1025 (SEQ ID NO: 266).

TABLA III

10

Siguiendo las instrucciones para el kit de XL-PCR (Perkin Elmer) y mezclando perfectamente la enzima y la mezcla de reacción, se obtiene una alta fidelidad de amplificación. Comenzando con 40 pmol de cada iniciador y las concentraciones recomendadas de todos los otros componentes del kit, se lleva a cabo la PCR utilizando el Peltier Thermal Cycle (PTC200; MJ Research, Watertown MA) y los siguientes parámetros:

Etapa 1: 94ºC durante 1 min (desnaturalización inicial)

Etapa 2: 65ºC durante 1 min

Etapa 3: 68ºC durante 6 min

Etapa 4: 94º durante 15 s

Etapa 5: 65ºC durante 1 min

Etapa 6: 68ºC durante 7 min

Etapa 7: Repetición de las Etapas 4 - 6 durante 15 ciclos adicionales

Etapa 8: 94ºC durante 15 s

Etapa 9: 65ºC durante 1 min

Etapa 10: 68ºC durante 7:15 min

Etapa 11: Repetición de las Etapas 8 - 10 durante 12 ciclos

Etapa 12: 72ºC durante 8 min

Etapa 13: 4ºC (y mantenerlo)

Se analiza una alícuota de 5 - 10 \mul de la mezcla de reacción por medio de electroforesis sobre un mini gel de agarosa de baja concentración (aproximadamente 0,6 - 0,8%) para determinar que reacciones fueron exitosas para extender la secuencia. Se seleccionaron las bandas que se cree que contienen los productos más grandes y se las cortó del gel. La purificación adicional involucra el uso de un método de extracción con gel comercial tal como QIAQuick^{TM} (QIAGEN Inc). Después de la recuperación del ADN, se utiliza enzima Klenow para recortar sobresalientes de nucleótidos monocatenarios creando extremos embotados que facilitan la religación y la clonación. Después de la precipitación con etanol, se redisuelven los productos en 13 \mul de amortiguador de ligación, se añaden 1 \mul de T4-ADN ligasa (15 unidades) y 1 \mul de T4 polinucleótido quinasa, y se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 2 - 3 horas o durante la noche a 16ºC. Se transforman células competentes de E. coli (en 40 \mul de medio apropiado) con 3 \mul de mezcla de ligación y se cultiva en 80 \mul de medio SOC (Sambrook, ver más arriba). Después de incubación durante una hora a 37ºC, se siembra en placa la mezcla de transformación completa sobre agar Luria Bertani (LB) (Sambrook, ver más arriba) que contiene 2 x Carb. Al día siguiente, se recogieron varias colonias en forma aleatoria de cada placa y se las cultivó en 150 \mul de medio LB/2xCarb líquido colocado en un pozo individual de una placa de microtitulación estéril de 96 pozos, comercialmente disponible. Al día siguiente, se transfirieron 5 \mul de cada cultivo durante la noche en una placa de 96 pozos no estéril y después de dilución 1:10 con agua, se transfieren 5 \mul de cada muestra en un arreglo de PCR. Para amplificación por PCR, se añaden a cada pozo 18 \mul de mezcla de reacción concentrada para PCR (3.3x) que contiene 4 unidades de 4Tth ADN polimerasa, un iniciador vector y ambos iniciadores génicos específicos utilizados para la reacción de extensión. La amplificación se realiza utilizando las siguientes condiciones:

Etapa 1: 94ºC durante 60 s

Etapa 2: 94ºC durante 20 s

Etapa 3: 55ºC durante 30 s

Etapa 4: 72ºC durante 90 s

Etapa 5: Repetición de las Etapas 2 - 4 durante 29 ciclos adicionales

Etapa 6: 72ºC durante 180 s

Etapa 7: 4ºC (y mantenerlo)

Las alícuotas de las reacciones PCR se corren sobre geles de agarosa junto con mercadores de peso molecular. Los tamaños de los productos PCR se comparan con los ADNc parciales originales, y se seleccionan los clones apropiados, se los liga en el plásmido y se los secuencia.

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Ejemplo 3

Expresión de proteínas CCP recombinantes en plantas transgénicas

En este ejemplo, se expresaron las moléculas de CCP de la presente invención en un vector de expresión 35S en plantas transgénicas. Se clonaron las moléculas de CCP de esta invención utilizando procedimientos de clonación estándar entre un promotor adecuado, por ejemplo el promotor CaMV35S o cualquier promotor por ejemplo de la Tabla II, y un terminador adecuado, por ejemplo, la región no traducida 3' NOS. Se clona posteriormente el gen recombinante resultante en un vector binario adecuado y se transfiere luego el vector resultante de la transformación de la planta a Agrobacterium tumefaciens. Se transforma Arabidopsis thaliana con este Agrobacterium aplicando el método de transformación por inmersión de la flor in planta (Clough y Bent, Plant J. 16: 735 - 743, 1998). Se seleccionan líneas transgénicas de plantas sobre un medio de cultivo que contiene el agente de selección adecuado (por ejemplo, kanamicina o Basta) o con base en la puntuación de la expresión de un marcador seleccionable (por ejemplo, luciferasa, proteína fluorescente verde).

Para expresión específica del tejido, el gen para CCP puede ser expresado también bajo el control del promotor 35S mínimo que contiene elementos UAS. Estos elementos UAS son sitios para activación transcripcional por la proteína de fusión GAL4-VP16. La proteína de fusión GAL4-VP16 a su vez se expresa bajo el control de un promotor específico del tejido. La construcción UAS-CCP y la construcción GAL4-VP16 se combinan por medio de co-transformación de ambas construcciones, transformación posterior de construcciones individuales o por medio de cruzamiento sexual de líneas que contienen las construcciones individuales. La ventaja de este sistema de dos componentes es que se puede generar una amplia gama de patrones de expresión específicos del tejido para un transgén específico, por simple cruzamiento de las líneas paternas seleccionadas que expresan la construcción UAS-CCP con diferentes líneas GAL4-VP16 específicas del tejido. Una combinación del promotor específico del tejido/CCP que produce un fenotipo deseado puede ser posteriormente clonada nuevamente en un solo vector de expresión, para evitar apilamiento de las construcciones de transgenes en las líneas comerciales.

Los transformantes primarios se caracterizan por medio de transferencias tipo Northern y tipo Western utilizando plántulas de 1 - 4 semanas. Se compararon los niveles de expresión con aquellos de las plantas no transformadas (control).

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Ejemplo 4

Reducción de la expresión de genes CCP objetivo en plantas transgénicas

Se puede reducir específicamente la expresión de genes de las plantas por medio de tecnologías antisentido y de co-supresión. Estas tecnologías se basan en la síntesis de transcriptos antisentido, complementarios al ARNm de un gen dado para CCP. Existen diferentes métodos descritos en la literatura, que incrementan la eficiencia de esta reducción de la expresión, por ejemplo para expresar la cadena sentido con repeticiones introducidas invertidas, en vez de la cadena antisentido. Las construcciones para reducción de la expresión de genes objetivo se elaboran en forma similar a aquellos para la expresión de proteínas recombinantes, es decir, se fusionan a secuencias promotoras y a secuencias de terminación de la transcripción (ver el ejemplo 3). Los promotores utilizados para este propósito son los promotores constitutivos así como los promotores específicos del tejido.

