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ES2354607T3 - Procedimiento y aparato para producir liposomas. - Google Patents

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ES2354607T3
ES2354607T3 ES03737789T ES03737789T ES2354607T3 ES 2354607 T3 ES2354607 T3 ES 2354607T3 ES 03737789 T ES03737789 T ES 03737789T ES 03737789 T ES03737789 T ES 03737789T ES 2354607 T3 ES2354607 T3 ES 2354607T3
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ES
Spain
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solution
lipid
organic
liposome
aqueous solution
Prior art date
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ES03737789T
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English (en)
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Ian Maclachlan
Lloyd Jeffs
Cory Giesbrecht
Lorne R. Palmer
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Protiva Biotherapeutics Inc
Original Assignee
Protiva Biotherapeutics Inc
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Publication date
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Abstract

Un procedimiento para producir una vesícula lipídica que encapsula un producto terapéutico, comprendiendo dicho procedimiento: proporcionar una solución acuosa en un primer depósito; proporcionar una solución lipídica orgánica en un segundo depósito, en el que una de la solución acuosa y la solución lipídica orgánica incluye un producto terapéutico; mezclar dicha solución acuosa con dicha solución lipídica orgánica, mezclándose dicha solución lipídica orgánica con dicha solución acuosa de modo que se produzca de forma sustancialmente instantánea una vesícula lipídica que encapsula el producto terapéutico; caracterizado porque la mezcla incluye introducir la solución acuosa y la solución lipídica orgánica en un ambiente de mezcla a caudales sustancialmente iguales y el ambiente de mezcla incluye un conector T, introduciéndose la solución acuosa y la solución lipídica orgánica en el conector T como flujos opuestos a sustancialmente 180º entre sí.

Description

Procedimiento y aparato para producir liposomas.
Antecedentes de la invención
Se conocen ya muchos sistemas para administrar sustancias activas, tales como liposomas, nanopartículas, partículas poliméricas, inmunocomplejos y complejos de ligando y ciclodextrinas (véase, Drug Transport in antimicrobial and anticancer chemotherapy. G. Papadakou Ed., CRC Press, 1995). Los liposomas se preparan típicamente en el laboratorio mediante sonicación, diálisis con detergente, inyección de etanol o dilución, extrusión con prensa francesa, infusión de éter y evaporación de fase inversa. Los liposomas con múltiples bicapas se conocen como vesículas lipídicas multilamelares (MLV). Las MLV son candidatos para fármacos de liberación temporal debido a que los fluidos atrapados entre las capas solo se liberan a medida que se degrada cada membrana. Los liposomas con una bicapa única se conocen como vesículas lipídicas unilamelares (UV). Las UV pueden preparase pequeñas (SUV) o grandes
(LUV).
Algunos de los procedimientos anteriores para la producción de liposomas imponen condiciones severas o extremas que pueden dar como resultado la desnaturalización del material fosfolipídico sin tratar y fármacos encapsulados. Además, estos procedimientos no pueden escalarse fácilmente para una producción en masa de grandes volúmenes de liposomas. Además, la formación de vesículas lipídicas por dilución convencional con etanol, implica la inyección o adición en gotas de un lípido en un tampón acuoso. Las vesículas resultantes son típicamente heterogéneas en tamaño y contienen una mezcla de vesículas unilamelares y multilamelares.
Los liposomas convencionales se formulan para portar agentes terapéuticos contenidos dentro del espacio interior acuoso (fármacos solubles en agua) o repartidos en la capa o capas lipídicas (fármacos insolubles en agua). Los agentes activos que tienen semividas cortas en el torrente sanguíneo son particularmente adecuados para su suministro mediante liposomas. Se sabe que muchos agentes antineoplásicos, por ejemplo, tienen una semivida corta en el torrente sanguíneo de modo que su uso parenteral no es viable. Sin embargo, el uso de liposomas para suministro específico de sitio de agentes activos mediante el torrente sanguíneo está limitado gravemente por el rápido aclaramiento de liposomas de la sangre por células del sistema reticuloendotelial (SRE).
El documento EP-A-1 203 614 desvela técnicas para la preparación de vesículas lipídicas usando un aparato que tiene un primer conducto (fase lipídica) conectado a un segundo conducto (fase polar) de modo que las porciones exteriores de los conductos forman una superficie de contacto común (orificio). El orificio se dispone de modo que la fase lipídica pueda pasar de forma sustancialmente perpendicular a la dirección del flujo de la fase polar.
El documento WO 02/43699 desvela un procedimiento para preparar liposomas grandes (es decir, de 1 a 8 micrómetros de tamaño) que contienen una sustancia farmacéutica atrapada por infusión de una solución de alcohol que contiene lípidos directamente en una solución de polímero acuoso, tal como una solución de polietilenglicol (PEG).
El documento EP-A-1 013 268 desvela un procedimiento para producir liposomas o emulsiones mediante pulverización de una solución oleosa y una solución acuosa en una boquilla de mezcla, en la que los liposomas o emulsiones se forman en la bruma cuando las soluciones nebulizadas colisionan entre sí.
El documento WO 00/29103 desvela un procedimiento para preparar liposomas en el que las fases lipídica y acuosa se introducen en una cámara de premezcla con una alta velocidad a 90º entre sí, creando de este modo un flujo turbulento. De hecho, el premezclador se diseña para crear un vórtice turbulento mediante el cual una corriente de componente se inyecta por medio de alta presión en una segunda corriente de componente a 90º entre sí o ambas corrientes se inyectan por medio de alta presión a 90º entre sí. Véanse, por ejemplo, las Figuras 3 y 10 del documento WO 00/29103.
El documento WO 91/16039 desvela un procedimiento para producir liposomas mediante la adición de una solución acuosa directamente en una solución lipídica orgánica presente en un recipiente de reacción, seguido de la mezcla de los componentes con agitación fuerte. Véase, por ejemplo, página 6, líneas 1-7 y Ejemplo 1 del documento WO 91/16039.
El documento US-A-5 653 996 desvela un procedimiento para producir liposomas mediante la pulverización de una solución lipídica orgánica en o bajo la superficie de una solución de tampón acuosa. Véase, por ejemplo, col. 4, líneas 7-14, Figura 1 y la reivindicación 1 del documento US-A-5 653 996.
Isele U y col. en Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 83, nº. 11, Noviembre 1994, págs. 1608-1616 desvela un dispositivo de mezcla en el que las soluciones acuosa y orgánica se bombean en la cámara de mezcla desde el mismo lado. Véase, por ejemplo, la Figura 1 en la página 1069. Por lo tanto, las soluciones acuosa y orgánica no se introducen en el ambiente de mezcla en ningún ángulo particular.
El documento EP-A-0 055 576 desvela un procedimiento para preparar liposomas mediante la dispersión de una solución lipídica que contiene dos disolventes orgánicos diferentes en una solución acuosa. En particular, D9 enseña que el procedimiento preferido para la formación de la dispersión es mediante el pase de la solución lipídica a través de un filtro microporoso (es decir, membrana de policarbonato) antes de que entre en contacto con la solución acuosa presente en el dispersador. Véase, por ejemplo, página 10, líneas 19-26 y Ejemplos 1-IV del documento EP-A-0 055 576.
La patente de Estados Unidos nº 5.478.860, que se expidió a Wheeler y col., el 26 de Diciembre de 1995 y que se incorpora en el presente documento por referencia, desvela composiciones de microemulsión para el suministro de compuestos hidrófobos. Dichas composiciones tienen una diversidad de usos. En una realización, los compuestos hidrófobos son agentes terapéuticos que incluyen fármacos. La patente también desvela procedimientos para suministro in vitro e in vivo de compuestos hidrófobos a células.
La publicación de PCT WO01/05373 de Knopov, y col., que se incorpora por referencia en el presente documento, desvela técnicas para preparar vesículas lipídicas usando un procedimiento de tipo inyección de etanol con un mezclador estático que proporciona un ambiente turbulento (por ejemplo, números de Reynolds > 2000). A continuación pueden cargarse agentes terapéuticos después de la formación de las vesículas.
A pesar de los aparentes avances de la patente de Estados Unidos nº 5.478.860 y el documento WO01/05373, existe una necesidad de procedimientos y aparatos para formular y producir vesículas lipídicas y en particular vesículas lipídicas que encapsulan un agente terapéutico tal como un ácido nucleico. La presente invención satisface esta y otras necesidades.
Breve sumario de la invención
La presente invención proporciona procedimientos y aparato para preparar vesículas lipídicas que contienen opcionalmente un agente terapéutico. El agente terapéutico puede incluir, por ejemplo, una proteína, un ácido nucleico, un ácido nucleico antisentido, un fármaco o similares. La presente invención puede usarse para formar vesículas lipídicas que contienen ADN plasmídico encapsulado o fármacos de moléculas pequeñas. En un aspecto, las vesículas lipídicas se preparan rápidamente a baja presión y el enfoque es completamente escalable. En ciertas realizaciones preferidas, el procedimiento no implica un mezclador estático o equipamiento de extrusión especializado.
