ES2356149T3 - Procedimiento para producir transglutaminasa microbiana. - Google Patents
Procedimiento para producir transglutaminasa microbiana. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2356149T3 ES2356149T3 ES04717856T ES04717856T ES2356149T3 ES 2356149 T3 ES2356149 T3 ES 2356149T3 ES 04717856 T ES04717856 T ES 04717856T ES 04717856 T ES04717856 T ES 04717856T ES 2356149 T3 ES2356149 T3 ES 2356149T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- pro
- mtg
- metalloprotease
- neutral metalloprotease
- neutral
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 title claims abstract description 46
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 52
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 claims abstract description 94
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 claims abstract description 90
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims abstract description 78
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 claims abstract description 21
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 241000186254 coryneform bacterium Species 0.000 claims description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 24
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 claims description 12
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- ZPHBZEQOLSRPAK-UHFFFAOYSA-N Phosphoramidon Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O ZPHBZEQOLSRPAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108010072906 phosphoramidon Proteins 0.000 claims description 8
- BWSDNRQVTFZQQD-AYVHNPTNSA-N phosphoramidon Chemical compound O([P@@](O)(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CC=1[C]2C=CC=CC2=NC=1)C(O)=O)[C@H]1O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O BWSDNRQVTFZQQD-AYVHNPTNSA-N 0.000 claims description 8
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108700018667 Streptomyces subtilisin inhibitor Proteins 0.000 claims description 5
- 101710151905 Subtilisin inhibitor Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003475 metalloproteinase inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 40
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 36
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 35
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 35
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 34
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 33
- 241001495137 Streptomyces mobaraensis Species 0.000 description 28
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 18
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 14
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 13
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 13
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 11
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 9
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 8
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 8
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 8
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 6
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 6
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 5
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 5
- 241000187432 Streptomyces coelicolor Species 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- -1 lysine and the like Chemical class 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 4
- 241000187392 Streptomyces griseus Species 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 241001446311 Streptomyces coelicolor A3(2) Species 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 2,2-dichloro-n-[(1s,2s)-1,3-dihydroxy-1-(4-nitrophenyl)propan-2-yl]acetamide Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@@H](CO)[C@@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 101000610620 Homo sapiens Putative serine protease 29 Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 101150023107 PS2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102100040345 Putative serine protease 29 Human genes 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- UXFQFBNBSPQBJW-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-methylpropane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(C)CO UXFQFBNBSPQBJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DMSDCBKFWUBTKX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1-nitrosoguanidine Chemical compound CN=C(N)NN=O DMSDCBKFWUBTKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DUHQIGLHYXLKAE-UHFFFAOYSA-N 3,3-dimethylglutaric acid Chemical compound OC(=O)CC(C)(C)CC(O)=O DUHQIGLHYXLKAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 210000003771 C cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001517047 Corynebacterium acetoacidophilum Species 0.000 description 1
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 1
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 241000194105 Paenibacillus polymyxa Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000187760 Streptomyces albogriseolus Species 0.000 description 1
- 241000520730 Streptomyces cinnamoneus Species 0.000 description 1
- 241000499056 Streptomyces griseocarneus Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 108010032995 epsilon-(gamma-glutamyl)-lysine Proteins 0.000 description 1
- JPKNLFVGUZRHOB-YUMQZZPRSA-N epsilon-(gamma-glutamyl)lysine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCCNC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O JPKNLFVGUZRHOB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 1
- SCVOEYLBXCPATR-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SCVOEYLBXCPATR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N methionine Chemical compound CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 238000006276 transfer reaction Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
- C12N9/1044—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un método para producir una transglutaminasa microbiana activa a partir de una protransglutaminasa microbiana, que comprende cultivar un microorganismo en que se ha introducido un gen que codifica una metaloproteasa neutra procedente de actinomicetos, produciéndose por ello la metaloproteasa neutra, y escindir selectivamente una parte proestructural de la protransglutaminasa mediante la metaloproteasa neutra que es producida por el microorganismo, en que la metaloproteasa neutra procedente de actinomicetos se caracteriza por que 1) tiene un peso molecular de aproximadamente 35.000; 2) tiene un pH óptimo de 7,0; 3) es estable en un pH de 4-10; 4) tiene una temperatura óptima de aproximadamente 45 °C; 5) es estable por debajo de aproximadamente 50 °C; y 6) es fuertemente inhibida por el ácido etilendiaminotetraacético, la 1,10-fenantrolina y el fosforamidón, que son inhibidores de metaloproteasas, y por el inhibidor de la subtilisina de Streptomyces (SSI) procedente de actinomicetos; o 7) tiene un peso molecular de aproximadamente 71.000; 8) tiene un pH óptimo de 7,0; 9) es estable en un pH de 5-10; 10) tiene una temperatura óptima de aproximadamente 55 °C; y 11) es fuertemente inhibida por el ácido etilendiaminotetraacético, la 1,10-fenantrolina y el fosforamidón, que son inhibidores de metaloproteasas, el ditiotreitol, que es un agente reductor de enlaces disulfuro, y por el inhibidor de la subtilisina de Streptomyces (SSI) procedente de actinomicetos.
Description
Campo del invento
El presente invento se refiere a una nueva proteasa que escinde eficazmente la parte proestructural de una protransglutaminasa para convertir ésta en una transglutaminasa en forma activa, y a un ácido nucleico que la codifica, siendo producida dicha protransglutaminasa por actinomicetos.
El presente invento también se refiere a un método para producir transglutaminasa microbiana en su forma activa usando dicha proteasa. Además, el presente invento se refiere a un método para producir la metaloproteasa neutra. Fundamento del invento
La transglutaminasa es una enzima que cataliza la reacción de transferencia acílica de grupos γ-carboxilamida en la cadena peptídica de la proteína. Cuando se hace reaccionar la enzima con una proteína, puede tener lugar la formación del enlace cruzado ε - (γ - Glu) - Lys y la sustitución de Gln por Glu mediante desamidación. Se han usado transglutaminasas para fabricar productos alimenticios gelificados, tales como gelatinas, yogures y quesos, productos cosméticos gelificados y otros, y para mejorar la calidad de la carne, etc. [publicación japonesa de solicitud examinada (JP-Kokoku) nº 1-50382]. Además, la transglutaminasa es una enzima que tiene una gran utilidad industrial ya que ha sido usada para fabricar materiales para microcápsulas termoestables, soportes para enzimas inmovilizadas, etc.
Se han conocido previamente transglutaminasas de animales, que son dependientes del calcio para expresar sus actividades, y transglutaminasas de microorganismos [transglutaminasa(s) microbiana(s), a la/las que también se hace/hacen referencia más adelante como "MTG(s)" (del inglés, microbial transglutaminase(s)], que son independentes del calcio para expresar sus actividades. En cuanto a la MTG, se ha descubierto una transglutaminasa de una bacteria que pertenece al género Streptoverticillium. Dichas bacterias Streptoverticillium incluyen, por ejemplo, Streptoverticillium griseocarneum IFO 12776, Streptoverticillium cinnamoneum subespecie cinnamoneum IFO 12852, Streptoverticillium mobaraense (que en adelante puede ser abreviada S. mobaraense) IFO 13819 y otras [publicación de solicitud de patente japonesa no examinada (JP-Kokai) nº 64-27471.
Sin embargo, puesto que estas transglutaminasas han sido producidas por medio de la purificación de cultivos, tales como los de los microorganismos anteriormente descritos, ha habido problemas en cuanto a la cantidad, la eficacia y similares. Entonces, como un método para hacer que se secretaran eficazmente proteínas heterólogas, se estableció el método por el que se seleccionaba una bacteria corineforme como huésped, una proteína fusionada que tenia transglutaminasa conectada cadena abajo con el dominio del péptido señal de una bacteria corineforme, y la transglutaminasa resultaba eficazmente secretada para obtener una gran producción de transglutaminasa (WO 01/23591). En este estudio, se describe un método por el que una MTG es secretada en una forma inactiva como una protransglutaminasa (a la que más adelante se hace referencia como "pro-MTG") en que una parte proestructural está conectada con la MTG, y la parte proestructural de la pro-MTG es luego escindida por una proteasa para convertirla en una transglutaminasa que tiene actividad, así como un método por el que se produce directamente una transglutaminasa activa en el medio de cultivo por coexpresión de SAM-P45, que es una serina proteasa procedente de actinomicetos, en una cantidad necesaria y suficiente en una bacteria corineforme que produce la pro-MTG.
Aunque se supone que un método por el que se produce directamente una transglutaminasa activa por coexpresión de pro-MTG y una proteasa que permite escindir la parte proestructural de la pro-MTG en una bacteria corineforme es un método muy eficaz para producir transglutaminasa, la especificidad de sustrato de SAM-P45 no es tan estricta y puede digerir y degradar no sólo la parte proestructural de la pro-TMG sino también la propia transglutaminasa en cierto grado; por lo tanto, puede que el manejo de SAM-P45 no sea sencillo. Por lo tanto, en los casos en que se utiliza SAM-P45, el método de producción de transglutaminasa debería ser estrictamente controlado para que no tuviera lugar en el medio de cultivo la descomposición de la transglutaminasa producida,
Por lo tanto, queda aún la exigencia de una proteasa que pueda escindir selectivamente sólo la parte proestructural de la pro-MTG y que cause una sobre-descomposición lo más pequeña posible de la propia transglutaminasa, para llevar a cabo ventajosamente la producción de una transglutaminasa en forma activa.
Como una enzima que escinde la parte proestructural de la pro-MTG, además de SAM-P45, se conoce una dispasa procedente de Bacillus polymyxa [Eur. J. Biochem., volumen 257, páginas 570-576 (1998)]. Sin embargo, se requiere una gran cantidad de enzimas para la escisión de la parte proestructural y existe el riesgo de la sobredescomposición de la propia transglutaminasa. Además, una dispasa es un reactivo para cultivo celular, por lo que es costosa como enzima para uso industrial.