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Ejemplo 5

Transformación de arroz mediante Agrobacterium

Se descascarillan semillas secas maduras de las variedades cultivadas de arroz japonés Nipponbare o Taipei 309, se esterilizan y germinan sobre un medio que contiene 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético). Después de incubación en la oscuridad durante cuatro semanas, se cortan y propagan callos embriogénicos derivados de escutelo, sobre el mismo medio. Se cocultivan luego los callos embriogénicos seleccionados con Agrobacterium. Se pueden utilizar cepas de Agrobacterium ampliamente utilizadas tales como LBA4404 o C58 que albergan vectores binarios de T-ADN. El gen hpt en combinación con higromicina es adecuado como un sistema marcador seleccionable pero se pueden utilizar otros sistemas. El callo cocultivado se cultiva sobre medio que contiene 2,4-D durante 4 a 5 semanas en la oscuridad en presencia de una concentración adecuada del agente selectivo. Durante este período, rápidamente se desarrollan islas de callos resistentes al crecimiento. Después de la transferencia de este material a un medio con una concentración reducida de 2,4-D e incubación en la luz, se libera el potencial embriogénico y se desarrollan brotes en las siguientes cuatro a cinco semanas. Se cortan los brotes del callo y se incuban durante una semana sobre un medio que contiene auxina a partir del cual pueden ser transferidos al suelo. Los brotes endurecidos se cultivan bajo humedad alta y días cortos en un fitotrón. Las semillas pueden ser cosechadas tres a cinco meses después del trasplante. El método produce transformantes de un solo locus con una tasa superior al 50% (Aldemita y Hodges (1996) Planta 199: 612 - 617; Chan et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 491 - 506; Hiei et al. (1994) Plant J. 6: 271 -
282).

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Ejemplo 6

Expresión de proteínas CCP recombinantes en células bacterianas

En este ejemplo, las moléculas de CCP de la presente invención se expresan como un polipéptido de fusión de glutationa-S-transferasa (GST) recombinante en E. coli y se aísla y caracteriza el polipéptido de fusión. Específicamente, se fusionan las moléculas de CCP con GST y este polipéptido de fusión se expresa en E. coli, por ejemplo, la cepa PEB199. La expresión de la proteína de fusión GST-CCP en PEB 199 se induce con IPTG. El polipéptido de fusión recombinante se purifica a partir de lisados bacterianos crudos de la cepa inducida PEB 199 por medio de cromatografía de afinidad sobre cuentas de glutationa. Utilizando análisis electroforético en gel de poliacrilamida del polipéptido purificado a partir de lisados bacterianos, se determina el peso molecular del polipéptido de fusión
resultante.

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Ejemplo 7

Expresión de proteínas CCP recombinantes en células COS

Para expresar el gen para CCP de la presente invención en células COS, se utiliza el vector pcDNA/Amp de Invitrogen Corporation (San Diego, CA). Este vector contiene un origen de replicación SV40, un gen de resistencia a la ampicilina, un origen de replicación de E. coli, un promotor CMV seguido por una región polienlazadora, y un intrón SV40 y un sitio de poliadenilación. Se clona un fragmento de ADN que codifica la proteína CCP entera y una etiqueta HA (Wilson et al. (1984) Cell 37: 767) o una etiqueta FLAG fusionada en el marco a su extremo 3' del fragmento dentro de la región polienlazadora del vector, poniendo así la expresión de la proteína recombinante bajo el control del promotor CMV.

Para construir el plásmido, se amplifica la secuencia de ADN para CCP por medio de la PCR utilizando dos iniciadores. El iniciador 5' contiene el sitio de restricción de interés seguido por aproximadamente veinte nucleótidos de la secuencia de codificación de CCP partiendo del codón de inicio; la secuencia del extremo 3' contiene secuencias complementarias al otro sitio de restricción de interés, un codón de detención de la traducción, la etiqueta HA o la etiqueta FLAG y los últimos 20 nucleótidos de la secuencia de codificación de CCP. Se digieren el fragmento amplificado por PCR y el vector pCDNA/Amp con las enzimas de restricción apropiadas y se desfosforila el vector utilizando la enzima CIAP (New England Biolabs, Beverly, MA). Preferiblemente los dos sitios de restricción escogidos son diferentes de manera que se inserta la quinasa y/o el gen de la Fosfatasa en la orientación correcta. Se transforma la mezcla de ligación dentro de células de E. coli (se pueden utilizar cepas HB101, DH5a, SURE, disponibles con Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), se siembra en placa el cultivo transformado sobre placas con medio de ampicilina, y se seleccionan las colonias resistentes. Se aísla el ADN del plásmido de los transformantes y se lo examina por medio de análisis de restricción por la presencia del fragmento correcto.

Las células COS son posteriormente transfectadas con el ADN del plásmido CCP-pcDNA/Amp utilizando los métodos de coprecipitación de cloruro de calcio o de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación. Otros métodos adecuados para transfección de células huésped pueden ser encontrados en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. La expresión del polipéptido CCP se detecta por medio de marcación radioactiva (se pueden utilizar ^{35}S-metionina o ^{35}S-cisteína disponibles con NEN, Boston, MA) e inmunoprecipitación (Harlow, E. y carril, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988) utilizando un anticuerpo monoclonal específico HA. En resumen, se marcan las células durante 8 horas con ^{35}S-metionina (o ^{35}S-cisteína). Se recolectan luego los medios de cultivo y se lisan las células utilizando detergentes (amortiguador RIPA, NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, DOC al 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,5). Se precipitan tanto el lisado celular como el medio de cultivo con un anticuerpo monoclonal específico HA. Se analizan luego los polipéptidos precipitados por medio de SDS-
PAGE.

Alternativamente, se clona el ADN que contiene la secuencia de codificación de la Quinasa y/o de la Fosfatasa directamente dentro del polienlazador del vector pCDNA/Amp utilizando los sitios de restricción apropiados. Se transfecta el plásmido resultante dentro de células COS en la forma descrita anteriormente, y se detecta la expresión del polipéptido CCP por medio de marcación radioactiva e inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo monoclonal específico para CCP.

