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CN120153078A - 编码rsv-f的rna分子及含所述rna分子的疫苗 - Google Patents

编码rsv-f的rna分子及含所述rna分子的疫苗 Download PDF

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CN120153078A
CN120153078A CN202380075365.8A CN202380075365A CN120153078A CN 120153078 A CN120153078 A CN 120153078A CN 202380075365 A CN202380075365 A CN 202380075365A CN 120153078 A CN120153078 A CN 120153078A
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CN
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rna
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rsv
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methyl
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陈伟
F·M·迪亚兹
K·A·斯旺森
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Pfizer Corp SRL
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Pfizer Corp SRL
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Abstract

本发明涉及编码呼吸道合胞体病毒(RSV)的RNA分子。本发明进一步涉及包含调配于脂质纳米颗粒中的所述RNA分子(RNA‑LNP)的组合物。本发明进一步涉及所述RNA分子、所述RNA‑LNP及所述组合物用于治疗和/或预防包括肺炎及支气管炎的RSV感染诱导的急性呼吸道病症的用途。

Description

编码RSV-F的RNA分子及含所述RNA分子的疫苗
【相关申请的交叉引用】
本申请主张2023年9月26日申请的美国临时申请第63/585,254号及2022年10月27日申请的美国临时申请第63/381,238号的权益。前述申请中的各者的全部内容以引用的方式并入本文中。
【序列表的引用】
本申请经由EFS网以电子方式申请且包括以.xml格式以电子方式提交的序列表。.xml档案含有名称为“PC072895A Sequence Listing.xml”的序列表，其在2023年9月25日创建且大小为145KB。此.xml档案中所含的序列表为说明书的一部分且以全文引用的方式并入本文中。
【先前技术】
呼吸道合胞体病毒(Respiratory syncytial virus；RSV)为感染肺及呼吸信道的呼吸道病毒。RSV为全世界婴儿中严重病毒性下呼吸道病症的主要原因及老年人中呼吸道病症的重要原因。在2023年批准两种RSV蛋白次单位疫苗：ABRYSVO(Pfizer)及AREXVY(GSK)。然而，尚无RNA疫苗经批准用于预防RSV感染。
RSV为肺病毒科的一员。其基因组由编码11种蛋白质(包括九种结构蛋白(三种糖蛋白及六种内部蛋白)及两种非结构蛋白)的单链、反义RNA分子组成。结构蛋白包括三种跨膜表面糖蛋白：附着蛋白G、融合蛋白F及疏水性小SH蛋白。存在两种RSV亚型：A及B。其主要在G糖蛋白方面不同，而两种亚型之间的F糖蛋白的序列更保守。
成熟F糖蛋白具有三个一般域：胞外域(ED)、跨膜域(TM)及细胞质尾(CT)。CT含有单个棕榈酰化半胱氨酸残基。
人类RSV的F糖蛋白最初自mRNA翻译为单个574氨基酸多肽前体(称为“F0”或“F0前体”)，其在N端含有信号肽序列(氨基酸1～25)。在翻译后，信号肽在内质网中被信号肽酶移除。F0前体的剩余部分(即残基26～574)可在两个多碱基位点(a.a.109/110及136/137)处被细胞蛋白酶(特定而言弗林蛋白酶(furin))裂解，从而移除称为pep27(氨基酸110～136)的27氨基酸插入序列且产生称为F1(C端部分；氨基酸137～574)及F2(N端部分；氨基酸26～109)的两个连接片段。F1在其N端处含有疏水性融合肽，及两个七肽(heptad)重复区域(HRA及HRB)。HRA在融合肽附近，且HRB在TM域附近。F1及F2片段经由两个二硫键连接在一起。无信号肽序列的未裂解的F0蛋白质或F1-F2异二聚体二者中的一者可形成RSV F原聚体。三种此类原聚体组装以形成最终RSV F蛋白复合物，其为三种原聚体的同源三聚体。
亚型A及B的F蛋白在氨基酸序列方面约90％一致。A亚型的F0前体多肽的实施例序列提供于SEQ ID NO：1(A2株系；GenBank GI：138251；Swiss Prot P03420)中，且B亚型的F0前体多肽的实施例序列提供于SEQ ID NO：2(18537株系；GenBankGI：138250；Swiss ProtP13843)中。SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2均为574氨基酸序列。SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2的信号肽序列也已报导为氨基酸1～25(GenBank及UniProt)。在两个序列中，TM域大致为氨基酸530～550，但可替代地报导为525～548。细胞质尾始于氨基酸548或550且结束于氨基酸574，其中棕榈酰化半胱氨酸残基位于氨基酸550处。
RSV F蛋白为探究RSV疫苗的初级抗原。RSV F蛋白三聚体介导病毒颗粒膜与宿主细胞膜之间的融合，且也促进合胞体的形成。在与宿主细胞的膜融合之前的病毒颗粒中，最大的F分子群体形成棒棒糖形结构，其中TM域锚定于病毒套膜中[Dormitzer,P.R.,Grandi,G.,Rappuoli,R.,Nature Reviews Microbiol,10,807,2012.]。此构形称为融合前构形。融合前RSV F被单株抗体(mAb)D25、AM22及MPE8识别，寡聚状态之间无区别。融合前F三聚体被mAb AM14特异性识别[Gilman MS，Moin SM,Mas V等人,PLoS Pathogens,11(7),2015]。在RSV进入细胞期间，F蛋白经由中间延伸结构自融合前状态(其在本文中可称为“pre-F”)重排为融合后状态(“post-F”)。在此重排期间，融合前分子的C端卷曲螺旋解离成其三个组成链，接着其围绕球状头部卷绕且接合三个额外螺旋以形成融合后六螺旋束。若融合前RSV F三聚体经受愈来愈苛刻的化学或物理条件(诸如高温)，则其进行结构变化。起初，丧失三聚结构(至少在分子内局部地)且接着重排为融合后形式，且接着域变性。
为了防止病毒进入，F特异性中和抗体可能必须在病毒套膜与细胞膜融合之前结合病毒颗粒上的F的融合前构形或可能的延伸的中间体。因此，F蛋白的融合前形式被视为作为所需疫苗抗原的较佳构形[Ngwuta,J.O.,Chen，M.,Modjarrad,K.，Joyce，M.G.,Kanekiyo,M.,Kumar,A.,Yassine,H.M.,Moin,S.M.,Killikelly,A.M.,Chuang,G.Y.,Druz,A.,Georgiev,I.S.,Rundlet,E.J.,Sastry,M.,Stewart-Jones,G.B.,Yang.Y.,Zhang,B.,Nason,M.C.,Capella,C.,Peeples,M.,Ledgerwood,J.E.,Mclellan,J.S.,Kwong,P.D.,Graham,B.S.,Science Translat.Med.,14,7,309(2015)]。在用表面活性剂(诸如曲拉通(Triton)X-100、曲拉通X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、吐温(Tween)20、吐温80、辛基葡萄糖苷、辛基硫葡萄糖苷、SDS、CHAPS、CHAPSO)自膜萃取、或表达为胞外域、物理或化学胁迫、或储存后，F糖蛋白容易地转化成融合后形式[McLellan JS，Chen M,Leung S等人Structure of RSV fusion glycoprotein trimer bound to a pre-fusion-specificneutralizing antibody.Science 340，1113-1117(2013)；Chaiwatpongsakorn,S.,Epand,R.F.,Collins,P.L.,Epand R.M.，Peeples，M.E.,J Virol.85(8):3968-77(2011)；Yunus，A.S.，Jackson T.P.，Crisafi,K.,Burimski,I.,Kilgore，N.R.,Zoumplis,D.,Allaway,G.P.,Wild,C.T.,Salzwedel,K.Virology.2010年1月20日；396(2):226-37]。因此，制备融合前F作为疫苗抗原仍为一种挑战。由于中和及由干扰病毒进入进行的保护性抗体功能，所以假定不引起融合前特异性抗体的F抗原预期不与引起融合前特异性抗体的F抗原一样有效。因此，认为更需要利用含有呈融合前形式的F蛋白免疫原的F蛋白疫苗。已提供RSV F蛋白的突变体以增加融合前稳定性(参见例如PCT申请第WO2017/109629号)且为有前景的疫苗候选者。
并入F蛋白抗原的RSV疫苗已在研发中。临床研究已显示，一些基于F蛋白亚基的疫苗候选者为安全的且具有免疫原性，但保护性功效及保护持久性方面需要提高。
因此，需要改良的免疫原性组合物以保护免受RSV感染。
【发明内容】
本发明提供尤其如本文所提供的对针对RSV感染的改良的免疫原性组合物的未满足的需求。在一个实施方式中，本发明提供用于预防、治疗或改善个体的感染、疾病或病状的免疫原性组合物及方法，其包含施用RNA分子，例如编码氨基酸序列(例如免疫原性抗原，包含呼吸道合胞体病毒(RSV)蛋白、其免疫原性变体、或RSV蛋白的免疫原性片段或其免疫原性变体，例如抗原性肽或蛋白质)的免疫原性RNA多核苷酸。因此，免疫原性抗原包含用于诱导个体中针对RSV的免疫反应的RSV蛋白的表位。施用编码免疫原性抗原的RNA多核苷酸以(在由适当目标细胞表达多核苷酸后)提供用于诱导(例如刺激、启动和/或扩增)免疫反应(例如抗体和/或免疫效应细胞)的抗原。在一个实施方式中，根据本发明诱导的免疫反应为B细胞介导的免疫反应(例如抗体介导的免疫反应)以及T细胞介导的免疫反应两者。在一个实施方式中，免疫反应为抗RSV免疫反应。
本文所述的免疫原性组合物包含RNA分子，其包含可在接收者的细胞中翻译成一或多种蛋白质的RNA(作为活性成分)。除编码抗原序列的野生型、密码子优化或突变型序列以外，RNA分子可含有针对就稳定性及翻译效率而言RNA的最大功效优化的一或多种结构组件(5'帽、5'UTR、亚基因组启动子、3'UTR、多A尾)。在一个实施方式中，RNA分子含有所有这些组件。本文所述的RNA分子可与脂质和/或蛋白质复合以产生RNA-颗粒(例如脂质纳米颗粒(LNP))用于施用。在一个实施方式中，本文所述的RNA分子与脂质复合以产生RNA-脂质纳米颗粒(例如RNA-LNP)用于施用。在一个实施方式中，本文所述的RNA分子与蛋白质复合用于施用。在一个实施方式中，本文所述的RNA分子与脂质及蛋白质复合用于施用。若使用不同RNA分子的组合，则RNA分子可一同与脂质和/或蛋白质一起复合或分开与脂质和/或蛋白质一起复合以产生RNA-颗粒用于施用。
本发明提供RNA分子及RNA-LNP，其包括至少一个编码RSV抗原的开放阅读框(openreading frame；ORF)。在一些实施方式中，RSV抗原为RSV多肽。在一些实施方式中，RSV多肽为RSV F蛋白。在一些实施方式中，RSV F蛋白为全长蛋白、截短蛋白、其片段或变体。在一些实施方式中，RSV F蛋白包含至少一个突变。
本发明提供RNA分子及RNA-LNP，其包括至少一个编码表1的RSV多肽的ORF。在一些实施方式中，RSV多肽包含选自SEQ ID NO：1～6或71～74的氨基酸序列。在一些实施方式中，RSV多肽与表1的氨基酸序列中的任一者(例如SEQ ID NO：1～6或71～74中的任一者)具有、具有至少或具有至多90％、91％、92％、93％、94％、95、96％、97％、98％或99％或更高同一性。在一些实施方式中，RSV多肽由表1的氨基酸序列中的任一者(例如SEQ ID NO：1～6或71～74中的任一者)组成。
本发明提供RNA分子及RNA-LNP，其包含至少一个转录自表2的至少一个DNA核酸的ORF。在一些实施方式中，RNA分子转录自选自SEQ ID NO：7～10或59～62的核酸序列。在一些实施方式中，RNA分子包含转录自与表2的核酸序列中的任一者(例如SEQ ID NO：7～10或59～62中的任一者)具有、具有至少或具有至多90％、91％、92％、93％、94％、95、96％、97％、98％或99％或更高同一性的核酸序列的ORF。在一些实施方式中，RNA分子包含转录自由表2的核酸序列中的任一者(例如SEQ ID NO：7～10或59～62中的任一者)组成的核酸序列的ORF。
本发明进一步提供RNA分子及RNA-LNP，其包含至少一个包含表3的RNA核酸序列的ORF。在一些实施方式中，RNA分子包含选自SEQ ID NO：11～16或63～70的核酸序列。在一些实施方式中，RNA分子包含与表3的核酸序列中的任一者(例如SEQ ID NO：11～16或63～70中的任一者)具有、具有至少或具有至多90％、91％、92％、93％、94％、95、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。在一些实施方式中，RNA分子包含由表3的核酸序列中的任一者(例如SEQ ID NO：11～16或63～70中的任一者)组成的核酸序列。在一些实施方式中，SEQID NO：11～16中的任一者的各尿苷经N1-甲基假尿苷(Ψ)置换(例如经修饰的RNA；modRNA)。
本发明进一步提供RNA分子及RNA-LNP，其包括5'非翻译区(5'-UTR)和/或3'非翻译区(3'-UTR)。在一些实施方式中，RNA分子包括5'非翻译区(5'-UTR)。在一些实施方式中，5'UTR包含选自SEQ ID NO：17～19中的任一者的序列。在一些实施方式中，5'UTR包含与SEQID NO：17～19中的任一者具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95、96％、97％、98％或99％或更高同一性的序列。在一些实施方式中，5'UTR包含选自SEQ ID NO：17～19中的任一者的序列。在一些实施方式中，5'UTR包含由SEQ ID NO：17～19中的任一者组成的序列。
在一些实施方式中，RNA分子及RNA-LNP包括3'非翻译区(3'-UTR)。在一些实施方式中，3′UTR包含选自SEQ ID NO：20～25中的任一者的序列。在一些实施方式中，3'UTR包含与SEQ ID NO：20～25中的任一者具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95、96％、97％、98％或99％或更高同一性的序列。在一些实施方式中，3'UTR包含选自SEQ ID NO：20～25中的任一者的序列。在一些实施方式中，3'UTR包含由SEQ ID NO：20～25中的任一者组成的序列。
本发明进一步提供RNA分子及RNA-LNP，其包括5'帽部分。在一些实施方式中，5'帽部分为(3′OMe)-m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG。本发明进一步提供RNA分子及RNA-LNP，其包括3'多A尾。在一些实施方式中，多A尾包含具有SEQ ID NO：26的序列。
在一些实施方式中，RNA分子包括5'UTR及3′UTR。在一些实施方式中，RNA分子包括5'帽、5′UTR及3'UTR。在一些实施方式中，RNA分子包括5′帽、5′UTR、3′UTR及多A尾。在一些实施方式中，RNA分子包括5′UTR、3′UTR及多A尾。在一些实施方式中，前述要素中的1、2、3者或更多者可排除在RNA分子外。在一些实施方式中，5'UTR、3′UTR及多A尾中的任一者的各尿苷经N1-甲基假尿苷(Ψ)置换(例如经修饰的RNA；modRNA)。
在一些实施方式中，多A尾长度可含有+1/-1A。在一些实施方式中，尿苷为N1-甲基假尿苷(Ψ)。
本发明提供表5中所描述的RNA分子。在一些实施方式中，RNA分子包含SEQ ID NO：18的5′UTR、SEQ ID NO：11的RSV ORF、SEQ ID NO：21的3′UTR和/或SEQ ID NO：26的多A尾。在另一实施方式中，RNA分子包含SEQ ID NO：18的5′UTR、SEQ ID NO：12的RSV ORF、SEQ IDNO：21的3′UTR和/或SEQ ID NO：26的多A尾。在另一实施方式中，RNA分子包含SEQ ID NO：18的5′UTR、SEQ ID NO：63的RSV ORF、SEQ ID NO：21的3′UTR和/或SEQ ID NO：26的多A尾。在另一实施方式中，RNA分子包含SEQ ID NO：18的5'UTR、SEQ ID NO：65的RSV ORF、SEQ IDNO：21的3′UTR和/或SEQ ID NO：26的多A尾。在另一实施方式中，RNA分子包含SEQ ID NO：18的5'UTR、SEQ ID NO：67的RSV ORF、SEQ ID NO：21的3'UTR和/或SEQ ID NO：26的多A尾。在另一实施方式中，RNA分子包含SEQ ID NO：18的5′UTR、SEQ ID NO：69的RSV ORF、SEQ IDNO：21的3′UTR和/或SEQ ID NO：26的多A尾。在一些实施方式中，RSVORF进一步包含本文所述的终止密码子。在一些实施方式中，多A尾长度可含有+1/-1A或+2/-2A。在一些实施方式中，RNA分子的各尿苷经N1-甲基假尿苷(Ψ)置换(例如经修饰的RNA；modRNA)。
本发明进一步提供RNA分子，其包括至少一个由密码子优化DNA产生的开放阅读框。在一些实施方式中，开放阅读框包含至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的G/C含量：50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％或75％，例如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％，为或为约50％～75％，或者为或为约55％～70％。在一些实施方式中，G/C含量为或为约58％，为或为约66％，或者为或为约62％。
本发明进一步提供RNA分子，其包含经稳定化的RNA。本发明进一步提供RNA分子，其包括具有至少一个经修饰的核苷酸的RNA(例如经修饰的RNA；modRNA)。在一些实施方式中，经修饰的核苷酸为假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4′-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫-1-甲基-假尿苷、2-硫-5-氮杂-尿苷、2-硫-二氢假尿苷、2-硫-二氢尿苷、2-硫-假尿苷、4-甲氧基-2-硫-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫-1-甲基-假尿苷、4-硫-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷或2′-O-甲基尿苷。在一些实施方式中，经修饰的核苷酸为N1-甲基假尿苷(Ψ)。在一些实施方式中，前述经修饰的核苷酸中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在RNA分子外。
本发明进一步提供RNA分子，其为信使RNA(mRNA)或自复制RNA。在一些实施方式中，RNA为mRNA。
本发明进一步提供免疫原性组合物，其包括本文所述的RNA分子。RNA分子可调配于此类免疫原性组合物中、囊封于其中、与其中的脂质纳米颗粒(LNP)复合、与LNP结合或吸附于LNP上(例如RSV RNA-LNP)。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒包括以下至少一者：阳离子脂质、聚合物结合脂质(例如聚乙二醇化脂质)及至少一种结构脂质(例如中性脂质及类固醇或类固醇类似物)。在一些实施方式中，前述脂质中的1、2、3者或更多者可排除在脂质纳米颗粒外。
在一些实施方式中，脂质纳米颗粒包括阳离子脂质。在一些实施方式中，阳离子脂质为(4-羟丁基)氨叉基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)。
在一些实施方式中，脂质纳米颗粒包括聚合物结合脂质。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒包括聚乙二醇化脂质，也称为PEG-脂质。在一些实施方式中，聚乙二醇化脂质为PEG修饰的磷脂酰乙醇胺；PEG修饰的磷脂酸；PEG修饰的神经酰胺(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)；PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油；2-[(聚乙二醇)-2000]-N，N-二(十四烷基)乙酰胺；二醇-脂质，包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA、PEG-s-DMG、N-[(甲氧基聚乙二醇)2000)氨甲酰基]-1,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)及PEG-2000-DMG；聚乙二醇化二酰基甘油(PEG-DAG)，诸如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2，3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)；聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)；PEG琥珀酸二酰基甘油(PEG-S-DAG)，诸如4-O-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-((ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)；聚乙二醇化神经酰胺(PEG-cer)；或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯，诸如共甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。在一些实施方式中，前述聚乙二醇化脂质中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在RNA分子外。在一些实施方式中，聚乙二醇化脂质为2-[(聚乙二醇)-2000]-N，N-二(十四烷基)乙酰胺(ALC-0159)。
在一些实施方式中，脂质纳米颗粒包括至少一种结构脂质，诸如中性脂质。在一些实施方式中，中性脂质为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基-油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-顺丁烯二酰亚氨基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)和/或1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。在一些实施方式中，前述结构脂质中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在RNA分子外。在一些实施方式中，中性脂质为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。
在一些实施方式中，脂质纳米颗粒包括第二结构脂质，诸如类固醇或类固醇类似物。在一些实施方式中，类固醇或类固醇类似物为胆固醇。
在一些实施方式中，脂质纳米颗粒的平均直径为约1～约500nm，例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：1nm、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm、460nm、470nm、480nm、490nm或500nm。
在一些实施方式中，RNA-LNP免疫原性组合物为液体RNA-LNP组合物，其包含浓度为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的编码本文所揭示的RSV多肽的RNA分子/多核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90mg/mL，优选为或为约0.01～0.09mg/mL，其囊封于包含以下的脂质组成的LNP中：浓度为或为约0.8～0.95mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94或0.95mg/mL)的阳离子脂质、浓度为或为约0.05～0.15mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14或0.15mg/mL)的聚乙二醇化脂质、浓度为或为约0.1～0.25mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25mg/mL)的第一结构脂质、及浓度为或为约0.3～0.45mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44或0.45mg/mL)的第二结构脂质。在一些实施方式中，液体组合物进一步包含缓冲组合物，其包含浓度为或为约0.1～0.3mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29或0.30mg/mL)的第一缓冲物、浓度为或为约1.25～1.4mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.30、1.31、1.32、1.33、1.34、1.35、1.36、1.37、1.38、1.39或1.40mg/mL)的第二缓冲物、及浓度为或为约95～110mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或110mg/mL)的稳定剂。在一些实施方式中，前述要素中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在液体RNA-LNP组合物外。在一些实施方式中，前述要素浓度中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在液体RNA-LNP组合物外。
在特定实施方式中，液体RNA-LNP免疫原性组合物包含浓度为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的编码本文所揭示的RSV多肽的RNA分子/多核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90mg/mL，优选为或为约0.01～0.09mg/mL，其囊封于包含以下的脂质组成的LNP中：浓度为或为约0.8～0.95mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94或0.95mg/mL)的((4-羟丁基)氨叉基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)、浓度为或为约0.05～0.15mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14或0.15mg/mL)的2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二(十四烷基)乙酰胺(ALC-0159)、浓度为或为约0.1～0.25mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25mg/mL)的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、及浓度为或为约0.3～0.45mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44或0.45mg/mL)的胆固醇。在一些实施方式中，液体组合物进一步包含Tris缓冲组合物，该Tris缓冲组合物包含浓度为或为约0.1～0.3mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29或0.30mg/mL)的缓血酸胺，及浓度为或为约1.25～1.4mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.30、1.31、1.32、1.33、1.34、1.35、1.36、1.37、1.38、1.39或1.40mg/mL)的Tris盐酸(HCl)、及浓度为或为约95～110mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或110mg/mL)的蔗糖。在一些实施方式中，前述要素中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在液体RNA-LNP组合物外。在一些实施方式中，前述要素浓度中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在液体RNA-LNP组合物外。
在一些实施方式中，液体RNA-LNP免疫原性组合物包含浓度为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的编码本文所揭示的RSV多肽的RNA分子/多核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90mg/mL，优选为或为约0.01～0.09mg/mL，其囊封于LNP中，且其进一步包含为或为约5～15mM的Tris缓冲物(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mM)及为或为约200～400mM的蔗糖(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或400mM)，pH呈或呈约7.0～8.0(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0)。在一些实施方式中，前述要素中的1、2、3者或更多者可排除在液体RNA-LNP组合物外。在一些实施方式中，前述要素浓度中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在液体RNA-LNP组合物外。
在一些实施方式中，RNA-LNP免疫原性组合物为冻干(复原)RNA-LNP组合物，其包含浓度为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的编码本文所揭示的RSV多肽的RNA分子/多核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90mg/mL，优选为或为约0.01～0.09mg/mL，其囊封于包含以下的脂质组成的LNP中：浓度为或为约0.8～0.95mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94或0.95mg/mL)的阳离子脂质、浓度为或为约0.05～0.15mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14或0.15mg/mL)的聚乙二醇化脂质、浓度为或为约0.1～0.25mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25mg/mL)的第一结构脂质、及浓度为或为约0.3～0.45mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44或0.45mg/mL)的第二结构脂质。在一些实施方式中，冻干组合物进一步包含以下各者：浓度为或为约0.01及0.15mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14或0.15mg/mL)的第一缓冲物、浓度为或为约0.5及0.65mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.50、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.60、0.61、0.62、0.63、0.64或0.65mg/mL)的第二缓冲物、浓度为或为约35～50mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50mg/mL)的稳定剂、及用于复原的浓度为或为约5～15mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mg/mL)的盐稀释剂。在特定实施方式中，冻干组合物复原于或于约0.6～0.75mL的盐稀释剂(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.60、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.70、0.71、0.72、0.73、0.74或0.75mL)中。冻干RNA-LNP组合物中的浓度系在复原后测定。在一些实施方式中，前述要素中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在冻干RNA-LNP组合物外。在一些实施方式中，前述要素浓度中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在冻干RNA-LNP组合物外。
在特定实施方式中，冻干(复原)RNA-LNP组合物包含浓度为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的编码本文所揭示的RSV多肽的RNA多核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90mg/mL，优选为或为约0.01～0.09mg/mL，其囊封于包含以下的脂质组成的LNP中：浓度为或为约0.8～0.95mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94或0.95mg/mL)的ALC-0315、浓度为或为约0.05～0.15mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14或0.15mg/mL)的ALC-0159、浓度为或为约0.1～0.25mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25mg/mL)的DSPC、及浓度为或为约0.3～0.45mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44或0.45mg/mL)的胆固醇，且进一步包含Tris缓冲组合物，该Tris缓冲组合物包含：浓度为或为约0.01～0.15mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14或0.15mg/mL)的缓血酸胺、及浓度为或为约0.5～0.65mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.50、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.60、0.61、0.62、0.63、0.64或0.65mg/mL)的Tris HCl、浓度为或为约35～50mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50mg/mL)的蔗糖、及用于复原的浓度为或为约5～15mg/mL(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mg/mL)的氯化钠(NaCl)稀释剂。在特定实施方式中，冻干组合物被复原于或于约0.6～0.75mL的氯化钠(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：0.60、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.70、0.71、0.72、0.73、0.74或0.75mL)中。冻干RNA-LNP组合物中的浓度系在复原后测定。在一些实施方式中，前述要素中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在冻干RNA-LNP组合物外。在一些实施方式中，前述要素浓度中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在冻干RNA-LNP组合物外。
本发明提供RNA分子、RNA-LNP及免疫原性组合物，其可以每次施用至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的剂量向个体施用：1μg、15μg、30μg、45μg、60μg、75μg、90μg、100μg或更高的囊封于LNP中的RSV RNA。在一些实施方式中，可排除囊封于LNP中的RSV RNA的前述浓度中的1、2、3、4、5者或更多者。
本发明提供RNA分子、RNA-LNP及免疫原性组合物，其可以单次剂量施用。本发明进一步提供RNA分子、RNA-LNP及免疫原性组合物，其可施用两次(例如第0天及在或约第7天、第0天及在或约第14天、第0天及在或约第21天、第0天及在或约第28天、第0天及在或约第60天、第0天及在或约第90天、第0天及在或约第120天、第0天及在或约第150天、第0天及在或约第180天、第0天及在或约1个月后、第0天及在或约2个月后、第0天及在或约3个月后、第0天及在或约6个月后、第0天及在或约9个月后、第0天及在或约12个月后、第0天及在或约18个月后、第0天及在或约2年后、第0天及在或约5年后、或第0天及在或约10年后)。本发明进一步提供RNA分子、RNA-LNP及免疫原性组合物，其可在第0天及在或约2个月后施用两次。本发明进一步提供RNA分子、RNA-LNP及免疫原性组合物，其可在第0天及在或约6个月后施用两次。本发明进一步提供RNA分子、RNA-LNP及免疫原性组合物，其可施用三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次。在一些实施方式中，可能需要以1～5年的间隔周期性加强来维持抗体的保护性水平。本发明进一步提供至少一次追加剂量的施用。在一些实施方式中，可排除前述施用方案中的1、2、3、4、5者或更多者。
本发明提供一种诱导个体中针对RSV的免疫反应的方法，其包括向个体施用有效量的本文所述的RNA分子、RNA-LNP和/或免疫原性组合物。本发明进一步提供一种本文所述的RNA分子、RNA-LNP和/或免疫原性组合物的用途，其用于制造用于诱导个体中针对RSV的免疫反应的药剂。
本发明提供一种诱导个体中针对RSV的免疫反应的方法，其包括向个体施用有效量的本文所述的包括至少一个编码RSV多肽的开放阅读框的RNA分子和/或RNA-LNP、或免疫原性组合物。本发明进一步提供一种本文所述的包括至少一个编码RSV多肽的开放阅读框的RNA分子和/或RNA-LNP、或免疫原性组合物的用途，其用于制造用于诱导个体中针对RSV的免疫反应的药剂。
本发明提供一种诱导个体中针对RSV的免疫反应的方法，其包括向个体施用有效量的本文所述的包括至少一个编码所关注基因的多肽的开放阅读框的RNA分子和/或RNA-LNP、或组合物。本发明进一步提供一种本文所述的包括至少一个编码所关注基因的多肽的开放阅读框的RNA分子和/或RNA-LNP、或组合物的用途，其用于制造用于诱导个体中针对RSV的免疫反应的药剂。
本发明提供一种预防、治疗和/或改善个体的感染、疾病或病状的方法，其包括向个体施用有效量的本文所述的RNA分子、RNA-LNP和/或免疫原性组合物。本发明进一步提供一种本文所述的RNA分子、RNA-LNP和/或免疫原性组合物的用途，其用于制造用于预防、治疗和/或改善个体的感染、疾病或病状的药剂。在一些实施方式中，感染、疾病或病状与RSV相关。在一些实施方式中，感染、疾病或病状为急性下呼吸道感染(acute lowerrespiratory infection；ALRI)，包括肺炎及支气管炎。在一些实施方式中，感染、疾病或病状为急性下呼吸道感染(ALRI)，包括肺炎及支气管炎。
本发明提供一种预防、治疗和/或改善个体的感染、疾病或病状的方法，其包括向个体施用有效量的本文所述的包括至少一个编码RSV多肽的开放阅读框的RNA分子和/或RNA-LNP、或免疫原性组合物。本发明进一步提供一种本文所述的包括至少一个编码RSV多肽的开放阅读框的RNA分子和/或RNA-LNP、或免疫原性组合物的用途，其用于制造用于预防、治疗和/或改善个体的感染、疾病或病状的药剂。在一些实施方式中，感染、疾病或病状与RSV相关。在一些实施方式中，感染、疾病或病状为急性下呼吸道感染(ALRI)，包括肺炎及支气管炎。在一些实施方式中，感染、疾病或病状为急性下呼吸道感染(ALRI)，包括肺炎及支气管炎。
本发明进一步提供一种预防、治疗和/或改善个体的感染、疾病或病状的方法，其包括向个体施用有效量的本文所述的包括至少一个编码所关注基因的多肽的开放阅读框的RNA分子和/或RNA-LNP、或免疫原性组合物。本发明进一步提供一种本文所述的包括至少一个编码所关注基因的多肽的开放阅读框的RNA分子和/或RNA-LNP、或免疫原性组合物的用途，其用于制造用于预防、治疗和/或改善个体的感染、疾病或病状的药剂。在一些实施方式中，感染、疾病或病状与所关注基因相关。
在一些实施方式中，个体的年龄为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或年龄为1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80岁或更大。在一些实施方式中，个体的年龄为、至少为、至多为或为约小于1岁、1岁或更大、5岁或更大、10岁或更大、20岁或更大、30岁或更大、40岁或更大、50岁或更大、60岁或更大、70岁或更大，或更大。在一些实施方式中，个体的年龄为或为约50岁或更大。在一些实施方式中，前述年龄群组中的1、2、3、4、5者或更多者不施用RNA分子和/或RNA-LNP。
在一些实施方式中，个体具有免疫能力。在一些实施方式中，个体免疫功能不全。
本发明提供一种本文所述的方法或用途，其中RNA分子、RNA-LNP和/或免疫原性组合物系作为疫苗施用。本发明提供一种本文所述的方法或用途，其中RNA分子、RNA-LNP和/或免疫原性组合物由皮内、肌肉内或鼻内注射施用。
经考虑，本说明书中所论述的任何实施方式可关于本发明的任何方法或组合物实施，且反之亦然。此外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。
在治疗性、诊断性或生理学目的或作用的情形下的任何方法也可描述于“用途”申请专利范围语言中，诸如本文中所论述的任何化合物、组合物或药剂用于达成或实施所描述的治疗性、诊断性或生理学目的或作用“的用途”。可基于本文所述的任何方法而采用一或多种组合物的用途。
本发明的其他目标、特征及优势将自以下实施方式而变得显而易见。然而，应理解，实施方式及特定实施例尽管指示本发明的特定实施方式，但仅以说明方式给出，因为在本发明的精神及范畴内的各种变化及修改将由此实施方式而变得对本领域技术人员显而易见。
【附图简述】
图1A～图1E显示小鼠中RSV 847的modRNA-LNP调配物的免疫原性。在第0及21天，以指示剂量，对雌性BALB/c小鼠(10只/群组)肌肉内免疫接种呈二价蛋白质亚基(RSV 847A+B)形式或呈一价(RSV 847A)或二价(RSV 847A+B)的modRNA-LNP调配物形式的RSV 847构建体。在第35天(剂量2后(PD2)2周)，收集血清用于RSV中和分析，且收集脾用于T细胞分析(ELISpot及细胞内细胞因子染色ICS分析)。图1A及图1B显示RSV A及B的中和分析结果，其表示为50％中和效价(各符号表示来自个别动物的效价。条杠表示几何平均效价(GMT))。图1C显示ELISpot分析结果，其测量分泌IFN-γ的RSV A+B F特异性细胞的数目，且表示为斑点形成细胞(SFC)/百万细胞。图1D及图1E显示ICS分析结果，其测量CD4+及CD8+T细胞内的表达RSV A+BF特异性IFN-γ的细胞，表示为IFN-γ+细胞的百分比。条杠及误差条杠描绘中位数与四分位数范围。NA：未分析。
图2显示小鼠中编码不同RSV A融合前F(preF)设计的modRNA-LNP调配物的免疫原性。在第0及21天，以0.5μg剂量，对雌性BALB/c小鼠(10只/群组)肌肉内免疫接种本文所描绘的编码RSV A融合前F(preF)设计的modRNA-LNP调配物。在第35天(2W PD2)，分析血清的RSV A中和反应，表示为50％中和效价。各符号表示来自个别动物的效价。条杠表示几何平均效价(GMT)。
图3A～图3F显示小鼠中RSV融合前F(preF)的modRNA-LNP及saRNA-LNP调配物的免疫原性。在第0及21天，以指示剂量，对雌性BALB/c小鼠(10只/群组)肌肉内免疫接种呈二价蛋白质亚基(RSV preF A+B)或二价modRNA-LNP调配物或二价saRNA-LNP调配物形式的RSVpreF构建体。在第21(3W PD1)及35天(2W PD2)，收集血清用于RSV中和分析，且在第35天收集脾脏用于T细胞分析(细胞内细胞因子染色ICS分析)。显示RSV A及B的中和分析结果，表示为在3W PD1(图3A及图3B)或2W PD2(图3C及图3D)的50％中和效价。各符号表示来自个别动物的效价。条杠表示几何平均效价(GMT)。图3E及图3F显示ICS分析结果，其测量CD4+T细胞及CD8+T细胞-内的表达RSV preF A+B F特异性IFN-γ的细胞。条杠及误差条杠描绘中位数与四分位数范围。NT：未测试。
图4示意性地绘示野生型(WT)RSV F蛋白(RSV WT)及变异RSV F蛋白构建体，其中“SP”是指信号肽序列(各构建体的氨基酸残基1～25)，“TM”是指对应于跨越细胞膜的蛋白质部分的跨膜肽序列，“CT”是指对应于延伸至细胞细胞质中的蛋白质部分的细胞质尾肽序列，且“胞外域”是指对应于延伸至细胞外空间中的蛋白质部分的肽序列，其中胞外域包含氨基酸残基1～513(无TM及CT，由“ΔTM&CT”表示)。其中指示各部分(即SP、F2、pep27、F1)的氨基酸位置或各构建体的突变，例如各构建体的SP跨越各构建体的氨基酸残基1～25。
【实施方式】
本发明提供一种RNA分子(例如RNA多核苷酸)，其包含至少一个编码呼吸道合胞体病毒(RSV)抗原的开放阅读框(ORF)。在一些实施方式中，RSV抗原为RSV多肽。在一些实施方式中，RSV多肽为RSV F多肽。在一些实施方式中，RSV多肽包含表1中所阐述的氨基酸序列。在一些实施方式中，RNA分子包含转录自表2的至少一个DNA核酸序列的ORF。在一些实施方式中，RNA分子包含含有表3的RNA核酸序列的ORF。在一些实施方式中，RNA分子包含5'帽、5′UTR、3'UTR及多A尾中的至少一者。在其他实施方式中，RNA分子包含5'帽、3′UTR及多A尾中的至少一者。本发明提供一种RNA分子，其包含经修饰的核苷酸(例如经修饰的RNA；modRNA)。
本发明提供一种免疫原性组合物，其包含编码本文所述的RSV多肽的RNA分子中的任一者，所述RNA分子与一或多种脂质复合、囊封于其中或用其调配且形成脂质纳米颗粒(RNA-LNP)。本发明进一步提供一种免疫原性组合物，其包含含有本文所述的至少一种RNA核酸的RNA分子中的任一者，所述RNA分子与一或多种脂质复合、囊封于一或多种脂质中或与一或多种脂质一起调配且形成RNA-LNP。本发明进一步提供一种经由向个体施用有效量的本文所述的RNA分子、RNA-LNP或免疫原性组合物来预防、治疗或改善个体的感染、疾病或病状(例如RSV感染相关呼吸道病症，包括肺炎及支气管炎)的方法。本发明进一步提供一种本文所述的RNA分子、RNA-LNP和/或免疫原性组合物作为疫苗的用途。
由参考以下对本发明的实施例及其中所包括的实施例的详细描述可更容易理解本发明。应理解，本发明不限于特定的制造方法，其当然可以有所变化。也应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施例的目的且不旨在为限制性的。