Como tal, en una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para producir una vesícula lipídica, preferentemente un liposoma. El procedimiento comprende proporcionar una solución acuosa en un primer depósito; proporcionar una solución lipídica orgánica en un segundo depósito, en el que una de la solución acuosa y la solución lipídica orgánica incluye un producto terapéutico; mezclar dicha solución acuosa con dicha solución lipídica orgánica, mezclándose dicha solución lipídica orgánica con dicha solución acuosa de modo que se produzca de forma sustancialmente instantánea un liposoma que encapsula el producto terapéutico. El procedimiento se caracteriza por que la mezcla incluye introducir la solución acuosa y la solución lipídica orgánica en un ambiente de mezcla a caudales sustancialmente iguales y el ambiente de mezcla incluye un conector T, introduciéndose la solución acuosa y la solución lipídica orgánica en el conector T como flujos opuestos a sustancialmente 180º entre sí.
En ciertos aspectos, la solución acuosa tal como un tampón, comprende un producto terapéutico, de modo que el producto terapéutico se encapsule en el liposoma.
Los productos terapéuticos adecuados incluyen, sin limitación, una proteína, un ácido nucleico, un ácido nucleico antisentido, una ribozima, ARNt, ARNnp, ARNip (ARN de interferencia pequeño), ADN precondensado y un antígeno. En ciertos aspectos preferidos, el producto terapéutico es ácido nucleico.
En ciertos aspectos, el producto terapéutico es un ácido nucleico incluido en la solución acuosa. En ciertos aspectos, el producto terapéutico es lipófilo y está incluido en la solución lipídica orgánica. En ciertos aspectos, la eficacia de la encapsulación del producto terapéutico inicial es tan alta como aproximadamente el 90%.
En otra realización más, la presente invención proporciona un aparato para producir una vesícula lipídica, preferentemente un liposoma, que encapsula un producto terapéutico. El aparato comprende un primer depósito para contener una solución acuosa; un segundo depósito para contener una solución lipídica orgánica, en el que una de la solución acuosa y de la solución lipídica orgánica incluye un producto terapéutico. El aparato también comprende un mecanismo de bomba configurado para bombear dichas soluciones acuosa y lipídica orgánica en una región de mezcla a caudales sustancialmente iguales. Durante el funcionamiento, la solución lipídica orgánica se mezcla con dicha solución acuosa en la región de mezcla para formar de forma sustancialmente instantánea un liposoma con producto terapéutico encapsulado. El aparato se caracteriza por que la región de mezcla incluye un conector T, introduciéndose dicha solución acuosa y dicha solución lipídica orgánica en el conector T como flujos opuestos a sustancialmente 180º entre sí.
Estos y otros aspectos resultarán más evidentes cuando se lean con los dibujos adjuntos y las descripciones detalladas siguientes.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 proporciona un diagrama de flujo para un procedimiento de fabricación de acuerdo con una realización de la presente invención.
La Figura 2 proporciona un esquema de un procedimiento para preparar liposomas en una realización de la presente invención.
La Figura 3 proporciona un esquema de un aparato de acuerdo con una realización de la presente invención.
La Figura 4 proporciona un esquema de un aparato que tiene un sistema de ultrafiltración de acuerdo con una realización de la presente invención.
La Figura 5 muestra el efecto de variar la concentración de etanol de la solución lipídica inicial en el diámetro medio de SPLP y encapsulación de ADN. La eficacia de encapsulación de ADN y los tamaños de vesículas se determinaron después de la etapa de dilución.
La Figura 6 muestra el efecto de variar el pH de la solución plasmídica inicial en el diámetro medio de SPLP y encapsulación de ADN. La eficacia de encapsulación de ADN y los tamaños de vesículas se determinaron después de la etapa de dilución.
La Figura 7 muestra el efecto de variar el pH del tampón usado para la etapa de dilución en la eficacia de encapsulación de ADNp.
La Figura 8 muestra el efecto de variar la concentración salina del tampón usado para la etapa de dilución en la eficacia de encapsulación de ADNp.
La Figura 9A-B muestra un procedimiento esquemático de preparación de liposomas de la presente invención.
La Figura 10 muestra la encapsulación de safranina en ciertos liposomas de la presente invención.
La Figura 11 muestra un procedimiento esquemático de preparación de liposomas de la presente invención.
La Figura 12 ilustra una comparación entre una realización de la presente invención y un procedimiento de goteo de etanol para encapsular ADNp.
La Figura 13 muestra un conector T y la dinámica de flujo asociada de acuerdo con una realización.
La Figura 14 muestra diversos parámetros asociados con el flujo del conector T de la Figura 13.
Descripción detallada de la invención y realizaciones preferidas I. Definiciones
La expresión "ácido nucleico" se refiere a un polímero que contiene al menos dos nucleótidos. Los "nucleótidos" contienen un azúcar desoxiribosa (ADN) o ribosa (ARN), una base y un grupo fosfato. Los nucleótidos se enlazan entre sí a través de los grupos fosfato. Las "bases" incluyen purinas y pirimidinas, que incluyen adicionalmente los compuestos naturales adenina, timina, guanina, citosina, uracilo, inosina y análogos naturales y derivados sintéticos de purinas y pirimidinas, que incluyen, sin limitación, modificaciones que sitúan nuevos grupos reactivos tales como, sin limitación, aminas, alcoholes, tioles, carboxilatos y alquilaluros.
El ADN puede estar en forma de antisentido, ADN plasmídico, partes de un ADN plasmídico, ADN precondensado, producto de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), vectores (P1, PAC, BAC, YAC, cromosomas artificiales), cassetes de expresión, secuencias quiméricas, ADN cromosómico o derivados de estos grupos. El ARN puede estar en forma de ARN de oligonucleótido, ARNt (ARN de transferencia), ARNnp (ARN nuclear pequeño), ARNr (ARN ribosomal), ARNm (ARN mensajero), ARN antisentido, ARNip (ARN de interferencia pequeño), ribozimas, secuencias quiméricas o derivados de estos grupos.
"Antisentido" es un polinucleótido que interfiere con la función de ADN y/o ARN. Esto puede dar como resultado la supresión de la expresión. Los ácidos nucleicos naturales tienen una cadena principal de fosfato, los ácidos nucleicos artificiales pueden contener otros tipos de cadenas principales y bases. Estos incluyen APN (ácidos péptido nucleicos), fosfotionatos y otras variantes de la cadena principal de fosfato de ácidos nucleicos nativos. Además, el ADN y el ARN pueden ser monocatenarios, bicatenarios, tricatenarios o tetracatenarios.
El término "gen" se refiere a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que comprende secuencias codificantes necesarias para la producción de un polipéptido o precursor (por ejemplo, virus del herpes simple). El polipéptido puede codificarse por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier parte de la secuencia codificante siempre que la actividad o propiedades funcionales deseadas (por ejemplo, actividad enzimática, unión a ligando, transducción de señales y similares) de la longitud completa o del fragmento se conserven.
Como se usa en el presente documento, la expresión "solución acuosa" se refiere a una composición que se comprende completamente, o en parte, de agua.
Como se usa en el presente documento, la expresión "solución lipídica orgánica" se refiere a una composición que se comprende completamente, o en parte, de un disolvente orgánico que tiene un lípido.
El término "lípido" se refiere a un grupo de compuestos orgánicos que son ésteres de ácidos grasos y se caracterizan por ser insolubles en agua pero solubles en muchos disolventes orgánicos. Habitualmente se dividen al menos en tres clases: (1) "lípidos simples" que incluyen grasas y aceites así como ceras, (2) "lípidos compuestos" que incluyen fosfolípidos y glucolípidos; (3) "lípidos derivados" tales como esteroides.
La expresión "lípido anfipático" se refiere, en parte, a cualquier material adecuado en el que la parte hidrófoba del material lipídico se orienta en una fase hidrófoba, mientras que una parte hidrófila se orienta hacia la fase acuosa. Los lípidos anfipáticos son habitualmente el componente principal de una vesícula lipídica. Las características hidrófilas derivan de la presencia de grupos polares o cargados tales como carbohidratos, grupos fosfato, carboxílico, sulfato, amino, sulfhidrilo, nitro, hidroxi y otros similares. Puede conferirse hidrofobicidad mediante la inclusión de grupos apolares que incluyen, sin limitación, grupos de hidrocarburos alifáticos de cadena larga saturados e insaturados y dichos grupos sustituidos por uno más grupos cicloalifáticos o heterocíclicos aromáticos. Los ejemplos de compuestos anfipáticos incluyen, sin limitación, fosfolípidos, aminolípidos y esfingolípidos. Los ejemplos representativos de fosfolípidos incluyen, sin limitación, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinotisol, ácido fosfatídico, palmitoiloleoil fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidilcolina, diolelilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina o dilinoleoilfosfatidilcolina. Otros compuestos que carecen de fósforo, tales como esfingolípidos, familias de glucoesfingolípidos, diacilgliceroles y \beta-aciloxiácidos, también están dentro del grupo designado como lípidos anfipáticos. Adicionalmente, el lípido anfipático descrito anteriormente puede mezclarse con otros lípidos incluyendo triglicéridos y esteroles.
