ES2358124T3

ES2358124T3 - Plantas que tienen producción incrementada y un método para elaborar las mismas.

Info

Publication number: ES2358124T3
Application number: ES06723862T
Authority: ES
Inventors: Valerie Frankard; Vladimir Mironov
Original assignee: CropDesign NV
Current assignee: CropDesign NV
Priority date: 2005-03-25
Filing date: 2006-03-24
Publication date: 2011-05-05
Anticipated expiration: 2026-03-24
Also published as: MX2007011577A; DE602006018903D1; CA2602768A1; EP1883700B1; AU2006226460B2; BRPI0608761A2; CN101180398A; EP1883700A1; AU2006226460A1; ATE491797T1; WO2006100112A1; US20080163394A1

Abstract

Método para incrementar la producción de semillas de plantas con relación a plantas tipo natural correspondientes, que comprende incrementar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido (CYCD3) de ciclina D3 bajo el control de un promotor específico para endosperma, en donde dicha expresión incrementada se efectúa al (i) introducir mediante transformación un ácido nucleico que codifica CYCD3 bajo el control de un promotor específico para endosperma; y (ii) seleccionar plantas que tienen producción de semilla incrementada.

Description

La presente invención se relaciona de manera general con el campo de la biología molecular y se relaciona con un método para incrementar la producción de semillas de plantas con relación a plantas tipo natural correspondientes. más específicamente, la presente invención se relaciona con un método para incrementar la producción de semillas de plantas que comprende transformar una planta con un ácido nucleico que codifica un polipéptido ciclina D3 (CYCD3) bajo el control de un promotor específico para endosperma. La presente invención también se relaciona con plantas que comprenden un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido CYCD3 bajo el control de un promotor específico para endosperma, cuyas plantas tienen producción de semilla incrementada con relación a plantas tipo natural correspondientes. La invención también proporciona construcciones útiles en los métodos de la invención.

La población mundial aún incrementada y la disminución de la oferta de tierra arable disponible para la investigación de combustibles agrícolas hacia la mejora de la eficiencia de la agricultura. Los medios convencionales para el cultivo y las mejoras hortícolas utilizan técnicas de siembra selectivas para identificar plantas que tienen características deseables. Sin embargo, tales técnicas de siembra selectiva tienen varias desventajas, a saber que estas técnicas son típicamente de trabajo intenso y resultan en plantas que frecuentemente contienen componentes genéticos heterogéneos que no siempre resultan en el rasgo deseable que se pasa desde las plantas progenitoras. Los avances en la biología molecular han permitido a la humanidad modificar el germoplasma de animales y plantas. La ingeniería genética de plantas entra en el aislamiento y manipulación del material genético (típicamente en la forma de ADN o ARN) y la introducción posterior de ese material genético dentro de una planta. Tal tecnología tiene la capacidad de suministrar cultivos o plantas que tienen varios rasgos hortícolas, agronómicos o económicos mejorados.

Un rasgo de interés económico particular es la producción. La producción se define normalmente como la medición producida de valor económico de un cultivo y se puede definir en términos de cantidad y/o calidad. La producción depende directamente de varios factores, por ejemplo, el número y tamaño de los órganos, arquitectura de la planta (por ejemplo, el número de ramas), producción de semilla y más. El desarrollo de la raíz, la captación de nutrientes la tolerancia a la tensión también son factores importantes para determinar la producción. Optimizar uno de los factores mencionados anteriormente puede por lo tanto contribuir a incrementar la producción de cultivo.

Un rasgo de interés económico particular es la producción de semilla. Las semillas de planta son una fuente importante de nutrición humana y animal. Los cultivos tal como, maíz, arroz, trigo, canola y soya representan la mitad de la captación calórica humana total, a través del consumo directo de las semillas en sí mismas o a través del consumo de productos alimenticios que surgen en semillas procesadas.

Ellos también son una fuente de azúcares, aceites y muchos tipos de metabolitos utilizados en los procesos industriales. Las semillas contienen un embrión, la fuente de nuevos brotes y raíces después de germinación, y una endosperma, la fuente de nutrientes para el crecimiento del embrión, durante la germinación y el crecimiento temprano de semillas. El desarrollo de una semilla involucra muchos genes, y requiere la transferencia de metabolitos de raíces, hojas y tallos en la semilla que crece. La endosperma, en particular, asimila los precursores metabólicos de polímeros de carbohidrato, aceite y proteínas y los sintetiza en macromoléculas de almacenamiento para llenar el grano.

La capacidad para incrementar la producción de semilla, a través de alterar los rasgos relacionados con la semilla, tal como número de semillas, biomasa de semilla, desarrollo de la semilla, relleno de la semilla o cualquier otro rasgo relacionado con la semilla, o al incrementar el número y tamaño de los órganos de planta, o al influenciar la arquitectura de la planta (por ejemplo, el número de ramas), desarrollo de la raíz, captación de nutrientes o tolerancia a la tensión, tendría muchas aplicaciones en la agricultura, y aún muchos usos no agrícolas, tal como en la producción biotecnológica de sustancias tal como farmacéuticos, anticuerpos o vacunas.

Una de las formas en las que la producción de la planta se puede incrementar es al alterar los mecanismos de crecimiento inherentes de una planta. Los mecanismos de crecimiento inherentes de una planta residen en una secuencia altamente ordenada de eventos conocidos colectivamente como el ’ciclo celular’. La progresión a través del ciclo celular es fundamental para el crecimiento y desarrollo de todos los organismos multicelulares y es crucial para la proliferación celular. Los componentes principales del ciclo celular son altamente conservados en levadura, mamíferos, y plantas. El ciclo celular se divide típicamente en las siguientes fases secuenciales: G0 - G1 - S - G2

M. La replicación de ADN o síntesis generalmente tiene lugar durante la fase S ("S" es para la síntesis de ADN) y la segregación mitótica de los cromosomas ocurre durante la fase M (la "M" es para mitosis), con fases gap intervinientes, G1 (durante células que crecen antes de la replicación de ADN) y G2 (un periodo después de la replicación de ADN durante el cual la célula se prepara para la división). La división celular se completa después de citoquinesis, la última etapa de la fase M. Las células que han salido del ciclo celular y que han estado en reposo se dice que están en la fase G0. Las células en esta fase se pueden estimular para presentar el ciclo celular en la fase G1. La "G" en G1, G2 y G0 significa "espacio". La terminación del proceso de ciclo celular permite a cada célula hija durante la división celular recibir una copia completa del genoma progenitor.

La división celular se controla por dos eventos de ciclo celular principales, a saber el inicio de síntesis de ADN y el inicio de mitosis. Cada transición a cada uno de estos eventos clave se controla por un punto de revisión representado por los complejos de proteína específicos (involucrados en la replicación de ADN y división). La expresión de los genes necesarios para síntesis de ADN en el límite G1/S se regula por la familia E2F de los factores de transcripción en mamíferos y célula de plantas (La Thangue, 1994; Muller et al., 2001; De Veylder et al., 2002). La entrada en el ciclo celular se regula/activa por un complejo E2F/Rb que integra señales y permite la activación de la transcripción de los genes del ciclo celular. La transición entre las diferentes fases del ciclo celular, y por lo tanto la progresión a través del ciclo celular, se controla mediante la formación y activación de diferentes quinasas de proteína serina/treonina heterodiméricas, generalmente denominadas como quinasas dependientes de ciclina (CDK). Un prerrequisito para la actividad de estas quinasas es la asociación física con una ciclina específica, el tiempo de activación es principalmente dependiente de la expresión de ciclina. La unión de ciclina induce los cambios conformacionales en el lóbulo de Terminal N del CDK asociado y contribuye a la localización y especificidad de sustrato del complejo. Los CDK monoméricos se activan cuando ellos se asocian con ciclinas y así tienen una actividad quinasa. Los niveles de proteína ciclina fluctuan en el ciclo celular y por lo tanto representan un factor principal en determinar el tiempo de activación CDK. La activación periódica de estos complejos que contienen ciclinas y CDK durante el ciclo celular media la regulación temporal de las transiciones de ciclo celular (puntos de control).

Las ciclinas se pueden agrupar en ciclinas mitóticas (designadas ciclinas tipo A- y B en eucariotes mayores y CLB en gemación de levadura) y ciclinas específicas de G1 (designados ciclinas tipo D en mamíferos y CLN en gemación de levadura). Las ciclinas tipo H regulan la actividad de los CAK (quinasas que activan CDK). Todos los cuatro tipos de ciclinas conocidas en las plantas se identifican mayormente por analogía a sus contrapartes humanas. En Arabidopsis, se han descrito diez ciclinas tipo A, nueve tipo B, diez tipo D y una tipo H (Vandepoele et al., 2002).

Las diez ciclinas tipo D en Arabidopsis se subdividen en siete subclases, D1 a D7, que reflejan su falta de alta similitud de secuencia una con la otra, que está en contraste con las ciclinas tipo A y tipo B. Solo las subclases D3 y D4 tienen más de un miembro, respectivamente tres y dos. Se ha propuesto previamente la redundancia de las ciclinas tipo D3 como una explicación para la falla de observar fenotipos mutantes luego de modificar genéticamente una ciclina única tipo D3 (Swaminathan et al., 2000). Las dos ciclinas tipo D3 se ligan por medio de duplicación segmental reciente, que sugiere que estas son funcionalmente redundantes. Una hipótesis similar podría tener ciclinas tipo D4, debido a que dos de estas tres se ubican en un bloque duplicado.

La divergencia mucho mayor vista para las ciclinas tipo D que se compara con las ciclinas tipo A-y B puede reflejar el presunto papel de las ciclinas tipo D en integrar señales de desarrollo y pistas ambientales en el ciclo celular. Por ejemplo, las ciclinas tipo D3 han mostrado que responden a hormonas de plantas, tal como citoquininas y brasinoesteroides, mientras que el CYCD2 y CYCD4 se activan más temprano en G1 y reaccionan con disponibilidad de azúcar (para revisión, ver Stals and Inzé, 2001).

La sobreexpresión del gen CYCD2;1 en tabaco se reporta que incrementa la división celular e incrementa el índice de crecimiento de planta general sin alteraciones morfológicas (Cockcroft et al., 2000).

La sobreexpresión en Arabidopsis del gen CYCD3;1 bajo el control de un promotor CaMV 35S se reporta que da plantas con cotiledóneas alargadas, un tamaño de planta final dramáticamente reducido y desarrollo distorsionado. En un nivel celular, las células se empujan a G1, originando divisiones celulares ectópicas en ambas regiones meristemáticas y en regiones en las que la división celular está limitada o normalmente ausente. Este incremento en los números de células se acopla a una reducción en el tamaño de la célula (Dewitte et al., 2003).

Es un objeto de la presente invención resolver algunos de los problemas asociados con la expresión de la técnica anterior de CYCD3 en plantas.

Ahora se ha encontrado que transformar una planta con un ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3 bajo el control de un promotor específico para endosperma da plantas que tienen producción de semilla incrementada con relación a plantas tipo natural correspondientes en particular con relación a plantas transgénicas bajo el control de promotores que no son específicos para endosperma. Por lo tanto de acuerdo con una realización de la presente invención, se proporciona un método para incrementar la producción de semillas de plantas, que comprende transformar una planta con un ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3 bajo el control de un promotor específico de endosperma.

Ventajosamente, el desempeño de los métodos de acuerdo con la presente invención resulta en plantas que tienen producción de semilla incrementada, con relación a plantas tipo natural correspondientes.

El término "producción incrementada" como se define aquí significa un incremento en una cualquiera o más de los siguientes, cada uno con relación a plantas tipo natural correspondientes: (i) biomasa incrementada (peso) de una o más partes de una planta, que puede incluir partes aéreas (cosechable) y/o (cosechable) partes debajo de la tierra, especialmente biomasa de raíz incrementada; (ii) producción de semilla total incrementada, que incluye un incremento en la biomasa de semilla (peso de semilla) y que puede ser un incremento en el peso de semilla por planta y/o en una base de semilla individual y/o por hectárea o acre; (iii) número incrementado de flores ("flores") por panículo (iv) número incrementado de semillas (relleno); (v) tamaño de semilla incrementado, que también puede influenciar la composición de semillas; (vi) volumen de semilla incrementado, que también puede influenciar la composición de las semillas (que incluye aceite, proteína y contenido de carbohidrato total y composición); (vii) área de semilla individual incrementada y/o perímetro de semilla; (viii) longitud y/o ancho de semilla individual incrementado; (ix) índice de cosecha incrementado, que se expresa como una relación de la producción de partes cosechables, tal como semillas, sobre la biomasa total; y (x) peso de mil granos incrementado (TKW), que se extrapola de un número de semillas rellenas contadas y su peso total. Un TKW incrementado puede resultar de un tamaño de semilla incrementado y/o peso de semilla. Un TKW incrementado puede resultar de un aumento en el tamaño del embrión (peso) y/o tamaño de la endosperma (peso). Un incremento en el tamaño de la semilla, volumen de semilla, área de semilla y longitud de semilla puede ser debido a un incremento en partes específicas de una semilla, por ejemplo debido a un incremento en el tamaño del embrión y/o endosperma y/o aleurona y/o escutelo y/o cotiledóneas, u otras partes de una semilla.