本文所用的章节标题仅出于组织目的且不应解释为限制所描述的主题。
本文所引用的所有参考文献，包括专利申请、专利公开、UniProtKB登录号，均以引用的方式并入本文中，如同具体地且单独地指出各个别参考文献以全文引用的方式并入本文中一般。
【I.定义的实施例】
除非本文中另外定义，否则结合本发明中使用的科学及技术术语应具有一般本领域技术人员通常所理解的含义。
在整个本申请中，术语“约”及“大致”及“实质上”系根据其在细胞及分子生物学领域中的普通且一般含义使用，以指示与其连接的一或多个值的±10％的偏差。因此，在任何所揭示实施方式中，所述术语可替换为“在”指定内容“的[百分比]内”。在一个非限制性实施方式中，该百分比包括0.1％、0.5％、1％、5％及10％。
本文中值的范围的叙述仅仅旨在充当个别地提及处于该范围内的各个别值的简写方法。除非本文中另外指示，否则各个别值均并入本说明书中，如同其在本文中个别地叙述一般。
当与术语“包含”结合使用时，字组“一(a)”或“一(an)”的使用可意谓“一个”，但其也与“一或多个”、“至少一个”及“一个或超过一个”的含义相符。
词组“和/或”意谓“及”或“或”。举例而言，A、B和/或C包括：单独的A、单独的B、单独的C、A与B的组合、A与C的组合、B与C的组合或A、B及C的组合。换言之，“和/或”作为包括性或操作。
词组“基本上全部”定义为“至少95％”；若群组的基本上全部成员具有某一特性，则该群组的至少95％成员具有该特性。在一些实施方式中，基本上全部意谓等于以下中的任一者、以下中的至少任一者或在以下中的任何两者之间的群组成员具有该特性：95％、96％、97％、98％、99％或100％。
组合物及其使用方法可“包含”、“基本上由…组成”或“由…组成”：在整个本说明书中所揭示的成分或步骤中的任一者。在整个本说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprising)”(及包含的任何形式，诸如“包含(comprise)”及“包含(comprises)”)、“具有(having)”(及具有的任何形式，诸如“具有(have)”及“具有(has)”)、“包括(including)”(及包括的任何形式，诸如“包括(includes)”及“包括(include)”)或“含有(containing)”(及含有的任何形式，诸如“含有(contains)”及“含有(contain)”)为包括性或开放性的，且应理解为暗示包括所陈述步骤或要素或者步骤或要素的群组，但不排除包括任何其他步骤或要素或者步骤或要素的群组。经考虑，本文在术语“包含”的上下文中描述的实施方式也可在术语“由…组成”或“基本上由…组成”的上下文中实施。“基本上由”所揭示的成分或步骤中的任一者“组成”的组合物及方法将申请专利范围的范畴限制于不实质影响所主张发明的基本及新颖特征的指定材料或步骤。词语“由…组成(consistingof)”(及由…组成的任何形式，诸如“由…组成(consist of)”及“由…组成(consistsof)”)意谓包括且限于接在词组“由…组成”后面的任何内容。因此，词组“由…组成”指示所列要素为所需或必选的，且不可存在其他要素。
在整个本说明书中对“一个实施方式”、“一实施方式”、“特定实施方式”、“相关实施方式”、“某一实施方式”、“额外实施方式”或“另一实施方式”或其组合的提及意谓结合该实施方式描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方式中。因此，前述词组在整个本说明书中各处的出现未必皆指代同一实施方式。此外，特定特征、结构或特性可在一或多个实施方式中以任何适合方式组合。
术语“抑制(inhibiting)”、“降低(decreasing)”或“减小(reducing)”或这些术语的任何变化形式包括任何可测量的降低(例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％降低)或完全抑制以达成所需结果。术语“改良/提高(improve)”、“促进(promote)”或“增加(increase)”或这些术语的任何变化形式包括任何可测量增加(例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％增加)以达成蛋白质或分子的所需结果或产量。
如本文所用，术语“参考”、“标准”或“对照”描述相对于其进行比较的值。举例而言，将药剂、个体、群体、样品或所关注值与参考、标准或对照药剂、个体、群体、样品或所关注值进行比较。参考、标准或对照可实质上同时进行测试和/或测定和/或与药剂、个体、群体、样品或所关注值的所关注测试或测定一起，和/或可在与评定下的药剂、个体、群体、样品或所关注值相当的条件或情况下测定或表征。
术语“经分离”可指实质上不含其起源来源的细胞材料、细菌材料、病毒材料或培养基(当由重组DNA技术产生时)、或化学前体或其他化学物质(当以化学方式合成时)的核酸或多肽。此外，经分离化合物是指可以经分离化合物形式向个体施用的化合物；换言之，若化合物粘附至管柱或嵌入于琼脂糖凝胶中，则其不可简单地视为“经分离”。此外，“经分离核酸片段”或“经分离肽”为天然不以片段形式存在和/或通常不呈功能状态和/或经由人工干预自天然状态改变或移除的核酸或蛋白质片段。举例而言，天然存在于活动物中的DNA并非“经分离”的，但合成DNA或自其天然状态的共存材料部分或完全分离的DNA为“经分离”的。经分离核酸可以实质上经纯化的形式存在，或可存在于非天然环境(诸如已递送核酸至其中的细胞)中。
如本文所用，“核酸”为包含核酸组分的分子，且是指DNA或RNA分子。其可与术语“多核苷酸”互换使用。核酸分子为包含核苷酸单体或由核苷酸单体组成的聚合物，所述核苷酸单体由糖/磷酸酯主链的磷酸二酯键彼此共价连接。核酸也可涵盖经修饰的核酸分子，诸如碱基修饰、糖修饰或主链修饰等DNA或RNA分子。核酸可以各种形式存在，诸如：并入序列的经分离的区段及重组载体或编码多肽(诸如抗原或抗体的一或两条链、或其片段、衍生物、突变蛋白或变体)的重组多核苷酸；足够用作杂交探针的多核苷酸；PCR引物或用于鉴别、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸的测序引物；用于抑制本文前文所描述的多核苷酸、mRNA、saRNA、modRNA及互补序列的表达的反义核酸。核酸可编码抗体可结合的表位。
术语“表位”是指被免疫球蛋白(例如抗体或受体)结合组分特异性识别的部分。在一些实施方式中，表位包含抗原上的多个化学原子或基团。在一些实施方式中，当抗原采用相关三维构形时，此类化学原子或基团为表面暴露的。在一些实施方式中，当抗原采用此类构形时，此类化学原子或基团在空间中以物理方式彼此接近。在一些实施方式中，当抗原采用替代构形(例如经线性化)时，至少一些此类化学原子或基团以物理方式彼此分开。
核酸可为单链或双链，且可包含RNA和/或DNA核苷酸以及其人工变体(例如肽核酸)。在一些情况下，核酸序列可编码具有其他异源编码序列的多肽序列，例如以实现多肽的纯化、运输、分泌、翻译后修饰，或实现治疗益处，诸如靶向或功效。可向经修饰的多肽编码序列中添加标签或其他异源多肽，其中“异源”是指与经修饰多肽不同的多肽。
术语“多核苷酸”是指一种核酸分子，其可为重组的或已自总基因组核酸分离。术语“多核苷酸”内包括寡核苷酸(100个残基或更少残基长度的核酸)、重组载体(包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒)等。在某些实施方式中，多核苷酸包括与其天然存在的基因或蛋白质编码序列实质上分离的调控序列。多核苷酸可为单链(编码或反义)或双链的，且可为RNA、DNA(基因组、cDNA或合成的)、其类似物或其组合。额外编码或非编码序列可(但未必)存在于多核苷酸内。
在某些实施方式中，存在与本文所揭示的序列具有实质上同一性的多核苷酸变体；使用本文所述的方法(例如使用标准参数的BLAST分析)，与本文提供的多核苷酸序列相比包含等于以下中的任一者、以下中的至少任一者、以下中的至多任一者或以下中的任何两者之间的序列同一性的那些：70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高。在某些实施方式中，经分离多核苷酸将包含编码在整个序列长度上与本文所述的氨基酸序列具有至少90％同一性的多肽的核苷酸序列；或与该经分离多核苷酸互补的核苷酸序列。在一些实施方式中，经分离多核苷酸将包含编码在整个序列长度上与本文所述的氨基酸序列具有至少95％同一性的多肽的核苷酸序列；或与该经分离多核苷酸互补的核苷酸序列。
与编码序列本身的长度无关，核酸区段可与其他核酸序列(诸如启动子、多腺苷酸化信号、其他限制酶位点、多克隆位点、其他编码区段等)组合，使得其整体长度可显著变化。核酸可具有任何长度。所述核酸的长度可例如等于以下中的任一者、以下中的至少任一者、以下中的至多任一者或以下中的任何两者之间：5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1500、3000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000或更多个核苷酸；和/或可包含一或多个额外序列(例如调节序列)；和/或可为较大核酸(例如载体)的一部分。因此考虑可使用几乎任何长度的核酸片段，其中总长度受制备简易性及预期重组核酸方案中的用途限制。
就此而言，术语“基因”用于指编码蛋白质、多肽或肽的核酸(包括恰当转录、翻译后修饰或定位所需的任何序列)。如本领域技术人员将理解，此术语涵盖基因组序列、表达盒、cDNA序列及较小的经工程改造的核酸区段，其表达或可经调适以表达蛋白质、多肽、域、肽、融合蛋白及突变体。编码全部或一部分多肽的核酸可含有编码全部或一部分此类多肽的连续核酸序列。也考虑特定多肽可由含有变化的核酸编码，所述核酸具有略微不同的核酸序列，但仍编码相同或实质上类似的多肽。
如本文所用，术语核酸序列的“表达”是指核酸序列产生任何基因产物。在一些实施方式中，基因产物可为转录本。在一些实施方式中，基因产物可为多肽。在一些实施方式中，核酸序列的表达涉及以下中的一或多者：(1)自DNA序列产生RNA模板(例如由转录)；(2)加工RNA转录本(例如由剪接、编辑等)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；和/或(4)翻译后修饰多肽或蛋白质。
一般而言，术语“经工程改造”是指已人工操控的实施方式。举例而言，当未以自然界中的顺序连接在一起的两个或更多个序列由人工操控以在经工程改造的多核苷酸中彼此直接连接时，和/或当多核苷酸中的特定残基为非天然存在的和/或系经由人工的作用引起与在自然界中其未连接的实体或部分连接时，多核苷酸被视为“经工程改造”。
如本文所用，术语“DNA”意谓包含诸如脱氧腺苷单磷酸、脱氧胸苷单磷酸、脱氧鸟苷单磷酸及脱氧胞苷单磷酸单体的核苷酸的核酸分子，所述核苷酸由糖部分(脱氧核糖)、碱基部分及磷酸部分构成，且由特征性主链结构聚合。主链结构通常由第一相邻单体的核苷酸的糖部分(例如脱氧核糖)与第二相邻单体的磷酸部分之间的磷酸二酯键形成。单体的特定顺序(例如连接至糖/磷酸主链的碱基的顺序)被称为DNA序列。DNA可为单链或双链。在双链形式中，第一链的核苷酸通常例如由A/T碱基配对及G/C碱基配对与第二链的核苷酸杂交。DNA可包含全部或大部分脱氧核糖核苷酸残基。如本文所用，术语“脱氧核糖核苷酸”意谓在β-D-呋喃核糖基的2′位置处缺乏羟基的核苷酸。在无任何限制的情况下，DNA可涵盖双链DNA、反义DNA、单链DNA、经分离DNA、合成DNA、以重组方式产生的DNA及经修饰的DNA。
如本文所用，术语“RNA”意谓包含诸如腺苷单磷酸、尿苷单磷酸、鸟苷单磷酸及胞苷单磷酸单体的核苷酸的核酸分子，所述核苷酸沿着所谓的主链彼此连接。主链由第一单体的糖(例如核糖)与第二相邻单体的磷酸部分之间的磷酸二酯键形成。RNA可例如在细胞内由DNA序列的转录获得。在真核细胞中，转录通常在细胞核或粒线体内进行。在活体内，DNA的转录可产生未成熟RNA，其被加工成信使RNA(mRNA)。例如在真核生物体中对未成熟RNA的加工包含各种转录后修饰，诸如剪接、5′加帽、多腺苷酸化、自细胞核或粒线体输出。加工成熟信使RNA且提供可翻译成肽或蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列。成熟mRNA可包含5′帽、5'UTR、开放阅读框、3′UTR及多腺苷酸尾序列。RNA可包含全部或大部分核糖核苷酸残基。如本文所用，术语“核糖核苷酸”意谓在β-D-呋喃核糖基的2'位置处具有羟基的核苷酸。在一个实施方式中，RNA可为与编码肽或蛋白质的RNA转录本相关的信使RNA(mRNA)。如本领域技术人员已知，mRNA一般含有5′非翻译区(5′UTR)、多肽编码区及3'非翻译区(3'UTR)。在无任何限制的情况下，RNA可涵盖双链RNA、反义RNA、单链RNA、经分离RNA、合成RNA、以重组方式产生的RNA及经修饰的RNA(modRNA)。
“经分离RNA”定义为一种RNA分子，其可为重组的或已自总基因组核酸分离。经分离RNA分子或蛋白质可以实质上经纯化的形式存在，或可存在于非天然环境(诸如宿主细胞)中。
“经修饰RNA”或“modRNA”是指与天然存在的RNA相比具有一或多个核苷酸的至少一个添加、缺失、取代和/或改变的RNA分子。此类改变可指将非核苷酸材料添加至内部RNA核苷酸，或添加至RNA的一或多个5'和/或3'端。在一个实施方式中，此类modRNA含有至少一个经修饰核苷酸，诸如核苷酸的碱基的改变。举例而言，经修饰核苷酸可置换一或多个尿苷和/或胞苷核苷酸。举例而言，这些置换可针对RNA序列中的尿苷和/或胞苷的每个例项进行，或可仅针对所选择尿苷和/或胞苷核苷酸进行。RNA中标准核苷酸的此类改变可包括非标准核苷酸，诸如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。举例而言，RNA序列中的至少一个尿苷核苷酸可经N1-甲基假尿苷置换。其他此类经改变的核苷酸为本领域技术人员已知的。此类经改变的RNA分子被视为天然存在的RNA的类似物。在一些实施方式中，RNA由使用DNA模板进行活体外转录而产生，其中DNA是指含有脱氧核糖核苷酸的核酸。在一些实施方式中，RNA可为复制子RNA(复制子)，尤其自复制RNA或自扩增RNA(saRNA)。
如本文中所涵盖，不受任何限制，RNA可用作治疗和/或预防哺乳动物(包括人类)的多种病状的治疗模态。本文所述的方法包含向哺乳动物(诸如人类)施用本文所述的RNA。举例而言，在一个实施方式中，使用RNA的此类方法包括编码抗原的RNA疫苗以诱导稳定中和抗体及随附/伴随的T细胞反应，从而达成保护性免疫接种。在一些实施方式中，施用最小疫苗剂量以诱导稳固中和抗体及伴随/相伴T细胞反应以达成保护性免疫接种。在一个实施方式中，所施用的RNA为活体外转录的RNA。举例而言，此类RNA可用于编码至少一种旨在在该哺乳动物中产生免疫反应的抗原。病原性抗原为来源于与传染病相关的病原体的肽或蛋白质抗原。在特定实施方式中，病原性物质为来源于RSV的肽或蛋白质抗原。可用本文所揭示的RNA治疗的病状和/或疾病包括但不限于由病毒感染引起和/或受其影响的那些。此类病毒包括但不限于RSV。
如本文所用，“预防(Prevent)”或“预防(prevention)”当结合疾病、病症和/或病状的出现使用时，是指减少罹患疾病、病症和/或病状的风险和/或延迟该疾病、病症或病状的一或多个特征或症状的发作。当疾病、病症或病状的发作已延迟预定时段时，可认为预防完成。
如将自上下文理解，疾病、病症和/或病状的“风险”是指特定个体将罹患该疾病、病症和/或病状的可能性。在一些实施方式中，风险表示为百分比。在一些实施方式中，风险为、至少为或至多为0、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％直至100％。在一些实施方式中，风险表示为相对于与参考样品或参考样品群组相关的风险的风险。在一些实施方式中，参考样品或参考样品群组具有疾病、病症、病状和/或事件的已知风险。在一些实施方式中，参考样品或参考样品群组来自与特定个体类似的个体。在一些实施方式中，风险可反映一或多种遗传属性，例如其可使个体倾向于罹患(或不罹患)特定疾病、病症和/或病状。在一些实施方式中，风险可反映一或多种表观遗传事件或属性和/或一或多种生活方式或环境事件或属性。易患上(Susceptibleto)：“易患上”疾病、病症和/或病状的个体为罹患该疾病、病症和/或病状的风险高于一般公众成员的个体。在一些实施方式中，易患上疾病、病症和/或病状的个体可能尚未诊断出该疾病、病症和/或病状。在一些实施方式中，易患上疾病、病症和/或病状的个体可展现该疾病、病症和/或病状的症状。在一些实施方式中，易患上疾病、病症和/或病状的个体可能不展现该疾病、病症和/或病状的症状。在一些实施方式中，易患上疾病、病症和/或病状的个体将罹患该疾病、病症和/或病状。在一些实施方式中，易患上疾病、病症和/或病状的个体将不罹患该疾病、病症和/或病状。
术语“蛋白质”、“多肽”或“肽”在本文中用作同义词且是指氨基酸单体的聚合物，例如包含至少两个氨基酸残基的分子。多肽可包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、异种同源物、同种同源物、片段及前述者的其他等效物、变体及类似物。多肽可为单分子或可为多分子复合物，诸如二聚体、三聚体或四聚体。蛋白质包含一或多种肽或多肽，且可折叠成蛋白质发挥其生物功能可能需要的3维形式。
如本文所用，术语“野生型”或“WT”或“天然”是指在生物体中天然存在的分子的内源性形式。在一些实施方式中，采用蛋白质或多肽的野生型形式，然而在本发明的其他实施方式中，使用经修饰的蛋白质或多肽来产生免疫反应。上文所描述的术语可互换地使用。
“经修饰的蛋白质”或“经修饰的多肽”或“变体”是指其化学结构，尤其其氨基酸序列相对于野生型蛋白质或多肽改变的蛋白质或多肽。在一些实施方式中，经修饰的蛋白质/变异蛋白或多肽具有至少一种经修饰的活性或功能(认识到蛋白质或多肽可具有多种活性或功能)。尤其考虑，经修饰/变异蛋白或多肽可相对于一种活性或功能改变，但在其他实施方式中保留野生型活性或功能，诸如免疫原性。当在本文中特定提及蛋白质时，其一般是指天然(野生型)或重组(经修饰)蛋白质。蛋白质可自天然的生物体直接分离，由重组DNA/外源性表达方法产生或由固相肽合成(solid-phase peptide synthesis；SPPS)或其他活体外方法产生。在特定实施方式中，存在经分离核酸区段及重组载体，其并有编码多肽(例如抗原或其片段)的核酸序列。术语“重组”可与多肽或特定多肽的名称结合使用，且此一般是指由已经活体外操控的核酸分子产生的多肽或作为此类分子的复制产物的多肽。
参考氨基酸序列(肽或蛋白质)的术语“片段”是指氨基酸序列的一部分，即表示在N端和/或C端处缩短的氨基酸序列的序列。在C端处缩短的片段(N端片段)可例如由翻译缺乏开放阅读框的3′端的截短开放阅读框而获得。在N端处缩短的片段(C端片段)可例如由翻译缺乏开放阅读框的5'端的截短开放阅读框而获得，只要截短开放阅读框包含用以起始翻译的起始密码子即可。氨基酸序列的片段包含例如来自氨基酸序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％的氨基酸残基。在本发明中，多肽、DNA核酸或RNA核酸序列的片段是指与其所来源的多肽、DNA核酸或RNA核酸序列具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间的序列同一性的序列：5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一个实施方式中，多肽、DNA核酸或RNA核酸序列的片段是指与其所来源的多肽、DNA核酸或RNA核酸序列具有至少70％的序列同一性的序列。在一个实施方式中，多肽、DNA核酸或RNA核酸序列的片段是指与其所来源的多肽、DNA核酸或RNA核酸序列具有至少80％的序列同一性的序列。在一个实施方式中，多肽、DNA核酸或RNA核酸序列的片段是指与其所来源的多肽、DNA核酸或RNA核酸序列具有至少85％的序列同一性的序列。在一个实施方式中，多肽、DNA核酸或RNA核酸序列的片段是指与其所来源的多肽、DNA核酸或RNA核酸序列具有至少90％的序列同一性的序列。在一个实施方式中，多肽、DNA核酸或RNA核酸序列的片段是指与其所来源的多肽、DNA核酸或RNA核酸序列具有至少95％的序列同一性的序列。在一个实施方式中，多肽、DNA核酸或RNA核酸序列的片段是指与其所来源的多肽、DNA核酸或RNA核酸序列具有至少97％的序列同一性的序列。在一个实施方式中，多肽、DNA核酸或RNA核酸序列的片段是指与其所来源的多肽、DNA核酸或RNA核酸序列具有至少99％的序列同一性的序列。
如本文在分子(例如核酸、蛋白质或小分子)的上下文中所使用，术语“变体/变异(variant)”是指显示与参考分子的显著结构同一性但在结构上与该参考分子不同的分子，例如与参考实体相比在一或多个化学部分的存在或不存在方面或在一或多个化学部分的含量方面不同。在一些实施方式中，变体也在功能上与其参考分子不同。一般而言，特定分子是否恰当地视为参考分子的“变体”是基于其与参考分子的结构同一性的程度。如本领域技术人员将了解，任何生物或化学参考分子均具有某些特征结构组件。按照定义，变体为与参考分子共有一或多个此类特征结构组件但在至少一个实施方式上与参考分子不同的不同分子。在一些实施方式中，由于氨基酸或核苷酸序列中的一或多个差异和/或作为多肽或核酸的共价组分(例如与多肽或核酸主链连接)的化学部分(例如碳水化合物、脂质、磷酸酯基团)中的一或多个差异，变异多肽或核酸可能与参考多肽或核酸不同。在一些实施方式中，变异多肽或核酸与参考多肽或核酸显示至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间的总体序列同一性：85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％。在一些实施方式中，变异多肽或核酸不与参考多肽或核酸共有至少一个特征序列组件。在一些实施方式中，参考多肽或核酸具有一或多种生物活性。在一些实施方式中，变异多肽或核酸共有参考多肽或核酸的生物活性中的一或多者。在一些实施方式中，变异多肽或核酸缺乏参考多肽或核酸的生物活性中的一或多者。在一些实施方式中，变异多肽或核酸与参考多肽或核酸相比显示一或多种生物活性水平的降低。在一些实施方式中，若所关注多肽或核酸的氨基酸或核苷酸序列与参考多肽或核酸的氨基酸或核苷酸序列一致但具有特定位置处的少数序列改变，则将其视为参考多肽或核酸的“变体”。优选地，变异多肽或核酸序列与参考多肽或核酸序列相比具有至少一个修饰，例如1～约20个修饰。在一个实施方式中，变异多肽或核酸序列与参考多肽或核酸序列相比具有1～约10个修饰。在一个实施方式中，变异多肽或核酸序列与参考多肽或核酸序列相比具有1～约5个修饰。在一个实施方式中，变异多肽或核酸序列与参考多肽或核酸序列相比具有1～约4个修饰。通常，与参考相比，变体中少于约20％、约15％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％或约2％的残基经取代、插入或缺失。通常，相对于参考，变异多肽或核酸包含极少数目个(例如少于约5、约4、约3、约2或约1个)经取代、插入或缺失的功能性残基(例如参与特定生物活性的残基)。在一些实施方式中，与参考相比，变异多肽或核酸包含约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2或约1个经取代的残基。在一些实施方式中，与参考相比，变异多肽或核酸包含少于约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约10、约9、约8、约7、约6个且通常少于约5、约4、约3或约2个添加或缺失。在一些实施方式中，与参考相比，变异多肽或核酸包含不超过约5、约4、约3、约2或约1个添加或缺失，且在一些实施方式中，不包含添加或缺失。
在一些实施方式中，参考多肽或核酸为自然界中存在的“野生型”或“WT”或“天然”序列，包括等位基因变异。野生型多肽或核酸序列具有未经有意修饰的序列。出于本发明的目的，氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的“变体”包含氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸取代变体。核苷酸序列的“变体”包含核苷酸插入变体、核苷酸添加变体、核苷酸缺失变体和/或核苷酸取代变体。术语“变体”包括所有突变体、剪接变体、翻译后修饰变体、构形、同功异型物、等位基因变体、物种变体及物种同源物，特别而言，天然存在的上述物质。术语“变体”尤其包括氨基酸或核酸序列的片段。
可由突变向核酸中引入改变，从而引起该核酸所编码的多肽(例如抗原或抗体或抗体衍生物)的氨基酸序列的改变。突变可使用此项技术中已知的任何技术引入。在一个实施方式中，使用例如定点突变诱发方案来改变一或多个特定氨基酸残基。在另一实施方式中，使用例如随机突变诱发方案来改变一或多个随机选择的残基。在一些实施方式中，无论以何种方式进行，可针对所需特性来表达及筛选突变多肽。
可在不显著改变核酸所编码的多肽的生物活性的情况下将突变引入核酸中。举例而言，可进行在非必需氨基酸残基处引起氨基酸取代的核苷酸取代。或者，可将选择性改变核酸所编码的多肽的生物活性的一或多个突变引入核酸中。举例而言，突变可定量或定性地改变生物活性。定量改变的实施例包括增加、降低或消除活性。定性改变的实施例包括改变抗体的抗原特异性。
“序列相似性”指示一致的或表示保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”指示序列之间一致的氨基酸的百分比。两个核酸序列之间的“序列同一性”指示序列之间一致的核苷酸的百分比。
术语“一致％(％identical)”、“同一性％(％identity)”或类似术语旨在尤其指待比较的序列之间最佳比对中一致的核苷酸或氨基酸的百分比。该百分比纯粹为统计的，且两个序列之间的差异可能但未必随机分布于所比较的序列的整个长度上。两个序列的比较通常由在最佳比对后相对于比较片段或“窗口”比较序列来进行，以便鉴别相应序列的局部区域。用于比较的最佳比对可手动地或借助于Smith及Waterman,1981,Ads App.Math.2,482的局部同源性算法、借助于Neddleman及Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法、借助于Pearson及Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 88，2444的相似性搜寻算法、或借助于使用所述算法的计算机程序(在Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N及TFASTA，Genetics Computer Group)进行。在一些实施方式中，使用可在United States National Center for Biotechnology Information(NCBI)网站获得的BLASTN或BLASTP算法测定两个序列的同一性百分比。
同一性百分比由测定所比较的序列中的对应的相同位置的数目，将此数值除以所比较的位置数(例如，参考序列中的位置数)且将此结果乘以100来获得。
在一些实施方式中，针对参考序列的整个长度的至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间的区域给出相似性或同一性程度：约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。举例而言，若参考核酸序列由200个核苷酸组成，则针对至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间的核苷酸(在一些实施方式中，连续核苷酸)给出同一性程度：约100、约120、约140、约160、约180或约200个。在一些实施方式中，针对参考序列的整个长度给出相似性或同一性程度。
同源氨基酸序列可展现至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间的氨基酸残基的同一性：40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。在一个实施方式中，同源氨基酸序列展现氨基酸残基的至少95％同一性。在一个实施方式中，同源氨基酸序列展现氨基酸残基的至少98％同一性。在一个实施方式中，同源氨基酸序列展现氨基酸残基的至少99％同一性。
氨基酸序列(肽或蛋白质)的片段或变体可为“功能片段”或“功能变体”。术语氨基酸序列的“功能片段”或“功能变体”是指展现出与其所来源的氨基酸序列相同或类似的一或多种功能特性的任何片段或变体，例如其为功能上等效的。关于抗原或抗原序列，一种特定功能为由片段或变体所来源的氨基酸序列呈现的一或多种免疫原性活性。如本文所用，术语“功能片段”或“功能变体”尤其是指包含氨基酸序列的变体分子或序列，该氨基酸序列与亲本分子或序列相比具有一或多个氨基酸的变化且仍能够实现亲本分子或序列的一或多种功能，例如诱导免疫反应。在一个实施方式中，亲本分子或序列的氨基酸序列中的修饰未显著影响或改变该分子或序列的特征。野生型RSV F蛋白的术语“突变体”、RSV F蛋白的“突变体”、“RSV F蛋白突变体”或“经修饰的RSV F蛋白”是指相对于野生型F蛋白呈现所引入突变且针对野生型F蛋白具有免疫原性的多肽。
“来源于”指定氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)是指第一氨基酸序列的来源。优选地，来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定序列或其片段一致、基本上一致或同源的氨基酸序列。来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列可为该特定序列或其片段的变体。举例而言，一般本领域技术人员应理解，可改变适用于本文中的抗原，使得其在序列上与其所来源的天然存在的序列或天然序列不同，同时保留天然序列的所需活性。
在本发明中，载体是指核酸分子，诸如人工核酸分子。载体可用于并入核酸序列，诸如包含开放阅读框的核酸序列。载体包括但不限于储存载体、表达载体、克隆载体、转移载体。载体可为RNA载体或DNA载体。在一些实施方式中，载体为DNA分子。在一些实施方式中，载体为质粒载体。在一些实施方式中，载体为病毒载体。通常，表达载体将含有所需编码序列及在特定宿主生物体(例如细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)中或在活体外表达系统中表达可操作地连接的编码序列所必需的适当其他序列。克隆载体通常用以工程改造及扩增某一所需片段(通常DNA片段)，且可缺乏表达一或多种所需片段所需要的功能性序列。
如本文所用，术语“医药组合物”是指与一或多种医药学上可接受的载剂一起调配的活性剂。医药组合物可为免疫原性组合物。在一些实施方式中，活性剂以适合施用的单位剂量的量存在于治疗方案中，其在向相关群体施用时显示出统计学上显著的达成预定治疗作用的机率。在一些实施方式中，医药组合物可专门调配用于非经肠施用，以例如无菌溶液或悬浮液、或持续释放调配物形式，例如由皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射。
如本文所用，术语“疫苗接种”是指施用旨在产生免疫反应的免疫原性组合物，例如疾病相关(例如致病)药剂(例如病毒)。在一些实施方式中，疫苗接种可在暴露于疾病相关药剂之前、期间和/或之后施用，且在某些实施方式中，在暴露于该药剂之前、期间和/或之后不久施用。在一些实施方式中，疫苗接种包括在时间上适当间隔开地多次施用疫苗组合物。在一些实施方式中，疫苗接种产生针对传染原的免疫反应。在一些实施方式中，疫苗接种产生针对肿瘤的免疫反应；在一些此类实施方式中，疫苗接种为“个人化”的，因为其部分或完全针对经测定在特定个体的肿瘤中存在的一或多种表位(例如其可为或包括一或多种新表位)。
免疫反应是指生物体中的体液反应、细胞反应或体液反应及细胞反应两者。免疫反应可由包括但不限于以下的分析测量：测量特异性识别蛋白质或细胞表面蛋白的抗体的存在或量的分析、测量T细胞活化或增殖的分析、和/或测量关于一或多种细胞因子的活性或表达的调节的分析。
如本文所用，术语“组合疗法”是指个体同时暴露于两种或更多种治疗方案(例如两种或更多种治疗剂)的那些情况。在一些实施方式中，两种或更多种方案可同时施用；在一些实施方式中，此类方案可依序施用(例如第一方案的全部“剂量”在施用第二方案的任何剂量之前施用)；在一些实施方式中，此类药剂以重叠施用方案施用。在一些实施方式中，组合疗法的“施用”可涉及向接受呈组合形式的一或多种其他药剂或一或多种模态(modality)的个体施用一或多种药剂或一或多种模态。出于清楚起见，组合疗法不需要个别药剂以单一组合物形式一起施用(或甚至必须在同时)，但在一些实施方式中，两种或更多种药剂或其活性部分可以组合组合物形式或甚至以组合化合物形式(例如作为单一化学复合物或共价实体的一部分)一起施用。
本领域技术人员将了解，术语“施用方案”可用以是指个别地向个体施用的一组单位剂量(通常超过一个)，其通常间隔一段时间。在一些实施方式中，给定治疗剂具有推荐的施用方案，其可涉及一或多次剂量。在一些实施方式中，施用方案包含多个剂量，所述剂量中的各者在时间上与其他剂量分隔开。在一些实施方式中，个别剂量彼此间隔长度相同的时段；在一些实施方式中，施用方案包含多个剂量及分隔开个别剂量的至少两个不同时段。在一些实施方式中，施用方案内的所有剂量均具有相同单位剂量的量。在一些实施方式中，施用方案内的不同剂量具有不同的量。在一些实施方式中，施用方案包含第一剂量的量的第一剂量，接着为不同于第一剂量的量的第二剂量的量的一或多次额外剂量。在一些实施方式中，施用方案包含第一剂量的量的第一剂量，接着为与第一剂量的量相同的第二剂量的量的一或多次额外剂量。在一些实施方式中，施用方案在跨越相关群体施用时与所需或有益结果相关(例如为治疗性施用方案)。
【II.呼吸道合胞体病毒(RSV)】
本发明提供RNA分子(例如RNA多核苷酸)，其包含至少一个编码呼吸道合胞体病毒(RSV)多肽的开放阅读框。本发明进一步提供一种免疫原性组合物，其包含至少一种编码RSV多肽的RNA分子，所述RNA分子与一或多种脂质复合、囊封于其中或用其调配且形成脂质纳米颗粒(LNP)。本文所揭示的免疫原性组合物中所包括的RSV多肽可为呈融合前构形的任何RSV F蛋白。
术语“融合前构形”是指(i)当RSV F蛋白或突变体呈单体或三聚体形式时可由抗体D25或AM22特异性结合，或(ii)当RSV F蛋白突变体呈三聚体形式时由抗体AM14特异性结合的RSV F蛋白或其突变体所采用的结构性构形。融合前三聚体构形为融合前构形的子集。如本文所用，呈融合前构形的RSV F蛋白或多肽或其突变体可表示为“RSV preF”。
术语“融合后构形”是指不由D25、AM22或AM14特异性结合的RSV F蛋白所采用的结构性构形。天然F蛋白在病毒套膜与宿主细胞膜融合之后采用融合后构形。当自膜萃取时，当表达为胞外域时，或在储存后，RSV F蛋白也可在融合事件的情形的外呈现融合后构形，例如在胁迫条件(诸如加热及低渗透压)下。术语“AM14”是指WO 2008/147196A2(其以全文引用的方式并入本文中)中所描述的抗体。术语“AM22”是指WO 2011/043643 A1(其以全文引用的方式并入本文中)中所描述的抗体。术语“D25”是指WO 2008/147196 A2(其在此以全文引用的方式并入本文中)中所描述的抗体。
在一些实施例中，RSV F蛋白为亚型A的RSV F蛋白。在一些实施例中，RSV F蛋白为亚型B的RSV F蛋白。如本文所用，术语“亚型”及“亚组”可互换地使用。如本文所用，术语“株系(strain)”是指各亚型或亚组内的特定分离株。在一些实施例中，RSV F蛋白为野生型RSVF蛋白的突变体。在一些实施例中，RSV F蛋白为亚型A的野生型RSV F蛋白的突变体。在一些实施例中，RSV F蛋白为亚型B的野生型RSV F蛋白的突变体。在一些实施例中，突变体相对于对应野生型RSV F蛋白的氨基酸序列在氨基酸序列中呈现所引入的突变，且针对呈融合前构形的野生型RSV F蛋白或针对包含野生型F蛋白的病毒具有免疫原性。相对于野生型RSV F蛋白，突变体中的氨基酸突变包括氨基酸取代、缺失或添加。
在一些实施例中，RSV F蛋白为WO2017/109629(其以全文引用的方式并入本文中)中所描述的RSV蛋白突变体。
在一些实施例中，RSV F蛋白为野生型RSV F蛋白的突变体，其中所引入氨基酸突变为野生型RSV F蛋白中的一对氨基酸残基突变为一对半胱氨酸(“经工程改造的二硫键突变”)。所引入半胱氨酸残基对允许在半胱氨酸残基之间形成二硫键，其使蛋白质的构形或寡聚状态(诸如融合前构形)稳定。特定的此类突变对的实施例包括：55C及188C；155C及290C；103C及148C；及142C及371C，诸如S55C及L188C；S155C及S290C；A103C及I148C；及L142C及N371C。
在另其他实施例中，RSV F蛋白突变体包含作为一或多种空腔填充突变的氨基酸突变。可经空腔填充的目标置换的氨基酸的实施例包括小脂族(例如Gly、Ala及Val)或小极性氨基酸(例如Ser及Thr)，以及融合前构形中埋入但融合后构形中暴露于溶剂的氨基酸。置换氨基酸的实施例包括较大脂族氨基酸(Ile、Leu及Met)或较大芳族氨基酸(His、Phe、Tyr及Trp)。在一些特定实施例中，RSV F蛋白突变体包含选自由以下组成的组的空腔填充突变：
(1)在位置55、62、155、190或290的S经I、Y、L、H或M取代；
(2)在位置54、58、189、219或397的T经I、Y、L、H或M取代；
(3)在位置151的G经A或H取代；
(4)在位置147或298的A经I、L、H或M取代；
(5)在位置164、187、192、207、220、296、300或495的V经I、Y、H取代；及
(6)在位置106的R经W取代。
在一些特定实施例中，RSV F蛋白突变体包含至少一个选自由以下组成的组的空腔填充突变：T54H、S190I及V296I。
在另其他实施例中，RSV F蛋白突变体包含静电突变，其降低折叠结构中彼此接近的蛋白质中的残基之间的离子排斥或增加其间的离子吸引。在若干实施例中，RSV F蛋白突变体包括降低与来自RSV F三聚体的另一原聚体的Glu487及Asp489的酸性残基的排斥性离子相互作用或增加与其的吸引性离子相互作用的静电取代。在一些特定实施例中，RSV F蛋白突变体包含选自由以下组成的组的静电突变：
(1)在位置82、92或487的E经D、F、Q、T、S、L或H取代；
(2)在位置315、394或399的K经F、M、R、S、L、I、Q或T取代；
(3)在位置392、486或489的D经H、S、N、T或P取代；及
(4)在位置106或339的R经F、Q、N或W取代。
在另其他实施例中，RSV F蛋白突变体包含选自以下的两种或更多种不同类型的突变的组合：经工程改造的二硫键突变、空腔填充突变及静电突变。在一些特定实施例中，RSV F蛋白突变体包含相对于对应野生型RSV F蛋白的突变的组合，其中突变的组合选自由以下组成的组：：
(1)A103C、I148C、S190I及D486S的组合；
(2)T54H、S55C、L188C、D486S的组合；
(3)T54H、A103C、I148C、S190I、V296I及D486S的组合；
(4)T54H、S55C、L142C、L188C、V296I及N371C的组合；
(5)S55C、L188C及D486S的组合；
(6)T54H、S55C、L188C及S190I的组合；
(7)S55C、L188C、S190I及D486S的组合；
(8)T54H、S55C、L188C、S190I及D486S的组合；
(9)S155C、S190I、S290C及D486S的组合；
(10)T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、N371C、D486S、E487Q及D489S的组合；
(11)T54H、S155C、S190I、S290C及V296I的组合；及
(12)S155C、S190F、S290C及V207L的组合。
在一些实施例中，RSV F蛋白具有亚型A，且包含突变S155C、S190F、S290C及V207L。
在一些实施例中，RSV F蛋白具有亚型B，且包含突变S155C、S190F、S290C及V207L。
在一些实施例中，RSV F蛋白具有亚型A，且包含突变S155C、S190F及S290C。
在一些实施例中，RSV F蛋白具有亚型B，且包含突变S155C、S190F及S290C。
在一些实施例中，RSV F蛋白具有亚型A，且包含突变A103C、I148C、S190I及D486S。
在一些实施例中，RSV F蛋白具有亚型B，且包含突变A103C、I148C、S190I及D486S。
在一些实施例中，RSV F蛋白具有亚型A，且包含突变T54H、A103C、I148C、S190I及D486S。
在一些实施例中，RSV F蛋白具有亚型B，且包含突变T54H、A103C、I148C、S190I及D486S。
在一些实施例中，RSV F蛋白具有亚型A，且包含突变T54H、S55C、L188C及D486S。
在一些实施例中，RSV F蛋白具有亚型B，且包含突变T54H、S55C、L188C及D486S。
鉴于RSV F序列的实质上保守，一般本领域技术人员可容易地比较不同天然RSV F序列之间的氨基酸位置，以鉴别不同RSV株系及亚型之间的对应RSV F氨基酸位置。举例而言，在整个几乎全部所鉴别天然RSV F0前体蛋白质中，弗林蛋白酶裂解位点落入相同氨基酸位置中。因此，整个株系及亚型中的天然RSV F蛋白序列的保守允许使用参考RSV F序列以用于比较RSV F蛋白中特定位置处的氨基酸。出于本发明的目的(除非上下文另外指示)，参考RSV A2株系的全长天然F前体多肽的氨基酸序列给出RSV F蛋白氨基酸位置；对应于GenInfo标识符GI 138251及Swiss Prot标识符P03420(SEQ ID NO：1)。
在一些实施例中，RSV F蛋白呈RSV F蛋白的成熟形式，其包含两条个别多肽链，即F1多肽及F2多肽。在一些其他实施例中，F2多肽由一或两个二硫键与F1多肽连接以形成F2/F1异二聚体。在另其他实施例中，RSV F突变体呈单链蛋白质形式，其中F2多肽由肽键或肽接头与F1多肽连接。可使用用于接合两条多肽链在一起的任何适合的肽接头。此类接头的实施例包括G、GG、GGG、GS及SAIG接头序列。接头也可为全长pep27序列或其片段，该全长pep27序列对应于SEQ ID NO：1的位置110～136处的氨基酸。
突变体的F1多肽链与对应野生型RSV F蛋白的全长F1多肽可具有相同长度；然而，其也可具有缺失，诸如缺失来自全长F1多肽的C端的1～60个氨基酸残基。RSV F突变体的全长F1多肽对应于天然RSV F0前体(SEQ ID NO：1)的氨基酸位置137～574，且包括(自N端至C端)细胞外区(残基137～524)、跨膜域(“TM”)(残基525～550)及细胞质域(“CT”)(残基551～574)。应注意，自天然F1多肽序列中的氨基酸残基514起为本文提供的免疫原性组合物中所包括的RSV F蛋白的F1多肽中的视情况存在的序列，且因此可能不存在于突变体的F1多肽中。
在一些实施例中，RSV F突变体的F1多肽缺乏整个细胞质域。在其他实施例中，F1多肽缺乏细胞质域以及跨膜域的一部分或所有全部。在一些特定实施例中，突变体包含F1多肽，其中来自位置510、511、512、513、514、515、520、525或530～574的氨基酸残基不存在。通常，对于与三聚域(诸如折叠子(foldon))连接的突变体而言，氨基酸514～574可不存在。因此，在一些特定实施例中，氨基酸残基514～574不存在于突变体的F1多肽中。在另其他特定实施例中，RSV F突变体的F1多肽包含以下或由以下组成：天然F0多肽序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基137～513，诸如RSV 847A-折叠子多肽(SEQ ID NO：74)；或替代性F0前体序列中的任一者，诸如WO2017109629(其以全文引用的方式并入本文中)的SEQ ID NO：1、2、4、6及81～270中所揭示的那些。
其中引入一或多个突变的RSV F蛋白突变体的F1多肽及F2多肽可来自此项技术中已知或未来发现的任何野生型RSV F蛋白，包括但不限于RSV亚型A及亚型B株系(包括A2Ontario及Buenos Aires)或任何其他亚型的F蛋白氨基酸序列。在一些实施例中，RSV F突变体包含其中引入一或多个突变的来自RSV A病毒的F1和/或F2多肽，例如来自WO2017109629的SEQ ID NO：1、2、4、6及81～270(所述序列以全文引用的方式并入本文中)中的任一者中所阐述的来自RSV F0前体蛋白质的F1和/或F2多肽。在一些其他实施例中，RSV F突变体包含其中引入一或多个突变的来自RSV B病毒的F1和/或F2多肽，例如WO2017/109629的SEQ ID NO：2及211～263(所述序列以全文引用的方式并入本文中)中的任一者中所阐述的来自RSV F0前体蛋白质的F1和/或F2多肽。在另其他实施例中，RSV F突变体包含其中引入一或多个突变的来自RSV牛病毒的F1和/或F2多肽，例如WO2017109629的SEQ IDNO：264～270(所述序列以全文引用的方式并入本文中)中的任一者中所阐述的来自RSV F0前体蛋白质的F1和/或F2多肽。
术语“F0多肽”(F0)是指RSV F蛋白的前体多肽，其由信号多肽序列、F1多肽序列、pep27多肽序列及F2多肽序列构成。在罕见例外情况下，已知RSV株系的F0多肽由574个氨基酸组成。
术语“F1多肽”(F1)是指成熟RSV F蛋白的多肽链。天然F1包括RSV F0前体的大致残基137～574且由以下构成(自N端至C端)：细胞外区(大致残基137～524)、跨膜域(“TM”)(大致残基525～550)及细胞质尾区(“CT”)(大致残基551～574)。如本文所用，该术语涵盖天然F1多肽及包括来自天然序列的修饰(例如氨基酸取代、插入或缺失)的F1多肽两者，所述修饰例如设计成使RSV F蛋白突变体稳定或增强RSV F蛋白突变体的免疫原性的修饰。
术语“F2多肽”(F2)是指成熟RSV F蛋白的多肽链。天然F2包括RSV F0前体的大致残基26～109。如本文所用，该术语涵盖天然F2多肽及包括来自天然序列的修饰(例如氨基酸取代、插入或缺失)的F2多肽两者，所述修饰例如设计成使呈融合前构形的RSV F蛋白突变体稳定或增强RSV F蛋白突变体的免疫原性的修饰。在天然RSV F蛋白中，F2多肽由两个二硫键与F1多肽连接以形成F2-F1异二聚体。术语“折叠子(foldon)”或“折叠子域”是指能够形成三聚体的氨基酸序列。此类折叠子域的一个实施例为来源于噬菌体T4纤维蛋白的肽序列，其具有GYIPEAPRDG QAYVRKDGEW VLLSTFL(SEQ ID NO：45)的序列。
在一些实施方式中，RNA分子编码以下中所揭示的RSV F蛋白突变体：WO2009/079796、WO2010/149745、WO2011/008974、WO2014/160463、WO2014/174018、WO2014/202570、WO2015/013551、WO2015/177312、WO2017/005848、WO2017/174564、WO2017/005844及WO2018/109220。这些参考文献中所揭示的RSV F蛋白以全文引用的方式并入本文中。
针对RSV F蛋白的抗体在天然感染之后及在疫苗接种之后为普遍的，且已显示在活体外中和病毒活性。如本文所用，术语“呼吸道合胞体病毒”或“RSV”不限于任何特定株系或变体。
在一些实施方式中，RNA分子包含编码RSV抗原的开放阅读框。在一些实施方式中，RSV抗原为RSV多肽。在一些实施方式中，RSV多肽为RSV糖蛋白或其片段或变体。在一些实施方式中，RNA分子编码RSV F蛋白。
在一些实施方式中，RSV多肽为全长RSV多肽。在一些实施方式中，RSV多肽为截短RSV多肽。在一些实施方式中，RSV多肽为RSV多肽的变体。在一些实施方式中，RSV多肽为RSV多肽的片段。
在一些实施方式中，RSV多肽为全长RSV F蛋白。在一些实施方式中，RSV多肽为截短RSV F蛋白。在一些实施方式中，RSV多肽为RSV F蛋白的变体。在一些实施方式中，RSV多肽为RSV F蛋白的片段。
在一些实施方式中，RSV F蛋白包含至少一个突变。在一些实施方式中，RSV F蛋白包含至少两个突变。在一些实施方式中，RSV F蛋白包含至少三个突变。在一些实施方式中，RSV F蛋白包含至少四个突变。在一些实施方式中，RSV F蛋白包含4个突变。在一些实施方式中，RSV F蛋白包含至少五个突变。
在一些实施方式中，RNA分子编码表1中所阐述的RSV F蛋白(参见实施例6)。在一些实施方式中，RNA分子编码包含SEQ ID NO：1～6及71～74中的任一者的氨基酸序列的RSVF蛋白，或其片段或变体。在一些实施方式中，RSV F多肽与表1的氨基酸序列中的任一者(例如SEQ ID NO：1～6及71～74中的任一者)可具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间的同一性：70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方式中，RSV F蛋白由表1的氨基酸序列中的任一者(例如SEQID NO：1～6及71～74中的任一者)组成。
