ES2354425T3

ES2354425T3 - Método para modificar las características de crecimiento de las plantas.

Info

Publication number: ES2354425T3
Application number: ES04708774T
Authority: ES
Inventors: Vladimir Mironov
Original assignee: CropDesign NV
Current assignee: CropDesign NV
Priority date: 2003-02-06
Filing date: 2004-02-06
Publication date: 2011-03-14
Anticipated expiration: 2024-02-06
Also published as: AR043126A1; CN1748033A; BRPI0407314A; EP1590466A2; WO2004070027A9; US7919678B2; DE602004029230D1; WO2004070027A3; CN1748033B; EP1590466B1; US20060037106A1; ATE482280T1; WO2004070027A2

Abstract

Método para modificar las características de crecimiento de plantas con relación a plantas tipo silvestre correspondientes, que comprende modificar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica una planta metionina aminopeptidasa (proteína MAP) y/o modificar el nivel y/o actividad en una planta de una proteína MAP de la planta, en donde dicha modificación de expresión, nivel y/o actividad se efectúa al introducir en una planta un ácido nucleico que codifica una proteína MAP que comprende un MAP2 distintivo, un dominio peptidasa-M24 y un dominio rico en lisina.

Description

La presente invención se relaciona con un método para modificar las características de 5 crecimiento de plantas. Más específicamente, la presente invención se relaciona con un método para modificar las características de crecimiento de plantas al modificar la expresión de un ácido nucleico que codifica una metionina aminopeptidasa (proteína MAP) y/o al modificar el nivel y/o la actividad de una proteína MAP en una planta. La presente invención también se relaciona con plantas que tienen expresión modificada de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP y/o nivel 10 modificado y/o la actividad de una proteína MAP, cuyas plantas han modificado las características de crecimiento con relación a las plantas tipo silvestre correspondientes.

Teniendo en cuenta la población mundial cada vez mayor, subsiste el objetivo principal de investigación agrícola para mejorar la eficiencia de la agricultura. Los medios convencionales para mejorar cultivos y horticultivos utilizando técnicas de siembra selectivas para identificar plantas que 15 tienen características deseables. Sin embargo, tales técnicas de siembra selectivas tienen varias desventajas, a saber estas técnicas son típicamente de trabajo intenso y resultan en plantas que frecuentemente contienen componentes genéticos heterogéneos que no siempre pueden resultar en el rasgo deseable que se pasan de las plantas progenitoras. En contraste, los avances en la biología molecular han permitido a la humanidad manipular más precisamente el germoplasma de las plantas. 20 La ingeniería genética de las plantas implica el aislamiento y manipulación del material genético (típicamente en la forma de ADN o ARN) y la introducción posterior de ese material genético en una planta. Tal tecnología ha conducido al desarrollo de plantas que tienen varios rasgos económicos, agronómicos u hortícolas mejoradas, por ejemplo producción mejorada.

La capacidad de influenciar una o más de las características de crecimiento de plantas, 25 tendría muchas aplicaciones en áreas tal como mejoramiento del cultivo, siembra de plantas, producción de plantas ornamentales, arboricultura, horticultura, silvicultura, producción de algas o plantas (para uso como biorreactores por ejemplo, para la producción de farmacéuticos tal como anticuerpos o vacunas, o para la bioconversión de desperdicio orgánico, o para uso como combustible en el caso de algas y plantas de alta producción). 30

Ahora se ha encontrado que modificar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP, y/o modificar en una planta el nivel y/o la actividad de una proteína MAP, da plantas que tienen características de crecimiento modificadas.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona un método para modificar las características de crecimiento de plantas con relación a plantas tipo silvestre correspondientes, que 35 comprende modificar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica una proteína metionina aminopeptidasa (MAP) y/o modificar el nivel y/o actividad en una planta de una proteína MAP.

El término "modificar" como se utiliza aquí se entiende que incrementa, reduce y/o cambia de lugar y/o tiempo. Modificar la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP o 40 modificar el nivel y/o la actividad de una proteína MAP abarca la expresión alterada de un gen y/o el nivel alterado y/o la actividad de un producto de gen, a saber un polipéptido, en células o tejidos específicos, cuando se compara con la expresión, nivel y/o actividad de un gen o proteína MAP en plantas tipo silvestre correspondientes. La expresión de gen modificada puede resultar de la expresión modificada de un gen MAP endógeno y/o puede resultar de la expresión modificada de un gen MAP 45 previamente introducido en una planta. De forma similar, los niveles modificados y/o la actividad de una proteína MAP se puede deber a la expresión modificada de un ácido nucleico o proteína MAP endógena y/o se puede deber a la expresión modificada de un ácido nucleico o proteína MAP previamente introducido en una planta. Se puede efectuar la expresión modificada de un ácido nucleico/gen y/o nivel modificado y/o actividad de un producto de gen/proteína, por ejemplo, por 5 medios químicos y/o medios recombinantes.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, modificar la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP y/o modificar el nivel y/o la actividad de una proteína MAP se puede efectuar por medios recombinantes. Tales medios recombinantes pueden comprender un método directo y/o indirecto. 10

Por ejemplo, un método recombinante indirecto puede comprender introducir, en una planta, un ácido nucleico capaz de modificar la expresión de un gen MAP y o capaz de modificar el nivel y/o la actividad de una proteína MAP. Ejemplos de tales ácidos nucleicos a ser introducidos en una planta incluyen ácidos nucleicos que codifican factores de transcripción o activadores o inhibidores que unen al promotor de un gen MAP o que interactúan con una proteína MAP. Los métodos para probar estos 15 tipos de interacciones y métodos para aislar ácidos nucleicos que codifican tales interactores incluyen seleccionar dos híbridos de levadura o un híbrido de levadura en los que se utiliza el gen/proteína de MAP como cebo. Por lo tanto, modificar la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP y/o modificar el nivel y/o la actividad de la proteína MAP se puede efectuar al reducir o incrementar los niveles de factores que controlan la expresión del gen MAP o que activan 20 directamente o indirectamente la proteína MAP. Adicionalmente, modificar el nivel y/o la actividad de una proteína MAP se puede efectuar al modificar los niveles de un factor capaz de interactuar con una proteína MAP. Tales factores pueden incluir un ligando o un objetivo/sustrato natural de una proteína MAP. Un ejemplo de tal un objetivo incluye el factor de inicio eucariótico elF2, que es parte de un complejo de inicio de traducción de proteína. 25

También se abarca por un método recombinante indirecto para modificar la expresión de un gen MAP y/o modificar el nivel y/o la actividad de una proteína MAP es la provisión de, o la inhibición o estimulación de elementos reguladores que conducen la expresión del gen MAP, por ejemplo el gen MAP endógeno. Por ejemplo, tales elementos reguladores a ser introducidos en una planta pueden ser un promotor capaz de conducir la expresión de un gen MAP endógeno. 30

Un método recombinante preferido para modificar la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP y/o la modificación del nivel y/o la actividad de una proteína MAP comprende introducir en una planta un ácido nucleico capaz de modificar la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP y/o capaz de modificar el nivel y/o la actividad de una proteína MAP. 35

De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona un método para modificar las características de crecimiento de plantas como se describió anteriormente, en donde modificar la expresión, el nivel y/o actividad se efectúa al introducir en una planta un ácido nucleico capaz de modificar la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP y/o capaz de modificar el nivel y/o la actividad de una proteína MAP. De acuerdo con una realización más directa y preferida 40 adicional de tal un método, ese ácido nucleico es un ácido nucleico que codifica una proteína MAP o su variante como se describe adelante, o es una variante de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP. Este ácido nucleico que codifica una proteína MAP puede ser tipo silvestre, es decir silvestre o endógeno. Alternativamente, el ácido nucleico puede ser heterólogo, es decir derivado de la misma u otras especies, cuyo ácido nucleico se introduce como un transgen. Este transgen se puede 45 modificar sustancialmente de su forma natural en la composición y/o ambiente genómico a través de la manipulación humana deliberada.

Adicionalmente o alternativamente, modificar la expresión del ácido nucleico que codifica una proteína MAP y/o modificar el nivel y/o la actividad de la proteína MAP en sí misma se puede efectuar mediante un método químico. Tal un método químico puede involucrar la aplicación exógena 5 de uno o más compuestos o elementos capaces de modificar la expresión de un ácido nucleico MAP (gen endógeno o introducido en la planta) y/o capaces de modificar el nivel y/o la actividad de una proteína MAP (endógeno o introducido en la planta). El término "aplicación exógena" como se define aquí se entiende poner en contacto o administrar un compuesto o elemento adecuado a una planta, célula de planta, tejido u órgano. El compuesto o elemento se puede aplicar exógenamente a una 10 planta en una forma adecuada para la retoma de la planta (tal como a través de la aplicación al suelo para retoma por medio de las raíces, o en el caso de algunas plantas, al aplicar directamente a las hojas, por ejemplo mediante rociado). La aplicación exógena puede tener lugar en plantas tipo silvestre o en plantas transgénicas que se han transformado previamente con un ácido nucleico/gen MAP u otro transgen. 15

Los compuestos o elementos adecuados para aplicación exógena incluyen proteínas MAP o ácidos nucleicos MAP. Alternativamente, los compuestos adecuados o elementos incluyen aquellos capaces de unir directamente o indirectamente o activar una proteína MAP. Los compuestos adecuados también incluyen anticuerpos que pueden reconocer o imitar la función de una proteína MAP. Tales anticuerpos pueden comprender "planticuerpos", anticuerpos de cadena única, 20 anticuerpos IgG y anticuerpos camélidos de cadena pesada, así como también sus fragmentos. Otros compuestos adecuados o elementos para modificación química de la expresión, actividad y/o el nivel de un gen o proteína MAP, incluyen sustancias mutagénicas, tal como N-nitroso-N-etilurea, etileno imina, etil metanosulfonato y dietil sulfato. También se puede lograr mutagenia mediante exposición a radiación ionizante, tal como rayos X o rayos gamma o luz ultravioleta. Los métodos para introducir 25 mutaciones, y para probar el efecto de las mutaciones (tal como al monitorear la expresión de gen y/o actividad de la proteína), son bien conocidos en la técnica.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para modificar las características de crecimiento de plantas, que comprende aplicación exógena de uno o más compuestos o elementos capaz de modificar la expresión de un gen MAP y/o capaz de 30 modificar el nivel y/o la actividad de una proteína MAP.

Se describen metioninas aminopeptidasas (MetAP o MAP) en la bibliografía por ser responsables de la inhibición del residuo metionina iniciador de un péptido durante síntesis de (Bradshaw y Yi, 2002, Essays Biochem 38:65-78). Las metionina aminopeptidasas son enzimas específicas y ubicuas que pertenecen a la familia de las metaloenzimas. Se ha encontrado que los 35 Eucariotes tienen dos clases de metionina aminopeptidasa (MAP1 y MAP2), mientras que los procariotes solo tienen uno. También se conoce MAP2 como el factor de inicio eucariótico 2 alfa (elF2alfa) asociado con la proteína p67. Se ha demostrado que la rata p67 en adición a su función peptidasa, también juega un papel importante en la regulación traduccional al evitar la fosforilación de la subunidad alfa del factor-2 de inicio. De acuerdo con lo anterior, las proteínas MAP2 tienen, en 40 adición a su actividad peptidasa, una función no proteolítica para proteger el elF2alfa contra la fosforilación (POEP), ya que el elF2alfa es inactivo en el estado fosforilado (Datta R et al. Biochimie. 2001 83:919-31). Las proteínas MAP de varios organismos se han estudiado con respecto a su función así como también a su estructura. Con base en el análisis de secuencia, se ha encontrado que las proteínas MAP tienen un MAP distintivo y un dominio peptidasa. Por ejemplo, las características 45 estructurales típicas de una proteína MAP1 son MAP1 distintivo (PROSITE PS00680 =[MFY]-x-G-H-G-[LIVMC]-[GSH]-x(3)-H-x(4)-[LIVM]-x-[HN]-[YWVH]) y un dominio pFAM PEPTIDASA_M24. Las características estructurales típicas de una proteína MAP2 incluyen un MAP2 distintivo (PROSITE PS01202 =[DA]-[LIVMY]-x-K-[LIVM]-D-x-G-x-[HQ]-[LIVM]-[DNS]-G-x(3)-[DN]) y un dominio pFAM PEPTIDASA_ M24. Las proteínas MAP2, tal como proteínas de planta 5 MAP2, adicionalmente comprenden por lo menos un dominio rico en lisina en el terminal N. Las proteínas MAP aislados de levadura se han descrito en Li y Chang, (1995) Proc Natl Acad Sci U S A. 92(26): 12357-61, las proteínas MAP humanas se han descrito en Li y Chang (1996) Biochem Biophys Res Commun 227:152-159 y se clonan seis cADN de MAP de Arabidopsis thaliana y las proteínas correspondientes se caracterizan in vivo y in vitro (Giglione et al. EMBO J. 2000 19:5916-10 29). Un ejemplo de una proteína Arabidopsis thaliana MAP se representa aquí por SEQ ID NO 2, y su secuencia codificante por SEQ ID NO 1. Otro ejemplo de una proteína Arabidopsis thaliana MAP se representa aquí por SEQ ID NO 4, y su secuencia codificante por SEQ ID NO 3.