Tomando el maíz como un ejemplo, se puede manifestar un incremento en la producción como uno o más de los siguientes: incremento en el número de plantas por hectárea o acre, un incremento en el número de espigas por planta, un incremento en el número de filas, número de granos por fila, peso de grano, peso de mil granos, diámetro/longitud de espigas, incremento en el índice de relleno de semilla (que es el número de semillas llenas dividido por el número total de semillas y multiplicado por 100), entre otros. Tomando el arroz como un ejemplo, un incremento en la producción se puede manifestar por un incremento en uno o más de los siguientes: número de plantas por hectárea o acre, número de panículas por planta, número de espigas por panículo, número de flores por panículo, incremento en el índice de relleno de semilla, incremento en TKW, entre otros. Un incremento en la producción también puede resultar en arquitectura modificada, o puede ocurrir como un resultado de la arquitectura modificada.

El desempeño de los métodos de la invención resulta en plantas que tienen producción de semilla incrementada. En particular, tal producción de semilla incrementada incluye número incrementado de flores por panículo, producción de semilla total incrementada, índice de cosecha incrementado y TKW incrementado, cada uno con relación a plantas tipo natural correspondientes. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para incrementar la producción de semilla en plantas, cuyo método comprende transformar una planta con un ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3 bajo el control de un promotor específico para endosperma.

Debido a que las plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención tienen producción de semilla incrementada, es fácil que estas plantas exhiban un índice de crecimiento incrementado (durante por lo menos parte de su ciclo de vida), con relación al índice de crecimiento de plantas tipo natural correspondientes en una etapa correspondiente en su ciclo de vida. El índice de crecimiento incrementado puede ser específico para una o más partes de una planta (incluyendo semillas), o pueden estar sustancialmente a lo largo de la planta completa. Una planta que tiene un índice de crecimiento incrementado puede aún exhibir florecimiento temprano. El aumento en el índice de crecimiento puede tener lugar en una o más etapas en el ciclo de vida de una planta o durante sustancialmente el ciclo de vida de la planta completa.

El índice de crecimiento incrementado durante las etapas tempranas en el ciclo de vida de una planta puede reflejar vigor mejorado. El aumento en el índice de crecimiento puede alterar el ciclo de cosecha de una planta lo que permite plantas que se sembrarán más tarde y/o se cosecharán antes de lo que sería de otra forma posible. Si el índice de crecimiento se aumenta suficientemente, este puede permitir la siembra adicional de semillas de la misma especie de planta (por ejemplo siembra y cosecha de plantas de arroz seguido por siembra y cosechas de plantas de arroz adicionales todas dentro de un periodo de crecimiento convencional). De forma similar, si el índice de crecimiento se aumenta suficientemente, esto puede permitir la siembra adicional de semillas de diferentes especies de plantas (por ejemplo la siembra y cosecha de plantas de arroz plantas seguido por, por ejemplo, la siembra y cosecha opcional de soya, papa o cualquier otra planta adecuada). También pueden ser posibles tiempos adicionales de cosecha para el mismo patrón en el caso de algunas plantas de cultivo. Alterar el ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un incremento en la producción de biomasa anual por acre (debido a un incremento en el número de tiempos (es decir en un año) que cualquier planta particular que se puede hacer crecer y cosechar). Un aumento en el índice de crecimiento también puede permitir el cultivo de plantas transgénicas en un área geográfica amplia que sus contrapartes tipo naturales, debido a que las limitaciones territoriales para hacer crecer un cultivo se determinan frecuentemente mediante condiciones ambientales adversas en el momento de plantar (estación temprana) o en el tiempo de cosechar (estación tardía). Tales condiciones adversas se pueden evitar si el ciclo de cosecha es más corto. El índice de crecimiento se puede determinar al derivar varios parámetros de las curvas de crecimiento, tales parámetros pueden ser: T-Mid (el tiempo tomado para plantas que alcanzan 50% de su tamaño máximo) y T-90 (tiempo tomado para plantas que alcanzan 90% de su tamaño máximo), entre otros.

Se describen aquí plantas que tienen un índice de crecimiento incrementado y un método para aumentar el índice de crecimiento de planta con relación al índice de crecimiento de plantas tipo natural correspondientes, cuyo método comprende transformar una planta con un ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3 bajo el control de un promotor específico para endosperma.

Un incremento en producción de semilla y/o el índice de crecimiento ocurren si la planta está bajo condiciones sin tensión o si se expone la planta a varias tensiones comparado con las plantas de control. Las Plantas típicamente responden a la exposición a la tensión al crecer más lentamente. En condiciones de tensión severa, la planta aún puede detener el crecimiento en conjunto. La tensión moderada, por otra parte, se define aquí como cualquier tensión a la cual se expone una planta que no resulta en cese de crecimiento de la planta en conjunto sin la capacidad de resumir el crecimiento. Debido a los avances en las prácticas agrícolas (irrigación, fertilización, tratamientos pesticidas) las tensiones severas no se encuentran frecuentemente en plantas de cultivo sembradas. Como una consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por tensión moderada es frecuentemente una característica indeseable para la agricultura. Las tensiones moderadas son tensiones típicas a las que se puede exponer una planta. Estas tensiones pueden ser las tensiones bióticas y/o abióticas diarias (ambientales) a las cuales se expone una planta. Las tensiones ambientales o abióticas típicas incluyen tensiones de temperatura originadas por temperaturas de frío/congelamiento o calor atípicas; tensiones de sal; tensiones de agua (sequía o exceso de agua). Los químicos también pueden originar tensiones abióticas. Las tensiones bióticas son típicamente aquellas tensiones originadas por patógenos, tal como bacterias, virus, hongos e insectos.

Ventajosamente, el desempeño de los métodos de la invención permite que se incremente la producción de semillas en cualquier planta.

El término "planta" como se utiliza aquí abarca plantas completas, ancestros y progenie de las plantas y partes de la planta, que incluyen semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (que incluyen tubérculos), flores, y tejidos y órganos, en donde cada uno de los mencionados anteriormente comprenden el gen/ácido nucleico de interés. El término "planta" también abarca célula de plantas, cultivos de suspensión, tejido calloso, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas, de nuevo en donde cada uno de los mencionados anteriormente comprende el gen/ácido nucleico de interés.

Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y plantas dicotiledóneas que incluyen forraje o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos de alimentos, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Doycnium rectum, Echinochloa pyramidalls, Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, Indigo incarnata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesii, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago sativa, Metasequola glyptostroboldes, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Omithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopls cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys varticillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorgo bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschla aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofa, espárragos, brócoli, col de bruselas, repollo, canola, zanahoria, coliflor, apio, col rizada, lino, col, lenteja, colza, ají turco, cebolla, papa, arroz, soya, fresa, remolacha, caña de azúcar, girasol, tomate, chayote, té y algas, entre otros.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo. Ejemplos de tales plantas de cultivo incluyen soya, girasol, canola, alfalfa, colza, algodón, tomate, papa y tabaco, entre otros. Adicionalmente preferiblemente, la planta es una planta monocotiledónea. Un tal ejemplo de una planta monocotiledónea es caña de azúcar. Más preferiblemente la planta es un cereal. Ejemplos de tales cereales incluyen arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, sorgo y avena.

Un polipéptido CYCD3 se puede identificar utilizando diferentes métodos. Por ejemplo, la secuencia de consulta de proteína puede ser BLASTed (por ejemplo, utilizando parámetros de penalidad BLAST para la penalidad de abertura espacio y la penalidad de extensión de espacio) contra una base de datos de secuencia de ácido nucleico Arabidopsis traducida. La primer conincidencia del resultado BLAST sería un polipéptido Arabidopsis CYCD3. Otro método para identificar un polipéptido CYCD3 es mediante la alineación de la secuencia de consulta con secuencias de proteína CYCD3 conocidas, utilizando por ejemplo el programa AlignX del Vector NTI suite (InforMax, Bethesda, MD). Las alineaciones múltiples luego se pueden llevar a cabo con una penalidad de abertura de espacio de 10 y una extensión de espacio de 0.01. La edición de manual menor de la alineación también puede ser necesaria con el fin de posicionar mejor algunas regiones conservadas. Si la secuencia de consulta es un polipéptido CYCD3, este se alienará con las secuencias de polipéptido CYCD3 conocidas.

Un "polipéptido CYCD3" como se define aquí se refiere a cualquier secuencia de polipéptido que, cuando se utiliza en la construcción de una ciclina o árbol filogenético de ciclina D, tal como uno descrito en la Fig. 1, cae dentro del grupo ciclina tipo D3 que incluye los polipéptidos CYCD3 (y no otras ciclinas tipo D, tal como ciclina D1, D2, D4, D5, D6 y D7). El desempeño de los métodos de la invención requiere el uso de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos CYCD3. La referencia aquí a un ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3 es a un ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3 como se definió anteriormente.

Una persona experta en la técnica podrá determinar fácilmente si cualquier secuencia de polipéptido en cuestión cae dentro de la definición mencionada anteriormente utilizando técnicas conocidas y software para la elaboración de tal un árbol filogenético, tal como un empaque GCG, EBI o CLUSTAL, utilizando parámetros predeterminados. Luego de la construcción de tal un árbol filogénetico, las secuencias agrupamiento en el grupo de ciclina tipo D3 se considerará que caen dentro de la definición de un "polipéptido CYCD3". Los ácidos nucleicos que codifican tales secuencias serán útiles en desarrollar los métodos de la invención.

Las ciclinas tipo D3 tienen típicamente la capacidad de unir y activar plantas CDK y Rb. En adición a un cuadro de ciclina y un motivo LxCxE dentro de los primeros 40 o aminoácidos (que es característico de la mayoría de cilcinas tipo D), las ciclinas tipo D3 pueden comprender una o más y preferiblemente todas las regiones conservadas identificadas por los cuadros mostrados en las Figuras 2 y 6. Como se muestra en las Figuras 2 y 6, se permite un emparejamiento erróneo dentro de los cuadros.

Ejemplos de ácidos nucleicos que codifica los polipéptidos CYCD3 que caen bajo la definición mencionada anteriormente de un polipéptido CYCD3 se dan en la Tabla 1 adelante. El ácido nucleico que codifica los CYCD3 mostrado en la Tabla 1 puede ser útil en desarrollar los métodos de la invención, es decir para obtener plantas que tienen producción de semilla mejorada con relación a plantas tipo natural correspondientes al transformar una planta con uno cualquiera de estos ácidos nucleicos bajo el control de un promotor específico para endosperma. Las variantes del ácido nucleico que codifica los CYCD3 de la Tabla 1 también son ventajosamente útiles en los métodos de la invención. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 48 o las variantes se prefieren para uso en los métodos de la presente invención.

Las variantes de un ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3 como se define aquí típicamente aseguran una porción sustancial de la proteína completa que puede comprender en adición a un cuadro de ciclina y un motivo LxCxE dentro de los primeros 40 o aminoácidos (que es una característica de la mayoría de ciclinas tipo D), una o más y preferiblemente todas las regiones conservadas identificadas por los cuadros mostrados en las Figuras 2 y 6 (como se muestra en las Figuras 2 y 6, se permite un ajuste erróneo dentro de los cuadros).

Ejemplos de polipéptidos CYCD3 como se definió aquí anteriormente se muestran en la Tabla 1 (codificado por las secuencias de polinucleótido con número de acceso NCBI). La secuencia de polipéptido CYCD3 preferida para el desempeño de la invención se representa por la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 49 o una porción sustancial del mismo.