Como se mencionó anteriormente, queda aún la necesidad de una proteasa que pueda escindir selectivamente sólo la parte proestructural de la pro-MTG y que cause una sobredescomposición lo más pequeña posible de la propia transglutaminasa para llevar a cabo ventajosamente la producción de una transglutaminasa en forma activa. Además, se creyó que, si se pudieran usar proteasas que pudieran escindir selectivamente sólo la parte proestructural de la pro-MTG y que causaran una sobredescomposición lo más pequeña posible de la propia transglutaminasa, esto sería ventajoso para la producción de una transglutaminasa activa. Además, se creyó que, si las proteasas útiles para la producción de transglutaminasa que pueden escindir selectivamente la parte proestructural de la pro-MTG fueran aquéllas que pueden ser secretadas extracelularmente, esto sería más preferible porque las transglutaminasas activas podrían ser directamente producidas en el medio de cultivo haciendo que se coexpresaran junto con la pro-MTG.
Por lo tanto, un objeto del presente invento es proporcionar una proteasa que sea útil para la producción de transglutaminasa y que escinda selectivamente la parte proestructural de la pro-MTG.
En particular, un objeto del invento es proporcionar una proteasa que escinda selectivamente la parte proestructural de la pro-MTG, proteasa que puede ser producida utilizando una bacteria corineforme como huésped, y que pueda ser fácilmente secretada extracelularmente.
Un objeto del invento es también proporcionar una molécula de ácido nucleico que codifique dicha proteasa.
Otro objeto del invento es proporcionar un método para producir eficazmente MTG utilizando dicha proteasa.
Además, un objeto del invento es proporcionar un método para producir dicha proteasa.
Los inventores del presente invento buscaban una proteasa que escindiera selectivamente la parte proestructural de la pro-MTG pero que causara la menor descomposición posible de la propia transglutaminasa, y más adelante pudieron aislar y purificar una metaloproteasa neutra que tenía dicha propiedad. Los inventores también obtuvieron un DNA que codificaba dicha proteasa, lo introdujeron en una bacteria corineforme, y luego tuvieron éxito en su expresión secretora al utilizar una bacteria corineforme como huésped. Además, la presente enzima fue hecha reaccionar realmente sobre la pro-MTG para escindir la parte proestructural y luego se recuperó la transglutaminasa activa. Los inventores establecieron el presente invento al identificar metaloproteasas neutras procedentes de microorganismos de otras fuentes que tenían una función equivalente, que han demostrado ser similarmente útiles para la producción de una MTG activa.
Es decir, el presente invento es una metaloproteasa neutra de actinomicetos que presenta una elevada selectividad para escindir la parte proestructural de la pro-MTG, y una molécula de ácido nucleico que la codifica.
El presente invento es también un método para producir una MTG activa, que comprende escindir una parte proestructural de una pro-MTG mediante una metaloproteasa neutra.
El presente invento es también un método para producir dicha metaloproteasa, que comprende introducir una molécula de ácido nucleico que codifica dicha metaloproteasa neutra en una bacteria corineforme, cultivar la bacteria corineforme en que se ha introducido dicha molécula de ácido nucleico, permitiendo por ello la expresión de dicha metaloproteasa neutra, y recuperar dicha metaloproteasa extracelularmente secretada.
Más específicamente, el presente invento es una metaloproteasa neutra SVP35 procedente de actinomicetos que tiene las propiedades siguientes: 1) Peso molecular: aproximadamente 35.000 (según se mide por SDS-PAGE) 2) pH óptimo: 6,0-8,0, más específicamente 6,5-7,5, en particular alrededor de 7,0 3) Estabilidad frente al pH: pH de 4-10 4) Temperatura óptima: aproximadamente 45 °C 5) Estabilidad frente a la temperatura: es estable por debajo de aproximadamente 50 °C 6) Resulta fuertemente inhibida por el ácido etilendiaminotetraacético, la 1,10-fenantrolina y el fosforamidón, que son inhibidores de metaloproteasas, y por el inhibidor de la subtilisina de Streptomyces (SSI; del inglés, Streptomyces subtilisin inhibitor) procedente de actinomicetos.
El presente invento es también una metaloproteasa neutra SVP70 que tiene las propiedades siguientes: 1) Peso molecular: aproximadamente 71.000 (según se mide por SDS-PAGE) 2) pH óptimo: el intervalo 6,0-8,0, más específicamente 6,5-7,5, en particular alrededor de 7,0 3) Estabilidad frente al pH: pH de 5-10 4) Temperatura óptima: el intervalo de aproximadamente 50-55 °C, en particular alrededor de 55 °C 5) Experimenta una intensa acción inhibitoria por el ácido etilendiaminotetraacético, la 1,10-fenantrolina y el fosforamidón, que son inhibidores de metaloproteasas, el ditiotreitol, que es un agente reductor de enlaces disulfuro, y por el inhibidor de la subtilisina de Streptomyces (SSI) procedente de actinomicetos.
El presente invento es también una molécula de ácido nucleico que codifica dicha SVP35 o SVP70.
El presente invento es también un método para producir una MTG activa, que comprende escindir la parte proestructural de la pro-MTG mediante dicha SVP35 o SVP70.
Además, el presente invento es un método para producir SVP35 o SVP70, que comprende introducir una molécula de ácido nucleico que codifica dicha SVP35 o SVP70 en una bacteria corineforme, cultivar la bacteria corineforme en que se ha introducido dicha molécula de ácido nucleico, y recuperar la SVP35 o SVP70 extracelularmente secretada. Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un gráfico que presenta la dependencia de la actividad de SVP35 y SVP70 frente al pH.
La Figura 2 es un gráfico que presenta la estabilidad de SVP35 y SVP70 frente al pH.
La Figura 3 es un gráfico que presenta la dependencia de la actividad de SVP35 y SVP70 frente a la temperatura.
La Figura 4 es un gráfico que presenta la estabilidad de SVP35 frente a la temperatura.
La Figura 5 representa las actividades inhibitorias de diversos compuestos sobre las actividades de SVP35 y SVP70.
La Figura 6 representa el cambio secuencial de la conversión de pro-MTG en una forma activa de MTG por SVP35 y SVP70, como cambio respectivo de la cantidad de la proteína.
Las Figura 7 (A) y (B) son los gráficos que representan el curso temporal de la actividad transglutaminasa si se hace reaccionar una pro-MTG con SVP70 y SAM-P45, respectivamente. (A): adición de SVP70, ●: cantidad de adición de 1/200 con respecto al sustrato, ■: cantidad de adición de 1/500 con respecto al sustrato; (B): adición de SAM-P45, ▲: cantidad de adición de 1/10 con respecto al sustrato, ♦: cantidad de adición de 1/50 con respecto al sustrato.
Las Figura 8 (A) y (B) son los gráficos que representan el curso temporal de la cantidad de proteína MTG si se hace reaccionar una pro-MTG con SVP70 y SAM-P45, respectivamente. (A): adición de SVP70, ●: cantidad de adición de 1/200 con respecto al sustrato, ■: cantidad de adición de 1/500 con respecto al sustrato; (B): adición de SAM-P45, ▲: cantidad de adición de 1/10 con respecto al sustrato, ♦: cantidad de adición de 1/50 con respecto al sustrato. Descripción de las realizaciones preferidas
En general, se ha sabido que una proteína secretora es traducida como un prepéptido o un prepropéptido y, más tarde, su péptido señal ("una preparte") es escindido para convertirse en un péptido o propéptido maduro, y el propéptido es escindido en el dominio al que se hace referencia como proestructura para ser un péptido maduro. Como aquí se utiliza, a una parte proestructural de una proteína secretora se puede hacer simplemente referencia como "proestructura". Además, como aquí se utiliza, "una secuencia señal" se refiere a la secuencia que está situada en el extremo N de un precursor de proteína secretora y que no está presente en una proteína madura presente en la naturaleza, y "un péptido señal" se refiere al péptido que se escinde de dicho precursor proteico. Generalmente, una secuencia señal es escindida por una proteasa después de la secreción extracelular.
Como aquí se usa, a una proteína que no contiene un péptido señal pero contiene una parte proestructural se puede hacer referencia como "proproteína", tal como, por ejemplo, "protransglutaminasa" o "pro-MTG". Como aquí se usa, a una parte proestructural de una proteína secretora se puede hacer simplemente referencia como "una proestructura" o "una parte proestructural", y estas expresiones se pueden utilizar aquí indistintamente.
Entre las proteasas que supuestamente son capaces de expresarse fácilmente en una bacteria corineforme, los inventores llevaron primero a cabo la búsqueda de una proteasa que tuviera una especificidad y una selectividad elevadas para el sustrato de interés, es decir, una proteasa que escindiera selectivamente la parte proestructural de una pro-MTG y causara una sobredescomposición lo más pequeña posible de la propia transglutaminasa.
Cuando la MTG es secretada extracelularmente por un actinomiceto, se ha supuesto que es primero secretada como una pro-MTG, lo que va seguido de la escisión de la parte proestructural de la pro-MTG para dar lugar a una forma activa de MTG [Eur. J. Biochem., volumen 257, páginas 570-576 (1998)]. En consecuencia, los inventores han supuesto que una proteasa que escinde la parte proestructural de una pro-MTG está presente en los actinomicetos que producen MTG. Puesto que esta proteasa es originalmente una proteasa que escinde la parte proestructural, se supone que la proteasa tiene una elevada selectividad por los sustratos y sólo escinde la parte proestructural mientras actúa en menor grado sobre la propia MTG.
Además, en una bacteria corineforme se pueden expresar eficazmente tanto un gen estructural de una pro-MTG de actinomicetos como un gen estructural de la proteasa SAM-P45, y se pueden secretar extracelularmente. Basándose en esta información, se ha realizado una seria investigación con objeto de hallar la proteasa de interés a partir de una bacteria productora de MTG que es un actinomiceto, y, como resultado, se reveló que la cepa de Streptoverticillium mobaraense productora de MTG tenía una elevada selectividad de escisión por la parte proestructural de la pro-MTG y produce nuevas metaloproteasas neutras útiles para la producción de una MTG activa. Los presentes inventores aislaron y purificaron estas metaloproteasas neutras y demostraron sus propiedades enzimológicas. Además, los inventores determinaron las secuencias de aminoácidos de las partes N-terminales de estas metaloproteasas y obtuvieron los genes que codifican las metaloproteasas.
Además, los inventores introdujeron el gen de la enzima en una bacteria corineforme, permitiendo su expresión en un sistema utilizando una bacteria corineforme como huésped, y, como resultado, la enzima era secretada extracelularmente. Además, en la práctica, se hacía reaccionar la enzima sobre una pro-MTG de una parte proestructural, lo que daba lugar a la escisión de la parte proestructural para producir una transglutaminasa activa. También se han hallado metaloproteasas neutras de microorganismos de otras fuentes que tienen una función equivalente, que han demostrado ser similarmente útiles para la producción de una forma activa de MTG.