在一些实施方式中，RNA分子序列转录自表2的DNA核酸序列(DNA多核苷酸)(参见实施例6)。在一些实施方式中，RNA分子包含转录自SEQ ID NO：7～10及59～62中的任一者的核酸序列或其片段或变体的ORF。在一些实施方式中，RNA分子包含转录自与表2的核酸序列中的任一者(例如SEQ ID NO：7～10及59～62中的任一者)可具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间的同一性的核酸序列的ORF：70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方式中，RNA分子包含转录自由表2的核酸序列中的任一者(例如SEQ ID NO：7～10及59～62中的任一者)组成的核酸序列的ORF。
在一些实施方式中，RNA分子包含含有表3的RNA核酸序列(RNA多核苷酸)(参见实施例6)的ORF。在一些实施方式中，RNA分子包含含有SEQ ID NO：11～16及63～70中的任一者的核酸序列或其片段或变体的ORF。在一些实施方式中，RNA分子包含含有与表3的RNA核酸序列中的任一者(例如SEQ ID NO：11～16及63～70中的任一者)可具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间的同一性的核酸序列的ORF：70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方式中，RNA分子包含含有由表3的RNA核酸序列中的任一者(例如SEQ ID NO：11～16及63～70中的任一者)组成的核酸序列的ORF。
在一些实施方式中，RNA分子包含稳定化RNA。在一些实施方式中，RNA分子包含至少一个尿苷经N1-甲基假尿苷置换的核酸序列。在一些实施方式中，RNA分子包含所有尿苷经N1-甲基假尿苷置换的序列(表示为“Ψ”)。在一些实施方式中，RNA分子包含含有SEQ IDNO：11～16及63～70中的任一者的核酸序列的ORF，其中所有尿苷已经N1-甲基假尿苷(表示为“Ψ”)置换。
在一些实施方式中，RNA分子包含编码与SEQ ID NO：1～6及71～74(表1)的RSV F蛋白序列中的任一者或本文所述的其他RSV融合前F蛋白可至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间一致的RSV F蛋白氨基酸序列的开放阅读框：70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方式中，RNA分子包含编码由SEQ ID NO：1～6及71～74(表1)的RSV F蛋白序列中的任一者或本文所述的其他RSV融合前F蛋白组成的RSV F蛋白氨基酸序列的开放阅读框。
在一些实施方式中，RNA分子包含转录自与SEQ ID NO：7～10及59～62(表2)的核酸序列中的任一者或本文所述的其他核酸可至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间一致的DNA核酸序列的开放阅读框：70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方式中，RNA分子包含转录自由SEQ ID NO：7～10及59～62(表2)的核酸序列中的任一者或本文所述的其他核酸组成的DNA核酸序列的开放阅读框。
在一些实施方式中，RNA分子包含含有与SEQ ID NO：11～16及63～70(表3)的核酸序列中的任一者或本文所述的其他核酸可至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间一致的RNA核酸序列的开放阅读框：70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方式中，RNA分子包含含有由SEQ ID NO：11～16及63～70(表3)的核酸序列中的任一者或本文所述的其他核酸组成的RNA核酸序列的开放阅读框。在一些实施方式中，RNA分子包含含有SEQ ID NO：11～16及63～70(表3)中的任一者的核酸序列的ORF，其中所有尿苷已经N1-甲基假尿苷(表示为“Ψ”)置换。
【III.RNA分子】
在一些实施方式中，本文所述的RNA分子为编码RNA分子。编码RNA包括可翻译成肽或多肽的功能性RNA分子。在一些实施方式中，编码RNA分子包括至少一个编码至少一种肽或多肽的开放阅读框(ORF)。开放阅读框包含可翻译成肽或蛋白质的密码子序列。编码RNA分子可包括一个(单顺反子)、两个(双顺反子)或更多个(多顺反子)ORF，其可为可翻译成所关注多肽或蛋白质的密码子序列。
编码RNA分子可为信使RNA(mRNA)分子、病毒RNA分子或自扩增RNA分子(saRNA，也称为复制子)。在一些实施方式中，RNA分子为mRNA。优选地，本发明的RNA分子为mRNA。在一些实施方式中，RNA分子为modRNA。在一些实施方式中，RNA分子为saRNA。在一些实施方式中，saRNA分子可为编码RNA分子。
RNA分子可编码一种所关注多肽或更多，诸如一种抗原或超过一种抗原，例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种多肽。或者或另外，一个RNA分子也可编码超过一种所关注多肽，诸如抗原，例如编码不同或相同抗原的双顺反子或三顺反子RNA分子。
RNA分子的序列可经密码子优化或去优化以供在所需宿主(诸如人类细胞)中表达。在一些实施方式中，与野生型编码序列相比，本文所述的所关注基因(例如抗原)由密码子优化和/或鸟苷/胞苷(G/C)含量增加的编码序列编码。在一些实施方式中，与野生型编码序列的对应序列区域相比，编码序列的一或多个序列区域经密码子优化和/或其G/C含量增加。在一些实施方式中，密码子优化和/或增加G/C含量不会改变所编码氨基酸序列的序列。
本领域技术人员应了解，术语“密码子优化”是指改变核酸分子的编码区中的密码子以反映宿主生物体的典型密码子使用而不改变由核酸分子编码的氨基酸序列。在本发明的上下文内，在一些实施方式中，编码区经密码子优化以供在待使用本文所述的RNA多核苷酸治疗的个体中最佳表达。密码子优化系基于以下发现：翻译效率也由细胞中tRNA分子的不同出现频率决定。因此，RNA的序列可经修饰，使得可获得频繁出现的tRNA分子的密码子插入在“罕见密码子”的位置。
在一些实施方式中，与编码所关注基因的野生型RNA的对应编码序列的G/C含量相比，RNA的(例如所关注基因序列；开放阅读框(ORF)的)编码区的G/C含量增加，其中在一些实施方式中，与由野生型RNA编码的氨基酸序列相比，由所述RNA编码的氨基酸序列未经修饰。RNA序列的此修饰系基于以下事实：待翻译的任何RNA区的序列对于该mRNA的高效翻译而言为重要的。G(鸟苷)/C(胞苷)含量增加的序列与A(腺苷)/U(尿苷)含量增加的序列相比更稳定。相对于若干密码子编码同一个氨基酸的事实(所谓的遗传密码简并)，可确定对于稳定性最有利的密码子(所谓的替代密码子使用)。视由RNA编码的氨基酸而定，与其野生型序列相比，RNA序列的修饰存在各种可能性。特别而言，含有A和/或U核苷的密码子可由用其他密码子取代这些密码子而经修饰，所述其他密码子编码相同氨基酸但不含A和/或U或含有更低含量的A和/或U核苷。因此，在一些实施方式中，与野生型RNA的编码区的G/C含量相比，本文所述的RNA的编码区的G/C含量增加至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间：10％、20％、30％、40％、50％、55％或甚至更多。在一些实施方式中，本文所述的RSV RNA的编码区包含以下的G/C含量：至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或约80％。在一些实施方式中，本文所述的RSV RNA的编码区包含以下的G/C含量：约50％～75％、约55％～70％、约50％～60％、约60％～70％、约70％～80％、约50％～55％、约55％～60％、约60％～65％、约65％～70％、约70％～75％、或约75％～80％。在一些实施方式中，本文所述的RSV RNA的编码区包含以下的G/C含量：约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％或约75％。在一些实施方式中，本文所述的RSV RNA的编码区包含约58％、约66％或约62％的G/C含量。
在一些实施方式中，RNA分子包括约20～约100,000个核苷酸(例如30～50、30～100、30～250、30～500、30～1,000、30～1，500、30～3，000、30～5,000、30～7,000、30～10,000、30～25,000、30～50,000、30～70,000、100～250、100～500、100～1,000、100～1,500、100～3,000、100～5，000、100～7，000、100～10，000、100～25，000、100～50，000、100～70，000、100～100，000、500～1，000、500～1，500、500～2，000、500～3，000、500～5，000、500～7，000、500～10，000、500～25，000、500～50，000、500～70，000、500～100，000、1，000～1，500、1，000～2，000、1，000～3，000、1，000～5，000、1，000～7，000、1，000～10，000、1，000～25，000、1,000～50,000、1,000～70,000、1,000～100,000、1,500～3,000、1,500～5,000、1,500～7,000、1,500～10,000、1,500～25,000、1,500～50，000、1，500～70,000、1，500～100，000、2，000～3，000、2，000～5，000、2，000～7，000、2,000～10,000、2,000～25,000、2,000～50，000、2,000～70,000、及2，000～100，000个核苷酸)。
在一些实施方式中，RNA分子具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间的核苷酸：约20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680、700、720、740、760、780、800、820、840、860、880、900、920、940、960、980、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800、4000、4200、4400、4600、4800、5000、5200、5400、5600、5800、6000、6200、6400、6600、6800、7000、7200、7400、7600、7800、8000、8200、8400、8600、8800、9000、9200、9400、9600、9800、10000、12000、14000、16000、18000、20000、22000、24000、26000、28000、30000、32000、34000、36000、38000、40000、42000、44000、46000、48000、50000、52000、54000、56000、58000、60000、62000、64000、66000、68000、70000、72000、74000、76000、78000、80000、82000、84000、86000、88000、90000、92000、94000、96000、98000或100000个。
在一些实施方式中，RNA分子包括至少100个核苷酸。举例而言，在一些实施方式中，RNA的长度在100与15，000个核苷酸之间；在7，000与16，000个核苷酸之间；在8，000与15，000个核苷酸之间；在9，000与12，500个核苷酸之间；在11，000与15，000个核苷酸之间；在13，000与16，000个核苷酸之间；在7，000与25,000个核苷酸之间。在一些实施方式中，RNA分子具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间的核苷酸：约100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、3950、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、4950、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450、5500、5550、5600、5650、5700、5750、5800、5850、5900、5950、6000、6050、6100、6150、6200、6250、6300、6350、6400、6450、6500、6550、6600、6650、6700、6750、6800、6850、6900、6950、7000、7050、7100、7150、7200、7250、7300、7350、7400、7450、7500、7550、7600、7650、7700、7750、7800、7850、7900、7950、8000、8050、8100、8150、8200、8250、8300、8350、8400、8450、8500、8550、8600、8650、8700、8750、8800、8850、8900、8950、9000、9050、9100、9150、9200、9250、9300、9350、9400、9450、9500、9550、9600、9650、9700、9750、9800、9850、9900、9950、10000、10050、10100、10150、10200、10250、10300、10350、10400、10450、10500、10550、10600、10650、10700、10750、10800、10850、10900、10950、11000、11050、11100、11150、11200、11250、11300、11350、11400、11450、11500、11550、11600、11650、11700、11750、11800、11850、11900、11950、12000、12050、12100、12150、12200、12250、12300、12350、12400、12450、12500、12550、12600、12650、12700、12750、12800、12850、12900、12950、13000、13050、13100、13150、13200、13250、13300、13350、13400、13450、13500、13550、13600、13650、13700、13750、13800、13850、13900、13950、14000、14050、14100、14150、14200、14250、14300、14350、14400、14450、14500、14550、14600、14650、14700、14750、14800、14850、14900、14950或15000个。
本发明的RNA分子可由此项技术中已知的任何方法制备，包括化学合成及活体外方法，诸如RNA活体外转录。在有一些实施方式中，本发明的RNA系使用活体外转录制备。
在一些实施方式中，本发明的RNA分子例如由过滤来纯化，该过滤可经由例如超滤、渗滤或例如切向流超滤/渗滤进行。
在一些实施方式中，本发明的RNA分子冻干成温度稳定的。
在本发明的一些实施方式中，RNA为或包含信使RNA(mRNA)，其与编码多肽的RNA转录本有关。在一些实施方式中，本文所揭示的RNA包含：5'帽，其包含本文所揭示的5'帽；5'非翻译区(5'UTR)，其包含帽近端序列；编码蛋白质(例如多肽)(例如RSV融合前F蛋白)的序列；3'非翻译区(3'UTR)；和/或多腺苷酸化(多A)序列。
在一些实施方式中，本文所揭示的RNA在5'至3'取向上包含以下组分：5′帽，其包含本文所揭示的5′帽；5'非翻译区(5'UTR)，其包含帽近端序列；编码蛋白质(例如多肽)(例如RSV融合前F蛋白)的序列；3′非翻译区(3′UTR)；及多A序列。
在一些实施方式中，本文所揭示的RNA进一步包含信号肽。信号肽以及编码此类肽的氨基酸及核酸序列的非限制性实施例可见于例如WO2017/109629(其揭示内容以全文引用的方式并入本文中)中。
在一些实施方式中，本文所揭示的RNA编码抗原性融合蛋白。因此，所编码的一或多种抗原可包括两种或更多种接合在一起的蛋白质(例如蛋白质和/或蛋白质片段)。或者，与蛋白质抗原融合的蛋白质不促进针对自身的强免疫反应，而是促进针对抗原的强免疫反应。在一些实施方式中，抗原性融合蛋白保留各初始蛋白质的功能特性。在一些实施方式中，本文所揭示的RNA编码包含与骨架部分连接的抗原的融合蛋白。在一些实施方式中，RNA进一步编码位于融合蛋白的至少一个或各域之间的接头。此类骨架部分及接头的非限制性实施例可见于例如WO 2022/067010(其揭示内容以全文引用的方式并入本文中)中。
【A.经修饰的核碱基】
在本发明的一些实施方式中，RNA分子未经化学修饰且包含由腺苷、鸟苷、胞嘧啶及尿苷组成的标准核糖核苷酸。在一些实施方式中，本发明的核苷酸及核苷包含标准核苷残基，诸如所转录RNA中存在的那些(例如A、G、C和/或U)。在一些实施方式中，本发明的核苷酸及核苷包含标准脱氧核糖核苷，诸如DNA中存在的那些(例如dA、dG、dC和/或dT)。
在本发明的其他实施方式中，RNA分子可包含经修饰的核碱基，所述经修饰的核碱基可并入经修饰的核苷及核苷酸中。在一些实施方式中，RNA分子可包括一或多种经修饰的核苷酸。在一些实施方式中，RNA分子可包括一或多种经修饰的核苷酸。天然存在的核苷酸修饰为此项技术中已知的。在一些实施方式中，RNA分子可包括经修饰的核苷酸。可包括在RNA分子中的经修饰的核苷酸的非限制性实施例包括假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基尿苷、3-甲基-尿苷、5-甲氧基-尿苷、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫-5-氮杂-尿苷、2-硫-尿苷、4-硫-尿苷、4-硫-假尿苷、2-硫-假尿苷、5-羟基-尿苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤基-尿苷(例如5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、尿苷5-氧乙酸、尿苷5-氧乙酸甲酯、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯、5-甲氧基羰基甲基-尿苷、5-甲氧基羰基甲基-2-硫-尿苷、5-胺甲基-2-硫-尿苷、5-甲氨基甲基-尿苷、1-乙基-假尿苷、5-甲氨基甲基-2-硫-尿苷、5-甲氨基甲基-2-硒基-尿苷、5-氨甲酰基甲基-尿苷、5-羧甲基胺甲基-尿苷、5-羧甲基胺甲基-2-硫-尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫-假尿苷、5-甲基-2-硫-尿苷、1-甲基-4-硫-假尿苷、4-硫-1-甲基-假尿苷、3-甲基-1-假尿苷、2-硫-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷、2-硫-二氢尿苷、2-硫-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷、5-(异戊烯基胺甲基)尿苷、5-(异戊烯基胺甲基)-2-硫-尿苷、a-硫-尿苷、2'-O-甲基-尿苷、5，2′-O-二甲基-尿苷、2'-O-甲基-假尿苷、2-硫-2'-O-甲基-尿苷、5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基-尿苷、5-氨甲酰基甲基-2'-O-甲基-尿苷、5-羧甲基胺甲基-2'-O-甲基-尿苷、3,2'-O-二甲基-尿苷、5-(异戊烯基胺甲基)-2′-O-甲基-尿苷、1-硫-尿苷、脱氧胸苷、2'-F-阿糖尿苷、2'-F-尿苷、2'-OH-阿糖尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷、此项技术中已知的任何其他经修饰的尿苷，或其组合。在一些实施方式中，前述经修饰的核苷酸中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
RNA分子中可存在的修饰进一步包括但不限于例如以下：ms2io6A(2-甲基硫-(N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷)；ms2m6A(2-甲基硫-N6-甲基腺苷)；ms2t6A 2-甲基硫-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷；g6A(N6-甘氨酰基氨甲酰基腺苷)；i6A(N6-异戊烯基腺苷)；m6A(N6-甲基腺苷)；t6A(N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷)；m'Am(1，2'-O-二甲基腺苷)；m1A(1-甲基腺苷)；2'-O-甲基腺苷；Ar(p)(2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯))；2-甲基腺苷；2-甲基硫-N6-异戊烯基腺苷；ms2hn6A(2-甲基硫-N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基腺苷)；2-O-甲基腺苷；Am(2-1-O-甲基腺苷)；2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；异戊烯基腺苷；io6A N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷；m6Am(N6,2'-O-二甲基腺苷)；m62Am(N6,N6,2'-O-三甲基腺苷)；m62A(N6,N6-二甲基腺苷)；ac6A(N6-乙酰基腺苷)；hn6A(N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基腺苷)；m6t6A(N6-甲基-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷)；m2A(2-甲基腺苷)；ms2i6A(2-甲基硫-N6-异戊烯基腺苷)；7-脱氮-腺苷；N1-甲基-腺苷；N6,N6-(二甲基)腺嘌呤；N6-顺式-羟基-异戊烯基-腺苷；a-硫-腺苷；2-(氨基)腺嘌呤；2-(氨基丙基)腺嘌呤；2-(甲基硫)-N6-(异戊烯基)腺嘌呤；2-(烷基)腺嘌呤；2-(氨基烷基)腺嘌呤；2-(氨基丙基)腺嘌呤；2-(卤基)腺嘌呤；2-(卤基)腺嘌呤；2-(丙基)腺嘌呤；2'-氨基-2'-脱氧-ATP；2'-叠氮基-2'-脱氧-ATP；2'-脱氧-2'-a-氨基腺苷TP；2'-脱氧-2'-a-叠氮基腺苷TP；6-(烷基)腺嘌呤；6-(甲基)腺嘌呤；6-(烷基)腺嘌呤；6-(甲基)腺嘌呤；7-(脱氮)腺嘌呤；8-(烯基)腺嘌呤；8-(炔基)腺嘌呤；8-(氨基)腺嘌呤；8-(硫烷基)腺嘌呤；8-(烯基)腺嘌呤；8-(烷基)腺嘌呤；8-(炔基)腺嘌呤；8-(氨基)腺嘌呤；8-(卤基)腺嘌呤；8-(羟基)腺嘌呤；8-(硫烷基)腺嘌呤；8-(硫醇基)腺嘌呤；8-叠氮基-腺苷；8-氧代-腺嘌呤；氮杂腺嘌呤；脱氮腺嘌呤；N6-(甲基)腺嘌呤；N6-(异戊基)腺嘌呤；7-脱氮-8-氮杂-腺苷；7-甲基腺嘌呤；1-脱氮腺苷TP；2'氟-N6-Bz-脱氧腺苷TP；2'-OMe-2-氨基-ATP；2'O-甲基-N6-Bz-脱氧腺苷TP；2'-a-乙炔基腺苷TP；2-氨基腺嘌呤；2-氨基腺苷TP；2-氨基-ATP；2'-a-三氟甲基腺苷TP；2-叠氮基腺苷TP；2′-b-乙炔基腺苷TP；2-溴腺苷TP；2'-b-三氟甲基腺苷TP；2-氯腺苷TP；2'-脱氧-2',2'-二氟腺苷TP；2'-脱氧-2'-a-巯基腺苷TP；2'-脱氧-2'-a-硫甲氧基腺苷TP；2'-脱氧-2′-b-氨基腺苷TP；2′-脱氧-2'-b-叠氮基腺苷TP；2′-脱氧-2'-b-溴腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-氯腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-氟腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-碘腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-巯基腺苷TP；2'-脱氧-2′-b-硫甲氧基腺苷TP；2-氟腺苷TP；2-碘腺苷TP；2-巯基腺苷TP；2-甲氧基-腺嘌呤；2-甲基硫-腺嘌呤；2-三氟甲基腺苷TP；3-脱氮-3-溴腺苷TP；3-脱氮-3-氯腺苷TP；3-脱氮-3-氟腺苷TP；3-脱氮-3-碘腺苷TP；3-脱氮腺苷TP；4'-叠氮基腺苷TP；4′-碳环腺苷TP；4′-乙炔基腺苷TP；5′-高(Homo)-腺苷TP；8-氮杂-ATP；8-溴-腺苷TP；8-三氟甲基腺苷TP；9-脱氮腺苷TP；2-氨基嘌呤；经取代的7-脱氮嘌呤；7-脱氮-7取代的嘌呤；7-脱氮-8取代的嘌呤；7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤；7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤；7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤；2,4-二氨基嘌呤；2，6-二氨基嘌呤；7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤；7-脱氮-2-氨基嘌呤；8-氮杂嘌呤；s2C(2-硫胞苷)；m3C(3-甲基胞苷)；f5C(5-甲酰基胞苷)；hm5C(5-羟基甲基胞苷)；m5C(5-甲基胞苷)；ac4C(N4-乙酰基胞苷)；Cm(2′-O-甲基胞苷)；m5Cm(5，2'-O-二甲基胞苷)；f5Cm(5-甲酰基-2′-O-甲基胞苷)；k2C(立西啶(Lysidine))；m4Cm(N4，2′-O-二甲基胞苷)；ac4Cm(N4-乙酰基-2′-O-甲基胞苷)；m4C(N4-甲基胞苷)；N4，N4-二甲基-2′-OMe-胞苷TP；4-甲基胞苷；5-氮杂-胞苷；假-异-胞苷；吡咯并-胞苷；a-硫-胞苷；2-(硫)胞嘧啶；2′-氨基-2′-脱氧-CTP；2'-叠氮基-2'-脱氧-CTP；2'-脱氧-2'-a-氨基胞苷TP；2'-脱氧-2'-a-叠氮基胞苷TP；3-(脱氮)5-(氮杂)胞嘧啶；3-(甲基)胞嘧啶；3-(烷基)胞嘧啶；3-(脱氮)5-(氮杂)胞嘧啶；3-(甲基)胞苷；4,2'-O-二甲基胞苷；5-(卤基)胞嘧啶；5-(甲基)胞嘧啶；5-(丙炔基)胞嘧啶；5-(三氟甲基)胞嘧啶；5-氯胞嘧啶；5-氟胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-羟基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；5-(烷基)胞嘧啶；5-(烯基)胞嘧啶；5-(炔基)胞嘧啶；5-(卤基)胞嘧啶；5-(丙炔基)胞嘧啶；5-(三氟甲基)胞嘧啶；5-溴-胞苷；5-碘-胞苷；5-丙炔基胞嘧啶；6-(偶氮)胞嘧啶；6-氮杂-胞苷；氮杂胞嘧啶；脱氮胞嘧啶；N4-(乙酰基)胞嘧啶；1-甲基-1-脱氮-假异胞苷；1-甲基-假异胞苷；2-甲氧基-5-甲基-胞苷；2-甲氧基-胞苷；2-硫-5-甲基-胞苷；4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷；4-甲氧基-假异胞苷；4-硫-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷；4-硫-1-甲基-假异胞苷；4-硫-假异胞苷；5-氮杂-泽布拉林(zebularine)；5-甲基-泽布拉林；吡咯并-假异胞苷；泽布拉林；(E)-5-(2-溴-乙烯基)胞苷TP；2,2'-脱水-胞苷TP盐酸盐；2'氟-N4-Bz-胞苷TP；2'氟-N4-乙酰基-胞苷TP；2'-O-甲基-N4-乙酰基-胞苷TP；2'O-甲基-N4-Bz-胞苷TP；2'-a-乙炔基胞苷TP；2'-a-三氟甲基胞苷TP；2′-b-乙炔基胞苷TP；2'-b-三氟甲基胞苷TP；2'-脱氧-2',2'-二氟胞苷TP；2'-脱氧-2'-a-巯基胞苷TP；2'-脱氧-2'-a-硫甲氧基胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-氨基胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-叠氮基胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-溴胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-氯胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-氟胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-碘胞苷TP；2′-脱氧-2′-b-巯基胞苷TP；2'-脱氧-2′-b-硫甲氧基胞苷TP；2′-O-甲基-5-(1-丙炔基)胞苷TP；3'-乙炔基胞苷TP；4'-叠氮基胞苷TP；4′-碳环胞苷TP；4'-乙炔基胞苷TP；5-(1-丙炔基)阿糖-胞苷TP；5-(2-氯-苯基)-2-硫胞苷TP；5-(4-氨基-苯基)-2-硫胞苷TP；5-氨基烯丙基-CTP；5-氰基胞苷TP；5-乙炔基阿糖-胞苷TP；5-乙炔基胞苷TP；5'-高-胞苷TP；5-甲氧基胞苷TP；5-三氟甲基-胞苷TP；N4-氨基-胞苷TP；N4-苯甲酰基-胞苷TP；假异胞苷；mimG(甲基鸟苷)；m7G(7-甲基鸟苷)；m2Gm(N2,2′-O-二甲基鸟苷)；m2G(N2-甲基鸟苷)；imG(怀俄苷(Wyosine))；m1Gm(1,2'-O-二甲基鸟苷)；m1G(1-甲基鸟苷)；2'-O-甲基鸟苷；2'-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)；Gm(2'-O-甲基鸟苷)；Gr(p)(2'-O-核糖基鸟苷(磷酸酯))；preQi(7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷)；preQo(7-氰基-7-脱氮鸟苷)；G*(古嘌苷(Archaeosine))；甲基怀俄苷；m2'7G(N2，7-二甲基鸟苷)；m22Gm(N2,N2,2'-O-三甲基鸟苷)；m2′2'7G(N2,N2，7-三甲基鸟苷)；m22G(N2,N2-二甲基鸟苷)；N2，7,2′-O-三甲基鸟苷；6-硫-鸟苷；7-脱氮-鸟苷；8-氧代-鸟苷；N1-甲基-鸟苷；a-硫-鸟苷；2-(丙基)鸟嘌呤；2-(烷基)鸟嘌呤；2'-氨基-2'-脱氧-GTP；2′-叠氮基-2'-脱氧-GTP；2′-脱氧-2′-a-氨基鸟苷TP；2′-脱氧-2′-a-叠氮基鸟苷TP；N2-二甲基鸟嘌呤；6-(甲基)鸟嘌呤；6-(烷基)鸟嘌呤；6-(甲基)鸟嘌呤；6-甲基-鸟苷；6-硫鸟嘌呤；7-(烷基)鸟嘌呤；7-脱氮-7取代的鸟嘌呤；7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤；7-脱氮-8取代的鸟嘌呤；7-(甲基)鸟嘌呤；7-(烷基)鸟嘌呤；7-(脱氮)鸟嘌呤；7-(甲基)鸟嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤；8-羟基鸟嘌呤；8-氧代鸟嘌呤；8-(烷基)鸟嘌呤；8-(炔基)鸟嘌呤；8-(卤基)鸟嘌呤；8-(硫烷基)鸟嘌呤；8-(烯基)鸟嘌呤；8-(烷基)鸟嘌呤；8-(炔基)鸟嘌呤；8-(氨基)鸟嘌呤；8-(卤基)鸟嘌呤；8-(羟基)鸟嘌呤；8-(硫烷基)鸟嘌呤；8-(硫醇基)鸟嘌呤；氮杂鸟嘌呤；脱氮鸟嘌呤；N(甲基)鸟嘌呤；N-(甲基)鸟嘌呤；1-甲基-6-硫-鸟苷；6-甲氧基-鸟苷；6-硫-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷；6-硫-7-脱氮-鸟苷；6-硫-7-甲基-鸟苷；7-脱氮-8-氮杂-鸟苷；7-甲基-8-氧代-鸟苷；N2,N2-二甲基-6-硫-鸟苷；N2-甲基-6-硫-鸟苷；1-me-GTP；2′氟-N2-异丁基-鸟苷TP；2'-O-甲基-N2-异丁基-鸟苷TP；2'-a-乙炔基鸟苷TP；2'-a-三氟甲基鸟苷TP；2′-b-乙炔基鸟苷TP；2'-b-三氟甲基鸟苷TP；2′-脱氧-2′，2'-二氟鸟苷TP；2′-脱氧-2'-a-巯基鸟苷TP；2′-脱氧-2'-a-硫甲氧基鸟苷TP；2′-脱氧-2′-b-氨基鸟苷TP；2′-脱氧-2′-b-叠氮基鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-溴鸟苷TP；2′-脱氧-2′-b-氯鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-氟鸟苷TP；2'-脱氧-2′-b-碘鸟苷TP；2′-脱氧-2′-b-巯基鸟苷TP；2′-脱氧-2′-b-硫甲氧基鸟苷TP；4′-叠氮基鸟苷TP；4'-碳环鸟苷TP；4'-乙炔基鸟苷TP；5′-高-鸟苷TP；8-溴-鸟苷TP；9-脱氮鸟苷TP；N2-异丁基-鸟苷TP；miI(1-甲基肌苷)；I(肌苷)；m'lm(1，2'-O-二甲基肌苷)；2'-O-甲基肌苷；7-甲基肌苷；Tm(2'-O-甲基肌苷)；oQ(环氧基Q核苷(queuosine))；galQ(半乳糖苷-Q核苷)；manQ(甘露糖基Q核苷)；Q(Q核苷)；烯丙基氨基-胸苷；氮杂胸苷；脱氮胸苷；脱氧-胸苷；Um(2′-O-甲基尿苷)；s2U(2-硫尿苷)；m3U(3-甲基尿苷)；cm5U(5-羧基甲基尿苷)；ho5U(5-羟基尿苷)；m5U(5-甲基尿苷)；tm5s2U(5-牛磺酸甲基-2-硫尿苷)；5-牛磺酸甲基尿苷；D(二氢尿苷)；假尿苷；acp3U(3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷)；1-甲基-3-(3-氨基-5-羧基丙基)假尿苷；1-甲基假尿苷；1-乙基-假尿苷；2'-O-甲基尿苷；2'-O-甲基假尿苷；2′-O-甲基尿苷；s2Um(2-硫-2'-O-甲基尿苷)；3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷；m3Um(3,2′-O-二甲基尿苷)；3-甲基-假-尿苷TP；s4U(4-硫尿苷)；chm5U(5-(羧基羟基甲基)尿苷)；mchm5U(5-(羧基羟基甲基)尿苷甲酯)；m5Um(5，2'-O-二甲基尿苷)；5，6-二氢-尿苷；nm5s2U(5-氨基甲基-2-硫尿苷)；ncm5Um(5-氨甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷)；ncm5U(5-氨甲酰基甲基尿苷)；5-羧基羟基甲基尿苷；5-羧基羟基甲基尿苷甲酯；cnmm5Um(5-羧基甲基氨基甲基-2'-O-甲基尿苷)；cmnm5s2U(5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷)；5-羧基甲基氨基甲基尿苷；cmnm5U(5-羧基甲基氨基甲基尿苷)；5-氨甲酰基甲基尿苷TP；mcm5Um(5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基尿苷)；mcm5s2U(5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷)；mcm5U(5-甲氧基羰基甲基尿苷)；mo5U(5-甲氧基尿苷)；m5s2U(5-甲基-2-硫尿苷)；mnm5se2U(5-甲基氨基甲基-2-硒基尿苷)；mnm5s2U(5-甲基氨基甲基-2-硫尿苷)；mnm5U(5-甲基氨基甲基尿苷)；m5D(5-甲基二氢尿苷)；5-氧基乙酸-尿苷TP；5-氧基乙酸-甲酯-尿苷TP；二氢尿嘧啶；假尿嘧啶；N1-甲基-假-尿嘧啶；N1-乙基-假-尿嘧啶；cmo5U(尿苷5-氧基乙酸)；mcmo5U(尿苷5-氧基乙酸甲酯)；3-(3-氨基-3-羧基丙基)-尿苷TP；5-(异-戊烯基氨基甲基)-2-硫尿苷TP；5-(异-戊烯基氨基甲基)-2'-O-甲基尿苷TP；5-(异-戊烯基氨基甲基)尿苷TP；5-丙炔基尿嘧啶；a-硫-尿苷；1-(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2(硫)-假尿嘧啶；1-(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2,4-(二硫)假尿嘧啶；1-(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-4-(硫)假尿嘧啶；1-(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-假尿嘧啶；1-(氨基羰基乙烯基)-2(硫)-假尿嘧啶；1-(氨基羰基乙烯基)-2,4-(二硫)假尿嘧啶；1-(氨基羰基乙烯基)-4-(硫)假尿嘧啶；1-(氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶；1-取代的2(硫)-假尿嘧啶；1-取代的2,4-(二硫)假尿嘧啶；1-取代的4-(硫)假尿嘧啶；1-取代的假尿嘧啶；1-(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2-(硫)-假尿嘧啶；1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷TP；1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假-UTP；1-甲基-假-UTP；1-乙基-假-UTP；2-(硫)假尿嘧啶；2'脱氧尿苷；2'氟尿苷；2-(硫)尿嘧啶；2,4-(二硫)假尿嘧啶；2'甲基、2'氨基、2'叠氮基、2'氟-鸟苷；2'-氨基-2'-脱氧-UTP；2'-叠氮基-2'-脱氧-UTP；2'-叠氮基-脱氧尿苷TP；2′-O-甲基假尿苷；2′脱氧尿苷；2′氟尿苷；2′-脱氧-2'-a-氨基尿苷TP；2′-脱氧-2'-a-叠氮基尿苷TP；2-甲基假尿苷；3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶；4-(硫)假尿嘧啶；4-(硫)假尿嘧啶；4-(硫)尿嘧啶；4-硫尿嘧啶；5-氨基尿嘧啶；5-(1,3-二唑-1-烷基)尿嘧啶；5-(2-氨基丙基)尿嘧啶；5-(氨基烷基)尿嘧啶；5-(二甲基氨基烷基)尿嘧啶；5-(胍基烷基)尿嘧啶；5-(甲氧基羰基甲基)-2-(硫)尿嘧啶；5-(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶；5-(甲基)2-(硫)尿嘧啶；5-(甲基)2,4-(二硫)尿嘧啶；5-(甲基)-4-(硫)尿嘧啶；5-(甲基氨基甲基)-2-(硫)尿嘧啶；5-(甲基氨基甲基)-2,4-(二硫)尿嘧啶；5-(甲基氨基甲基)-4-(硫)尿嘧啶；5-(丙炔基)尿嘧啶；5-(三氟甲基)尿嘧啶；5-(2-氨基丙基)尿嘧啶；5-(烷基)-2-(硫)假尿嘧啶；5-(烷基)-2,4-(二硫)假尿嘧啶；5-(烷基)-4-(硫)假尿嘧啶；5-(烷基)假尿嘧啶；5-(烷基)尿嘧啶；5-(烯基)尿嘧啶；5-(炔基)尿嘧啶；5-(烯丙基氨基)尿嘧啶；5-(氰基烷基)尿嘧啶；5-(二烷基氨基烷基)尿嘧啶；5-(二甲基氨基烷基)尿嘧啶；5-(胍基烷基)尿嘧啶；5-(卤基)尿嘧啶；5-(1,3-二唑-1-烷基)尿嘧啶；5-(甲氧基)尿嘧啶；5-(甲氧基羰基甲基)-2-(硫)尿嘧啶；5-(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶；5-(甲基)2(硫)尿嘧啶；5-(甲基)-2,4-(二硫)尿嘧啶；5-(甲基)-4-(硫)尿嘧啶；5-(甲基)-2-(硫)假尿嘧啶；5-(甲基)-2,4-(二硫)假尿嘧啶；5-(甲基)-4-(硫)假尿嘧啶；5-(甲基)假尿嘧啶；5-(甲基氨基甲基)-2-(硫)尿嘧啶；5-(甲基氨基甲基)-2,4(二硫)尿嘧啶；5-(甲基氨基甲基)-4-(硫)尿嘧啶；5-(丙炔基)尿嘧啶；5-(三氟甲基)尿嘧啶；5-氨基烯丙基-尿苷；5-溴-尿苷；5-碘-尿苷；5-尿嘧啶；6-(偶氮)尿嘧啶；6-(偶氮)尿嘧啶；6-氮杂-尿苷；烯丙基氨基-尿嘧啶；氮杂尿嘧啶；脱氮尿嘧啶；5-甲基尿嘧啶；5-(羟基甲基)尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；N3-(甲基)尿嘧啶；假-UTP-1-2-乙酸；假尿嘧啶；4-硫-假-UTP；1-羧基甲基-假尿苷；1-甲基-1-脱氮-假尿苷；1-丙炔基-尿苷；1-牛磺酸甲基-1-甲基-尿苷；1-牛磺酸甲基-4-硫-尿苷；1-牛磺酸甲基-假尿苷；2-甲氧基-4-硫-假尿苷；2-硫-1-甲基-1-脱氮-假尿苷；2-硫-1-甲基-假尿苷；2-硫-5-氮杂-尿苷；2-硫-二氢假尿苷；2-硫-二氢尿苷；2-硫-假尿苷；4-甲氧基-2-硫-假尿苷；4-甲氧基-假尿苷；4-硫-1-甲基-假尿苷；4-硫-假尿苷；5-氮杂-尿苷；二氢假尿苷；(±)1-(2-羟基丙基)假尿苷TP；(2R)-1-(2-羟基丙基)假尿苷TP；(2S)-1-(2-羟基丙基)假尿苷TP；(E)-5-(2-溴-乙烯基)阿糖-尿苷TP；(E)-5-(2-溴-乙烯基)尿苷TP；(Z)-5-(2-溴-乙烯基)阿糖-尿苷TP；(Z)-5-(2-溴-乙烯基)尿苷TP；1-(2，2,2-三氟乙基)-假-UTP；1-(2,2,3,3,3-五氟丙基)假尿苷TP；1-(2,2-二乙氧基乙基)假尿苷TP；1-(2，4,6-三甲基苯甲基)假尿苷TP；1-(2,4,6-三甲基-苯甲基)假-UTP；1-(2,4,6-三甲基-苯基)假-UTP；1-(2-氨基-2-羧基乙基)假-UTP；1-(2-氨基-乙基)假-UTP；1-(2-羟基乙基)假尿苷TP；1-(2-甲氧基乙基)假尿苷TP；1-(3,4-双-三氟甲氧基苯甲基)假尿苷TP；1-(3，4-二甲氧基苯甲基)假尿苷TP；1-(3-氨基-3-羧基丙基)假-UTP；1-(3-氨基-丙基)假-UTP；1-(3-环丙基-丙-2-炔基)假尿苷TP；1-(4-氨基-4-羧基丁基)假-UTP；1-(4-氨基-苯甲基)假-UTP；1-(4-氨基-丁基)假-UTP；11(4-氨基-苯基)假-UTP；1-(4-叠氮基苯甲基)假尿苷TP；1-(4-溴苯甲基)假尿苷TP；1-(4-氯苯甲基)假尿苷TP；1-(4-氟苯甲基)假尿苷TP；1-(4-碘苯甲基)假尿苷TP；1-(4-甲磺酰基苯甲基)假尿苷TP；1-(4-甲氧基苯甲基)假尿苷TP；1-(4-甲氧基-苯甲基)假-UTP；1-(4-甲氧基-苯基)假-UTP；1-(4-甲基苯甲基)假尿苷TP；1-(4-甲基-苯甲基)假-UTP；1-(4-硝基苯甲基)假尿苷TP；1-(4-硝基-苯甲基)假-UTP；1(4-硝基-苯基)假-UTP；1-(4-硫甲氧基苯甲基)假尿苷TP；1-(4-三氟甲氧基苯甲基)假尿苷TP；1-(4-三氟甲基苯甲基)假尿苷TP；1-(5-氨基-戊基)假-UTP；1-(6-氨基-己基)假-UTP；1，6-二甲基-假-UTP；1-[3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酰基]假尿苷TP；1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-丙酰基}假尿苷TP；1-乙酰基假尿苷TP；1-烷基-6-(1-丙炔基)-假-UTP；1-烷基-6-(2-丙炔基)-假-UTP；1-烷基-6-烯丙基-假-UTP；1-烷基-6-乙炔基-假-UTP；1-烷基-6-高烯丙基-假-UTP；1-烷基-6-乙烯基-假-UTP；1-烯丙基假尿苷TP；1-氨基甲基-假-UTP；1-苯甲酰基假尿苷TP；1-苯甲基氧基甲基假尿苷TP；1-苯甲基-假-UTP；1-生物素基-PEG2-假尿苷TP；1-生物素基假尿苷TP；1-丁基-假-UTP；1-氰基甲基假尿苷TP；1-环丁基甲基-假-UTP；1-环丁基-假-UTP；1-环庚基甲基-假-UTP；1-环庚基-假-UTP；1-环己基甲基-假-UTP；1-环己基-假-UTP；1-环辛基甲基-假-UTP；1-环辛基-假-UTP；1-环戊基甲基-假-UTP；1-环戊基-假-UTP；1-环丙基甲基-假-UTP；1-环丙基-假-UTP；1-乙基-假-UTP；1-己基-假-UTP；1-高烯丙基假尿苷TP；1-羟基甲基假尿苷TP；1-异-丙基-假-UTP；1-me-2-硫-假-UTP；1-me-4-硫-假-UTP；1-me-α-硫-假-UTP；1-甲磺酰基甲基假尿苷TP；1-甲氧基甲基假尿苷TP；1-甲基-6-(2，2,2-三氟乙基)假-UTP；1-甲基-6-(4-(N-吗啉基))-假-UTP；1-甲基-6-(4-硫(N-吗啉基))-假-UTP；1-甲基-6-(经取代的苯基)假-UTP；1-甲基-6-氨基-假-UTP；1-甲基-6-叠氮基-假-UTP；1-甲基-6-溴-假-UTP；1-甲基-6-丁基-假-UTP；1-甲基-6-氯-假-UTP；1-甲基-6-氰基-假-UTP；1-甲基-6-二甲基氨基-假-UTP；1-甲基-6-乙氧基-假-UTP；1-甲基-6-羧酸乙酯-假-UTP；1-甲基-6-乙基-假-UTP；1-甲基-6-氟-假-UTP；1-甲基-6-甲酰基-假-UTP；1-甲基-6-羟基氨基-假-UTP；1-甲基-6-羟基-假-UTP；1-甲基-6-碘-假-UTP；1-甲基-6-异-丙基-假-UTP；1-甲基-6-甲氧基-假-UTP；1-甲基-6-甲基氨基-假-UTP；1-甲基-6-苯基-假-UTP；1-甲基-6-丙基-假-UTP；1-甲基-6-叔丁基-假-UTP；1-甲基-6-三氟甲氧基-假-UTP；1-甲基-6-三氟甲基-假-UTP；1-(N-吗啉基)甲基假尿苷TP；1-戊基-假-UTP；1-苯基-假-UTP；1-三甲基乙酰基假尿苷TP；1-炔丙基假尿苷TP；1-丙基-假-UTP；1-丙炔基-假尿苷；1-对甲苯基-假-UTP；1-叔丁基-假-UTP；1-硫甲氧基甲基假尿苷TP；1-硫(N-吗啉基)甲基假尿苷TP；1-三氟乙酰基假尿苷TP；1-三氟甲基-假-UTP；1-乙烯基假尿苷TP；2,2'-脱水-尿苷TP；2'-溴-脱氧尿苷TP；2'-F-5-甲基-2'-脱氧-UTP；2'-OMe-5-me-UTP；2'-OMe-假-UTP；2'-a-乙炔基尿苷TP；2'-a-三氟甲基尿苷TP；2′-b-乙炔基尿苷TP；2'-b-三氟甲基尿苷TP；2′-脱氧-2',2'-二氟尿苷TP；2'-脱氧-2'-a-巯基尿苷TP；2'-脱氧-2′-a-硫甲氧基尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-氨基尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-叠氮基尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-溴尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-氯尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-氟尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-碘尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-巯基尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-硫甲氧基尿苷TP；2-甲氧基-4-硫-尿苷；2-甲氧基尿苷；2'-O-甲基-5-(1-丙炔基)尿苷TP；3-烷基-假-UTP；4'-叠氮基尿苷TP；4'-碳环尿苷TP；4'-乙炔基尿苷TP；5-(1-丙炔基)阿糖-尿苷TP；5-(2-呋喃基)尿苷TP；5-氰基尿苷TP；5-二甲基氨基尿苷TP；5'-高-尿苷TP；5-碘-2'-氟-脱氧尿苷TP；5-苯基乙炔基尿苷TP；5-三氘代甲基-6-氘代尿苷TP；5-三氟甲基-尿苷TP；5-乙烯基阿糖尿苷TP；6-(2，2,2-三氟乙基)-假-UTP；6-(4-(N-吗啉基))-假-UTP；6-(4-硫(N-吗啉基))-假-UTP；6-(经取代的苯基)-假-UTP；6-氨基-假-UTP；6-叠氮基-假-UTP；6-溴-假-UTP；6-丁基-假-UTP；6-氯-假-UTP；6-氰基-假-UTP；6-二甲基氨基-假-UTP；6-乙氧基-假-UTP；6-羧酸乙酯-假-UTP；6-乙基-假-UTP；6-氟-假-UTP；6-甲酰基-假-UTP；6-羟基氨基-假-UTP；6-羟基-假-UTP；6-碘-假-UTP；6-异-丙基-假-UTP；6-甲氧基-假-UTP；6-甲基氨基-假-UTP；6-甲基-假-UTP；6-苯基-假-UTP；6-苯基-假-UTP；6-丙基-假-UTP；6-叔丁基-假-UTP；6-三氟甲氧基-假-UTP；6-三氟甲基-假-UTP；α-硫-假-UTP；假尿苷1-(4-甲基苯磺酸)TP；假尿苷1-(4-甲基苯甲酸)TP；假尿苷TP 1-[3-(2-乙氧基)]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-(2-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-{2(2-乙氧基)-乙氧基}-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-甲基膦酸；假尿苷TP 1-甲基膦酸二乙酯；假-UTP-N1-3-丙酸；假-UTP-N1-4-丁酸；假-UTP-N1-5-戊酸；假-UTP-N1-6-己酸；假-UTP-N1-7-庚酸；假-UTP-N1-甲基-对苯甲酸；假-UTP-N1-对苯甲酸；yW(怀俄丁苷(Wybutosine))；OHyW(羟基怀俄丁苷)；imG2(异怀俄苷)；o2yW(过氧基怀俄丁苷)；OHyW*(欠修饰的羟基怀俄丁苷)；imG-14(4-去甲基怀俄苷)；2,6-(二氨基)嘌呤；1-(氮杂)-2-(硫)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基；1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；1,3，5-(三氮杂)-2,6-(二氧杂)-萘；2-(氨基)嘌呤；2,4,5-(三甲基)苯基；2'甲基、2′氨基、2′叠氮基、2'氟-胞苷；2'甲基、2′氨基、2'叠氮基、2'氟-腺嘌呤；2′甲基、2′氨基、2′叠氮基、2′氟-尿苷；2′-氨基-2′-脱氧核糖；2-氨基-6-氯-嘌呤；2-氮杂-肌苷基；2'-叠氮基-2′-脱氧核糖；2′氟-2'-脱氧核糖；2′-氟-经修饰的碱基；2′-O-甲基-核糖；2-氧代-7-氨基吡啶并嘧啶-3-基；2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基；2-吡啶酮；3-硝基吡咯；3-(甲基)-7-(丙炔基)异喹诺酮基(carbostyrilyl)；3-(甲基)异喹诺酮基；4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)吲哚基；4,6-(二甲基)吲哚基；5-硝基吲哚；5-取代的嘧啶；5-(甲基)异喹诺酮基；5-硝基吲哚；6-(氮杂)嘧啶；6-(偶氮)胸腺嘧啶；6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基；6-氯-嘌呤；6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(氮杂)吲哚基；7-(胍基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫)-3-(氮杂)-吩噁嗪l-基；7-(胍基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基；7-(胍基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-(胍基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(胍基烷基-羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基；7-(胍基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(丙炔基)异喹诺酮基；7-(丙炔基)异喹诺酮基；丙炔基-7-(氮杂)吲哚基；7-脱氮-肌苷基；7取代的1-(氮杂)-2-(硫)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7取代的1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；9-(甲基)-咪唑并吡啶基；氨基吲哚基；蒽基；双-邻位-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；双-邻位取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；二氟甲苯基；次黄嘌呤；咪唑并吡啶基；肌苷基；异喹诺酮基；异鸟苷(isoguanisine)；N2-取代的嘌呤；N6-甲基-2-氨基-嘌呤；N6取代的嘌呤；N-烷基化衍生物；萘基；硝基苯并咪唑基；硝基咪唑基；硝基吲唑基；硝基吡唑基；鲁布拉润(nubularine)；O6-取代的嘌呤；O-烷基化衍生物；邻位-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；邻位取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；氧间型霉素(oxoformycin)TP；对(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；对位取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；稠五苯基；丙烯合蒽基；苯基；丙炔基-7-(氮杂)吲哚基；芘基；吡啶并嘧啶-3-基；吡啶并嘧啶-3-基；2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基；吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；吡咯并嘧啶基；吡咯并吡嗪基；均二苯乙烯基(stilbenzyl)；经取代的1,2,4-三唑；并四苯基；杀结核菌素(tubercidine)；黄嘌呤；黄苷-5'-TP；2-硫-泽布拉林；5-氮杂-2-硫-泽布拉林；7-脱氮-2-氨基-嘌呤；吡啶-4-酮核糖核苷；2-氨基核糖苷-TP；间型霉素(formycin)A TP；间型霉素B TP；吡咯离氨酸(pyrrolosine)TP；2'-OH-阿糖-腺苷TP；2′-OH-阿糖-胞苷TP；2'-OH-阿糖-尿苷TP；2′-OH-阿糖-鸟苷TP；5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷TP；N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)腺苷TP；氢(无碱基残基)；及2′-O-甲基-U。在一些实施方式中，RNA分子包括前述经修饰的核碱基中的至少两者(例如2、3、4者或更多者)的组合。在一些实施方式中，前述修饰中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