Los polipéptidos CYCD3 pueden ser la proteína completa codificada por los ácidos nucleicos, o pueden ser porciones de la proteína codificada. Preferiblemente, los ácidos nucleicos proporcionados aquí codifican los polipéptidos CYCD3 que constituyen una porción sustancial de la proteína completa que comprende, en adición a un cuadro de ciclina y un motivo LxCxE dentro de los primero 40 o aminoácidos (que es una característica de la mayoría de ciclinas tipo D), una o más y preferiblemente todas las regiones conservadas identificadas por los cuadros mostrados en las Figuras 2 y 6 (como se muestra en las Figuras 2 y 6, se permite un ajuste erróneo dentro de los cuadros). La porción se puede utilizar en forma aislada o esta se puede fusionar a otras secuencias codificantes (o no codificantes) con el fin de, por ejemplo, producir una proteína que combina varias actividades.

Cuando se fusiona a otras secuencias codificantes, el polipéptido resultante producido luego de traducción puede ser más grande que el predicho para el fragmento CYCD3.

Tabla 1: Ejemplos de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos CYCD3 También son útiles en los métodos de la presente invención las variantes del ácido nucleico que codifica los CYCD3 proporcionados aquí. Tales variantes se pueden derivar de cualquier fuente natural o artificial. El ácido nucleico/gen

Nombre: Número de acceso de ácido nucleico NCBI Fuente SEQ ID NO de ácido nucleico SEQ ID NO de polipéptido

Antma_cycD3a: AJ250397 Antirrhinum majus SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7

Antma_cycD3b: AJ250398 Antirrhinum majus SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9

Arath_CYCD3;1: NM_119579.2 Arabidopsis thaliana SEQ ID NO:10 SEQ ID NO: 11

Arath_CYCD3;2: NM_126126.2 Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13

Arath_CYCD3;3: NM_114867.2 Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2

Eupes_cycD3;2: AY340588 Euphorbia esula SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15

Eupes_cycD3;1: AY340589 Euphorbia esula SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17

Helan_cycD3: AY033440 Helianthus annuus SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 19

Heltu_cycD3;1: AY063461 Helianthus tuberosus SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21

Lagsi_cycD3;1: AF519810 Lagenaria siceraria SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23

Lagsi_cycD3;2: AF519811 Lagenaria siceraria SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25

Lyces_cycD3;1: AJ002588 Lycopersicum esculentum SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27

Lyces_cycD3;2: AJ002589 Lycoperslcum esculentum SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29

Lyces_cycD3;3: AJ002590 Lycopersicum esculentum SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 31

Medsa_cycD3: X88864 Medicago sativa SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33

Nicta_cycD3;1: AJ011893 Nicotlana tabacum SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 35

Nicta_cycD3;2: AJ011894 Nicotiana tabacum SEQ ID NO: 36 SEQ ID NO: 37

Nicta_cycD3;3: AB015222 Nicotiana tabacum SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 39

como Orysa_cycD3: AK103499.1 Oryza sativa SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 41

Plssa_cycD3: AB008188 Pisum sativum SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 43

Popal_cycD3: AY230139 Populus alba SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 45

Poptr_cycD3: AF181993 Populus tremula x Populus tremuloides SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 47

*Arath_ cycD3_modificado: NA Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 49

Aqufo_CycD3: DT755971.1 DT749271 Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 51

Camsi_CycD3: AB247282 Camellia sinensis SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 53

Camsi_CycD3;2: AB247283 Camellia sinensis SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 55

Citsi_CycD3: CX676162 CX676163 Citrus sinensis SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 57

Glyma_CycD3: AY439098 Glycine max SEQ ID NO: 58 SEQ ID NO: 59

Goshi_CycD3: DT571998 DT543827.1 Gossypium hirsutum SEQ ID NO: 60 SEQ ID NO: 61

Lotco_CycD3: AP008090 Lotus corniculatus SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 63

Medtr_CycD3: DY615448.1 Medicago trunculata SEQ ID NO: 64 SEQ ID NO: 65

Scuba_CycD3: AB205135.1 Scutellarla baicalensis SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 67

Zeama_CycD3 como 2: DV509394.1 DV028752.1 Zea mays SEQ ID NO: 68 SEQ ID NO: 69

Zeama_CycD3 como 3: DT948601.1 DT642394.1 Zea mays SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 71

*No contiene codón de parada, que genere un transcripto mayor; la porción extra resultante no se considera que afecta la función comparado con una secuencia no modificada correspondiente (SEQ ID NO: 2).

o su variante se puede asilar de una fuente microbiana, tal como levadura u hongos, o de una fuente de planta,

5 algas o animal (que incluyen humano). Este ácido nucleico se puede modificar de su forma nativa en el ambiente de la composición y/o genómico a través de la manipulación humana deliberada. El ácido nucleico es preferiblemente de origen de planta, de la misma especie de planta (por ejemplo a uno de los cuales este se introduce) o de una especie diferente de planta. El ácido nucleico se puede aislar de una especie dicotiledónea, preferiblemente de la familia Brassicaceae, adicionalmente preferiblemente de Arabidopsis thaliana. Más preferiblemente, el ácido

10 nucleico que codifica CYCD3 que se aísla de Arabldopsis thaliana se representa por la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 48, y la secuencia de polipéptido CYCD3 es como se representa por la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 49.

Un ejemplo de una variante de un ácido nucleico que codifica CYCD3/gen es un ácido nucleico capaz de hibridar bajo condiciones de exigencia reducida, preferiblemente bajo condiciones exigentes, con un ácido nucleico que codifica CYCD3/gen que codifica un polipéptido que, cuando se utiliza en la construcciónde una ciclina o un árbol 15 filogenético de ciclina D en un grupo de ciclina tipo D3 que incluye el CYCD3 como en la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 49. Preferiblemente, una variante de un ácido nucleico que codifica CYCD3/gen es un ácido nucleico capaz de hibridar con un ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3, cuyo polipéptido comprende, en adición al cuadro de ciclina y un motivo LxCxE dentro de los primeros 40 o aminoácidos, una o más y preferiblemente todas las regiones conservadas identificadas por los cuadros mostrados en las Figuras 2 y 6 (como se muestra en las Figuras

20 2 y 6, se permite un ajuste erróneo dentro de los cuadros). Se prefiere un ácido nucleico capaz de hibridar con un ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 48. También son útiles en los métodos de la invención cualquier ácido nucleico capaz de hibridar con cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican CYCD3 mostrados en la Tabla 1.

El término "hibridación" como se define aquí es un proceso en donde las secuencias de nucleótido complementarias

25 sustancialmente homólogas hibridan una con la otra. El proceso de hibridación puede ocurrir completamente en la solución, es decir ambos ácidos nucleicos complementarios están en la solución. El proceso de hibridación también puede ocurrir con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en una matriz tal como glóbulos magnéticos, glóbulos de Sefarosa o cualquier otra resina. El proceso de hibridación puede ocurrir adicionalmente

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con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en un soporte sólido tal como una nitrocelulosa o membrana de nylon o se inmoviliza mediante por ejemplo fotolitografía en, por ejemplo, un soporte vítreo silíceo (el último conocido como disposiciones o microdisposiciones de ácido nucleico o como trozos de ácido nucleico). Con el fin de permitir que ocurra la hibridación, las moléculas de ácido nucleico generalmente se desnaturalizan térmicamente o químicamente para fusionar una cepa doble en dos únicas cepas y/o para remover las horquillas u otras estructuras secundarias de ácidos nucleicos monocatenarios. La exigencia de la hibridación se influencia mediante condiciones tal como temperatura, concentración de sal, resistencia iónica y composición de amortiguador de hibridación.

"Condiciones de hibridación exigentes" y "condiciones de lavado de hibridación exigentes" en el contexto de los experimentos de hibridación de ácido nucleico tal como hibridaciones Southern y Northern son dependientes de secuencia y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. Una persona experta en la técnica tendrá en cuenta varios parámetros que se pueden alterar durante hibridación y lavado y que mantendrán o cambiarán las condiciones exigentes.

El Tm es la temperatura bajo resistencia iónica definida y pH, en la que 50% de la secuencia objetivo hibrida a una sonda perfectamente emparejada. El Tm es dependiente de las condiciones de solución y la composición base y la longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias mayores hibridan específicamente a altas temperaturas. El índice máximo de hibridación se obtiene de aproximadamente 16°C hasta 32°C por debajo de Tm. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reducen la repulsión electrostática entre las dos cepas ácido nucleico por lo cual promueven la formación de híbrido; este efecto es visible para concentraciones de sodio de hasta 0.4M. La formamida reduce la temperatura de fusión de los dúplex de ADN-ADN y ADN-ARN con 0.6 a 0.7°C para cada porcentaje de formamida, y la adición de 50% de formamida permite desarrollar hibridación de 30 a 45°C, aunque el índice de hibridación será más bajo. Los emparejamientos incorrectos de par base reducen el índice de hibridación y la estabilidad térmica de los dúplex. En promedio y para sondas grandes, el Tm reduce aproximadamente 1°C por % de base de emparejamiento incorrecto. El Tm se puede calcular utilizando las siguientes ecuaciones, dependiendo de los tipos de híbridos:

1.: Híbridos ADN-ADN (Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984):

2.: Híbridos de ADN-ADN o ARN-ARN:

3.: Híbridos oligo-ADN o oligo-ARNd:

imagen1

Para <20 nucleótidos: Tm= 2 (In)

Para 20-35 nucleótidos: Tm= 22 + 1.46 (In)

a o para otro catión monovalente, pero solo exacto en el rango 0.01-0.4 M.

b solo exacto para %GC en el rango de 30% a 75%.

c L = longitud de dúplex en pares base.

d Oligo, oligonucleótido; In, longitud efectiva del cebador = 2X(no. de G/C)+(no. de A/T).

Nota: para cada 1 % de formamida, el Tm se reduce mediante aproximadamente 0.6 a 0.7°C, aunque la presencia de 6 M de urea reduce el Tm mediante aproximadamente 30°C

La especificidad de hibridación es típicamente la función de lavados post-hibridación. Para remover el antecedente resultante de la hibridación no específica, las muestras se lavan con soluciones de sal diluidas. Los factores críticos de tales lavados incluyen la resistencia iónica y la temperatura de la solución de lavado final: la concentración de sal menor y la temperatura de lavado mayor, la exigencia mayor del lavado. Las condiciones de lavado típicamente se desarrollan en o por debajo de la exigencia de hibridación. Generalmente, las condiciones exigentes adecuadas para los ensayos de hibridación de ácido nucleico o procedimientos de detección de amplificación de gen son como se establecieron anteriormente. Las condiciones de mayor o menor exigencia también se pueden seleccionar. Generalmente, las condiciones de exigencia baja se seleccionan por ser aproximadamente 50°C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica en una resistencia iónica definida y pH. Las condiciones de exigencia medias son cuando la temperatura es 20°C por debajo de Tm, y las condiciones de alta exigencia son cuando la temperatura es 10°C por debajo de Tm. Por ejemplo, las condiciones exigentes son aquellas que son por lo menos tan exigentes como, por ejemplo, las condiciones A-L; y las condiciones exigentes reducidas son por lo menos tan exigentes como, por ejemplo, las condiciones M-R. La unión no específica se puede controlar utilizando cualquiera de un número de técnicas conocidas tal como, por ejemplo, bloquear la membrana con las soluciones que contienen proteína, adicionales de ARN heterólogo, ADN, y SDS para el amortiguador de hibridación, y el tratamiento con RNasa. Ejemplos de hibridación y condiciones de lavado se listan en la Tabla 2 adelante.

Tabla 2: Ejemplos de hibridación y condiciones de lavado Para los propósitos de definir el nivel de exigencia, se puede hacer referencia a Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ra Edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989).