El término "proteína MAP" como se utiliza aquí abarca una metionina aminopeptidasa (MAP), por ejemplo un MAP de la SEQ ID NO 2 o 4, así como también su variante (o un proteína 15 esencialmente similar a esta). Los términos "gen MAP" o "ácido nucleico MAP" o "ácido nucleico que codifica una proteína MAP" se utilizan intercambiablemente aquí y también abarcan ácidos nucleicos MAP variantes, por ejemplo variantes de la SEQ ID NO 1 o 3. Los términos "una variante de" y "esencialmente similar a" se utilizan intercambiablemente aquí. Las proteínas MAP variantes o ácidos nucleicos variantes que codifica una proteína MAP incluyen: 20

(i) porciones funcionales de un ácido nucleico MAP, por ejemplo un ácido nucleico MAP de la SEQ ID NO 1 o 3;

(ii) Secuencias capaces de hibridar con un ácido nucleico MAP, por ejemplo con un ácido nucleico MAP de la SEQ ID NO 1 o 3;

(iii) Variantes de división alternativa de un ácido nucleico MAP, por ejemplo un 25 ácido nucleico MAP de la SEQ ID NO 1 o 3;

(iv) Variantes alélicas de un ácido nucleico MAP, por ejemplo un ácido nucleico MAP de la SEQ ID NO 1 o 3; y

(v) Homólogos, derivados y fragmentos activos de una proteína MAP, por ejemplo una proteína MAP de la SEQ ID NO 2 o 4. 30

Ventajosamente, los métodos de acuerdo con la invención se pueden practicar utilizando proteínas MAP variantes y ácidos nucleicos MAP variantes. Las variantes adecuadas incluyen variantes de la SEQ ID NO 2 o 4 y/o variantes de la SEQ ID NO 1 o 3. Sin embargo, debe ser claro que la aplicabilidad de la invención no se limita al uso del ácido nucleico representado por SEQ ID NO 1 o 3, ni con el ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácido representada por SEQ ID 35 NO 2 o 4, pero que otros ácidos nucleicos que codifican variantes de la SEQ ID NO 2 pueden ser útiles en los métodos de la presente invención.

Para uso en los métodos de acuerdo con la presente invención, la proteína MAP preferiblemente comprende cualquiera de uno o ambos de los siguientes dominios:

a) un MAP distintivo 40

b) un dominio peptidasa-M24

Una proteína MAP preferida comprende ambos dominios en el orden de clasificación anterior.

El término "variante" también incluye variantes en la forma de un complemento, ADN, ARN, cADN o ADN genómico. El ácido nucleico variante se puede sintetizar por completo o en parte, 45 puede ser un ácido nucleico bicatenario o un ácido nucleico monocatenario. También, el término "variante" abarca una variante debida a la degeneración del código genético; un miembro de la familia del o proteína; y variantes que se interrumpen por una o más secuencias que intervienen tal como intrones o transposones.

Un ácido nucleico variante que codifica una proteína MAP es una porción funcional de un 5 ácido nucleico que codifica una proteína MAP. Ventajosamente, el método de la presente invención también se puede practicar utilizando porciones de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP. Una porción funcional se refiere a una pieza de ADN derivada de o preparada de una molécula de ADN original (larga), cuya porción, retiene por lo menos parte de la funcionalidad del ADN original, y que, cuando se expresa en una planta, da plantas que tienen características de crecimiento 10 modificadas. La porción pueden comprender muchos genes, con o sin elementos de control adicionales o puede contener secuencias espaciadoras. La porción se puede hacer al elaborar una o más eliminaciones y/o truncaciones en el ácido nucleico. Las técnicas de introducir truncaciones y eliminaciones en un ácido nucleico son bien conocidas en la técnica. Las porciones adecuadas para uso en los métodos de acuerdo con la invención se pueden determinar fácilmente por los métodos 15 siguientes descritos en la sección de Ejemplos al sustituir simplemente la secuencia utilizada en el Ejemplo actual con la porción a ser probada para funcionalidad.

Otra variante de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP es un ácido nucleico capaz de hibridar con un ácido nucleico que codifica una proteína MAP, por ejemplo para cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican una proteína representada por SEQ ID NO 2 o 4. Las secuencias 20 hibridadas adecuadas para uso en los métodos de acuerdo con la invención se pueden determinar fácilmente, por ejemplo mediante los siguientes métodos descritos en la sección de Ejemplos al sustituir simplemente la secuencia utilizada en el Ejemplo actual con la secuencia hibridada.

El término "hibridar" como se utiliza aquí significa hibridar a una secuencia de nucleótidos complementaria sustancialmente homóloga en un proceso de hibridación. El proceso de hibridación 25 puede ocurrir completamente en la solución, es decir ambos ácidos nucleicos complementarios están en la solución. Las herramientas en la biología molecular se basan en tal un proceso incluyen la reacción de cadena de polimerasa (PCR; y todos los métodos con base en este), hibridación sustractiva, extensión de cebador aleatorizado, mapeo de nucleasa S1, extensión de cebador, transcripción inversa, síntesis de cADN, exhibición diferencial de los ARN, y determinación de la 30 secuencia de ADN. El proceso de hibridación también puede ocurrir con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en una matriz tal como glóbulos magnéticos, glóbulos de Sefarosa o cualquier otra resina. Las herramientas en la biología molecular se basan en tal un proceso incluyen el aislamiento del poli (A+) mARN. El proceso de hibridación puede ocurrir adicionalmente con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en un soporte sólido tal como una nitro-celulosa 35 o membrana de nylon o inmovilizado mediante por ejemplo fotolitografía en por ejemplo un soporte vítreo silíceo (el último conocido como matrices o micromatrices de ácido nucleico o como genochips). Las herramientas en la biología molecular se basan en tal un proceso que incluye análisis blot de gel ARN y ADN, hibridación de colonia, hibridación de placa, hibridación in situ e hibridación de micromatriz Con el fin de permitir que ocurra la hibridación, las moléculas de ácido nucleico 40 generalmente se desnaturalizan térmicamente o químicamente para fundir un bicatenario en dos monocatenarios y/o para remover horquillas u otras estructuras secundarias de ácidos nucleicos monocatenarios. La exigencia de hibridación se influencia por condiciones tales como temperatura, concentración de sodio/sal y hibridación de la composición amortiguadora. Las altas condiciones exigentes para la hibridación incluyen temperatura alta y/o baja concentración de sal (sales que 45 incluyen NaCl y Na3-citrato) y/o la inclusión de formamida en el amortiguador de hibridación y/o disminución de la concentración de compuestos tal como SDS (detergente de dodecil sulfato de sodio) en el amortiguador de hibridación y/o exclusión de compuestos tal como sulfato dextrano o polietilenglicol (promover hacinamiento molecular) del amortiguador de hibridación. Las condiciones de hibridación convencionales se describen en, por ejemplo, Sambrook (2001) Molecular Cloning: a 5 laboratory manual, 3ra Edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, pero el experto apreciará que numerosas condiciones de hibridación diferentes se pueden diseñar en función de la homología esperada o conocida y/o longitud del ácido nucleico. Son particularmente preferidas condiciones de hibridación de exigencia suficientemente baja (por lo menos en el Cebador caso) para aislar ácidos nucleicos heterólogos para las secuencias de ADN de la invención definidas supra. Un 10 ejemplo de condiciones de baja exigencia es 4-6x SSC / 0.1-0.5% p/v SDS a 37-45°C durante 2-3 horas. Dependiendo de la fuente y concentración del ácido nucleico involucrado en la hibridación, se pueden emplear condiciones alternativas de exigencia, tal como condiciones de exigencia media. Ejemplos de de condiciones de exigencia media incluyen 1-4x SSC / 0.25% p/v SDS a ≥ 45°C durante 2-3 horas. Con hibridación específica significa hibridar bajo condiciones exigentes. Un ejemplo de 15 condiciones altamente exigentes incluye 0.1-2XSSC, 0.1XSDS, y 1X SSC, 0.1X SDS a 60°C durante 2-3 horas.

Los métodos de acuerdo con la presente invención también se pueden practicar utilizando una variante de división alternativa de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP, por ejemplo una variante de división alternativa de la SEQ ID NO 1 o 3. El término "variante de división 20 alternativa" como se utiliza aquí abarca variantes de un ácido nucleico cuyos intrones y/o exones seleccionados se han cortado, reemplazado o agregado. Tales variantes divididas se pueden encontrar en la naturaleza o pueden ser hechas por el hombre. Los métodos para elaborar tales variantes divididas son bien conocidos en la técnica. Las variantes divididas adecuadas para uso en los métodos de acuerdo con la invención se pueden determinar fácilmente, por ejemplo, mediante los siguientes 25 métodos descritos en la sección de Ejemplos al sustituir simplemente la secuencia utilizada en el Ejemplo actual con la variante dividida.

Otro ácido nucleico variante MAP útil para practicar el método para modificar las características de crecimiento de plantas, es una variante alélica de un gen MAP, por ejemplo una variante alélica de la SEQ ID NO 1 o 3. Las variantes alélicas que existen en la naturaleza y que se 30 abarcan por los métodos de la presente invención es el uso de estos alelos naturales. Las variantes alélicas también abarcan Polimorfismos de Nucleótido Únicos (SNP) así como también Polimorfismos de Inserción/Eliminación pequeños (INDEL). El tamaño de los INDEL es usualmente menos de 100 bp. Los SNP y INDEL forman el conjunto más largo de las variantes de secuencia en cepas polimórficas de ocurrencia natural de la mayoría de los organismos. Las variantes alélicas 35 adecuadas para uso en los métodos de acuerdo con la invención se pueden determinar fácilmente por ejemplo mediante los siguientes métodos descritos en la sección de Ejemplos l sustituir simplemente la secuencia utilizada en el Ejemplo actual con la variante alélica.

La presente invención proporciona un método para modificar las características de crecimiento de plantas, que comprende modificar expresión en una planta de una variante de división 40 alternativa o de una variante alélica de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP y/o al modificar el nivel y/o actividad en una planta de una proteína MAP codificada por una variante de división alternativa o variante alélica.

Un ejemplo de una variante de proteína MAP útil para practicar los métodos de la presente invención es un homólogo de una proteína MAP. "Homólogos" de una proteína MAP particular 45 abarca péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen una sustitución de aminoácido, eliminación y/o inserción con relación a aquella proteína MAP particular y que tienen actividad funcional y biológica similar como una proteína MAP. Los homólogos de una las proteínas MAP se pueden hacer por el hombre mediante las técnicas de ingeniería genética y/o ingeniería de proteína. Para producir tales homólogos, los aminoácidos de proteína se pueden reemplazar por otros 5 aminoácidos que tienen propiedades similares (tal como hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad similar, propensión a formar o romper estructuras α-helicoidales o estructuras de lámina β). Las tablas de sustitución conservadora son bien conocidas en la técnica (ver por ejemplo Creighton (1984) Proteínas. W.H. Freeman and Company).

Adicionalmente y/o alternativamente, los homólogos de una proteína MAP particular existen 10 en la naturaleza y se pueden encontrar en la misma o especies diferentes u organismos de los que se deriva aquella proteína MAP particular. Dos formas especiales de homólogos, ortólogos y parálogos, son conceptos evolutivos utilizados para describir las relaciones ancestrales de los genes. El término "ortólogos" se relaciona con genes homólogos en diferentes organismos debido a la relación ancestral. El término "parálogos" se relaciona conduplicaciones de gen dentro del genoma de una especie que 15 conduce a genes parálogos. El término "homólogos" de una proteína MAP como se utiliza aquí por lo tanto abarca parálogos y ortólogos de la proteína MAP, que también son útiles para practicar los métodos de la presente invención.

Los homólogos útiles en el método de acuerdo con la invención tienen, en orden incrementado de preferencia, por lo menos 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 20 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66 %, 67%, 68%, 69%, 70 %, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76 %, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO 2 o con la secuencia de la 25 SEQ ID NO 4, preferiblemente sobre la longitud completa de la SEQ ID NO 2 o 4.

El porcentaje de la identidad de secuencia se calcula utilizando un programa de alineación global en forma de pares que implementa el algoritmo de Needleman-Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) que maximiza el número de coincidencias y minimiza el número de gaps. Para el cálculo de los porcentajes mencionados anteriormente, se utiliza el programa Align X (como parte del Vector 30 NTI suite 5.5) con los parámetros estándar y los parámetros variables de penalidad de espacio abierto 10 y y penalidad de extensión de espacio 0.1.

La alineación múltiple de las proteínas MAP de varias fuentes se genera utilizando el programa Clustal X con los parámetros fijos estándar y los parámetros variables de penalidad de espacio abierto 10 y penalidad de extensión de espacio 0.2. El porcentaje de identidad entre las 35 proteínas de esta alineación múltiple se calcula utilizando software BoxShade (disponible en http://www.isrec.isb-sib.ch/ftp-server/boxshade/). La Tabla I da una revisión general de estos porcentajes.