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Ejemplo 8

Fosforilación in vitro de CDC2bDN-IC26M por las CDK de la planta

La región de codificación CDC2bDN-IC26M (SEQ ID NO: 4) fue amplificada por medio de la PCR con Pfu polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA). Se subclonó el producto PCR en pET19b (Novagen, Madison, WI), para obtener CDC2bDN-IC26MpET19b. El gen CDC2bDN-IC26M se localiza secuencia abajo de un promotor T71ac, en el marco con una secuencia que codifica una etiqueta de 10-histidina seguido por un sitio de reconocimiento de enteroquinasa. Se cultivaron células BL21 (DE3) de Escherichia coli (Novagen) que contienen el plásmido CDC2bDN-IC26MpET19b a 37ºC en medio M9 (Sambrook y Russel, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Edition, CSHL Press, CSH New York, 2001), suplementado con 100 \mug/ml de ampicilina, para obtener una densidad celular correspondiente a un A600 de 0,6. Posteriormente, se indujo la expresión del gen CDC2bDN-IC26M por medio de la adición de isopropil \beta-D-tiogalactósido 0,4 mM, y se continuó el cultivo durante 4 h a
30ºC.

Se recolectaron las células en amortiguador de lisis que contenía amortiguador de fosfato de sodio 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, Triton X-100 al 0,1%, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF) y se lisaron sobre hielo por medio de sonicación. Se clarificó el extracto por medio de centrifugación durante 20 minutos a 20.000 x g. Se cargó el extracto crudo a 4ºC sobre una resina de afinidad de níquel - ácido nitrilotriacético - agarosa (Qiagen), y se llevó a cabo el fraccionamiento de la proteína de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se reunieron las fracciones que contenían la proteína de fusión CDC2bDN-IC26M.

Se llevaron a cabo ensayos de la quinasa CDC2bDN-IC26M con complejos de CDK purificados a partir de extractos de proteína total de la planta (plántulas de Arabidopsis) por medio de enlazamiento de afinidad de p13suc1-Sefarosa de acuerdo con Azzi et al. (Eur. J. Biochem. 203: 353 - 360). En resumen, se purificó p13sucl a partir de una sobre producción de la cepa de E. coli por medio de cromatografía en Sefacril S2000, y se conjugó con Sefarosa 4B activada con CNBr (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los extractos de proteína total de la planta (300 \mug) fueron incubados con 50 \mul de cuentas de p13suc1-Sefarosa al 50% (v/v) durante 2 h a 4ºC. Se combinaron las cuentas lavadas con 30 \mul de amortiguador de quinasa que contenía \sim1 mg/ml de CDC2bDN-IC26M, ATP 150 mM y 1 \muCi de [-32P]ATP (Amersham). Después de 20 minutos de incubación a 30ºC, se analizaron las muestras por medio de SDS-PAGE y se autorradiografiaron.

Como se muestra en la Figura 48, la proteína CDC2bDN-IC26M purificada se fosforila por medio de las CDK in vitro.

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Ejemplo 9

Amplificación por pcr de AtDPb

Con base en los datos de secuencia disponibles de clones parciales relacionados con DP putativa de la planta del banco de datos (DP de soja (AI939068), DP de tomate (AW217514), y DP de algodón (AI731675)), se sintetizaron tres oligonucleótidos, correspondientes a la parte más conservada del enlazamiento del ADN y los dominios de heterodimerización de E2F (MKVCEKV, SEQ ID NO: 240; LNVLMAMD, SEQ ID NO: 241 y FNSTPFEL, SEQ ID NO: 242), y denominó A (ATAGAATTCATGAAAGTTTGTGAAAAGGTG, SEQ ID NO: 243), B (ATAGAATTCCT
GAAT GTTCTCATGGCAATGGAT, SEQ ID NO: 244) y C (ATAGGATCCCAGCTCAAAAGGAGTGCTATTGAA, SEQ ID NO: 245), respectivamente.

Se llevó a cabo una PCR sobre una biblioteca de ADNc del cultivo en suspensión doble híbrido de Arabidopsis/levadura. Se purificaron los productos PCR, se digirió con EcoRI y BamHI, y se ligó dentro del vector pCR-XL-TOPO (Invitrogen). Se secuenciaron los insertos clonados por medio de secuenciación didesoxi bicatenaria.

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Ejemplo 10

Construcción de mutantes AtDP y AtE2F, sistema de transcripción-traducción in vitro e inmunoprecipitación

Se construyeron versiones etiquetadas de hemaglutinina (HA) de la influenza de AtE2Fa y AtE2Fb mutantes y de tipo silvestre por medio de clonación dentro del plásmido pSK (Stratagene) que contiene la etiqueta de HA (SEQ ID NO: 202). Los mutantes AtE2F, es decir AtE2Fa 1 - 420 (SEQ ID NO: 217), AtE2Fa 162 - 485 (SEQ ID NO: 218), y AtE2Fb 1 - 385 (SEQ ID NO: 206), fueron obtenidos por medio de la PCR y clonados dentro de los sitios EcoRI y BamHI de HA-pSK. Las versiones etiquetadas de c-myc (SEQ ID NO: 200) de tipo silvestre y mutantes de AtDP (AtDPa 1 - 292, SEQ ID NO: 114; AtDPa 121 - 292, SEQ ID NO: 211; AtDPa 1 - 142, SEQ ID NO: 208; AtDPa 172 - 292, SEQ ID NO: 213; AtDPa 121 - 213, SEQ ID NO: 212; y AtDPb 1 - 385, SEQ ID NO: 127; AtDPb 182 - 385, SEQ ID NO: 216; AtDPb 1 - 263, SEQ ID NO: 223; AtDPb 1 - 193, SEQ ID NO: 214; y AtDPb 182 - 263, SEQ ID NO: 215) fueron generadas por medio de la PCR y clonadas dentro de los sitios EcoRI y PstI del plásmido pBluescript (Stratagene) que contiene una etiqueta doble de c-myc. Se llevaron a cabo todas las etapas de clonación de acuerdo con procedimientos estándar, y se verificaron los marcos de lectura por medio de secuenciación
directa.

Se llevaron a cabo experimentos de transcripción y de traducción in vitro utilizando el kit de extracción del germen de trigo acoplado a TNT T7 (Promega) cebado con plásmidos apropiados durante 90 min a 30ºC. Para inmunoprecipitación, se diluyeron 10 \mul del extracto traducido total in vitro (50 \mul) en proporción 1:5 en amortiguador Nonidet P40 (Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Nonidet P40 al 1%, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 10 \mug/ml de leupeptina/aprotinina/pepstatina) y se incubó durante 2 h a 4ºC con anticuerpos anti-cmyc (9E10; BabCo) o anti-HA (16B12; BabCo). Se añadió proteína-A-Sefarosa (40 \mul al 25% (v/v)) y se incubó durante 1 h a 4ºC, luego se lavaron las cuentas cuatro veces con amortiguador Nonidet P40. Se eluyeron los complejos inmunes con 10 \mul de amortiguador para muestra de dodecil sulfato de sodio 2 U (SDS) y se analizó por medio de SDS-PAGE al 10% o al 15% y por medio de autorradiografía.

En la Tabla 4 se da una visión general de los fragmentos AtDP y AtE2F y sus SEQ ID NOs.