Condición exigente: Híbrido de polinucleótido ± Longitud del híbrido (bp) ± Temperatura de hibridación y amortiguador Temperatura de lavado y amortiguador

A: ADN:ADN > o igual a 50 65°C 1_SSC; o 42°C, 1XSSC y 50% de formamida 65°C; 0.3_SSC

B: ADN:ADN <50 Tb*; 1XSSC Tb*; 1XSSC

C: ADN:ARN > o igual a 50 67°C 1XSSC; o 45°C, 1XSSC y 50% de formamida 67°C; 0.3XSSC

D: ADN:ARN <50 Td*; 1XSSC Td*; 1XSSC

E: ARN:ARN > o igual a 50 70°C 1XSSC; o 50°C, 1XSSC y 50% de formamida 70°C; 0.3XSSC

F: ARN:ARN <50 Tf*; 1XSSC Tf*; 1XSSC

G: ADN:ADN > o igual a 50 65°C 4_SSC; o 45°C, 4_SSC y 50% de formamida 65°C; 1XSSC

H: ADN:ADN <50 Th*; 4 _SSC Th*; 4_SSC

I: ADN:ARN > o igual a 50 67°C 4_SSC; o 45°C, 4_SSC y 50% de formamida 67°C; 1XSSC

J: ADN:ARN <50 Tj*: 4 _SSC Tj*; 4 _SSC

K: ARN:ARN > o igual a 50 70°C 4XSSC; o 40°C, 6XSSC y 50% de formamida 67°C; 1XSSC

L: ARN:ARN <50 T1*; 2 _SSC T1*; 2XSSC

M: ADN:ADN > o igual a 50 50°C 4XSSC; o 40°C, 6XSSC y 50% de formamida 50°C; 2XSSC

N: ADN:ADN <50 Tn*; 6XSSC Tn*; 6XSSC

O: ADN:ARN > o igual a 50 55°C 4XSSC; o 42°C, 6XSSC y 50% de formamida 55°C; 2XSSC

P: ADN:ARN <50 Tp*; 6XSSC Tp*; 6XSSC

Q: ARN:ARN > o igual a 50 60°C 4XSSC; o 45°C, 6XSSC y 50% de formamida 60°C.; 2XSSC

R: ARN:ARN <50 Tr*; 4 XSSC Tr*; 4XSSC

‡ La "longitud de híbrido" es la longitud anticipada para el ácido nucleico hibridizante. Cuando los ácidos nucleicos de la secuencia conocida se hibridan, la longitud del híbrido se puede determinar al alinear las secuencias e identificar las regiones conservadas descritas aquí. † SSPE (1XSSPE es 0.15M NaCl, 10mM NaH2PO4, y 1.25mM EDTA, pH7.4) se puede sustituir por SSC (1XSSC es 0.15M NaCl y 15mM citrato de sodio) en la hibridación y amortiguadores de lavado; los lavados se desarrollan durante 15 minutos después que se completa la hibridación. Las hibridaciones y los lavados incluyen adicionalmente reactivo 5 X Denhardt, 0.5-1.0% SDS, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado, 0.5% de pirofosfato de sodio, y hasta 50% de formamida. * Tb-Tr: La temperatura de hibridación para los híbridos que se anticipa por ser menos de 50 pares base en longitud debe ser 5-10°C menos que la temperatura de fusión Tm de los híbridos; el Tm se determina de acuerdo con las ecuaciones mencionadas anteriormente. ± La presente invención también abarca la sustitución de uno cualquiera, o más patrones de híbrido de ADN o ARN con un PNA, o un ácido nucleico modificado.

5 Los ácidos nucleicos que codifican "homólogos" de un polipéptido CYCD3 también pueden ser útiles en la presente invención. Los homólogos abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácido, con relación a la proteína no modificada en cuestión y tiene similar actividad funcional y biológica como la proteína no modificada de la cual ellos se derivan. Para producir tales homólogos, los aminoácidos de la proteína se pueden reemplazar por otros aminoácidos que tienen

10 propiedades similares (tal como hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión similar para formar o romper estructuras helicoidales α o estructuras de lámina β). Las tablas de sustitución conservadora son bien conocidas en la técnica (ver por ejemplo Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company y Tabla 3 adelante).

El término "homólogo" también abarca dos formas especiales de homología, que incluyen secuencias ortólogas y secuencias parálogas, que abarcan conceptos evolucionarios utilizados para describir las relaciones ancestrales de

15 los genes. El término "parálogos” se relaciona con duplicados de gen dentro del genoma de una especie que conduce a genes parálogos. El término "ortólogo" se relaciona con genes homólogos en diferentes organismos debido a especiación. Ejemplos de homólogos de un polipéptido CYCD3 se dieron en la Tabla 1 aquí anteriormente.

Los ortólogos en, por ejemplo, especies de plantas monocotiledóneas se pueden encontrar fácilmente al desarrollar una búsqueda blast recíproca así llamada. Esto se puede hacer mediante un primer blast que involucra hacer una 20 búsqueda blast de una secuencia de consulta (por ejemplo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 48 o SEQ ID NO: 49) contra cualquier base de datos de secuencia, tal como la base de datos NCBI públicamente disponible que se puede encontrar en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Se puede utilizar BLASTn o TBLASTX cuando se parte de secuencia de nucleótido, o BLASTP o TBLASTN cuando se parte de la proteína, con valores predeterminados estándar. Los resultados BLAST se pueden filtrar opcionalmente. Las secuencias de longitud completa de los 25 resultados filtrados o los resultados no filtrados se les práctica nuevamente búsqueda BLAST (segundo BLAST) contra las secuencias del organismo de las cuales se deriva la secuencia de consulta. Los resultados de los primeros y segundos BLAST luego se comparan. Un parálogo se identifica si una coincidencia de alto nivel del segundo blast es de la misma especie como de la que se deriva la secuencia de consulta; un ortólogo se identifica si una coincidencia de alto nivel no es de la misma especie como de la que se deriva la secuencia de consulta. Las

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coincidencias de alto nivel son aquellas que tienen un valor E bajo. El valor E inferior, la clasificación más significativa (o en otras palabras, menor será la posibilidad de que la coincidencia sea encontrada por casualidad). La computación del valor E es bien conocido en la técnica. En el caso de familias grandes, se puede utilizar ClustalW, seguido por un árbol de unión vecino, para ayudar a visualizar el agrupamiento de los genes relacionados y para identificar los ortólogos y parálogos.

Los ortólogos y parálogos identificados como se describió aquí anteriormente son útiles en desarrollar los métodos de la invención. De acuerdo con la invención, se proporciona un método para incrementar la producción de semillas de plantas, que comprende transformar una planta con un ácido nucleico que codifica un ortólogo o un parálogo de un polipéptido CYCD3 representado por la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 49, cuyo ácido nucleico está bajo el control de un promotor específico para endosperma.

Un homólogo puede estar en la forma de una "variante sustitucional" de una proteína, es decir en donde por lo menos un residuo en una secuencia de aminoácido se ha removido y un residuo diferente se inserta en su lugar. Las sustituciones de aminoácido son típicamente de residuos únicos, pero se puede agrupar dependiendo de las restricciones funcionales colocadas en el polipéptido; las inserciones serán usualmente del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoácido. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácido comprenden sustituciones de aminoácido conservadoras. Las tablas de sustitución conservadora están fácilmente disponibles en la técnica. La Tabla 3 adelante da ejemplos de sustituciones de aminoácido conservadas.

Tabla 3: Ejemplos de sustituciones de aminoácido conservadas

Residuo: Sustituciones conservadoras Residuo Sustituciones conservadoras

Ala: Ser Leu Ile; Val

Arg: Lys Lys Arg; Gln

Asn: Gln; His Met Leu; Ile

Asp: Glu Phe Met; Leu; Tyr

Gln: Asn Ser Thr; Gly

Cys: Ser Thr Ser; Val

Glu: Asp Trp Tyr

Gly: Pro Tyr Trp; Phe

His: Asn; Gln Val Ile; Leu

Ile: Leu, Val

Un homólogo también puede estar en la forma de una "variante insercional" de una proteína, es decir en donde se introducen uno o más residuos de aminoácido en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones de terminal N y/o de terminal C así como también inserciones intra-secuencia de únicos o múltiples aminoácidos. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de polipéptido serán más pequeñas que las fusiones de terminal N- o C, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Ejemplos de proteínas o péptidos de fusión de terminal N- o C incluyen el dominio de unión o el dominio de activación de un activador transcripcional como se utiliza en el sistema de dos híbridos de levadura, proteínas de recubrimiento de fago, etiqueta (histidina)-6-, etiqueta glutationa S-transferasa, proteína A, proteína de unión a maltosa, dihidrofolato reductasa, etiqueta de epítopo -100, epítopo c-myc, epítopo FLAG®, lacZ, CMP (péptido de unión a calmodulina), epítopo HA, epítopo de proteína C y epítopo VSV.

Los homólogos en la forma de "variantes de eliminación" de una proteína se caracterizan por la remoción de uno o más aminoácidos de una proteína.

Las variantes de polipéptido de una proteína se pueden hacer fácilmente utilizando técnicas sintéticas de péptido bien conocidas en la técnica, tal como síntesis de péptido de fase sólida y similares, o mediante manipulaciones de ADN recombinante. Los métodos para la manipulación de las secuencias de ADN para producir variantes de sustitución, inserción o eliminación de una proteína son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las técnicas para hacer las mutaciones de sustitución en los sitios predeterminados en el ADN son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen mutagenia M13, mutagenia T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH), mutagenia Dirigida a Sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagenia dirigida a sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagenia dirigida a sitio.

El polipéptido CYCD3 puede ser un derivado. "Derivados" de una proteína abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que comprenden residuos de aminoácido de ocurrencia natural alterados (glicosilados, acilados, ubiquinatados, prenilados, fosforilados, miristoilados, sulfatados etc.) o alterados de ocurrencia no natural comparado con la secuencia de aminoácido de una forma de ocurrencia natural del polipéptido. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes de no aminoácido o adiciones comparado con la secuencia de aminoácido de la cual este se deriva, por ejemplo una molécula indicadora u otro ligando, unido covalentemente o no covalentemente a la secuencia de aminoácido, tal como una molécula indicadora que se vincula para facilitar su detección, y los residuos de aminoácido de ocurrencia no natural con relación a la secuencia de aminoácido de una proteína de ocurrencia natural.

El polipéptido CYCD3 se puede codificar por una variante de división alternativa de un ácido nucleico que codifica CYCD3/ gen. El término "variante de división alternativa" como se utiliza aquí abarca variantes de una secuencia de ácido nucleico en la cual los intrones y/o exones seleccionados se han cortado, mantenido, reemplazado o agregado, o en la cual los intrones se han acortado o alargado. Tales variantes serán unas en las que la actividad biológica de la proteína se retiene, que se puede lograr mediante segmentos funcionales que se retienen selectivamente de la proteína. Tales variantes de división se pueden encontrar en la naturaleza o se pueden hacer por el hombre. Los métodos para elaborar tales variantes de división son bien conocidos en la técnica.

De acuerdo con la invención, se proporciona un método para incrementar la producción de semillas de plantas, que comprende transformar una planta con una variante de división de un ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3 bajo el control de un promotor específico para endosperma.

Las variantes de división preferidas son variantes de división de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que, cuando se utiliza en la construcción de una ciclina o árbol filogenético de ciclina D, cae dentro del grupo tipo D3 que incluye el CYCD3 representado por la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 49. Tales variantes de división pueden ser variantes de división de cualquiera de los ácidos nucleicos mencionados en la Tabla 1 anterior. Las variantes de división de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 48 se prefieren particularmente para uso en los métodos de la invención.

El polipéptido CYCD3 también se puede codificar por una variante alélica de un ácido nucleico que codifica CYCD3/gen. Las variantes alélicas que existen en la naturaleza, y se abarcan dentro de los métodos de la presenteinvención es el uso de estos alelos naturales. Las variantes alélicas abarcan Polimorfismos de Nucleótido Únicos (SNP), así como también Polimorfismos de Inserción/Eliminación Pequeños (INDEL). El tamaño de los INDEL es usualmente menos que 100 bp. Los SNP y INDEL forman el conjunto mayor de las variantes de secuencia en las cepas polimórficas de ocurrencia natural de la mayoría de organismos.

De acuerdo con la invención, se proporciona un método para incrementar la producción de semillas de plantas, que comprende transformar una planta con una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3 bajo el control de un promotor específico para endosperma.

Las variantes alélicas preferidas son variantes alélicas de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que, cuando se utiliza en la construcción de una ciclina o árbol filogenético de ciclina D cae dentro del grupo tipo D3 que incluye el CYCD3 como en la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 49. Tales variantes alélicas pueden ser variantes alélicas de cualquiera de los ácidos nucleicos mencionados en la Tabla 1 anterior. Las variantes alélicas de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 48 se prefieren particularmente para uso en los métodos de la invención.

La mutagenia dirigida a sitio y la evolución dirigida son ejemplos de tecnologías que permiten la generación de variantes CYCD3 novedosas.

Varios métodos están disponibles para alcanzar la mutagenia dirigida a sitio, los métodos con base en PCR más comunes (protocolos actuales en molecular biology. Wiley Eds. http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html).

La evolución dirigida, también conocida como mezcla génica, también se puede utilizar para generar variantes de ácido nucleico que codifica los CYCD3. Esto consiste de iteraciones de mezcla de ADN seguido por detección apropiada y/o selección para generar variantes de ácido nucleico que codifica los CYCD3 o sus porciones que codifican los polipéptidos CYCD3 o sus porciones que tienen actividad biológica modificada (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151-4; patentes US 5,811,238 y 6,395,547).