Más adelante se ilustrarán las realizaciones más específicas del presente invento.
Las metaloproteasas neutras de acuerdo con el presente invento pueden ser preparadas a partir de las superficies de actinomicetos en cultivo o del sobrenadante del cultivo de los actinomicetos, incluyendo Streptoverticillium mobaraense, Streptomyces griseus, Streptomyces coelicolor, etc.
En la parte siguiente se describen primero las recién halladas metaloproteasas neutras de Streptoverticillium mobaraense IFO13819.
El cultivo de una bacteria para obtener la metaloproteasa neutra de acuerdo con el presente invento, por ejemplo, un actinomiceto anteriormente descrito, puede ser llevado a cabo de acuerdo con los métodos convencionalmente utilizados para el cultivo de actinomicetos. Es decir, como medio para el cultivo, se puede utilizar un medio común que contiene convencionales fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, iones inorgánicos y otros. Como fuentes de carbono se pueden utilizar glucosa, almidón, sacarosa y otros. Como fuentes de nitrógeno, si fueran necesarias, se usan opcionalmente peptona, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, sal de amonio y otros. El cultivo puede ser llevado a cabo bajo el estado aeróbico que es apropiadamente controlado dentro del intervalo de pHs de entre 5,0 y 8,5 y el intervalo de temperaturas de entre 15 °C y 37 °C. Para la producción de las metaloproteasas neutras de acuerdo con el presente invento, el cultivo es preferiblemente continuado hasta que se puede alcanzar la máxima cantidad de la metaloproteasa neutra pretendida y luego puede ser terminado. Aunque el periodo de cultivo adecuado depende de la temperatura, el pH y el tipo de medio, normalmente el periodo es preferiblemente de aproximadamente 1 a 12 días. Después del periodo de cultivo, se puede someter el cultivo a la separación de las células y el sobrenadante por centrifugación y similares.
Las nuevas metaloproteasas neutras de acuerdo con el presente invento se pueden obtener del sobrenadante del cultivo así como de las células recuperadas, en particular de la superficie de las células. Para purificar la enzima, se pueden adoptar cualesquier métodos que se usan convencionalmente para purificar una enzima, tales como, por ejemplo, la técnica de precipitación por adición de sulfato amónico, la técnica de filtración en gel, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía hidrófoba y similares. La proteasa puede ser purificada más eficazmente usando cromatografía de alta eficacia en fase líquida (HPLC; del inglés, high performance li-quid chromatography), etc. La medición de la actividad enzimática de la metaloproteasa neutra obtenida de este modo puede ser llevada a cabo haciendo reaccionar la enzima con un péptido que contiene una región que conecta la proparte de una protransglutaminasa y una transglutaminasa madura, tal como, por ejemplo, el péptido sintético Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser (ID. SEC. nº 11) (Peptide Institute), como sus-trato y calculando la cantidad reducida del sustrato.
Como se mencionó anteriormente, la metaloproteasa neutra de acuerdo con el invento, purificada a partir de las células recuperadas, en particular de la superficie de las células, o a partir del sobrenadante del cultivo, puede ser analizada en cuanto a la secuencia de aminoácidos N-terminal mediante un secuenciador de proteínas en fase gaseosa para determinar la secuencia parcial de aminoácidos. Además, se pueden examinar las propiedades enzimáticas (pH óptimo, estabilidad frente al pH, temperatura óptima, efecto de un inhibidor, etc.) de la metaloproteasa neutra aislada y purificada.
En una realización del presente invento, la metaloproteasa neutra denominada SVP35 fue obtenida de la superficie de las células de Streptoverticillium mobaraense, y la metaloproteasa neutra denominada SVP70 puede ser obtenida del sobrenadante del cultivo de Streptoverticillium mobaraense.
En una realización del presente invento, la metaloproteasa neutra de acuerdo con el invento es la metaloproteasa neutra SVP35 que tiene las propiedades siguientes: 1) Peso molecular: aproximadamente 35.000 (según se mide por SDS-PAGE) 2) pH óptimo: 6,0-8,0, más específicamente 6,5-7,5, en particular alrededor de 7,0 3) Estabilidad frente al pH: pH de 4-10 4) Temperatura óptima: aproximadamente 45 °C 5) Estabilidad frente a la temperatura: es estable por debajo de aproximadamente 50 °C 6) Inhibidores: Resulta fuertemente inhibida por el ácido etilendiaminotetraacético, la 1,10-fenantrolina y el fosforamidón, que son inhibidores de metaloproteasas, y por el inhibidor de la subtilisina de Streptomyces (SSI) procedente de actinomicetos.
En otra realización del presente invento, la metaloproteasa neutra de acuerdo con el presente invento es la metaloproteasa neutra SVP70 que tiene las propiedades siguientes: 1) Peso molecular: aproximadamente 71.000 (según se mide por SDS-PAGE) 2) pH óptimo: 6,0-8,0, más específicamente 6,5-7,5, en particular alrededor de 7,0 3) Estabilidad frente al pH: pH de 5-10 4) Temperatura óptima: aproximadamente 50-55 °C, en particular alrededor de 55 °C 5) Inhibidores: Resulta fuertemente inhibida por el ácido etilendiaminotetraacético, la 1,10-fenantrolina y el fosforamidón, que son inhibidores de metaloproteasas, el ditiotreitol, que es un agente reductor de enlaces disulfuro, y por el inhibidor de la subtilisina de Streptomyces (SSI) procedente de actinomicetos.
Cuando se hace reaccionar SVP35 o SVP70 sobre pro-MTG, ambas muestran una elevada actividad de escisión selectiva sobre la parte proestructural de la MTG. Es decir, puesto que ambas enzimas se caracterizan por convertir eficazmente la pro-MTG en la MTG activa, aunque la actividad para degradar la propia MTG activa resultante es baja, ambas son las enzimas adecuadas para producir una MTG activa utilizando pro-MTG como materia prima. Las secuencias de aminoácidos N-terminales de las dos nuevas metaloproteasas neutras se muestran en la ID. SEC. nº 1 para SVP35 y la ID. SEC. nº 2 para SVP70, que revelan la homología entre estas secuencias. Por lo tanto, se buscaron aquellas enzimas que tuvieran cualquier homología con estas proteasas en cuanto a sus secuencias de aminoácidos N-terminales y se hallaron una metaloproteasa SGMP II [J. Biochem., volumen 110, páginas 339-344 (1991)] de Streptomyces griseus así como las tres metaloproteasas (Gen-Bank/EMBL/DDBJ CAB76000, CAB76001, CAB69762) de Streptomyces coelicolor y similares. Estas proteasas pueden ser también utilizadas del mismo modo que SVP35 y SVP70 para la escisión selectiva de la parte proestructural de una pro-MTG y pueden ser usadas con objeto de producir una MTG activa utilizando una pro-MTG como materia prima.
A continuación se describirá un método para producir la metaloproteasa neutra de acuerdo con el presente invento mediante una técnica de DNA recombinante.
Se conocen diversos ejemplos de la producción de proteínas útiles, incluyendo enzimas, sustancias fisiológicamente activas y similares, utilizando la técnica de DNA recombinante. La ventaja de utilizar la técnica de DNA recombinante es la capacidad de producción masiva de proteínas útiles que existen en cantidades mínimas en la naturaleza.
Para producir la metaloproteasa neutra de acuerdo con el presente invento utilizando la técnica de DNA recombinante, se genera primero una construcción genética, construcción genética que contiene un promotor, una secuencia que codifica un péptido señal apropiado, un fragmento de ácido nucleico que codifica la metaloproteasa neutra de acuerdo con el invento, y una secuencia reguladora (un operador o terminador, etc.) que es necesaria para que se exprese el gen de la metaloproteasa neutra en una bacteria corineforme, en una posición apropiada para que puedan actuar. La metaloproteasa neutra de acuerdo con el invento puede tener una parte proestructural en el extremo N. Los vectores que se pueden utilizar para esta construcción no están particularmente limitados e incluyen cualquiera que pueda actuar en una bacteria corineforme, y pueden ser aquellos que se replican autónomamente, tales como plásmidos, o aquellos que se integran en el cromosoma de la bacteria. Cuando se usa una bacteria corineforme como huésped, los plásmidos procedentes de bacterias corineformes son particularmente preferibles como vectores. Estos incluyen, por ejemplo, pHM1519 [Agric. Biol. Chem. 48, 2901-2903 (1984)], pAM330 [Agric. Biol. Chem. 48, 2901-2903 (1984)] y plásmidos modificados, que poseen genes de resistencia a fármacos.
Los ejemplos de la corinebacteria que se puede utilizar como bacteria huésped en el presente invento incluyen cepas mutantes procedentes de cepas de tipo silvestre, incluyendo Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066, Brevibacterium immariophilum ATCC14068, Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC13869, Brevibacterium roseum ATCC 13825, Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC14067, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum) ATCC15990, Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC6871 y similares, y cepas mutantes procedentes de cepas mutantes de estos tipos silvestres.
La cepas mutantes que se utilizan en el presente invento incluyen, por ejemplo, cepas mutantes defectuosas en cuanto a la capacidad para producir glutamato, cepas mutantes en cuanto a la producción de aminoácidos tales como lisina y similares, y cepas mutantes modificadas para que produzcan otras sustancias tales como ácidos nucleicos, por ejemplo, inosina. Dichas cepas mutantes se pueden obtener llevando a cabo un tratamiento con radiación ultravioleta o un agente mutágeno químico, tal como N-metil-N'-nitrosoguanidina o similares, y seleccionando luego las cepas en que ha aumentado la capacidad para secretar-producir proteínas.