TABLA IV

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Ejemplo 11

Interacción in vitro entre las AtDP, AtE2F y los mutantes de los mismos illustrados por medio de experimentos de inmunoprecipitación

La AtDPa y la AtDPb pueden interactuar eficientemente in vitro con AtE2Fa y AtE2Fb. Como una primera etapa en la comparación de las propiedades bioquímicas de AtDPa y AtDPb, se analizó la habilidad de estas moléculas para heterodimerizar con AtE2Fa y AtE2Fb. Para este propósito, se utilizó el sistema acoplado de transcripción-traducción in vitro en el cual AtDPa o AtDPb etiquetado con c-myc fue co-expresado con la AtE2Fa o AtE2Fb etiquetado con HA. Se resolvió una parte de cada muestra por medio de SDS-PAGE (Figuras 50 y 51, paneles A), mientras que otra parte fue sometida a inmunoprecipitación con anticuerpos monoclonales anti-c-myc (Figuras 50 y 51, paneles B). En la ausencia de proteínas DP, no se precipitó AtE2F2a o AtE2F2b por los anticuerpos anti-c-myc (Figura 51, panel B, carril 1). Sin embargo, tanto las proteínas HA-AtE2F co-precipitaron en forma reproducible con AtDPa etiquetado con c-myc (Figura 50, panel B, carriles 1 y 2) como AtDPb (Figura 51, panel B, carriles 3 y 4). Se obtuvieron idénticos resultados en un experimento recíproco con anticuerpos monoclonales anti-HA. Estos datos revelaron que ambas proteínas relacionadas con DP de Arabidopsis interactuaron in vitro con las diferentes proteínas relacionadas con E2F de Arabidopsis.

El dominio conservado de dimerización de las AtE2F pareció ser importante para la interacción con las AtDP, debido a que los análisis mutacionales mostraron que ni la supresión de la extensión N-terminal ni de la parte C-terminal de AtE2Fa y AtE2Fb perjudicaron la interacción con los DP (Figuras 50 y 51, paneles B). Se obtuvieron resultados similares por medio del análisis doble híbrido (ver la Tabla 5 del Ejemplo 12). Para analizar si los requerimientos estructurales para la heterodimerización de las AtDP fueron similares a aquellos de sus homólogos animales, se construyeron diferentes mutantes de supresión de AtDPa y AtDPb (para una ilustración esquemática, ver las Figuras 52 y 53), etiquetados con el epítopo de c-myc (Figuras 54 y 55, paneles A). Las interacciones entre las AtDP mutantes y AtE2Fb fueron analizadas en experimentos de inmunoprecipitación con los anticuerpos específicos anti-HA o anti-c-myc (Figuras A6 y A7, paneles B y C, respectivamente). Como se muestra en las Figuras 54 y 55, las proteínas mutantes AtDP con dominio de enlazamiento suprimido de ADN podrían enlazarse suficientemente con las proteínas co-traducidas HA-AtE2Fb (Figura 54, panel C, carril 2; y Figura 55, panel C, carril 2). No se encontró interacción detectable entre la proteína AtE2Fb y las proteínas mutantes DP que contienen el dominio de enlazamiento completo del ADN, pero que carecen del dominio putativo de dimerización (Figura 54, panel C, carril 3; Figura 55, panel C, carril 4). Por lo tanto, la parte N-terminal de ambas proteínas AtDP, incluido el dominio de enlazamiento conservado del ADN, no fue suficiente para que ocurriera la interacción in vitro. En contraste, una forma mutante de AtDPb (aminoácidos 1 - 263; SEQ ID NO: 223) podría enlazar a AtE2Fb (Figura 55, panel C, carril 3), indicando que se requiere de la región de AtDPb entre los aminoácidos 182 y 263 para interacción con
AtE2Fb.

Para confirmar esta hipótesis, se construyó un mutante de supresión de AtDPb (182 - 263, SEQ ID NO: 215) y, como se esperaba, podría enlazarse con AtE2Fb (Figura 56). El requerimiento para el dominio de dimerización homólogo de AtDPa para la interacción con AtE2Fb estaba soportado por un ensayo de enlazamiento en el cual el mutante AtDPa 172 - 292 (SEQ ID NO: 213), con la parte N-terminal del dominio de dimerización suprimido, falló en enlazarse con AtE2Fb (Figura 54, paneles B y C, carriles 4). Sin embargo, cuando se analizó la actividad de enlazamiento de E2F del dominio de dimerización predicho de la AtDPa (posiciones de los aminoácidos 121 - 213, SEQ ID NO: 212), no se podía detectar interacción entre esta región y la proteína AtE2Fb (Figura 54, panel B, carril 5). Estos datos indican que se requieren otras regiones carboxilo-terminales de AtDPa para la interacción estable con AtE2Fb.

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Ejemplo 12

Experimentos doble híbrido de levadura para mostrar interacción entre mutantes DP y E2F

Para la selección de la biblioteca, se suministraron vectores y cadenas (HF7c) con el sistema doble híbrido
Matchmaker (Clontech). Se amplificaron la dimerización y los dominios de enlazamiento del ADN de la AtE2Fa (aminoácidos 226 - 356; SEQ ID NO: 205) por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se subclonaron en el marco con el dominio de enlazamiento del ADN de GAL4 de pGBT9 (Clontech) para crear el plásmido cebo pGBTE2Fa226-356. Se llevaron a cabo selecciones como se describió previamente (De Veylder et al. 1999; Planta 208, 453 - 462). Se llevó a cabo una segunda selección de biblioteca con la construcción AtE2Fb (pGBTE2Fb-Rb) careciendo del dominio de enlazamiento de Rb (aminoácidos 1 - 385; SEQ ID NO: 206). Se aislaron y secuenciaron los plásmidos de los clones interactuantes.

Para los experimentos de interacción doble híbrido de levadura, se crearon una cantidad de plásmidos presa doble híbridos de levadura (en pAD-GAL424) por medio de la amplificación por PCR de los fragmentos de los genes para AtDPa (DPa 1 - 292, SEQ ID NO: 114; DPa 1 - 142, SEQ ID NO: 208; DPa 42 - 142, SEQ ID NO: 209; DPa 42 - 292, SEQ ID NO: 210; DPa 121 - 292, SEQ ID NO: 211; DPa 121 - 213, SEQ ID NO: 212; y DPa 172 - 292, SEQ ID NO: 213) y AtDPb (DPb 1 - 385, SEQ ID NO: 127; DPb 1 - 193, SEQ ID NO: 214; DPb 182 - 263, SEQ ID NO: 215; y DPb 182 - 385, SEQ ID NO: 216) y se los confirmó por medio de secuenciación. Se transformaron diferentes combinaciones entre el cebo (pGBTE2Fa226-356, pGBTE2Fb-Rb, o pGBTE2Fb 1 - 127, SEQ ID NO: 207) y las construcciones presa en células de levadura y se evaluó su habilidad para crecer sobre medio mínimo His después de 3 días de incubación a 30ºC. Se evaluaron los plásmidos cebo cotransformados con pAD-GAL424 vacío y plásmidos presa con pGBT9 vacío como controles para la especificidad de la interacción.

En la Tabla 4 se da un resumen de los fragmentos de AtDP y AtE2F y de sus SEQ ID NOs.