在一些实施方式中，RNA分子中的经修饰的核碱基包含假尿苷(ψ)、2-硫尿苷(s2U)、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫-1-甲基-假尿苷、2-硫-5-氮杂-尿苷、2-硫-二氢假尿苷、2-硫-二氢尿苷、2-硫-假尿苷、4-甲氧基-2-硫-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫-1-甲基-假尿苷、4-硫-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2′-O-甲基尿苷、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、a-硫-鸟苷、a-硫-腺苷、5-氰基尿苷、4'-硫尿苷7-脱氮-腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)、2,6-二氨基嘌呤、肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、7-脱氮-鸟苷、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preQO)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preQl)、7-甲基-鸟苷(m7G)、1-甲基-鸟苷(m1G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、2,8-二甲基腺苷、2-香叶基硫尿苷、2-立西啶、2-硒基尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)-5,6-二氢尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷、3-甲基假尿苷、5-(羧基羟基甲基)-2'-O-甲基尿苷甲酯、5-氨基甲基-2-香叶基硫尿苷、5-氨基甲基-2-硒基尿苷、5-氨基甲基尿苷、5-氨甲酰基羟基甲基尿苷、5-氨甲酰基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基-2-香叶基硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基-2-硒基尿苷、5-氰基甲基尿苷、5-羟基胞苷、5-甲基氨基甲基-2-香叶基硫尿苷、7-氨基羧基丙基-去甲基怀俄苷、7-氨基羧基丙基怀俄苷、7-氨基羧基丙基怀俄苷甲酯、8-甲基腺苷、N4,N4-二甲基胞苷、N6-甲酰基腺苷、N6-羟基甲基腺苷、阿格吗特啶(agmatidine)、环状N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、麸氨酰基-Q核苷、甲基化的欠修饰的羟基怀俄丁苷、N4,N4,2′-O-三甲基胞苷、香叶基化的5-甲基氨基甲基-2-硫尿苷、香叶基化的5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、Q碱基、preQO碱基、preQI碱基，及其两者或更多者的组合。在一些实施方式中，RNA分子包括前述经修饰的核碱基中的至少两者(例如2、3、4者或更多者)的组合，包括但不限于化学修饰。在一些实施方式中，前述经修饰的核碱基中的1、2、3、4、5者或更多者为排除在本文所揭示的RNA分子外。
具有经修饰的胞嘧啶的例示性核碱基及核苷包括5-氮杂-胞苷、6-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷(m3C)、N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲酰基-胞苷(f5C)、N4-甲基-胞苷(m4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤基-胞苷(例如5-碘-胞苷)、5-羟基甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫-胞苷(s2C)、2-硫-5-甲基-胞苷、4-硫-假异胞苷、4-硫-1-甲基-假异胞苷、4-硫-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫-泽布拉林、2-硫-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、立西啶(k2C)、a-硫-胞苷、2'-O-甲基-胞苷(Cm)、5,2'-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2'-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4，2'-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲酰基-2'-O-甲基-胞苷(f5Cm)、N4,N4,2′-O-三甲基-胞苷(m42Cm)、1-硫-胞苷、2'-F-阿糖-胞苷、2'-F-胞苷及2'-OH-阿糖-胞苷。在一些实施方式中，前述经修饰的胞嘧啶中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
在一些实施方式中，经修饰的核碱基为经修饰的尿苷。具有经修饰的尿嘧啶的例示性核碱基及核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫-5-氮杂-尿苷、2-硫-尿苷(s2U)、4-硫-尿苷(s4U)、4-硫-假尿苷、2-硫-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤基-尿苷(例如5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、5-氰基尿苷、3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、尿苷5-氧基乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧基乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羟基甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟基甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、5-甲基氨基甲基-2-硫-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒基-尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫-尿苷(cmnmVU)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(xm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫-尿苷(xmVu)、1-牛磺酸甲基-4-硫-假尿苷、5-甲基-尿苷(m5U，例如具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1Ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲基-2-硫-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫-假尿苷(m1s4Ψ)、4-硫-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3Ψ)、2-硫-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5，6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫-二氢尿苷、2-硫-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫-尿苷(inm5s2U)、a-硫-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5,2′-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2′-O-甲基-假尿苷(Ψm)、2-硫-2'-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基氨基甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3，2′-O-二甲基-尿苷(m3Um)、及5-(异戊烯基氨基甲基)-2'-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫-尿苷、脱氧胸苷、2'-F-阿糖-尿苷、2'-F-尿苷、2'-OH-阿糖-尿苷、5-(2-羰基甲氧基乙烯基)尿苷及5-[3-(l-E-丙烯基氨基)]尿苷。在一些实施方式中，前述经修饰的尿苷中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
在本发明的一些实施方式中，经修饰的核苷酸包括N1-甲基假尿苷和/或假尿苷中的任一者。
在一些实施方式中，RNA分子包含经N1-甲基假尿苷修饰的核苷酸。在一些实施方式中，RNA分子包含经假尿苷修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，RNA包含经修饰的核苷来代替至少一个尿苷。在一些实施方式中，RNA包含代替各尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，RNA分子包含至少一个尿苷经N1-甲基假尿苷置换的序列。在一些实施方式中，RNA分子包含所有尿苷经N1-甲基假尿苷置换的序列。N1-甲基假尿苷在序列中表示为“Ψ”。如本文所用，术语“尿嘧啶”描述可出现在RNA的核酸中的一种核碱基。如本文所用，术语“尿苷”描述可出现在RNA中的一种核苷。“假尿苷”为经修饰的核苷的一个实施例，其为尿苷的异构物，其中尿嘧啶经由碳-碳键而非氮-碳糖苷键连接至戊糖环。
在一些实施方式中，RNA分子包含至少一个尿苷经N1-甲基假尿苷和/或假尿苷置换的核酸序列。在一些实施方式中，RNA分子包含至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的尿苷经N1-甲基假尿苷和/或假尿苷置换的核酸序列：1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方式中，RNA分子包含所有尿苷经N1-甲基假尿苷和/或假尿苷置换的核酸序列。
在一些实施方式中，经修饰的核碱基为经修饰的腺嘌呤。具有经修饰的腺嘌呤的例示性核碱基及核苷包括2-氨基-嘌呤、2、6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤基-嘌呤(例如2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤基-嘌呤(例如6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)、2-甲基硫-N6-甲基-腺苷(ms2m6A)、N6-异戊烯基-腺苷(i6A)、2-甲基硫-N6-异戊烯基-腺苷(ms2i6A)、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(io6A)、2-甲基硫-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(ms2io6A)、N6-甘氨酰基氨甲酰基-腺苷(g6A)、N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺苷(t6A)、N6-甲基-N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺苷(m6t6A)、2-甲基硫-N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺苷(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺苷(m62A)、N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基-腺苷(hn6A)、2-甲基硫-N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基-腺苷(ms2hn6A)、N6-乙酰基-腺苷(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲基硫-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、a-硫-腺苷、2'-O-甲基-腺苷(Am)、N6，2′-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6，N6，2'-O-三甲基-腺苷(m62Am)、1,2'-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2′-O-核糖基腺苷(磷酸酯)(Ar(p))、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫-腺苷、8-叠氮基-腺苷、2'-F-阿糖-腺苷、2'-F-腺苷、2′-OH-阿糖-腺苷、及N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺苷。在一些实施方式中，前述经修饰的腺嘌呤中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
在一些实施方式中，经修饰的核碱基为经修饰的鸟嘌呤。具有经修饰的鸟嘌呤的例示性核碱基及核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、4-去甲基-怀俄苷(imG-14)、异怀俄苷(imG2)、怀俄丁苷(yW)、过氧基怀俄丁苷(o2yW)、羟基怀俄丁苷(OhyW)、欠修饰的羟基怀俄丁苷(OhyW*)、7-脱氮-鸟苷、Q核苷(Q)、环氧基Q核苷(oQ)、半乳糖苷-Q核苷(galQ)、甘露糖基-Q核苷(manQ)、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preQo)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preQ1)、古嘌苷(G+)、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫-鸟苷、6-硫-7-脱氮-鸟苷、6-硫-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷(m7G)、6-硫-7-甲基-鸟苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基-鸟苷(m1G)、N2-甲基-鸟苷(m2G)、N2,N2-二甲基-鸟苷(m22G)、N2,7-二甲基-鸟苷(m2′7G)、N2、N2,7-二甲基-鸟苷(m2'2'7G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫-鸟苷、N2-甲基-6-硫-鸟苷、N2，N2-二甲基-6-硫-鸟苷、a-硫-鸟苷、2'-O-甲基-鸟苷(Gm)、N2-甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m2Gm)、N2，N2-二甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m22Gm)、1-甲基-2'-O-甲基-鸟苷、N2，7-二甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m2'7Gm)、2'-O-甲基-肌苷(Im)、1，2'-O-二甲基-肌苷(m1Im)、2'-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)(Gr(p))、1-硫-鸟苷、O6-甲基-鸟苷、2'-F-阿糖-鸟苷及2'-F-鸟苷。在一些实施方式中，前述经修饰的鸟嘌呤中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
在一些实施方式中，对于特定修饰而言，RNA分子均匀地经修饰(例如完全修饰，在整个序列中经修饰)。在一些实施方式中，RNA分子可沿分子的整个长度部分地或完全(例如均匀地)经修饰。举例而言，本发明的多核苷酸中或其给定预定序列区中，一或多种或所有或给定类型的核苷酸(例如嘌呤和/或嘧啶，或A、G、U、C中的任何一或多种或所有)可均匀地经修饰。在一些实施方式中，本发明的多核苷酸中(或其给定序列区中)的所有核苷酸X为经修饰的核苷酸，其中X可为核苷酸A、G、U、C中的任一者，和/或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C和/或A+G+C中的任一者。举例而言，多核苷酸可均匀地经假尿苷修饰，意谓RNA序列中的所有尿苷残基均经假尿苷置换。类似地，多核苷酸可由用经修饰的残基(诸如上文所阐述的那些)进行置换而对序列中存在的任何类型的核苷残基进行均匀地修饰。经修饰的核苷酸可经具有单一独特结构的一种化合物置换，或可经复数种具有不同结构(例如2、3、4种或更多种独特结构)的化合物置换。
RNA分子可含有为或为约1％～100％的经修饰的核苷酸(与总体核苷酸含量有关，或与一或多种类型的核苷酸(例如A、G、U和/或C中的任何一或多者)有关)(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％)或任何中间百分比(例如1％～20％、1％～25％、1％～50％、1％～60％、1％～70％、1％～80％、1％～90％、1％～95％、10％～20％、10％～25％、10％～50％、10％～60％、10％～70％、10％～80％、10％～90％、10％～95％、10％～100％、20％～25％、20％～50％、20％～60％、20％～70％、20％～80％、20％～90％、20％～95％、20％～100％、50％～60％、50％～70％、50％～80％、50％～90％、50％～95％、50％～100％、70％～80％、70％～90％、70％～95％、70％～100％、80％～90％、80％～95％、80％～100％、90％～95％、90％～100％、及95％～100％)。应理解，任何剩余百分比由未经修饰A、G、U和/或C的存在补足。
在一些实施方式中，RNA分子可包括氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或甲基磷酸酯键联。
在一些实施方式中，RNA分子可包括一或多种赋予多核苷酸适用特性的结构和/或化学修饰和/或改变，在一些实施方式中，包括细胞或生物体中降低的降解和/或缺乏对其中引入RNA分子的细胞的先天性免疫反应的实质上诱导。如本文所用，“结构”特征或修饰为两个或更多个连接核苷酸在RNA分子中插入、缺失、复制、倒置和/或随机化而不对核苷酸本身进行显著化学修饰的特征或修饰。因为化学键将必然断裂且重新形成以实现结构修饰，因此结构修饰具有化学性质且因此为化学修饰。然而，结构修饰将产生不同核苷酸序列。举例而言，多核苷酸“ATCG”可化学修饰为“AT-5meC-G”。相同多核苷酸可自“ATCG”结构修饰为“ATCCCG”。此处，已插入二核苷酸“CC”，从而引起多核苷酸的结构修饰。
在一些实施方式中，相对于包含标准核苷酸及核苷的未经修饰的核酸，引入细胞或生物体中的经修饰的RNA分子分别展现细胞或生物体中降低的降解。在一些实施方式中，相对于包含标准核苷酸及核苷的未经修饰的核酸，引入细胞或生物体中的经修饰的RNA分子可分别展现细胞或生物体中降低的免疫原性(例如降低的先天性反应)。
在一些实施方式中，RNA分子可包括一或多个除任何5'帽结构以外的经修饰的核苷酸。在一些实施方式中，RNA分子不包括经修饰的核苷酸，例如不包括经修饰的核碱基，且RNA分子中的所有核苷酸均为习知标准核糖核苷酸A、U、G及C，除可包括例如7-甲基鸟苷的视情况存在的5′帽以外，其在下文进一步描述。在一些实施方式中，RNA可包括包含7'-甲基鸟苷的5′帽，且前1、2或3个5'核糖核苷酸可在核糖的2'位置处甲基化。
【B.5'帽】
在一些实施方式中，本文所述的RNA分子包括5'帽，其通常对RNA的5'端“加帽”且使RNA分子稳定。
在一些实施方式中，5'帽部分为天然5'帽。“天然5'帽”定义为包括经由5'-5'三磷酸酯键键合至mRNA分子的5'端的7-甲基鸟苷的帽。在一些实施方式中，包括在5'帽中的鸟苷核苷可例如由碱基(鸟嘌呤)上的一或多个位置处(例如7位置处)的甲基化和/或由核糖的一或多个位置处的甲基化而经修饰。在一些实施方式中，包括在5'帽中的鸟苷核苷包含核糖处的3'O甲基化(3'OMeG)。在一些实施方式中，包括在5'帽中的鸟苷核苷包含鸟嘌呤的7位置处的甲基化(m7G)。在一些实施方式中，包括在5'帽中的鸟苷核苷包含鸟嘌呤的7位置处的甲基化及核糖处的3'O甲基化(m7(3′OMeG))。5'帽可在RNA合成期间并入(例如，共转录加帽)，或可在RNA转录之后酶促工程改造(例如，转录后加帽)。在一些实施方式中，用本文所揭示的帽进行共转录加帽与用适当参考比较物进行共转录加帽相比，RNA的加帽效率增加。在一些实施方式中，提高加帽效率可增加RNA的翻译效率和/或翻译速率，和/或增加所编码多肽的表达。在一些实施方式中，加帽在RNA分子的纯化(例如切向流过滤)之后进行。
在一些实施方式中，本文所述的RNA包含5'帽或5'帽类似物，例如帽0、帽1或帽2。在一些实施方式中，所提供的RNA不具有未加帽的5'-三磷酸酯。在一些实施方式中，RNA的5'端以经修饰的核糖核苷酸加帽。在一些实施方式中，5'帽部分为5'帽类似物。在一些实施方式中，RNA可用5'帽类似物加帽。帽结构包括但不限于7mG(5')ppp(5')N1pN2p(帽0)、7mG(5')ppp(5')N1 mpNp(帽1)、及7mG(5')ppp(5′)N1 mpN2 mp(帽2)。在一些实施方式中，前述帽结构中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
在一些实施方式中，本文所述的RNA包含帽0。在一些实施方式中，帽0为N7-甲基鸟苷，且帽0结构包含在鸟嘌呤的7位置处甲基化的鸟苷核苷(m7G)。在一些实施方式中，帽0结构经由5′-5′三磷酸酯键键合至RNA，且在本文中也称为m7G、m7Gppp和/或m7G(5′)ppp(5′)。5′帽可用结构7mG(5′)ppp(5′)N1pN2p(帽0)或其衍生物甲基化，其中N为携带5′帽的核酸的末端5'核苷酸，通常mRNA的5'端。用于加帽的例示性酶促反应可包括使用包括mRNA三磷酸酶、鸟苷酰基转移酶及鸟嘌呤-7-甲基转移酶的牛痘病毒加帽酶(VCE)，其催化N7-单甲基化帽0结构的构建。帽0结构在维持RNA分子的稳定性及翻译功效方面起重要作用。在细胞中，帽0结构对于携载帽的mRNA的高效翻译为至关重要的。
在一些实施方式中，本文所述的RNA包含例如本文所述的帽1。RNA分子的5'帽可进一步由2'-O-甲基转移酶对2'O位置进行修饰，该2'-O-甲基转移酶引起帽1结构(m7Gppp[m2'-Ο]N)的产生，其可进一步增加翻译效率。在一些实施方式中，帽1结构包含在鸟嘌呤的7位置处甲基化的鸟苷核苷(m7G)及RNA中经2′O甲基化的第一个核苷酸(2′OmeN1)。在一些实施方式中，帽1结构经由5'-5'三磷酸酯键键合至RNA且在本文中也称为m7GpppNm，其中Nm表示具有2'O甲基化、7mG(5')ppp(5′)N1 mpNp、m7Gppp(2′OMeN1)和/或m7G(5')ppp(5′)(2'OMeN1)的任何核苷酸。在一些实施方式中，N1选自A、C、G或U。在一些实施方式中，N1为A。在一些实施方式中，N1为C。在一些实施方式中，N1为G。在一些实施方式中，N1为U。在一些实施方式中，m7G(5')ppp(5′)(2'OmeN1)帽1结构包含第二核苷酸N2，其为位置2处的帽近端核苷酸且选自A、G、C或U(m7G(5′)ppp(5')(2′OmeN1)N2)。在一些实施方式中，N2为A。在一些实施方式中，N2为C。在一些实施方式中，N2为G。在一些实施方式中，N2为U。
在一些实施方式中，帽1结构包含在鸟嘌呤的7位置处甲基化的鸟苷核苷(m7G)及一或多个额外修饰(例如核糖上的甲基化)以及RNA中经2'O甲基化的第一核苷酸。在一些实施方式中，帽1结构包含在鸟嘌呤的7位置处甲基化的鸟苷核苷、核糖处的3'O甲基化(m7(3'OMeG))及RNA中经2′O甲基化的第一核苷酸(2'OMeN1)。在一些实施方式中，帽1结构经由5′-5'三磷酸酯键键合至RNA，且在本文中也称为m7(3′OMeG)ppp(2′OMeN1)和/或m7(3'OMeG)(5′)ppp(5′)(2'OMeN1)。在一些实施方式中，N1选自A、C、G或U。在一些实施方式中，N1为A。在一些实施方式中，N1为C。在一些实施方式中，N1为G。在一些实施方式中，N1为U。在一些实施方式中，m7(3'OMeG)(5')ppp(5′)(2′OMeN1)帽1结构包含第二核苷酸N2，其为位置2处的帽近端核苷酸且选自A、G、C或U(m7(3′OMeG)(5')ppp(5′)(2′OmeN1)N2)。在一些实施方式中，N2为A。在一些实施方式中，N2为C。在一些实施方式中，N2为G。在一些实施方式中，N2为U。在一些实施方式中，前述帽1结构中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
在一些实施方式中，帽1结构中的第二核苷酸可包含一或多种修饰，例如甲基化。在一些实施方式中，本文所述的RNA包含帽2。在一些实施方式中，包含含有2′O甲基化的第二核苷酸的帽1结构为帽2结构。
在一些实施方式中，RNA分子可使用牛痘鸟苷酰基转移酶、鸟苷三磷酸及S-腺苷基-L-甲硫氨酸在5'端处酶促加帽，得到帽0结构。倒置的7-甲基鸟苷帽经由5'-5'三磷酸酯桥添加。或者，使用2'O-甲基转移酶与牛痘鸟苷酰基转移酶得到帽1结构，其中除帽0结构以外，倒数第二个核苷酸上的2'OH基团经甲基化。S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)为用作甲基转移试剂的辅因子。5′帽结构的非限制性实施例为与此项技术中已知的合成5'帽结构(或野生型、天然或生理5'帽结构)相比，尤其帽结合多肽的结合增强、半衰期增加、对5′核酸内切酶的敏感性降低和/或5'去帽减少的那些结构。
举例而言，重组牛痘病毒加帽酶及重组2′O-甲基转移酶可在mRNA的5′末端核苷酸与鸟嘌呤帽核苷酸之间产生典型5'-5′三磷酸酯键联，其中帽鸟嘌呤包括N7甲基化且mRNA的5'末端核苷酸包括2′-O-甲基。此类结构被称为帽1结构。与例如此项技术中已知的其他5'帽类似物结构相比，此帽使得翻译能力及细胞稳定性更高以及细胞促炎性细胞因子的活化减少。
帽物种可包括一或多种经修饰的核苷和/或接头部分。举例而言，帽可包括在其5'位置处由三磷酸酯键联接合的鸟嘌呤核苷酸及在7位置处甲基化的鸟嘌呤(G)核苷酸，例如m7G(5')ppp(5')G，通常书写为m7GpppG。帽物种也可为抗反向帽类似物。可能的帽物种的非限制性清单包括m7GpppG、m7Gpppm7G、m73'dGpppG、m27,O3'GpppG、m27,O3′GppppG、m27,O2′GppppG、m7Gpppm7G、m73′dGpppG、m27，O3′GpppG、m27,O3'GppppG及m27，O2′GppppG。在一些实施方式中，前述帽物种中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
在一些实施方式中，5'端帽包括帽类似物，例如5'端帽可包括鸟嘌呤类似物。例示性鸟嘌呤类似物包括但不限于肌苷、N1-甲基-鸟苷、2′-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷及2-叠氮基-鸟苷。在一些实施方式中，前述鸟嘌呤类似物中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的帽结构外。
在一些实施方式中，加帽区可包括单一帽或形成帽的一系列核苷酸。在此实施方式中，加帽区的长度可为1～10，例如2～9、3～8、4～7、1～5、5～10个，或至少2个或10个或更少核苷酸。在此实施方式中，加帽区的长度为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方式中，不存在帽。在一些实施方式中，第一及第二可操作区的长度可在3～40个核苷酸，例如5～30、10～20、15、或至少4个或30个或更少的范围内，且除起始和/或终止密码子以外可包含一或多个信号和/或限制性酶切序列。在一些实施方式中，第一及第二操作区的长度为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸，且除起始和/或终止密码子以外可包含一或多个信号和/或限制性酶切序列。
5'帽结构的其他实施例包括但不限于甘油基、倒置的脱氧无碱基残基(部分)、4',5'-亚甲基核苷酸、1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4′-硫核苷酸、碳环核苷酸、1,5-无水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、经修饰的碱基核苷酸、苏-呋喃戊糖基核苷酸、非环状3',4'-开环核苷酸、非环状3,4-二羟丁基核苷酸、非环状3,5-二羟基戊基核苷酸、3′-3'-倒置的核苷酸部分、3'-3′-倒置的无碱基部分、3′-2'-倒置的核苷酸部分、3′-2′-倒置的无碱基部分、1,4-丁二醇磷酸酯、3'-氨基磷酸酯、己基磷酸酯、氨基己基磷酸酯、3′-磷酸酯、3′-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、和/或桥联或非桥联甲基膦酸酯部分。在一些实施方式中，前述5'帽结构中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
在一些实施方式中，本发明的RNA分子包含至少一个5′帽结构。在一些实施方式中，本发明的RNA分子不包含5′帽结构。
多种合成5'帽类似物已研发出且为此项技术中已知的，以增强mRNA稳定性及可译性(参见例如Grudzien-Nogalska，E.,Kowalska,J.,Su,W.,Kuhn,A.N.,Slepenkov，S.V.,Darynkiewicz,E.,Sahin,U.,Jemielity,J.及Rhoads,R.E.，Synthetic mRNAs withsuperior translation and stability properties in Synthetic Messenger RNA andCellMetabolism Modulation in Methods in Molecular Biology 69(Rabinovich,P.H.编),2013)。在一个实施方式中，5'加帽结构包含经修饰的5'帽1结构(m7G+m3'-5'-ppp-5'-Am)。在一个实施方式中，5′加帽结构包含(3′OMe)-m2 7,3′-OGppp(m1 2′-O)ApG(TriLinkBioTechnologies)。此分子与天然RNA帽结构一致，因为其以在N7处甲基化的鸟苷开始，且由5'-5'三磷酸酯键键合至所转录RNA的第一所编码核苷酸(在此情况下为腺苷)。此鸟苷也在核糖的3'羟基处甲基化以缓解帽分子的可能反向并入。腺苷上的核糖的2'羟基经甲基化，从而赋予帽1结构。
【C.非翻译区(UTR)】
5'UTR为位于蛋白质开放阅读框的5'端的调节区域，其转录成mRNA但不翻译成氨基酸序列，和/或RNA多核苷酸(诸如mRNA分子)中的对应区。非翻译区(UTR)可存在于开放阅读框的5'端(上游)(5'UTR)和/或开放阅读框的3'端(下游)(3'UTR)。
在一些实施方式中，UTR来源于在mRNA表达所靶向的特定组织(例如淋巴组织)中天然丰富的mRNA。在一些实施方式中，UTR增加蛋白质合成。不受机制或理论所束缚，UTR可由增加mRNA在翻译聚核糖体中的保持时间(讯息稳定性)和/或核糖体基于讯息起始翻译的速率(讯息翻译效率)来增加蛋白质合成。因此，UTR序列可以组织特异性方式延长蛋白质合成。
在一些实施方式中，UTR的调节特征可并入本发明的RNA中以尤其增强分子的稳定性。也可并入特异性特征，以确保转录本在被误导至不希望的器官部位的情况下的受控下调。各种5'UTR及3'UTR序列为此项技术中已知且可用的。
应理解，来自任何基因的任何UTR可并入本发明的RNA的区域中。此外，可利用任何已知基因的多种野生型UTR。提供不为野生型区域的变体的人工UTR也在本发明的范畴内。这些UTR或其部分的置放取向可与其所选自的转录本中相同，或其取向和/或位置可变化。因此，5'和/或3′UTR可倒置、缩短、延长，和/或一或多种其他5'UTR或3′UTR也如此。如本文所用，术语“改变”在与UTR序列有关时，意谓UTR已相对于参考序列以某种方式进行变化。举例而言，5'UTR和/或3'UTR可由上文所教导改变其取向和/或位置而相对于野生型或天然UTR进行改变，和/或可由包括额外核苷酸、缺失核苷酸、交换和/或转位核苷酸而进行改变。这些变化中的任一者产生“改变”的UTR(无论5'和/或3')，包括变异UTR。
在一些实施例中，可使用双重、三重或四重UTR，诸如5'和/或3'UTR。如本文所用，“双”UTR为同一UTR的两个复本串联或实质上串联编码的UTR。举例而言，可使用双重β-球蛋白3′UTR。具有模式化UTR也在本发明的范畴内。如本文所用，“模式化UTR”为反映重复或交替模式的那些UTR，诸如AB AB AB或AABBAABBAABB或ABCABCABC或其变体重复一次、两次或超过3次。在这些模式中，各字母A、B或C表示在核苷酸层级的不同UTR。
RNA可编码属于在特定细胞、组织中和/或在发育期间的一些时间表达的蛋白质家族的所关注多肽。在一些实施方式中，来自这些基因中的任一者的UTR可交换相同或不同的蛋白质家族的任何其他UTR以产生新的RNA分子。如本文所用，“蛋白质家族”以最广泛的意义使用，是指共享至少一种功能、结构、特征、定位、起源和/或表达模式的一组两种或更多种所关注多肽。
在一些实施方式中，5′UTR及3'UTR序列以计算方式得出。在一些实施方式中，5′UTR及3'UTR来源于组织中天然丰富的mRNA。该组织可为例如肝脏、干细胞和/或淋巴组织。淋巴组织可包括例如淋巴球(例如B淋巴球、辅助T淋巴球、细胞毒性T淋巴细胞、调节T淋巴球和/或自然杀手细胞)、巨噬细胞、单核球、树突状细胞、嗜中性球、嗜酸性球及网状红血球中的任一者。在一些实施方式中，5'UTR及3'UTR来源于α病毒(alphavirus)。在一些实施方式中，5'UTR及3′UTR来自野生型α病毒。
在一些实施方式中，非翻译区也可包括翻译增强子组件(TEE)。作为一非限制性实施例，TEE可包括美国申请第20090226470号(其以全文引用的方式并入本文中)中所描述的那些以及此项技术中已知的那些。
【i.5'UTR】
在一些实施方式中，本文所揭示的RNA包含5'UTR。5'UTR(若存在)位于5'端处且以蛋白质编码区的起始密码子上游的转录起始位点开始。5'UTR在5′帽(若存在)下游，例如直接邻近于5′帽。5'UTR可含有各种调节组件，例如5'帽结构、茎环结构及内部核糖体进入位点(IRES)，其可在翻译起始的控制中起作用。5′UTR可含有标志，如Kozak序列，其也涉及核糖体藉以起始许多基因翻译的过程。5'UTR也可形成涉及延伸因子结合的二级结构。
在一些实施方式中，本文所揭示的5′UTR包含例如本文所揭示的帽近端序列。在一些实施方式中，帽近端序列包含邻近于5'帽的序列。在一些实施方式中，帽近端序列包含RNA多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和/或+5的核苷酸。
在一些实施方式中，帽结构包含帽近端序列的一或多个多核苷酸。在一些实施方式中，帽结构包含m7鸟苷帽及RNA多核苷酸的核苷酸+1(N1)。在一些实施方式中，帽结构包含m7鸟苷帽及RNA多核苷酸的核苷酸+2(N2)。在一些实施方式中，帽结构包含m7鸟苷帽及RNA多核苷酸的核苷酸+1及+2(N1及N2)。
阅读本发明的本领域技术人员应了解，在一些实施方式中，帽近端序列(例如残基+1、+2、+3、+4和/或+5中的一或多者)的一或多个残基可借助于包括于帽实体(例如帽1结构等)中而包括于RNA中；或者，在一些实施方式中，帽近端序列中的至少一些残基可以酶促方式添加(例如由聚合酶，诸如T7聚合酶)。举例而言，在其中利用(m2 7,3'-O)Gppp(m2'-O)ApG帽的某些例示性实施方式中，+1及+2残基为帽的(m2 7,3'-O)A及G残基，且+3、+4及+5残基由聚合酶(例如T7聚合酶)添加。
在一些实施方式中，帽近端序列包含帽结构的N1和/或N2，其中N1及N2为任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方式中，N1为A。在一些实施方式中，N1为C。在一些实施方式中，N1为G。在一些实施方式中，N1为U。在一些实施方式中，N2为A。在一些实施方式中，N2为C。在一些实施方式中，N2为G。在一些实施方式中，N2为U。在一些实施方式中，帽近端序列包含帽结构的N1及N2以及N3、N4及N5，其中N1～N5对应于RNA多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和/或+5。在一些实施方式中，N1、N2、N3、N4或N5为任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方式中，N1N2包含以下中的任一者：AA、AC、AG、AU、CA、CC、CG、CU、GA、GC、GG、GU、UA、UC、UG或UU。在一些实施方式中，N1N2包含AG，且N3N4N5包含以下中的任一者：AAA、ACA、AGA、AUA、AAG、AGG、ACG、AUG、AAC、ACC、AGC、AUC、AAU、ACU、AGU、AUU、CAA、CCA、CGA、CUA、CAG、CGG、CCG、CUG、CAC、CCC、CGC、CUC、CAU、CCU、CGU、CUU、GAA、GCA、GGA、GUA、GAG、GGG、GCG、GUG、GAC、GCC、GGC、GUC、GAU、GCU、GGU、GUU、UAA、UCA、UGA、UUA、UAG、UGG、UCG、UUG、UAC、UCC、UGC、UUC、UAU、UCU、UGU或UUU。
在一些实施方式中，帽近端序列包含帽结构的N1及N2，以及包含A3A4X5(SEQ ID NO：46；其中X5为A、G、C或U)的序列，其中N1及N2各自独立地选自：A、C、G或U。在一些实施方式中，N1为A且N2为G。在一些实施方式中，X5选自A、C、G或U。在一些实施方式中，X5为A。在一些实施方式中，X5为C。在一些实施方式中，X5为G。在一些实施方式中，X5为U。
在一些实施方式中，帽近端序列包含帽结构的N1及N2，以及包含C3A4X5(SEQ ID NO：47；其中X5为A、G、C或U)的序列，其中N1及N2各自独立地选自：A、C、G或U。在一些实施方式中，N1为A且N2为G。在一些实施方式中，X5选自A、C、G或U。在一些实施方式中，X5为A。在一些实施方式中，X5为C。在一些实施方式中，X5为G。在一些实施方式中，X5为U。
在一些实施方式中，帽近端序列包含帽结构的N1及N2，以及包含X3Y4X5(SEQ ID NO：48；其中X3或X5各自独立地选自A、G、C或U；且Y4不为C)的序列。在一些实施方式中，N1且N2各自独立地选自：A、C、G或U。在一些实施方式中，N1为A且N2为G。在一些实施方式中，X3及X5各自独立地选自：A、C、G或U。在一些实施方式中，X3和/或X5为A。在一些实施方式中，X3和/或X5为C。在一些实施方式中，X3和/或X5为G。在一些实施方式中，X3和/或X5为U。在一些实施方式中，Y4为C。在其他实施方式中，Y4不为C。在一些实施方式中，Y4为A。在一些实施方式中，Y4为G。在其他实施方式中，Y4不为G。在一些实施方式中，Y4为U。
在一些实施方式中，帽近端序列包含帽结构的N1及N2以及包含A3C4A5(SEQ ID NO：49)的序列。在一些实施方式中，N1且N2各自独立地选自：A、C、G或U。在一些实施方式中，N1为A且N2为G。
在一些实施方式中，帽近端序列包含帽结构的N1及N2以及包含A3U4G5(SEQ ID NO：50)的序列。在一些实施方式中，N1且N2各自独立地选自：A、C、G或U。在一些实施方式中，N1为A且N2为G。
在一些实施方式中，前述帽近端序列中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子的5'UTR外。
在本发明的一些实施方式中，5'UTR为异源UTR，例如为在自然界中发现与不同ORF结合的UTR。在另一实施方式中，5'UTR为例如在自然界中不存在的合成UTR。合成UTR包括已突变或合成以改良其特性(例如以增加基因表达)的UTR。在一些实施方式中，5'UTR功能性地连接至ORF，例如与ORF结合，以使得其可发挥功能，例如与包含参考5'UTR的参考RNA分子或缺乏5'UTR的RNA分子相比，增加、增强、稳定和/或延长自RNA分子的蛋白质产生，和/或增加自RNA分子的蛋白质表达和/或总蛋白质产生。在一些实施方式中，可排除前述5'UTR功能中的1、2、3、4、5者或更多者。
例示性5'UTR包括来源于非洲爪蟾属(Xenopus)或人类α球蛋白或β球蛋白、人类细胞色素b-245a、羟基类固醇(17b)脱氢酶、烟草蚀刻病毒、CMV立即早期1(IE1)基因、TEV、HSP705'、c-Jun或前述中的任一者的同源物、片段或变体的5′UTR。在一些实施方式中，5'UTR为：缺乏5'TOP基序(寡嘧啶段(tract))的TOP基因的5'UTR的片段、同源物或变体；来源于核糖体蛋白大32(L32)基因的5′UTR；来源于羟基类固醇(17p)脱氢酶4基因(HSD17B4)的5′UTR的5'UTR；或来源于ATP5A1的5′UTR的5'UTR。在一些实施方式中，5'UTR来源于专利申请WO2013/143700(其揭示内容以全文引用的方式并入本文中)的SEQ ID NO：1～1363、SEQID NO：1395、SEQ ID NO：1421及SEQ ID NO：1422，或与前述序列中的任一者具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的同一性的序列：99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。也可使用序列GGGAUCCUACC。在一些实施方式中，前述5'UTR序列中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