La expresión "lípido aniónico" se refiere a cualquier lípido que está cargado negativamente a pH fisiológico. Estos lípidos incluyen, sin limitación, fosfatidilglicerol, cardiolipina, diacilfosfatidilserina, ácido diacilfosfatídico, N-dodecanoilfosfatidiletanolaminas, N-succinil fosfatidiletanolaminas, N-glutarilfosfatidiletanolaminas, lisilfosfatidilgliceroles y otros grupos modificadores aniónicos unidos a lípidos neutros.
La expresión "lípido catiónico" se refiere a cualquiera de una variedad de especies lipídicas que portan una carga positiva neta a un pH selectivo, tal como pH fisiológico. Dichos lípidos incluyen, sin limitación, cloruro de N,N-dioelil-N,N-dimetilamonio ("DODAC"); cloruro de N-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio ("DOTMA"); bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio ("DDAB"); cloruro de N-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio ("DOTAP"); 3-(N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil)colesterol ("DC-Col") y bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio ("DMRIE"). Adicionalmente, están disponibles varias preparaciones comerciales de lípidos catiónicos que pueden usarse en la presente invención. Estas incluyen, por ejemplo, LIPOFECTIN® (liposomas catiónicos disponibles en el mercado que comprenden DOTMA y 1,2-dioleoil-sn-3-fosfoetanolamina ("DOPE") de GIBCOBRL, Grand Island, Nueva York, Estados Unidos); LIPOFECTAMINE® (liposomas catiónicos disponibles en el mercado que comprenden N-(1-(2,3-dioleiloxi)propil)-N-(2-(espermincarboxamido)etil)-N,N-dimetilamonio trifluoroacetato ("DOSPA") y ("DOPE"), de GIBCO/BRL); y TRANSFECTAM® (lípidos catiónicos disponibles en el mercado que comprenden dioctadecilamidoglicil carboxiespermina ("DOGS") en etanol de Promega Corp., Madison, Wisconsin, Estados Unidos). Los siguientes lípidos son catiónicos y tienen una carga positiva a pH por debajo del fisiológico: DODAP, DODMA, DMDMA y similares.
"Vesícula lipídica" se refiere a cualquier composición lipídica que pueda usarse para suministrar un compuesto incluyendo, sin limitación, liposomas, en la que se encapsula un volumen acuoso mediante una bicapa lipídica anfipática; o en la que los lípidos revisten un interior que comprende un componente molecular grande, tal como un plásmido, con un interior acuoso reducido; o agregados lipídicos o micelas, en las que el componente encapsulado está contenido dentro de una mezcla lipídica relativamente desordenada.
Como se usa en el presente documento, "encapsulado lipídico" puede referirse a una formulación lipídica que proporciona un compuesto con encapsulación completa, encapsulación parcial o ambas.
Como se usa en el presente documento, el término "SPLP" se refiere a una partícula lipídica plasmídica estable. Una SPLP representa una vesícula de lípidos que revisten un interior que comprende un ácido nucleico tal como un plásmido con un interior acuoso reducido.
II. General
La presente invención proporciona procedimientos y aparato para preparar vesículas lipídicas. Los procedimientos pueden usarse para preparar vesículas lipídicas que poseen una amplia serie de componentes lipídicos que incluyen, sin limitación, lípidos catiónicos, lípidos aniónicos, lípidos neutros, lípidos de polietilenglicol (PEG), lípidos poliméricos hidrófilos, lípidos fusogénicos y esteroles. Pueden incorporarse principios activos hidrófobos en el disolvente orgánico (por ejemplo, etanol) con el lípido y pueden añadirse ácidos nucleicos y principios activos hidrófilos a un componente acuoso. En ciertos aspectos, los procedimientos de la presente invención pueden usarse en la preparación de microemulsiones cuando una monocapa lipídica rodea a un núcleo de base oleosa. En ciertos aspectos preferidos, los procedimientos y aparato se usan en la preparación de vesículas lipídicas o liposomas, encapsulándose un agente terapéutico dentro del liposoma coincidiendo con la formación del liposoma.
III. Procedimientos de Preparación
La Figura 1 es un ejemplo de un diagrama de flujo representativo 100 de un procedimiento de la presente invención. Este diagrama de flujo es meramente una ilustración y no debería limitar el alcance de las reivindicaciones del presente documento. Un experto habitual en la materia reconocerá otras variaciones, modificaciones y alternativas.
En un aspecto, el presente procedimiento proporciona una solución lipídica 110 tal como un lípido de uso clínico sintetizado bajo la Buena Práctica de Fabricación (GMP), que se solubiliza posteriormente en una solución orgánica 120 (por ejemplo, etanol). De forma similar, un producto terapéutico, por ejemplo, un agente activo terapéutico tal como ácido nucleico 112 u otro agente, se prepara bajo GMP. A partir de entonces, una solución de agente terapéutico (por ejemplo, ADN plasmídico) 115 que contiene un tampón (por ejemplo, de citrato) se mezcla con una solución lipídica 120 solubilizada en un alcanol inferior para formar una formulación liposomal 130. En aspectos preferidos de la presente invención, el agente terapéutico se "atrapa de forma pasiva" en el liposoma coincidiendo sustancialmente con la formación del liposoma. Sin embargo, los expertos en la materia se darán cuenta de que los procedimientos y el aparato de la presente invención son igualmente aplicables al atrapamiento o carga activos de los liposomas después de la formación de la vesícula.
De acuerdo con los procedimientos y el aparato de la presente invención, la acción de introducir de forma continua soluciones lipídicas y de tampón en un ambiente de mezcla, tal como en una cámara de mezcla, provoca una dilución continua de la solución lipídica con la solución de tampón, produciendo de este modo un liposoma de forma sustancialmente instantánea tras la mezcla. Como se usa en el presente documento, la frase "diluir continuamente una solución lipídica con una solución de tampón" (y variaciones) significa generalmente que la solución lipídica se diluye de forma suficientemente rápida en un proceso de hidratación con suficiente fuerza para efectuar la generación de vesículas. Mediante la mezcla de la solución acuosa con la solución lipídica orgánica, la solución lipídica orgánica experimenta una dilución continua por etapas en presencia de la solución de tampón (acuosa) para producir un liposoma.
En los procedimientos de la presente invención, la solución lipídica orgánica preferentemente incluye un disolvente orgánico, tal como un alcanol inferior. En un aspecto, los liposomas se diluyen después 140 con un tampón (por ejemplo, de citrato) para aumentar el atrapamiento de ácido nucleico (por ejemplo, plasmídico). Antes de la concentración de la muestra 160, se retira el agente terapéutico libre (por ejemplo, ácido nucleico) mediante el uso, por ejemplo, de un cartucho de intercambio aniónico 150. Además, mediante el uso de una etapa de ultrafiltración 170 para retirar el alcanol, la muestra se concentra (por ejemplo, a aproximadamente 0,9 mg/ml de ADN plasmídico), se retira el alcanol y se reemplaza el tampón con un tampón de sustitución (por ejemplo, con un tampón salino) 180. A partir de entonces, la muestra se filtra 190 y se introduce en viales 195. El procedimiento se discutirá ahora en más detalle en el presente documento a continuación usando las etapas como se exponen en la Figura 1.
1. Solubilización de lípidos y disolución del agente terapéutico
En una realización, las vesículas de liposoma de los presentes procedimientos son formulaciones de partícula lipídica plasmídica estable (es decir, SPLP). Los expertos en la materia apreciarán que la siguiente descripción solamente tiene fines ilustrativos. Los procedimientos de la presente invención son aplicables a una amplia serie de tipos y tamaños de vesículas lipídicas. Estas vesículas lipídicas incluyen, sin limitación, vesículas lipídicas bicapa sencillas conocidas como vesículas lipídicas unilamelares que pueden prepararse pequeñas (SUV) o grandes (LUV), así como vesículas lipídicas multilamelares (MLV). Las vesículas adicionales incluyen micelas, partículas lípido-ácido nucleico, virosomas y similares. Los expertos en la materia conocerán otras vesículas lipídicas para las que los procedimientos y el aparato de la presente invención serán adecuados.
El tamaño preferido para los liposomas preparados de acuerdo con los presentes procedimientos y aparato están entre aproximadamente 50 y 550 nm de diámetro. En ciertos aspectos preferidos, la preparación de liposomas tiene una distribución de tamaños en la que el tamaño medio (por ejemplo, el diámetro) es de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 300 nm y más preferentemente el tamaño medio es menor de aproximadamente 200 nm, tal como aproximadamente 150 nm o menos (por ejemplo, aproximadamente 100 nm).