Especialmente, se supone que Corynebacterium glutamicum AJ1203 (FERM BP-734) (el depósito original fue el 26 de Marzo de 1984; actualmente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chrome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, 305-8566, Japón), que se ha aislado de la Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) ATCC13869 de tipo silvestre como una cepa mutante resistente a la estreptomicina, tiene una mutación en un gen funcional asociado con la secreción de proteínas, y su capacidad para secretar-producir proteínas heterólogas es tan elevada como aproximadamente 2 ó 3 veces, como una cantidad acumulada, la de su cepa parental (cepa silvestre) bajo la condición de cultivo óptima, por lo que es adecuada como una bacteria huésped (véase el Documento WO 02/081694). Además, es preferible utilizar una cepa que haya sido obtenida modificando dicha cepa como un huésped para que la cepa ya no produzca la proteína de la superficie celular, porque la purificación de las proteínas heterólogas secretadas al medio resultará más sencilla, por lo que es particularmente preferible. Dicha modificación puede ser llevada a cabo, por medio de técnicas de mutagénesis o de recombinación génica, introduciendo una mutación en el gen cromosómico de la proteína de la superficie celular o en su región reguladora de la expresión.
Los ejemplos de promotores de una bacteria corineforme incluyen promotores para los genes de las proteínas PS1, PS2 y SlpA de la superficie celular, promotores para los genes en sistemas biosintéticos de diversos aminoácidos, tales como, por ejemplo, el gen de la glutamina sintetasa, el gen de la aspartocinasa en el sistema biosintético de la lisina y similares.
El péptido señal que se utiliza en el presente invento es el péptido señal de una proteína secretora de una bacteria corineforme, el huésped, y es preferiblemente el péptido señal de una proteína de la superficie celular de una bacteria corineforme. Las proteínas de la superficie celular de las bacterias corineformes incluyen PS1 y PS2 de C. glutamicum (JP-Kokai nº 6-502548) y SlpA de C. ammoniagenes (JP-Kokai nº 10-108675).
Para producir una metaloproteasa neutra cuya actividad relativa a la escisión selectiva de una proestructura de una pro-MTG sea elevada utilizando la técnica de DNA recombinante, se necesita un DNA que codifique dicha metaloproteasa neutra.
En una realización del presente invento, se produce la metaloproteasa neutra SVP35 utilizando la técnica de DNA recombinante. El DNA que codifica SVP35 puede ser obtenido del modo siguiente.
En primer lugar, se determina la secuencia de aminoácidos de la SVP35 purificada. Se puede usar el método de Edman [P. Edman, Acta Chem. Scand. 4, 227 (1950)] para determinar la secuencia de aminoácidos. También se pueden utilizar un secuenciador de proteínas en fase gaseosa, de Shimadzu Co. Ltd., y similares para determinar la secuencia de aminoácidos.
Para la metaloproteasa neutra SVP35 de acuerdo con el presente invento, se ha hallado la secuencia mostrada en la ID. SEC. nº 1 secuenciando 20 restos de aminoácido de su extremo N.
Esta información puede ser usada para sintetizar un cebador apropiado para PCR y generar una sonda para obtener la metaloproteasa neutra de acuerdo con el presente invento. Por ejemplo, un gen de proteasa de actinomicetos, del que se supone que tiene una homología basándose en los resultados de la búsqueda de homologías en la secuencia de aminoácidos N-terminal, por ejemplo, un gen de metaloproteasa (GenBank/EMBL/DDBJ CAB76001) de Streptomyces coelicolor, puede ser sometido a una PCR utilizando como molde un DNA de actinomicetos preparado mediante el método de Saito y Miura [Biochem. Biophys. Acta 72, 619 (1963)], para multiplicar el fragmento del gen que codifica esta proteasa. El fragmento multiplicado puede ser utilizado como una sonda.
A continuación, el DNA de actinomicetos preparado mediante el método de Saito y Miura, por ejemplo, el DNA cromosómico de Streptoverticillium mobaraense IFO13819, es digerido con diferentes enzimas de restricción apropiadas, por ejemplo, con diversas enzimas de restricción que reconocen secuencias de 6 bases. El DNA cromosómico de actinomicetos digerido puede ser analizado mediante las técnicas bien conocidas por los expertos en este campo técnico, tales como la técnica de hibridación por transferencia Southern descrita en "Molecular Cloning", 2ª edición [J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, página 9.31 (1989)], y similares, usando el producto de PCR obtenido mediante la PCR anteriormente descrita, marcado con 32P. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico que codifica la metaloproteasa neutra de acuerdo con el presente invento o la parte de la misma puede ser clonada recuperando el fragmento del que se ha confirmado por transferencia Southern que tiene una elevada homología con la sonda utilizada y clonándolo en un vector apropiado. Las técnicas necesarias para dicha clonación génica son bien conocidas por los expertos en este campo técnico [véase, por ejemplo, J. Sambrook,
E. F. Fritsch y T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, página 1.90 (1989)].
En una realización del presente invento, se lleva a cabo una PCR utilizando el DNA cromosómico de Streptomyces coelicolor A3(2) como molde para producir una sonda. Además, se detecta una sola banda de aproximadamente 8 kb, hibridable con sondas marcadas con 32P, en el producto de digestión del DNA cromosómico de Streptoverticillium mobaraense IFO13819 digerido con SphI. De esta manera, se digiere con SphI el DNA cromosómico de Streptoverticillium mobaraense IFO13819 preparado mediante el método precedente, se recupera el fragmento de aproximadamente 8 kb por medio de una electroforesis en gel de agarosa, se introduce el fragmento recuperado en el sitio SphI de pUC18 y luego se introduce en una célula competente de Escherichia coli JM109 para generar un banco. Se pueden obtener los clones de interés explorando el banco generado, utilizando un oligonucleótido sintético como sonda de acuerdo con las técnicas de hibridación de colonias descritas en "Molecular Cloning", 2ª edición (supra), y seleccionando la cepa que porta el plásmido que contiene el fragmento génico de SVP35 clonado en el plásmido. El plásmido recuperado de esta cepa es aquí denominado pVSV1. Se analiza la secuencia de nucleótidos del fragmento clonado en pVSV1 y se deduce la secuencia de aminoácidos primaria para confirmar que el fragmento codifica la secuencia de aminoácidos N-terminal previamente determinada. De este modo, se confirma que el gen obtenido es el gen que codifica SVP35.
Luego se puede construir una molécula de ácido nucleico recombinante que exprese la metaloproteasa neutra de acuerdo con el presente invento al ligar una construcción genética que contiene el DNA que codifica la metaloproteasa obtenida, con un vector apropiado que depende de las propiedades del huésped utilizado. Las células huésped de bacteria corineforme son transformadas con la molécula de ácido nucleico recombinante. Las células transformadas pueden ser cultivadas en un medio adecuado para recuperar la metaloproteasa neutra de acuerdo con el presente invento, secretada o acumulada en el medio y/o en la célula.
A continuación, se describirá un método para producir una MTG activa a partir de pro-MTG utilizando la metaloproteasa neutra.
La metaloproteasa neutra utilizada en la producción de una MTG activa puede ser hecha reaccionar sobre una pro-MTG, como una fracción que contiene la metaloproteasa neutra preparada a partir del medio de cultivo de una bacteria productora de metaloproteasa neutra. También puede ser utilizada como una metaloproteasa neutra más sumamente purificada con elevada actividad específica. Además, como se describe más adelante, también se puede utilizar la metaloproteasa neutra, en que la metaloproteasa neutra puede ser obtenida al cultivar la célula transformada con una molécula de ácido nucleico recombinante que se puede obtener al conectar un DNA que codifica una metaloproteasa neutra que tiene una intensa actividad de escisión selectiva hacia una parte proestructural de una pro-MTG.
La pro-MTG utilizada para la producción de MTG puede ser una fracción que contenga la pro-MTG preparada a partir del medio de cultivo de una bacteria productora de pro-MTG. También se puede usar una pro-MTG más sumamente purificada. La reacción se puede llevar a cabo bajo la condición de que la cantidad de una metaloproteasa neutra añadida a la pro-MTG sea de 1/10 a 1/500 en peso y de que se ajusten apropiadamente la temperatura de reacción en el intervalo de entre 15 °C y 50 °C y el pH en el intervalo de entre 5,0 y 9.
Además, la construcción genética, que se construye del modo anteriormente descrito y contiene el DNA que codifica la metaloproteasa neutra de acuerdo con el presente invento, puede ser introducida en un microorganismo que contiene la construcción genética que codifica una pro-MTG, en particular, en una bacteria corineforme, para producir en una sola célula bacteriana tanto la pro-MTG como la metaloproteasa neutra de acuerdo con el presente invento, por lo que se puede convertir la pro-MTG en una MTG madura bajo la condición anterior. En, por ejemplo, el Documento WO 01/123591 se describen un método más detallado para producir eficazmente una pro-MTG en células corineformes, la construcción genética utilizada para dicho método, y una bacteria corineforme en que se introducido la construcción genética. Más específicamente, por ejemplo, se puede obtener una bacteria corineforme que puede secretar extracelular y eficazmente una proteína pro-MTG al introducir una construcción genética en una bacteria corineforme, en que la construcción genética se obtiene al conectar la secuencia que tiene la secuencia que codifica una pro-MTG, que está situada cadena abajo con respecto a la secuencia que codifica el dominio de péptido señal de una bacteria corineforme, particularmente el dominio de péptido señal de una proteína de la superficie celular, cadena abajo con respecto a un promotor apropiado. El péptido señal, el promotor y el huésped que se pueden utilizar para este fin pueden ser seleccionados entre péptidos señal, promotores y huéspedes que son adecuados para que se expresen las metaloproteasas neutras de acuerdo con el presente invento, como se mencionó anteriormente. Los expertos en la técnica también conocen bien una combinación de vectores que son compatibles en la misma célula. Por lo tanto, se puede obtener la MTG madura introduciendo una apropiada construcción para expresión genética que contiene el DNA que codifica la metaloproteasa neutra de acuerdo con el presente invento, como se mencionó anteriormente, en una bacteria corineforme que produce una pro-MTG, o viceversa, introduciendo una apropiada construcción para expresión genética que codifica una pro-MTG en una bacteria corineforme que produce la metaloproteasa neutra de acuerdo con el presente invento, lo que permite que las construcciones genéticas que pueden expresar la pro-MTG y la metaloproteasa neutra de acuerdo con el presente invento coexistan en la misma bacteria, cultivando la bacteria y manteniendo el cultivo en una condición apropiada para que la metaloproteasa neutra de acuerdo con el presente invento pueda ser activa.