Tabla 1: Identidad de secuencia entre diferentes las proteínas MAP

General: % de identidad Secuencias utilizadas para el cálculo

Entre MAP2 de dicotiledóneas: 90% 2 secuencias Arabidopsis

Entre MAP2 de monocotiledóneas: 80% 2 secuencias de arroz y 1 de maíz

Entre MAP2 de dicotiledóneas y monocotiledóneas: 76% 3 secuencias de monocotiledóneas y 2 de dicotiledóneas

Entre MAP2 de plantas y animales: 65% 5 secuencias de planta y 4 de animal

Entre MAP1 y MAP2: 20% 11 secuencias MAP2 y 6 de MAP1

Los homólogos útiles en los métodos de acuerdo con la invención se pueden derivar (directamente o indirectamente, es decir si se modifica posteriormente) de cualquier fuente proporcionada de aquella la secuencia, cuando se expresa en una planta, conduce a características de crecimiento modificadas. El ácido nucleico se puede aislar de una fuente microbiana, tal como fuente de bacterias, levadura u hongos, o de una planta, alga, insecto o animal (incluyendo humano). 5

El ácido nucleico que codifica un homólogo MAP se aísla preferiblemente de una planta. Adicionalmente preferiblemente, el ácido nucleico se aísla de una planta dicotiledónea, preferiblemente de la familia Brassicaceae, adicionalmente preferiblemente de Arabidopsis thaliana. Las proteínas MAP de Arabidopsis se han subdividido en tres clases diferentes en la base de su nivel de homología de secuencia (Giglione et al. (2000, EMBO J. 19: p 5916-5929). Se identifican la clase 10 MAP1 (con isoformas A, B, C y D) y clase MAP2 (con isoformas A y B) en Arabidopsis. Estas clases e isoformas también se abarcan por el término "homólogo" como se utiliza aquí. Ventajosamente, estas diferentes clases o isoformas de las proteínas MAP, o sus ácidos nucleicos codificantes, se pueden utilizar en los métodos de la presente invención. De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona un método como se describió aquí anteriormente, en donde el ácido nucleico 15 MAP o proteína MAP se obtiene de una planta, preferiblemente de una planta dicotiledónea, adicionalmente preferiblemente de la familia Brassicaceae, más preferiblemente de Arabidopsis thaliana. De acuerdo con una realización adicional, un ácido nucleico o proteína MAP es un ácido nucleico MAP2 o proteína o un ácido nucleico o proteína MAP1. De acuerdo con una realización adicional de la invención, el ácido nucleico MAP codificante o la proteína MAP es, una isoforma de la 20 proteína MAP representada por la SEQ ID NO 2 o 4. De acuerdo con una realización adicional de la invención, el ácido nucleico MAP codifica o la proteína MAP es la proteína MAP2B Arabidopsis thaliana representada por la SEQ ID NO 2.

Otros homólogos MAP preferidos y sus secuencias codificantes se pueden encontrar en la base de datos de secuencia (pública). Los métodos para la búsqueda y la identificación de homólogos 25 MAP en la base de datos de secuencia estarán bien dentro del ámbito de las personas expertas en la técnica. Tales métodos, involucran la detección de la base de datos de secuencia con las secuencias proporcionadas por la presente invención, por ejemplo SEQ ID NO 2 o 4 (o SEQ ID NO 1 o 3), preferiblemente en una forma legible por computador. Las bases de datos de secuencia útiles incluyen, pero no se limitan a, Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genbank), la Base de Datos de 30 Ácido Nucleico del Laboratorio de Biología Molecular Europea (EMBL) (http:/w.ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db.html) o sus versiones o la base de datos MIPS (http://mips.gsf.del). Diferentes algoritmos de búsqueda y el software para la alineación y comparación de las secuencias son bien conocidos en la técnica. Tal software incluye por ejemplo GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. Preferiblemente se utiliza el software BLAST, que calcula el porcentaje de identidad de 35 secuencia y desarrolla un análisis estadístico de la similitud entre las secuencias. Los programas adecuados se refieren a programas BLAST que tienen 5 diferentes implementaciones: tres diseñados para consultas de secuencias de nucleótidos (BLASTN, BLASTX, y TBLASTX) y dos diseñados para consultas de secuencias de proteínas (BLASTP y TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology: 76-80, 1994; Birren et al., GenomeAnalysis, 1: 543, 1997). El software para desarrollar el análisis 40 BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional para la Información de Biotecnología.

Los ortólogos de una proteína MAP en otras especies de planta se pueden encontrar fácilmente al desarrollar una búsqueda Blast recíproca. Este método abarca la búsqueda de una o más bases de datos de secuencia con un gen o proteína de consulta de interés (por ejemplo SEQ ID NO 1, 2, 3 o 4), utilizado por ejemplo el programa BLAST. Los genes objeto de mayor clasificación que resultan de la búsqueda se utilizan luego como una secuencia de consulta en una búsqueda similar 5 BLAST. Solo aquellos genes que tienen como una alta coincidencia de nuevo la secuencia original de consulta (SEQ ID NO 1, 2, 3 o 4) se considera que son genes ortólogos. Por ejemplo, para encontrar un ortólogo de arroz de un gen Arabidopsis thaliana, uno puede desarrollar un análisis BLASTN o TBLASTX en una base de datos de arroz tal como (pero no limitado a) la base de datos Oryza sativa Nipponbare disponible en el sitio web NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) o las secuencias 10 genómicas de arroz (cultivars indica o japonica). En una siguiente etapa, las secuencias de arroz obtenidas se utilizan en un análisis inverso BLAST utilizando una base de datos Arabidopsis. El método se puede utilizar para identificar ortólogos de muchas especies diferentes, por ejemplo de maíz.

Los parálogos de una proteína MAP en la misma especie se puede encontrar fácilmente al 15 desarrollar una búsqueda Blast en secuencias de la misma especie de las que se deriva la proteína MAP. De las secuencias que se seleccionan por la búsqueda Blast, se pueden identificar parálogos verdaderos mediante búsqueda de identidad entre las secuencias o para conservación de los dominios típicos MAP. Una búsqueda de parálogos de la proteína MAP Arabidopsis thaliana se han llevado a cabo por Giglione et al. (2000, EMBO J. 19: p 5916-5929). 20

Un BLAST que utiliza parámetros predeterminados y que utiliza la SEQ ID NO 2 o la SEQ ID NO 1 como secuencia de búsqueda se desarrolla y resulta en la identificación de los siguientes ácidos nucleicos MAP y proteínas. Las secuencias sustancialmente idénticas a la SEQ ID NO 1 (AtMAP2B) se han publicado bajo los números de acceso Genbank NM-115862 (ADN genómico), BT000063 (At3g59990 mARN), AY084710, AY065161 y AF300880. Una isoforma de la SEQ ID 25 NO 1 y 2, denominada aquí AtMAP2A, se encuentra en la base de datos bajo el número de acceso Genbank AF250964. Las isoformas de una clase diferente se encuentran en la base de datos bajo el número de acceso Genbanks AF250960 ((AtMAP1A y representado aquí por la SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4), AF250961 (AtMAP1B), AF250962 (AtMAP1C) y AF250963 (AtMAP1D).

También se han identificado homólogos MAP de diferentes especies de planta, cuyos 30 homólogos son útiles en los métodos de la presente invención. Existe un alto grado de conservación entre las proteínas MAP de plantas (ver Tabla I). Tales homólogos incluyen por ejemplo, la proteína MAP de Oryza sativa como se publica en el número de acceso bajo la base de datos Genbank BAD03108, la proteína Oryza sativa bajo el número de acceso AK122063, la proteína Oryza sativa bajo el número de acceso Genbank AK107616 y la proteína Zea Mays bajo el número de acceso 35 Genbank AY105027. Los genes que codifican los homólogos MAP de plantas de cultivo pueden ser especialmente útiles en practicar los métodos de la invención en plantas de cultivo. En otra realización de la invención, los genes que codifican los homólogos MAP de una planta dicotiledónea se pueden utilizar para practicar los métodos de la presente invención en una planta monocotiledónea, o viceversa. 40

Las secuencias de genoma de Arabidopsis thaliana y Oryza sativa ahora están disponibles en las bases de datos públicas tal como Genbank y otros genomas actualmente se secuencian. Por lo tanto, se espera que los homólogos adicionales serán fácilmente identificables mediante alineación de secuencia con la SEQ ID NO 1 o 3 o con la SEQ ID NO 2 o 4 utilizando los programas Blast X o BlastP u otros programas. 45

Se puede construir un árbol filogenético con todos los homólogos, parálogos y ortólogos como se definió aquí anteriormente. Las alineaciones múltiples se hacen utilizando el programa ClustalX como se describió aquí anteriormente. El árbol filogenético se hace por el empaque de software Phylip disponible en http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html. Los agrupamientos de secuencias alrededor de una o más de las 6 proteínas MAP de Arabidopsis thaliana 5 identifica proteínas, y sus correspondientes genes, aptos para uso en los métodos de la presente invención.

Los análisis de software mencionados anteriormente para comparar las secuencias, para el cálculo de la identidad de secuencia, para la búsqueda de homólogos, ortólogos o parálogos o para la elaboración de un árbol filogenético, se hace preferencialmente con secuencias de longitud completa. 10 Alternativamente, se puede llevar a cabo este análisis de software con una región conservada de la proteína MAP o secuencia de ADN. De acuerdo con lo anterior, estos análisis se pueden basar en la comparación y cálculo de la identidad de secuencia entre regiones conservadas, dominios funcionales, motivos o cuadros.

La identificación de tales dominios o motivos, por ejemplo, los dominios representados por la 15 SEQ ID NO 5 (MAP1 distintivo), SEQ ID NO 6 (MAP2 distintivo), SEQ ID NO 7 (dominio peptidasa-M24 de AtMAP1A), SEQ ID NO 8 (dominio de peptidasa-M24 de AtMAP2B), SEQ ID NO 9 (dominio rico en lisina de AtMAP2B), también estaría bien dentro del ámbito de una persona experta en la técnica e involucra la detección de un formato legible por computador de las proteínas MAP para la presencia de dominios conservados de proteína, motivos y cuadros. Está disponible la 20 información del dominio de proteína en la base de datos PRODOM (http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/jj/prodomsrchjj.html). PIR (http://pir.georgetown.edu/), PROSITE (http://au.expasy.org/PROSITE/) o pFAM (http://pFAM .wustl.edu/). Los programas de software diseñados para tal dominio de búsqueda incluyen, pero no se limitan a, MotifScan, MEME, SIGNALSCAN, y GENESCAN. El MotifScan es un programa de 25 software preferido y está disponible en (http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN, cuyo programa utiliza una información de dominio de proteína de PROSITE y pFAM . Se puede encontrar un algoritmo MEME (Versión 3.0) en el empaque GCG; o en http://www.sdsc.edu/ MEME/meme. La información SIGNALSCAN versión 4.0 está disponible en http://blosci.cbs.umn.edu/software/sigscan.html. Se puede encontrar GENESCAN en http://gnomic.stanford.edu/GENESCANW.html. 30

El término "MAP distintivo" significa un dominio específico MAP. Ejemplos de tales MAP distintivo son MAP1 o MAP2 distintivos. La MAP1 distintiva se describe en la base de datos PROSITE bajo el número de acceso PS00680 y se representa aquí por la secuencia consenso de la SEQ ID NO 5: [MFY]-x-G-H-G-[LIVMC]-[GSH]-x(3)-H-x (4)-[LIVM]-x-[HN]-[YWVH]. En las proteínas MAP1, la MAP1 distintiva se puede ubicar dentro del dominio peptidasa. El MAP2 35 distintivo se describe adicionalmente en la base de datos PROSITE bajo el número de acceso PS01202 y se representa aquí por las secuencias consenso de la SEQ ID NO 6: [DA]-[LIVMY]-x-K-[LIVM]-D-x-G-x-[HQ]-[LIVM]-[DNS]-G-x(3)-[DN]. En el caso de las proteínas MAP2, el MAP2 distintivo se ubica preferiblemente en la dirección 5’ del dominio peptidasa. Una persona experta en la técnica reconocerá un MAP distintivo que se puede desviar, con por ejemplo 1 o 2 emparejamientos erróneos, 40 de los MAP consenso distintivos mencionados anteriormente, sin perder su funcionalidad. Un ejemplo se encuentra en la proteína MAP2 Drosophila (ver Figura 3), que tiene un K en la vigésima posición de su MAP2 distintivo, en lugar de D, N, o S.

El término "dominio peptidasa-M24 ", como se utiliza aquí, se refiere a un dominio peptidasa, que ocurre en las proteínas MAP. El dominio peptidasa-M24 se describe en la base de datos 45 pFAM bajo el número de acceso PF00557. Una secuencia consenso para este dominio no se da en la base de datos pFAM, pero se categorizan casi 500 proteínas que tienen un dominio peptidasa-M24. Este dominio se puede identificar mediante su doblez y estructura terciaria, diferente de su estructura primaria, que puede ser variable. Diferentes proteínas MAP por lo tanto también exhiben variación sustancial en la estructura primaria (secuencia de aminoácido) de este dominio peptidasa-M24 (ver 5 Figura 3). Una persona experta en la técnica conocerá fácilmente cómo determinar la presencia de un dominio peptidasa-M24 en una secuencia de proteína. Un ejemplo es someter una secuencia de proteína a un programa de software capaz de determinar dominios conservados, por ejemplo el programa MotifScan como se describe aquí anteriormente. Un ejemplo de un dominio peptidasa-M24 se da en la SEQ ID NO 7, que es el dominio peptidasa-M24 de AtMAP1A. Otro ejemplo se da en la 10 SEQ ID NO 8, que es el dominio peptidasa-M24 de AtMAP2B. Preferiblemente, la proteína MAP utilizada en los métodos de la presente invención tiene un dominio peptidasa-M24, que es por lo menos 70% idéntico a la SEQ ID NO 7 o a la SEQ ID NO 8.