En ciertos aspectos, la formulación de liposomas (por ejemplo, formulación de SPLP) de la presente invención incluye cuatro componentes lipídicos: un fosfolípido; colesterol; un lípido de PEG; y un lípido catiónico. En un aspecto preferido el fosfolípido es DSPC, el lípido de PEG es PEG-DSG y el lípido catiónico es DODMA. En un aspecto preferido, la composición molar es aproximadamente 20:45:10:25 DSPC:Col:PEG-DSG:DODMA. En ciertas realizaciones, la concentración de disolvente orgánico en la que los lípidos se solubilizan es de aproximadamente 45% v/v a aproximadamente 90% v/v. En ciertos aspectos preferidos, el disolvente orgánico es un alcanol inferior. Los alcanoles inferiores adecuados incluyen, sin limitación, metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol, sus isómeros y combinaciones de los mismos. En una realización, el disolvente es preferentemente etanol con un volumen de aproximadamente 50-90% v/v. Preferentemente, los lípidos ocupan un volumen de aproximadamente 1 ml/g a aproximadamente 5 ml/g.
Los lípidos se solubilizan 120 usando, por ejemplo, un agitador superior a una temperatura adecuada. En un aspecto, la concentración de lípidos total de la solución es de aproximadamente 15,1 mg/ml (20 mM). En ciertos aspectos preferidos, el agente terapéutico (por ejemplo, ácido nucleico) se incluye en una solución acuosa (por ejemplo, tampón) y se diluye hasta una concentración final. En un aspecto preferido, por ejemplo, la concentración final es de aproximadamente 0,9 mg/mg en tampón de citrato, con un pH de aproximadamente 4,0. En este caso, el volumen de la solución de plásmido es la misma que la solución de alcanol-lípido. En una realización, la preparación de la solución de agente terapéutico (por ejemplo, ácido nucleico) se realiza en un recipiente de acero inoxidable con envoltura con un mezclador superior. La muestra no necesita calentarse para prepararse, aunque en ciertos casos está a la misma temperatura que la solución lipídica antes de la formación de vesículas lipídicas.
En una realización, el agente terapéutico se incluye en la solución lipídica. En ciertos aspectos preferidos, el agente terapéutico en la solución lipídica es lipófilo. Los agentes lipófilos adecuados incluyen taxol, derivados del taxol, incluyendo, por ejemplo, protax III y paclitaxol, benzoporfirinas lipófilas, verteporfina el profármaco lipídico de foscarnet, 1-O-octadecil-sn-glicerol-3-fosfonoformato (ODG-PFA), dioleoil[3H]yododesoxiuridina ([3H]IDU-O12), péptidos inhibidores de la proteasa de VIH derivatizados con lípidos tales como: iBOC-[L-Phe]-[D-beta-Nal]-Pip-[alfa-(OH)-Leu]-Val (7194) y otros fármacos o profármacos derivatizados con lípidos.
2. Formación de Liposomas
Después de que las soluciones, por ejemplo, solución lipídica 120 y solución de agente terapéutico acuosa (por ejemplo, ácido nucleico) 115, se han preparado, se mezclan entre sí 130 usando, por ejemplo, un mezclador de bomba peristáltica. En un aspecto, las soluciones se bombean a caudales sustancialmente iguales en un ambiente de mezcla. El ambiente de mezcla incluye un conector "T" o cámara de mezcla. En este caso, se prefiere que las líneas de fluido, y por lo tanto los flujos de fluido, se encuentren en una apertura estrecha dentro del conector "T" como flujos opuestos a aproximadamente 180º entre sí.
Tras el encuentro y mezcla de los flujos de solución en el ambiente de mezcla, se forman vesículas lipídicas de forma sustancialmente instantánea. Las vesículas lipídicas se forman cuando una solución orgánica que incluye un lípido disuelto y una solución acuosa (por ejemplo, tampón) se mezclan de forma simultánea y continua. De forma ventajosa, y sorprendentemente, mediante la mezcla de la solución acuosa con la solución lipídica orgánica, la solución lipídica orgánica experimenta una dilución continua por etapas hasta producir de forma sustancialmente instantánea un liposoma. El mecanismo de bomba puede configurarse para proporcionar caudales equivalentes o diferentes de las soluciones lipídica y acuosa en el ambiente de mezcla que crea vesículas lipídicas en un ambiente de alto alcanol.
De forma ventajosa, y sorprendentemente, los procedimientos y aparato para mezclar la solución lipídica y la solución acuosa como se enseña en el presente documento posibilitan la encapsulación del agente terapéutico en el liposoma formado de forma sustancialmente coincidente con la formación del liposoma con una eficacia de encapsulación de hasta aproximadamente el 90%. Pueden usarse etapas de procesamiento adicionales como se analiza en el presente documento para refinar adicionalmente la eficacia de encapsulación y la concentración si se desea.
En un aspecto preferido, usando los procedimientos y aparato de la presente invención, es posible formar vesículas lipídicas de forma instantánea en un procedimiento continuo de dos etapas que es completamente escalable. En un aspecto, las vesículas lipídicas se forman con un diámetro medio de menos de aproximadamente 200 nm, lo que no requiere una reducción de tamaño adicional mediante procedimientos de alta energía tales como extrusión de membrana, sonicación o microfluidización.
En una realización, las vesículas lipídicas se forman cuando los lípidos disueltos en un disolvente orgánico (por ejemplo, etanol) se diluyen de una manera por etapas mediante su mezcla con una solución acuosa (por ejemplo, tampón). Esta dilución controlada por etapas se consigue mezclando las corrientes acuosa y lipídica entre sí en una apertura, tal como un conector T. Las concentraciones de lípidos, disolventes y soluto resultantes pueden mantenerse constantes a lo largo del procedimiento de formación de vesículas.
Una realización del proceso de la invención se muestra en la Figura 2. En un aspecto, usando los procedimientos de la presente invención, se prepara una vesícula mediante una dilución por etapas de dos fases sin gradientes. Por ejemplo, en la primera dilución por etapas, las vesículas se forman en un ambiente de alto alcanol (por ejemplo, etanol) (por ejemplo, de aproximadamente 30% a aproximadamente 50% v/v de etanol). Estas vesículas pueden estabilizarse después mediante la disminución de la concentración de alcanol (por ejemplo, etanol) hasta menos o igual a aproximadamente el 25% v/v, tal como de aproximadamente el 17% v/v a aproximadamente el 25% v/v, de una manera por etapas. En aspectos preferidos, con el agente terapéutico presente en la solución acuosa, o en a solución lipídica, el agente terapéutico se encapsula de forma coincidente con la formación del liposoma.
Como se muestra en la Figura 2, en una realización, los lípidos se disuelven inicialmente en un ambiente de alcanol de aproximadamente el 40% v/v a aproximadamente el 90% v/v, más preferentemente de aproximadamente el 65% v/v a aproximadamente el 90% v/v y más preferentemente de aproximadamente el 80% v/v a aproximadamente el 90% v/v (A). A continuación, la solución lipídica se diluye por etapas mediante su mezcla con una solución acuosa dando como resultado la formación de vesículas a una concentración de alcanol (por ejemplo, etanol) de entre aproximadamente 37,5 y 50% (B). Mediante la mezcla de la solución acuosa con solución lipídica orgánica la solución lipídica orgánica experimenta una dilución continua por etapas para producir un liposoma. Además, las vesículas lipídicas tales como SPLP (una partícula lipídica) pueden estabilizarse más mediante una dilución adicional por etapas de las vesículas a una concentración de alcanol de menos o igual a aproximadamente el 25%, preferentemente entre aproximadamente el 19 y el 25% (C).
En ciertos aspectos, para ambas diluciones por etapas (A\rightarrowB y B\rightarrowC), las concentraciones de etanol, lípido y soluto resultantes se mantienen a niveles constantes en el recipiente receptor. A estas concentraciones de etanol mayores después de la etapa de mezcla inicial, el reordenamiento de los monómeros lipídicos en bicapas transcurre de una manera más ordenada en comparación con vesículas que se forman por dilución a concentraciones de etanol menores. Sin quedar ligado a ninguna teoría particular, se cree que estas concentraciones de etanol mayores promueven la asociación de ácidos nucleicos con lípidos catiónicos en las bicapas. En un aspecto preferido, la encapsulación de ácido
nucleico se produce dentro de un intervalo de concentraciones de alcanol (por ejemplo etanol) por encima del 22%.
En ciertos aspectos, después de que se formen las vesículas lipídicas, estas se recogen en otro recipiente, por ejemplo, un recipiente de acero inoxidable. En un aspecto, las vesículas lipídicas se forman a una velocidad de aproximadamente 60 a aproximadamente 80 ml/min. En un aspecto, después de la etapa de mezcla 130, la concentración de lípidos es de aproximadamente 1-10 mg/ml y la concentración de agente terapéutico (por ejemplo, ADN plasmídico) es de aproximadamente 0,1-3 mg/ml. En ciertos aspectos preferidos, la concentración de lípidos es de aproximadamente 7,0 mg/ml y la concentración de agente terapéutico (por ejemplo, ADN plasmídico) es de aproximadamente 0,4 mg/ml para proporcionar una relación ADN:lípido de aproximadamente 0,06 mg/mg. La concentración del tampón es de aproximadamente 1-3 mM y la concentración del alcanol es de aproximadamente el 45% v/v a aproximadamente el 90% v/v. En aspectos preferidos, la concentración de tampón es de aproximadamente 3 mM y la concentración de alcanol es de aproximadamente el 45% v/v a aproximadamente el 60% v/v.