Los resultados obtenidos fueron confirmados por medio del análisis de interacción doble hibrido. pGBTE2Fa226-356 y pGBTE2Fb-Rb fueron co-transformados en una mancha apropiada del reportero de levadura apropiado con un plásmido produciendo la proteína AtDPa o AtDPb de longitud completa fusionada al dominio de transactivación de GAL4. La reconstitución específica de la expresión del gen que depende de GAL4 medida como la habilidad para crecer en ausencia de histidina confirma la interacción entre las dos proteínas DP y E2F (Tabla 5).

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(Tabla pasa a página siguiente)

12

Ejemplo 13

Aislamiento del ARN y análisis (RT)-PCR de la transcripción inversa de la expresión de AtDP y AtE2F

Se mantuvieron cultivos en suspensión de células (L.) Heynh. de A. thaliana como se describió previamente (Glab et al. 1994, FEBS Lett. 17, 207 - 211). Se sincronizaron parcialmente las células por medio de la adición consecutiva de afidicolina (5 \mug/ml) y propizamida (1,54 \mug/ml). Se dejó el bloque de afidicolina durante 24 horas. Se lavaron las células durante 1 hora en medio B5 antes de la adición de propizamida. Se recogieron las mezclas al final de las 24 horas del bloque de afidicolina, al final de 1 hora de la etapa de lavado, y 1, 2, 3, y 4 horas después de la adición de propizamida al medio de cultivo. Se aisló el ARN total del cultivo en suspensión de células de Arabidopsis de acuerdo con Magyar et al. (1997), Plant Cell 9, 223 - 235, y con el reactivo Triazol (Gibco/BRL) a partir de órganos diferentes. Se llevó a cabo una amplificación RT-PCR semicuantitativa sobre ARNm transcrito en forma inversa, garantizando que la cantidad de producto amplificado permaneció en proporción lineal con el molde inicial presente en la reacción. Se transfirieron 10 \mul de la PCR sobre una membrana Hybond-N/, se hibridó con sondas específicas del gen marcadas con fluoresceína (módulo de marcación aleatoria del iniciador Gene-Images; Amersham Pharmacia Bio-tech), detectado con el módulo de detección CDP-Star (Amersham), y visualizado por medio de exposición corta a una película de autorradiografía X-OMAT de Kodak.

Se utilizaron los siguientes pares de iniciadores (hacia adelante e inversos) para la amplificación: 5' -ATAGAATTC
ATGTCCGGTGTCGTACGA-3' (SEQ ID NO: 249, sitio de EcoRI subrayado) y 5'-ATAGGATCCCACCTCCAATGT
TTCTGCAGC-3' (SEQ ID NO: 250, sitio de BamHI subrayado) para AtE2Fa (número de acceso del GenBank AJ294533); 5' -ATAGAATTCGAGAAGAAAGGGCAATCAAGA-3' (SEQ ID NO: 251, sitio de EcoRI subrayado) y 5'-ATACTGCAGAGAAATCTCGATTTCGACTAC-3' (SEQ ID NO: 252, sitio de PstI subrayado) para AtDPa (número de acceso del GenBank AJ294531); 5'-GCCACTCTCATAGGGTTCTC CATCG-3' (SEQ ID NO: 253) y 5'-GGCATGCCTCCAAGATCCTTGAAGT-3' (SEQ ID NO: 254) para Arath;CDKA;1 (número de acceso del Genbank X57839); 5'-GGGTCTTGGTCGTTTTACTGTT-3' (SEQ ID NO: 255) y 5'-CCAAGACGATGACAACAGA
TACAGC-3' (SEQ ID NO: 256) para Arath;CDKB1;1 (número de acceso del Genbank X57840); 5'-ATAAACTAAAT
CTTCGCTGAA- 3' (SEQ ID NO: 257) y 5'-CAAACGCGGATCTGAAAAACT-3' (SEQ ID NO: 258) para histona H4 (número de acceso del Genbank M17132); 5' -TCTCTCTTCCAAATCTCC-3' (SEQ ID NO: 259) y 5'-AAGTCTCT CACTTTCTCACT-3' (SEQ ID NO: 260) para ROC5 (AtCYP1, número de acceso del GenBank
U072676) (Chou y Gasser 1997, Plant Mol. Biol. 35, 873 - 892); 5'- CTAAGCTCTCAAGATCAAAGGCTTA-3' (SEQ ID NO: 261) y 5'-TTAACATTG CAAAGAGTTTCAAGGT-3' (SEQ ID NO: 262) para el gen de actina 2 (número de acceso del GenBank U41998) (An et al. 1996, Plant J. 10, 107 - 121).

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Ejemplo 14

Los genes para AtDPa y AtE2Fa se coexpresan en una forma que depende de la fase del ciclo celular

La identificación de la AtDPa en una selección doble híbrido de levadura como un gen que codifica una proteína que se asocia con AtE2Fa indicó que puede actuar en forma cooperativa en las células de la planta como un heterodímero funcional: Para fortalecer esta hipótesis, investigamos si ambos genes eran corregulados a nivel transcripcional. Los análisis de expresión específica del tejido revelaron que se favoreció claramente la expresión de ambos genes en flores y fueron transcritos muy fuertemente en cultivos en suspensión de células dividiéndose activamente (Figura 57). La expresión en estos tejidos podría ser un signo para la correlación entre la actividad real de proliferación de un tejido dado y la acumulación del transcripto, como puede observarse a partir del gen Arath;CDKB1;1. Los transcriptos de AtDPa fueron también detectables en hojas y, en menor medida, en tejidos de la raíz y el tallo, mientras que los transcriptos de AtE2Fa fueron virtualmente indetectables en raíces y en el tallo únicamente con niveles ligeros de expresión en tejidos de hoja. Se estudió la transcripción del gen que depende de la fase del ciclo celular utilizando una suspensión de células de Arabidopsis que estaba parcialmente sincronizada por el tratamiento secuencial con afidicolina y propizamida. La histona H4 de Arabidopsis y el gen Arath;CDKB1;1 fueron incluidos para monitorear el progreso del ciclo celular (Figura 58) (Chaubet et al. 1996, Plant J. 10, 425 - 435; Segers et al. 1996, Plant J. 10, 601 - 612). Teniendo en cuenta la sincronización parcial del cultivo, puede observarse que los niveles del transcripto de histona H4 alcanzaron un pico inmediatamente después de la remoción del inhibidor y la disminución posterior en forma gradual (Figura 58). El patrón opuesto de expresión podría ser observado para el gen Arath;CDKB1;1, ilustrando que las células entraron a las fases G2-M con sincronía parcial. Dentro de este entorno experimental, los genes para AtDPa y AtE2Fa mostraron un patrón de expresión muy similar. Ambos exhiben mayor acumulación de transcripto antes del pico de expresión del gen de histona H4 y decae rápidamente en los siguientes ejemplos (Figura 58). La similitud en la expresión de los patrones de AtDPa y AtE2Fa de Arabidopsis soporta la posibilidad de que ellos actúen en forma cooperativa como un heterodímero durante la fase S.