Opcionalmente, por ejemplo el caso de las proteínas MAP2, la proteína MAP útil en los métodos de la presente invención tiene por lo menos un dominio rico en lisina. Preferiblemente tal 15 dominio rico en lisina se ubica entre el terminal N y el MAP distintivo. El término "región rica en lisina" significa una región de aminoácido, que se enriquece con aminoácidos lisina. Típicamente un dominio rico en lisina es una secuencia de aminoácido de las que más de 50% de los aminoácidos son lisina (K). Por ejemplo, en AtMAP2B, 12 de 14 residuos continuos del dominio rico en lisina son lisina, que corresponde a 85% de los residuos lisina. Opcionalmente se puede presentar un tramo de 20 lisitinas continuas, por ejemplo un tramo de por lo menos 3 residuos lisina, por ejemplo de 4, 5, 6 o más residuos lisina. De acuerdo con lo anterior, la variación sustancial entre el dominio rico en lisina de diferentes proteínas MAP existe, como se ilustra en la Figura 3. El dominio rico en lisina de la proteína MAP2B Arabidopsis thaliana se representa por la SEQ ID NO 9.

Con base en la presencia y conservación de los dominios estructurales mencionados 25 anteriormente, las personas expertas en la técnica han sido capaces de reconocer fácilmente las proteínas MAP de diferentes organismos, por ejemplo de plantas (ver Giglione et al., (2000), EMBO J. 19: p 5916-5929).

Algunas de las variantes como se mencionó aquí anteriormente pueden ocurrir en la naturaleza. Una vez se conoce la secuencia de una variante, y su secuencia codificante 30 correspondiente, la persona experta en la técnica será capaz de aislar el gen MAP o variante correspondiente de material biológico, por ejemplo mediante la técnica de PCR. Un ejemplo de tal un experimento se destaca en el Ejemplo 1.

Alternativamente y/o adicionalmente, las variantes como se mencionó anteriormente se puede hacer por el hombre mediante técnicas que involucran, por ejemplo, mutación (sustitución, 35 inserción o eliminación) o derivación. Estas variantes se refieren aquí como "derivados", tales derivados también son útiles en los métodos de la presente invención. Los derivados de una proteína se pueden hacer fácilmente utilizando técnicas de síntesis de péptido bien conocidas en la técnica, tal como síntesis de péptido de fase sólida y similares, o mediante manipulaciones de ADN recombinante. La manipulación de las secuencias de ADN para producir las variantes de sustitución, 40 inserción o eliminación de una proteína son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las técnicas para elaborar las mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en ADN son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen mutagenia M13, mutagenia T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH), Mutagenia Dirigida al sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagenia dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagenia dirigidos al sitio. 45

Un ejemplo de un derivado es una variante de sustitución. El término "variantes de sustitución" de una proteína se refiere a aquellas variantes en las que se ha removido por lo menos un residuo en una secuencia de aminoácido y se inserta un aminoácido diferente en su lugar. Las sustituciones de aminoácido son típicamente de residuos únicos, pero que se pueden agrupar dependiendo de restricciones funcionales puestas en el polipéptido; las inserciones usualmente son del 5 orden de aproximadamente 1-10 aminoácidos, y las eliminaciones pueden variar de aproximadamente 1-20 aminoácidos. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos comprenden sustituciones de aminoácidos conservadoras.

Otros derivados son "variante de inserción" en las que uno o más aminoácidos se introducen en un sitio predeterminado en la proteína MAP. Las inserciones pueden comprender fusión en el 10 Terminal amino y/o terminal carboxi así como también inserción intrasecuencia de un único o múltiples aminoácidos. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia amino agregada son del orden de aproximadamente 1 a 10 aminoácidos. Ejemplos de fusiones de terminal amino- o carboxi incluyen fusión del dominio de unión o dominio de activación de un activador transcripcional como se utiliza en el sistema de dos híbridos de levadura, proteínas recubiertas de fago, (histidina)6-tag, S-15 transferasa glutationa, proteína A, proteína de unión maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo Tag•100, epítopo c-myc, epítopo FLAG®, lacZ, CMP (péptido de unión a calmodulina), epítopo HA, epítopo de proteína C y epítopo VSV.

Otros derivados de una proteína MAP son "variantes de eliminación", caracterizados por la remoción de uno o más aminoácidos de la proteína. 20

Otro "derivado" de una proteína MAP se caracteriza por sustituciones, y/o eliminaciones y/o adiciones de aminoácidos de ocurrencia natural o no natural se compara con los aminoácidos de una proteína MAP de ocurrencia natural. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes sin aminoácidos que se comparan con la secuencia de aminoácido de la que este se deriva. Tales sustituyentes sin aminoácido incluyen por ejemplo aminoácidos de ocurrencia no natural, una 25 molécula reportera u otro ligando, unido covalentemente o no covalentemente a la secuencia de aminoácido. Tal como molécula reportera se puede unir para facilitar la detección de la proteína MAP.

Otra variante de una proteína MAP útil en los métodos de la presente invención es un fragmento activo de una proteína MAP. "Fragmentos activos" de una proteína MAP abarcan por lo menos cinco residuos de aminoácido contiguos de una proteína MAP, cuyos residuos retienen la 30 actividad biológica y/o funcional similar en una proteína de ocurrencia natural o una parte de la misma. Los fragmentos adecuados incluyen fragmentos de una proteína MAP partiendo del segundo o tercero o residuos metionina internos adicionales. Estos fragmentos originados de la traducción de proteína, partiendo de codones internos ATG. Los fragmentos funcionales de una proteína MAP útiles en practicar los métodos de la presente invención pueden tener o más de los dominios conservados de 35 las proteínas MAP, mientras retiene su funcionalidad en los métodos de la presente invención.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, un método para modificar las características de crecimiento de plantas, comprende mejorar o incrementar la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP. Los métodos para obtener expresión de genes mejorada o incrementada o productos de gen son bien documentados en la técnica e incluyen, por 40 ejemplo, sobreexpresión conducida por un promotor (fuerte), el uso de mejoradores de transcripción o mejoradores de traducción. El término sobreexpresión como se utiliza aquí significa cualquier forma de expresión que es adicional al nivel de expresión tipo silvestre original. Preferiblemente el ácido nucleico a ser introducido en la planta y/o el ácido nucleico que se sobreexpresa en la planta está en el sentido de dirección con respecto al promotor al que se liga operablemente. Preferiblemente, en los 45 métodos de la presente invención un ácido nucleico que codifica una proteína MAP se sobrexpresa en una planta, tal como un ácido nucleico MAP de la SEQ ID NO 1 o su variante, tal como una porción de la SEQ ID NO 1 o una secuencia capaz de hibridar con este. Sin embargo, debe ser claro que la aplicabilidad de la invención no se limita al uso del ácido nucleico representado por SEQ ID NO 1 ni al ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO 2, pero que otros ácidos 5 nucleicos que codifican homólogos, derivados o fragmentos activos de la SED ID NO 2 pueden ser útiles en los métodos de la presente invención.

Alternativamente y/o adicionalmente, la expresión incrementada de un gen MAP o el nivel incrementado, y/o la actividad de una proteína MAP en una planta la célula, se alcanza por mutagenia. Por ejemplo estas mutaciones pueden ser responsables por el control alterado del gen MAP, 10 resultando en mayor expresión del gen, con relación al gen tipo silvestre. Las mutaciones también pueden originar cambios conformacionales en una proteína, que resulta en niveles mayores y/o mayor actividad de la proteína MAP. Tales mutaciones o tales genes mutantes se pueden seleccionar, o aislar y/o introducir en la misma o diferentes especies de planta con el fin de obtener plantas que tienen características de crecimiento modificadas. Ejemplos de tales mutantes incluyen mutantes positivos 15 dominantes de un gen MAP.

Modificar la expresión de gen (mediante un método directo o indirecto) abarca niveles de trascripto de gen alterados. Los niveles de transcripto alterados pueden ser suficientes para inducir ciertos efectos fenotípicos, por ejemplo por medio del mecanismo de cosupresión. Aquí el efecto general de la sobreexpresión de un transgen es que existe menos actividad en la célula de la proteína 20 codificada por un gen natural que tiene homología en el transgen introducido. Por lo tanto, de acuerdo con otra realización de la presente invención, se proporciona un método para modificar las características de crecimiento de plantas, que comprende inhibir o reducir la expresión de un gen que codifica una proteína MAP o reducir el nivel y/o la actividad de una proteína MAP. Ejemplos para reducir la expresión, el nivel y/o la actividad de una proteína también están bien documentados en la 25 técnica e incluyen, por ejemplo, subregulación de la expresión mediante técnicas anticodificantes, técnicas de ARNi, ARN de interferencia pequeña (siARN) y microARN (miARN).

Otro método para la subregulación de la expresión del gen o inactivación del gen comprende uso de ribozimas, por ejemplo como se describe en Atkins et al. 1994 (WO 94/00012), Lenee et al. 1995 (WO 95/03404), Lutziger et al. 2000 (WO 00/00619), Prinsen et al. 1997 (WO 97/3865) y Scott 30 et al. 1997 (WO 97/38116).

También se puede alcanzar inactivación del gen mediante mutagenia de inserción (por ejemplo, inserción de T-ADN o inserción de transposón) o mediante estrategias de inactivación del gen como se describe por, entre otros, Angell y Baulcombe 1998 (WO 98/36083), Lowe et al. 1989 (WO 98/53083), Lederer et al. 1999 (WO 99/15682) o Wang et al. 1999 (WO 99/53050). 35

La expresión de un gen MAP endógeno también se puede reducir mediante mutación. Tal una mutación o tal un gen mutante se puede aislar y introducir en la misma o especies diferentes de planta con el fin de obtener plantas que tienen características de crecimiento modificadas. Ejemplos de tales mutantes incluyen mutantes negativos dominantes de un gen MAP.

Las construcciones genéticas con objetivo de inactivar la expresión del gen pueden 40 comprender la secuencia de nucleótido que codifica una proteína MAP, por ejemplo un ácido nucleico representado por SEQ ID NO 1 (o su variante), en una orientación codificante y/o anticodificante con relación a la secuencia promotora. Las copias codificantes y/o anticodificantes de por lo menos parte del gen endógeno en la forma de repeticiones directas o invertidas o en la forma de una horquilla se puede utilizar en los métodos de acuerdo con la invención. El crecimiento de plantas también se puede 45 modificar al introducir en una planta por lo menos parte de una versión anticodificante de una secuencia de nucleótido que codifica una proteína MAP.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporcionan construcciones genéticas y vectores para facilitar la introducción en una planta la célula y/o facilitar la expresión y/o facilitar el mantenimiento de la secuencia de nucleótido capaz de modificar la expresión 5 de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP y/o capaz de modificar el nivel y/o la actividad de una proteína MAP. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una construcción genética que comprende:

(a) Un ácido nucleico que codifica una proteína MAP de la planta o su variante o una variante de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP de la planta; 10

(b) Una o más secuencias de control capaces de controlar la expresión del ácido nucleico de en una planta (a); y opcionalmente

(c) Una secuencia de terminación de transcripción.

Las construcciones útiles en los métodos de acuerdo con la presente invención se pueden construir utilizando tecnología de ADN recombinante bien conocida por las personas expertas en la 15 técnica. Las construcciones genéticas se pueden insertar en los vectores, que pueden estar disponibles comercialmente, adecuado para la transformación en plantas y adecuado para mantenimiento y la expresión de un gen MAP en las células transformadas. Preferiblemente la construcción genética es un vector de expresión de planta.

El ácido nucleico de acuerdo con (a) es ventajosamente cualquiera de los ácidos nucleicos 20 descritos aquí anteriormente. Un ácido nucleico preferido es un ácido nucleico representado por la SEQ ID NO 1 o 3, o su variante como se definió aquí anteriormente, o es un ácido nucleico que codifica a proteína representado por SEQ ID NO 2 o 4, o su variante como se definió aquí anteriormente.

Los términos "elemento regulador" y "secuencias de control", se utilizan 25 intercambiablemente aquí y se toman en un amplio contexto referido como secuencias de ácido nucleico reguladoras capaces de controlar y/o regular la expresión de las secuencias a las que ellas se ligan y/o se ligan operablemente. Preferiblemente, las secuencias de control de (b) es operable en una planta, más preferiblemente las secuencias de control es una derivada de una secuencia de planta. Se abarcan por los términos "secuencias de control" los promotores. Un "promotor" abarca secuencias 30 reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico eucariótico clásico (que incluye el cuadro TATA que se requiere para el inicio de transcripción exacto, con o sin una secuencia de caja CCAAT) elementos reguladores áridos adicionales (es decir secuencias activantes en la dirección 5’, mejoradoras e inactivadoras), que alteran la expresión de gen en respuesta al estímulo externo y/o de desarrollo, o en una forma específica de tejido. También se incluye dentro del término una secuencia 35 reguladora transcripcional de un gen procariótico clásico, en cuyo caso este puede incluir una secuencia de -35 cuadros y/o secuencias reguladores transcripcionales de -10 cuadros. El término "elemento regulador" también abarca una molécula o derivado de fusión sintética, que confiere, activa o mejora la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano. El término "ligado operablemente" como se utiliza aquí se refiere a un ligado funcional entre la secuencia 40 promotora y el gen de interés, de tal manera que la secuencia promotora es capaz de iniciar la transcripción del gen de interés. Preferiblemente, el promotor se liga operablemente al gene de interés en una orientación codificante.