La transglutaminasa producida mediante el método de acuerdo con el presente invento puede ser aislada y purificada de la mezcla de reacción de acuerdo con los métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la transglutaminasa puede ser aislada y purificada separando las células de la mezcla por centrifugación, etc., y utilizando luego apropiados métodos conocidos tales como precipitación por adición de sal, precipitación con etanol, ultrafiltración, cromatografía de filtración en gel, cromatografía en columna de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía en fase líquida y presión media-elevada, cromatografía en fase inversa, cromatografía hidrófoba y las combinaciones de los mismos.
El presente invento es adicionalmente descrito en los ejemplos siguientes, los cuales no deben ser considerados en modo alguno como limitación del presente invento. Ejemplos Ejemplo 1: Metaloproteasa neutra producida por Streptoverticillium mobaraense IFO13819
(1) Purificación de la metaloproteasa neutra (SVP70) producida por Streptoverticillium mobaraense IFO13819
Se cargaron 800 ml de medio de cultivo ISP2 (4 g de extracto de levadura, 10 g de extracto de malta y 4 g de glucosa por litro de agua; pH ajustado a 7,3) en un matraz Sakaguchi (matraz con sacudimiento) de 5 l de capacidad, se inoculó Streptoverticillium mobaraense IFO13819 procedente de una placa y se cultivó mediante sacudimiento a 30 °C durante 9 días a 120 rpm. Se centrifugó el medio de cultivo y se recogió el sobrenadante del cultivo. Se filtró usando un filtro Depth (tamaño de poro de 3 µm; Saltorius Co, Ltd.), lo que fue seguido de concentración utilizando una membrana Sartocon Slice que tenía un tamaño de poro de 10.000 Da (Saltorius Co. Ltd.). El producto de concentración fue diluido en un orden de magnitud de 10 con tampón de Tris-HCl/cloruro cálcico 5 mM (pH de 7,5), sometido a cromatografía rápida en fase líquida para proteínas (FPLC; del inglés, fast protein liquid chromatography) (Amersham Pharmacia Co. Ltd.) en una columna de DEAE-Sepharose FF (2,6 cm de diámetro x 10 cm; Amersham Pharmacia Co. Ltd.) equilibrada con el mismo tampón, y eluida utilizando un gradiente lineal de concentraciones con cloruro sódico 0-0,5 M. Se recogió una fracción que contenía el ingrediente activo, se sometió a cromatografía en una columna de Phenyl-Sepharose HP (1,6 cm de diámetro x 10 cm; Amersham Pharmacia Co. Ltd.) equilibrada con sulfato amónico 1,5 M/tampón de MES 20 mM/cloruro cálcico 5 mM (pH de 6,0) y se eluyó usando un gradiente lineal de concentraciones con sulfato amónico 1,5-0 M, y se recogió una fracción activa. La fracción activa resultante fue dializada frente a tampón de MES 20 mM/cloruro cálcico 5 mM (pH de 6,0) durante la noche a 4 °C para obtener una disolución de enzima purificada.
La medición de la actividad enzimática en cada operación se llevó a cabo del modo siguiente:
La disolución de la enzima fue añadida a un tampón de fosfato sódico 20 mM que contenía el péptido GPSFRAPDS (Peptide Institute) (ID. SEC. nº 11) para obtener un volumen total de líquido de 170 µl y fue dejada reaccionar a 30 °C durante 10 minutos, lo que fue seguido de un calentamiento a 95 °C durante 5 minutos para
que terminara la reacción. Se analizaron 80 µl de esta disolución por HPLC bajo la
condición siguiente y se calculó su actividad basándose en la cantidad disminuida del
sustrato.
Aparato: sistema HPLC L-6300 (Hitachi Co. Ltd.)
Columna: YMC-PACK ODS 120A, 4,6 x 150 mm (YMC)
Eluyente: (A) TFA al 0,1%, (B) acetonitrilo al 80%/TFA al 0,1%
Condición de elución: gradiente lineal de concentraciones con acetonitrilo al 12-16%
(durante 15 minutos)
Caudal: 1,0 ml/min
Longitud de onda de detección: 220 nm
Bajo esta condición, el péptido GPSFRAPDS resultó eluido con un tiempo de retención de 13 a 14 minutos y el producto degradado FRAPDS resultó eluido con un tiempo de retención de 7,5 a 8,5 minutos.
La cantidad de enzima que cataliza la descomposición de un (1) nanomol de pro-MTG en un minuto se definió como una (1) unidad de actividad enzimática.
(2) Purificación de la metaloproteasa neutra (SVP35) producida por Streptoverticillium mobaraense IFO13819
Se cargaron 800 ml de medio de cultivo ISP2 en un matraz Sakaguchi de 5 l de capacidad, se inoculó Streptoverticillium mobaraense IFO13819 procedente de una placa y se cultivó mediante sacudimiento a 30 °C durante 48 horas a 120 rpm. Se centrifugó el medio de cultivo y se desechó el sobrenadante del cultivo para recoger las células. Se suspendieron las células en tampón de Tris-HCl 20 mM/cloruro sódico 30 mM (pH de 7,5), se sacudió la suspensión sobre hielo durante 4 horas y luego se recogió el sobrenadante por centrifugación. El sobrenadante obtenido fue filtrado y esterilizado utilizando un filtro Depth (tamaño de poro de 0,22 µm; fabricado por Saltorius Co, Ltd.) y fue luego sometido a FPLC (Amersham Pharmacia Co. Ltd.) en una columna de CM-Sepharose FF (1,6 cm de diámetro x 10 cm; Amersham Pharmacia Co. Ltd.) equilibrada con tampón de Tris-HCl 20 mM (pH de 7,5) que contenía cloruro de calcio 5 mM y cloruro de cinc 0,01 mM, realizándose la elución con el mismo tampón utilizando un gradiente lineal de concentraciones con cloruro sódico 0-0,5
M. Se recogió una fracción que contenía el ingrediente activo y se sometió adicional-mente a cromatografía en una columna de Phenyl-Sepharose HP (1 ml de capacidad, Amersham Pharmacia Co. Ltd.) equilibrada con tampón de Tris-HCl 20 mM que contenía sulfato amónico 1,5 M, cloruro cálcico 5 mM y cloruro de cinc 0,01 mM, realizándose la elución utilizando un gradiente lineal de concentraciones con sulfato amónico 1,5-0 M. Se recogió una fracción activa y se desmineralizó mediante un tampón de Tris-HCl 20 mM (pH de 7,5) que contenía cloruro de calcio 5 mM y cloruro de cinc 0,01 mM, utilizando una columna PD-10 (Amersham Pharmacia), para obtener una disolución de enzima con parte purificada.
Se midió la actividad enzimática en cada operación utilizando el péptido GPSFRAPDS como sustrato del mismo modo que en el punto (1).
(3) Evaluación de las propiedades de la metaloproteasa neutra (SVP35) producida por Streptoverticillium mobaraense IFO13819 i) Especificidad de sustrato
Se usó como sustrato 1 mg/ml de disolución de insulina B y disolución de pro-MTG preparada en tampón de Tris-HCl 20 mM (pH de 7,5) que contenía cloruro de calcio 5 mM y cloruro de cinc 0,01 mM, se añadió una disolución de enzima a la disolución para que reaccionaran a 30 °C durante 2 horas y se separaron luego los fragmentos peptídicos por HPLC bajo la condición siguiente: Aparato: L-7100/7200/7405/D-7600 (Hitachi Co. Ltd.) Columna: VYDAC C18, 4,6 mm de diámetro interno x 250 mm (VYDAC) Eluyente: (A) TFA al 0,1%, (B) acetonitrilo al 80%/TFA al 0,1% Condición de elución: gradiente lineal de concentraciones con acetonitrilo al 4-44% Caudal: 0,5 ml/min Longitud de onda de detección: radiación UV de 220 nm
Se analizaron mediante PPSQ-10 (Shimadzu Co. Ltd.) las secuencias de aminoácidos de los fragmentos peptídicos obtenidos, para caracterizar las secuencias de los puntos de escisión para SVP35. Como resultado, se confirmó que el péptido era escindido antes de (en el extremo N de) especialmente Phe, a menudo Leu, a veces Tyr, Trp, Ile y Val, y que la SVP reconocía los aminoácidos aromáticos y aminoácidos hidrófobos con cadenas laterales voluminosas situadas en P' 1 del sitio de escisión. ii) pH óptimo
En un tampón de GTA 0,15 M [tamponado mediante ácido 3,3-dimetilglutárico, tris(hidroximetil)aminometano, 2-amino-2-metil-1,3-propanodiol] con un pH de 3 a 10, se dejó que SVP35 actuara sobre Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser como sustrato a 30 °C durante 10 minutos. Como resultado, se reveló que el pH óptimo para SVP35 era aproximadamente 7,0 y que, cuando se definía la actividad en un pH de 7,0 como el 100%, la SVP35 tenía una actividad de 70% o más en un pH de 6,0-8,0 y una actividad de 80% o más en un pH de 6,5-7,5 (véase la Figura 1). iii) Estabilidad frente al pH
Se añadieron 40 µl de tampón de GTA 0,15 M para cada valor del pH de 3 a 10 a 10 µl de una disolución de la enzima SVP35 purificada y se dejó la mezcla a 4 °C durante la noche, lo que fue seguido de la adición de un tampón de fosfato sódico 0,1 M (pH de 7,0) para ajustar el volumen del líquido a 400 µl, y se ajustó el pH a 7,0. Se añadió Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser como sustrato a estas disoluciones de enzima y se dejó que transcurriera la reacción en un pH de 7,0 a 30 °C durante 10 minutos. Como resultado, se mostró que SVP35 era estable en el intervalo de pHs de 4 a 10 (cuando la actividad en un pH de 4,0 era definida como el 100%, tenía una actividad de 90% o más en un pH de 4-10) (véase la Figura 2). iv) Temperatura óptima
Se añadió Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser a la disolución de enzima purificada, diluida con tampón de Tris-HCl 20 mM (pH de 7,5) que contenía cloruro de calcio 5 mM y cloruro de cinc 0,01 mM, y se dejó que transcurriera la reacción en un pH de 7,0 durante 10 minutos a una temperatura de entre 5 °C y 65 °C. Como resultado, se mostró que SVP35 tenía una temperatura óptima de aproximadamente 45 °C y tenía una elevada actividad en el intervalo de 40 °C a 50 °C (tenía una actividad de 80% o más que aquella a 45 °C) (véase la Figura 3). v) Estabilidad frente a la temperatura
Se añadieron 40 µl de tampón de Tris-HCl 20 mM (pH de 7,5) que contenía cloruro de calcio 5 mM y cloruro de cinc 0,01 mM a 10 µl de la disolución de enzima purificada para un tratamiento a 4 °C o a una temperatura de 30 °C a 70 °C durante 15 minutos, y luego se enfrió la mezcla mediante hielo y se añadieron 250 µl de un tampón de fosfato sódico 20 mM (pH de 7,0). Se añadió Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser como sustrato a esta disolución de enzima y se dejó que transcurriera la reacción a 30 °C durante 5 minutos. Cuando la actividad con el tratamiento a 4 °C fue definida como el 100%, se calculó la actividad restante a cada temperatura. Como resultado, se mostró que SVP35 conservaba el 80% de la actividad a 50 °C pero perdía su actividad a 60 °C (véase la Figura 4).