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Ejemplo 15

Transformación de Arabidopsis thaliana con CaMV35S::DPa

Se transformaron plantas de Arabidopsis (utilizando el método de inmersión de la flor in planta; Clough y Bent, Plant J. 16: 735 - 743, 1998) con una construcción que contiene al gen para DPa bajo el control del promotor CaMV 35S. Se analizaron las líneas en forma molecular por medio de transferencias tipo Northern. Como puede observarse en la Figura 59, todas las líneas mostraron mayores niveles de DPa en comparación con el control no transformado. Generalmente, se observaron dos clases de líneas: líneas de expresión débil (por ejemplo, 16) y líneas de expresión fuerte (por ejemplo, 23) (ver la Figura 59). Las plantas son posteriormente analizadas por alteraciones fenotípicas como las descritas aquí.

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Equivalentes

Aquellos capacitados en el arte reconocerán, o serán capaces de determinar utilizando únicamente experimentación de rutina, muchos equivalentes con las modalidades específicas de la invención descrita aquí. Tales equivalentes están destinados a ser abarcados por las siguientes reivindicaciones.

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

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<130> CNN-001PC

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<150> US 60/204.045

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-05-12

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<160> 290

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<170> PatentIn version 3.0

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<210> 1

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<211> 1255

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 1

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\hskip0,8cm

13

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<210> 2

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<211> 471

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 2

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\hskip0,8cm

14

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<210> 3

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<211> 1351

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 3

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\hskip0,8cm

15

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 672

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 4

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\hskip0,8cm

16

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<210> 5

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<211> 1287

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

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<400> 5

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\hskip0,8cm

17

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<210> 6

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<211> 1078

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 6

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\hskip0,8cm

18

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 511

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip0,8cm

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1155

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip0,8cm

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1308

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

21

\hskip0,8cm

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1006

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip0,8cm

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 643

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip0,8cm

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 484

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip0,8cm

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 688

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip0,8cm

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 461

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica nueva

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 396

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a, g, c, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip0,8cm

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 862

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica nueva

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 292, 294, 339

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a, g, c, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip0,8cm

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1114

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip0,8cm

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 794

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip0,8cm

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 448

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip0,8cm

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1152

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip0,8cm

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 409

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica nueva

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 201, 344, 365, 369

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a, g, c, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip0,8cm

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 758

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip0,8cm

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 624

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\hskip0,8cm

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 495

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\hskip0,8cm

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 580

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip0,8cm

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 656

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\hskip0,8cm

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 985

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 527

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica nueva

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 512

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a, g, c, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 610

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica nueva

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 482, 494, 495, 516, 560, 567, 587, 607

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a, g, c, o t

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip0,8cm

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 546

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 492

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip0,8cm

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 723

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica nueva

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 559, 622, 677

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a, g, c, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 344

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1131

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\hskip0,8cm

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 631

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1333

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2289

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1094

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1204

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1715

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2195

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\hskip0,8cm

53

\hskip0,8cm

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1413

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2766

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1260

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\hskip0,8cm

57

\hskip0,8cm

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\hskip0,8cm

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1266

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica nueva

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (757)..(761)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a, g, c, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\hskip0,8cm

60

\hskip0,8cm

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1520

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica nueva

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1455)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a, g, c, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1142

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1189

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 805

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1539

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1977

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 525

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2610

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2235

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4002

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\hskip0,8cm

71

\hskip0,8cm

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1251

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2955

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

74

\hskip0,8cm

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 865

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 723

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica nueva

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 559, 622, 677

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a, g, c, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 426

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1442

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\hskip0,8cm

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1506

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\hskip0.8cm

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2631

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

81

\hskip0,8cm

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2743

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

83

\hskip0,7cm

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2959

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

85

\hskip0,8cm

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1295

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

87

\hskip0,8cm

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 340

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

89

\hskip0,8cm

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 450

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

92

\hskip0,8cm

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

94

\hskip0,8cm

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 429

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

96

\hskip0,8cm

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 359

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

98

\hskip0,8cm

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 337

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 436

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\hskip0,8cm

103

\hskip0,8cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 97, 98, 113

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 296

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

112

\hskip0,8cm

113

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 383

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\hskip0,8cm

115

\hskip0,8cm

116

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 70, 118

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\hskip0,8cm

117

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 181

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\hskip0,8cm

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\hskip0,8cm

119

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 328

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

123

\hskip0,8cm

124

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\hskip0,8cm

125

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\hskip0,8cm

126

\hskip0,8cm

127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 181

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\hskip0,8cm

129

\hskip0,8cm

130

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\hskip0,8cm

131

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\hskip0,8cm

132

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 376

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 316

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

135

\hskip0,8cm

136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 194

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 333

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

139

\hskip0,8cm

140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 460

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

141

\hskip0,8cm

142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 664

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\hskip0,8cm

143

\hskip0,8cm

144

\hskip0,8cm

145

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 450

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

146

\hskip0,8cm

147

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 901

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

148

\hskip0,8cm

149

\hskip0,8cm

150

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 358

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

151

\hskip0,8cm

152

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

153

\hskip0,8cm

154

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 385

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 252, 253

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

155

\hskip0,8cm

156

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 465

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

157

\hskip0,8cm

158

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 313

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

159

\hskip0,8cm

160

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 292

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\hskip0,8cm

161

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

162

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 432

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

163

\hskip0,8cm

164

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 559

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

165

\hskip0,8cm

166

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

167

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 784

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

168

\hskip0,8cm

169

\hskip0,8cm

170

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 724

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

171

\hskip0,8cm

172

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1313

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

173

\hskip0,8cm

174

\hskip0,8cm

175

\hskip0,8cm

176

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 310

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

177

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 964

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

178

\hskip0,8cm

179

\hskip0,8cm

180

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

181

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\hskip0,8cm

182

\hskip0,8cm

183

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

184

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 385

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\hskip0,8cm

185

\hskip0,8cm

186

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 437

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

187

\hskip0,8cm

188

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 749

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

189

\hskip0,8cm

190

\hskip0,8cm

191

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 792

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

192

\hskip0,8cm

193

\hskip0,8cm

194

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 911

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

195

\hskip0,8cm

196

\hskip0,8cm

197

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

198

\hskip0,8cm

199

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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<400> 133

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\vskip0.400000\baselineskip

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggtt agatcagatg aaaatag

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 134

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<211> 54

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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<400> 134

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\vskip0.400000\baselineskip

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ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cttattaata ttaaatcaga aacc

\hfill

54

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<210> 135

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<211> 52

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggta aatccgggtc ac

\hfill

52

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<210> 136

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<211> 51

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt ttctgtagtc agacctggat a

\hfill

51

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgggg aaggaaaatg ctgtg

\hfill

55

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc cttcagaata gcgtgtcaag tagc