Ventajosamente, se puede utilizar cualquier tipo de promotor en los métodos de la presente invención. Por ejemplo, un promotor específico de meristemo, tal como el RNR (reductasa 45 ribonucleótido), promotor cdc2a y el promotor cyc07; o un promotor específico de semilla, tal como albúmina 2S2, prolamina, o promotor oleosina. Se puede seleccionar un promotor con el fin de incrementar la expresión de una proteína MAP en el momento de germinación. Alternativamente, se puede utilizar un promotor expresado solo en uno o más de los tejidos de semilla, tal como la aleurona, embrión, escutelo o endosperma. Un promotor específico de flor, tal como el promotor con 5 hojas, se puede utilizar si el resultado deseado será para modificar la expresión de un gen MAP en órganos de flor. Un promotor específico de antera se puede utilizar para modificar la expresión de MAP en órganos reproductores. Adicionalmente, se puede utilizar un promotor específico de raíz, particularmente en cultivos en los que las raíces se cosechan; tales cultivos incluyen remolacha, nabo, zanahoria, y papa. Un promotor específico vascular se puede utilizar o un promotor específico de 10 nódulo o un promotor inducible por tensión. Un promotor específico de pared celular se puede utilizar o los promotores expresados preferiblemente en uno o más de los tejidos de fondo anteriores de la planta, tal como tejidos verdes, brotes, tallos, hojas, frutos, y tejidos jóvenes que se expanden.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, el ácido nucleico MAP en la construcción genética como se describió anteriormente, se liga operablemente a un promotor 15 constitutivo. El término "constitutivo" como se define aquí se refiere a un promotor que se expresa sustancialmente continuamente en y sustancialmente todos los tejidos de una planta. Ejemplos de promotores constitutivos útiles se seleccionan del promotor de arroz GOS2, promotor de maíz GOS2, promotor CaMV35S, promotor ubiquitina, promotor enolasa, promotor actina-2 y promotor L-41 u otros promotores con patrones de expresión similares. Los promotores con patrones de expresión 20 similar se pueden encontrar al acoplarlos en un gen reportero y revisar la función del gen reportero en diferentes tejidos de una planta. Un gen reportero adecuado es beta-glucuronidasa y teñido GUS calorimétrico para visualizar la actividad beta-glucuronidasa en un tejido de planta es bien conocido por una persona experta en la técnica.

Opcionalmente, una o más secuencias de terminación de transcripción también se pueden 25 incorporar en la construcción genética. El término "secuencia de terminación de transcripción" abarca una secuencia de control al final de una unidad transcripcional, cuyas señales de procesamiento u poliadenilación 3’ de un transcripto primario y la terminación de transcripción. Los elementos reguladores adicionales, tal como mejoradores transcripcionales o traduccionales, se pueden incorporar en la construcción genética. Aquellos expertos en la técnica serán conscientes de 30 secuencias terminadoras y mejoradoras, que pueden ser adecuadas para uso en la invención. Tales secuencias se conocerían o se podrían obtener fácilmente por una persona experta en la técnica.

Las construcciones genéticas de la invención pueden incluir adicionalmente un origen de replicación que se requiere para mantenimiento y/o replicación en un tipo celular específico. Un ejemplo es cuando una construcción genética se requiere para ser mantenida en una célula bacteriana 35 como un elemento genético episómico (por ejemplo plásmido o molécula cósmida) en una célula. Los orígenes preferidos de replicación incluyen, pero no se limitan a, f1-ori y colE1 ori.

La construcción genética puede comprender opcionalmente un gen marcador seleccionable. Como se utiliza aquí, el término "gen marcador seleccionable" incluye cualquier gen, que confiere un fenotipo en una célula en la que este se expresa para facilitar la identificación y/o selección de la 40 células, que se transfectan o se transforman, con una construcción genética de la invención. Se pueden seleccionar marcadores adecuados que confieren resistencia antibiótica o herbicida. La células que contienen el ADN recombinante así serán capaces de sobrevivir a la presencia de concentraciones antibióticas o herbicidas que matan células no transformadas. Ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen genes que confieren resistencia a los antibióticos (tal como nptll que codifica 45 fosfotransferasa neomicina capaz de fosforilar la neomicina y canamicina, o hpt que codifica fosfotransfersa higromicina capaz de fosforilar la higromicina), a herbicidas (por ejemplo barra que proporciona resistencia a Basta; aroA o gox que proporciona resistencia contra el glifosato), o genes que proporciona un rasgo metabólico (tal como manA que permite a las plantas utilizar manosa como fuente de carbón sola). Los genes marcadores visuales resultan en la formación de color (por ejemplo 5 beta-glucuronidasa, GUS), luminiscencia (tal como luciferasa) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP, y sus derivados). adicionalmente ejemplos de genes marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen de resistencia a ampicilina (Ampr), gen de resistencia a tetraciclina (Tcr), gen de resistencia de canamicina bacteriana (Kanr), gen de resistencia fosfinotricina, y el gen cloramfenicol acetiltransferasa (CAT), entre otros. 10

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para la producción de plantas, que tiene características de crecimiento modificadas con relación a plantas tipo silvestre correspondientes, que comprende modificar la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP y/o modificar el nivel y/o la actividad de una proteína MAP en la planta. De acuerdo con una realización de la invención, tal un método comprende introducir en una planta la 15 célula un ácido nucleico capaz de modificar la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP y/o capaz de modificar el nivel y/o la actividad de una proteína MAP.

De acuerdo con una realización adicional de la invención, se proporciona un método para la producción de plantas que tienen características de crecimiento modificadas, cuyo método comprende:

(a) Introducir en una planta la célula un ácido nucleico que codifica una proteína 20 MAP o su variante, o introducir una variante de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP; y

(b) Cultivar dicha célula de planta bajo condiciones que promueven el crecimiento de la planta.

De acuerdo con una realización preferida adicional, el ácido nucleico de (a) es como el 25 representado por la SEQ ID NO 1 o 2, o su variante, o el ácido nucleico de (a) codifica una proteína MAP como se representa por SEQ ID NO 2 o 4, o su variante.

Cultivar células de planta bajo condiciones que promueven el crecimiento de la planta, pueden o no incluir la regeneración de la planta la célula en una planta. Cultivar células de planta bajo condiciones que promueven el crecimiento de la planta puede o no incluir el crecimiento para alcanzar 30 la madurez, que incluye por ejemplo producción de frutos, formación de semillas, maduración de semillas y endurecimiento de semillas.

Métodos para modificar la expresión de un ácido nucleico MAP y/o para modificar el nivel y/o la actividad de una proteína MAP en una planta la célula, incluyen la introducción de la proteína directamente en dicha célula, por ejemplo mediante microinyección o medio balístico. 35 Alternativamente, estos métodos incluyen la introducción de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP en una célula de planta transitoria.

El ácido nucleico MAP se introduce preferiblemente en una planta mediante transformación. El término "transformación" se refiere aquí que abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula anfitriona, independiente del método utilizado para transferencia. 40

El tejido de planta capaz de propagación clónica posterior, mediante organogenia o embriogenia, se puede transformar con una construcción genética de la presente invención. La elección del tejido depende de la especie de planta particular a ser transformada. Los objetivos de tejido de ejemplo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledóneas, hipocotiledóneas, megagametofitos, tejido calloso, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemos 45 apicales,retoños axilares, y meristemos de raíz), y tejido meristemático inducido (por ejemplo, meristemos de cotiledones y meristemos de hipocotilos).El ácido nucleico se puede introducir transitoriamente o establemente en una célula de planta y se puede mantener no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Preferiblemente, el ácido nucleico que codifica una proteína MAP se introduce establemente en el genoma de la célula de planta transformada. La introducción estable en el 5 genoma de una célula de planta se puede alcanzar, por ejemplo, al utilizar un vector de transformación de planta o un vector de expresión de planta que tiene límites de T-ADN cuyo flanco de ácido nucleico a ser introducido en el genoma.

La transformación de una especie de planta ahora es una técnica bastante rutinaria. Ventajosamente, cualquiera de estos varios métodos de transformación se pueden utilizar para 10 introducir un ácido nucleico MAP en una célula de planta. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, químicos que incrementan la retoma de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, bombardeo de pistola de partículas, transformación utilizando virus o polen y microproyección. Se pueden seleccionar métodos del método de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. et al., 1882, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. 15 Biol. 8, 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol 3, 1099-1102); microinyección en material de planta (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen Genet 202, 179-185); bombardeo de partículas recubiertas con ADN o ARN (Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70) infección con virus (no integrado) y similares. Un método de transformación preferido para la producción de plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención, es un método de 20 transformación mediado por Agrobacterium.

Las plantas de arroz transgénicas se producen preferiblemente por medio de transformación mediad por Agrobacterium utilizando cualquiera de los métodos bien conocidos para transformación de arroz, tal como otras descritas en cualquiera de los siguientes: solicitud de patente Europea publicada EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta, 199, 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol. 25 Biol. 22 (3) 491-506, 1993); Hiei et al. (Plant J. 6 (2) 271-282, 1994). En el caso de transformación de maíz, el método preferido es como se describe en Ishida et al. (Nat. Biotechnol. 1996 Jun; 14(6): 745-50) o Frame et al. (Plant Physiol. 2002 May; 129(1):13-22).

Generalmente después de transformación, las células de planta o los grupos de célula se seleccionan por la presencia de uno o más de los genes marcadores seleccionables mencionados 30 anteriormente, que se cotransforman con el gen MAP.

Las células de planta transformadas resultantes, los grupos de células, o tejido de planta luego se pueden utilizar para regenerar una planta completa por medio de técnicas bien conocidas por las personas expertas en la técnica.

Posteriormente, las células de planta putativamente transformadas o plantas se pueden 35 evaluar, por ejemplo utilizando análisis Southern, por la presencia del gen de interés, número de copia y/o organización genómica. Alternativamente o adicionalmente, los niveles de expresión del ácido nucleico introducido se pueden llevar a cabo utilizando análisis Northern y/o Western, ambas técnicas son bien conocidas por las personas expertas en la técnica.

Las plantas transformadas regeneradas se pueden propagar mediante una variedad de medios, 40 tal como mediante propagación clónica o técnicas de siembra clásicas. Por ejemplo, una primera planta transformada de regeneración (planta T1) se pueden autofecundar para dar la segunda planta de generación homocigota (plantas T2), cuyas plantas T2 se pueden propagar adicionalmente a través de técnicas de siembra clásicas.

Las plantas transformadas generadas pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, ellas pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes clónicas (por ejemplo, todas las células transformadas por contener la construcción genética de acuerdo con la invención); las gráficas de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, un injerto de rizoma no transformado en un vástago no transformado). 5

La presente invención se extiende claramente a plantas obtenibles mediante cualquiera de los métodos de acuerdo con la presente invención, cuyas plantas han modificado las características de crecimiento. La presente invención se extiende claramente a cualquier parte de la planta y propágulos de tales plantas. La presente invención se extiende adicionalmente para abarcar la progenie de una célula transformada principal, tejido, órgano o planta completa que se ha producido mediante 10 cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, solo el requerimiento es que la progenie exhiba las mismas características genotípicas y/o fenotípicas con el padre producido por los métodos de acuerdo con la invención. La invención también incluye células anfitrionas que tienen expresión modificada de un gen MAP y/o nivel modificado y/o la actividad de una proteína MAP. Particularmente, la invención incluye células anfitrionas que comprenden ácido nucleico aislado que 15 codifica una proteína MAP. Tales células anfitrionas preferiblemente comprenden una construcción genética como se mencionó aquí anteriormente. Las células anfitrionas preferidas de acuerdo con la invención se pueden seleccionar de bacterias, algas, hongos, levadura, plantas de insectos o células anfitrionas de animal. La presente invención se extiende a una célula de planta transgénica o planta que tiene características de crecimiento modificadas, cuya planta tiene la expresión modificada de un 20 gen MAP y/o nivel modificado y/o la actividad de una proteína MAP. Preferiblemente dicha célula de planta transgénica o planta que comprende ácido nucleico aislado que codifica una proteína MAP o su variante, más preferiblemente comprende una construcción genética como se mencionó aquí anteriormente. La invención también se extiende a cualquier parte de la planta de acuerdo con la invención, preferiblemente una parte cosechable, tal como, pero no limitado a, una semilla, hoja, 25 fruto, flor, cultivo de tallo, tallo, rizoma, raíz, tubérculo, bulbo y fibra de algodón.