vi) Inhibidores
Se añadió la disolución de enzima purificada a un tampón de fosfato sódico 20 mM (pH de 7,0) que contenía diversos compuestos con la concentración mostrada en la Figura 5 y se dejó la mezcla a temperatura ambiental durante 60 minutos. Luego se añadió Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser como sustrato y se dejó que transcurriera la reacción durante 10 minutos a 30 °C. Se calculó la actividad relativa al añadir cada compuesto basándose en una actividad de escisión de Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser de 100% en ausencia de compuestos. Como resultado, se mostró que SVP35 resultaba fuertemente inhibida por el ácido etilendiaminotetraacético, la 1,10-fenantrolina y el fosforamidón, que son inhibidores de metaloproteasas, y por el inhibidor de la subtilisina de Streptomyces (SSI) procedente de actinomicetos (véase la Figura 5).
(4) Caracterización de las propiedades de la metaloproteasa neutra (SVP70) producida por Streptoverticillium mobaraense IFO13819 i) Especificidad de sustrato
Se examinó la especificidad de sustrato de una manera similar a la descrita en (3)-i). Como resultado, se reveló que el sustrato era escindido antes de (en el lado N-terminal de) especialmente Phe, a menudo Leu, a veces Tyr, Trp, Ile y Val, y que SVP70 reconocía los aminoácidos aromáticos y aminoácidos hidrófobos con cadenas laterales voluminosas situadas en P' 1 del sitio de escisión. ii) pH óptimo
Se examinó el pH óptimo de SVP70 de una manera similar a la descrita en (3)-ii). Como resultado, se reveló que el pH óptimo para SVP70 era aproximadamente 7,0 y que, si se definía la actividad en un pH de 7,0 como 100%, la SVP70 tenía una actividad de 90% o más en un pH de 6,0-8,0 y una actividad de 95% o más en un pH de 6,5-7,5 (véase la Figura 1). iii) Estabilidad frente al pH
Se examinó la estabilidad frente al pH de una manera similar a la descrita en (3)-iii). Como resultado, se mostró que SVP70 era estable en un pH de 5 a 10 pero era menos estable que SVP35 en un pH ligeramente alcalino (véase la Figura 2). Específicamente, si la actividad en un pH de 5,0 era definida como 100%, tenía una actividad de 90% o más en el intervalo de pHs de 5 a 7 y tenía una actividad de aproximadamente 80% o más incluso en el intervalo de pHs de 7 a 10.
iv) Temperatura óptima
Se examinó la temperatura óptima de SVP70 de una manera similar a la descrita en (3)-iv). Como resultado, se mostró que la temperatura óptima de SVP70 estaba en el intervalo de aproximadamente 50 °C a 55 °C, especialmente alrededor de 55 °C (véase la Figura 3). v) Inhibidores
Se examinaron las actividades inhibitorias de diversos compuestos sobre SVP70 de una manera análoga a la descrita en (3)-vi). Como resultado, SVP70 experimentó una intensa acción inhibitoria por el ácido etilendiaminotetraacético, la 1,10-fenantrolina y el fosforamidón, que son inhibidores de metaloproteasas, y por el agente reductor ditiotreitol, la urea y el inhibidor de la subtilisina de Streptomyces (SSI) procedente de actinomicetos (véase la Figura 5).
(5) Secuenciación de la secuencia de aminoácidos N-terminal de SVP35 y SVP70
Se transfirieron las enzimas purificadas de SVP35 y SVP70, obtenidas en los puntos (1) y (2) anteriores, a una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF; del inglés, polyvinilidene-difluoride) usando Membrane Cartridge (Perkin Elmer Co. Ltd.) y se analizó la secuencia de aminoácidos N-terminal utilizando el secuenciador de proteínas en fase gaseosa PPSQ-10 (Shimadzu Co. Ltd.). La secuencia de aminoácidos de SVP35 se muestra en la ID. SEC. nº 1, y la secuencia de aminoácidos de SVP70 se muestra en la ID. SEC. nº 2. Se puede ver una homología en estas secuencias.
En consecuencia, se buscaron aquellas enzimas que tuvieran cualquier homología con estas proteasas en cuanto a sus secuencias de aminoácidos N-terminales y luego se hallaron la metaloproteasa SGMP II [J. Biochem., volumen 110, páginas 339-344 (1991)] de Streptomyces griseus y tres metaloproteasas (Gen-Bank/EMBL/DDBJ CAB76000, la misma CAB76001 y la misma CAB69762), etc., de Streptomyces coelicolor. Estas proteasas pueden ser también utilizadas para escindir selectivamente la parte proestructural de la pro-MTG y, por lo tanto, pueden ser usadas para producir una forma activa de MTG de acuerdo con el presente invento.
(6) Clonación del gen SVP35 y su expresión secretora en bacterias corineformes
Se preparó el DNA cromosómico de Streptomyces coelicolor A3(2) utilizando el método de Saito y Miura [Biochem. Biophys. Acta 72, 619 (1963)]. Se sintetizaron los cebadores mostrados en la ID. SEC. nº 3 y la ID. SEC. nº 4 por referencia a la secuencia del gen de metaloproteasa (GenBank/EMBL/DDBJ CAB76001) de Streptomyces coelicolor, que tienen una homología en la secuencia de aminoácidos N-terminal. Se usaron los cebadores mostrados en la ID. SEC. nº 3 y la ID. SEC. nº 4 para llevar a cabo una PCR utilizando el DNA cromosómico de Streptomyces coelicolor A3(2) como molde, y se multiplicó la región génica del gen de la metaloproteasa. Para la reacción PCR, se usó la DNA polimerasa Pyrobest (Takarasyuzo Co. Ltd.), y la condición de reacción siguió el protocolo recomendado por el fabricante. Se digirió el DNA cromosómico de Streptoverticillium mobaraense IFO13819, preparado mediante el método de Saito y Miura, con diversas enzimas de restricción que reconocen secuencias de 6 bases, se analizaron las muestras digeridas mediante una hibridación por transferencia Southern del modo descrito en "Molecular Cloning", 2ª edición [J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, página 9.31 (1989)] usando como sonda el producto de PCR marcado con 32P, y se detectó una sola banda de aproximadamente 8 kb mediante escisión por SphI. En consecuencia, se digirió con SphI el DNA cromosómico de Streptoverticillium mobaraense IFO13819 que había sido preparado mediante el método precedente, y se recuperó el fragmento de aproximadamente 8 kb por medio de electroforesis en gel de agarosa utilizando EASYTRAP ver. 2 (Takarasyuzo Co. Ltd). El fragmento recuperado fue insertado en el sitio SphI de pUC18, que fue introducido en células competentes de Escherichia coli JM109 (Takarasyuzo Co. Ltd) para generar un banco. El banco fue explorado en cuanto a la cepa bacteriana que contiene el plásmido en que se clonó el fragmento del gen SVP35, mediante hibridación de colonias del modo descrito en "Molecular Cloning", 2ª edición [J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, página 1.90 (1989)], usando el nucleótido sintético como sonda.
El plásmido fue recuperado de la cepa anteriormente obtenida y fue denominado pVSV1. Se determinó la secuencia de nucleótidos del fragmento clonado en pVSV1. En la ID. SEC. nº 5 se muestra la secuencia de nucleótidos de este fragmento clonado. Se dedujo la secuencia de aminoácidos primaria codificada por este gen, lo que permitió la determinación de la secuencia de aminoácidos primaria completa de SVP35 que contiene la secuencia señal de SVP35, incluyendo la secuencia de aminoácidos de la porción N-terminal previamente determinada y la región que supuestamente es una parte proestructural. En la ID. SEC. nº 6 se muestra la secuencia de aminoácidos completa de SVP35. Se supone que los aminoácidos números 1-36 de la secuencia de aminoácidos descrita en la ID. SEC. nº 6 se refieren a la secuencia señal, los aminoácidos números 37-216 se refieren a la parte proestructural, y los aminoácidos números 217-537 corresponden a la SVP35 madura.
Se sintetizaron los cebadores mostrados en la ID. SEC. nº 7 y la ID.
SEC. nº 8 utilizando pVSV1 como molde por referencia a la secuencia de la ID. SEC. nº 5, y se multiplicó la región génica que contenía la parte proestructural de SVP35 y la SVP35 madura mediante una técnica de PCR. Para la reacción PCR, se usó la DNA polimerasa Pyrobest (Takarasyuzo Co. Ltd.), y la condición de reacción siguió el protocolo recomendado por el fabricante.
A continuación, utilizando como molde el pPKSPTG1 descrito en el documento WO 01/23591, se multiplicó la región que incluye la región 5'-cadena arriba que contiene la región promotora del gen de PS2, que es una proteína de la superficie celular de C. glutamicum, y la secuencia señal de SlpA, una proteína de la superficie celular de C. ammoniagenes, mediante una técnica de PCR utilizando la combinación de los oligonucleótidos de las ID. SEC. nº 9 e ID. SEC. nº 10. El cebador mostrado en la ID. SEC. nº 10 contiene la secuencia que codifica los aminoácidos N-terminales de SVP35 que tienen una parte proestructural.