\hfill

54

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<212> ADN

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgggg aagaagtgtg attt

\hfill

54

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt gtgagttaaa caacaaccgt

\hfill

50

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<212> ADN

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggtt aactcatgcg agaac

\hfill

55

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<212> ADN

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt ggattaagaa tgatgagact ca

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52

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggcg aataatcctc cg

\hfill

52

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<211> 51

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<212> ADN

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc actatcactc cccaacttct c

\hfill

51

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<212> ADN

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggag ggttcgtcgt c

\hfill

51

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<211> 49

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc caaaagaaga gcaacttca

\hfill

49

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgtat tgctcttctt cgatgc

\hfill

56

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<211> 52

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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\vskip0.400000\baselineskip

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ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg cttggtgtca tcttgagaat ag

\hfill

52

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<211> 54

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggca aagatgcaat tatc

\hfill

54

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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<400> 150

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\hfill

50

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggct atttcaaaag ctcttatc

\hfill

58

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<212> ADN

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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<400> 152

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ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg aggctagcgt agcactgg

\hfill

48

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgggg aagaagaaca agag

\hfill

54

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<213> secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

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\hfill

51

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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<400> 155

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggaa ttgcttgaca tgaac

\hfill

55

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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<400> 156

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53

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<210> 157

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<211> 54

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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\hfill

54

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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\hfill

50

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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<400> 159

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggag ttgtttgtca ctcca

\hfill

55

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<211> 49

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<212> ADN

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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<400> 160

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ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cagcgagtat caatggatc

\hfill

49

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<210> 161

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<211> 52

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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<400> 161

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgcaa ccgacagaga cg

\hfill

52

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<210> 162

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<211> 49

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<212> ADN

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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<400> 162

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ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg ctcgtccaac actaaggtt

\hfill

49

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<210> 163

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<212> ADN

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgaat agggaaaagt tgatg

\hfill

55

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<210> 164

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<212> ADN

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctctaagaag cagcagc

\hfill

47

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<212> ADN

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggag gacgacgacg ag

\hfill

52

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<212> ADN

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt gtcagctact tacattgccg

\hfill

50

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggcc accgtatctt c

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51

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<212> ADN

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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48

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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56

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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47

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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56

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggaa atctacacca tg

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52

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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<212> ADN

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggag tttggatctt ttc

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53

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggcg gagcagaaga gtac

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggcg aatccttggt g

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<212> ADN

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt caatacgaag gaggagca

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48

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggct ctcaatctcc gtc

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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\hfill

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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<400> 183

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgctg atgctgtgtg gg

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt ttcaacaatg ttcaacaaca ct

\hfill

52

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<212> ADN

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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<400> 185

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggtg aagttgatga tacg

\hfill

54

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<212> ADN

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt ttagtgcaac caaagagtc

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggag aaacagagta ctcaac

\hfill

56

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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<400> 188

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\vskip0.400000\baselineskip

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ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt tatgaaggtc tctttgtagc t

\hfill

51

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<210> 189

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<211> 58

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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<400> 189

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgaca actactgggt ctaattct

\hfill

58

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<211> 47

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<212> ADN

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

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<400> 190

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ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt caattctccg gcttcat

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 191

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 191

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggcg ctgcagaaca tt

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 192

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg caaagaaaag ttaggaggga a

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 193

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggcg gctaacaaat tcg

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 194

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 194

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg tcgttgttcc ttgcctcac

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 195

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgtca ctcttgttcc tcaatcc

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 196

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc cttctaccga tttctgtttc ttat

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 197

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggaa ggttcctcgt cag

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cacgatgtaa tcatgggc

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 199

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 199

\hskip0,8cm

200

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 200

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 200

\hskip0,8cm

201

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 201

\hskip0,8cm

202

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 202

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 202

\hskip0,8cm

203

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 203

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 203

\hskip0,8cm

204

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 204

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 204

\hskip0,8cm

205

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 205

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 205

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

206

\hskip0,8cm

207

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 206

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 385

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 206

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

208

\hskip0,8cm

209

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 207

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 207

\hskip0,8cm

210

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 208

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 208

\hskip0,8cm

211

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 209

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 209

\hskip0,8cm

212

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 210

\hskip0,8cm

213

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 211

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 211

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

214

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 212

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

215

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 213

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

216

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 214

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 214

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

217

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 215

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 215

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

218

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 204

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 216

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

219

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 217

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 420

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 217

\hskip0,8cm

220

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 218

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 218

\hskip0,8cm

221

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 219

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 219

\hskip0,8cm

222

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 220

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 220

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

223

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 221

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 221

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

224

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 222

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

225

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 223

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

226

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 224

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 224

\hskip0,8cm

227

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 225

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 225

\hskip0,8cm

228

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 226

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 226

\hskip0,8cm

229

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 227

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 227

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

230

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 393

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 228

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 229

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 516

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 229

\hskip0,8cm

232

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 230

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 276

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 230

\hskip0,8cm

233

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 645

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 231

\hskip0,8cm

234

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 450

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 232

\hskip0,8cm

235

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 233

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 233

\hskip0,8cm

236

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 870

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 234

\hskip0,8cm

237

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 235

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 235

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

238

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 236

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 363

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 236

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

239

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 237

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 237

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

240

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 238

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 354

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 238

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

241

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 426

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 239

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

242

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 240

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

243

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 241

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 241

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

244

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 242

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

245

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 243

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 243

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atagaattca tgaaagtttg tgaaaaggtg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 244

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atagaattcc tgaatgttct catggcaatg gat

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 245

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 245

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ataggatccc agctcaaaag gagtgctatt gaa

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 246

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 247

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcaca

\hfill

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 248

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 249

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atagaattca tgtccggtgt cgtacga

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 250

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 250

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ataggatccc acctccaatg tttctgcagc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 251

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atagaattcg agaagaaagg gcaatcaaga

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 252

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atactgcaga gaaatctcga tttcgactac

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 253

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 253

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccactctca tagggttctc catcg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 254

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcatgcctc caagatcctt gaagt

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 255

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggtcttggt cgttttactg tt

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 256

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 256

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaagacgat gacaacagat acagc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 257

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ataaactaaa tcttcgctga a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 258

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 258

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaacgcgga tctgaaaaac t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 259

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 259

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctctcttcc aaatctcc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 260

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 260

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagtctctca ctttctcact

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 261

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 261

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaagctctc aagatcaaag gctta

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 262

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttaacattgc aaagagtttc aaggt

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 263

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 263

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

246

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 264

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

247

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 265

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 265

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggccccaa ataatgattt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 266

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 266

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacacgggcc agagctgc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 267

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2, 3, 5, y 6

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminiácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Ile o Val

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminiácido o tramo o cualquiera de los dos aminoácidos posteriores

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 267

\hskip0,8cm

248

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 268

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminiácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Ile o Val

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 268

\hskip0,8cm

249

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 5, 6, 7

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminiácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 269

\hskip0,8cm

250

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2, 4, 5, 7

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminiácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 270