3. Dilución de liposomas
Volviendo a la Figura 1, después de la etapa de mezclado 130, el grado de encapsulación de agente terapéutico (por ejemplo, ácido nucleico) puede potenciarse si la suspensión de vesículas lipídicas se diluye opcionalmente 140 antes de la retirada del plásmido libre. Por ejemplo, antes de la etapa de dilución 140, si el atrapamiento del agente terapéutico es de aproximadamente 30-40%, puede aumentarse hasta aproximadamente 70-80% después de la incubación tras la etapa de dilución 140. En la etapa 140, la formulación de liposoma se diluye hasta de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 40%, preferentemente aproximadamente el 20% de alcanol, mediante la mezcla con una solución acuosa tal como un tampón (por ejemplo, 1:1 con tampón de citrato, NaCl 100 mM, pH 4,0). Dicha dilución adicional se consigue preferentemente con un tampón. En ciertos aspectos dicha dilución adicional de la solución de liposoma es una dilución continua por etapas. Después opcionalmente se permite que la muestra diluida se incube a temperatura ambiente.
4. Retirada del agente terapéutico libre
Después de la etapa opcional de dilución 140, aproximadamente el 70-80% o más del agente terapéutico (por ejemplo, ácido nucleico) está atrapado dentro de la vesícula lipídica (por ejemplo, SPLP) y el agente terapéutico libre puede retirarse de la formulación 150. En ciertos aspectos, se usa cromatografía de intercambio aniónico. Ventajosamente, el uso de una resina de intercambio aniónico da como resultado una capacidad de retirada de ácido nucleico dinámica alta, es capaz de un uso único, puede preesterilizarse y validarse y es completamente escalable. Además, el procedimiento preferentemente da como resultado la retirada de agente terapéutico libre (por ejemplo, ácido nucleico tal como aproximadamente el 25% del plásmido total). El volumen de muestra después de la cromatografía no cambia y las concentraciones de agente terapéutico (por ejemplo ácido nucleico) y de lípido son de aproximadamente 0,64 y 14,4 mg/ml, respectivamente. En este punto, la muestra puede ensayarse con respecto a agente terapéutico encapsulado y ajustarse a aproximadamente 0,55 mg/ml.
5. Concentración de la muestra
En ciertos casos, la solución de liposoma se concentra opcionalmente aproximadamente 2-6 veces, preferentemente aproximadamente 4 veces, usando por ejemplo, ultrafiltración 160 (por ejemplo, diálisis de flujo tangencial). En una realización, la muestra se transfiere a un depósito de suministro de un sistema de ultrafiltración y se retira el tampón. El tampón puede retirarse usando diversos procedimientos, tales como mediante ultrafiltración. En un aspecto, el tampón se retira usando cartuchos rellenos con fibras huecas de polisulfona, por ejemplo, que tienen diámetros internos de aproximadamente 0,5 mm y un punto de corte de peso molecular nominal (NMWC) de 30.000. Los liposomas se conservan dentro de las fibras huecas y se recirculan mientras que el disolvente y las moléculas pequeñas se retiran de la formulación mediante su paso a través de los poros de las fibras huecas. En este procedimiento, el filtrado se conoce como la solución de permeado. Tras la compleción de la etapa de concentración, las concentraciones de agente terapéutico (por ejemplo, ácido nucleico) y lípido aumentan hasta aproximadamente 0,90 y 15,14 mg/ml respectivamente. En una realización, la concentración de alcanol permanece sin cambios, pero la relación alcanol:lípido disminuye aproximadamente cuatro veces.
6. Retirada del alcanol
En una realización, la formulación concentrada se diafiltra después frente a aproximadamente 5-15 volúmenes, preferentemente aproximadamente 10 volúmenes, de solución acuosa (por ejemplo, tampón) (por ejemplo, tampón de citrato pH 4,0 (citrato 25 mM, NaCl 100 mM) para retirar el alcanol 170. La concentración de alcanol al final de la etapa 170 es menor de aproximadamente el 1%. Preferentemente, las concentraciones de lípido y agente terapéutico (por ejemplo, ácido nucleico) permanecen sin cambios y el nivel de atrapamiento de agente terapéutico también permanece constante.
7. Reemplazamiento del tampón
Después de que se haya retirado el alcanol, la solución acuosa (por ejemplo, tampón) se reemplaza después por diafiltración frente a otro tampón 180 (por ejemplo, frente a 10 volúmenes de solución salina de NaCl 150 mM con Hepes 10 mM pH 7,4). Preferentemente, la relación de concentraciones de lípido y agente terapéutico (por ejemplo, ácido nucleico) permanecen sin cambios y el nivel de atrapamiento de ácido nucleico es aproximadamente constante. En ciertos casos, el rendimiento de la muestra puede mejorarse mediante el aclarado del cartucho con tampón a aproximadamente 10% del volumen de la muestra concentrada. En ciertos aspectos, este aclarado se añade después a la muestra concentrada.
8. Filtración estéril
En ciertas realizaciones preferidas, puede realizarse opcionalmente una filtración estéril 190 de la muestra a concentraciones de lípido de aproximadamente 12-14 mg/ml. En ciertos aspectos, la filtración se realiza a presiones por debajo de aproximadamente 275,79 kPa, usando un filtro de cápsula y un recipiente dispensador presurizado con una camisa de calefacción. Calentar la muestra ligeramente puede mejorar la facilidad de filtración.
9. Llenado estéril
La etapa de llenado estéril 195 se realiza usando procedimientos similares a los de las formulaciones liposomales convencionales. Los procedimientos de la presente invención dan como resultado aproximadamente 50-60% del agente terapéutico de entrada (por ejemplo, ácido nucleico) en el producto final. En ciertos aspectos preferidos, la relación de agente terapéutico y lípido del producto final es de aproximadamente 0,04 a 0,07.
IV. Agentes terapéuticos
Las formulaciones de fármaco basadas en lípidos y composiciones de la presente invención son útiles para el suministro sistémico o local de agentes terapéuticos o agentes bioactivos y también son útiles en los ensayos de diagnóstico. El siguiente análisis de refiere generalmente a liposomas; sin embargo, resultará inmediatamente evidente para los expertos en la materia que este mismo análisis es completamente aplicable a los otros sistemas de suministro de fármaco de la presente invención.
Como se describe anteriormente, el agente terapéutico se incorpora preferentemente a la vesícula lipídica durante la formación de la vesícula. En una realización, los principios activos hidrófobos pueden incorporarse al disolvente orgánico con el lípido, mientras que los principios activos de ácido nucleico e hidrófilos pueden añadirse al componente acuoso. En ciertos casos, el agente terapéutico incluye uno de una proteína, un ácido nucleico, un ácido nucleico antisentido, ribozimas, ARNt, ARNnp, ARNip, ADN precondensado, un antígeno y combinaciones de los mismos. En aspectos preferidos, el agente terapéutico es ácido nucleico. El ácido nucleico puede codificar una proteína tal como, por ejemplo, un virus de herpes simple, timidina quinasa (HSV-TK), una citosina desaminasa, una xantina-guaninfosforribosiltransferasa, una p53, una purina nucleósido fosforilasa, una carboxilesterasa, una desoxicitidina quinasa, una nitrorreductasa, una timidina fosforilasa o citocromo P450 2B1.
En ciertos aspectos, se incorpora un agente terapéutico al componente lipídico orgánico. En ciertos casos el agente terapéutico es lipófilo. Los agentes lipófilos adecuados incluyen taxol, derivados del taxol, incluyendo, por ejemplo, protax III y Paclitaxol, benzoporfirinas lipófilas, verteporfina el profármaco lipídico de foscarnet, 1-O-octadecil-sn-glicerol-3-fosfonoformato (ODG-PFA), dioleoil[3H]yododesoxiuridina ([3H]IDU-O12), péptidos inhibidores de la proteasa de VIH derivatizados con lípidos tales como iBOC-[L-Phe]-[D-beta-Nal]-Pip-[alpha-(OH)-Leu]-Val (7194) y otros fármacos o profármacos derivatizados con lípidos.
En otra realización, las vesículas lipídicas de la presente invención pueden cargarse con uno o más agentes terapéuticos después de la formación de la vesícula. En ciertos aspectos, los agentes terapéuticos que se administran usando la presente invención puede ser cualquiera de una diversidad de fármacos que se seleccionan para ser un tratamiento apropiado para la enfermedad a tratar. Con frecuencia el fármaco es un agente antineoplásico tal como vincristina, doxorrubicina, mitoxantrona, camptotecina, cisplatino, bleomicina, ciclofosfamida, metotrexato, estreptozocina y similares. Los agentes antitumorales especialmente preferidos incluyen, por ejemplo, actinomicina D, vincristina, vinblastina, cistina arabinósido, antraciclinas, agentes alquilantes, compuestos de platino, antimetabolitos y análogos de nucleósidos, tales como metotrexato análogos de purina y pirimidina. También puede ser deseable suministrar agentes antiinfecciosos a tejidos específicos mediante los presentes procedimientos. Las composiciones de la presente invención también pueden usarse para el suministro selectivo de otros fármacos incluyendo, sin limitación, anestesia local, por ejemplo, dibucaína y clorpromacina; bloqueadores beta-adrenérgicos, por ejemplo, propanolol, timolol y labetolol; agentes antihipertensores, por ejemplo, clonidina e hidralacina; antidepresivos, por ejemplo, imipramina, amitriptilina, y doxepim: anticonvulsivos, por ejemplo, fenitoína; antihistamínicos, por ejemplo, difenhidramina, clorfenirimina y prometacina; agentes antibióticos/antibacterianos, por ejemplo, gentamicina, criprofloxacina y cefoxitina; agentes antifúngicos, por ejemplo, miconazol, treconazol, econazol, isoconazol, butaconazol, clotrimazol, itraconazol, nistatina, naftifina y anfotericina B, agentes antiparasitarios, hormonas, antagonistas de hormonas, inmunomoduladores, antagonistas de neurotransmisores, agentes antiglaucoma, vitaminas, narcóticos y agentes de formación de imágenes.