Por lo tanto, el ácido nucleico introducido dentro de una planta puede ser uno obtenido a través de las técnicas de mutagenia dirigida a sitio o evolución dirigida o cualquier otro método conocidos para la generación de tales secuencias de variante.

El ácido nucleico a ser introducido dentro de una planta puede ser un ácido nucleico de longitud completa o puede ser una secuencia variante como se definió aquí anteriormente. De acuerdo con un aspecto preferido de la presente invención, se prevé que incrementa la expresión del ácido nucleico que codifica CYCD3. Los métodos para incrementar la expresión de los genes o productos de gen están bien documentados en la técnica e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión dirigida por promotores apropiados, el uso de mejoradores de transcripción o mejoradores de traducción. Los ácidos nucleicos aislados que sirven como elementos promotores o mejoradores se puede introducir en una posición apropiada (típicamente en la dirección 5’) de una forma no heteróloga de un polinucleótido con el fin de sobreregular la expresión de un ácido nucleico que codifica CYCD3 o su variante. Por ejemplo, los promotores endógenos se pueden alterar in vivo mediante mutación, eliminación, y/o sustitución (ver, Kmiec, Patente U.S. No. 5,565,350; Zarling et al., WO 93/22443), o los promotores aislados se pueden introducir dentro de una célula de planta en la orientación y distancia apropiada de un gen de la presente invención con el fin de controlar la expresión del gen. Los métodos para reducir la expresión de los genes o productos de gen están bien documentados en la técnica.

Si se desea la expresión del polipéptido, es generalmente preferible incluir una región de poliadenilación en el extremo 3’ de una región que codifica el polinucleótido. La región de poliadenilación se puede derivar del gen natural, de una variedad de otros genes de planta, o de T-ADN. La secuencia de extremo 3’ a ser agregada se puede derivar de, por ejemplo, los genes de sintasa nopalina o sintasa octopina, o alternativamente de otro gen de planta, o menos preferiblemente de cualquier otro gen eucariótico.

También se puede agregar una secuencia de intrón a la región no traducida 5’ o la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para incrementar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón divisible en la unidad de transcripción en las construcciones de expresión de planta y animal ha mostrado que incrementa la expresión de gen en los niveles de mARN y proteína hasta 1000 veces, Buchman y Berg, Mol. Cell biol. 8:4395-4405 (1988); Callis et al., Genes Dev. 1:1183-1200 (1987). Tal mejoramiento de intrón se la expresión de gen es típicamente mayor cuando se coloca cerca al extremo 5’ de la unidad de transcripción. Se conoce en la técnica el uso de los intrones de maíz Adh1-S Intrón 1, 2, y 6, el intrón Bronze-1. Ver generalmente, The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

La invención también proporciona construcciones genéticas y vectores para facilitar la introducción y/o expresión de las secuencias de nucleótido útiles en los métodos de acuerdo con la invención.

Por lo tanto, se proporciona una construcción de gen que comprende:

(i): Un ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3;

(ii): una o más secuencias de control específicas para endosperma que conducen la expresión del ácido nucleico de

(i): en la endosperma de semillas; y opcionalmente

(iii) Una secuencia de terminación de transcripción.

El ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3 puede ser cualquier ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3 como se definió aquí anteriormente. Particularmente se prefieren los ácidos nucleicos descritos en la Tabla 1, particularmente el ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 48. También se prefieren variantes de ácido nucleico de los ácidos nucleicos descritos en la Tabla 1, tales variantes son como se definió anteriormente.

Las construcciones útiles en los métodos de acuerdo con la presente invención se pueden construir utilizando tecnología de ADN recombinante bien conocida por las personas expertas en la técnica. Las construcciones de gen se pueden insertar dentro de vectores, que pueden estar comercialmente disponibles, adecuados para transformar en plantas y adecuados para la expresión del gen de interés en las células transformadas. La invención por lo tanto proporciona el uso de una construcción gen como se definió aquí anteriormente en los métodos de la invención.

Las plantas se transforman con un vector que comprende la secuencia de interés (es decir, un ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3). La secuencia de interés se liga operablemente a una o más secuencias de control (por lo menos con un promotor capaz de conducir preferiblemente la expresión del ácido nucleico en la endosperma

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de semillas). Los términos "elemento regulador", "secuencia de control" y "promotor" todos se utilizan intercambiablemente aquí y se toman en un amplio contexto para referirse a las secuencias de ácido nucleico reguladoras para afectar la expresión de las secuencias a las que ellas se ligan. Se abarcan por los términos mencionados anteriormente las secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico eucariótico clásico (que incluyen el cuadro TATA que se requiere para iniciación de transcripción exacta, con o sin una secuencia de cuadro CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir secuencias activantes en dirección 5’, mejoradores y silenciadores) que alteran la expresión de gen en respuesta al estímulo externo y/o desarrollado, o en una forma específica de tejido. También se incluye dentro del término una secuencia reguladora transcripcional de un gen procariótico clásico, en cuyo caso este puede incluir una secuencia de cuadro -35 y/o secuencias reguladoras transcripcionales de cuadro -10. El término "elemento regulador también abarca una molécula de fusión sintética o derivado que confiere, activa o mejora la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano. El término "ligado operablemente" como se utiliza aquí se refiere a un ligado funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de tal manera que la secuencia promotora es capaz de iniciar la transcripción del gen de interés.

El promotor capaz de expresar preferiblemente el ácido nucleico en la endosperma de semillas es un promotor específico de endosperma. Un promotor específico para endosperma se refiere a un promotor capaz de conducir preferiblemente la expresión del gene de interés en la endosperma. La referencia aquí a incrementar preferiblemente la expresión en la endosperma de semillas se toma que significa incrementar la expresión en la endosperma sustancialmente a la exclusión de la expresión en cualquier parte en la planta, aparte de cualquier expresión residual debido a promotores defectuosos. Por ejemplo, el promotor prolamina muestra la expresión fuerte en la endosperma, con defectuosos en el meristemo, más específicamente el meristemo del brote y/o el centro de discriminación del meristemo.

Preferiblemente, el promotor específico para endosperma es un promotor de proteína de almacenamiento de semilla, más preferiblemente un promotor aislado de un gen prolamina, tal como un promotor de prolamina de arroz RP6 (Wen et al., (1993) Plant Physiol 101(3):1115-6) como se representa por la SEQ ID NO: 3 o un promotor de resistencia similar y/o un promotor con un patrón de expresión similar como el promotor prolamina de arroz. La resistencia similar y/o el patrón de expresión similar se puede analizar, por ejemplo, al acoplar los promotores a un gen indicador y revisar la función del gen indicador en los tejidos de la planta. Un gen indicador bien conocido es beta-glucuronidasa y la cepa colorimétrica GUS utilizada para visualizar la actividad beta-glucuronidasa en el tejido de planta. Debe ser claro que la aplicabilidad de la presente invención no se restringe al ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 48, ni la aplicabilidad de la invención restringe la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3 cuando se controla mediante el promotor prolamina. Ejemplos de otros promotores específicos para endosperma que también se pueden utilizar en desarrollar los métodos de la invención se muestran en la Tabla 4 adelante.

Tabla 4: Ejemplos de promotores específicos para endosperma para uso en la presente invención

FUENTE DE GEN: REFERENCIA

Glutelina (arroz): Takaiwa et al. (1986) Mol Gen Genet 208:15-22 Takaiwa et al. (1987) FEBS Letts. 221:43-47

Zeina: Matzke et al., (1990) Plant Mol Biol 14(3): 323-32

trigo LMW y HMW glutenina-1: Colot et al. (1989) Mol Gen Genet 216:81-90 Anderson et al. (1989) NAR 17:461-2

trigo SPA: Albani et a/. (1997) Plant Cell 9:171-184

Gliadinas de trigo: Rafalski et al. (1984) EMBO 3:1409-15

Promotor de cebada Itr1: Diaz et al. (1995) Mol Gen Genet 248(5):592-8

cebada B1, C, D, hordein: Cho et al. (1999) Theor Appl Genet 98:1253-62 Muller et al. (1993) Plant J 4:343-55 Sorenson et al. (1996) Mol Gen Genet 250:750-60

cebada DOF: Mena et al, (1998) Plant J 116(1): 53-62

blz2: Onate et al. (1999) J Biol Chem 274(14):9175-82

Promotor sintético: Vicente-Carbajosa et al. (1998) Plant J 13:629-640

arroz prolamina NRP33: Wu et al, (1998) Cell plant Physiol 39(8) 885-889

arroz globulina Glb-1: Wu et al. (1998) Cell plant Physiol 39(8) 885-889

arroz globulina REB/OHP-1: Nakase et al. (1997) Plant Molec Biol 33: 513-522

arroz ADP-glucosa PP: Russell et al. (1997) Trans Res 6:157-68

Familia del gen de maíz ESR: Opsahl-Ferstad et al. (1997) Plant J 12:235-46

Sorgo kafirin: DeRose et al. (1996) Plant Molec Biol 32:1029-35

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Opcionalmente, una o más secuencias terminadoras también se pueden utilizar en la construcción introducida en una planta. El término "terminador" abarca una secuencia de control que es una secuencia de ADN en el extremo de una unidad transcripcional que señala el procesamiento 3’ y la poliadenilación de un transcripto primario y la terminación de la transcripción. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir mejoradores transcripcionales así como también mejoradores traduccionales. Aquellos expertos en la técnica tendrán en cuenta las secuencias terminadoras y mejoradoras que pueden ser adecuadas para uso en desarrollar la invención. Tales secuencias se conocerían o se pueden obtener fácilmente por una persona experta en la técnica.

Las construcciones genéticas de la invención pueden incluir adicionalmente un origen de la secuencia de replicación que se requiere para el mantenimiento y/o replicación en un tipo celular específico. Un ejemplo es cuando una construcción genética se requiere para ser mantenida en una célula bacteriana como un elemento genético episómico (por ejemplo molécula de plásmido o cósmido). Los orígenes preferidos de replicación incluyen, pero no se limitan a, el f1-ori y colE1.

La construcción genética puede comprender opcionalmente un gen marcador seleccionable. Como se utiliza aquí, el término "gen marcador seleccionable" incluye cualquier gen que confiere un fenotipo en una célula en la cual este se expresa para facilitar la identificación y/o selección de células que se transfectan o se transforman con una construcción de ácido nucleico de la invención. Los marcadores adecuados se pueden seleccionar de marcadores que confieren resistencia antibiótica o herbicida, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten la selección visual. Ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen genes que confieren resistencia a los antibióticos (tal como nptII que fosforila neomicina y canamicina, o hpt, que fosforila higromicina), a los herbicidas (por ejemplo bar que proporciona resistencia a Basta; aroA o gox que proporciona resistencia contra el glifosato), o genes que proporcionan un rasgo metabólico (tal como manA que permite a las plantas utilizar manosa como fuente de carbón única). Los genes marcadores visuales resultan en la formación de color (por ejemplo β-glucuronidasa, GUS), luminiscencia (tal como luciferasa) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP, y sus derivados).

La presente invención también abarca plantas (y partes de las mismas) que se pueden obtener mediante los métodos de acuerdo con la presente invención, en donde dichas plantas comprenden una construcción que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3 bajo el control de un promotor específico para endosperma. La presente invención por lo tanto proporciona plantas que se pueden obtener por el método de acuerdo con la presente invención, cuyas plantas se han transformado con un ácido nucleico que codifica CYCD3 bajo el control de un promotor específico para endosperma.

La invención también proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen producción de semilla incrementada, que comprende transformar una planta con un ácido nucleico que codifica CYCD3 bajo el control de un promotor específico para endosperma.

Más específicamente, la presente invención proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen producción de semilla incrementada, cuyo método comprende:

(i): transformar una planta o célula de planta con un ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3 bajo el control de un promotor específico para endosperma; y

(ii): cultivar la célula de planta bajo condiciones que promueven el desarrollo y crecimiento de la planta.

El incremento en la producción de semilla es como se definió anteriormente.

El ácido nucleico se puede introducir directamente dentro de una célula de planta o dentro de la planta en sí misma (que incluye la introducción dentro de un tejido, órgano o cualquier otra parte de una planta). De acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico se introduce en una planta mediante transformación.