在一些实施方式中，5'UTR包含来自编码以下各者的基因的5'UTR区域或来自其同源物、片段或变体的序列：RPSA、RPS2、RPS3、RPS3A、RPS4、RPS5、RPS6、RPS7、RPS8、RPS9、RPS10、RPS1 1、RPS12、RPS13、RPS14、RPS15、RPS15A、RPS16、RPS17、RPS18、RPS19、RPS20、RPS21、RPS23、RPS24、RPS25、RPS26、RPS27、RPS27A、RPS28、RPS29、RPS30、RPL3、RPL4、RPL5、RPL6、RPL7、RPL7A、RPL8、RPL9、RPL10、RPL10A、RPL1 1、RPL12、RPL13、RPL13A、RPL14、RPL15、RPL17、RPL18、RPL18A、RPL19、RPL21、RPL22、RPL23、RPL23A、RPL24、RPL26、RPL27、RPL27A、RPL28、RPL29、RPL30、RPL31、RPL32、RPL34、RPL35、RPL35A、RPL36、RPL36A、RPL37、RPL37A、RPL38、RPL39、RPL40、RPL41、RPLPO、RPLP1、RPLP2、RPLP3、RPLPO、RPLP1、RPLP2、EEF1A1、EEF1B2、EEF1 D、EEF1 G、EEF2、EIF3E、EIF3F、EIF3H、EIF2S3、EIF3C、EIF3K、EIF3EIP、EIF4A2、PABPC1、HNRNPA1、TPT1、TUBB1、UBA52、NPM1、ATP5G2、GNB2L1、NME2、UQCRB；或与前述基因序列中的任一者具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的同一性的基因序列：99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。在一些实施方式中，前述5'UTR序列中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
在一个实施方式中，编码本文所揭示的5′UTR的DNA包含与SEQ ID NO：17具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的同一性的序列：99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。在一个实施方式中，编码5'UTR的DNA包含SEQ IDNO：17的序列。在一个实施方式中，本文所揭示的RNA包含含有与SEQ ID NO：18或19(其中所转录5'帽结构加下划线)中的任一者中所提供的5′UTR具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间的同一性的序列的5'UTR：99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。在一个实施方式中，5'UTR包含SEQ ID NO：18或19(其中所转录5'帽结构加下划线)中的任一者的序列。
【SEQ ID NO：17(DNA)】
AGAATAAACT AGTATTCTTC TGGTCCCCAC AGACTCAGAG AGAACCC
【SEQ ID NO:18(RNA)】
AGAAUAAACU AGUAUUCUUC UGGUCCCCAC AGACUCAGAG AGAACCC
【SEQ ID NO：19(RNA)】
AGAAΨAAACΨAGΨAΨΨCΨΨCΨGGΨCCCCAC AGACΨCAGAG AGAACCC
在一个实施方式中，编码本文所揭示的5'UTR的DNA包含与SEQ ID NO：51具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的同一性的序列：99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。在一个实施方式中，编码5'UTR的DNA包含SEQ IDNO：51的序列。在一个实施方式中，本文所揭示的RNA包含含有与SEQ ID NO：52或53中的任一者中所提供的5′UTR具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间的同一性的序列的5'UTR：99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。在一个实施方式中，5'UTR包含SEQ ID NO：52或53(其中所转录5'帽结构加下划线)中的任一者的序列。
【SEQ ID NO：51(DNA)】
GATAGGCGGC GCATGAGAGA AGCCCAGACC AATTACCTAC CCAAA
【SEQ ID NO：52(RNA)】
GAUAGGCGGC GCAUGAGAGA AGCCCAGACC AAUUACCUAC CCAAA
【SEQ ID NO：53(RNA)】
GAΨAGGCGGC GCAΨGAGAGA AGCCCAGACC AAΨΨACCΨAC CCAAA
在一些实施方式中，前述5′UTR序列中的1、2、3者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
【ii.3′UTR】
在一些实施方式中，本文所揭示的RNA包含3′UTR。3'UTR(若存在)位于蛋白编码序列开放阅读框下游，例如蛋白质编码区的终止密码子下游。3′UTR通常为位于mRNA的蛋白质编码序列与多A尾之间的mRNA部分。因此，在一些实施方式中，3'UTR在多A序列(若存在)上游，例如直接邻近于多A序列。3'UTR可涉及调节过程，包括转录本裂解、稳定性及多腺苷酸化、翻译、及mRNA定位。
天然或野生型3'UTR包含腺苷及尿苷的延伸部分。这些富AU标志在周转率较高的基因中尤其普遍。基于其序列特征及功能特性，富AU组件(ARE)可分成三类：I类ARE在富U区域内含有数个分散的AUUUA基序复本。II类ARE具有两个或更多个重叠UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。III类ARE不含AUUUA基序。已知大部分与ARE结合的蛋白质使分子不稳定。因此，3'UTRARE的引入、移除和/或修饰可用于调节本发明的核酸(例如RNA)的稳定性。当工程改造特定核酸时，在一些实施方式中，可引入一或多个ARE复本以使得RNA较不稳定且因此减少翻译且降低所得蛋白质的产生。同样，在一些实施方式中，可鉴别及移除和/或突变ARE以增加细胞内稳定性且因此增加翻译及所得蛋白质的产生。可在相关细胞株中使用本发明的核酸进行转染实验，且可在转染后的不同时间点分析蛋白质产生。举例而言，可用不同的ARE工程改造分子且由使用针对相关蛋白质的ELISA试剂盒来转染细胞且在转染后6小时、12小时、24小时、48小时及7天分析所产生的蛋白质。在一些实施方式中，3'UTR可使一或多个富AU序列被移除。或者，富AU序列可保持在3'UTR中。
3'UTR也可包含不在转录RNA的模板中编码但在转录之后在成熟期间添加的组件，例如多A尾。mRNA的3'UTR不翻译成氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所揭示的RNA包含含有F组件和/或I组件的3'UTR。在一些实施方式中，3'UTR或其近端序列包含限制位点。在一些实施方式中，限制位点为BamHI位点。在一些实施方式中，限制位点为Xhol位点。
在本发明的一些实施方式中，3'UTR为异源UTR，例如为在自然界中发现与不同ORF结合的UTR。在另一实施方式中，3'UTR为例如在自然界中不存在的合成UTR。在一些实施方式中，3'UTR功能性地连接至ORF，例如与ORF结合，以使得其可发挥功能，例如与包含参考3'UTR的参考RNA分子或缺乏3'UTR的RNA分子相比，增加、增强、稳定和/或延长自RNA分子的蛋白质产生，和/或增加自RNA分子的蛋白质表达和/或总蛋白质产生。在一些实施方式中，可排除前述3'UTR功能中的1、2、3、4、5者或更多者。
例示性3'UTR包括：来源于以下的3'UTR：白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、核糖体蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂肪加氧酶基因及胶原蛋白α基因(诸如胶原蛋白α1(1)基因；或来源于包含以下的基因的3'UTR的同源物、片段或变体：白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、核糖体蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂肪加氧酶基因和/或胶原蛋白α基因(诸如胶原蛋白α1(1)基因)，根据专利申请WO2013/143700(其揭示内容以全文引用的方式并入本文中)的SEQ ID NO：1369～1390，或与前述序列中的任一者具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的同一性的序列：99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。在一些实施方式中，使用序列UUUGAAUU。在一些实施方式中，前述3'UTR序列中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
在一些实施方式中，3'UTR包含：转录本的序列，其包括NM_000661.4、NM_001024921.2、NM_000967.3、NM_001033853.1、NMJD00968.3、NM_000969.3、NM_001024662.1、NM_000970.3、NM_000971.3、NMJD00972.2、NM_000975.3、NM_001 199802.1、NM_000976.3、NM__000977.3、NM_033251.2、NMJ 01243130.1、NM_001243131、NM_000978.3、NM_000979.3、NM_001270490.1、NMJD00980.3、NM_000981.3、NM_000982.3、NM_000983.3、NM_000984.5、NM_000985.4、NM_001035006.2、NM_001 199340.1、NM_001 199341.1、NMJD01199342.1、NM_001199343.1、NM_001 199344.1、NM_001 199345.1、NM_000986.3、NM_000987.3、NM_000988.3、NM_000989.3、NM_000990.4、NM_001 136134.1、NMJD00991.4、NM_001 136135.1、NM_001 136136.1、NM_001 136137.1、NM_000992.2、NM_000993.4、NM_001098577.2、NM_001099693.1、NM_000994.3、NM_001007073.1、NM_001007074.1、NM_000996.2、M_000997.4、NM_000998.4、NM_000999.3、NM_001035258.1、NM_001000.3、NM_001002.3、NM_053275.3、NM_001003.2、NM_213725.1、NM_001004.3、NM_001005.4、NM_001256802.1、NM_001260506.1、NM_001260507.1、NM_001006.4、NM_001267699.1、NM_001007.4、NM_001008.3、N_001009.3、NM_001010.2、NM_00101 1.3、NM_001012.1、NM_001013.3、NM_001203245.2、NM_001014.4、NM_001204091.1、NM_001015.4、NM_001016.3、NM_001017.2、NM_001018.3、NM_001030009.1、NM_001019.4、NM_001020.4、NM_001022.3、NM_001 146227.1、NM_001023.3、NM_001024.3、NM_001025.4、NM_001028.2、NM_001029.3、NM_001030.4、NM_002954、NM_001 135592.2、NM_001 177413.1、NM_001031.4、NM_001032.4、NM_001030001.2、NM_002948.3、NM_001253379.1、NM_001253380.1、NM_001253382.1、NM_001253383.1、NM_001253384.1、NM_002952.3、NM_001034996.2、NM_001025071.1、NM_001025070.1、NM_005617.3、NM_006013.3、NM_001256577.1、NM_001256580.1、NM_007104.4、NM_007209.3、NM_012423.3、NM_001270491.1、NM_033643.2、NM_015414.3、NM_021029.5、NM_001 199972.1、NM_021 104.1、NM_022551.2、NM_033022.3、NM_001 142284.1、NM_001026.4、NM_001 142285.1、NM_001 142283.1、NM_001 142282.1、NM_000973.3、NM_033301.1、NM_000995.3、NM_033625.2、NM_001021.3、NM_002295.4、NM_001012321.1、NM_001033930.1、NM_003333.3、NM_001997.4、NM_001099645.1、NM_001021.3、NM_052969.1、NM_080746.2、NM_001001.4、NM_005061.2、NM_015920.3、NM_016093.2、NM_198486.2、NG_01 1 172.1、NG_011253.1、NG_000952.4、NR_002309.1、NG_010827.2、NG_009952.2或NG_009517.1；或与前述转录本中的任一者具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的同一性的转录本的序列：99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。在一些实施方式中，前述3′UTR序列中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
在一些实施方式中，3′UTR包含：来自编码核糖体蛋白的基因的3′UTR区域的序列，该核糖体蛋白例如核糖体蛋白L9(RPL9)、核糖体蛋白L3(RPL3)、核糖体蛋白L4(RPL4)、核糖体蛋白L5(RPL5)、核糖体蛋白L6(RPL6)、核糖体蛋白L7(RPL7)、核糖体蛋白L7a(RPL7A)、核糖体蛋白L11(RPL11)、核糖体蛋白L12(RPL12)、核糖体蛋白L13(RPL13)、核糖体蛋白L23(RPL23)、核糖体蛋白L18(RPL18)、核糖体蛋白L18a(RPL18A)、核糖体蛋白L19(RPL19)、核糖体蛋白L21(RPL21)、核糖体蛋白L22(RPL22)、核糖体蛋白L23a(RPL23A)、核糖体蛋白L17(RPL17)、核糖体蛋白L24(RPL24)、核糖体蛋白L26(RPL26)、核糖体蛋白L27(RPL27)、核糖体蛋白L30(RPL30)、核糖体蛋白L27a(RPL27A)、核糖体蛋白L28(RPL28)、核糖体蛋白L29(RPL29)、核糖体蛋白L31(RPL31)、核糖体蛋白L32(RPL32)、核糖体蛋白L35a(RPL35A)、核糖体蛋白L37(RPL37)、核糖体蛋白L37a(RPL37A)、核糖体蛋白L38(RPL38)、核糖体蛋白L39(RPL39)、核糖体蛋白大P0(RPLP0)、核糖体蛋白大P1(RPLP1)、核糖体蛋白大P2(RPLP2)、核糖体蛋白S3(RPS3)、核糖体蛋白S3A(RPS3A)、X连锁的核糖体蛋白S4(RPS4X)、Y连锁的核糖体蛋白S4 1(RPS4Y1)、核糖体蛋白S5(RPS5)、核糖体蛋白S6(RPS6)、核糖体蛋白S7(RPS7)、核糖体蛋白S8(RPS8)、核糖体蛋白S9(RPS9)、核糖体蛋白S10(RPS10)、核糖体蛋白S11(RPS11)、核糖体蛋白S12(RPS12)、核糖体蛋白S13(RPS13)、核糖体蛋白S15(RPS15)、核糖体蛋白S15a(RPS15A)、核糖体蛋白S16(RPS16)、核糖体蛋白S19(RPS19)、核糖体蛋白S20(RPS20)、核糖体蛋白S21(RPS21)、核糖体蛋白S23(RPS23)、核糖体蛋白S25(RPS25)、核糖体蛋白S26(RPS26)、核糖体蛋白S27(RPS27)、核糖体蛋白S27a(RPS27a)、核糖体蛋白S28(RPS28)、核糖体蛋白S29(RPS29)、核糖体蛋白L15(RPL15)、核糖体蛋白S2(RPS2)、核糖体蛋白L14(RPL14)、核糖体蛋白S14(RPS14)、核糖体蛋白L10(RPL10)、核糖体蛋白L10a(RPL10A)、核糖体蛋白L35(RPL35)、核糖体蛋白L13a(RPL13A)、核糖体蛋白L36(RPL36)、核糖体蛋白L36a(RPL36A)、核糖体蛋白L41(RPL41)、核糖体蛋白S18(RPS18)、核糖体蛋白S24(RPS24)、核糖体蛋白L8(RPL8)、核糖体蛋白L34(RPL34)、核糖体蛋白S17(RPS17)、核糖体蛋白SA(RPSA)或核糖体蛋白S17(RPS17)；或编码与前述核糖体基因蛋白质序列中的任一者具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的同一性的核糖体蛋白的基因的序列：99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。在一些实施方式中，前述3'UTR序列中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
在一些实施方式中，3'UTR包含：来自编码核糖体蛋白的基因的3'UTR区域或来自包含以下的基因的序列：泛蛋白A-52残基核糖体蛋白融合产物1(UBA52)、广泛表达(FAU)的芬克尔-比斯基思-赖利(Finkel-Biskis-Reilly)鼠类肉瘤病毒(FBR-MuSV)、核糖体蛋白L22样1(RPL22L1)、核糖体蛋白L39样(RPL39L)、核糖体蛋白L10样(RPL10L)、核糖体蛋白L36a样(RPL36AL)、核糖体蛋白L3样(RPL3L)、核糖体蛋白S27样(RPS27L)、核糖体蛋白L26样1(RPL26L1)、核糖体蛋白L7样1(RPL7L1)、核糖体蛋白L13a假基因(RPL13AP)、核糖体蛋白L37a假基因8(RPL37AP8)、核糖体蛋白S10假基因5(RPS10P5)、核糖体蛋白S26假基因1 1(RPS26P1 1)、核糖体蛋白L39假基因5(RPL39P5)、核糖体蛋白大PO假基因6(RPLP0P6)及核糖体蛋白L36假基因14(RPL36P14)；和/或编码与前述基因蛋白质序列中的任一者具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的同一性的蛋白质的基因的序列：99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。在一些实施方式中，前述3′UTR序列中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
一般本领域技术人员应理解，可使用异源和/或合成的5′UTR与任何所需3′UTR序列，且反之亦然。举例而言，可使用异源5′UTR与合成和/或异源3'UTR。
在一个实施方式中，本文所揭示的编码3'UTR的DNA包含与SEQ ID NO：20具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的同一性的序列：99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。在一个实施方式中，编码3'UTR的DNA包含SEQ IDNO：20的序列。在一些实施方式中，本文所揭示的RNA包含含有与SEQ ID NO：21或22中的任一者中所提供的3′UTR具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的同一性的序列的3'UTR：99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。在一个实施方式中，3'UTR包含SEQ ID NO：21或22中的任一者的序列。
【SEQ ID NO：20(DNA)】
【SEQ ID NO：21(RNA)】
【SEQ ID NO：22(RNA)】
在一个实施方式中，本文所揭示的编码3'UTR的DNA包含与SEQ ID NO：23具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的同一性的序列：99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。在一个实施方式中，编码3'UTR的DNA包含SEQ IDNO：23的序列。在一个实施方式中，本文所揭示的RNA包含含有与SEQ ID NO：24或25中的任一者中所提供的3′UTR具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间的同一性的序列的3′UTR：99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。在一个实施方式中，3'UTR包含SEQ ID NO：24或25中的任一者的序列。
【SEQ ID NO：23(DNA)】
【SEQ ID NO：24(RNA)】
【SEQ ID NO：25(RNA)】
在一些实施方式中，前述3′UTR序列中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
【D.开放阅读框(ORF)】
5'及3'UTR可操作地连接至开放阅读框(ORF)，其可为能够翻译成所关注多肽的密码子序列。开放阅读框可为若干DNA或RNA核苷酸三联体的序列，其可翻译成肽或蛋白质。ORF可以其5′端及下一区处的起始密码子开始，该起始密码子例如通常编码氨基酸甲硫氨酸的三个连续核苷酸的组合(ATG或AUG)，其长度通常为3个核苷酸的倍数。开放阅读框可以至少一个终止密码子结束，该终止密码子包括但不限于TAA、TAG、TGA或UAA、UAG或UGA，或其任何组合。在一些实施方式中，开放阅读框可以一个、两个、三个、四个或更多个终止密码子结束，所述终止密码子包括但不限于TAATAA(SEQ ID NO：27)、TAATAG(SEQ ID NO：28)、TAATGA(SEQ ID NO：29)、TAGTGA(SEQ ID NO：30)、TAGTAA(SEQ ID NO：31)、TAGTAG(SEQ IDNO：32)、TGATGA(SEQ ID NO：33)、TGATAG(SEQ ID NO：34)、TGATAA(SEQ ID NO：35)或UAAUAA(SEQ ID NO：36)、UAAUAG(SEQ ID NO：37)、UAAUGA(SEQ ID NO：38)、UAGUGA(SEQ ID NO：39)、UAGUAA(SEQ ID NO:40)、UAGUAG(SEQ ID NO：41)、UGAUGA(SEQ ID NO：42)、UGAUAG(SEQID NO：43)、UGAUAA(SEQ ID NO：44)或其任何组合。开放阅读框可为分离的，或其可并入较长核酸序列中，例如并入载体或mRNA中。开放阅读框也可被称为“(蛋白质)编码区”或“编码序列”。
如本文所陈述，RNA分子可包括一个(单顺反子)、两个(双顺反子)或更多个(多顺反子)开放阅读框。
在一些实施方式中，ORF编码非结构病毒基因。在一些实施方式中，ORF进一步包括一或多个亚基因组启动子。在一些实施方式中，RNA分子包括可操作地连接至ORF的亚基因组启动子。在一些实施方式中，第一RNA分子不包括编码任何所关注多肽的ORF，而第二RNA分子包括编码所关注多肽的ORF。在一些实施方式中，第一RNA分子不包括亚基因组启动子。
本发明提供一种RNA分子，其包含至少一个编码呼吸道合胞体病毒(RSV)多肽的开放阅读框。在一些实施方式中，RNA分子包含至少一个编码RSV F蛋白的开放阅读框。在一优选实施方式中，RNA分子包含至少一个编码呼吸道合胞体病毒(RSV)融合前F蛋白(preF)多肽的开放阅读框。
【E.所关注基因】
本文所述的RNA分子可包括所关注基因。所关注基因编码所关注多肽。所关注多肽的非限制性实施例包括例如生物制剂、抗体、疫苗、治疗性多肽或肽、细胞穿透肽、分泌性多肽、质膜多肽、细胞质或细胞骨架多肽、细胞内膜结合多肽、核多肽、与人类疾病相关的多肽、靶向部分、由已确定无治疗适应症但其在研究及探索领域中仍具有效用的人类基因组编码的那些多肽，或其组合。在一些实施方式中，可排除前述所关注多肽中的1、2、3、4、5者或更多者。特定所关注基因的序列容易由本领域技术人员使用公共及私有数据库(例如)鉴别。
在一些实施方式中，RNA分子包括所关注基因的编码区。在一些实施方式中，所关注基因为或包含抗原性多肽或其免疫原性变体或免疫原性片段。在一些实施方式中，抗原性多肽包含来自抗原的一个表位。在一些实施方式中，抗原性多肽包含多个来自抗原的不同表位。在一些实施方式中，包含多个来自抗原的不同表位的抗原性多肽为多表位的。在一些实施方式中，抗原性多肽包含：来自过敏原的抗原性多肽、病毒抗原性多肽、细菌抗原性多肽、真菌抗原性多肽、寄生虫抗原性多肽、来自传染原的抗原性多肽、来自病原体的抗原性多肽、肿瘤抗原性多肽或自身抗原性多肽。在一些实施方式中，可排除前述抗原性多肽中的1、2、3、4、5者或更多者。
术语“抗原”可是指能够由免疫系统(例如由后天性免疫系统)识别且能够例如由形成抗体和/或抗原特异性T细胞来诱发抗原特异性免疫反应作为后天性免疫反应的一部分的物质。抗原可为或可包含可由MHC呈递至T细胞的肽或蛋白质。抗原可为所提供核酸分子(例如本文所述的包含至少一个编码序列的RNA分子)的翻译产物。另外，抗原(诸如肽或蛋白质)的包含至少一个表位的片段、变体及衍生物理解为抗原。
在一些实施方式中，编码所关注基因(例如抗原)的RNA在所治疗个体的细胞中表达以提供所关注基因(例如抗原)。在一些实施方式中，RNA在个体的细胞中短暂表达。在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)的表达系在细胞表面处。在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)在MHC的环境下表达及呈递。在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)表达至细胞外空间中，例如抗原被分泌出。
在一些实施方式中，RNA分子包括所关注基因(例如抗原)的编码区。在一些实施方式中，RNA分子包括来源于与传染病相关的病原体的所关注基因(例如抗原)的编码区。在一些实施方式中，RNA分子包括来源于RSV的所关注基因(例如抗原)的编码区。
在一些实施方式中，RNA分子编码RSV preF蛋白或其片段或变体。
在一些实施方式中，本文所述的RNA多核苷酸或包含其的组合物或医药制剂包含本文所揭示的核苷酸序列。在一些实施方式中，RNA多核苷酸包含与本文所揭示的核苷酸序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方式中，RNA多核苷酸包含编码与本文所揭示的多肽序列具有至少80％同一性的多肽的序列。在一些实施方式中，本文所述的RNA多核苷酸或包含其的组合物或医药制剂由DNA模板转录。在一些实施方式中，用于转录本文所述的RNA多核苷酸的DNA模板包含与RNA多核苷酸互补的序列。在一些实施方式中，本文所述的所关注基因由包含本文所揭示的核苷酸序列的本文所述的RNA多核苷酸编码。在一些实施方式中，RNA多核苷酸编码与本文所揭示的多肽序列具有至少80％同一性的多肽。在一些实施方式中，本文所述的多肽由RNA多核苷酸编码，所述RNA多核苷酸由包含与RNA多核苷酸互补的序列的DNA模板转录。
在一些实施方式中，RNA分子编码RSV preF蛋白，该RSV preF蛋白包含SEQ ID NO：1～6及71～74中的任一者的序列、或其片段或变体。
在一些实施方式中，RNA分子编码自核酸序列或其片段或变体合成的RSV preF蛋白，该核酸序列包含SEQ ID NO：7～10及59～62中的任一者。
【F.多A尾】
在一些实施方式中，本文所揭示的RNA分子包含例如本文所述的多腺苷酸(多A)序列。在一些实施方式中，多A序列位于3′UTR下游，例如邻近于3'UTR。“多A尾”或“多A序列”是指可连接至RNA分子的3′端的连续腺嘌呤残基延伸部分，其例如具有长达或长达约400个腺苷核苷酸，例如为或为约20～约400个，优选为或为约50～约400个，更优选为或为约50～约300个，甚至更优选为或为约50～约250个，最优选为或为约60～约250个腺苷核苷酸。多A序列为本领域技术人员已知的，且可接在本文所述的RNA分子中的3'UTR后面。多A尾可增加RNA分子的稳定性、半衰期和/或翻译效率。
在裂解之后，大部分pre-mRNA获得多腺苷酸化尾，其中包括以组蛋白茎-环替代多A序列结束的复制依赖性组蛋白转录本的pre-mRNA例外。在此上下文中，3'端加工为一种促进将mRNA自细胞核运输至细胞质且影响mRNA的稳定性及翻译的核共转录过程。此3'端的形成发生在由裂解/多腺苷酸化机制引导的两步反应中，且视mRNA前体(pre-mRNA)中的两个序列组件：六核苷酸多腺苷酸化信号及下游富G/U序列的存在而定。在第一步骤中，这些两个组件之间的pre-mRNA裂解成游离3'羟基。在第二步骤中，新形成的3'端由多腺苷酸化或添加多A序列而延长。
多腺苷酸化是指将多A序列添加至RNA分子，例如添加至未成熟mRNA。多腺苷酸化可由所谓的多腺苷酸化信号诱导。此信号可位于接近于待多腺苷酸化的RNA分子的3'端或在其3'端处的核苷酸延伸部分内。人工核酸分子的3'UTR也可包含多腺苷酸化信号。多腺苷酸化信号通常包含由腺嘌呤及尿嘧啶/胸腺嘧啶核苷酸组成的六聚体，优选六聚体序列AAUAAA，但也可以想到其他序列(优选六聚体序列)。多腺苷酸化通常发生在pre-mRNA(也称为未成熟mRNA)的加工期间。通常，RNA成熟(自pre-mRNA至成熟mRNA)包含多腺苷酸化的步骤。活体外转录mRNA的多A加尾可使用多种途径达成，所述途径包括但不限于将聚T段克隆至DNA模板中，或由使用多A聚合酶进行转录后添加。该术语可指作为细胞过程的RNA的多腺苷酸化，或指由活体外酶促反应用适合酶(诸如大肠杆菌(E.coli)多A聚合酶)或由化学合成进行多腺苷酸化。
本文所揭示的RNA分子可具有在转录之后由不依赖于模板的RNA聚合酶连接至RNA的游离3'端的多A序列，或由DNA编码且由依赖于模板的RNA聚合酶转录的多A序列。在一些实施方式中，多A序列系在RNA转录期间，例如在活体外转录RNA的制备期间连接，其系基于与编码链互补的链中包含重复dT核苷酸(脱氧胸苷酸)的DNA模板。
编码多A序列的DNA序列(编码链)被称为多A盒。在一些实施方式中，DNA的编码链中存在的多A盒基本上由dA核苷酸组成，但间杂有四种核苷酸(dA、dC、dG及dT)的随机序列。此类随机序列的长度可为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的核苷酸：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个。此类盒揭示于例如WO 2016/005324 A1(其以引用的方式并入本文中)中。WO 2016/005324A1中所揭示的任何多A盒均可用于本发明中。基本上由dA核苷酸组成但间杂有具有四种核苷酸(dA、dC、dG、dT)的相等分布且长度为例如5～50个核苷酸的随机序列的多A盒在DNA层级上显示质粒DNA在大肠杆菌中的不断繁殖，且在RNA层级上仍与同支持RNA稳定性及翻译效率有关的有益特性相关。在一些实施方式中，本文所述的RNA多核苷酸中所含有的多A序列基本上由腺苷核苷酸组成，但间杂有四种核苷酸(A、C、G、U)的随机序列。此类随机序列的长度可为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的核苷酸：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个。
多A序列可位于3'UTR内的任何位置处。在一些实施方式中，没有除腺苷核苷酸以外的核苷酸在多A序列的3'端侧接该多A序列，例如多A序列的3′端不被除腺苷以外的核苷酸掩盖或多A序列的3'端后面不跟随除腺苷以外的核苷酸。在一些实施方式中，多A序列可位于3'UTR的3'末端处，例如3'UTR不含有超过12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸位于多A序列的3′；更优选地，3'UTR不含有其他组件位于多A序列的3′。在一些实施方式中，多A序列位于RNA分子的3'末端处，例如人工核酸分子不含有超过12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸位于多A序列的3′。或者，多A序列可位于3'UTR的5'末端处，例如位于紧邻人工核酸分子的ORF的3'处，或位于3'UTR内，例如侧接在其他3'UTR组件的5'侧及3'侧。在一些实施方式中，多A序列侧接在聚C序列和/或组蛋白茎-环序列的3'侧。或者或另外，多A序列可侧接在来源于例如人类白蛋白或球蛋白基因的3′UTR组件的5'侧。
在一些实施方式中，RNA分子可进一步包括紧接在多A尾序列下游的核酸内切酶识别位点序列。RNA分子可进一步包括多A聚合酶识别序列(例如多腺苷酸化信号)(例如AAUAAA)在其3'端附近。在一些实施方式中，多腺苷酸化信号位于3'UTR中所包含的多A序列的3'。在一些实施方式中，多A序列由包含至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的核苷酸或由其组成的核苷酸序列与多腺苷酸化信号分隔开：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150个，其中核苷酸序列优选不包含超过10、9、8、7、6、5、4、3或2个连续腺嘌呤核苷酸。在一些实施方式中，将多A序列与多腺苷酸化信号分隔开的核苷酸序列包含或包含约1～约200个核苷酸，例如10～90、20～85、30～80、40～80、50～75、或55～85个核苷酸，更优选地55～80个核苷酸，且核苷酸序列不包含超过10、9、8、7、6、5、4、3或2个连续腺嘌呤核苷酸。
在一些实施方式中，多腺苷酸化信号包含共有序列NN(U/T)ANA，其中N＝A或U，优选为AA(U/T)AAA或A(U/T)(U/T)AAA。此类共有序列可被大部分动物及细菌细胞系统识别，例如被多腺苷酸化因子(诸如与CstF、PAP、PAB2、CFI和/或CFII协作的裂解/多腺苷酸化特异性因子(CPSF))识别。在一些实施方式中，多腺苷酸化信号(例如共有序列NNUANA)位于本文所定义的3'UTR组件的3'端下游的小于或小于约50个核苷酸处，例如位于至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的核苷酸处：1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个，使得RNA分子的转录将产生含有多腺苷酸化信号在其3'UTR下游的未成熟RNA且随后将多A序列连接至未成熟RNA。因此，所得RNA可包含含有至少一个多A序列的3'UTR，且其中3'UTR之后为额外多A序列。
多A序列可具有任何长度。在一些实施方式中，多A尾的长度可为5～300个核苷酸。在一些实施方式中，RNA分子包括多A尾，该多A尾包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：为或为约25～约400个腺苷核苷酸的序列、为或为约50～约400个腺苷核苷酸的序列、为或为约50～约300腺苷核苷酸的序列、为或为约50～约250个腺苷核苷酸的序列、为或为约60～约250个腺苷核苷酸的序列、或者为或为约40～约100个腺苷核苷酸的序列。在一些实施方式中，多A尾包含至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的腺苷核苷酸、基本上由其组成或由其组成：5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000个。在此上下文中，“基本上由…组成”意指多A序列中的大部分核苷酸，多A序列中通常至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％数目的核苷酸为腺苷核苷酸，但允许其余核苷酸为除腺苷核苷酸以外的核苷酸，诸如尿苷、鸟苷和/或胞嘧啶。在此上下文中，“由…组成”意指多A序列中的所有核苷酸(即多A序列中100％数目的核苷酸)为腺苷核苷酸。
在一些实施方式中，RNA分子包括含有大于30个腺苷核苷酸的序列的多A尾。在一些实施方式中，RNA分子包括含有或含有约40个腺苷核苷酸的多A尾。在一些实施方式中，RNA分子包括含有或含有约80个腺苷核苷酸的多A尾。在一些实施方式中，3'多A尾具有至少10个连续腺苷残基且至多300个连续腺苷残基的延伸部分。在一些特定实施方式中，RNA分子包括或包括约40个连续腺苷残基。在一些实施方式中，RNA分子包括或包括约80个连续腺苷残基。多A尾可在增强翻译效率及调节mRNA质量控制及降解的效率中起关键调节作用。短序列或超多腺苷酸化可传讯RNA降解。
在一些实施方式中，多A尾可位于RNA分子或其他核酸分子内，诸如位于载体中，例如位于充当例如由转录载体来产生RNA(例如mRNA)的模板的载体中。在一些实施方式中，RNA分子可不包括多A尾。
在一些实施方式中，多A尾可位于RNA分子或其他核酸分子内，诸如位于载体中，例如位于充当例如由转录载体来产生RNA(例如mRNA)的模板的载体中。在一些实施方式中，RNA分子可不包括多A尾。
在一个实施方式中，本文所揭示的编码多A尾的DNA包含与SEQ ID NO：26具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的同一性的序列：99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。在一个实施方式中，编码多A尾的DNA包含SEQ IDNO：26的序列。在一个实施方式中，本文所揭示的RNA包含含有与SEQ ID NO：26具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的同一性的序列的多A尾：99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。在一个实施方式中，多A尾包含SEQ ID NO：26的序列。在一个实施方式中，多A尾包含SEQ ID NO：26±2个腺苷(A)核苷酸的序列。在一个实施方式中，多A尾包含SEQ ID NO：26±1个腺苷(A)核苷酸的序列。在一个实施方式中，多A尾包含SEQ ID NO：26的序列。在一个实施方式中，多A尾包含SEQ ID NO：26±2个腺苷(A)核苷酸的序列。在一个实施方式中，多A尾包含SEQ ID NO：26±1个腺苷(A)核苷酸的序列。在一些实施方式中，多A尾包含SEQ ID NO：26的序列。
在一些实施方式中，前述多A序列中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
【SEQ ID NO：26(DNA，RNA)】
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA
【G.其他组件】
在本发明的一些实施方式中，RNA分子另外包括链终止核苷。举例而言，链终止核苷可包括在其糖基的2'和/或3'位置处脱氧的那些核苷。此类物种可包括3'-脱氧腺苷(蛹虫草菌素(cordycepin))、3'脱氧尿苷、3'脱氧胞嘧啶、3'脱氧鸟苷、3'脱氧胸腺嘧啶及2'，3'-双脱氧核苷(诸如2′,3′-双脱氧腺苷、2′,3'-双脱氧尿苷、2'，3'-双脱氧胞嘧啶、2′，3′-双脱氧鸟苷及2′,3′-双脱氧胸腺嘧啶)。在一些实施方式中，前述链终止核苷中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。在一些实施方式中，将链终止核苷酸并入mRNA中(例如在3'末端)，可引起mRNA的稳定化，例如国际专利公开第WO 2013/103659号中所描述。
在本发明的一些实施方式中，RNA分子另外包括茎环，诸如组蛋白茎环。茎环可包括2、3、4、5、6、7、8或更多个核苷酸碱基对。举例而言，茎环可包括4、5、6、7或8个核苷酸碱基对。茎环可位于mRNA的任何区域中。举例而言，茎环可位于非翻译区(5'UTR或3'UTR)、编码区或多A序列或尾中、之前或之后。在一些实施方式中，茎环可影响mRNA的一或多种功能，诸如翻译的起始、翻译效率和/或转录终止。此类组蛋白茎-环序列可为WO 2012/019780(其揭示内容以全文引用的方式并入本文中)中所揭示的组蛋白茎-环序列。组蛋白茎环结构及编码此类结构的核酸序列的其他非限制性实施例可见于例如WO 2016/091391(其揭示内容以全文引用的方式并入本文中)中。
在一些实施方式中，多A序列或多腺苷酸化信号与至少一个组蛋白茎-环(即使两者在自然界中表示替代性机制)的组合协同起作用以增加蛋白质表达超出个别组件中的任一者的情况下所观测到的含量。在一些实施方式中，多A与至少一个组蛋白茎-环的组合的协同作用不视组件的顺序和/或多A序列的长度而定。
在一些实施方式中，RNA不包含组蛋白下游组件(histone downstream element；HDE)。HDE包括天然存在的茎-环3'的大致15～20个核苷酸的富嘌呤多核苷酸延伸部分，其表示U7 snRNA的结合位点，其涉及将组蛋白pre-mRNA加工成成熟组蛋白mRNA。
在一些实施方式中，组蛋白茎-环一般来源于组蛋白基因，且包括两个相邻的部分或完全反向互补序列的分子内碱基配对，所述互补序列由间隔子分隔开，由短序列组成，形成结构的环。未配对环区通常不能与茎环组件中的任一者进行碱基配对。茎-环结构的稳定性一般视配对区域的长度、错配或隆起的数目和/或碱基组成而定。在一些实施方式中，可产生摆动碱基配对(非沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对)。在一些实施方式中，至少一个组蛋白茎-环序列包含15～45个核苷酸的长度。
在一些实施方式中，RNA分子包括(例如在3'UTR内)聚(C)序列。在一些实施方式中，聚C序列具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的胞苷：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个。在一些实施方式中，聚C序列具有或具有约30个胞苷。
在一些实施方式中，RNA分子包括内部核糖体进入位点(internal ribosomeentry site；IRES)序列或IRES基序。在一些实施方式中，例如若RNA编码两种或更多种肽或蛋白质，则IRES序列将ORF分隔开。若RNA分子为双顺反子或多顺反子核酸分子，则IRES序列因此可为适用的。
在一些实施方式中，RNA不包含内含子。在一些实施方式中，RNA可替代地或另外包括微小RNA结合位点。
包括本文所揭示的组件的组合的代表性RNA分子在5'-至-3′方向上可包括但不限于以下：
ORF-多A序列；
ORF-IRES-ORF-多A序列；
ORF-3'UTR-多A序列；
ORF-多A序列-3'UTR；
ORF-3'UTR-多A序列-聚(C)序列-组蛋白茎-环；
ORF-3′UTR-多A序列-聚(C)序列-多A序列；
ORF-3'UTR-多A序列-组蛋白茎-环-多A序列；
5'UTR-ORF-3'UTR；
5'UTR-ORF-多A序列；
5'UTR-ORF-多A序列-聚(C)序列-组蛋白茎-环；
5′UTR-ORF-多A序列-聚(C)序列-多A序列；
5′UTR-ORF-多A序列-组蛋白茎-环-多A序列；
5'UTR-ORF-3'UTR-多A序列；
5′UTR-ORF-3'UTR-多A序列-聚(C)序列
5'UTR-ORF-3′UTR-多A序列-聚(C)序列-组蛋白茎-环；
5'-帽-5'UTR-ORF-3'UTR；
5'-帽-5'UTR-ORF-多A序列；
5′-帽-5′UTR-ORF-3'UTR-多A序列；
5'-帽-5'UTR-ORF-3'UTR-多A序列-聚(C)序列；或
5'-帽-5'UTR-ORF-3'UTR-多A序列-聚(C)序列-组蛋白茎-环。
在一些实施方式中，前述组件中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
【H.自扩增RNA(saRNA)】
在一些实施方式中，RNA分子可为saRNA。“自扩增RNA”、“saRNA”及“复制子”是指能够自我复制的RNA。自扩增RNA分子可由使用来源于例如α病毒的复制组件且用编码所关注多肽的核苷酸序列取代结构病毒多肽来产生。自扩增RNA分子通常为可在递送至细胞之后直接翻译的正链分子，且此翻译提供RNA依赖性RNA聚合酶，其接着自所递送RNA产生反义及有义转录本两者。所递送RNA引起多个子RNA分子的产生。这些子RNA分子以及共线亚基因组转录本可自身经翻译以提供所编码的所关注基因(例如病毒抗原)的原位表达，和/或可经转录以提供与经翻译以提供抗原的原位表达的所递送RNA同义的其他转录本。此系列转录的总体结果为所引入saRNA分子的数目扩增，且因此所编码的所关注基因(例如病毒抗原)变成细胞的主要多肽产物。
在一些实施方式中，自扩增RNA包括至少一种或多种基因，包括病毒复制酶、病毒蛋白酶、病毒解螺旋酶及其他非结构病毒蛋白中的任一者，或其组合。在一些实施方式中，前述基因中的1、2、3者或更多者可排除在本文所揭示的自扩增RNA分子外。在一些实施方式中，自扩增RNA也可包括5′端及3'端牵引复制序列，及视情况存在的编码所需氨基酸序列(例如所关注抗原)的异源序列。引导异源序列的表达的亚基因组启动子可包括在自扩增RNA中。视情况，异源序列(例如所关注抗原)可框内融合至自扩增RNA中的其他编码区和/或可处于内部核糖体进入位点(IRES)的控制下。
在一些实施方式中，本文所述的自扩增RNA分子编码：(i)可由自扩增RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶；及(ii)所关注多肽，例如病毒抗原。在一些实施方式中，聚合酶可为α病毒复制酶，例如包括α病毒蛋白质nsP1、nsP2、nsP3、nsP4中的任一者，或其任何组合。在一些实施方式中，前述α病毒蛋白质中的1、2、3者或更多者可排除在本文所揭示的RNA分子外。
在一些实施方式中，自扩增RNA分子可具有两个开放阅读框。第一(5')开放阅读框可编码复制酶；第二(3')开放阅读框可编码包含所关注抗原的多肽。在一些实施方式中，RNA可具有额外(例如下游)开放阅读框，例如以编码其他抗原或编码辅助多肽。
在一些实施方式中，saRNA分子进一步包括：(1)α病毒5'复制识别序列；及(2)α病毒3'复制识别序列。在一些实施方式中，自扩增RNA分子的5'序列经选择以确保与所编码的复制酶兼容。
在一些实施方式中，自扩增RNA分子可编码单一多肽抗原，或视情况编码两种或更多种多肽抗原，所述多肽抗原以序列中的各者在以氨基酸序列形式表达时保持其同一性的方式连接在一起(例如串联连接)。由自扩增RNA产生的多肽接着可以融合多肽的形式产生，或以使得产生分离多肽或肽序列的方式经工程改造。
在一些实施方式中，本文所述的自扩增RNA可编码包括一系列表位的一或多种多肽抗原。在一些实施方式中，本文所述的自扩增RNA可编码能够引起辅助T细胞反应或细胞毒性T细胞反应或两者的表位。
在一个实施方式中，本文所揭示的自扩增RNA包含含有与SEQ ID NO：54具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间的同一性的序列的亚基因组启动子：99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。在一个实施方式中，亚基因组启动子包含SEQ IDNO：54的序列。
【SEQ ID NO：54(RNA)】
CCUGAAUGGA CUACGACAUA GUCUAGUCCG CCAAG
在一些实施方式中，本文所述的自扩增RNA分子编码：(i)可由自扩增RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶；及(ii)所关注多肽，例如病毒抗原。在一些实施方式中，聚合酶可为α病毒复制酶，例如包括α病毒蛋白质nsP1、nsP2、nsP3、nsP4中的任一者及其任何组合。