\hskip0,8cm

251

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 271

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4, 6, 7, 9

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminiácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 271

\hskip0,8cm

252

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 272

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminiácido o un tramo de cualquiera de dos de los aminoácidos posteriores

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 5, 7, 8, 9, 10

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminiácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Trp o Tyr

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 272

\hskip0,8cm

253

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 273

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = aminiácido o un tramo de cualquiera de dos de los aminoácidos posteriores

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Arg o Lys

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 273

\hskip0,8cm

254

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminiácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Arg o Lys

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 274

\hskip0,8cm

255

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 275

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminiácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Ile, Leu, Val o Met

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 275

\hskip0,8cm

256

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 276

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Ile, Leu, Val o Met

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminiácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 276

\hskip0,8cm

257

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 277

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 277

\hskip0,8cm

258

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 278

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser un tramo de cualquiera de los diez aminoácidos posteriores

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 278

\hskip0,8cm

259

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 279

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 279

\hskip0,8cm

260

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 280

\hskip0,8cm

261

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 281

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2, 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 281

\hskip0,8cm

262

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 282

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2, 4

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 282

\hskip0,8cm

263

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2, 4

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 283

\hskip0,8cm

264

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 284

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser un tramo de cualquiera de los siete aminoácidos posteriores

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser un tramo de cualquiera de los tres aminoácidos posteriores

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 284

\hskip0,8cm

265

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 285

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser un tramo de cualquiera de los seis aminoácidos posteriores

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser un tramo de cualquiera de los cuatro aminoácidos posteriores

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 285

\hskip0,8cm

266

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 286

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Asp, Asn o sin aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Gln o Glu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Arg o Gly

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = es Tyr o Asp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Leu o Phe

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Met, Ile, Leu o sin aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Asp o Asn

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Val o Ile

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = es Ser o Ala

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Lys o Arg

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Asp o Glu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Lys, Gln, Arg o sin aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Arg, Lys o Ile

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 286

\hskip0,8cm

267

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 287

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Gly o Asn

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Lys o Arg

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = His o Gln

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Met o Val

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Lys o Met

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Ile, o Val

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser un tramo de cualquiera entre cero a diecisiete aminoácidos posteriores

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Glu o Gln

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Val o Leu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Gln, Glu o sin aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Ser o sin aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Gly o Lys

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Arg, Ile o sin aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Ser o sin aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Asn o Lys

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Leu o Ile

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Val o Ile

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Ala o Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Glu o Gln

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 287

\hskip0,8cm

268

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Arg o Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Ile o Val

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3, 6, 8

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Gln o Lys

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Leu o Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 288

\hskip0,8cm

269

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Arg o Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Ile o Val

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3, 5, 8

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Gln o Lys

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser un tramo de cualquiera de los tres aminoácidos posteriores

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Leu o Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Leu o Met

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser un tramo de cualquiera de los cuatro o cinco aminoácidos posteriores

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Gln o His

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser un tramo de cualquiera de los cuatro o tres aminoácidos posteriores

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Val, Ile o Met

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Gln o Glu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 289

\hskip0,8cm

270

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 290

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1, 5

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Leu o Ile

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Val o Leu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7, 25

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser un tramo de cualquiera de los tres o cuatro aminoácidos posteriores

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Thr o Val

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser un tramo de cualquiera de los doce o catorce aminoácidos posteriores

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 14

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Glu o Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Met, Ile, Val o Leu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser un tramo de cualquiera de los dos aminoácidos posteriores

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Val o Ile

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Arg o Lys

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 290

\hskip0,8cm

271

Claims

1. Método para incrementar el rendimiento de un cultivo, mejorando la tasa de crecimiento o el tamaño de tejidos u órganos específicos en la planta, mejorando la tolerancia a las condiciones de estrés ambiental, o mejorando la tolerancia a los patógenos de la planta que comprende la modificación de la expresión en células particulares, tejidos u órganos de una planta de una secuencia genética que codifica una CCP, en donde dicha secuencia genética se selecciona del grupo que consiste de:

2. Método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde dicha secuencia genética está operativamente conectada a una secuencia promotora operable por la planta.

3. Método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde la modulación de la expresión de dicha secuencia genética resulta en la modificación de una o más características morfológicas, bioquímicas o fisiológicas incluida: (i) una modificación de la longitud de la fase G1 y/o la fase S y/o la fase G2 y/o la fase M del ciclo celular de una planta; (ii) una modificación de la transición de fase G1/S y/o S/G2 y/o G2/M y/o M/G1 de una célula de la planta; (iii) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la división celular; (iv) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la replicación del ADN; (v) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora del conjunto de semillas y/o tamaño de la semilla y/o desarrollo de la semilla; (vi) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la formación de tubérculos; (vii) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la formación de frutos; (viii) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la formación de hojas; (ix) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la iniciación y/o desarrollo de brotes; (x) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la iniciación y/o el desarrollo de las raíces; (xi) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la iniciación y/o el desarrollo de las raíces laterales; (xii) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la formación del nódulo; (xiii) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de lo tupido de la planta; (xiv) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora del enanismo en la planta; (xv) una modificación del inicio, promoción, estimulación o mejora de la senectud; (xvi) una modificación del grosor del tallo y/o de las características de resistencia y/o de resistencia al viento del tallo y/o de la longitud del tallo; (xvii) de modificación de la tolerancia y/o de la resistencia a estreses bióticos tales como infección por patógenos; y (xviii) de modificación de la tolerancia y/o de la resistencia a estreses abióticos tales como estrés por sequía o estrés por salinidad.

4. Método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde dichas condiciones de estrés ambiental incluyen sequía, salinidad, temperatura, o falta de nutrientes.

5. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de (i) hasta (viii) de la reivindicación 1.

6. Una célula huésped transfectada con el vector de la reivindicación 5, en donde dicha célula huésped comprende al menos un ácido nucleico como se define en cualquiera de (i) hasta (viii) de la reivindicación 1.

7. Una planta transgénica que comprende un polinucleótido heterólogo que contiene una molécula de ácido nucleico como se define en cualquiera de (i) hasta (viii) de la reivindicación 1.

8. La planta transgénica de la reivindicación 7, en donde la planta es una planta monocotiledónea.

9. La planta transgénica de la reivindicación 7, en donde la planta es una planta dicotiledónea.

10. La planta transgénica de la reivindicación 7, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de Arabidopsis thaliana, arroz, trigo, maíz, tomate, alfalfa, colza de semilla oleaginosa, soja, girasol, y canola.

11. Un método de acuerdo a la reivindicación 1, que comprende la introducción en la planta de una molécula de ácido nucleico para CCP o de un polipéptido como se define en la reivindicación 1.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 u 11, en donde la planta es una planta monocotiledónea.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 u 11, en donde la planta es una planta dicotiledónea.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 u 11, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de Arabidopsis thaliana, arroz, trigo, maíz, tomate, alfalfa, colza de semilla oleaginosa, soja, girasol, y canola.