El término "transformación" como se denomina aquí abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno dentro de una célula anfitriona, independiente del método utilizado para transferencia. El tejido de planta capaz de propagación clónica posterior, mediante organogenia o embriogenia, se puede transformar con una construcción genética de la presente invención y una planta completa regenerada de este. El tejido particular seleccionado variará dependiendo de los sistemas de propagación clónica disponibles para, y mejor adecuados para, las especies particulares a ser transformadas. Los objetivos de tejido de ejemplo incluyen discos de hoja, polen, embriones, cotiledóneas, hipocotiledóneas, megagametofitos, tejido calloso, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, yemas axilares, y meristemas de raíz), y tejido de meristema inducido (por ejemplo, meristema cotiledóneo y meristema hipocotiledóneo). El polinucleótido se puede introducir transitoriamente o establemente dentro de una célula anfitriona y se puede mantener no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, esto se puede integrar dentro del genoma anfitrión. La célula de planta transformada resultante se puede utilizar para regenerar una planta transformada en una forma conocida por las personas expertas en la técnica.

La transformación de especies de planta es ahora una técnica de rutina. Ventajosamente, cualquiera de varios métodos de transformación se puede utilizar para introducir el gene de interés en una célula antecesora adecuada. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, químicos que incremental la captación de ADN libre, inyección del ADN directamente dentro de la planta, bombardeo de pistola de partículas, transformación utilizando virus y polen y microproyección. Se pueden seleccionar métodos del método de calcio/polietlienglicol para protoplastos (Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); microinjecyección en el material de planta (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeo de partícula recubierto de ADN o ARN (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70) infección con virus (no integradores) y similares. Las plantas de arroz transgénicas que expresan un ácido nucleico que codifica CYCD3/gen se producen preferiblemente por medio de transformación mediada por Agrobacterium utilizando cualquiera de los métodos bien conocidos para la transformación de arroz, tal como se describe en cualquiera de los siguientes: solicitud de patente Europea publicada EP 1198985 A1, Aldemita and Hodges (Plant 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994). En el caso de transformación de maíz, el método preferido es como se describe en Ishida et a/. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o Frame et al. (Plant Physiol 129 (1): 13-22, 2002).

Generalmente después de transformación, las células de planta o grupos de células se seleccionan para la presencia de uno o más marcadores que se codifican por los genes que expresan la planta cotransectados con el gene de interés, luego de lo cual el material transformado se regenera en una planta completa.

Luego de transferencia y regeneración de ADN, las plantas transformadas putativamente se pueden evaluar, por ejemplo utilizando análisis Southern, para la presencia del gen de interés, número de copia y/o organización genómica. Alternativamente o adicionalmente, los niveles de expresión del ADN nuevamente introducido se pueden monitorear utilizando análisis Northern y/o Western, ambas técnicas son bien conocidas por las personas que tienen experticia en la técnica.

Las plantas transformadas generadas se pueden propagar mediante una variedad de medios, tal como mediante propagación clónica o técnicas de siembra clásicas. Por ejemplo, una primera generación (o T1) que transforma la planta en sí misma puede dar los transformantes de segunda generación homozigota (o T2), y las plantas T2 plantas adicionalmente se propagan a través de técnicas de siembra clásicas.

Los organismos transformados generados se pueden tomar de una variedad de formas. Por ejemplo, ellos pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes clónicos (por ejemplo, todas las células transformadas que contienen el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado injertado en un vástago no transformado).

La presente invención se extiende claramente a cualquier célula de planta o planta producida por cualquiera de los métodos descritos aquí, y a todas las partes de la planta y sus propágulos. La presente invención se extiende adicionalmente para abarcar la progenie de una células transfectadas o transformada primaria, tejido, órgano o planta completa que se ha producido mediante cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, solo el requerimiento que es la progenie que exhibe las mismas características genotípicas y/o fenotípicas como aquellas producidas por los progenitores en los métodos de acuerdo con la invención. La invención también incluye células anfitrionas que contienen un ácido nucleico aislado que codifica CYCD3. Las células anfitrionas preferidas de acuerdo con la invención son células de plantas. La invención también se extiende a partes cosechables de una planta tal como, pero no limitado a, hojas, frutas, flores, cultivos de tallo, rizomas, tubérculos y bulbos. La invención se relaciona adicionalmente con productos derivados directamente de una parte cosechable de tal una planta, tal como glóbulos o polvos secos, aceite, ácidos grasos y grasa, almidón o proteínas.

La presente invención también abarca el uso del ácido nucleico que codifica CYCD3 y uso de polipéptidos CYCD3.

Un tal uso se relaciona con incrementar la producción de semilla. La producción de semilla es como se definió aquí anteriormente y preferiblemente incluye una o más de los siguientes: número incrementado de flores por panículo, producción de semilla total incrementada, índice de cosecha incrementado y TKW incrementado, cada uno con relación a plantas tipo natural correspondientes.

Los ácidos nucleicos que codifican CYCD3 o sus variantes, o los polipéptidos CYCD3 pueden encontrar uso en programas de siembra en los que se identifica un marcador ADN que se puede ligar genéticamente a un gen que codifica CYCD3 o su variante. El ácido nucleico que codifica CYCD3/ genes o sus variantes, o polipéptidos CYCD3 se puede utilizar para definir un marcador molecular. Este ADN o marcador de proteína luego se puede utilizar en programas de siembra para seleccionar plantas que tienen producción de semilla incrementada. El gen que codifica CYCD3 o su variante, por ejemplo, puede ser un ácido nucleico como se representa por la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 48.

Las variantes alélicas de un ácido nucleico que codifica CYCD3/gen también pueden encontrar uso en programas de siembra asistidos por marcador. Tales programas de siembra algunas veces requieren la introducción de variación alélica mediante tratamiento mutagénico de las plantas, utilizando por ejemplo mutagenia EMS; alternativamente, el programa puede iniciar con una colección de variantes alélicas denominadas de origen "natural" originado no intencionalmente. La identificación de variantes alélicas luego toma lugar, por ejemplo, mediante PCR. Esto se sigue mediante una etapa para la selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y que da producción de semilla incrementada. La selección se lleva a cabo típicamente al monitorear el desempeño de crecimiento de plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión, por ejemplo, diferentes variantes alélicas de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 48. El desempeño de crecimiento se puede monitorear en un invernadero o en el campo. Adicionalmente las etapas opcionales incluyen plantas cruzadas, en las que se identifica la variante alélica superior, con otra planta. Esto se puede utilizar, por ejemplo, para hacer una combinación de las características fenotípicas de interés.

Un ácido nucleico que codifica CYCD3 o su variante también se pueden utilizar como sondas para mapear físicamente o genéticamente los genes que son una parte de, y como marcadores para los rasgos ligados a aquellos genes. Tal información puede ser útil en la siembra de plantas con el fin de desarrollar estirpes con fenotipos deseados. Tal uso de ácido nucleico que codifica CYCD3 o sus variantes solo requiere una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 15 nucleótidos en longitud. El ácido nucleico que codifica CYCD3 o sus variantes se pueden utilizar como marcadores de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP). Los Southern blot (Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) de ADN genómico de planta digerido de restricción se puede sondear con el ácido nucleico que codifica CYCD3 o sus variantes. Los patrones de banda resultantes luego se pueden someter a análisis genético utilizando programas de computador tal como MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174-181) con el fin de construir un mapa genético. Adicionalmente, los ácidos nucleicos se pueden utilizar para sondear Southern blot que contienen los ADN genómicos tratados con endonucleasa de restricción de un conjunto de individuos que representan la progenie y el parentesco de un cruce genético definido. La segregación de los polimorfismos de ADN se nota y se utiliza para calcular la posición del ácido nucleico que codifica CYCD3 o si variante en el mapa genético previamente obtenido utilizado esta población (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331).

La producción y uso de sondas derivadas de gen de planta para uso en mapeo genético se describe en Bematzky and Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37-41. Numerosas publicaciones describen el mapeo genético de clones de cADN específicos utilizando la metodología bosquejada anteriormente o sus variaciones. Por ejemplo, las poblaciones intercruzadas F2, poblaciones retrocruzadas, poblaciones emparejadas aleatoriamente, estirpes isogénicas cercanas (NIL), y otros conjuntos de individuos se puede utilizar para mapeo. Tales metodologías son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica.

Las sondas de ácido nucleico también se pueden utilizar para mapeo físico (es decir, colocación de las secuencias en mapas físicos; ver Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, y referencias citadas allí).

En otra realización, se pueden utilizar sondas de ácido nucleico en mapeo de fluorescencia directa de hibridación in situ (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7:149-154). Aunque los métodos actuales de mapeo FISH favorecen el uso de grandes clones (varios kb a varios cientos kb; ver Laan et al. (1995) Genome Res. 5:13-20), las mejoras en la sensibilidad pueden permitir el desempeño de mapeo FISH utilizando sondas más cortas.

Una variedad de métodos con base en amplificación de ácido nucleico para mapeo genético y físico se pueden llevar a cabo utilizando los ácidos nucleicos. Ejemplos incluyen amplificación específica de alelo (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16:325-332), ligación específica de alelo (Landegren et al. (1988) Science 241:1077-1080), reacciones de extensión de nucleótido (Sokolov (1990) Nucleic acid Res. 18:3671), Mapeo de Híbrido de Radiación (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7:22-28) y Mapeo Happy (Dear y Cook (1989) Nucleic acid Res. 17:6795-6807). Para estos métodos, la secuencia de un ácido nucleico se utiliza para diseñar y producir pares cebadores para uso en la reacción de amplificación o en las reacciones de extensión de cebador. El diseño de tales cebadores es bien conocido por aquellos expertos en la técnica. En los métodos que emplean mapeo genético con base en PCR, es necesario identificar las diferencias de la secuencia de ADN entre los progenitores del mapeo cruzado en la región que corresponde a la secuencia de ácido nucleico actual. Esto, sin embargo, no es generalmente necesario para métodos de mapeo.

Se obtienen incrementos en la producción en los métodos de la invención al transformar una planta con un ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3 bajo el control de un promotor específico para endosperma. Sin embargo, tales incrementos de producción de semilla también se pueden obtener mediante otras técnicas bien conocidas, tal como activación T-ADN, TILLING y recombinación homóloga.

La etiqueta de activación T-ADN (Hayashi et al. Science (1992) 1350-1353) que involucra la inserción de T-ADN, contiene usualmente un promotor (también puede ser un mejorador de traducción o un intrón), en la región genómica del gen de interés o 10 kb en la dirección 5’ o 3’ de la región codificante de un gen en una configuración de tal manera que el promotor dirige la expresión del gen objetivo. Típicamente, se interrumpe la regulación de la expresión del gen objetivo mediante su promotor natural y el gen cae bajo el control del promotor nuevamente formado. El promotor se embebe típicamente en un T-ADN. Este T-ADN se inserta aleatoriamente en el genoma de planta, por ejemplo, a través de la infección de Agrobacterium y conduce a la sobreexpresión de genes cerca al TADN insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la sobreexpresión de genes cerrado en el promotor introducido. El promotor a ser introducido puede ser cualquier promotor específico para endosperma.

La técnica de TILLING (Lesiones Locales Inducidas por Objetivo En Genomas) también se puede utilizar para reproducir los efectos de desarrollar los métodos de la invención. El TILLING es una tecnología de mutagenia útil para generar y/o identificar, y para eventualmente aislar un ácido nucleico que codifica CYCD3 con expresión y/o actividad modificada. El TILLING también permite la selección de plantas que llevan tales variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden exhibir expresión modificada, en resistencia o en ubicación o en tiempo (si las mutaciones afectan el promotor, por ejemplo). El TILLNG combina mutagenia de alta densidad con métodos de detección de alto rendimiento. Las etapas típicamente seguidas en TILLING son: (a) mutagenia EMS (Redei GP and Koncz C (1992) In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Singapore, World Scientific Publishing Co, pp. 16-82; Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner J y Caspar T (1998) In J Martinez- Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Human Press, Totowa, NJ, pp 91-104); (b) preparación de ADN y agrupamiento de individuos; (c) amplificación de PCR de una región de interés; (d) desnaturalización e hibridación para permitir la formación de heterodúplex; (e) DHPLC, en donde la presencia de un heterodúplex en un grupo se detecta como un pico extra en el cromatograma; (f) identificación del mutante individual; y (g) secuenciamiento del producto PCR mutante. Los métodos para TILLING son bien conocidos en la técnica (McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457; revisado por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50). Las plantas que llevan tales variantes mutantes tienen expresión preferiblemente incrementada de un gen que codifica CYCD3 en la endosperma.