El término "planta" o "plantas" como se utiliza aquí abarca plantas completas, ancestros y progenie de plantas y partes de planta, que incluyen semillas, brotes, tallos, raíces (que incluyen tubérculos), y células de planta, tejidos y órganos. El término "planta" también por lo tanto abarca cultivos de suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, gametofitos, esporofitos, 30 polen, y microesporas. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas que incluyen un forraje o leguminosa forrajera, planta ornamental, cultivo de alimento, árbol, o arbusto seleccionado de la lista que comprende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp.,Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., 35 Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenomeles spp.,Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia 40 oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium 45 thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevil /ea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus, Hordeum vulgare, Hyparrhenla rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesii, Lotus spp., MacroWoma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago sativa, 5 Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Omithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis 10 umbellate, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys verticillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophyl/a, Vaccinium spp., Vicia spp. Vitis vinifera, Watsonia 15 pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofa, espárragos, brócoli, col de bruselas, repollo, canola, zanahoria, coliflor, cereal, hojas de col, lino, col rizada, lenteja, aceite de semilla de colza, ocra, cebolla, papa, arroz, soya, caña, remolacha, caña de azúcar, girasol, tomate, zapallo, y té, árboles y algas entre otros. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo tal como soya, girasol, canola, alfalfa, colza, algodón, 20 tomate, papa, tabaco, zapallo, papaya, álamo, leguminosa, lino, lupinus y sorgo. De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, la planta es una planta monocotiledónea, tal como caña de azúcar, adicionalmente preferiblemente un cereal tal como arroz, maíz (maíz), trigo, cebada, mijo, arroz y avenas.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona cualquiera de los métodos 25 como se describió aquí anteriormente, o una planta transgénica como se describió aquí anteriormente, en donde la planta es una monocotiledónea, preferiblemente un cereal, más preferiblemente en donde la planta es arroz o en donde la planta es maíz.

Ventajosamente, el desarrollo de los métodos de acuerdo con la presente invención conduce a plantas que tienen varias características de crecimiento modificadas. El término "modificado" como se 30 utiliza aquí significa tiempo y/o lugar incrementado o mejorado, reducido o cambiado. Preferiblemente, con los métodos de la presente invención se mejoran las características de crecimiento de plantas. El término "característica de crecimiento" como se utiliza aquí, preferiblemente se refiere a, pero no se limita a producción/biomasa y peso de planta o una cualquiera o más de las características de crecimiento como se describe aquí adelante. 35

El término "rendimiento" se refiere a la cantidad de material cosechable y se define normalmente como la medición que se produce de valor económico de un cultivo. Para las plantas de cultivo, "producción" también significa la cantidad de material cosechado por hectárea (acre) o unidad de producción. La producción se puede definir en términos de cantidad y calidad. El material cosechado puede variar de cultivo a cultivo, por ejemplo, este puede ser semillas (por ejemplo para 40 arroz, sorgo o maíz cuando crecen semillas); biomasas del cultivo anterior (por ejemplo para maíz, cuando se utiliza como forraje ensilado), raíces (por ejemplo para remolacha, nabo, papa), frutos (por ejemplo para tomate, papaya), fibras de algodón, o cualquier otra parte de la planta que es de valor económico. "Producción" también abarca estabilidad de producción en las plantas. Alta estabilidad de producción significa que año tras año se obtiene producción similar de la progenie de las plantas. 45 "Producción" también abarca producción potencial, que es la producción máxima obtenible. La producción puede depender de un número de componentes de producción, que se puede monitorear por ciertos parámetros. Estos parámetros son bien conocidos por las personas expertas en la técnica y varían de cultivo a cultivo. Por ejemplo, los cultivadores son muy conscientes de los componentes de producción específicos y los parámetros correspondientes del cultivo ellos tienen el objetivo de 5 mejorar. Por ejemplo los parámetros de producción clave para el maíz incluyen el número de plantas por hectárea o acre, número de mazorcas por planta, número de surcos (de semillas) por mazorca, número de granos por surcos, y miles de granos en peso. Para maíz ensilado, los parámetros típicos son la biomasa de cultivo anterior y contenido de energía. Los parámetros de producción claves para el arroz incluyen el número de plantas por hectárea o acre, número de panículas por planta, número de 10 flores (espiguillas) por panícula, índice de llenado de semilla (número de semillas por espiguilla) y miles de peso kernel. Los métodos preferidos para producción incrementada del arroz abarca el número incrementado de semillas.

De acuerdo con una realización particular, el término "producción" abarca "producción de semilla". Las plantas de la presente invención se caracterizan por producción de semilla de cosecha 15 incrementada. Las plantas se caracterizan por un número incrementado de semillas y peso total incrementado de semillas cosechadas. Las plantas de acuerdo con la presente invención también pueden tener número total incrementado de semillas por planta. Los métodos de la presente invención son particularmente favorables en los cereales, tal como arroz y maíz. De acuerdo con lo anterior, una realización particular de la presente invención se relaciona con un método para incrementar de la 20 producción de maíz, por ejemplo producción de semilla, que comprende modificar la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP.

El término "producción" también abarca el índice de cosecha, que es la relación entre la biomasa cosechada sobre la cantidad total de la biomasa. Las plantas de la presente invención se caracterizan por el índice de cosecha incrementado. Ventajosamente, los métodos de la presente 25 invención se pueden utilizar para incrementar el índice de cosecha de cereales y en particular el índice de cosecha de maíz o arroz.

El término "producción" también puede abarcar Miles de Pesos Kernel (TKW), que es un parámetro para la biomasa de una semilla única. Las plantas de la presente invención también pueden exhibir TKW incrementado. El TKW incrementado también es una indicación de volumen de semilla 30 incrementado y/o densidad de semilla incrementada. Ventajosamente, los métodos de la presente invención se pueden utilizar para incrementar los miles de peso kernel de cereales y en particular los miles de peso kernel de maíz o arroz.

El término "producción" también abarca componentes de biomasa típicos, tal como la biomasa aérea. Los parámetros de biomasa generales incluyen el área de tierra y/o peso seco aéreo. 35 Las plantas de la presente invención se caracterizan por área aérea incrementada. Por lo tanto, los métodos de la presente invención son particularmente favorables para cultivos que crecen por tejido verde y/o crecen por su biomasa aérea incrementada. Los métodos de la presente invención son particularmente útiles para céspedes, cultivos forrajeros (tal como maíz forrajero, trébol y medicago), árboles y caña de azúcar. 40

La producción incrementada obtenida por los métodos de la invención, puede resultar de incremento o mejora de uno o más de los componentes y/o parámetros de producción mencionados anteriormente.

El término "característica de crecimiento" como se utiliza aquí también abarca peso de planta. Las plantas de acuerdo con la presente invención también pueden exhibir peso de planta incrementado.

La invención adicionalmente se relaciona con el uso de ácido nucleico aislado que codifica una proteína MAP o uso de una proteína MAP aislada para modificar las características de 5 crecimiento de plantas. Adicionalmente, la invención incorpora el uso de un gen MAP o una proteína MAP como un regulador de crecimiento, tal como un herbicida o un estimulador de crecimiento. También la presente invención incorpora una composición que comprende un ácido nucleico MAP o una proteína MAP o una construcción genética como se describió aquí anteriormente, para uso como un regulador de las características de crecimiento de plantas (por ejemplo regulador de crecimiento tal 10 como un estimulador de crecimiento). Adicionalmente, esta composición comprende un portador adecuado, diluyente o excipiente.

Alternativamente, los genes MAP y las proteínas MAP se pueden considerar como objetivos interesantes para compuestos agroquímicos, tal como un regulador de crecimiento o estimulador de crecimiento. De acuerdo con lo anterior, la invención incorpora el uso de un gen MAP o una proteína 15 MAP como un objetivo de un compuesto agroquímico, tal como o un regulador de crecimiento.

Ya que las plantas de la presente invención tienen excelentes características de crecimiento y tiene alta producción, ellas son adecuadas para la producción de enzimas, farmacéuticos o agroquímicos. También, ellos son adecuados para la producción de productos alimenticios y alimentos. La invención se extiende claramente a enzimas, farmacéuticos o agroquímicos así como 20 también productos alimenticios y alimentos aislados o producidos de estas plantas.

Adicionalmente, un ácido nucleico que codifica una proteína MAP, una proteína MAP y/o las construcciones de la presente invención se pueden utilizar en programas de siembra que ayudan en el desarrollo de plantas con producción incrementada. Adicionalmente, las variantes alélicas como se definió anteriormente también se pueden utilizar en programas de siembra convencionales 25 particulares, tal como en siembra asistida por marcador. Tales programas de siembra algunas veces necesitan la introducción de la variación alélica en las plantas mediante tratamiento mutagénico de una planta. Un método mutagénico adecuado es mutagenia EMS. La identificación de variantes alélicas luego tiene lugar mediante, por ejemplo, PCR. Esto se sigue por una etapa de selección de variantes alélicas superiores de la secuencia MAP, que surge para alterar las características de 30 crecimiento en una planta. La selección se lleva a cabo típicamente al monitorear el desarrollo de crecimiento de las plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia MAP, por ejemplo diferentes variantes alélicas de la secuencia MAP de la SEQ ID NO 1. Se puede hacer monitoreo del desempeño de crecimiento en un invernadero y/o en el campo. Posteriormente, se seleccionan plantas que tienen características de crecimiento modificadas. Tales características de 35 crecimiento pueden ser una o más de las características de crecimiento como se describió aquí anteriormente. Las etapas opcionales adicionales incluyen cruzar las plantas seleccionadas en las que la variante alélica superior se identifica con otra planta, por ejemplo una planta con un genotipo económicamente valioso. Estos métodos cruzados se pueden utilizar, por ejemplo, para hacer una combinación de características o rasgos fenotípicos interesantes. 40

De acuerdo con otro tipo de programa de siembra, se identifica un marcador de ADN que se puede ligar genéticamente al gen capaz de modificar la expresión de un gen MAP y/o modificar el nivel y/o la actividad de una proteína MAP en una planta (cuyo gen puede ser el gen que codifica la proteína MAP en sí misma u otro gen capaz de modificar la expresión de un gen MAP o capaz de modificar el nivel y/o la actividad de la proteína MAP). Este marcador ADN luego se utiliza en 45 programas de siembra para seleccionar plantas que tienen características de crecimiento modificadas. Tales características de crecimiento pueden ser una cualquiera o más de las características de crecimiento como se describió aquí anteriormente.

Los métodos de acuerdo con la presente invención también se pueden practicar al introducir en una planta por lo menos una parte de un cromosoma (natural o artificial) (tal como un Cromosoma 5 Artificial Bacteriano (BAC)), cuyo cromosoma contiene por lo menos un gen que codifica una proteína MAP, opcionalmente junto con uno o más miembros de la familia de gen relacionados. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para modificar las características de crecimiento de plantas que comprende introducir en una planta por lo menos una parte de un cromosoma que comprende por lo menos un gen que codifica una proteína 10 MAP.

La presente invención ahora se describirá con referencia a las siguientes figuras en las que:

La Figura 1 es un mapa del vector de expresión de planta que comprende un casete de expresión para un gen MAP bajo control de un promotor constitutivo. El CDS0430 es el código interno para el cADN de Arabidopsis thaliana que codifica metionina aminopeptidasa 15 MAP2B. El PR00129 es el código interno para el promotor de arroz GOS2. El casete de expresión MAP también comprende la secuencia de terminación de doble transcripción T-zeína y T-rbcs-deltaGA. Esta casete de expresión se ubica dentro del límite izquierdo (LB Ti C58) y el límite derecho (RB Ti C58) del plásmido nopalina Ti. Los clones dentro de estos límites T también son un marcador detectable y un marcador seleccionable bajo control de un 20 promotor constitutivo y seguido por una secuencia de terminación de transcripción NOS. Adicionalmente, este vector también contiene un origen de replicación (pBR322 (ori + bom) para replicación bacteriana y un marcador seleccionable bacteriano (Sm/SpR) para la selección bacteriana.

La Figura 2 lista todas las secuencias utilizadas en la descripción de la presente 25 invención.

La Figura 3 muestra una alineación múltiple de proteínas de planta y animal de MAP, con la anotación de los diferentes dominios. Desde el terminal N al terminal C: dominio rico en lisina, MAP2 distintivo o MAP1 distintivo y dominio de Peptidasa-M24. El dominio peptidasa se anota que corresponde al dominio peptidasa de las proteínas MAP2 (ver 30 por ejemplo SEQ ID NO 8). El dominio peptidasa de las proteínas MAP1 se extiende adicionalmente a esta anotación (ver por ejemplo SEQ ID NO 7).

Ejemplos

La presente invención ahora se describirá con referencia a los siguientes ejemplos, que son solo por vía de ilustración. 35

Manipulación de ADN

A menos que se indique otra cosa, las técnicas de ADN recombinante se desarrollan de acuerdo con protocolos estándar descritos en Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ra Edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales y 40 métodos estándar para el trabajo molecular de planta se describen en Plant Molecular Biology Labfase (1993) by R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) y Blackwell Scientific Publications (UK).