在一个实施方式中，本文所揭示的自扩增RNA包含α病毒复制酶，例如包括α病毒蛋白质nsP1、nsP2、nsP3、nsP4中的任一者及其任何组合，其包含分别与SEQ ID NO：55～58具有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间的同一性的序列：99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。在一个实施方式中，α病毒蛋白质nsP1、nsP2、nsP3及nsP4各自分别包含SEQ ID NO：55～58的序列。
【SEQ ID NO：55(nsP1 RNA)】
【SEQ ID NO：56(NSP2 RNA)】
【SEQ ID NO：57(NSP3 RNA)】
【SEQ ID NO：58(NSP4 RNA)】
【IV.RNA转录】
在一些实施方式中，本文所揭示的RNA由活体外转录或化学合成产生。在本发明的上下文中，术语“转录”涉及其中DNA序列中的遗传密码转录成RNA的过程。随后，RNA可翻译成肽或蛋白质。
根据本发明，“转录”包含“活体外转录”或“IVT”，其是指其中转录在非细胞系统中活体外发生以产生用于各种应用的合成RNA产物，包括例如产生蛋白质或多肽的过程。用于活体外转录mRNA的方法为此项技术中熟知的(参见例如Losick,R.1972.In vitrotranscription,Ann Rev Biochem,41 409-46；Kamakaka,R.T.及Kraus,W.L.2001.Invitro Transcription,Current Protocols in Cell Biology,2:11.6:11.6.1-11.6.17；Beckert,B.及Masquida,B.2010.Synthesis of RNA by In vitro Transcription inRNA,Methods in Molecular Biology,703(Neilson，H.编),New York,N.Y.Humana Press,2010；Brunelle，J.L.及Green，R.,2013,第五章-In vitro transcription from plasmidor PCR-amplified DNA,Methods in Enzymology 530:101-114；其全部均以引用的方式并入本文中)。
可应用克隆载体来产生转录本。这些克隆载体一般被称为转录载体，且根据本发明由术语“载体”涵盖。根据特定实施方式，所使用RNA为活体外转录的RNA(IVT-RNA)，且可由适当DNA模板的活体外转录获得。可用此项技术中熟知的适当技术制备模板DNA用于自多种来源进行活体外转录，所述技术包括但不限于质粒DNA及聚合酶连锁反应扩增(参见Linpinsel,J.L及Conn,G.L.,Generalprotocols for preparation of plasmid DNAtemplate，及Bowman,J.C.,Azizi,B.,Lenz,T.K.,Ray,P.及Williams,L.D.,RNA in vitrotranscription and RNA purification by denaturing PAGEin Recombinant andinvitro RNA syntheses,Methods 941Conn G.L.(编),New York,N.Y.Humana Press,2012，其各自以引用的方式并入本文中)。用于控制转录的启动子可为任何RNA聚合酶的任何启动子。RNA聚合酶的特定实施例为T7、T3及SP6 RNA聚合酶。优选地，根据本发明的活体外转录受T7或SP6启动子控制。用于活体外转录的DNA模板可由克隆核酸(尤其cDNA)且将其引入用于活体外转录的适当载体中而获得。cDNA可由RNA的反转录获得。
合成IVT RNA产物可活体外翻译或直接引入细胞中，所述产物可在所述细胞中翻译。就RNA而言，术语“表达”或“翻译”涉及在细胞的核糖体中mRNA链引导氨基酸序列的组装以产生肽或蛋白质的过程。此类合成RNA产物包括但不限于例如mRNA分子、saRNA分子、反义RNA分子、shRNA分子、长非编码RNA分子、核糖核酸酶、适体、引导RNA分子(例如对于CRISPR)、核糖体RNA分子、小核RNA分子、小核仁RNA分子等。在一些实施方式中，可排除前述合成RNA产物中的1、2、3、4、5者或更多者。IVT反应通常利用如本文所述和/或利用的DNA模板(例如线性DNA模板)、核糖核苷酸(例如未经修饰的核糖核苷酸三磷酸或经修饰的核糖核苷酸三磷酸)及适当RNA聚合酶。
在一些实施方式中，mRNA由活体外转录使用DNA模板制造，其中DNA是指含有脱氧核糖核苷酸的核酸。在一些实施方式中，本文所揭示的RNA为活体外转录的RNA(IVT-RNA)，且可由适当DNA模板的活体外转录获得。用于控制转录的启动子可为任何RNA聚合酶的任何启动子。用于活体外转录的DNA模板可由克隆核酸(尤其cDNA)且将其引入用于活体外转录的适当载体中而获得。cDNA可由RNA的反转录获得。
在一些实施方式中，IVT的起始材料可包括线性化DNA模板、核苷酸、RNA酶抑制剂、焦磷酸酶和/或聚合酶(例如T7 RNA聚合酶)。核苷酸可内部制造，可获自供货商，或可合成。核苷酸可为但不限于本文所述的那些，包括天然及非天然(经修饰)核苷酸。可使用任何数目的RNA聚合酶或变体，包括但不限于：噬菌体RNA聚合酶，例如T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶；和/或突变聚合酶，诸如但不限于能够并入经修饰的核酸和/或经修饰的核苷酸(包括化学修饰的核酸和/或核苷酸)的聚合酶。在一些实施方式中，前述RNA聚合酶中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在外。一些实施例排除使用DNA酶。
在一些实施方式中，IVT过程在生物反应器中进行。生物反应器可包含混合器。在一些实施方式中，核苷酸可在整个IVT过程期间添加至生物反应器中。
在一些实施方式中，在生物反应器中，在IVT过程后，向包含RNA的IVT混合物中添加一或多种IVT后药剂。例示性IVT后药剂可包括配置为消化线性化DNA模板的DNA酶I和/或配置为消化DNA酶I及T7 RNA聚合酶的蛋白酶K。在一些实施方式中，在IVT之后，将IVT后药剂与生物反应器中的混合物一起温育。在一些实施方式中，生物反应器可含有至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的IVT混合物：60、70、80、90、100、110、120、130、140、150,160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490及500公升或更多。IVT混合物可具有为或不为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的RNA浓度：3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90及100mg/mL RNA或更多。
在一些实施方式中，IVT混合物可包括残余亚精胺、残余DNA、残余蛋白质、肽、HEPES、EDTA、硫酸铵、阳离子(例如Mg2+、Na+、Ca2+)、RNA片段、残余核苷酸、游离磷酸酯或其任何组合。在一些实施方式中，前述中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在IVT混合物外。
本文所述的核酸的分离和/或纯化可包括但不限于苯酚/氯仿萃取和/或在一价阳离子或氯化锂存在下用任一醇(乙醇、异丙醇)沉淀，以用于核酸清除、质量保证及质量对照。纯化程序的额外非限制性实施例包括珠粒(Beckman Coulter Genomics,Danvers,MA)、聚T珠粒、LNATM寡聚T捕获探针(Inc，Vedbaek，Denmark)、基于HPLC的纯化方法(诸如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、逆相HPLC(RP-HPLC)及疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC))、尺寸排阻层析及基于二氧化硅的亲和层析与聚丙烯酰胺凝胶电泳。可使用各种市售试剂盒进行纯化，所述试剂盒包括但不限于SV总分离系统(Promega)及活体外转录清除及浓缩试剂盒(Norgen Biotek)。在一些实施方式中，可排除前述纯化中的1、2、3、4、5者或更多者。
当关于核酸使用时，术语“经纯化”，诸如“经纯化核酸”是指与至少一种污染物分离的一者。“污染物(contaminant)”为使得另一物质不合适、不纯或较差的任何物质。因此，经纯化核酸(例如DNA及RNA)以不同于其在自然界中发现的形式或设定存在，或以与在对其进行处理和/或纯化方法之前存在的形式或设定不同的形式或设定存在。
在一些实施方式中，IVT混合物的至少一部分经过滤。IVT混合物可经由超滤和/或渗滤来过滤，以自IVT混合物移除至少一些杂质和/或改变至少一部分IVT混合物的缓冲溶液以产生浓缩RNA溶液作为渗余物。
在一些实施方式中，“超滤”及“渗滤”均是指膜过滤制程。超滤通常使用孔径为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的膜：0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09及0.1μm。在一些实施方式中，超滤膜通常由截留分子量(MWCO)而非孔径来进行分类。举例而言，MWCO可为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、110kDa、120kDa、130kDa、140kDa、150kDa、160kDa、170kDa、180kDa、190kDa、200kDa、210kDa、220kDa、230kDa、240kDa、250kDa、260kDa、270kDa、280kDa、290kDa、300kDa、310kDa、320kDa、330kDa、340kDa、350kDa、360kDa、370kDa、380kDa、390kDa、400kDa、500kDa、600kDa、700kDa、800kDa、900kDa、1000kDa、2000kDa、3000kDa、4000kDa、5000kDa、6000kDa、7000kDa、8000kDa、9000kDa及10000kDa。本领域技术人员应理解，过滤膜可包含不同的适合材料，包括例如聚合物、纤维素、陶瓷等，视应用而定。在一些实施方式中，膜过滤可更合乎大体积纯化制程需要。
在一些实施方式中，用于纯化RNA的IVT混合物的超滤及渗滤可包括：(1)直流过滤(DFF)，也称为“死端”过滤，其应用垂直于膜表面的进料流且试图使100％的流体通过膜；和/或(2)切向流过滤(TFF)，也称为扫流过滤，其中进料流平行于膜表面传递，其中一个部分通过膜(渗透物)，而剩余物(渗余物)保留和/或再循环回至进料槽。
在一些实施方式中，IVT混合物的过滤经由TFF进行，该TFF包含超滤步骤、第一渗滤步骤及第二渗滤步骤。在一些实施方式中，第一渗滤步骤在硫酸铵存在下进行。第一渗滤步骤可配置为自IVT混合物移除大部分杂质。在一些实施方式中，第二渗滤步骤在不存在硫酸铵的情况下进行。第二渗滤步骤可配置为将RNA转移至DS缓冲液调配物中。
可选择具有适当MWCO的过滤膜用于TFF制程中的超滤。TFF膜的MWCO决定哪些溶质可通过膜进入滤液中及哪些溶质保留在渗余物中。TFF膜的MWCO可经选择，使得实质上所有所关注溶质(例如所需合成RNA物种)保留在渗余物中，而非所需组分(例如过量的核糖核苷酸、小核酸片段(诸如经消化或水解的DNA模板)、肽片段(诸如经消化的蛋白质)和/或其他杂质)传递至滤液中。在一些实施方式中，包含所需合成RNA物种的渗余物可再循环至进料储槽中以在额外循环中再过滤。在一些实施方式中，TFF膜的MWCO可为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa或更多。在一些实施方式中，TFF膜的MWCO可为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：100kDa、150kDa、200kDa、250kDa、300kDa、350kDa、400kDa或更多。在一些实施方式中，TFF膜的MWCO可为或为约250～350kDa。在一些实施方式中，TFF膜(例如基于纤维素的膜)的MWCO可为或为约30～300kDa；50～300kDa、100～300kDa或200～300kDa。
渗滤可不连续地或者连续地进行。举例而言，在连续渗滤中，渗滤溶液可以与产生滤液相同的速率添加至样品进料储槽中。以此方式，样品储槽的容积保持恒定，但移除可自由渗透通过膜的小分子(例如盐、溶剂等)。使用溶剂移除作为实施例，各额外渗滤体积(DV)进一步降低溶剂浓度。在不连续渗滤中，溶液首先经稀释且接着浓缩回至起始体积。接着重复此制程直至达到储槽中剩余的小分子(例如盐、溶剂等)的所需浓度。各额外渗滤体积(DV)进一步降低小分子(例如溶剂)浓度。连续渗滤通常需要用于待过滤分子的给定降低的最小体积。另一方面，不连续渗滤准许渗余物状态(诸如pH、盐含量等)的快速变化。在一些实施方式中，以至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的量进行第一渗滤步骤：2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个渗滤体积。在一些实施方式中，以至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的量进行第二渗滤步骤：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个渗滤体积。在一些实施方式中，以5个渗滤体积进行第一渗滤步骤，且以10个渗滤体积进行第二渗滤步骤。
在一些实施方式中，对于超滤和/或渗滤，IVT混合物以至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的速率过滤：100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、500、600、700、800、900或1000L/m2过滤器面积/小时或更大。浓缩RNA溶液可包含至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的单链RNA：2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5mg/mL。
在一些实施方式中，也可减少经由过滤获得RNA产物溶液的浓缩RNA溶液的生物负荷。可使用一或多个过滤器进行过滤以用于减少生物负荷。该一或多个过滤器可包括孔径为或不为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的过滤器：0.2μm、0.45μm、0.65μm、0.8μm，或配置为移除生物负荷的任何其他孔径。
作为一个实施例，减少生物负荷可包括对含有获自超滤和/或渗滤的渗余物的渗余物贮槽进行排液以获得渗余物。减少生物负荷可包括使用洗涤缓冲溶液来冲洗用于超滤和/或渗滤的过滤系统，以获得包含过滤系统中剩余的残余RNA的洗涤池溶液。可过滤渗余物以获得经过滤的渗余物。可使用第一0.2μm过滤器过滤洗涤池溶液以获得经过滤的洗涤池溶液。可使用第一0.2μm过滤器或另一0.2μm过滤器过滤渗余物。
可合并经过滤的洗涤池溶液及经过滤的渗余物以形成经合并的池溶液。可使用第二0.2μm过滤器来过滤经合并的池溶液以获得经过滤的合并的池溶液，该经过滤的合并的池溶液使用第三0.2μm过滤器进一步过滤以产生RNA产物溶液。
质量保证和/或质量控制检查可使用诸如但不限于凝胶电泳、UV吸光度和/或分析型HPLC的方法进行。
在一些实施方式中，可由包括但不限于逆转录酶-PCR的方法对核酸进行测序。
在一些实施方式中，可使用诸如但不限于紫外线可见光谱分析(UV/Vis)的方法对核酸进行定量。UV/Vis光谱仪的非限制性实施例为光谱仪(ThermoFisher,Waltham,MA)。可分析定量的核酸以便判定核酸是否可具有适当大小和/或评定降解。核酸的降解可由诸如但不限于以下的方法评定：琼脂糖凝胶电泳；基于HPLC的纯化方法，诸如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、逆相HPLC(RP-HPLC)及疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)；液相层析质谱法(LCMS)；毛细管电泳(CE)；及毛细管凝胶电泳(CGE)。在一些实施方式中，可排除前述评定方法中的1、2、3、4、5者或更多者。
【V.RNA囊封】
RNA产物溶液中的RNA可经囊封，且RNA溶液可进一步包含至少一种囊封剂。在一个实施方式中，囊封剂包含脂质、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质复合物、聚合物颗粒、聚合复合物、整体型递送系统或其组合。在一些实施方式中，可排除前述组件中的1、2、3、4、5者或更多者作为囊封剂。
在一个实施方式中，囊封剂为脂质，且产生脂质纳米颗粒(LNP)囊封的RNA。不旨在受任何理论所束缚，认为，阳离子或阳离子可离子化脂质或脂质样材料和/或阳离子聚合物与核酸组合在一起以形成聚集物，且此聚集产生胶态稳定的颗粒。
脂质可为天然存在的脂质或合成脂质。然而，脂质通常为生物物质。生物脂质为此项技术中所熟知，且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜类、溶血脂质、鞘糖脂、糖脂质、硫苷脂、具有醚及酯连接的脂肪酸的脂质及可聚合脂质，及其组合。脂质为不溶于水且可用有机溶剂萃取的物质。除本文专门描述的那些化合物以外的化合物由本领域技术人员理解为脂质，且由本发明的组合物及方法涵盖。脂质组分及非脂质可彼此共价或非共价连接。
在一些实施方式中，LNP可设计成保护RNA分子(例如saRNA、mRNA)免于细胞外RNA酶，和/或可经工程改造用于将RNA全身性递送至目标细胞。在一些实施方式中，此类LNP可尤其适用于当向有需要的个体静脉内施用RNA分子时递送RNA分子(例如saRNA、mRNA)。在一些实施方式中，此类LNP可尤其适用于当向有需要的个体肌肉内施用RNA分子时递送RNA分子(例如saRNA、mRNA)。在一些实施方式中，此类LNP可尤其适用于当向有需要的个体皮内施用RNA分子时递送RNA分子(例如saRNA、mRNA)。在一些实施方式中，此类LNP可尤其适用于当向有需要的个体鼻内施用RNA分子时递送RNA分子(例如saRNA、mRNA)。
在一个实施方式中，RNA产物溶液中的RNA的浓度＜1mg/mL。在另一实施方式中，RNA的浓度为至少或至少约0.05mg/mL。在另一实施方式中，RNA的浓度为至少或至少约0.5mg/mL。在另一实施方式中，RNA的浓度为至少或至少约1mg/ml。在另一实施方式中，RNA浓度为或为约0.05mg/mL～约0.5mg/mL。在另一实施方式中，RNA的浓度为至少10mg/mL。在另一实施方式中，RNA的浓度为至少50mg/mL。在一些实施方式中，RNA的浓度为或不为至少、至多、恰好以下、在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)或约以下：0.05mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、10mg/mL、50mg/mL、75mg/mL、100mg/mL、150mg/mL、200mg/mL、250mg/mL、300mg/mL、400mg/mL或更多。
本发明提供一种RNA产物溶液及一种其脂质制剂混合物或组合物，其包含至少一种编码例如抗原(例如RSV融合前F蛋白)的RNA，该至少一种RNA与一或多种脂质复合、囊封于其中和/或用其调配，且形成脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体、脂质复合物和/或纳米脂质体。在一些实施方式中，组合物包含脂质纳米颗粒。
脂质纳米颗粒或LNP是指当阳离子脂质及视情况一或多种其他脂质例如在水性环境中和/或在RNA存在下合并时所产生的任何形态的颗粒。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒包括在调配物中，该调配物可用于将活性剂或治疗剂(诸如核酸(例如mRNA))递送至所关注的目标部位(例如细胞、组织、器官、肿瘤等)。在一些实施方式中，本发明的脂质纳米颗粒包含核酸(例如mRNA)。此类脂质纳米颗粒通常包含阳离子脂质及一或多种赋形剂，例如一或多种中性脂质、带电脂质、类固醇、聚合物结合脂质或其组合。在一些实施方式中，LNP包含至少一种阳离子(例如可离子化)脂质、至少一种中性(例如非阳离子)脂质、至少一种结构脂质(例如类固醇)和/或至少一种聚合物结合脂质(例如聚乙二醇(PEG)修饰的脂质)。在一些实施方式中，前述赋形剂中的1、2、3者或更多者可排除在LNP外。
在一些实施方式中，LNP包含20-60mol％的一或多种阳离子(例如可离子化)脂质。举例而言，LNP可包含20～50mol％、20～40mol％、20～30mol％、30～60mol％、30～50mol％、30～40mol％、40～60mol％、40～50mol％或50～60mol％的一或多种阳离子(例如可离子化)脂质。在一些实施方式中，LNP包含或不包含至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的一或多种阳离子(例如可离子化)脂质：20mol％、30mol％、40mol％、50mol％或60mol％。在一些实施方式中，LNP包含45～55摩尔％(mol％)的一或多种阳离子(例如可离子化)脂质。举例而言，LNP可包含或不包含至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的一或多种阳离子(例如可离子化)脂质：45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55mol％。
在一些实施方式中，LNP包含5～25mol％一或多种中性(例如非阳离子)脂质。举例而言，LNP可包含5～20mol％、5～15mol％、5～10mol％、10～25mol％、10～20mol％、10～25mol％、15～25mol％、15～20mol％或20～25mol％的一或多种中性(例如非阳离子)脂质。在一些实施方式中，LNP为或不为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的一或多种中性(例如非阳离子)脂质：5mol％、10mol％、15mol％、20mol％或25mol％。在一些实施方式中，LNP包含5～15mol％的一或多种中性(例如非阳离子)脂质。举例而言，LNP可包含至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的一或多种中性(例如非阳离子)脂质：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mol％。
在一些实施方式中，LNP包含25～55mol％的一或多种结构脂质(例如类固醇)。举例而言，LNP可包含25～50mol％、25～45mol％、25～40mol％、25～35mol％、25～30mol％、30～55mol％、30～50mol％、30～45mol％、30～40mol％、30～35mol％、35～55mol％、35～50mol％、35～45mol％、35～40mol％、40～55mol％、40～50mol％、40～45mol％、45～55mol％、45～50mol％或50～55mol％的一或多种结构脂质(例如类固醇)。在一些实施方式中，LNP为或不为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的一或多种结构脂质(例如类固醇)：25mol％、30mol％、35mol％、40mol％、45mol％、50mol％或55mol％。在一些实施方式中，LNP包含35至40mol％的一或多种结构脂质(例如类固醇)。举例而言，LNP可包含至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的一或多种结构脂质(例如类固醇)：35、36、37、38、39或40mol％。
在一些实施方式中，LNP包含0.5～15mol％的一或多种聚合物结合脂质(例如聚乙二醇(PEG)修饰的脂质)。举例而言，脂质纳米颗粒可包含0.5～10mol％、0.5～5mol％、1～15mol％、1～10mol％、1～5mol％、2～15mol％、2～10mol％、2～5mol％、5～15mol％、5～10mol％或10～15mol％的一或多种聚合物结合脂质(例如聚乙二醇(PEG)修饰的脂质)。在一些实施方式中，脂质LNP为或不为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的一或多种聚合物结合脂质(例如聚乙二醇(PEG)修饰的脂质)：0.5mol％、1mol％、2mol％、3mol％、4mol％、5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％、10mol％、11mol％、12mol％、13mol％、14mol％或15mol％。在一些实施方式中，LNP包含1～2mol％的一或多种聚合物结合脂质(例如聚乙二醇(PEG)修饰的脂质)。举例而言，LNP可包含至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的一或多种聚合物结合脂质(例如聚乙二醇(PEG)修饰的脂质)：1、1.5或2mol％。
在一些实施方式中，LNP包含：20～75mol％的一或多种阳离子(例如可离子化)脂质(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％及75％)、0.5～25mol％的一或多种中性(例如非阳离子)脂质(例如至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)：0.5％、2.25％、4％、5.75％、7.5％、9.25％、11％、12.75％、14.5％、16.25％、18％、19.75％、21.5％、23.25％及25％)、5～55mol％的一或多种结构脂质(例如类固醇)(例如至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)：5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％及55％)及0.5～20mol％的一或多种聚合物结合脂质(例如聚乙二醇(PEG)修饰的脂质)(例如至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)：0.5％、2％、3.5％、5％、6.5％、8％、9.5％、11％、12.5％、14％、15.5％、17％、18.5％及20％)。在一些实施方式中，所述脂质中的1、2、3者或更多者可排除在LNP外。
在一些非限制性实施方式中，摩尔脂质比率为50/10/38.5/1.5(mol％阳离子脂质/中性脂质/结构脂质/聚合物结合脂质)、60/7.5/31/1.5(mol％阳离子脂质/中性脂质/结构脂质/聚合物结合脂质)、57.5/7.5/31.5/3.5(mol％阳离子脂质/中性脂质/结构脂质/聚合物结合脂质)、57.2/7.1/34.3/1.4(mol％阳离子脂质/中性脂质/结构脂质/聚合物结合脂质)、40/15/40/5(mol％阳离子脂质/中性脂质/结构脂质/聚合物结合脂质)、50/10/35/4.5/0.5(mol％阳离子脂质/中性脂质/结构脂质/聚合物结合脂质)、50/10/35/5(mol％阳离子脂质/中性脂质/结构脂质/聚合物结合脂质)、40/10/40/10(mol％阳离子脂质/中性脂质/结构脂质/聚合物结合脂质)、35/15/40/10(mol％阳离子脂质/中性脂质/结构脂质/聚合物结合脂质)、或52/13/30/5(mol％阳离子脂质/中性脂质/结构脂质/聚合物结合脂质)。
在一些实施方式中，活性剂或治疗剂(诸如核酸(例如mRNA))可囊封于脂质纳米颗粒的脂质部分和/或被脂质纳米颗粒的脂质部分中的一些或所有包裹的水性空间中，从而保护其免于酵素降解或由宿主生物体或细胞的机制诱导的其他非所需作用，例如不良免疫反应。核酸(例如mRNA)或其部分也可与脂质纳米颗粒结合及复合。脂质纳米颗粒可包含能够形成连接核酸和/或囊封一或多种核酸的颗粒的任何脂质。
在一些实施方式中，所提供RNA分子(例如saRNA、mRNA)可用LNP调配。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒可具有或可不具有为或不为约1～500nm的平均直径(例如至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)：1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500nm)。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒的平均直径为或为约30nm～约150nm、约40nm～约150nm、约50nm～约150nm、约60nm～约130nm、约70nm～约110nm、约70nm～约100nm、约80nm～约100nm、约90nm～约100nm、约70～约90nm、约80nm～约90nm、约70nm～约80nm，或为至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)：30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm，且为实质上无毒的。术语“平均直径”是指使用所谓的累积量算法由动态激光光散射(DLS)与数据分析所测量的颗粒的平均流体动力学直径，其结果提供长度维度的所谓的Z平均值及无维度的多分散性指数(PI)(Koppel,D.,J.Chem.Phys.57,1972,第4814-4820页,ISO 13321)。此处，颗粒的“平均直径”、“直径”或“尺寸”与Z平均值同义使用。
本文所述的LNP可展现小于或小于约0.5、0.4、0.3或0.2或更小的多分散性指数。借助于实施例，LNP可展现或可不展现至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)的多分散性指数：0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49或0.5。在一些实施方式中，多分散性指数是基于动态光散射测量由“平均直径”的定义中所提及的所谓的累积量分析来计算。在某些先决条件下，其可视为纳米颗粒总体的尺寸分布的测量值。
在一些实施方式中，本发明的LNP包含或不包含为或为约2:1～约30:1的N:P比，例如至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)的N:P比：2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1或30:1。在一些实施方式中，本发明的LNP包含为或为约6:1的N:P比。在一些实施方式中，本发明的LNP包含为或为约3:1的N:P比。
在一些实施方式中，本发明的LNP包含或不包含为或为约5:1～约100:1的阳离子脂质组分与RNA的wt/wt比，例如至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)的阳离子脂质组分与RNA的wt/wt比：5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1或100:1。在一些实施方式中，本发明的LNP包含为或为约20:1的可离子化阳离子脂质组分与RNA的wt/wt比。在一些实施方式中，本发明的LNP包含为或为约10:1的可离子化阳离子脂质组分与RNA的wt/wt比。
在某些实施方式中，核酸(例如RNA分子)(当所提供LNP中存在时)在水溶液中对于用核酸酶降解具有抗性。在一些实施方式中，LNP为靶向肝脏的脂质纳米颗粒。在一些实施方式中，LNP为包含一或多种阳离子脂质(例如本文所述的那些)的阳离子脂质纳米颗粒。在一些实施方式中，阳离子LNP可包含至少一种阳离子脂质、至少一种聚合物结合脂质及至少一种辅助脂质(例如至少一种中性脂质)。
在某些实施方式中，RNA溶液及其脂质制剂混合物或组合物可具有至少、至多、恰好以下、在以下之间(包括性或排他性)或约以下的特定脂质、脂质类型或非脂质组分(诸如脂质样材料和/或阳离子聚合物和/或佐剂)、抗原、肽、多肽、糖、核酸或本文所揭示或本领域技术人员将已知的其他材料：1％、2％、3％、4％5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
本文所述的LNP可使用此项技术中一般已知的组分、组合物及方法来产生，参见例如PCT/US2016/052352、PCT/US2016/068300、PCT/US2017/037551、PCT/US2015/027400、PCT/US2016/047406、PCT/US2016000129、PCT/US2016/014280、PCT/US2016/014280、PCT/US2017/038426、PCT/US2014/027077、PCT/US2014/055394、PCT/US2016/52117、PCT/US2012/069610、PCT/US2017/027492、PCT/US2016/059575及PCT/US2016/069491，其全部均以全文引用的方式并入本文中。用于制备LNP的方法的其他非限制性实施例可见于例如WO2022/032154中，其揭露内容以全文引用的方式并入本文中。
举例而言，制备LNP的方法可涉及自至少一种阳离子或阳离子可离子化脂质或脂质样材料和/或至少一种阳离子聚合物获得胶体，及将胶体与核酸混合，以获得核酸颗粒。如本文所用，术语“胶体”涉及分散颗粒不会沉淀出来的一种均匀混合物。混合物中的不可溶颗粒为微小的，其粒径在1与1000纳米之间。混合物可被称为胶体或胶态悬浮液。有时，术语“胶体”仅是指混合物中的颗粒而非整个悬浮液。
为了制备包含至少一种阳离子或阳离子可离子化脂质或脂质样材料和/或至少一种阳离子聚合物的胶体，在本文中可应用习知用于制备脂质体囊泡且经适当调适的方法。用于制备脂质体囊泡的最常用方法共享以下基本阶段：(i)将脂质溶解于有机溶剂中，(ii)对所得溶液进行干燥，及(iii)对干燥脂质进行水合(使用多种水性介质)。
在膜水合方法中，首先将脂质溶解于适合的有机溶剂中且干燥，在烧瓶底部得到薄膜。使用适当水性介质对所获得脂质膜进行水合，产生脂质体分散液。此外，可包括额外缩小尺寸步骤。
逆相蒸发为一种膜水合以用于制备脂质体囊泡的替代方法，该方法涉及在水相与含有脂质的有机相之间形成油包水乳剂。此混合物的短暂声波处理为系统均匀化所需。在减压下移除有机相，得到乳白色凝胶，其随后转变成脂质体悬浮液。
术语“乙醇注射技术”是指其中包含脂质的乙醇溶液经由针头快速注射至水溶液中的制程。此操作使脂质分散在整个溶液中且促进脂质结构形成，例如脂质囊泡形成，诸如脂质体形成。一般而言，本文所述的RNA脂质复合物颗粒可由将RNA添加至胶态脂质体分散液中而获得。使用乙醇注射技术，在一些实施方式中，此类胶体脂质体分散液如下形成：在搅拌下将包含脂质(诸如阳离子脂质及额外脂质)的乙醇溶液注射至水溶液中。在一些实施方式中，本文所述的RNA脂质复合物颗粒可在无挤出步骤的情况下获得。术语“挤出(extruding)”或“挤出(extrusion)”是指产生具有固定横截面轮廓的颗粒。特别而言，其是指缩小颗粒的尺寸，其中迫使颗粒通过具有所限定孔的过滤器。
根据本发明，也可使用用于制备具有无有机溶剂特征的胶体的其他方法。
在一些实施方式中，LNP囊封RNA可由以下来制造：在使得触发一或多种脂质组分的溶解性的急剧变化(其驱动脂质以LNP形式自组装)的条件下，将本文所述的RNA溶液(例如RNA产物溶液)与本文所述的脂质制剂(包含例如至少一种阳离子脂质及视情况一或多种其他脂质组分于有机溶剂中)快速混合。在一些实施方式中，适合的缓冲剂包含tris、组氨酸、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐和/或琥珀酸盐。在一些实施方式中，排除前述缓冲剂中的1、2、3者或更多者。液体调配物的pH与囊封剂(例如阳离子脂质)的pKa有关。酸化缓冲液的pH可比囊封剂(例如阳离子脂质)的pKa小至少一半pH标度，且最终缓冲液的pH可比囊封剂(例如阳离子脂质)的pKa大至少一半pH标度。在一些实施方式中，选择阳离子脂质的特性以使得颗粒的初始形成由与核酸(例如RNA)的带相反电荷的主链结合而发生。以此方式，围绕核酸形成颗粒，在一些实施方式中，其例如可产生比在核酸与脂质组分中的至少一者之间不存在相互作用的情况下达成的囊封效率高得多的囊封效率。在某些实施方式中，核酸当存在于脂质纳米颗粒中时，其在水溶液中耐核酸酶降解。
包含核酸的脂质纳米颗粒及其制备方法揭示于例如美国专利公开第2004/0142025号、第2007/0042031号及PCT公开第WO 2013/016058号及第WO 2013/086373号中，所述文献的全部揭示内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
本文所述的一些实施方式涉及超过一种，例如2、3、4、5、6或甚至更多种核酸物种(诸如RNA物种)的组合物、方法及用途。在LNP调配物中，有可能将各核酸物种分开调配为个别LNP调配物。在该情况下，各个别LNP调配物将包含一种核酸物种。个别LNP调配物可以分开的实体的形式存在，例如存在于分开的容器中。此类调配物可由分开提供各核酸物种(通常各自呈含核酸溶液的形式)以及允许形成LNP的适合阳离子或阳离子可离子化脂质或脂质样材料及阳离子聚合物来获得。各别颗粒将仅含有当形成颗粒时提供的特定核酸物种(个别颗粒调配物)。
在一些实施方式中，诸如医药组合物的组合物包含超过一种个别LNP调配物。各别医药组合物被称为混合LNP调配物。根据本发明的混合的LNP调配物可由分开地形成如上文所描述的个别LNP调配物，随后将个别LNP调配物混合的步骤而获得。由混合的步骤，可获得包含含有核酸的LNP的混合群体的调配物。个别LNP群体可一起在一个容器中，其包含个别LNP调配物的混合群体。
或者，有可能的是，不同核酸物种调配在一起作为组合的LNP调配物。此类调配物可由提供不同RNA物种的组合调配物(通常为组合溶液)以及允许形成LNP的适合阳离子或阳离子可离子化脂质或脂质样材料及阳离子聚合物来获得。与混合LNP调配物相反，组合LNP调配物将通常包含含有超过一种RNA物种的LNP。在组合LNP组合物中，不同RNA物种通常一起存在于单一颗粒中。
【A.阳离子聚合材料】
鉴于聚合材料的高度化学可挠性，通常将聚合材料用于基于纳米颗粒的递送。通常，使用阳离子材料使带负电的核酸静电凝聚成纳米颗粒。这些带正电基团通常由质子化状态在5.5与7.5之间的pH范围内改变的胺组成，认为该改变会引起导致胞内体破裂的离子不平衡。聚合物(诸如聚-L-离氨酸、聚酰氨基胺、鱼精蛋白及聚乙烯亚胺)以及天然存在的聚合物(诸如几丁糖)全部均已应用于核酸递送且适用作适用于本文中的一些实施方式中的阳离子材料。另外，一些研究者已合成特定用于核酸递送的聚合材料。特别而言，聚(P-氨基酯)由于其易于合成及可生物降解性而广泛用于核酸递送中。在一些实施方式中，此类合成材料可适用作本文中的阳离子材料。
如本文所用，“聚合材料”具有其普通含义，例如包含由共价键连接的一或多个重复单元(单体)的分子结构。在一些实施方式中，此类重复单元可全部均一致；或者，在一些情况下，聚合材料内可存在超过一种类型的重复单元。在一些情况下，聚合材料为以生物方式衍生的，例如生物聚合物，诸如蛋白质。在一些情况下，聚合材料中也可存在额外部分，例如靶向部分，诸如本文所述的那些靶向部分。
本领域技术人员应了解，当聚合物(或聚合部分)内存在超过一种类型的重复单元时，则聚合物(或聚合部分)称为“共聚物”。在一些实施方式中，根据本发明使用的聚合物(或聚合部分)可为共聚物。形成共聚物的重复单元可以任何方式排列。举例而言，在一些实施方式中，重复单元可以随机顺序排列；或者或另外，在一些实施方式中，重复单元可以交替顺序排列，或排列为“嵌段”共聚物，其例如包含一或多个各自含有第一重复单元(例如第一嵌段)的区域及一或多个各自含有第二重复单元(例如第二嵌段)的区域等。嵌段共聚物可具有两种(二嵌段共聚物)、三种(三嵌段共聚物)或更多数目种不同嵌段。
在某些实施方式中，根据本发明使用的聚合材料为生物兼容性的。生物兼容性材料为在适中浓度下通常不导致显著细胞死亡的材料。在某些实施方式中，生物兼容性材料为可生物降解的，例如能够在生理环境内，诸如在身体内以化学和/或生物方式降解。在某些实施方式中，聚合材料可为或包含鱼精蛋白或聚亚烷基亚胺，特别而言鱼精蛋白。
本领域技术人员应了解，术语“鱼精蛋白”常用以指具有相对较低分子量、富含精氨酸且发现在各种动物(如鱼)的精子细胞中尤其与DNA而非体细胞组蛋白结合的各种强碱性蛋白质中的任一者。特别而言，术语“鱼精蛋白”常用以指存在于鱼精子中的呈强碱性、可溶于水、加热不凝固且在水解时主要产生精氨酸的蛋白质。在纯化形式中，其用于胰岛素的长效调配物中且用以中和肝素的抗凝血剂作用。
在一些实施方式中，如本文所用，术语“鱼精蛋白”是指获自或来源于天然或生物学来源的鱼精蛋白氨基酸序列，包括其片段和/或该氨基酸序列或其片段的多聚形式，以及为人工的且专门设计用于特定目的并且不能与天然或生物学来源分离的(合成)多肽。
在一些实施方式中，聚亚烷基亚胺包含聚亚乙基亚胺和/或聚亚丙基亚胺。在一些实施方式中，聚亚烷基亚胺为聚乙亚胺(PEI)。在一些实施方式中，聚亚烷基亚胺为直链聚亚烷基亚胺，例如直链聚乙亚胺(PEI)。
预期用于本文中的阳离子材料(例如聚合材料，包括多阳离子聚合物)包括能够静电结合核酸的那些阳离子材料。在一些实施方式中，预期用于本文中的阳离子聚合材料包括例如由与核酸形成复合物或形成围封或囊封核酸的囊泡而可与核酸结合的任何阳离子聚合材料。
在一些实施方式中，本文所述的颗粒可包含除阳离子聚合物以外的聚合物，例如非阳离子聚合材料和/或阴离子聚合材料。阴离子及中性聚合材料在本文中统称为非阳离子聚合材料。
【B.脂质及脂质样材料】
术语“脂质”及“脂质样材料”在本文中用于指包含一或多种疏水性部分或基团以及视情况一或多种亲水性部分或基团的分子。根据本发明，脂质及脂质样材料可为阳离子、阴离子或中性的。在所选pH下，中性脂质或脂质样材料以不带电或中性两性离子形式存在。
术语“脂质”是指特征为不可溶于水中但可溶于许多有机溶剂中的一群有机化合物。通常，脂质可分为八类：脂肪酸及其衍生物(包括三酸甘油酯、二酸甘油酯、单酸甘油酯及磷脂)、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮化合物、固醇脂质以及含固醇代谢物(诸如胆固醇)及异戊烯醇脂质。脂肪酸的实施例包括但不限于脂肪酯及脂肪酰胺。甘油脂的实施例包括但不限于糖基甘油(glycosylglycerol)及甘油磷脂(例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)。鞘脂的实施例包括但不限于神经酰胺鞘磷脂(phosphosphingolipid)(例如鞘磷脂(sphingomyelin)、磷酸胆碱)及糖神经鞘脂质(例如脑苷脂、神经节苷脂)。固醇脂质的实施例包括但不限于胆固醇及其衍生物以及生育酚及其衍生物。在一些实施方式中，所述脂质中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本发明的LNP外。
术语“脂质样材料”、“脂质样化合物”或“脂质样分子”是指结构上和/或功能上与脂质有关但在严格意义上可能不视为脂质的物质。举例而言，该术语包括在其存在于水性环境中的囊泡、多层/单层脂质体或膜中时能够形成两亲性层的化合物，且包括表面活性剂或具有亲水性及疏水性部分两者的合成化合物。一般言之，该术语是指包含具有不同结构组织的亲水性及疏水性部分的分子，其可能与脂质类似或可能不类似。
在一些实施方式中，RNA溶液及其脂质制剂混合物或组合物可包含阳离子脂质、中性脂质、胆固醇和/或聚合物(例如聚乙二醇)结合脂质，其形成包围RNA分子的脂质纳米颗粒。因此，在一些实施方式中，LNP可包含阳离子脂质及一或多种赋形剂，例如一或多种中性脂质、带电脂质、类固醇或类固醇类似物(例如胆固醇)、聚合物结合脂质(例如PEG-脂质)或其组合。在一些实施方式中，前述赋形剂中的1、2、3者或更多者可排除在本发明的LNP外。在一些实施方式中，脂质以有效形成脂质纳米颗粒且递送治疗剂(例如RNA分子)用于治疗所关注的特定疾病或病状(例如与RSV相关的那些)的量存在于组合物中。在一些实施方式中，LNP包涵或囊封核酸分子。
【i.阳离子脂质】
阳离子或阳离子可离子化脂质或脂质样材料是指能够带正电且能够静电结合核酸的脂质或脂质样材料。如本文所用，“阳离子脂质”或“阳离子脂质样材料”是指具有净正电荷的脂质或脂质样材料。阳离子脂质或脂质样材料由静电相互作用结合带负电的核酸。一般而言，阳离子脂质具有亲脂性部分，诸如固醇、酰基链、二酰基或更多酰基链，且脂质的头部基团通常携带正电荷。例示性阳离子脂质包括携带正电荷的一或多个氨基。阳离子脂质可囊封带负电的RNA。
在一些实施方式中，阳离子脂质为可离子化的，使得视pH而定，其可以带正电或中性形式存在。阳离子脂质的离子化影响脂质纳米颗粒在不同pH条件下的表面电荷。不希望受理论所束缚，认为此可离子化行为经由帮助胞内体逃逸以及与在生理pH下保持阳离子性的颗粒相比降低毒性来促进功效。出于本发明的目的，除非与情形相矛盾，否则术语“阳离子脂质”或“阳离子脂质样材料”包含此类“阳离子可离子化”脂质或脂质样材料。
在一些实施方式中，阳离子脂质可包含或包含约10mol％～约100mol％、约20mol％～约100mol％、约30mol％～约100mol％、约40mol％～约100mol％、或约50mol％～约100mol％的颗粒中存在的总脂质。在一些实施方式中，阳离子脂质可为或可不为至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)的颗粒中存在的总脂质：10mol％、20mol％、30mol％、40mol％、50mol％、60mol％、70mol％、80mol％、90mol％或100mol％，或其中可导出的任何范围或值。