La activación de T-ADN y TILUNG son ejemplos de tecnologías que permite la generación de las modificaciones genéticas (preferiblemente en el locus de un gen que codifica un polipéptido CYCD3) que da expresión preferiblemente incrementada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3 en la endosperma de las plantas. El locus de un gen se define aquí como una región genómica, que incluye el gen de interés y 10 kb corriente arriba y corriente debajo de la región codificante.

La recombinación homóloga permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición seleccionada definida. La recombinación homóloga es una tecnología estándar utilizada rutinariamente en ciencias biológicas para organismos inferiores tal como levadura o el musgo Physcomitrella. Los métodos para desarrollar la recombinación homóloga en las plantas se ha descrito no solo para plantas modelo (Offringa et al. (1990) EMBO J 9(10): 3077-84) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo arroz (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030-4; lida and Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132-8). El ácido nucleico (que puede ser un ácido nucleico que codifica CYCD3 o su variante como se definió aquí anteriormente) se objetiva en el locus de un gen CYCD3. El ácido nucleico a ser objetivado puede ser un alelo mejorado utilizado para reemplazar el gen endógeno o se puede introducir en adición al gen endógeno. El ácido nucleico a ser objetivado es preferiblemente la región que controla la expresión natural de un ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3 en una planta. Un

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promotor específico para endosperma se introduce dentro de esta región, en adición a este, o reemplazándolo parcialmente o sustancialmente todo de este.

Todos los métodos de acuerdo con la presente invención resultan en plantas que tienen producción de semilla incrementada, como se describió aquí anteriormente. Estos rasgos útiles también se pueden combinar con otros rasgos económicamente ventajosos, tal como adicionalmente rasgos de mejoramiento de la producción, tolerancia a varias tensiones, rasgos que modifican varias características arquitectónicas y/o características bioquímicas y/o fisiológicas.

Descripción de las figuras

La presente invención ahora se describirá con referencia a las siguientes figuras en las que:

Figura 1 es una alineación de polipéptido múltiple preparada utilizando ClustalW y valores predeterminados, seguido por la computación del árbol de distancia promedio. Se muestra el grupo polipéptido CYCD3.

Figura 2 es una alineación de las secuencias de proteína CYCD de planta conocidas. Las secuencias se alinean utilizando el programa AlignX del Vector NTI suite (InforMax, Bethesda, MD). Se hace alineación múltiple con una penalidad de abertura de espacio 10 y una extensión de espacio de 0.01. También se lleva a cabo la edición de manual menor donde sea necesario para posicionar mejor algunas regiones conservadas. La línea mostrada indica la separación de los polipéptidos CYCD3 de otras ciclinas tipo D. Se colocan en cajas un número de motivos específicos para los polipéptidos CYCD3.

Figura 3 es una matriz de similitud/identidad preparada utilizando MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) que calcula la similitud e identidad entre cada par de las secuencias de polipéptido en un conjunto de datos dado sin requerir prealineación de los datos. El programa desarrolla una serie de alineaciones en forma de par utilizando el algoritmo de alineación global Myers y Miller (con una penalidad de abertura espacio de 12, y una penalidad de extensión de espacio de 2). Este luego calcula la similitud e identidad utilizando, por ejemplo, Blosum 60 como la matriz de clasificación, y luego coloca los resultados en una matriz de distancia. La similitud de la secuencia se muestra en la mitad de fondo de la línea divisora y la identidad de secuencia se muestra en la mitad superior de la línea divisora. La secuencia de la SEQ ID NO: 2 se indica como el número 5 en la matriz. Las secuencias de polipéptido que tienen por lo menos 30% de identidad de secuencia para la secuencia de la SEQ ID NO: 2 abarca los polipéptidos CYCD3.

Figura 4 es un vector binario para la expresión en Oryza sativa del gen Arabidopsis thaliana CycD3;3 bajo el control del promotor prolamina.

Figura 5 detalla ejemplos de las secuencias útiles en desarrollar los métodos de acuerdo con la presente invención.

Figura 6 es una alineación solo de las secuencias de proteína CYCD3 de planta. Las secuencias se alinean utilizando el programa AlignX del Vector NTI suite (InforMax, Bethesda, MD). Se hace alineación múltiple con una penalidad de abertura espacio de 10 y una extensión de espacio de 0.01. También se lleva a cabo la edición de manual menor donde sea necesario para posicionar mejor algunas regiones conservadas. En adición al cuadro de ciclina (marcado como ’X’ por debajo de la secuencia consensus (Interpro ref: IPR006670)) y el motivo LxCxE dentro de los primeros 40 o aminoácidos, se identifica un número de motivos específicos para los polipéptidos CYCD3.

Ejemplos

La presente invención ahora se describirá con referencia a los siguientes ejemplos, que son solo por vía de ilustración.

Manipulación de ADN: a menos que se indique otra cosa, se desarrollan técnicas de ADN recombinante de acuerdo con los protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ra Edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales estándar y métodos para trabajo molecular de plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfase (1993) by R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) y Blackwell Scientific Publications (UK).

Ejemplo 1: Clonación de Gen

Se amplifica Arabldopsis CycD3;3 mediante PCR utilizando como plantilla colección de cADN de siembra Arabldopsis thaliana (Invitrogen, Paisley, UK). Después de transcripción inversa de ARN se extrae de semillas, los cADN se clonan en pCMV Sport 6.0. El tamaño de inserto promedio del banco es 1.5 kb y el número original de clones es de 1.59x107 cfu. Se determina que el título original es 9.6x105 cfu/ml después de la primera amplificación de 6x1011 cfu/ml. Después de la extracción de plásmido, se utiliza 200 ng de plantilla en una mezcla de 50 µl de PCR. Los cebadores prm0360 (codón de inicio, codificante en negrilla, sitio AttB1 en cursiva: 5’ GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGCTTTAGAAGAGG AGGA 3’) y prm0361 (cordón de parada, complementario, inverso en negrilla, sitio AttB2 en cursiva: 5’ GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAGCGAGGACTACTACTAAGCA 3’), que incluye los sitios AttB para recombinación Gateway, se utilizan para amplificación PCR. El PCR se desarrolla utilizando una polimerasa de Etiqueta de ADN Hifi en condiciones estándar. Un fragmento PCR de 1086 bp se amplifica y se purifica también utilizando métodos estándar. La primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, luego se desarrolla, durante lo cual el fragmento PCR se recombina in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway, un "clon de entrada", p0443. El plásmido pDONR201 se compra de Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

Para la secuencia modificada de la SEQ ID NO: 48/49, el cebador inverso es: 5’ GGGGACCAC77TGTACAAGAAAGCTGGGTTTAGCGAGGACTACTATAAGCA 3’).

Ejemplo 2: Vector de Construcción

El clon de entrada p0443 se utiliza posteriormente en una reacción LR con p0830, un vector de destino utilizado para la transformación de Oryza sativa. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de los límites T-ADN: un marcador seleccionable de planta; un marcador detectable de planta, y un casete Gateway destinado para recombinación LR in vivo con la secuencia de interés ya clonada en el clon de entrada. Un promotor prolamina para expresión específica de endosperma (PRO0090; SEQ ID NO: 3) se ubica en dirección 5’ de este casete Gateway.

Después de la etapa de recombinación LR, el vector de expresión resultante (ver Figura 4) se transforma en la cepa Agrobacterium LBA4404 y posteriormente en plantas Oryza sativa. El vector de expresión resultante como se muestra en la Figura 4 se transforma en Agrobacterium y posteriormente en plantas Oryza sativa. A las plantas de arroz transformadas se les permite crecer y luego se examinan para los parámetros descritos en el Ejemplo 3.

Ejemplo 3: Evaluación y Resultados

Se generan aproximadamente 15 a 20 transformantes de arroz T0 independientes. Los transformantes primarios se transfieren de las cámaras de cultivo de tejido en un invernadero para hacer crecer y cosechar la semilla T1. Se retienen seis eventos, de los cuales la progenie T1 segrega 3:1 para la presencia/ausencia del transgen. Para cada uno de estos eventos, se seleccionan aproximadamente 10 semillas T1 que contienen el transgen (hetero- y homozigotos), y aproximadamente 10 semillas T1 que carecen del transgen (nulizigotos), al monitorear la expresión del marcador visual. Las plantas transgénicas y los nulizigotos correspondientes se hacen crecer lado a lado en las posiciones aleatorias. De la etapa de siembra hasta la etapa de madurez las plantas se pasan varias veces a través de una cabina de formación de imágenes digital. En cada punto de tiempo las imágenes digitales (2048x1536 pixeles, 16 millón de clores) se toman de cada planta desde por lo menos 6 diferentes ángulos. Adicionalmente se evalúan cinco eventos T1 en la generación T2 siguiendo el mismo procedimiento de evaluación para la generación de T1 pero con más individuos por evento.

Análisis estadístico: prueba t y prueba F

Se utiliza un ANOVA de dos factores (análisis de variantes) como un modelo estadístico para la evaluación general de las características fenotípicas de planta. Se lleva a cabo una prueba F en todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con el gen la presente invención. La prueba F se lleva a cabo para revisar un efecto gel gen durante todos los eventos de transformación y para verificar un efecto general del gen, también conocido como un efecto de gen global. El umbral para significancia de un efecto de gen global verdadero se establece en un nivel de probabilidad de 5% para la prueba F. Los puntos de valor de prueba F significativos para un efecto de gen, significa que no solo la presencia o posición del gen origina las diferencias en el fenotipo.

Para la revisión de un efecto de los genes dentro del evento, es decir, para un efecto específico de estirpe, se desarrolla una prueba t dentro de cada evento utilizado conjuntos de datos de las plantas transgénicas y las plantas nulas correspondientes. "Plantas nulas" o "segregantes nulos" o "nulizigotos" son las plantas tratadas en la misma forma como la planta transgénica, pero de la cual se ha segregado el transgen. Las plantas nulas también se pueden describir como las plantas transformadas negativas homozigotas. El umbral para la significancia de la prueba t se establece en un nivel de probabilidad de 10%. Los resultados para algunos eventos pueden estar por encima o por debajo de este umbral. Esto se basa en la hipótesis que un gen solo puede tener un efecto en ciertas posiciones en el genoma, y que la ocurrencia de este efecto dependiente de la posición no es rara. Este tipo de efecto de gen también se nombra aquí "efecto de estirpe del gen". El valor p se obtiene al comparar el valor t con la distribución t o alternativamente, al comparar el valor F con la distribución F. El valor p luego da la probabilidad que la hipótesis nula (es decir, no existe efecto del transgen) sea correcta.

3.1 Medición del parámetro relacionado con semilla

Las panículas primarias maduras se cosechan, se embolsan, se marcan con códigos de barras y luego se secan durante tres días en el horno a 37°C. Luego se trillan las panículas y se recolectan y se cuentan todas las semillas. Las cáscaras llenas se separan de las vacías utilizando un dispositivo para soplar aire. Las cáscaras vacías se

5 desechan y la fracción restante se cuenta de nuevo. Las cáscaras llenas se pesan en una balanza analítica. Este procedimiento resulta en el conjunto de parámetros relacionados con semillas descritos adelante.

3.1.1 Número total de flores por panículo

El número total de flores por panículo como se define en la presente invención es la relación entre el número total de semillas y el número de panículas primarias maduras. La diferencia de porcentaje entre los dos eventos transgénicos

10 significativos y sus nulizigotos correspondientes en T2 se muestra en la Tabla 5. También se muestra el valor P de los eventos significativos en la evaluación T2. Un valor P significativo indica que la presencia del transgen se relaciona con el incremento en el número total de flores por panículo.

Tabla 5: Número total de flores por panículo

% de incremento en T2: Valor P por evento

Evento significativo 1: 13 0.0286

Evento significativo 2: 22 0.0007

15 3.1.2 Producción total de semilla

La producción total de semilla se mide al pesar todas las cáscaras llenas cosechadas de una planta. El porcentaje de diferencia entre tres eventos transgénicos significativos y sus nulizigotos correspondientes en T2 se muestra en la Tabla 6. También se muestra el valor P de los eventos significativos en la evaluación T2. Un valor P significativo indica que la presencia del transgen se relaciona con el incremento en la producción total de semilla.