Ejemplo 1. Clonación de CDS0430 que codifica Arabidopsis thaliana MAP2B

Un gen que codifica una metionina aminopeptidasa MAP2B se amplifica por PCR de una colección de cADN de siembra Arabidopsis thaliana (Invitrogen, Paisley, UK). Después de transcripción inversa de ARN extraída de la siembra, los cADN se clonan en pCMV Sport 6.0. El tamaño del inserto promedio del banco es aproximadamente 1.5 kb, y el número original de clones es aproximadamente 1.59x107 cfu. Se determina el título original por ser 9.6x105 cfu/ml, después de la 5 primera amplificación de 6x1011 cfu/ml. Después de extracción de plásmido, se utiliza 200 ng de plantilla en una mezcla de 50µl de PCR. Los cebadores utilizados para amplificación PCR, prm01642 con la secuencia 5’ ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCA CAATGGCGAGCGAAAGTCC 3’ como se representa por la SEQ ID NO 10 y prm01643 con la secuencia 5’ ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTA GGATCTGAATCAGTAGTCGTCTC 3’ como se 10 representa por la SEQ ID NO 11, incluyen un sitio attB para recombinación Gateway (cursiva). EL PCR se desarrolla utilizando polimerasa de ADN Taq Hifi en condiciones estándar. Un fragmento PCR de 1381 bp se amplifica y se purifica utilizando métodos estándar. Esta primera etapa en el procedimiento Gateway, la reacción BP, luego se desarrolla, durante cuyo fragmento PCR recombina in vivo con el plásmido pDONR201 para producir la entrada hecha p1753. El plásmido pDONR201 se 15 compra a Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

Ejemplo 2: Construcción del casete de expresión CD2231 (pGOS2::AtMAP2B)

El clon de entrada p1753 se utiliza posteriormente en una reacción de recombinación LR Gateway con p0640, un vector de destino Gateway adecuado para la transformación del arroz. El vector p0640 contiene como elementos funcionales dentro de los límites de T-ADN, un marcador 20 seleccionable de planta y un casete Gateway destinado para recombinación LR in vivo con la secuencia de interés ya clonada en el clon de entrada. La dirección 5’ de este casete Gateway vincula el promotor de arroz GOS2 (PRO0129) para la expresión constitutiva de los genes de interés (De Pater et al., Plant J. 2(6) 837-844, 1992). Después de la etapa de recombinación, el vector de expresión resultante con el casete de expresión CD2231 (Figura 1) se puede transformar en la cepa 25 Agrobacterium LBA4404 y posteriormente en las plantas Oryza sativa var. Nipponbare. Las plantas de arroz transformadas se les permiten crecer y se examinan por varias características de crecimiento como se describe en el Ejemplo 3.

Ejemplo 3: Evaluación de plantas de arroz T0, T1 y T2 transformadas con pGOS2::AtMAP2B 30

Se generan aproximadamente 15 a 20 transformantes T0 independientes. Se transfieren transformantes primarios de cámaras de cultivo de tejido a un invernadero para hacer crecer y cosechar semillas T1. Se retienen seis eventos de los que la progenie T1 segregada 3/1 para presencia/ausencia del transgen. "Plantas nulas" o "Segregares nulos" o "Nulicigotos" son las plantas tratadas en la misma forma como una planta transgénica, pero de cuyo transgen se ha segregado. Las 35 plantas nulitratadas también se pueden describir como los transformantes negativos homocigotos. Para cada uno de estos eventos, aproximadamente 10 semillas T1 que contienen el transgen (hetero- y homo-cigotos), y aproximadamente 10 semillas T1 que carecen del transgen (nulicigotos), se selecciona por PCR.

Con base en los resultados de la evaluación T1, tres eventos, que muestran características de 40 crecimiento mejoradas en el nivel T1, se seleccionan para caracterización adicional en el T2 y generaciones adicionales. A este grado, las tandas de semilla de las plantas positivas T1 (hetero- y homocigotos), se detectan al monitorear la expresión marcadora. Para cada evento seleccionado, las tandas de semilla heterocigoto luego se seleccionan para evaluación T2. Un número igual de positivo y negativo dentro de cada tanda de semillas se trasplantan para evaluación en el invernadero (es decir, 45 para cada evento 40 plantas, de las cuales crecen 20 positivas para el transgen y 20 negativas para el transgen). Para los tres eventos por lo tanto, una cantidad total de 120 plantas se evalúa en la generación T2.

Se transfieren plantas T1 y T2 a un invernadero y se evalúan para parámetros de crecimiento vegetativo y parámetros de semilla, como se describe aquí abajo. 5

(I) Análisis estadístico de datos numéricos

Se utiliza un ANOVA de dos factores (análisis de varianza) corregido para el diseño no balanceado como el modelo de evaluación estadística para los valores numéricos de las características fenotípicas de planta observadas. Los valores numéricos se someten a una prueba t y una prueba F. Se obtiene el valor p al comprar el valor t en la distribución t o alternativamente, al comparar el valor F 10 en la distribución F. En el valor p permanece la probabilidad que es correcta la hipótesis nula (la hipótesis nula es "no existe efecto del transgen").

Se desarrolla una prueba T en todos los valores de todas las plantas de un evento. Se repite tal una prueba t para cada evento y para cada característica de crecimiento. La prueba t se lleva a cabo para revisar un efecto del gen dentro de un evento de transformación, también denominado aquí como 15 "efecto específico de línea". En la prueba t, el umbral para el efecto específico de línea significativo se estable en 10% de nivel de probabilidad. Por lo tanto, los datos con un valor p de la prueba t bajo 10% indican un efecto "específico en línea", que significa que el fenotipo observado en las plantas transgénicas de aquella línea se origina por la presencia del gen. Dentro de una población de eventos de transformación, algunos eventos pueden estar por debajo o por encima de este umbral. Esta 20 diferencia puede ser debido a la diferencia en la posición del transgen en el genoma. No es común que un gene pueda tener solo un efecto en las posiciones del genoma. Por lo tanto, el "efecto específico fino" mencionado anteriormente también se refiere a "efecto dependiente de posición".

Se lleva a cabo una prueba F en todos los valores medidos para todas las plantas de todos los eventos. Se repite una prueba F para cada característica de crecimiento. La prueba F se lleva a cabo 25 para la revisión de un efecto del gen sobre todos los eventos de transformación y para verificar un efecto general del gen, también denominado aquí "efecto de gen". En la prueba F, el umbral para un efecto de gen global significativo se establece en 5% de nivel de probabilidad. Por lo tanto, los datos con un valor p de la prueba F bajo 5% indica un "efecto de gen", que significa que el fenotipo observado se origina por más que justo la presencia del gene y o la posición del transgen en el 30 genoma. Un "efecto de gen" es una indicación para la amplia aplicabilidad del gen en plantas transgénicas.

(II) Mediciones de crecimiento vegetativo

Las plantas seleccionadas se hacen crecer en un invernadero. Cada planta recibe una única marca de código de barras para ligar ambiguamente los datos de fenotipo en la planta correspondiente. 35 Las plantas seleccionadas se hacen crecer en el suelo en tazas de 10 cm de diámetro bajo las siguientes condiciones ambientales: fotoperiodo= 11.5 h, intensidad a la luz del día= 30,000 lux o más, temperatura de día= 28°C o más, temperatura en la noche= 22°C, humedad relativa= 60-70%. Las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes se hacen crecer lado a lado en posiciones aleatorias. Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez (que es la etapa donde no existe más 40 incremento en la biomasa) las plantas se pasan semanalmente a través de un gabinete de formación de imagen digital. En cada punto de tiempo las imágenes digitales (2048x1536 pixeles, 16 millones de colores) se toman de cada planta de por lo menos 6 ángulos diferentes. Los parámetros descritos adelante se derivan en una forma automática de imágenes digitales utilizando software de análisis de imagen. 45

(a) Área aérea

Se determina el área aérea de la planta al contar el número total de pixeles de partes de plantas aéreas discriminadas en el antecedente. Este valor se promedia para las imágenes tomadas en el mismo punto de tiempo de los diferentes ángulos y se convierte en un valor de superficie físico expresado en mm cuadrados mediante calibración. Los experimentos muestran que el área de planta 5 aérea, que corresponde al área máxima total, medida en esta forma se correlaciona con la biomasa de partes de planta aérea.

Estos resultados del área aérea máxima se resumen en la Tabla 1. En promedio, las plantas transgénicas muestran un incremento en el área aérea de 10%. En una línea particular el incremento en el área aérea es tan alta como 26%. Estos resultados indican que el gen MAP tiene un efecto en la 10 biomasa aérea de MAP de plantas transgénicas.

Tabla 1: Área aérea máxima de plantas T2 transgénicas MAP. Cada surco corresponde a un evento, para el que el área aérea máxima promedio (expresada en mm2) se determina para las plantas transgénicas (TR) y las plantas nulitratadas (nulo). La diferencia entre las plantas transgénicas y las plantas nulitratadas de cada evento está presente en valores absolutos (dif.), así como también en el 15 porcentaje de diferencia (% dif). P significa la probabilidad producida por la prueba t para cada evento. La última fila presenta los números promedio calculados de todos los eventos. Aquí el valor p se produce por la prueba F.

Área aérea máxima

Línea: TR Nulo Dif % dif Valor p

CD2231 L1: 67117 66542 576 1 0,9193

CD2231 L2: 51901 49645 2257 5 0,9612

CD2231 L3: 77716 61626 16090 26 0,0065

General: 65647 59498 6146 10 0,0495

(III) Medición de parámetros relacionados con semilla

Se cosechan panículas primarias maduras, se embolsan, se marcan con código de barras y luego se secan durante tres días en horno a 37°C. Las panículas se trillan a continuación y se 5 recolectan todas las semillas. Las cáscaras cargadas se separan de las vacías utilizando un dispositivo de flujo de aire. Después de separación, ambos lotes de semilla luego se cuentan utilizando una máquina para contar comercialmente disponible. Se desechan las cáscaras vacías. Las cáscaras cargadas se pesan en un balance analítico. Este procedimiento resulta en el establecimiento de parámetros relacionados con la semilla se describen adelante. 10

(a) Número total de semillas cargadas por planta

El número de semillas cargadas se determina al contar el número de cáscaras cargadas que permanece después de la etapa de separación. Estos números se resumen en la Tabla 2. En promedio, las plantas transgénicas muestran un incremento en el número de semillas cargadas de 52%. En una línea particular el incremento en el número de semillas cargadas es tan alto como 76%. Estos 15 resultados indican que el gen MAP tiene un efecto en el número de semillas cargadas de plantas transgénicas MAP.

Tabla 2: Número de semillas cargadas de plantas T2 transgénicas MAP. Cada surco corresponde a un evento, para el que el número de semillas cargadas se determina para las plantas transgénicas (TR) y las plantas nulitratadas (nulo). La diferencia entre las plantas transgénicas y las 20 plantas nulitratadas de cada evento está presente en valores absolutos (dif.), así como también en el porcentaje de diferencia (% dif). P significa la probabilidad producida por la prueba t para cada evento. La última fila presenta los números promedio calculados de todos los eventos. Aquí el valor p se produce por la prueba F.

25

Número de semillas cargadas

Línea: TR Nulo Dif % dif Valor p

CD2231 L1: 382.2 216 112.21 52 0.0132

CD2231 L2: 157.1 137.2 19.91 15 0.6551

CD2231 L3: 412 233.8 178.21 76 0.0001

General: 300.5 198.1 102.36 52 <0.0001

(b) Producción de semilla total por planta

La producción de semilla total se mide como el peso de semilla total, al pesar todos cáscaras cargadas cosechados de una planta. Los valores de peso de semilla total se resumen en la Tabla 3. En promedio, las plantas transgénicas muestran un incremento en el peso de semilla total de 55%. En una 30 línea particular el incremento en el peso de semilla total y así en la producción de semilla es tan alto como 79%. Estos resultados indican que el gen MAP tiene un efecto en el peso de semilla total y la producción de semilla de plantas transgénicas MAP.

Tabla 3: Peso de semilla total por planta de plantas T2 transgénicas MAO. Cada fila corresponde a un evento, para el que el peso de semilla total promedio (en gramos) se determina para las plantas transgénicas (TR) y las plantas nulitratadas (nulo). La diferencia entre las plantas 5 transgénicas y las plantas nulitratadas de cada evento se presenta en valores absolutos (dif.), así como también en porcentaje de diferencia (% dif). P significa la probabilidad producida por la prueba t para cada evento. La última fila presenta los números promedio calculados de todos los eventos. Aquí el valor p se produce por la prueba F.

10

Peso de semilla total

Línea: TR Nulo Dif % dif Valor p

CD2231 L1: 9 5.9 3.08 52 0.0071

CD2231 L2: 3.7 3.1 0.63 20 0.5746

CD2231 L3: 11.1 6.2 4.9 79 <0.0001

General: 8 5.1 2.83 55 <0.0001

(c) Índice de cosecha

El índice de cosecha en la presente invención se define como la relación entre la producción de semilla total y el área aérea (mm2), multiplicado por un factor 106. Los valores para el índice de cosecha se resumen en la Tabla 4. En promedio, las plantas transgénicas muestran un incremento en el 15 índice de cosecha de 36%. En una línea particular el incremento en el índice de cosecha y así el incremento en la producción es tan alta como 50%. Estos resultados indican que el gen MAP tiene un efecto en el índice de cosecha y en la producción de las plantas transgénicas MAP.