Luego se multiplicó el gen del fragmento génico de preproSVP35 de fusión heteróloga, que estaba conectado con la región 5'-cadena arriba que comprende la región promotora del gen de PS2 y la secuencia señal de SlpA, la proteína de la superficie celular de C. ammoniagenes, llevando a cabo una PCR con sobrecruzamiento con la ID. SEC. nº 8 y la ID. SEC. nº 9 usando una mezcla de 1 μl de cada una de las disoluciones de PCR multiplicadas. El fragmento multiplicado de aproximadamente 2,3 kb fue detectado mediante electroforesis en gel de agarosa. Se sometió el producto de PCR a una electroforesis en gel de agarosa para recuperar un fragmento de aproximadamente 2,3 kb y, después de dejar romos sus extremos usando DNA Blunting Kit (Takarasyuzo Co. Ltd.), se insertó el fragmento en el sitio SmaI de pCV7 del modo descrito en JP-Kokai nº 9-070291 para obtener pVSV1. Se determinó la secuencia de nucleótidos del fragmento insertado, de acuerdo con el método convencional, para confirmar que se había construido el gen de fusión del modo esperado.
Se transformó C. glutamicum ATCC13869 con el plásmido pVSV1 construido y se seleccionaron las cepas cultivadas en un medio de agar CM2S que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol (10 g de extracto de levadura, 10 g de triptona, 5 g de sacarosa, 5 g de NaCl y 15 g de agar por litro de agua destilada). La C. glutamicum ATCC13869 seleccionada que portaba pVSV1 fue luego cultivada en medio de cultivo MMTG (60 g de glucosa, 0,4 g de sulfato magnésico heptahidratado, 30 g de sulfato amónico, 1 g de dihidrogenofosfato potásico, 0,01 g de sulfato ferroso heptahidratado, 0,01 g de sulfato de manganeso pentahidratado, 450 µg de hidrocloruro de tiamina, 450 µg de biotina, 0,15 g de D,L-metionina y 50 g de carbonato cálcico por litro de agua destilada; pH ajustado a 7,5) que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol a 30 °C durante 30 horas. Se centrifugó 1 ml del medio de cultivo para separar el sobrenadante del cultivo y las bacterias. La actividad de SVP35 se detectó en el sobrenadante del cultivo y, como resultado de una electroforesis SDS-PAGE [Nature 227, 380-685 (1970)] de acuerdo con el método de Laemmli, se confirmó que se expresaban-secretaban aproximadamente 200 mg/l de SVP35. Ejemplo 2: Conversión de transglutaminasa de Streptoverticillium mobaraense IFO13819 (pro-MTG) en una forma activa
Utilizando pro-MTG (1 mg/ml) expresada por Corynebacterium glutamicum como un sustrato purificado, se mezcló la proteasa neutra (SVP35, SVP70) de Streptoverticillium mobaraense o la metaloproteasa neutra SGMP II de Streptomyces griseus en una relación de sustrato:enzima = 200:1 y se dejó reaccionar la mezcla a 30 °C. Después de 0, 1, 2, 4, 7 y 20 horas, se tomaron secuencialmente partes alícuotas de la mezcla de reacción y se mezclaron con tampón de muestras para SDSPAGE, y se calentaron las mezclas a 95 °C durante 3 minutos y se sometieron luego a SDS-PAGE de acuerdo con el método de Laemmli [Nature 227, 680-685 (1970)]. El resultado se muestra en la Figura 6. Como se puede ver en la Figura 6, cuando se hicieron reaccionar estas proteasas, las pro-MTGs se convirtieron en las formas maduras, y las MTGs producidas no se redujeron ni siquiera después de una reacción de larga duración. Se midió la actividad transglutaminasa (TG) de la fracción recogida mediante el método del hidroxamato y se confirmó la actividad suficiente. Además, se purificó la SGMP II a partir de actinasa (Kakenseiyaku Co. Ltd) de acuerdo con el método de referencia (J. Biochem., volumen 110, páginas 339-344, 1991).
Luego se añadieron la metaloproteasa neutra SVP70 de Streptoverticillium mobaraense y la serina proteasa SAM-P45 (Streptomyces albogriseolus) como testigo a las pro-MTGs aumentando gradualmente la cantidad de estas enzimas, llevándose la reacción a cabo a 30 °C y en un pH de 7,0. Después de 1, 4, 7 y 24 horas, se recogieron secuencialmente fracciones de la mezcla de reacción para determinar la actividad TG mediante el método del hidroxamato (véase la Figura 7). Se midió la concentración de proteína de la TG por cromatografía en fase inversa (véase la Figura 8). Como resultado, se mostró que SVP podía convertir la pro-MTG en la MTG activa con una cantidad tan pequeña como el 1/500 del sustrato. Se mostró que SAM-P45 sólo generaba una actividad transglutaminasa insuficiente incluso en una cantidad del 1/50 del sustrato y que no se observaba la conversión completa en la forma activa. Por otra parte, cuando se añadía SAM-P45 en una cantidad del 1/10 del sustrato, se observaba la conversión en la MTG activa, pero se observaba una disminución en la cantidad y la actividad de la proteína MTG. Esto sugiere que tenía lugar la sobredescomposición de la MTG madura por SAM-P45.
El presente invento proporciona una nueva proteasa procedente de un actinomiceto, Streptoverticillium mobaraense, que escinde específicamente la parte proestructural del precursor de transglutaminasa para activarlo, y el gen de la misma. La nueva proteasa de acuerdo con el presente invento puede ser expresada en gran cantidad por una bacteria corineforme y, por ello, el presente invento proporciona un método para producir eficazmente transglutaminasa a partir de microorganismos.
La ventaja de utilizar las metaloproteasas neutras de actinomicetos de acuerdo con el presente invento para la producción de una MTG activa es que estas enzimas presentan unas potentes actividades en cuanto a escindir selectivamente la parte proestructural de la pro-MTG y que estas enzimas pueden ser extracelularmente expresadas por una bacteria corineforme.
Como se muestra que la pro-MTG de actinomicetos puede ser eficazmente expresada y secretada por una bacteria corineforme, es posible producir más eficazmente una MTG activa mediante una sola célula bacteriana al hacer que se coexpresen y secreten la pro-MTG y la metaloproteasa neutra. En este caso, sólo basta que se exprese la metaloproteasa neutra en una cantidad necesaria y suficiente para escindir la parte proestructural de la pro-MTG. Referencias
- 1.
- JP-Kokoku nº 1-50382
- 2.
- JP-Kokai nº 64-27471
- 3.
- Publicación WO nº 01/2351
- 4.
- JP-Kokai nº 6-502548
- 5.
- JP-Kokai nº 10-108675
- 6.
- Eur. J. Biochem., volumen 257, páginas 570-576, 1998
- 7.
- J. Biochem., volumen 110, páginas 339-344, 1991
LISTA DE SECUENCIAS
<110> Ajinomoto Co., Inc.
<120> Método para producir transglutaminasa microbiana
<130> 0P04093
<150> JP 2003-61623
<151> 2003-03-07
<160> 11
<170> PatentIn, versión 3.2
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Streptoverticillium mobaraense
<400> 1
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> Streptoverticillium mobaraense
<400> 2
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 3 <210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 4
<210> 5
<211> 1614
<212> DNA
<213> Streptoverticillium mobaraense
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1611)
<400> 5
<210> 6
<211> 537
<212> PRT
<213> Streptoverticillium mobaraense
<400> 6
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Cebador de PCR
<400> 7
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 8
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 9
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 10
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Streptoverticillium mobaraense
<400> 11
Claims (6)
- REIVINDICACIONES1. Un método para producir una transglutaminasa microbiana activa a partir de una protransglutaminasa microbiana, que comprende cultivar un microorganismo en que se ha introducido un gen que codifica una metaloproteasa neutra procedente de actinomicetos, produciéndose por ello la metaloproteasa neutra, y escindir selectivamente una parte proestructural de la protransglutaminasa mediante la metaloproteasa neutra que es producida por el microorganismo, en que la metaloproteasa neutra procedente de actinomicetos se caracteriza por que1) tiene un peso molecular de aproximadamente 35.000;2) tiene un pH óptimo de 7,0;3) es estable en un pH de 4-10;4) tiene una temperatura óptima de aproximadamente 45 °C;5) es estable por debajo de aproximadamente 50 °C; y6) es fuertemente inhibida por el ácido etilendiaminotetraacético, la 1,10-fenantrolina y el fosforamidón, que son inhibidores de metaloproteasas, y por el inhibidor de la subtilisina de Streptomyces (SSI) procedente de actinomicetos; o7) tiene un peso molecular de aproximadamente 71.000;8) tiene un pH óptimo de 7,0;9) es estable en un pH de 5-10;10) tiene una temperatura óptima de aproximadamente 55 °C; y11) es fuertemente inhibida por el ácido etilendiaminotetraacético, la 1,10-fenantrolina y el fosforamidón, que son inhibidores de metaloproteasas, el ditiotreitol, que es un agente reductor de enlaces disulfuro, y por el inhibidor de la subtilisina de Streptomyces (SSI) procedente de actinomicetos.
-
- 2.
- Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en que el microorganismo en que se ha introducido un gen que codifica una metaloproteasa neutra de actinomicetos es una bacteria corineforme.
-
- 3.
- Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en que la metaloproteasa neutra que tiene el peso molecular de aproximadamente 35.000 tiene la secuencia de aminoácidos N-terminal de la ID. SEC. nº 1.
-
- 4.
- Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en que la metaloproteasa neutra que tiene el peso molecular de aproximadamente 71.000 tiene la secuencia de aminoácidos N-terminal de la ID. SEC. nº 2.
-
- 5.
- Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en que la metaloproteasa neutra que tiene el peso molecular de aproximadamente 35.000 tiene la secuen
cia de aminoácidos de las posiciones de aminoácido 217-537 de la ID. SEC. nº 6. -
- 6.