20 Tabla 6: producción de semilla total

% de incremento en T2: Valor P por evento

Evento significativo 1: 31 0.1306

Evento significativo 2: 36 0.0826

Evento significativo 3: 37 0.0005

El TKW en la presente invención se extrapola del número de semillas llenas contadas y su peso total. La diferencia de porcentaje entre tres eventos transgénicos significativos y sus nulizigotos correspondientes en T2 se muestra en la Tabla 7. También se muestra el valor P de los eventos significativos en la evaluación T2. Un valor P significativo

25 indica que la presencia del transgen se relaciona con el incremento en TKW.

Tabla 7: TKW 3.1.4 Índice de cosecha de plantas

% de incremento en T2: Valor P por evento

Evento significativo 1: 6 0.0006

Evento significativo 2: 5 0.0009

Evento significativo 3: 4 0.0165

El índice de cosecha de la presente invención se define como la relación entre la producción total de semilla y el área por encima de la tierra (mm2), multiplicado por un factor 108. El porcentaje de diferencia entre los tres eventos transgénicos significativos y sus nulizigotos correspondientes en T2 se muestra en la Tabla 8. También se muestra el valor P de los eventos significativos en la evaluación T2. Un valor P significativo indica que la presencia del transgen se relaciona con el incremento en el índice de cosecha.

Tabla 8: Índice de cosecha

% de incremento en T2: Valor P por evento

Evento significativo 1: 30 0.0324

Evento significativo 2: 49 0.0014

Evento significativo 3: 15 0.0727

Ejemplo 4: Datos comparativos pOleosina:ciclina D3;3

10 Las plantas que contienen la construcción anterior se producen y se evalúan utilizando los mismos procedimientos como se describió anteriormente para pProlamina:ciclina D3;3. Los resultados de la evaluación T1 se muestran en las Tablas 9 a 11 adelante. En cada una de las tablas se muestra el porcentaje de diferencia entre las plantas transgénicas y los nulizigotos correspondientes. También se muestra el valor P de la prueba F.

Tabla 9: Área por encima de la tierra

Área por encima de la tierra

% de diferencia: Valor P

T1 general: -12 0.0083

El valor P de la prueba F indica significativamente que la expresión del transgen conducida por su promotor reduce significativamente el área por encima de la tierra.

Tabla 10: Peso de semilla total

Peso de semilla total

% de diferencia: Valor P

T1 general: -15 0.0858

20 Los resultados muestran que el peso total de las semillas de las plantas transgénicas es menor que el peso de semilla total de los nulizigotos correspondientes.

Tabla 11: Número de Semillas Llenas

Número de Semillas Llenas

% de diferencia: Valor P

T1 general: -17 0.0572

Los resultados muestran que el número de semillas llenas de las plantas transgénicas es menor que el número de semillas llenas de los nulizigotos correspondientes.

5 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> CropDesign N.V.

<120> Plantas que tienen producción incrementada y un método para elaborar las mismas

<130> CD-130-PCT

<150> EP 05102444.6 10 <151> 2005-03-25

<150> US 60/668,076

<151> 2005-04-05

<160> 71

<170> PatentIn version 3.3 15 <210> 1

<211> 1086

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

imagen1

<210> 2

<211> 361

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

imagen1

<210> 3

<211> 654

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 3

imagen1

<210> 4

<211> 54

<212> ADN

5: <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador: prm0360

<400> 4

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggct ttagaagagg agga: 54

10: <210> 5

<211> 51

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

15: <223> cebador: prm0361

<400> 5

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt tagcgaggac tactataagc a: 51

<210> 6

<211> 1140

20: <212> ADN

<213> Antirrhinum majus

<400> 6

imagen1

<210> 7

<211> 343

<212> PRT

<213> Antirrhinum majus

<400> 7

imagen1

<210> 8

<211> 1451

<212> ADN

<213> Antirrhinum majus

<400> 8

imagen1

<210> 9

<211> 361

<212> PRT

<213> Antirrhinum majus

<400> 9

imagen1

<210> 10

<211> 1646

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 10

imagen1

<210> 11

<211> 376

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 11

imagen1

<210> 12

<211> 1415

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 12

imagen1

<210> 13

<211> 367

10 <212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 13

imagen1

<210> 14

<211> 1425

<212> ADN 5 <213> Euphorbia esula

<220>

<221> misc_feature

<222> (1347)..(1347)

<223> n es a, c, g, o t

10 <400> 14

imagen1

<210> 15

<211> 355

<212> PRT

<213> Euphorbia esula

<400> 15

imagen1

<210> 16

<211> 1501

<212> ADN

<213> Euphorbia esula

<400> 16

imagen1

<210> 17

<211> 350

<212> PRT

<213> Euphorbia esula

<400> 17

imagen1

<210> 18

<211> 1193

<212> ADN

<213> Helianthus annuus

<400> 18

imagen1

<210> 19

<211> 308

<212> PRT

<213> Helianthus annuus

<400> 19

imagen1

<210> 20

<211> 1400

<212> ADN

<213> Helianthus tuberosus

<400> 20

imagen1

<210> 21

<211> 357

10 <212> PRT

<213> Helianthus tuberosus

<400> 21

imagen1

<210> 22

<211> 1630

<212> ADN

<213> Lagenaria siceraria

<400> 22

imagen1

<210> 23

<211> 352

<212> PRT

<213> Lagenaria siceraria

<400> 23

imagen1

<210> 24

<211> 1565

<212> ADN

<213> Lagenaria siceraria

<400> 24

imagen1

<210> 25

<211> 380

<212> PRT

<213> Lagenaria siceraria

<400> 25

imagen1

<210> 26

<211> 1518

<212> ADN

<213> Lycopersicon esculentum

<400> 26

imagen1

<210> 27

<211> 359

10 <212> PRT

<213> Lycopersicon esculentum

<400> 27

imagen1

<210> 28

<211> 1459

<212> ADN

<213> Lycopersicon esculentum

<400> 28

imagen1

<210> 29

<211> 364

<212> PRT

<213> Lycopersicon esculentum

<400> 29

imagen1

<210> 30

<211> 1449

<212> ADN

<213> Lycopersicon esculentum

<400> 30

imagen1

<210> 31

<211> 336

<212> PRT

<213> Lycopersicon esculentum

<400> 31

imagen1

<210> 32

<211> 1861

<212> ADN

<213> Medicago sativa

<400> 32

imagen1

<210> 33

<211> 386

<212> PRT

<213> Medicago sativa

<400> 33

imagen1

<210> 34

<211> 1679

<212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 34

imagen1

<210> 35

<211> 373

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 35

imagen1

<210> 36

<211> 1430

<212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 36

imagen1

<210> 37

<211> 367

10 <212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 37

imagen1

<210> 38

<211> 1487

<212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 38

imagen1

<210> 39

<211> 368

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 39

imagen1

<210> 40

<211> 1714

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 40

imagen1

<210> 41

<211> 364

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 41

imagen2

<210> 42

<211> 1628

<212> ADN

<213> Pisum sativum

10 <400> 42

imagen1

<210> 43

<211> 384

<212> PRT

<213> Pisum sativum

<400> 43

imagen1

<210> 44

<211> 1491

<212> ADN

<213> Populus alba

<400> 44

imagen1

<210> 45

<211> 371

<212> PRT

<213> Populus alba

<400> 45

imagen1

<210> 46

<211> 1405

<212> ADN

<213> Populus tremula x Populus tremuloides

<400> 46

imagen1

<210> 47

<211> 376

10 <212> PRT

<213> Populus tremula x Populus tremuloides

<400> 47

imagen1

<210> 48

<211> 1152

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 48

imagen1

<210> 49

<211> 383

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 49

imagen1

<210> 50

<211> 1161

<212> ADN

<213> Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens

<400> 50

imagen1

<210> 51

<211> 386

10 <212> PRT

<213> Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens

<400> 51

imagen1

<210> 52

<211> 1116

<212> ADN

<213> Camellia sinensis

<400> 52

imagen1

<210> 53

<211> 371

<212> PRT

<213> Camellia sinensis

<400> 53

imagen1

<210> 54

<211> 1119

<212> ADN

<213> Camellia sinensis

<400> 54

imagen1

<210> 55

<211> 372

10 <212> PRT

<213> Camellia sinensis

<400> 55

imagen1

<210> 56

<211> 1128

<212> ADN

<213> Citrus sinensis

<400> 56

imagen1

<210> 57

<211> 375

<212> PRT

<213> Citrus sinensis

<400> 57

imagen1

<210> 58

<211> 1191

<212>: ADN 5 <213> Glycine max

<220>

<221> misc_feature

<222> (117)..(117)

<223> n es a, c, g, o t

<210> 59

<211> 396

<212>: PRT 5 <213> Glicina max

10 <400> 58 <220>

imagen1

<221> misc_feature

<222> (39)..(39)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de ocurrencia natural

10 <400> 59 <210> 60

imagen1

<211> 1125

<212> ADN

<213> Gossypium hirsutum

<400> 60

imagen1

<210> 61

<211> 374

<212> PRT

<213> Gossypium hirsutum

<400> 61

imagen1

<210> 62

<211> 1173

<212> ADN

<213> Lotus corniculatus

<400> 62

imagen1

<210> 63

<211> 390

<212> PRT

<213> Lotus corniculatus

<400> 63

imagen1

<210> 64

<211> 1161

<212> ADN

<213> Medicago trunculata

<400> 64

imagen1

<210> 65

<211> 386

10 <212> PRT

<213> Medicago trunculata

<400> 65

imagen1

<210> 66

<211> 1119

<212> ADN

<213> Scutellaria baicalensis

<400> 66

imagen1

<210> 67

<211> 372

<212> PRT

<213> Scutellaria baicalensis

<400> 67

imagen1

<210> 68

<211> 1164

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 68

imagen1

<210> 69

<211> 387

10 <212> PRT

<213> Zea mays

<400> 69 <210> 70

imagen1

<211> 1176

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 70 <210> 71

imagen1

<211> 391

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 71

imagen1

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para incrementar la producción de semillas de plantas con relación a plantas tipo natural correspondientes, que comprende incrementar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido (CYCD3) de ciclina D3 bajo el control de un promotor específico para endosperma,

en donde dicha expresión incrementada se efectúa al

(i)

introducir mediante transformación un ácido nucleico que codifica CYCD3 bajo el control de un promotor específico para endosperma; y

(ii)

seleccionar plantas que tienen producción de semilla incrementada.
2.

Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho ácido nucleico es capaz de hibridar con un ácido nucleico que codifica CYCD3 de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:48.
3.

Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho ácido nucleico codifica un ortólogo o parálogo de la proteína CYCD3 de la SEQ ID NO: 2.
4.

Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho ácido nucleico que codifica CYCD3 es de origen de planta, preferiblemente de una planta dicotiledónea, adicionalmente preferiblemente de la familia Brassicaceae, más preferiblemente el ácido nucleico es de Arabidopsis thaliana.
5.

Método de acuerdo con una cualquiera de 3 reivindicaciones de la 1 a 4, en donde dicho promotor específico para endosperma es un promotor prolamina.
6.

Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha producción de semilla incrementada se selecciona de: número incrementado de flores por panículo, producción de semilla total incrementada, índice de cosecha incrementado y TKW incrementado.
7.

Construcción que comprende:

(i)

un ácido nucleico que codifica un polipéptido CYCD3;

(ii)

una o más secuencias de control específicas para endosperma que conducen la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i) en la endosperma de semillas; y opcionalmente

(iii) una secuencia de terminación de transcripción.
8.

Construcción de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha secuencia de control es un promotor específico para endosperma.
9.

Construcción de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicho promotor específico para endosperma es un promotor prolamina.
10.

Construcción de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicho promotor prolamina es como se representa por la SEQ ID NO: 3.
11.

Método para la producción de una planta transgénica que tiene producción de semilla incrementada, cuyo método comprende:

(i)

transformar una planta o célula de planta con una construcción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10; y

(ii)

cultivar la célula de planta bajo condiciones que promueven el desarrollo y crecimiento de la planta.
12. Planta transgénica que comprende una construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a
10.
13. Planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicha planta es una planta monocotiledónea, tal como caña de azúcar o en donde la planta es un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, avena

o sorgo.
14. Partes cosechables de una planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, en donde dichas partes cosechables comprenden una construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a
10.
15. Partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dichas partes cosechables son

5 semillas, y en donde las partes cosechables comprenden una construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.
16.

Uso de una construcción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 en mejorar la producción de semilla, con relación a plantas tipo natural correspondientes.
17.

Uso de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicha producción de semilla se selecciona de: número

10 incrementado de flores por panículo, producción de semilla total incrementada, índice de cosecha incrementado y TKW incrementado.