Tabla 4: Índice de cosecha de plantas T2 transgénicas MAP. Cada fila corresponde a un evento, para el que se determina el índice de cosecha promedio para las plantas transgénicas (TR) y 20 las plantas nulitratadas (nulo). La diferencia entre las plantas transgénicas y las plantas nulitratadas de cada evento se presenta en valores absolutos (dif.), así como también en porcentaje de diferencia (% dif). P significa la probabilidad producida por la prueba t para cada evento. La última fila presenta los números promedio calculados de todos los eventos. Aquí el valor p se produce por la prueba F.

25

Índice de cosecha

Línea: TR Nulo Dif % dif Valor p

CD2231 L1: 126.4 84.1 42.24 50 0.0002

CD2231 L2: 67.4 59.8 7.63 13 0.4843

CD2231 L3: 138.6 99.1 39.52 40 0.0007

General: 110.5 80.9 29.53 36 <0.0001

(d) Peso de miles de granos

El TKW se extrapola del número de semillas cargadas contadas y su peso total. Algunas plantas transgénicas MAP muestran un incremento de peso de miles de granos, que es un indicador de densidad de semilla incrementada y/o tamaño de semilla incrementado. 30

(IV) Medición de altura de la planta

Se determina Altura de la planta mediante la distancia entre las líneas horizontales que van a través del borde superior de la taza y el píxel más superior que corresponde a una parte de planta aérea. Este valor se promedia para las imágenes tomadas en el mismo punto de tiempo desde diferentes ángulos (tomados como se describió anteriormente) y se convierte, mediante calibración, a una distancia física expresada en mm. Los experimentos muestran que altura de la planta medido en 5 esta forma se correlaciona con altura de la planta medido manualmente con una regla. Algunas plantas transgénicas MAP, muestran un incremento de altura de la planta.

Ejemplo 4. Evaluación de plantas de maíz transgénicas transformadoras con MAP

Los métodos de la invención descritos aquí también se utilizan en maíz (Zea mays). Para este objetivo, un MAP que codifica el gen, por ejemplo un ortólogo MAP de maíz, se clona bajo el control 10 de un promotor operable en maíz, en un vector de transformación de planta adecuado para transformación de maíz mediada por Agrobacterium. El promotor operable en el maíz por ejemplo puede ser un promotor constitutivo, seleccionado de promotores GOS2, promotores ubiquitina, promotores L-41, promotores actina-2 y promotores enolasa. Los métodos para uso para transformación del maíz se ha descrito en la bibliografía (Ishida et al., Nat Biotechnol. 1996 Jun; 15 14(6):745-50; Frame et al., Plant Physiol. 2002 May; 129(1):13-22).

Las líneas transgénicas (consanguíneo) hechas por estos métodos se pueden cruzar con otra línea transgénica o no transgénica (consanguíneo) o se auto/sub poliniza. De forma importante, las líneas transgénicas (consanguíneo) se puede utilizar como un padre macho o hembra. La inheritabilidad y el número de copia del transgen se revisan mediante PCR cuantitativo en tiempo real 20 y análisis Southern blot y la expresión de los niveles del transgen se determinan mediante PCR inverso y análisis Northern. Los eventos transgénicos con inserciones de única copia del transgen y con varios niveles de la expresión de transgen se seleccionan adicionalmente para evaluaciones en generaciones posteriores.

Las semillas de progenie obtenidas como se describió aquí anteriormente se germinan y se 25 hacen crecer en el invernadero en condiciones bien adaptadas para el maíz (16:8 fotoperiodo, 26-28°C temperatura en el día y 20-24°C temperatura en la noche) también bajo condiciones deficientes de agua, deficientes de nitrógeno, y exceso de NaCl. Los segregantes nulos de la misma línea parental (híbridos o línea consanguínea), así como también plantas tipo silvestre de la misma línea consanguínea o se utilizan híbridos como controles. Las plantas de progenie se evalúan en diferentes 30 parámetros de biomasa y de desarrollo, que incluyen pero no se limitan a altura de la planta, ancho del tallo, nodos por debajo de la mazorca, nodos por encima de la mazorca, raíces adventicias, número de hojas, color verde de las hojas, ángulo de las hojas, total área aérea, tiempo para borla, tiempo para producción de seda, tiempo para madurez, altura de la mazorca, número de mazorcas, longitud de mazorca, peso de mazorca, número de surcos, número de granos, humedad del grano. Rasgos del 35 grano incluyen pero no se limitan al tamaño del grano, peso del grano, contenido de almidón, contenido de proteína, y contenido de aceite también se monitorean. La producción del maíz se calcula de acuerdo con métodos bien conocidos. Las plantas de maíz transformadas con una proteína MAP muestran características de crecimiento mejoradas. Más particularmente ellos muestran una mejora en una cualquiera o más de los parámetros de biomasa y de desarrollo mencionados 40 anteriormente.

Los eventos transgénicos que se mejoran más significativamente se comparan con las líneas de control correspondientes se seleccionan para prueba de campo adicionales y siembra asistida por marcador, con el objetivo de transferir los rasgos transgénicos validados en campo en otro germoplasma. El fenotipo de maíz para crecimiento y parámetros relacionados a la producción en el 45 campo se conduce utilizando protocolos bien establecidos. Las plantas de maíz se evalúan particularmente en componentes de producción en diferentes densidades de planta y bajo diferentes condiciones ambientales. Las mejoras posteriores para introgresión a lugares específicos (tal como transgen que contiene locus) de un germoplasma en otro también se conduce utilizando protocolos bien establecidos que incluyen pero no se limitan a MAS. 5

Ejemplo 5. Evaluación de plantas transgénicas transformadas con Arabidopsis thaliana MAP1A

Los métodos descritos en los Ejemplos 1, 2, 3 y 4 también se repiten con Arabidopsis thaliana MAP1A. Para este objetivo, el AtMAP1A que codifica el gen, representado por SEQ ID NO 3, se clona bajo el control de un promotor operable en arroz o maíz, en un vector de transformación de 10 planta adecuado para la transformación mediada por Agrobacterium en arroz o maíz. Un promotor adecuado es un promotor constitutivo, tal como un promotor GOS2.

En el caso de plantas de arroz, el protocolo para aislamiento de cADN y para la construcción del vector se sigue como se describe en el Ejemplo 1 y 2, excepto que los cebadores son específicos para la SEQ ID NO 3. Los protocolos para transformación de la planta, el crecimiento de la planta y 15 evaluación de la planta siguen como se describe en el Ejemplo 3. Las plantas de arroz transformadas con AtMAP1A han modificado las características de crecimiento y muestran una cualquiera o más de las características de crecimiento mejoradas como se describe en el Ejemplo 3.

En el caso de plantas de maíz, los protocolos para transformación de planta, crecimiento de la planta, propagación de la planta, selección de la planta, y evaluación de la planta siguen como se 20 describen en el Ejemplo 4. Las plantas de maíz transformadas con AtMAP1A han modificado las características de crecimiento y muestran una cualquiera o más de las características de crecimiento mejoradas como se describe en el Ejemplo 4.

LISTADO DE SECUENCIAS

25

<110> CropDesign N.V.

<120> Método para modificar las características de crecimiento de plantas

<130> CD-074-PCT

<150> EP 03075363.6

<151> 2003-02-06 30

<160> 11

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1320

<212> ADN 35

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

<210> 2

<211> 439

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana 5

<400> 2

<210> 3

<211> 1419

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana 5

<400> 3

<210> 4

<211> 398

<212> PRT 10

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 4

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Secuencia consenso de MAP1 distintivo

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) 10

<223> Xaa puede ser Met o Phe o Tyr

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido 15

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6).. (6)

<223> Xaa puede ser Leu o Ile o Val o Met o Cys

<220> 20

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa puede ser Gly o Ser o His

<220>

<221> MISC_FEATURE 25

<222> (8)..(10)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(15) 30

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> Xaa puede ser Leu o Ile o Val o Met 35

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(17)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)..(18)

<223> Xaa puede ser His o Asn

<220> 5

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)..(19)

<223> Xaa puede ser Tyr o Trp o Val o His

<400> 5

10

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 15

<223> Secuencia consenso de MAP2 distintivo

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa puede ser Asp o Ala 20

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa puede ser Leu o Ile o Val o Met o Tyr

<220> 25

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> MISC_FEATURE 30

<222> (5)..(5)

<223> Xaa puede ser Leu o Ile o Val o Met

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7) 35

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido 40

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa puede ser His o Gln

<220>

<221> MISC_FEATURE 5

<222> (11)..(11)

<223> Xaa puede ser Leu o Ile o Val o Met

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12) 10

<223> Xaa puede ser Asp o Asn o Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14)..(16)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido 15

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(17)

<223> Xaa puede ser Asp o Asn

<400> 6 20

<210> 7

<211> 74

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana 25

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Dominio peptidasa_M24 de AtMAP1A

<400> 7

30

<210> 8

<211> 72

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> MISC_FEATURE 5

<223> Dominio peptidasa_M24 de AtMAP2B

<400> 8

<210> 9

<211> 13 10

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> dominio rico en lisina de AtMAP2B 15

<400> 9

<210> 10

<211> 47

<212> ADN 20

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador prm01642

<400> 10

acaagtttgt acaaaaaagc aggcttcaca atggcgagcg aaagtcc 47 25

<210> 11

<211> 49

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30

<223> Cebador prm01643

<400> 11

acccagcttt cttgtacaaa gtggtaggat ctgaatcagt agtcgtctc 49

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para modificar las características de crecimiento de plantas con relación a plantas tipo silvestre correspondientes, que comprende modificar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica una planta metionina aminopeptidasa (proteína MAP) y/o modificar el nivel y/o actividad en una planta de una proteína MAP de la 5 planta, en donde dicha modificación de expresión, nivel y/o actividad se efectúa al introducir en una planta un ácido nucleico que codifica una proteína MAP que comprende un MAP2 distintivo, un dominio peptidasa-M24 y un dominio rico en lisina.
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha modificación de expresión, nivel y/o actividad comprende expresión, nivel y/o actividad incrementadas. 10
3. Método para la producción de una planta que tiene características de crecimiento modificadas con relación a plantas tipo silvestre correspondientes, que comprende:

a) Introducir en una célula de planta un ácido nucleico que codifica una proteína MAP de planta que comprende un MAP2 distintivo, un dominio peptidasa-M24 y un dominio rico en lisina; y 15

b) Cultivar dicha célula de planta bajo condiciones que promueven el crecimiento de la planta.
4. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho MAP2 distintivo es como se representa por la SEQ ID NO: 6.
5. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha 20 peptidasa-M24 es por lo menos 70% idéntica a la SEQ ID NO: 7 o a la SEQ ID NO: 8.
6. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho dominio de peptidasa-M24 es como se representa por la SEQ ID NO: 8.
7. Método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el ácido nucleico de (a) es como se representa por la SEQ ID NO 1 o 3, o en donde dicho ácido nucleico de (a) codifica 25 una proteína MAP como se representa por la SEQ ID NO 2 o 4.
8. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en donde dicho ácido nucleico codifica un homólogo que tiene, en orden incrementado de preferencia, por lo menos 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 52%, 54%, 56%, 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 30 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO 2 o con la secuencia de la SEQ ID NO 4.
9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha característica de crecimiento modificada es producción incrementada. 35
10. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha característica de crecimiento modificada es producción de semilla incrementada.
11. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha característica de crecimiento es peso de planta incrementado.
12. Uso de ácido nucleico aislado que codifica una proteína MAP o uso de una proteína 40 MAP aislada para modificar las características de crecimiento de plantas, dicha proteína MAP comprende un MAP2 distintivo, un dominio peptidasa-M24 y un dominio rico en lisina.
13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicha característica de crecimiento es producción incrementada. 45
14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicha producción incrementada es producción de semilla incrementada.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicha característica de crecimiento es peso de planta incrementado.
16. Uso de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP o uso de una proteína MAP 5 como un objetivo para el crecimiento regulador de la planta, dicha proteína MAP comprende un MAP2 distintivo, un dominio peptidasa-M24 y un dominio rico en lisina.
17. Uso de un ácido nucleico que codifica una proteína MAP en un programa de siembra de plantas dirigido a la producción mejorada, dicha proteína MAP comprende un MAP2 distintivo, un dominio peptidasa-M24 y un dominio rico en lisina. 10
18. Uso de una planta o una parte de planta que comprende una construcción genética que comprende (a) un ácido nucleico que codifica una proteína MAP de la planta que comprende un MAP2 distintivo, un dominio peptidasa-M24 y un dominio rico en lisina; y (b) una o más secuencias de control capaces de controlar la expresión del ácido nucleico de (a) en una planta; y opcionalmente (c) una secuencia de terminación de 15 transcripción en la producción de enzimas, farmacéuticos o agroquímicos.
19. Uso de una planta o una parte de planta que comprende una construcción genética que comprende (a) un ácido nucleico que codifica una proteína MAP de la planta que comprende un MAP2 distintivo, un dominio peptidasa-M24 y un dominio rico en lisina; y (b) una o más secuencias de control capaces de controlar la expresión del ácido 20 nucleico de (a) en una planta; y opcionalmente (c) una secuencia de terminación de transcripción, en la producción de alimentos y productos alimenticios.