阳离子脂质的实施例包括但不限于：((4-羟丁基)氨叉基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、N,N-二甲基-2,3-二油酰氧基丙胺(DODMA)、1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、3-(N-(N',N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、二甲基二(十八烷基)铵(DDAB)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷、1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷；氯化二(十八基)二甲基铵(DODAC)、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、2，3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羟乙基)-二甲基铵氮(DMRIE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)、溴化1,2-二油酰基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基铵(DORIE)、2,3-二油酰氧基-N-[2(精氨甲酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙酰胺鎓(propanamium)三氟乙酸盐(DOSPA)、1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1，2-二次亚麻氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、双十八烷基酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、3-二甲氨基-2-(胆固醇-5-en-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(顺式，顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5′-(胆固醇-5-烯-3-β-氧基)-3′-氧杂戊烯氧基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9′,12′-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3，4-二油烯基氧基苯甲胺(DMOBA)、1,2-N,N'-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)、2，3-二亚油酰基氧基-N,N-二甲基丙胺(DLinDAP)、1,2-N，N'-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLincarbDAP)、1，2-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinCDAP)、2，2-二亚油基-4-二甲氨基甲基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-DMA)、2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-XTC2-DMA)、2，2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、溴化N-(2-羟乙基)-N，N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙胺鎓(DMRIE)、(±)-溴化N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(顺式-9-十四碳烯基氧基)-1-丙胺鎓(GAP-DMORIE)、(±)-溴化N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十二烷氧基)-1-丙胺鎓(GAP-DLRIE)、(±)-溴化N-(3-氨基丙基)-N，N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙胺鎓(GAP-DMRIE)、溴化N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙胺鎓(bAE-DMRIE)、N-(4-羧基苯甲基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰基氧基)丙-1-铵(DOBAQ)、2-({8-[(3b)-胆固醇-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z，12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基铵-丙烷(DMDAP)、1,2-二棕榈酰基-3-二甲基铵-丙烷(DPDAP)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基甲酰氨基)乙基]-3,4-二[油氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、溴化2,3-双(十二烷氧基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基丙-1-铵(DLRIE)、溴化N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)丙-1-铵(DMORIE)、8,8′-((((2(二甲氨基)乙基)硫)羰基)氨叉基)二辛酸二((Z)-壬-2-烯-1-基酯)(ATX)、N,N-二甲基-2,3-双(十二烷氧基)丙-1-胺(DLDMA)、N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)丙-1-胺(DMDMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)-9-((4-(二甲基氨基丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)、N-十二基-3-((2-十二烷基氨甲酰基-乙基)-{2-[(2-十二烷基氨甲酰基-乙基)-2-{(2-十二烷基氨甲酰基-乙基)-[2-(2-十二烷基氨甲酰基-乙氨基)-乙基]-氨基}-乙氨基)丙酰胺(类脂质98N12-5)、1-[2-[双(2-羟基十二烷基)氨基]乙基-[2-[4-[2-[双(2羟基十二烷基)氨基]乙基]哌嗪-1-基]乙基]氨基]十二烷-2-醇(类脂质02-200)；C12-200；或8-((2-羟乙基)(6-氧代-6-(十一烷氧基)己基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(SM-102)。在一些实施方式中，前述阳离子脂质中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本发明的LNP外。
在一些实施方式中，本发明的可离子化阳离子脂质包含式(I)化合物：
或其医药学上可接受的盐、互变异构物、前药或立体异构物，其中：
R1为C5～30烷基、C5～20烯基、-R*YR"、-YR"或-R"M'R'；
R2及R3独立地为H、C1～14烷基、C2～14烯基、-R*YR"、-YR"或-R*OR"，和/或R2及R3与其所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4为C3～6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2或未经取代的C1-6烷基，其中Q为碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR或-C(R)N(R)2C(O)OR，和/或各n独立地为1、2、3、4或5；
各R5独立地为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
各R6独立地为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
M及M′独立地为-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR')O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基或杂芳基；
R7为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
R8为C3～6碳环或杂环；
R9为H、CN、NO2、C1～6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2～6烯基、C3～6碳环或杂环；
各R为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
各R'为C1～18烷基、C2～18烯基、-R*YR"、-YR"或H；
各R"为C3～14烷基或C3～14烯基；
各R*独立地为C1～12烷基或C2～12烯基；
各Y独立地为C3～6碳环；
各X独立地为F、Cl、Br或I；及
m为5、6、7、8、9、10、11、12或13。
在一些实施方式中，式(I)化合物的子集包括如下的那些：其中当R4为-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR或-CQ(R)2时，则(i)当n为1、2、3、4、或5时，Q不为-N(R)2，或(ii)当n为1或2时，Q不为5、6或7员杂环烷基。
在一些实施方式中，式(I)化合物的另一子集包括如下的那些：其中R1为C5～30烷基、C5～20烯基、-R*YR"、-YR"或-R"M'R'；
R2及R3独立地为H、C1～14烷基、C2～14烯基、-R*YR"、-YR"或-R*OR"，和/或R2及R3与其所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4为C3～6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2或未经取代的C1～6烷基，其中Q为C3～6碳环、具有一或多个包含N、O或S的杂原子的5～14员杂芳基、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR或具有一或多个包含N、O及S的杂原子的5～14员杂环烷基(其经一或多个包含氧代(＝O)、OH、氨基、单或二烷基氨基、或C1～3烷基的取代基取代)，和/或各n独立地为1、2、3、4或5；
各R5独立地为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
各R6独立地为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
M及M′独立地为-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR')O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基或杂芳基；
R7为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
R8为C3～6碳环或杂环；
R9为H、CN、NO2、C1～6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2～6烯基、C3～6碳环或杂环；
各R独立地为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
各R′独立地为C1～18烷基、C2～18烯基、-R*YR"、-YR"或H；
各R"独立地为C3～14烷基或C3～14烯基；
各R*独立地为C1～12烷基或C2～12烯基；
各Y独立地为C3～6碳环；
各X独立地为F、Cl、Br或I；及
m为5、6、7、8、9、10、11、12或13；和/或其医药学上可接受的盐、互变异构物、前药或立体异构物。
在一些实施方式中，式(I)化合物的另一子集包括如下的那些，其中：
R1为C5～30烷基、C5～20烯基、-R*YR"、-YR"或-R"M'R'；
R2及R3独立地为H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR"、-YR"或-R*OR"，和/或R2及R3与其所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4为C3～6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2或未经取代的C1-6烷基，其中Q为C3～6碳环、具有一或多个包含N、O或S的杂原子的5～14员杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR或-C(＝NR9)N(R)2，和/或各n独立地为1、2、3、4或5；和/或当Q为5至14员杂环时且(i)R4为-(CH2)nQ，其中n为1或2，或(ii)R4为-(CH2)nCHQR，其中n为1，或(iii)R4为-CHQR及-CQ(R)2，则Q为5～14员杂芳基或8～14员杂环烷基；
各R5独立地为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
各R6独立地为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
M及M'独立地为-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R')-、-N(R')C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR')O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基或杂芳基；
R7为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
R8为C3～6碳环或杂环；
R9为H、CN、NO2、C1～6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环或杂环；
各R独立地为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
各R'独立地为C1～18烷基、C2～18烯基、-R*YR"、-YR"或H；
各R"独立地为C3～14烷基或C3～14烯基；
各R*独立地为C1～12烷基或C2～12烯基；
各Y独立地为C3～6碳环；
各X独立地为F、Cl、Br或I；及
m为5、6、7、8、9、10、11、12或13；和/或其医药学上可接受的盐、互变异构物、前药或立体异构物。
在一些实施方式中，式(I)化合物的另一子集包括如下的那些，其中：
R1为C5～30烷基、C5～20烯基、-R*YR"、-YR"或-R"M'R'；
R2及R3独立地为H、C1～14烷基、C2～14烯基、-R*YR"、-YR"或-R*OR"，和/或R2及R3与其所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4为C3～6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2或未经取代的C1～6烷基，其中Q为C3～6碳环、具有一或多个包含N、O或S的杂原子的5～14员杂芳基、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR或-C(＝NR9)N(R)2，和/或各n独立地为1、2、3、4、或5；
各R5独立地为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
各R6独立地为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
M及M'独立地为-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R')-、-N(R')C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR')O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基或杂芳基；
R7为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
R8为C3～6碳环或杂环；
R9为H、CN、NO2、C1～6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2～6烯基、C3～6碳环或杂环；
各R独立地为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
各R'独立地为C1～18烷基、C2～18烯基、-R*YR"、-YR"或H；
各R"独立地为C3～14烷基或C3～14烯基；
各R*独立地为C1～12烷基或C2～12烯基；
各Y独立地为C3～6碳环；
各X独立地为F、Cl、Br或I；及
m为5、6、7、8、9、10、11、12或13；和/或其医药学上可接受的盐、互变异构物、前药或立体异构物。
在一些实施方式中，式(I)化合物的另一子集包括如下的那些，其中：
R1为C5～30烷基、C5～20烯基、-R*YR"、-YR"或-R"M'R'；
R2及R3独立地为H、C2～14烷基、C2～14烯基、-R*YR"、-YR"或-R*OR"，和/或R2及R3与其所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4为-(CH2)nQ或-(CH2)nCHQR，其中Q为-N(R)2，和/或n为3、4或5；
各R5独立地为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
各R6独立地为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
M及M′独立地为-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR')O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基或杂芳基；
R7为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
各R独立地为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
各R'独立地为C1～18烷基、C2～18烯基、-R*YR"、-YR"或H；
各R"独立地为C3～14烷基或C3～14烯基；
各R*独立地为C1～12烷基或C1～12烯基；
各Y独立地为C3～6碳环；
各X独立地为F、Cl、Br或I；及
m为5、6、7、8、9、10、11、12或13；和/或其医药学上可接受的盐、互变异构物、前药或立体异构物。
在一些实施方式中，式(I)化合物的另一子集包括如下的那些，其中：
R1为C5～30烷基、C5～20烯基、-R*YR"、-YR"或-R"M′R′；
R2及R3独立地为C1～14烷基、C2～14烯基、-R*YR"、-YR"或-R*OR"，和/或R2及R3与其所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4为-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR或-CQ(R)2，其中Q为-N(R)2，和/或n为1、2、3、4、或5；
各R5独立地为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
各R6独立地为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
M及M′独立地为-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR′)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基或杂芳基；
R7为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
各R独立地为C1～3烷基、C2～3烯基或H；
各R′独立地为C1～18烷基、C2～18烯基、-R*YR"、-YR"或H；
各R"独立地为C3～14烷基或C3～14烯基；
各R*独立地为C1～12烷基或C1～12烯基；
各Y独立地为C3～6碳环；
各X独立地为F、Cl、Br或I；及
m为5、6、7、8、9、10、11、12或13；和/或其医药学上可接受的盐、互变异构物、前药或立体异构物。
在一些实施方式中，式(I)化合物的子集包括式(IA)的那些：
或其医药学上可接受的盐、互变异构物、前药或立体异构物，其中I为1、2、3、4或5；m为5、6、7、8或9；M1为键或M′；R4为未经取代的C1～3烷基或-(CH2)nQ，其中Q为OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M及M'独立地为-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R')-、-P(O)(OR')O-、-S-S-、芳基或杂芳基；且R2及R3独立地为H、C1～14烷基或C2～14烯基。
在一些实施方式中，式(I)化合物的子集包括式(II)的那些：
或其医药学上可接受的盐、互变异构物、前药或立体异构物，其中I为1、2、3、4或5；M1为键或M'；R4为未经取代的C1～3烷基或-(CH2)nQ，其中n为2、3或4，且Q为OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M及M'独立地为-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R')-、-P(O)(OR')O-、-S-S-、芳基或杂芳基；且R2及R3独立地为H、C1～14烷基或C2～14烯基。在一些实施方式中，式(I)化合物的子集包括式(Ila)、(lIb)、(lIc)或(lIe)的那些：
或其医药学上可接受的盐、互变异构物、前药或立体异构物，其中R4如本文所述。
在一些实施方式中，式(I)化合物的子集包括式(IId)的那些：
或其医药学上可接受的盐、互变异构物、前药或立体异构物，其中n为2、3或4；且m、R'、R"及R2～R6如本文所述。举例而言，R2及R3中的各者可独立地为C5～14烷基或C5～14烯基。
在一些实施方式中，本发明的可离子化阳离子脂质包含具有以下结构的化合物：
在一些实施方式中，本发明的可离子化阳离子脂质包含具有以下结构的化合物：
在一些实施方式中，本发明的可离子化阳离子脂质包含具有以下结构的化合物：
或其医药学上可接受的盐、互变异构物、前药或立体异构物，其中：
L1或L2中的一者为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)＝NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，且L1或L2中的另一者为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，或为直接键；
G1及G2各自独立地为未经取代的C1～C12亚烷基或C1～C12伸烯基；G为C1～C24亚烷基、C1～C24伸烯基、C3～C8伸环烷基、C3～C8伸环烯基；
Ra为H或C1～C12烷基；
R1及R2各自独立地为C6～C24烷基或C6～C24烯基；
R3为H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；
R4为C1～C12烷基；
R5为H或C1～C6烷基；及
x为0、1或2。
在有一些前述实施方式中，可离子化阳离子脂质包含具有以下结构中的一者的化合物：
或其医药学上可接受的盐、互变异构物、前药或立体异构物，其中：
A为3～8员环烷基或伸环烷基环；
R6在各次出现时独立地为H、OH或C1～C24烷基；及
n为在1～15范围内的整数。
在有一些前述实施方式中，可离子化阳离子脂质包含具有以下结构中的一者的化合物：
或其医药学上可接受的盐、互变异构物、前药或立体异构物，其中y及z各自独立地为在1～12范围内的整数。
在前述实施方式中的任一者中，L1或L2中的一者为-OCCO)-。举例而言，在一些实施方式中，L1及L2中的各者为-O(C＝O)-。在前述任一者的一些实施方式中，L1及L2各自独立地为-(C＝O)O-或-O(C＝O)-。举例而言，在一些实施方式中，L1及L2中的各者为-(C＝O)O-。
在有一些前述实施方式中，可离子化阳离子脂质包含具有以下结构中的一者的化合物：
或其医药学上可接受的盐、互变异构物、前药或立体异构物。
在有一些前述实施方式中，可离子化阳离子脂质包含具有以下结构中的一者的化合物：
或其医药学上可接受的盐、互变异构物、前药或立体异构物。
在有一些前述实施方式中，n为在2～12，例如2～8或2～4范围内的整数。举例而言，在一些实施方式中，n为3、4、5或6。在一些实施方式中，n为3。在一些实施方式中，n为4。在一些实施方式中，n为5。在一些实施方式中，n为6。
在有一些前述实施方式中，y及z各自独立地为在2～10范围内的整数。举例而言，在一些实施方式中，y及z各自独立地为在4～9或4～6范围内的整数。
在有一些前述实施方式中，R6为H。在前述实施例中的其他者中，R6为C1～C24烷基。在其他实施方式中，R6为OH。在一些实施例中，G未经取代。在其他实施方式中，G3经取代。在各种不同实施方式中，G3为直链C1～C24亚烷基或直链C1～C24伸烯基。
在一些其他前述实施例中，R1或R2或两者为C6～C24烯基。举例而言，在一些实施例中，R1及R2各自独立地具有以下结构：
其中：
R7a及R7b在各次出现时独立地为H或C1～C12烷基；且a为2～12的整数，
其中R7a、R7b及a各自经选择以使得R1及R2各自独立地包含6～20个碳原子。举例而言，在一些实施例中，a为在5～9或8～12范围内的整数。
在有一些前述实施方式中，R7a的至少一次出现为H。举例而言，在一些实施方式中，R7a在各次出现时为H。在前述的其他不同实施方式中，R7b的至少一次出现为C1～C8烷基。举例而言，在一些实施例中，C1～C8烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在不同实施方式中，R1或R2或两者具有以下中的一者：
在有一些前述实施方式中，R为OH、CN、-C(＝O)OR4-OC(＝O)R4或-NHC(＝O)R4。在一些实施方式中，R4为甲基或乙基。
应理解，上文所阐述的化合物的任何实施方式以及上文所阐述的化合物中的任何特定取代基和/或变量可独立地与其他实施方式和/或化合物的取代基和/或变量组合，以形成上文未特定阐述的本发明的实施方式。另外，在一特定实施例和/或技术方案中针对任何特定取代基和/或变数列举取代基和/或变量的列表的情况下，应理解，可自特定实施方式和/或技术方案缺失各个别取代基和/或变量，以及取代基和/或变量的残余列表将视为在本发明的范畴内。应理解，在本说明书中，所描绘化学式的取代基和/或变量的组合仅当此类作用产生稳定化合物时才容许。
在一些实施例中，阳离子脂质为
在一些实施例中，阳离子脂质为
在一些实施方式中，脂质纳米颗粒包含一或多种阳离子脂质。在一个实施方式中，脂质纳米颗粒包含(4-羟丁基)氨叉基)双(己烷-6，1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)，其具有下式：
例示性阳离子脂质揭示于例如U.S.10,166,298中，其全部揭示内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。代表性阳离子脂质包括：
在一些实施方式中，前述阳离子脂质中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本发明的LNP外。
在一些实施方式中，RNA-LNP包含阳离子脂质、本文所述的RNA分子及以下中的一或多者：中性脂质、类固醇、聚乙二醇化脂质或其组合。若将超过一种阳离子脂质并入LNP内，则这些百分比应用于经合并的阳离子脂质。在一个实施方式中，阳离子脂质系以诸如至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)或约以下的量存在于LNP中：40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60摩尔％(mol％)。在一些实施方式中，将两种或更多种阳离子脂质并入LNP内。若将超过一种阳离子脂质并入LNP内，则前述百分比应用于经合并的阳离子脂质。
在本发明的一些实施方式中，LNP包含上文所描述的任何脂质的组合或混合物。
【ii.聚合物结合脂质】
在一些实施方式中，LNP包含聚合物结合脂质。术语“聚合物结合脂质”是指包含脂质部分及聚合物部分两者的分子。聚合物结合脂质的实施例为聚乙二醇化脂质(例如聚乙二醇-脂质、PEG-脂质)。在某些实施方式中，LNP包含额外稳定化脂质，其为聚乙二醇化脂质。术语“聚乙二醇化脂质”是指包含脂质部分及聚乙二醇部分两者的分子。
聚乙二醇化脂质为此项技术中已知的且包括但不限于PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二(十四烷基)乙酰胺及其混合物。代表性聚乙二醇-脂质包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA、PEG-DSG、PEG-DPG及PEG-s-DMG(1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油)。在一个实施方式中，聚乙二醇-脂质为N-[(甲氧基聚乙二醇)2000)氨甲酰基]-1,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。在一个实施方式中，聚乙二醇-脂质为PEG-2000-DMG。在一个实施方式中，聚乙二醇-脂质为PEG-c-DOMG。在其他实施方式中，LNP包含聚乙二醇化二酰基甘油(PEG-DAG)(诸如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2，3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG))、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEG-S-DAG)(诸如4-O-(2',3′-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-((ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、聚乙二醇化神经酰胺(PEG-cer)、或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯(诸如共甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2，3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯)。PEG-脂质揭示于例如US 9,737,619中，其全部揭示内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，前述聚乙二醇化脂质中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本发明的LNP外。
在一些实施方式中，组合物包含具有以下结构的聚乙二醇化脂质：
或其医药学上可接受的盐、互变异构物或立体异构物，其中：
R8及R9各自独立地为含有10～30个碳原子的直链或分支链、饱和或不饱和烷基链，其中所述烷基链视情况间杂有一或多个酯键；且w具有在30～60范围内的平均值。在一些实施方式中，R8及R9各自独立地为含有12～16个碳原子的直链饱和烷基链。在一些实施方式中，w具有在43～53范围内的平均值。在其他实施方式中，平均w为或为约45。在其他不同实施例中，平均w为或为约49。
在一些实施方式中，脂质纳米颗粒包含聚合物结合脂质。在一个实施方式中，脂质纳米颗粒包含2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二(十四烷基)乙酰胺(ALC-0159)，其具有下式：
在各种实施方式中，阳离子脂质与聚乙二醇化脂质的摩尔比在或约100:1～约20:1的范围内，例如20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1，或其中可导出的任何范围或值。
在某些实施方式中，PEG-脂质以或不以相对于纳米颗粒的总脂质含量为或为约1～约10摩尔％(mol％)(例如至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mol％)的量存在于LNP中。
在一些实施方式中，脂质纳米颗粒调配物中PEG的比率可增加或降低，和/或PEG脂质的碳链长度可修改以改变脂质纳米颗粒调配物的药物动力学和/或生物分布。
【iii.额外脂质】
在某些实施方式中，LNP包含一或多种额外脂质或脂质样材料，其使颗粒在其形成期间稳定。适合的稳定化或结构脂质包括非阳离子脂质，例如中性脂质及阴离子脂质。不受任何理论所束缚，由添加其他疏水性部分，诸如胆固醇及除可离子化/阳离子脂质或脂质样材料以外的脂质使LNP的调配优化可增强颗粒稳定性及核酸递送功效。
如本文所用，“阴离子脂质”是指在所选pH下带负电的任何脂质。术语“中性脂质”是指在生理pH下以不带电或中性两性离子形式存在的多种脂质物种中的任一者。在一些实施方式中，额外脂质包含以下中性脂质组分中的一者：(1)磷脂；(2)胆固醇或其衍生物；或(3)磷脂及胆固醇或其衍生物的混合物。
代表性中性脂质包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、神经酰胺、鞘磷脂、二氢-鞘磷脂、脑磷脂及脑苷脂。例示性磷脂包括例如：磷脂酰胆碱，例如二酰基磷脂酰胆碱，诸如二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二十五碳酰磷脂酰胆碱、二月桂酰基胆碱磷脂、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二花生酰胆碱磷脂(DAPC)、二山嵛酰基磷脂酰胆碱(DBPC)、二(二十三烷酰基)磷脂酰胆碱(DTPC)、二(二十四烷酰基)磷脂酰胆碱(DLPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇半丁二酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(OChemsPC)及1-十六烷基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(C16Lyso PC)；及磷脂酰乙醇胺，例如二酰基磷脂酰乙醇胺，诸如二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,2-双十一碳酰基-sn-甘油基-磷酸胆碱(DUPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)及二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-顺丁烯二酰亚氨基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、1-植烷酰基-磷脂酰乙醇胺(DpyPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)、1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂及其混合物。在一些实施方式中，前述中性脂质中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本发明的LNP外。
在一个实施方式中，中性脂质为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)，其具有下式：
在一些实施方式中，LNP包含中性脂质，且中性脂质包含以下中的一或多者：DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和/或SM。在一些实施方式中，前述中性脂质中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本发明的LNP外。
在各种实施方式中，LNP进一步包含类固醇或类固醇类似物。“类固醇”为包含以下碳骨架的化合物：
在某些实施方式中，类固醇或类固醇类似物为胆固醇、粪固醇、植物固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、西红柿次碱、熊果酸、α-生育酚及其混合物。在一些实施方式中，前述类固醇或类固醇类似物中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本发明的LNP外。在某些实施方式中，类固醇或类固醇类似物为胆固醇。胆固醇衍生物的实施例包括但不限于胆甾烷醇、胆甾烷酮、胆甾烯酮、粪甾醇、胆固醇基-2′-羟乙基醚、胆固醇基-4'-羟丁基醚、生育酚及其衍生物，以及其混合物。在一些实施方式中，前述胆固醇衍生物中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本发明的LNP外。在一个实施方式中，胆固醇具有下式：
不受任何理论所束缚，与至少一种额外脂质的量相比，至少一种阳离子脂质的量可影响重要核酸颗粒特征，诸如核酸的电荷、粒径、稳定性、组织选择性及生物活性。因此，在一些实施方式中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比在或约2:1～约8:1的范围内，或在或约10:0～约1:9、约4:1～约1∶2或约3:1～约1:1的范围内。
在一些实施方式中，非阳离子脂质(例如中性脂质(例如一或多种磷脂和/或胆固醇))可包含在或在约0mol％～约90mol％、在或在约0mol％～约80mol％、在或在约0mol％～约70mol％、在或在约0mol％～约60mol％、或者在或在约0mol％～约50mol％的颗粒中存在的总脂质。在一些实施方式中，非阳离子脂质(例如中性脂质(例如一或多种磷脂和/或胆固醇))可为或可不为至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)的颗粒中存在的总脂质：0mol％、10mol％、20mol％、30mol％、40mol％、50mol％、60mol％、70mol％、80mol％或90mol％。
【VI.RNA分子的表征及分析】
本文所述的RNA分子可使用各种方法分析及表征。分析可在加帽之前和/或之后进行。或者，分析可在基于多A捕获的亲和纯化之前和/或之后进行。在另一实施方式中，分析可在额外纯化步骤，例如阴离子交换层析等之前和/或之后进行。举例而言，RNA模板质量可使用基于生物分析仪芯片的电泳系统来测定。在其他实施方式中，RNA模板纯度系使用分析型逆相HPLC来分析。加帽效率可使用例如总核酸酶消化，随后二核苷酸帽物种相对于未加帽GTP物种的MS/MS定量来分析。活体外功效可由例如将RNA分子转染至人类细胞株中来分析。所关注多肽的蛋白质表达可使用诸如ELISA和/或流式细胞分析技术的方法来定量。免疫原性可由例如将RNA分子转染至指示先天性免疫刺激的细胞株(例如PBMC)中来分析。细胞因子诱导可使用例如诸如ELISA的方法来分析，以定量细胞因子，例如干扰素-α。生物分布可由例如生物发光测量来分析。在一些实施方式中，可排除前述分析方法中的1、2、3、4、5者或更多者。
在一些实施方式中，本文所揭示的RNA多核苷酸的特征在于，当在施用包含RNA多核苷酸的组合物或医药制剂的生物体中评定时，相对于适当参考观测到：所关注基因(例如抗原)的表达升高；所关注基因(例如抗原)的表达持续时间增加(例如延长表达)；所关注基因(例如抗原)的表达升高且表达持续时间增加(例如延长表达)；与RNA多核苷酸的IFIT1的相互作用减少；和/或RNA多核苷酸的翻译增加。在一些实施方式中，前述特征中的1、2、3、4、5者或更多者可能不系在施用包含本发明的RNA分子的组合物或医药制剂之后观测到。
在一些实施方式中，参考包含施用在其他方面类似但不具有m7(3′OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeAi)pG2帽的RNA多核苷酸。在一些实施方式中，参考包含施用在其他方面类似但不具有本文所揭示的帽近端序列的RNA多核苷酸的生物体。在一些实施方式中，参考包含施用在其他方面类似但具有自杂交序列的RNA多核苷酸的生物体。
在一些实施方式中，在施用包含RNA多核苷酸的组合物或医药制剂之后至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时或至少120小时测定升高的表达。在一些实施方式中，在施用包含RNA多核苷酸的组合物或医药制剂之后至少24小时测定升高的表达。在一些实施方式中，在施用包含RNA多核苷酸的组合物或医药制剂之后至少48小时测定升高的表达。在一些实施方式中，在施用包含RNA多核苷酸的组合物或医药制剂之后至少72小时测定升高的表达。在一些实施方式中，在施用包含RNA多核苷酸的组合物或医药制剂之后至少96小时测定升高的表达。在一些实施方式中，在施用包含RNA多核苷酸的组合物或医药制剂之后至少120小时测定升高的表达。
在一些实施方式中，在施用包含RNA多核苷酸的组合物或医药制剂之后在或在约24～120小时测定升高的表达。在一些实施方式中，在施用包含RNA多核苷酸的组合物或医药制剂之后在或在约以下时测定升高的表达：24～110小时、24～100小时、24～90小时、24～80小时、24～70小时、24～60小时、24～50小时、24～40小时、24～30小时、30～120小时、40～120小时、50～120小时、60～120小时、70～120小时、80～120小时、90～120小时、100～120小时或110～120小时。
在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)的表达升高或不升高至少2倍～至少10倍。在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)的表达升高至少2倍。在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)的表达升高至少3倍。在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)的表达升高至少4倍。在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)的表达升高至少6倍。在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)的表达升高至少8倍。在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)的表达升高至少10倍。
在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)的表达升高或升高约2倍～约50倍。在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)的表达升高或升高约2倍～约45倍、约2倍～约40倍、约2倍～约30倍、约2倍～约25倍、约2倍～约20倍、约2倍～约15倍、约2倍～约10倍、约2倍～约8倍、约2倍～约5倍、约5倍～约50倍、约10倍～约50倍、约15倍～约50倍、约20倍～约50倍、约25倍～约50倍、约30倍～约50倍、约40倍～约50倍、或约45倍～约50倍。在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)的表达升高或不升高至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)：2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍或50倍，或其中可导出的任何范围或值。
在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)的表达升高(例如表达持续时间增加)在施用包含RNA多核苷酸的组合物或医药制剂之后持续至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)：24小时、48小时、72小时、96小时或120小时。在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)的表达升高在施用之后持续至少24小时。在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)的表达升高在施用之后持续至少48小时。在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)的表达升高在施用之后持续至少72小时。在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)的表达升高在施用之后持续至少96小时。在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)的表达升高在施用包含RNA多核苷酸的组合物或医药制剂之后持续至少120小时。
在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)的表达升高在施用包含RNA多核苷酸的组合物或医药制剂之后持续或持续约24～120小时。在一些实施方式中，表达升高在施用包含RNA多核苷酸的组合物或医药制剂之后持续或持续约24～110小时、24～100小时、24～90小时、24～80小时、24～70小时、24～60小时、24～50小时、24～40小时、24～30小时、30～120小时、40～120小时、50～120小时、60～120小时、70～120小时、80～120小时、90～120小时、100～120小时或110～120小时。在一些实施方式中，所关注基因(例如抗原)的表达升高持续或不持续至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)：24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时或120小时，或其中可导出的任何范围或值。
【VII.免疫反应及分析】
如本文所论述，本发明涉及诱发或诱导个体中针对RSV蛋白(例如野生型或变异RSV F蛋白)的免疫反应。在一个实施方式中，免疫反应可保护个体免于罹患感染或相关疾病(特别而言与RSV相关的那些)，或治疗患有、疑似患有该感染或相关疾病或处于罹患该感染或相关疾病的风险下的个体。本发明的免疫原性组合物的一种用途为由对个体进行接种或疫苗接种来预防RSV感染。在一些实施方式中，免疫原性组合物使个体免疫RSV长达1年(例如针对单个RSV季节)。在一些实施方式中，免疫原性组合物使个体免疫RSV长达2年。在一些实施方式中，免疫原性组合物使个体免疫RSV超过2年。在一些实施方式中，免疫原性组合物使个体免疫RSV超过3年。在一些实施方式中，免疫原性组合物使个体免疫RSV超过4年。在一些实施方式中，免疫原性组合物使个体免疫RSV 5～10年。
【A.免疫分析】
本发明包括实施血清学分析以评估免疫反应是否由本发明的组合物诱导或诱发以及诱导或诱发至何种程度。存在可实施的许多类型的免疫分析。本发明涵盖的免疫分析包括但不限于美国专利4,367,110(双重单株抗体夹心分析)及美国专利4,452,901(蛋白印迹(western blot))中所描述的那些。其他分析包括活体外及活体内的经标记配体的免疫沉淀及免疫细胞化学。
免疫分析一般为结合分析。在一些实施方式中，免疫分析为此项技术中已知的各种类型的酶联免疫吸附分析(ELISA)及放射免疫分析(RIA)。使用组织切片进行的免疫组织化学检测也为尤其适用的。在一个实施例中，抗体或抗原固定在所选择表面上，诸如聚苯乙烯微量滴定盘中的孔、试纸或管柱载体上。接着，将怀疑含有所需抗原或抗体的测试组合物(诸如临床样品)添加至所述孔。在结合及洗涤以移除非特异性结合的免疫复合物之后，可检测结合的抗原或抗体。检测一般由添加连接至可检测标记的对所需抗原或抗体具有特异性的另一种抗体来达成。此类型ELISA被称为“夹心ELISA”。检测也可由添加对所需抗原具有特异性的第二抗体，随后添加对于第二抗体具有结合亲和力的第三抗体来达成，其中第三抗体连接至可检测标记。
竞争ELISA也为其中测试样品与已知量的经标记抗原或抗体竞争结合的可能实施方式。未知样品中反应性物种的量由在与经涂布的孔一起温育之前或期间将样品与已知标记物种混合来测定。样品中反应性物种的存在用以减少可用于结合至孔的经标记物种的量，且因此减少最终信号。无论采用何种形式，ELISA均具有某些共同特征，诸如涂布、温育或结合、洗涤以移除非特异性结合的物种，及检测经结合的免疫复合物。
抗原或抗体也可连接至固体载体，诸如呈盘、珠粒、试纸、膜或管柱基质形式的固体载体，且待分析的样品施加至经固定的抗原或抗体。在用抗原或抗体涂布培养盘时，一般将该培养盘的孔与抗原或抗体溶液一起温育过夜或指定时间。接着洗涤该培养盘的孔以移除不完全吸附的物质。接着，所述孔的任何残留可用表面利用对测试抗血清呈抗原中性的非特异性蛋白质“涂布”。所述蛋白质包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白及奶粉溶液。该涂布允许阻断固定表面上的非特异性吸附位点且因此减少由该表面上抗血清的非特异性结合引起的背景。
【B.RSV感染的诊断】
本发明涵盖以多种方式使用RSV多肽、蛋白质和/或肽，包括检测RSV的存在以诊断感染。根据本发明，检测感染存在的方法涉及获得疑似经一或多种RSV株系感染的样品的步骤，该样品诸如获自个体的样品，例如获自血液、唾液、组织、骨骼、肌肉、软骨或皮肤的样品。在分离样品之后，可进行利用本发明的多肽、蛋白质和/或肽的诊断分析以检测RSV的存在，且用于测定样品中的此类存在的此类分析技术为本领域技术人员所熟知的，且包括诸如放射免疫分析、蛋白印迹分析及ELISA分析的方法。
一般而言，根据本发明，涵盖一种诊断感染的方法，其中已将根据本发明的多肽、蛋白质或肽添加至怀疑感染RSV的样品中，且RSV由与所述多肽、蛋白质和/或肽的抗体结合或与样品中的抗体的多肽、蛋白质和/或肽结合来指示。
也涵盖一种测试样品的方法，已向该样品中添加根据本发明的多肽、蛋白质或肽，疑似感染RSV、先前已感染RSV或感染RSV，且RSV由与所述多肽、蛋白质和/或肽的抗体结合或与样品中的抗体的多肽、蛋白质和/或肽结合来指示。
因此，编码根据本发明的RSV多肽、蛋白质和/或肽的RNA分子可用于治疗、预防由RSV感染(例如主动或被动免疫接种)引起的感染所致的疾病或降低其严重程度或适用作研究工具。
上述多肽、蛋白质和/或肽中的任一者可直接用可检测标记物标记以便鉴别及定量RSV。适用于免疫分析的标签一般为本领域技术人员已知的，且包括酶、放射性同位素、及荧光、发光及发色物质，包括着色颗粒，诸如胶体金或乳胶珠粒。适合的免疫分析包括酶联免疫吸附分析(ELISA)。
【C.保护性免疫】