V. Aparato
En otra realización, la presente invención proporciona un aparato para llevar a cabo los procedimientos de la presente invención. La Figura 3 es un ejemplo de un esquema representativo de un aparato 300 de acuerdo con una realización de la presente invención. Este esquema es meramente una ilustración y no debería limitar el alcance de las reivindicaciones del presente documento. Un experto habitual en la materia reconocerá otras variaciones, modificaciones y alternativas.
En una realización, el aparato de la presente invención incluye dos depósitos, un depósito de solución acuosa 310 y un depósito de solución orgánica 320, para contener solución acuosa y solución orgánica, respectivamente. En ciertos aspectos, las formulaciones de vesícula lipídica se preparan rápidamente, a baja presión (por ejemplo, < 68,95 kilopascales) y el aparato y los procedimientos de la presente invención son completamente escalables (por ejemplo 0,5 ml-5000 l). A una escala de 1 l, las vesículas lipídicas se forman a aproximadamente 0,4-0,8 l/min. En ciertos aspectos preferidos, el aparato no usa mezcladores estáticos ni equipamiento de extrusión especializado.
La cámara de mezcla 340 es, en una realización, un conector T, que tiene espigas de manguera opcionales, en las que las líneas de fluido 334 y 336 impactan entre sí a aproximadamente 180. En aspectos preferidos, se preparan vesículas lipídicas de diámetros medios bien definidos y reproducibles usando caudales sustancialmente iguales de las líneas de flujo. En otros aspectos, las vesículas lipídicas de diámetros medios bien definidos y reproducibles se preparan cambiando el caudal de las líneas de fluido, por ejemplo, para asegurar una mezcla suficiente en algunos casos. En aspectos preferidos, la varianza entre los caudales es menor del 50%, más preferentemente menor del aproximadamente 25% e incluso más preferentemente menor de aproximadamente el 5%.
La Figura 13 muestra un conector T y la dinámica de flujo asociada de acuerdo con una realización. Los ejemplos de caudales y tasas de cizallamiento y números de Reynolds (medida de la turbulencia) resultantes se muestran en la Figura 14 y se analizan en más detalle a continuación en el Ejemplo 8. Al comparar con sistemas anteriores, la presente invención proporciona un flujo no turbulento y tasas de cizallamiento aumentadas a caudales mucho menores (y sustancialmente equivalentes). Por ejemplo, la presente invención proporciona ventajosamente un flujo no turbulento (N_{re} < 2000) en el ambiente de mezcla con una tasa de cizallamiento entre aproximadamente 500/s y aproximadamente 3300/s a un caudal (ambas líneas de flujo) de entre aproximadamente 0,075 y aproximadamente 0,3 l/min.
La mezcla de los dos componentes fluidos puede accionarse usando, por ejemplo, una bomba peristáltica 330, una bomba de desplazamiento positivo o mediante la presurización de los recipientes de lípido-etanol y tampón 320, 310. En un aspecto, se usa una bomba Watson-Marlow 505Di/L equipada con un cabezal de bomba 505L; pueden usarse tubos de silicona (por ejemplo, endurecidos con platino con DI de 3,2 mm, grosor de pared de 2,4 mm; disponible de Watson Marlon como el nº de catálogo 913A032024) para líneas de flujo en un conector T de polipropileno o de acero inoxidable (por ejemplo, con un DI de 3,18 mm). Las vesículas lipídicas se forman típicamente a temperatura ambiente, pero las vesículas lipídicas pueden formarse a temperaturas elevadas de acuerdo con la presente invención. A diferencia de otros enfoques existentes, no existen requisitos generales para la composición de tampón. De hecho, los procedimientos y aparato de la presente invención pueden formular una vesícula lipídica mediante la mezcla de lípido en un alcanol con agua. En ciertos aspectos, los procedimientos y aparato de la presente invención forman vesículas lipídicas que tienen menos de 200 nm de diámetro.
Cuando se preparan vesículas lipídicas que contienen ADN plasmídico (tales como SPLP), la relación de plásmido y lípido catiónico y contraiones puede optimizarse. Para formulaciones purificadas, se prefiere una encapsulación de ADN plasmídico ("ADNp") del 70-95% después de la mezcla y etapas de retirada de etanol. El nivel de encapsulación de ADNp puede aumentarse mediante la dilución de esta formulación de SPLP inicial. De forma sorprendente, los procedimientos y aparato de la presente invención proporcionan una eficacia de encapsulación tras la mezcla de las soluciones (con agente terapéutico en uno de los componentes de la solución) en el ambiente de mezcla de hasta aproximadamente el 90%. Puede realizarse una purificación adicional, por ejemplo, dilución, como se analiza en el presente documento.
En ciertos aspectos, el aparato de producción de liposomas 300 de la presente invención incluye adicionalmente un mecanismo de control de la temperatura (no mostrado) para controlar la temperatura de los depósitos 310 y 320. Preferentemente, el fluido del primer depósito 310 y el segundo depósito 320 fluye a la cámara de mezcla 340 simultáneamente en aperturas separadas. El aparato 300 incluye adicionalmente un depósito de recogida 350 corriente abajo de la cámara de mezcla para la recogida de liposoma. Además, en ciertos aspectos, el aparato 300 incluye adicionalmente recipientes de almacenamiento corriente arriba de uno o ambos de los depósitos 310 y 320. Además, uno o ambos de los depósitos 310 y 320 son preferentemente recipientes de acero inoxidable con envoltura equipados con un mezclador superior.
En otra realización, la presente invención proporciona un aparato que tiene un sistema de ultrafiltración para llevar a cabo los procedimientos de la presente invención. La Figura 4 es un ejemplo de un esquema representativo de un aparato 400 de acuerdo con una realización de la presente invención. Este esquema es meramente una ilustración y no debería limitar el alcance de las reivindicaciones del presente documento. Un experto en la materia reconocerá otras variaciones, modificaciones y alternativas.
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En ciertos aspectos el aparato 400 incluye una pluralidad de depósitos y está equipado con un sistema de ultrafiltración. Un depósito de solución acuosa 440 y un depósito de solución orgánica 430 tienen cada uno vesículas de preparación corriente arriba 433 y 425 respectivamente. En un aspecto, el recipiente de preparación de lípido 425 está equipado opcionalmente con un recipiente de almacenamiento de alcanol 421 en comunicación fluida con el
mismo.
Como se muestra en la Figura 4, el sistema de ultrafiltración incluye un recipiente de incubación 450 en comunicación fluida con un recipiente de recogida 455, una columna de intercambio 460 y un cartucho de ultrafiltración de flujo tangencial 465. El sistema de ultrafiltración opcionalmente incluye un recipiente de permeado 470. En ciertos aspectos, la ultrafiltración se usa para concentrar muestras de SPLP y retirar después el etanol de la formulación mediante reemplazo de tampón.
En una realización de funcionamiento, las SPLP diluidas se transfieren al depósito de suministro del sistema de ultrafiltración. La concentración se realiza mediante la retirada de tampón y etanol usando, por ejemplo, cartuchos de flujo cruzado 465 rellenados con fibras huecas de polisulfona que poseen diámetros internos de aproximadamente 0,5 mm y un punto de corte de peso molecular (MWCO) de 100.000. Las SPLP se conservan dentro de las fibras huecas y se recirculan, mientras que el etanol y los componentes de tampón se retiran de la formulación mediante su paso a través de los poros de estas fibras huecas. Este filtrado se conoce como la solución de permeado y se descarta mediante el recipiente 470. Después de que se concentren las SPLP a la concentración de plásmido deseada, el tampón en el que se suspenden las SPLP se retira por ultrafiltración y se reemplaza con un volumen igual del tampón final. La ultrafiltración puede reemplazarse con otros procedimientos tales como diálisis convencional.
VI. Ejemplos Ejemplo 1
Este ejemplo ilustra diversas propiedades físicas y químicas de las SPLP preparadas de acuerdo con una realización de la presente invención.
Tabla I: la cantidad de etanol, ADNp y contenido de lípidos en las etapas del procedimiento de acuerdo con la presente invención.
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TABLA I
1 
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La Tabla II expone la especificación plasmídica preparada de acuerdo con un aspecto de la presente invención.