- El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, en que se produce dicha protransglutaminasa al cultivar un microorganismo en que se introducido un gen que codifica la protransglutaminasa.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003061623 | 2003-03-07 | ||
| JP2003-61623 | 2003-03-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2356149T3 true ES2356149T3 (es) | 2011-04-05 |
Family
ID=32958965
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES04717856T Expired - Lifetime ES2356149T3 (es) | 2003-03-07 | 2004-03-05 | Procedimiento para producir transglutaminasa microbiana. |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7704707B2 (es) |
| EP (1) | EP1602722B1 (es) |
| JP (1) | JP4482938B2 (es) |
| KR (1) | KR20050106502A (es) |
| CN (1) | CN100381569C (es) |
| AT (1) | ATE496995T1 (es) |
| BR (1) | BRPI0407911A (es) |
| CA (1) | CA2518049C (es) |
| DE (1) | DE602004031198D1 (es) |
| DK (1) | DK1602722T3 (es) |
| ES (1) | ES2356149T3 (es) |
| RU (1) | RU2316594C2 (es) |
| WO (1) | WO2004078973A1 (es) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2000230762A1 (en) * | 2000-01-21 | 2001-07-31 | Ajinomoto Co. Inc. | Process for producing l-lysine |
| ATE496995T1 (de) | 2003-03-07 | 2011-02-15 | Ajinomoto Kk | Verfahren zur herstellung mikrobieller transglutaminase |
| WO2005103278A1 (ja) * | 2004-04-20 | 2005-11-03 | Ajinomoto Co., Inc. | タンパク質の製造法 |
| JP4631436B2 (ja) * | 2004-12-22 | 2011-02-16 | 岡山県 | メタロエンドペプチダーゼ |
| JP4973496B2 (ja) * | 2005-08-30 | 2012-07-11 | 味の素株式会社 | トランスグルタミナーゼ含有物のプロテアーゼ活性測定方法及び接着用トランスグルタミナーゼ製剤 |
| WO2007026922A1 (ja) * | 2005-08-30 | 2007-03-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プロテアーゼ活性が低減されているトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法 |
| KR101162049B1 (ko) * | 2007-02-15 | 2012-07-04 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 디설파이드 결합 도입 트랜스글루타미나제 |
| EP2138049B1 (en) | 2007-03-29 | 2014-06-25 | Ajinomoto Co., Inc. | Enzyme preparation for adhesion and method of producing adhesion-molded food product |
| WO2009066785A1 (ja) | 2007-11-19 | 2009-05-28 | Ajinomoto Co., Inc. | 繊維加工物及びその製造法 |
| WO2009102050A1 (ja) * | 2008-02-15 | 2009-08-20 | Ajinomoto Co., Inc. | 腸管免疫賦活剤 |
| EP2302066A4 (en) * | 2008-07-09 | 2012-02-08 | Ajinomoto Kk | METHOD FOR PRODUCING AMINOHYDROXYBENZOIC ACID |
| TWI444146B (zh) | 2008-09-25 | 2014-07-11 | Ajinomoto Kk | 黏著成型食品用酵素製劑及黏著成型食品之製造方法 |
| WO2010101256A1 (ja) | 2009-03-06 | 2010-09-10 | 味の素株式会社 | 放線菌由来の耐熱性トランスグルタミナーゼ |
| IN2014CN00436A (es) | 2011-06-23 | 2015-04-03 | Ajinomoto Kk | |
| EP2772546B1 (en) | 2011-10-25 | 2019-05-15 | Ajinomoto Co., Inc. | Secretion production method for protein |
| IN2014CN04002A (es) * | 2011-11-02 | 2015-10-23 | Ajinomoto Kk | |
| WO2013065869A1 (en) | 2011-11-02 | 2013-05-10 | Ajinomoto Co.,Inc. | Method for secretory production of protein |
| CN104379742A (zh) | 2012-05-29 | 2015-02-25 | 味之素株式会社 | 生产3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸的方法 |
| EP3218473B1 (en) * | 2014-11-10 | 2020-04-08 | Novozymes A/S | Metalloproteases and uses thereof |
| CN108103041A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-06-01 | 泰兴市东圣生物科技有限公司 | 一种热稳定微生物转谷氨酰胺酶及其编码基因 |
| CN113528478B (zh) * | 2020-04-13 | 2023-01-20 | 中国科学院微生物研究所 | 一种高效生产转谷氨酰胺酶的方法及其专用工程菌 |
| CN113528479B (zh) * | 2020-04-13 | 2023-01-24 | 中国科学院微生物研究所 | 一种转谷氨酰胺酶的高效制备方法及其专用工程菌 |
| KR102277403B1 (ko) * | 2021-01-27 | 2021-07-14 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 리보뉴클레아제 p 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0665280B2 (ja) | 1987-03-04 | 1994-08-24 | 味の素株式会社 | タンパクゲル化剤及びそれを用いるタンパクのゲル化方法 |
| TW306932B (es) * | 1993-08-27 | 1997-06-01 | Holland Sweetener Co | |
| DE69535037T2 (de) * | 1994-08-26 | 2006-12-07 | Novozymes A/S | Mikrobielle transglutaminasen, ihre herstellung und ihre verwendung |
| JPH0970291A (ja) | 1995-06-30 | 1997-03-18 | Ajinomoto Co Inc | 人工トランスポゾンを用いた遺伝子増幅方法 |
| CN1174889A (zh) * | 1997-06-16 | 1998-03-04 | 中国医学科学院医药生物技术研究所 | 一种链霉菌产生的新型纤溶酶 |
| RU2224796C2 (ru) * | 1999-09-30 | 2004-02-27 | Адзиномото Ко., Инк. | Способ получения гетерологичного секреторного белка |
| JP4320769B2 (ja) | 1999-09-30 | 2009-08-26 | 味の素株式会社 | トランスグルタミナーゼの製造法 |
| EP1375664B1 (en) | 2001-03-30 | 2009-11-04 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for the secretion and production of protein |
| RU2209244C2 (ru) * | 2001-04-28 | 2003-07-27 | Закрытое акционерное общество "АСГЛ-Фармацевтические Инновации" | Нуклеиновая кислота, кодирующая лидерную последовательность (варианты), вектор на основе плазмиды р6803-platform (варианты), лидерный пептид (варианты) и способ получения белков |
| ATE496995T1 (de) * | 2003-03-07 | 2011-02-15 | Ajinomoto Kk | Verfahren zur herstellung mikrobieller transglutaminase |
| WO2005103278A1 (ja) * | 2004-04-20 | 2005-11-03 | Ajinomoto Co., Inc. | タンパク質の製造法 |
-
2004
- 2004-03-05 AT AT04717856T patent/ATE496995T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-03-05 EP EP04717856A patent/EP1602722B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-05 CA CA2518049A patent/CA2518049C/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-05 BR BRPI0407911-6A patent/BRPI0407911A/pt not_active Application Discontinuation
- 2004-03-05 JP JP2005503155A patent/JP4482938B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-05 DE DE602004031198T patent/DE602004031198D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-05 ES ES04717856T patent/ES2356149T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-05 WO PCT/JP2004/002923 patent/WO2004078973A1/ja not_active Ceased
- 2004-03-05 KR KR1020057016640A patent/KR20050106502A/ko not_active Ceased
- 2004-03-05 RU RU2005127869/13A patent/RU2316594C2/ru active
- 2004-03-05 CN CNB2004800062248A patent/CN100381569C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-05 DK DK04717856.1T patent/DK1602722T3/da active
-
2005
- 2005-09-06 US US11/218,780 patent/US7704707B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-03-01 US US12/714,853 patent/US8105802B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2518049C (en) | 2013-05-07 |
| CA2518049A1 (en) | 2004-09-16 |
| KR20050106502A (ko) | 2005-11-09 |
| RU2005127869A (ru) | 2006-02-10 |
| US20100159560A1 (en) | 2010-06-24 |
| BRPI0407911A (pt) | 2006-02-14 |
| US8105802B2 (en) | 2012-01-31 |
| EP1602722B1 (en) | 2011-01-26 |
| US7704707B2 (en) | 2010-04-27 |
| CN100381569C (zh) | 2008-04-16 |
| EP1602722A4 (en) | 2006-08-02 |
| JPWO2004078973A1 (ja) | 2006-06-08 |
| ATE496995T1 (de) | 2011-02-15 |
| US20060019367A1 (en) | 2006-01-26 |
| DE602004031198D1 (de) | 2011-03-10 |
| CN1759180A (zh) | 2006-04-12 |
| WO2004078973A1 (ja) | 2004-09-16 |
| RU2316594C2 (ru) | 2008-02-10 |
| DK1602722T3 (da) | 2011-05-16 |
| EP1602722A1 (en) | 2005-12-07 |
| JP4482938B2 (ja) | 2010-06-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2356149T3 (es) | Procedimiento para producir transglutaminasa microbiana. | |
| ES2335750T3 (es) | Metodo de secrecion y de produccion de proteinas. | |
| KR100565030B1 (ko) | 트랜스글루타미나제의 제조방법 | |
| Date et al. | High level expression of Streptomyces mobaraensis transglutaminase in Corynebacterium glutamicum using a chimeric pro-region from Streptomyces cinnamoneus transglutaminase | |
| Kano et al. | Cold adaptation of a mesophilic serine protease, subtilisin, by in vitro random mutagenesis | |
| Lin et al. | Cloning of the gene coding for transglutaminase from Streptomyces platensis and its expression in Streptomyces lividans | |
| ES2231089T5 (es) | Secuencias de nucleotidos que codifican el gen dapf. | |
| CN100523197C (zh) | 反馈抗性乙酰羟酸合成酶突变体 | |
| Hatanaka et al. | pTONA5: a hyperexpression vector in Streptomycetes | |
| Verseck et al. | Screening, overexpression and characterization of an N-acylamino acid racemase from Amycolatopsis orientalis subsp. lurida | |
| Arima et al. | Gene cloning and overproduction of an aminopeptidase from Streptomyces septatus TH-2, and comparison with a calcium-activated enzyme from Streptomyces griseus | |
| Lee et al. | Heterologous expression and enzymatic characterization of γ-glutamyltranspeptidase from Bacillus amyloliquefaciens | |
| Komeda et al. | L-Stereoselective amino acid amidase with broad substrate specificity from Brevundimonas diminuta: characterization of a new member of the leucine aminopeptidase family | |
| KR100806991B1 (ko) | 신규 니트릴 히드라타아제 | |
| JPWO2006062189A1 (ja) | ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体 | |
| Taguchi et al. | Overexpression and purification of microbial pro-transglutaminase from Streptomyces cinnamoneum and in vitro processing by Streptomyces albogriseolus proteases | |
| Hyun et al. | Alteration of substrate specificity of valine dehydrogenase from Streptomyces albus | |
| US20070172933A1 (en) | Thermally stable amidases | |
| JP4406298B2 (ja) | アミノペプチダーゼ | |
| KR20010043649A (ko) | 신규한 글루타미나제, 이의 유전자 및 이의 제조 방법 |