TABLA II
3 
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La tabla III expone la especificación de SPLP preparada de acuerdo con un aspecto de la presente invención.
TABLA III
4
Ejemplo 2
Este ejemplo ilustra diversos parámetros de procedimiento en una realización de la presente invención.
En una realización de SPLP, la variación de la concentración inicial de etanol para la disolución de lípidos tuvo escaso impacto en el tamaño del vehículo o la encapsulación del ADN, siempre que la concentración de etanol fue lo suficientemente alta para asegurar que no precipitaban ninguno de los componentes lipídicos individuales (véase, Figura 5). Por debajo del 75% de etanol, los lípidos no eran solubles incluso calentando a 55ºC. Los lípidos que se disolvieron en etanol al 75% a 55ºC formaron SPLP con diámetros medios mayores y menor encapsulación de ADN (véase, Figura 5).
La relación inicial de ADN y lípido ha variado de 0,048 a 0,081 mg de ADN: mg de formulación lipídica y se formaron vesículas de tamaño similar con un 77-90% de encapsulación de ADN.
Se han preparado SPLP con un intervalo de pH de aproximadamente 3,5 a 6 para la etapa de mezcla inicial y todas las formulaciones poseían diámetros de partícula medios de menos de 150 nm y eficacias de encapsulación de ADN de más del 50% (véase, Figura 6). A pH mayor, las vesículas también se preparan con tamaños de vesículas similares, pero con eficacias de encapsulación de ADN menores.
En ciertos aspectos, los diámetros de vesícula medios de vesículas vacías preparadas usando un procedimiento de la presente invención dependen de la concentración salina del tampón de dilución (por ejemplo, vesículas de esfingomielina:colesterol, vesículas de EPC:EPG). La variación de las condiciones iónicas en el tampón influye en la tendencia de un lípido dado a disponerse en bicapas y vesículas.
Durante el desarrollo de una formulación de SPLP, se descubrió que tanto el pH como la concentración salina del tampón de dilución tenían un efecto significativo en la eficacia de encapsulación de ADN. De forma natural, los tampones de dilución con valores de pH menores que la pKa para el componente lipídico catiónico (DODMA) dio valores de encapsulación mayores (Figura 7). De forma interesante, una concentración salina final de 150 mM también era óptima para encapsulación de ADN (Figura 8).
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Ejemplo 3
Este ejemplo ilustra el uso de un procedimiento de la presente invención para realizar vesículas de EPC y POPC.
Las vesículas de POPC son útiles como vesículas "sumidero" para ensayos de fusión de membrana. En particular, pueden usarse en exceso para retirar lípidos de PEG de otros liposomas, desestabilizando de este modo los otros liposomas y permitiéndoles fusionarse con la membrana deseada. Las vesículas de EPC son útiles para retirar colesterol de placas arteriales.
Las vesículas se prepararon con una concentración de etanol inicial del 80% y una concentración de lípidos de 10 mM. Después de mezclar y diluir, la concentración de etanol fue del 20% y la concentración de lípidos fue de 5 mM. La formulación de EPC se mezcló y diluyó con PBS y el POPC se mezcló y diluyó con HBS. Ambas preparaciones se concentraron y se retiró el etanol usando un cartucho de ultrafiltración, es decir, EPC contra PBS, y el POPC contra HBS. Ambas preparaciones se filtraron de forma estéril usando filtros de jeringa de 0,22 \mum.
TABLA IV Datos de vesículas de EPC y POPC
6
Ejemplo 4
Este ejemplo ilustra el uso de un procedimiento de la presente invención para preparar vesículas de EPC/colesterol con un gradiente de pH.
Las vesículas lipídicas unilamelares (LUV) que comprenden EPC y colesterol se han preparado tradicionalmente mediante películas lipídicas hidratantes para formar vesículas lipídicas multilamelares (MLV) que se han sometido a reducción de tamaño de vesícula usando extrusión de alta presión. Se conoce bien que estas vesículas pueden prepararse con interiores acuosos ácidos y un gradiente pH a través de la bicapa lipídica. Se ha demostrado que las moléculas lipófilas débilmente básicas se acumulan en estas vesículas a concentraciones internas altas. Diversos liposomas cargados con fármaco que están actualmente en las últimas etapas de los ensayos clínicos utilizan este enfoque (por ejemplo, Myocet: vesículas cargadas con doxorrubicina).
En un aspecto, se usó safranina para determinar si dicho gradiente de pH estaba presente. La safranina es un colorante lipófilo básico que se ha usado para estudiar gradientes de membrana de pH.
Se prepararon vesículas de EPC/Col usando los presentes procedimientos y aparato a una concentración inicial de etanol del 80% y concentración de lípidos 10 mM (véase Figura 9A-B). Después de la mezcla y dilución, la concentración de etanol fue del 20% y la concentración de lípidos fue de 5 mM. Se prepararon tres formulaciones diferentes:
1. Mezclada y diluida con PBS (control).
2. Mezclada y diluida con citrato 150 mM (la concentración final de citrato es 94 mM).
3. Mezclada y diluida con citrato 300 mM (la concentración final de citrato es 188 mM).
Después de la mezcla y dilución, cada muestra se concentró y se retiró el etanol usando ultrafiltración. Después de la etapa de concentración, cada muestra se diafiltró frente a su tampón de dilución para asegurar que el tampón de citrato ácido presente dentro de las vesículas no se filtrara durante la retirada del etanol. Todas las muestras se formularon finalmente con un tampón externo de solución salina tamponada con fosfato a pH 7,4. Después de la filtración estéril, los diámetros de vesícula medios de estas formulaciones fueron muy similares (90-92 nm) y poseían una desviación típica y valores de Chi cuadrado aceptables (Tabla V).
Después de la diálisis, las vesículas se ensayaron con respecto a concentración de lípidos usando el ensayo de colesterol Infinity. Después se prepararon soluciones que contenían lípido 5 mM y safranina 0,2 mM obtenidos de una solución madre 10 mM filtrada. Las soluciones se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Después se pasó una alícuota de 500 \mul de cada solución incubada por una columna de filtración de gel de Sepharose CL4B de 2 ml. El colorante libre se separó de las vesículas y las fracciones que contenían lípidos se recogieron y analizaron. La concentración de safranina se determinó mediante la medida de la fluorescencia de las muestras a excitación a 516 nm y emisión a 585 nm.
Las vesículas con interiores ácidos acumularon safranina, mostrando las vesículas que contenían citrato 94 nM la mayor encapsulación. Por el contrario, las vesículas control con PBS encapsularon muy poca safranina. Las vesículas con citrato 188 mM también encapsularon algo de safranina, pero no tanta como las vesículas que contenían citrato 94 mM (véase Figura 10).
TABLA V Vesículas de EPC/Col cargadas con Safranina
7 
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Ejemplo 5
Este ejemplo ilustra el uso de un procedimiento de la presente invención para preparar vesículas de esfingomielina/colesterol.
Las vesículas de esfingomielina/colesterol son deseables debido a su durabilidad y fuerza. Estas vesículas también pueden usarse para encapsular fármacos usando un gradiente de pH. Sin embargo, estas LUV han necesitado tradicionalmente formarse a temperaturas mayores de 65ºC y usando extrusión de alta presión. Para formar estas vesículas con el lipomixer, deberían tomarse en cuenta varias variables, tales como concentración de etanol, concentración de lípidos y la concentración salina del tampón de mezcla y dilución.
Las vesículas se formularon en una relación de 55/45 SM/Col (mol:mol), mientras que la concentración inicial de etanol después de mezclar variaba de 50 a 25%. Los tampones de dilución ensayados incluyeron PBS, agua, citrato 10 mM, citrato 150 mM, y citrato 300 mM. Las concentraciones de lípido finales variaron de 0,5 a 2,5 mM. Las vesículas formuladas en presencia de sal (es decir, usando tampones) fueron de 200-500 nm, lo que indicaba una MLV. Se dializaron alícuotas de estas muestras frente a citrato 150 mM y agua en un intento de retirar el etanol y estabilizar las vesículas.
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Ejemplo 6
Este ejemplo ilustra el uso de un procedimiento de la presente invención para preparar vesículas que encapsulan de forma pasiva moléculas pequeñas tales como calceína.
La calceína es un colorante fluorescente que se autoinactiva a concentraciones mayores de 10 mM. Pueden usarse vesículas que encapsulan calceína en ensayos de fusión para determinar si las vesículas se han fusionado entre sí. La fusión disminuye la concentración de calceína interna provocando que emita fluorescencia. Las vesículas se prepararon con DSPC:COL:PEG-DLG:DODMA (20:55:10:15) a una concentración de etanol del 19% y lípido 2 mM después de mezcla y dilución (véase la Figura 11). Los lípidos disueltos en etanol se mezclaron con una solución que contenía citrato 20 mM y calceína 75 mM y después se diluyeron las vesículas resultantes con NaCl 300 mM y calceína 37,5 mM. La calceína se obtuvo a partir de una solución madre 100 mM. La concentración de calceína final en las vesículas fue de 37,5 mM.
Después de mezcla y dilución las vesículas se dializaron durante una noche frente a HBS para retirar el colorante no encapsulado. Esto no tuvo éxito en la retirada de todo el colorante libre, de modo que las vesículas se pasaron a través de una columna de filtración en gel. La fracción de lípido se recogió y se analizó. Se descubrió que la calceína de hecho se inactivaba a la concentración dentro de las vesículas. Esto es una clara demostración de que los procedimientos y aparato de la presente invención pueden usarse para preparar vesículas que encapsulan de forma pasiva moléculas pequeñas.
TABLA VI Vesículas con Calceína encapsulada
8 
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Ejemplo 7
Este ejemplo ilustra el uso de un procedimiento de la presente invención frente a procedimientos de la técnica anterior.
En referencia a la Figura 12, los lípidos se disolvieron en etanol al 90% (A) y se diluyeron: por etapas usando el aparato de la presente invención hasta etanol al 45% (B) y 22,5% (C), representado por la línea continua ("LipoMixer"); o se añadieron en gotas en el tampón con agitación hasta una concentración de etanol final del 22,5% (C), representado por la línea punteada. Incluso aunque las concentraciones de etanol finales para ambas preparaciones era la misma, la SPLP formada de acuerdo con los procedimientos de la presente invención tenía una encapsulación de ADN del 85% mientras que las vesículas preparadas por goteo de etanol solo tenían una encapsulación de ADN del 5%.
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Ejemplo 8
Este ejemplo ilustra diversas condiciones y propiedades para formar liposomas de acuerdo con la presente invención. Debería apreciarse que pueden usarse otras condiciones y parámetros y que los usados en el presente documento son meramente ejemplares.
En referencia a las Figuras 13 y 14, se modelan diversos caudales (sustancialmente equivalentes para flujos de solución lipídica y acuosa) y se analizan para mostrar diversos parámetros tales como tasa de cizallamiento y número de Reynolds (N_{re}) y tamaño de vesícula. Los parámetros y condiciones se determinaron en la salida del conector T corrigiendo con respecto a la densidad y viscosidad de la solución de etanol resultante. No se ha explicado la turbulencia adicional como resultado del encuentro de las dos corrientes entre sí en oposición, así como tampoco la turbulencia adicional como resultado de que las corrientes tengan que doblar una esquina de 90º.

Claims (44)

1. Un procedimiento para producir una vesícula lipídica que encapsula un producto terapéutico, comprendiendo dicho procedimiento:
proporcionar una solución acuosa en un primer depósito;
proporcionar una solución lipídica orgánica en un segundo depósito, en el que una de la solución acuosa y la solución lipídica orgánica incluye un producto terapéutico;
mezclar dicha solución acuosa con dicha solución lipídica orgánica, mezclándose dicha solución lipídica orgánica con dicha solución acuosa de modo que se produzca de forma sustancialmente instantánea una vesícula lipídica que encapsula el producto terapéutico; caracterizado porque
la mezcla incluye introducir la solución acuosa y la solución lipídica orgánica en un ambiente de mezcla a caudales sustancialmente iguales y el ambiente de mezcla incluye un conector T, introduciéndose la solución acuosa y la solución lipídica orgánica en el conector T como flujos opuestos a sustancialmente 180º entre sí.
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2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la vesícula lipídica es un liposoma.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho liposoma está en una solución que tiene una concentración de aproximadamente el 20% v/v a aproximadamente el 50% v/v de disolvente orgánico.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, que comprende adicionalmente diluir adicionalmente la solución de liposoma.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicha dilución adicional es con un tampón.
6. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicha dilución adicional de la solución de liposoma es una dilución continua por etapas.
7. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la solución de liposoma tiene una concentración de menos de aproximadamente el 25% v/v de disolvente orgánico después de la dilución.
8. El procedimiento de la reivindicación 3, que comprende adicionalmente retirar dicho disolvente orgánico asociado con dicha solución de liposoma para formar una forma final.
9. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha solución lipídica orgánica comprende un disolvente orgánico.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho disolvente orgánico es un alcohol inferior.
11. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho disolvente orgánico comprende agua.
12. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha solución acuosa comprende una solución orgánica.
13. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha solución acuosa comprende un tampón.
14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha vesícula lipídica es de menos de aproximadamente 200 nm de diámetro.
15. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha vesícula lipídica se forma a una velocidad de aproximadamente 60 a aproximadamente 80 ml/min.
16. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha solución acuosa comprende el producto terapéutico.
17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que dicho producto terapéutico se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un plásmido, un ácido nucleico, un ácido nucleico antisentido, una ribozima, ARNt, ARNnp, ARNip, ADN precondensado y un antígeno.
18. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que dicho producto terapéutico es un ácido nucleico.
19. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el producto terapéutico es una especie cargada.
20. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha solución lipídica orgánica comprende el producto terapéutico.
21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que el producto terapéutico es lipófilo.
22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que el producto lipófilo se selecciona del grupo que consiste en protax III, Paclitaxol, taxol, derivados de taxol y profármacos derivatizados con lípidos.
23. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que se controla la temperatura de uno o ambos del primer y el segundo depósitos.
24. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que uno o ambos del primer y el segundo depósitos incluyen un recipiente de acero inoxidable con envoltura con un mezclador superior.
25. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que durante la mezcla la solución lipídica orgánica experimenta una dilución continua por etapas en presencia de la solución acuosa.
26. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicho liposoma está en una solución que tiene un pH de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,0.
27. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicho ácido nucleico codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en una timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-TK), una citosina desaminasa, una xantina-guaninfosforribosil transferasa, una p53, una purina nucleósido fosforilasa, una carboxilesterasa, una desoxicitidina quinasa, una nitrorreductasa, una timidina fosforilasa, y un citocromo P450 2B1.
28. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicho liposoma tiene una eficacia de encapsulación de ácido nucleico de más de aproximadamente el 50%.
29. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicho liposoma tiene una eficacia de encapsulación de ácido nucleico de entre aproximadamente el 80% y aproximadamente el 90%.
30. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicho liposoma tiene un diámetro de aproximadamente 150 nm o menos.
31. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicho liposoma está en una solución que tiene una concentración salina de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 200 mM.
32. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, comprendiendo dicho procedimiento adicionalmente:
proporcionar dicha solución lipídica orgánica que tiene una concentración de aproximadamente el 70% v/v a aproximadamente el 100% v/v de disolvente orgánico en el segundo depósito.
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33. El procedimiento de la reivindicación 32, en el que durante la mezcla la solución lipídica orgánica experimenta una dilución continua por etapas hasta una concentración de aproximadamente el 35% v/v a aproximadamente el 50% v/v de disolvente orgánico.
34. El procedimiento de la reivindicación 32, en el que el producto terapéutico es uno de una especie aniónica y una especie catiónica.
35. Un aparato para producir una vesícula lipídica que encapsula un producto terapéutico, comprendiendo dicho aparato:
un primer depósito para contener una solución acuosa;
un segundo depósito para contener una solución lipídica orgánica, en el que una de la solución acuosa y la solución lipídica orgánica incluye un producto terapéutico; y
un mecanismo de bomba configurado para bombear dicha solución acuosa y dicha solución lipídica orgánica en una región de mezcla a caudales sustancialmente iguales;
mezclándose la solución lipídica orgánica con dicha solución acuosa en la región de mezcla para formar de forma sustancialmente instantánea una vesícula lipídica con producto terapéutico encapsulado; caracterizado por que
la región de mezcla incluye un conector T, introduciéndose dicha solución acuosa y dicha solución lipídica orgánica en el conector T como flujos opuestos a sustancialmente 180º entre sí.
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36. El aparato de la reivindicación 35, en el que la vesícula lipídica es un liposoma.
37. El aparato de la reivindicación 36, que incluye adicionalmente un recipiente receptor para recibir el liposoma con producto terapéutico encapsulado.
38. El aparato de la reivindicación 36, en el que el liposoma está en una solución que tiene una primera concentración, incluyendo adicionalmente el aparato un sistema de filtración acoplado al recipiente receptor, configurándose dicho sistema de filtración para aumentar la concentración de la solución de liposoma con producto terapéutico encapsulado hasta una segunda concentración.
39. El aparato de la reivindicación 35 o 36, en el que el producto terapéutico se selecciona del grupo que consiste una proteína, un plásmido, un ácido nucleico, un ácido nucleico antisentido, una ribozima, ARNt, ARNnp, ARNip, ADN precondensado y un antígeno.
40. El aparato de la reivindicación 35 o 36, en el que el mecanismo de bomba incluye una bomba peristáltica.
41. El aparato de la reivindicación 36, en el que durante la mezcla, la solución lipídica orgánica experimenta una dilución continúa por etapas en presencia de la solución acuosa.
42. El aparato de la reivindicación 35 o 36, en el que la solución lipídica orgánica incluye el producto terapéutico y en el que el producto terapéutico es lipófilo.
43. El aparato de la reivindicación 35 o 36, en el que la solución acuosa incluye el producto terapéutico.
44. El aparato de la reivindicación 35 o 36, en el que el producto terapéutico es uno de una especie aniónica y una especie catiónica.
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