在本发明的一些实施方式中，编码RSV preF多肽的RNA分子、RNA-LNP及其组合物向个体赋予保护性免疫。保护性免疫是指建立特异性免疫反应的身体能力，其保护个体免于患上特定疾病或病状，其涉及针对其存在免疫反应的药剂。免疫原性有效量能够赋予个体保护性免疫。在一些实施方式中，本发明的编码RSV多肽的RNA分子、RNA-LNP及其组合物可用于诱导针对RSV的平衡免疫反应(包含细胞及体液免疫)，而无与减毒病毒疫苗接种相关的许多风险。“体液”免疫反应是指由抗体分子(包括例如分泌性(IgA)或IgG分子)介导的免疫反应，而“细胞”免疫反应为由T淋巴球(例如CD4+辅助T细胞和/或CD8+T细胞(例如CTL)和/或其他白血球介导的免疫反应。
如本文所用，词组“免疫反应(immune response)”或其等效词组“免疫反应(immunological response)”是指产生针对抗原的体液反应(抗体介导)、细胞反应(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导)或体液及细胞反应两者。此类反应可为主动反应或被动反应。细胞免疫反应由多肽表位与I类或II类MHC分子结合呈递以活化抗原特异性CD4(+)T辅助细胞和/或CD8(+)细胞毒性T细胞来引发。反应也可涉及单核球、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱性球、树突状细胞、星形胶质细胞、微神经胶质细胞、嗜酸性球或先天性免疫的其他组分的活化。如本文所用，“主动免疫”是指由响应于抗原(例如由本发明的RNA分子编码的RSV F蛋白)的存在产生抗体而赋予个体的任何免疫。
如本文所用，“被动免疫”包括但不限于施用活化的免疫效应子，包括免疫反应的细胞介体或蛋白质介体(例如单株和/或多株抗体)。单株或多株抗体组合物可用于被动免疫接种以治疗、预防由携带抗体所识别的抗原的生物体感染引起的疾病或降低其严重程度。抗体组合物可包括结合于多种抗原的抗体，所述抗原可继而与各种生物体结合。抗体组分可为多株抗血清。在某些实施方式中，一或多种抗体系自已用一或多种抗原攻击的动物或第二个体亲和纯化得到。或者，可使用抗体混合物，其为针对相同、相关或不同微生物或生物体(诸如病毒，包括但不限于RSV)中存在的抗原的单株和/或多株抗体的混合物。
可由向患者施用获自具有已知免疫反应性的供体或其他非患者来源的免疫球蛋白(Ig)和/或其他免疫因子而向患者或个体赋予被动免疫。在其他实施方式中，可向个体施用本发明的免疫原性组合物，该个体随后充当含有针对RSV或其他生物体的抗体的球蛋白的来源或供体，该球蛋白系响应于免疫原性组合物的攻击而产生(“超免疫球蛋白”)。由此治疗的个体将供给血浆，接着经由习知血浆分离方法自其中获得超免疫球蛋白，且施用给另一个体以赋予针对RSV感染的抗性或治疗RSV感染。
出于本说明书及随附申请专利范围的目的，术语“表位”及“抗原决定子”可互换地用于指B和/或T细胞回应或识别的抗原上的位点。B细胞表位可由由蛋白质的三级折叠而并置的连续氨基酸或非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理后消失。表位通常包括呈独特空间构形的至少3个且更通常至少5个或8～10个氨基酸。测定表位的空间构形的方法包括例如x射线结晶学及2维核磁共振。参见例如Epitope Mapping Protocols(1996)。识别相同表位的抗体可在显示一种抗体阻断另一抗体与目标抗原的结合的能力的简单免疫分析中鉴别。T细胞针对CD8细胞识别约九个氨基酸的连续表位或针对CD4细胞识别约13～15个氨基酸的连续表位。识别表位的T细胞可由活体外分析、由抗原依赖性杀死(细胞毒性T淋巴细胞分析，Tigges等人,1996)或由细胞因子分泌来鉴别，所述活体外分析测量抗原依赖性增殖，其由回应于表位的致敏T细胞引起的3H-胸苷并入所测定(Burke等人,1994)。
细胞介导的免疫反应的存在可由增殖分析(CD4(+)T细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)分析法来测定。体液及细胞反应对免疫原性组合物的保护或治疗作用的相对贡献可由分别自经免疫接种的同基因型动物分离IgG及T细胞且测量第二个体中的保护或治疗作用来区分。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”可互换使用，且是指作为动物或接受者的免疫反应的一部分起作用的若干类别的结构相关蛋白质中的任一者，所述蛋白质包括IgG、IgD、IgE、IgA、IgM及相关蛋白质。在正常生理条件下，抗体存在于血浆及其他体液中以及某些细胞的膜中，且由类型指示为B细胞的淋巴细胞或其功能等效物产生。
如本文所用，术语“免疫原性剂”或“免疫原”或“抗原”可互换使用以描述在单独、与佐剂结合或呈递于呈递媒剂上向接受者施用时能够诱导针对其自身的免疫反应的分子。
【VIII.组合物】
在一些实施方式中，本文所揭示的RNA分子和/或RNA-LNP可以医药组合物或药剂形式施用且可以任何适合医药组合物的形式施用。在一些实施方式中，医药组合物系用于治疗性和/或防治性治疗。在一个实施方式中，本发明涉及一种用于向宿主施用的组合物。在一些实施方式中，该宿主为人类。在其他实施方式中，该宿主为非人类。
本文所述的疫苗组合物的调配物可由药理学技术中已知或此后研发的任何方法来制备。一般而言，此类制备方法包括以下的步骤：使活性成分(例如RNA分子和/或RNA-LNP)与赋形剂和/或一或多种其他辅助成分结合，及接着必要和/或需要时，将产物分割、塑形和/或封装成所需单剂量或多剂量单位。根据本发明的医药组合物或调配物可以散装形式、以单一单位剂量形式和/或以多个单一单位剂量形式制备、封装和/或出售。根据本发明的医药组合物中活性成分、医药学上可接受的赋形剂和/或任何额外成分的相对量将视治疗的个体的身分、体型和/或病状且进一步视组合物施用的途径而变化。借助于实施例，组合物可包含0.1％～100％之间，例如0.5～50％之间、1～30％之间、5～80％之间、至少80％(w/w)，或至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的活性成分：0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(w/w)。诸如本文所述的组合物的医药剂的调配和/或制造中的一般考虑因素可见于例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy第21版，Lippincott Williams及Wilkins,2005年(以全文引用的方式并入本文中)中。
在一些实施方式中，本文所揭示的RNA分子和/或RNA-LNP可以医药组合物形式施用，该医药组合物可调配成固体、半固体、液体、冻干、冷冻和/或气体形式的制剂。在一些实施方式中，本文所揭示的RNA分子和/或RNA-LNP可以医药组合物形式施用，该医药组合物可包含医药学上可接受的载剂且可视情况包含一或多种佐剂、稳定剂、盐、缓冲剂、防腐剂及视情况存在的其他治疗剂。在一些实施方式中，本文所揭示的医药组合物包含一或多种医药学上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂。在一些实施方式中，医药组合物不包括佐剂(例如，其不含佐剂)。
如本文所用，术语“赋形剂”是指本发明的医药组合物中可存在但不为活性成分的物质。赋形剂的实施例包括但不限于载剂、稀释剂(例如溶剂、分散介质和/或其他液体媒剂、分散液或悬浮助剂)、造粒剂和/或分散剂、表面活性剂、等张剂、增稠剂和/或乳化剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂和/或油、着色剂、甜味剂和/或调味剂、稳定剂、抗氧化剂、抗微生物剂和/或抗真菌剂、重量摩尔渗透浓度调节剂、pH调节剂、缓冲剂、螯合剂、低温保护剂和/或增积剂。在一些实施方式中，前述赋形剂中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的医药组合物外。
术语“载剂”是指可为天然、合成、有机或无机的组分，活性组分合并于该组分中以便有助于、增强和/或实现医药组合物的施用。如本文所用，载剂可为一或多种适合于向个体施用的兼容固体或液体填充剂、稀释剂或囊封物质。适合载剂包括但不限于无菌水、林格氏溶液(Ringer′s solution)、林格氏乳酸盐溶液、无菌氯化钠溶液、等张盐水、聚亚烷二醇、氢化萘，以及尤其生物兼容性乳酸交酯聚合物、乳酸交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一些实施方式中，本发明的医药组合物包括氯化钠。在一些实施方式中，前述载剂中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的医药组合物外。
术语“稀释剂”关于稀释和/或稀化剂。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体悬浮液和/或混合介质中的任何一或多者。适合用于本发明的医药组合物中的稀释剂的实施例包括但不限于乙醇、甘油、盐水、水、碳酸钙或碳酸钠、磷酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇等，和/或其组合。在一些实施方式中，前述稀释剂中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的医药组合物外。
适合造粒剂和/或分散剂的实施例包括但不限于淀粉、预糊化淀粉、或微晶淀粉、褐藻酸、瓜尔豆胶、琼脂、聚(乙烯基-吡咯啶酮)(聚维酮(providone))、交联化聚(乙烯基-吡咯啶酮)(交联聚维酮)、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、交联化羧甲基纤维素钠(交联羧甲纤维素)、硅酸镁铝月桂基硫酸钠等，和/或其组合。在一些实施方式中，前述造粒剂和/或分散剂中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的医药组合物外。
适合用于本发明的医药组合物中的表面活性剂的实施例包括但不限于天然乳化剂(例如阿拉伯胶、琼脂、褐藻酸、褐藻酸钠、黄蓍胶、鹿角菜、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡及卵磷脂)、脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯[80]、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯[40]、单油酸甘油酯、聚氧乙烯酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如)、聚氧乙烯醚(例如聚氧乙烯月桂基醚[30])、F 68、188等，和/或其组合。在一些实施方式中，前述表面活性剂中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的医药组合物外。
适合用于本发明的医药组合物中的防腐剂的实施例包括但不限于氯化烷基二甲基苄基铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、抗坏血酸、丁基化羟基甲氧苯、乙二胺、月桂基硫酸钠(SLS)、月桂基醚硫酸钠(SLES)等，及其组合。在一些实施方式中，前述防腐剂中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的医药组合物外。
适合用于本发明的医药组合物中的抗微生物剂和/或抗真菌剂的实施例包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾或苯甲酸钠、山梨酸钾或山梨酸钠、丙酸钠、山梨酸等，及其组合。在一些实施方式中，前述抗微生物剂和/或抗真菌剂中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的医药组合物外。
适合用于本发明的医药组合物中的粘合剂的实施例包括但不限于淀粉、明胶、糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露糖醇)、氨基酸(例如甘氨酸)、天然及合成胶(例如阿拉伯胶、褐藻酸钠)、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等，及其组合。在一些实施方式中，前述粘合剂中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的医药组合物外。
适合用于本发明的医药组合物中的润滑剂和/或油的实施例包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠或月桂基硫酸镁等，及其组合。在一些实施方式中，前述润滑剂和/或油中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的医药组合物外。
适合用于本发明的医药组合物中的抗氧化剂的实施例包括但不限于α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、苯甲醇、丁基化羟基甲氧苯、间甲酚、甲硫氨酸、丁基化羟基甲苯、单硫甘油、偏亚硫酸氢钠或偏亚硫酸氢钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠等，及其组合。在一些实施方式中，前述抗氧化剂中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的医药组合物外。
适合用于本发明的医药组合物中的重量摩尔渗透浓度调节剂、pH调节剂及缓冲剂的实施例包括但不限于磷酸钠、柠檬酸钠、琥珀酸钠、组氨酸(或组氨酸-HCl)、苹果酸钠、碳酸钠等，和/或其组合。在一些实施方式中，前述重量摩尔渗透浓度调节剂中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的医药组合物外。
适合用于本发明的医药组合物中的螯合剂的实施例包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、单水合柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、反丁烯二酸、苹果酸、磷酸、乙二胺四乙酸钠、酒石酸、乙二胺四乙酸三钠等，及其组合。在一些实施方式中，前述螯合剂中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的医药组合物外。
适合用于本发明的医药组合物中的低温保护剂的实施例包括但不限于甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘油、右旋糖等，及其组合。在一些实施方式中，前述低温保护剂中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的医药组合物外。
适合增积剂的实施例包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、甘氨酸、乳糖、棉子糖及其组合。在一些实施方式中，前述增积剂中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的医药组合物外。
组合物可使用一或多种赋形剂(例如一或多种载体和/或稀释剂)调配以例如：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许持续和/或延迟释放(例如自储槽式调配物)；(4)改变生物分布(例如靶向特定组织和/或细胞类型)；(5)增加活体内所编码蛋白质的翻译；和/或(6)改变活体内所编码蛋白质(抗原)的释放概况。在一些实施方式中，可排除前述赋形剂目的中的1、2、3、4、5者或更多者。用于治疗用途的医药学上可接受的赋形剂(例如载剂和/或稀释剂)为医药技术中熟知的，且描述于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R Gennaro编辑.1985)中。
可关于预期施用途径及标准医药实践来选择医药赋形剂(例如载剂和/或稀释剂)。
在一些实施方式中，组合物包含含有编码免疫原性多肽的开放阅读框的RNA分子。在一些实施方式中，免疫原性多肽包含RSV抗原。在一些实施方式中，RSV抗原为RSV F蛋白或其片段或变体。
在一些实施方式中，组合物包含有包含编码全长RSV F蛋白的开放阅读框的RNA分子。在一些实施方式中，所编码的免疫原性多肽为截短RSV F蛋白。在一些实施方式中，所编码的免疫原性多肽为RSV F蛋白的变异体。在一些实施方式中，所编码的免疫原性多肽为RSV F蛋白的片段。
【A.包括LNP的免疫原性组合物】
在一些实施方式中，医药组合物包含与基于脂质的递送系统一起调配的本文所揭示的RNA分子(例如多核苷酸)。因此，在一些实施方式中，组合物包括基于脂质的递送系统(例如LNP)(例如基于脂质的疫苗)，其将核酸分子递送至细胞内部，该核酸分子接着可在细胞内部复制、抑制所关注蛋白质表达和/或表达所编码的所关注多肽。递送系统可具有增强所编码抗原的免疫原性的佐剂作用。在一些实施方式中，组合物包含至少一个编码RSV多肽的RNA分子，该至少一个RNA分子与一或多种脂质复合、囊封于一或多种脂质中和/或与一或多种脂质一起调配，且形成脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体、脂质复合物和/或纳米脂质体。在一些实施方式中，组合物包含脂质纳米颗粒。因此，在某些实施方式中，本发明涉及包含一或多种与核酸或多肽/肽结合的脂质(例如RSV RNA-LNP)的组合物。
在一些情况下，包括基于脂质的递送系统的免疫原性组合物可进一步包括一或多种盐和/或一或多种医药学上可接受的表面活性剂、防腐剂、载剂、稀释剂和/或赋形剂。在一些实施方式中，包括基于脂质的递送系统的免疫原性组合物进一步包括医药学上可接受的媒剂。在一些实施方式中，缓冲剂、稳定剂及视情况存在的盐中的每一者可包括在包括基于脂质的递送系统的免疫原性组合物中。在其他实施方式中，缓冲剂、稳定剂、盐、表面活性剂、防腐剂及赋形剂中的任何一或多者可排除在包括基于脂质的递送系统的免疫原性组合物外。
在另一实施方式中，包括基于脂质的递送系统的免疫原性组合物进一步包含稳定剂。在一些实施方式中，稳定剂包含蔗糖、甘露糖、山梨糖醇、棉子糖、海藻糖、甘露糖醇、肌醇、氯化钠、精氨酸、乳糖、羟乙基淀粉、聚葡萄糖、聚乙烯吡咯啶酮、甘氨酸或其组合。在一些实施方式中，前述稳定剂中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的免疫原性组合物外。在一些实施方式中，稳定剂为双糖或糖。在一个实施方式中，稳定剂为蔗糖。在另一实施方式中，稳定剂为海藻糖。在另一实施方式中，稳定剂为蔗糖与海藻糖的组合。在一些实施方式中，组合物中一或多种稳定剂的总浓度为或为约5％～约10％w/v。举例而言，稳定剂的总浓度可为或可不为至少、至多、恰好等于以下或在以下之间(包括性或排他性)：1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％w/v，或其中可导出的任何范围或值。在一些实施方式中，稳定剂浓度包括但不限于为或为约10mg/mL～约400mg/mL、约100mg/mL～约200mg/mL、约100mg/mL～约150mg/mL、约100mg/mL～约140mg/mL、约100mg/mL～约130mg/mL、约100mg/mL～约120mg/mL、约100mg/mL～约110mg/mL、或约100mg/mL～约105mg/mL的浓度。在一些实施方式中，稳定剂的浓度为或不为至少、至多、恰好等于以下或在以下之间(包括性或排他性)：10mg/mL、20mg/mL、50mg/mL、100mg/mL、101mg/mL、102mg/mL、103mg/mL、104mg/mL、105mg/mL、106mg/mL、107mg/mL、108mg/mL、109mg/mL、110mg/mL、150mg/mL、200mg/mL、300mg/mL、400mg/mL或更高。
在另一实施方式中，稳定剂的质量的量与RNA的质量的量呈特定比率。在一个实施方式中，稳定剂与RNA的质量的量的比率不超过5000。在另一实施方式中，稳定剂与RNA的质量的量的比率不超过2000。在另一实施方式中，稳定剂与RNA的质量的量的比率不超过1000。在另一实施方式中，稳定剂与RNA的质量的量的比率不超过500。在另一实施方式中，稳定剂与RNA的质量的量的比率不超过100。在另一实施方式中，稳定剂与医药物质的质量的量的比率不超过50。在另一实施方式中，稳定剂与RNA的质量的量的比率不超过10。在另一实施方式中，稳定剂与RNA的质量的量的比率不超过1。在另一实施方式中，稳定剂与RNA的质量的量的比率不超过0.5。在另一实施方式中，稳定剂与RNA的质量的量的比率不超过0.1。在另一实施方式中，稳定剂及RNA包含为或为约200～2000:1的质量比的稳定剂及RNA。
在一些实施方式中，包括基于脂质的递送系统的免疫原性组合物进一步包含缓冲剂。缓冲剂的实施例包括但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、d-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、乳糖酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、磷酸氢钙、磷酸、磷酸钙、磷酸氢氧化钙、乙酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、缓血酸胺、Tris盐酸(HCl)、氨基磺酸盐缓冲液(例如HEPES)、氢氧化镁、氢氧化铝、褐藻酸、无热原水、等张盐水、林格氏溶液、乙醇和/或其组合。在一些实施方式中，前述缓冲剂中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的免疫原性组合物外。在一些实施方式中，缓冲剂为HEPES缓冲液、Tris缓冲液和/或PBS缓冲液。在一个实施方式中，缓冲剂为Tris缓冲液。在另一实施方式中，缓冲剂为HEPES缓冲液。在另一实施方式中，缓冲剂为PBS缓冲液。举例而言，缓冲液浓度可为或可不为至少、至多、恰好等于以下或在以下之间(包括性或排他性)：1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、或20mM，或其中可导出的任何范围或值。缓冲液可呈中性pH、pH 6.5～8.5、pH 7.0～pH 8.0、或pH 7.2～pH 7.6。举例而言，缓冲液可呈或可不呈至少、至多、恰好以下pH或以下之间(包括性或排他性)的pH：6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、或8.5，或其中可导出的任何范围或值。在特定实施方式中，缓冲液呈pH 7.4。
在一些实施方式中，包括基于脂质的递送系统的免疫原性组合物可进一步包含盐。盐的实施例包括但不限于钠盐和/或钾盐。在一个实施方式中，盐为钠盐。在一特定实施方式中，钠盐为氯化钠。在一个实施方式中，盐为钾盐。在一些实施方式中，钾盐包含氯化钾。在一些实施方式中，前述盐中的任何一或多者可排除在本文所揭示的免疫原性组合物外。组合物中盐的浓度可为或为约70mM～约140mM。举例而言，盐浓度可为或不可为至少、至多、恰好等于以下或在以下之间(包括性或排他性)：50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM。
在一些实施方式中，盐浓度包括但不限于为或为约1mg/mL～约100mg/mL、约1mg/mL～约50mg/mL、约1mg/mL～约40mg/mL、约1mg/mL～约30mg/mL、约1mg/mL～约20mg/mL、约1mg/mL～约10mg/mL、或约1mg/mL～约15mg/mL的浓度。在一些实施方式中，盐的浓度为或不为至少、至多、恰好等于以下或在以下之间(包括性或排他性)：1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL或更高。盐可呈中性pH、pH6.5～8.5、pH 7.0～pH 8.0、或pH 7.2～pH 7.6。举例而言，盐可呈或可不呈至少、至多、恰好等于以下或在以下之间(包括性或排他性)的pH：6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5。
在一些实施方式中，包括基于脂质的递送系统的免疫原性组合物进一步包含表面活性剂、防腐剂、任何其他赋形剂或其组合。如本文所用，“任何其他赋形剂”包括但不限于抗氧化剂、麸胱甘肽、EDTA、甲硫氨酸、甲磺酸去铁胺(desferal)、抗氧化剂、金属清除剂和/或游离基清除剂。在一个实施方式中，表面活性剂、防腐剂、赋形剂或其组合为无菌注射用水(sWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、盐水、右旋糖溶液、聚山梨醇酯、泊洛沙姆(poloxamer)、曲拉通、二价阳离子、乳酸林格氏液、氨基酸、糖、多元醇、聚合物和/或环糊精。在一些实施方式中，前述赋形剂中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的免疫原性组合物外。
赋形剂是指免疫原性组合物中不为活性成分的成分，其其他实施例包括但不限于载剂、粘合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、调味剂、崩解剂、包衣、塑化剂、压缩剂、湿式造粒剂和/或着色剂。如本文所用，“医药学上可接受的载剂”包括任何及所有水性溶剂(例如水、醇/水溶液、盐水溶液、非经肠媒剂，诸如氯化钠、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)等)、非水性溶剂(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油及诸如油酸乙酯的可注射有机酯)、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂及惰性气体)、等张剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、流体及营养补充剂，诸如一般本领域技术人员将已知的物质及其组合。稀释剂或者稀释或稀化剂包括但不限于乙醇、甘油、水、糖(诸如乳糖、蔗糖、甘露糖醇及山梨糖醇)及来源于小麦、玉米水稻及马铃薯的淀粉；及纤维素，诸如微晶纤维素。组合物中稀释剂的量按总组合物的重量计可在或在约10％～约90％的范围内，例如在或在约25％～约75％、约30％～约60％、或约12％～约60％的范围内。用于本文所揭示的组合物中的防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯及硫柳汞。在一些实施方式中，前述赋形剂中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在本文所揭示的免疫原性组合物外。
包括基于脂质的递送系统的免疫原性组合物中各种组分的pH及确切浓度系根据熟知参数来进行调节。此类介质及药剂用于医药活性物质的用途为此项技术中熟知的。除非任何习知介质或药剂与活性成分不兼容，否则涵盖其在免疫原性、预防性和/或治疗性组合物中的用途。
在一个实施方式中，医药组合物包含编码本文所揭示的RSV多肽的RSV RNA分子，该RSV RNA分子与一或多种脂质复合、囊封于一或多种脂质中和/或与一或多种脂质一起调配以形成RSV RNA-LNP。在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物为液体。在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物为冷冻的。在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物为冻干的。在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物包含编码本文所揭示的RSV多肽的RSV RNA多核苷酸分子，其囊封于具有阳离子脂质、聚乙二醇化脂质(即PEG-脂质)及一或多种结构性脂质(例如中性脂质)的脂质组成的LNP中。在一些实施方式中，前述脂质中的任何一或多者可排除在本文所揭示的医药组合物的LNP外。
在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物包含阳离子脂质。阳离子脂质可包含本文所揭示的任何一或多种阳离子脂质。
阳离子脂质可包含本文所揭示的任何一或多种阳离子脂质。在特定实施方式中，阳离子脂质包含((4-羟丁基)氨叉基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)。在一些实施方式中，阳离子脂质(例如ALC-0315)以或不以至少以下、至多以下、以下之间(包括性或排他性)或恰好以下的浓度包括在组合物中：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.5、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.7、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99、1、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.1、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.2、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.3、1.31、1.32、1.33、1.34、1.35、1.36、1.37、1.38、1.39、1.4、1.41、1.42、1.43、1.44、1.45、1.46、1.47、1.48、1.49、1.5、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.6、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.7、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.8、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.9、1.91、1.92、1.93、1.94、1.95、1.96、1.97、1.98、1.99或2ng/μg/mg/mL。在一些实施方式中，阳离子脂质(例如ALC-0315)以或不以至少以下、至多以下、以下之间(包括性或排他性)或恰好以下的浓度包括在组合物中：0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.5、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.7、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1mg/mL。在一些实施方式中，阳离子脂质(例如ALC-0315)以至少0.4mg/mL、至少0.45mg/mL、至少0.5mg/mL、至少0.55mg/mL、至少0.6mg/mL、至少0.65mg/mL、至少0.7mg/mL、至少0.75mg/mL、至少0.8mg/mL、至少0.85mg/mL、至少0.9mg/mL、至少0.95mg/mL、或至少1mg/mL的浓度包括在组合物中。在一些实施方式中，阳离子脂质(例如ALC-0315)以0.4与0.5mg/mL之间、0.5与0.6mg/mL之间、0.6与0.7mg/mL之间、0.7与0.8mg/mL之间、0.8与0.9mg/mL之间、或0.9与1mg/mL之间的浓度包括在组合物中。在一些实施方式中，阳离子脂质(例如ALC-0315)以0.4与0.45mg/mL之间、0.45与0.5mg/mL之间、0.5与0.55mg/mL之间、0.55与0.6mg/mL之间、0.6与0.65mg/mL之间、0.65与0.7mg/mL之间、0.7与0.75mg/mL之间、0.75与0.8mg/mL之间、0.8与0.85mg/mL之间、0.85与0.9mg/mL之间、0.9与0.95mg/mL之间、或0.95与1mg/mL之间的浓度包括在组合物中。
在特定实施方式中，阳离子脂质(例如ALC-0315)以0.8～0.95mg/mL的浓度包括在组合物中。在特定实施方式中，阳离子脂质(例如ALC-0315)以或以约0.8～0.9mg/mL的浓度包括在组合物中。在特定实施方式中，阳离子脂质(例如ALC-0315)以或以约0.85～0.9mg/mL的浓度包括在组合物中。在特定实施方式中，阳离子脂质(例如ALC-0315)以或不以以下的浓度或至少、至多、恰好以下或在以下任何两者之间(包括性或排他性)或约以下的浓度包括在组合物中：0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94或0.95mg/mL。在特定实施方式中，阳离子脂质(例如ALC-0315)以或以约0.86mg/mL的浓度包括在组合物中。冻干组合物的浓度系在复原后测定。
在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物进一步包含聚乙二醇化脂质(即PEG-脂质)。
聚乙二醇化脂质可包含本文所揭示的任何一或多种聚乙二醇化脂质。在特定实施方式中，聚乙二醇化脂质包含2-[(聚乙二醇)-2000]-N，N-二(十四烷基)乙酰胺(ALC-0159)。在一些实施方式中，聚乙二醇化脂质(例如ALC-0159)以或不以至少以下、至多以下、以下之间(包括性或排他性)或恰好以下的浓度包括在组合物中：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.5、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.7、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99、1、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.1、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.2、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.3、1.31、1.32、1.33、1.34、1.35、1.36、1.37、1.38、1.39、1.4、1.41、1.42、1.43、1.44、1.45、1.46、1.47、1.48、1.49、1.5、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.6、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.7、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.8、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.9、1.91、1.92、1.93、1.94、1.95、1.96、1.97、1.98、1.99或2ng/μg/mg/mL。在一些实施方式中，聚乙二醇化脂质(例如ALC-0159)以或不以至少以下、至多以下、以下之间(包括性或排他性)或恰好以下的浓度包括在组合物中：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49或0.5mg/mL。在一些实施方式中，聚乙二醇化脂质(例如ALC-0159)以至少0.01mg/mL、至少0.05mg/mL、至少0.1mg/mL、至少0.15mg/mL、至少0.2mg/mL、至少0.25mg/mL、至少0.3mg/mL、至少0.35mg/mL、至少0.4mg/mL、至少0.45mg/mL、或至少0.5mg/mL的浓度包括在组合物中。在一些实施方式中，聚乙二醇化脂质(例如ALC-0159)以0.01与0.05mg/mL之间、0.05与0.1mg/mL之间、0.1与0.15mg/mL之间、0.15与0.2mg/mL之间、或0.2与0.25mg/mL之间的浓度包括在组合物中。
在特定实施方式中，聚乙二醇化脂质(例如ALC-0159)以或以约0.05～0.15mg/mL的浓度包括在组合物中。在特定实施方式中，聚乙二醇化脂质(例如ALC-0159)以或以约0.10～0.15mg/mL的浓度包括在组合物中。在特定实施方式中，聚乙二醇化脂质(例如ALC-0159)以或不以以下的浓度或至少、至多、恰好以下或在以下任何两者之间(包括性或排他性)或约以下的浓度包括在组合物中：0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14或0.15mg/mL。在特定实施方式中，聚乙二醇化脂质(例如ALC-0159)以或以约0.11mg/mL的浓度包括在组合物中。冻干组合物的浓度系在复原后测定。
在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物进一步包含一或多种结构性脂质。
一或多种结构性脂质可包含本文所揭示的任何一或多种结构性脂质。在特定实施方式中，一或多种结构性脂质包含中性脂质及类固醇或类固醇类似物。在特定实施方式中，一或多种结构性脂质包含1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)及胆固醇。在一些实施方式中，一或多种结构性脂质(例如DSPC及胆固醇)以或不以至少以下、至多以下、以下之间(包括性或排他性)或恰好以下的浓度包括在组合物中：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.5、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.7、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99、1、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.1、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.2、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.3、1.31、1.32、1.33、1.34、1.35、1.36、1.37、1.38、1.39、1.4、1.41、1.42、1.43、1.44、1.45、1.46、1.47、1.48、1.49、1.5、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.6、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.7、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.8、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.9、1.91、1.92、1.93、1.94、1.95、1.96、1.97、1.98、1.99或2ng/μg/mg/mL。在一些实施方式中，一或多种结构性脂质(例如DSPC及胆固醇)以或不以至少以下、至多以下、以下之间(包括性或排他性)或恰好以下的浓度包括在组合物中：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49或0.5mg/mL。在一些实施方式中，一或多种结构性脂质(例如DSPC及胆固醇)以至少0.05mg/mL、至少0.1mg/mL、至少0.15mg/mL、至少0.2mg/mL、至少0.25mg/mL、至少0.3mg/mL、至少0.35mg/mL、至少0.4mg/mL、至少0.45mg/mL、至少0.5mg/mL、至少0.55mg/mL、至少0.6mg/mL、至少0.65mg/mL、至少0.7mg/mL、至少0.75mg/mL、至少0.8mg/mL、至少0.85mg/mL、至少0.9mg/mL、至少0.95mg/mL、或至少1mg/mL的浓度包括在组合物中。在一些实施方式中，一或多种结构性脂质(例如DSPC及胆固醇)以0.05与0.1mg/mL之间、0.1与0.15mg/mL之间、0.15与0.2mg/mL之间、0.2与0.25mg/mL之间、0.25与0.3mg/mL之间、0.3与0.35mg/mL之间、0.35与0.4mg/mL之间、0.4与0.45mg/mL之间、0.45与0.5mg/mL之间、0.5与0.55mg/mL之间、0.55与0.6mg/mL之间、0.6与0.65mg/mL之间、0.65与0.7mg/mL之间、0.7与0.75mg/mL之间、0.75与0.8mg/mL之间、0.8与0.85mg/mL之间、0.85与0.9mg/mL之间、0.9与0.95mg/mL之间、或0.95与1mg/mL之间的浓度包括在组合物中。
在特定实施方式中，一或多种结构性脂质包括DSPC，且DSPC以或以约0.1～0.25mg/mL的浓度包括在组合物中。在特定实施方式中，一或多种结构性脂质包括DSPC，且DSPC以或以约0.15～0.25mg/mL的浓度包括在组合物中。在特定实施方式中，一或多种结构性脂质包括DSPC，且DSPC以或不以以下的浓度或至少、至多、恰好以下或在以下任何两者之间(包括性或排他性)或约以下的浓度包括在组合物中：0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25mg/mL。在特定实施方式中，DSPC以或以约0.19mg/mL的浓度包括在组合物中。
在特定实施方式中，一或多种结构性脂质包括胆固醇，且胆固醇以或以约0.3～0.45mg/mL的浓度包括在组合物中。在特定实施方式中，一或多种结构性脂质包括胆固醇，且胆固醇以或以约0.3～0.4mg/mL的浓度包括在组合物中。在特定实施方式中，一或多种结构性脂质包括胆固醇，且胆固醇以或以约0.35～0.45mg/mL的浓度包括在组合物中。在特定实施方式中，一或多种结构性脂质包括胆固醇，且胆固醇以或不以以下的浓度或至少、至多、恰好以下或在以下任何两者之间(包括性或排他性)或约以下的浓度包括在组合物中：0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44或0.45mg/mL。在特定实施方式中，胆固醇以和/或以约0.37mg/mL的浓度包括在组合物中。冻干组合物的浓度系在复原后测定。
在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物进一步包含一或多种缓冲剂及稳定剂以及视情况存在的盐稀释剂。因此，在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物包含阳离子脂质、聚乙二醇化脂质、一或多种结构性脂质、一或多种缓冲剂、稳定剂及视情况存在的盐稀释剂。在一些实施方式中，前述要素中的1、2、3者或更多者排除在RSV RNA-LNP组合物外。
在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物包含一或多种缓冲剂。
一或多种缓冲剂可包含本文所揭示的任何一或多种缓冲剂。在特定实施方式中，组合物包含Tris缓冲液，其包含至少第一缓冲剂及第二缓冲剂。在一些实施方式中，第一缓冲剂为缓血酸胺。在一些实施方式中，第二缓冲剂为Tris盐酸(HCl)。在一些实施方式中，Tris缓冲液的第一缓冲剂及第二缓冲剂(例如缓血酸胺及Tris HCl)以或不以至少以下、至多以下、以下之间(包括性或排他性)或恰好以下的浓度包括在组合物中：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.5、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.7、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99、1、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.1、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.2、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.3、1.31、1.32、1.33、1.34、1.35、1.36、1.37、1.38、1.39、1.4、1.41、1.42、1.43、1.44、1.45、1.46、1.47、1.48、1.49、1.5、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.6、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.7、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.8、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.9、1.91、1.92、1.93、1.94、1.95、1.96、1.97、1.98、1.99或2ng/μg/mg/mL。冻干组合物的浓度系在复原后测定。
在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物为包含Tris缓冲液的液体组合物。
在一些实施方式中，Tris缓冲液包含第一缓冲剂。在一些实施方式中，第一缓冲剂为缓血酸胺。在一些实施方式中，第一缓冲剂(例如缓血酸胺)以或不以至少以下、至多以下、以下之间(包括性或排他性)或恰好以下的浓度包括在液体组合物中：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49或0.5mg/mL。在一些实施方式中，第一缓冲剂(例如缓血酸胺)以至少0.1mg/mL、至少0.05mg/mL、至少0.1mg/mL、至少0.15mg/mL、至少0.2mg/mL、至少0.25mg/mL、至少0.3mg/mL、至少0.35mg/mL、至少0.4mg/mL、至少0.45mg/mL、至少0.5mg/mL、至少0.55mg/mL、至少0.6mg/mL、至少0.65mg/mL、至少0.7mg/mL、至少0.75mg/mL、至少0.8mg/mL、至少0.85mg/mL、至少0.9mg/mL、至少0.95mg/mL、或至少1mg/mL的浓度包括在液体组合物中。在一些实施方式中，第一缓冲剂(例如缓血酸胺)以0.05与0.15mg/mL之间、0.15与0.25mg/mL之间、0.25与0.35mg/mL之间、0.35与0.45mg/mL之间、0.45与0.55mg/mL之间、0.55与0.65mg/mL之间、0.65与0.75mg/mL之间、0.75与0.85mg/mL之间、或0.85与0.95mg/mL之间的浓度包括在液体组合物中。在一些实施方式中，第一缓冲剂(例如缓血酸胺)以0.05与0.1mg/mL之间、0.1与0.15mg/mL之间、0.15与0.2mg/mL之间、0.2与0.25mg/mL之间、0.25与0.3mg/mL之间、0.3与0.35mg/mL之间、0.35与0.4mg/mL之间、0.4与0.45mg/mL之间、0.45与0.5mg/mL之间、0.5与0.55mg/mL之间、0.55与0.6mg/mL之间、0.6与0.65mg/mL之间、0.65与0.7mg/mL之间、0.7与0.75mg/mL之间、0.75与0.8mg/mL之间、0.8与0.85mg/mL之间、0.85与0.9mg/mL之间、0.9与0.95mg/mL之间、或0.95与1mg/mL之间的浓度包括在液体组合物中。
在特定实施方式中，第一缓冲剂(例如缓血酸胺)以或以约0.1～0.3mg/mL的浓度包括在液体组合物中。在特定实施方式中，第一缓冲剂(例如缓血酸胺)以或以约0.15～0.25mg/mL的浓度包括在液体组合物中。在特定实施方式中，第一缓冲剂(例如缓血酸胺)以或不以以下的浓度或至少、至多、恰好以下或在以下任何两者之间(包括性或排他性)或约以下的浓度包括在液体组合物中：0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29或0.3mg/mL。在特定实施方式中，第一缓冲剂(例如缓血酸胺)以或以约0.20mg/mL的浓度包括在液体组合物中。
在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物为包含有包含第二缓冲剂的Tris缓冲液的液体组合物。
在一些实施方式中，第二缓冲剂包含Tris HCl。在一些实施方式中，第二缓冲剂(例如Tris HCl)以或不以至少以下、至多以下、以下之间(包括性或排他性)或恰好以下的浓度包括在液体组合物中：0.5、0.55、1、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.1、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.2、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.3、1.31、1.32、1.33、1.34、1.35、1.36、1.37、1.38、1.39、1.4、1.41、1.42、1.43、1.44、1.45、1.46、1.47、1.48、1.49或1.5mg/mL。在一些实施方式中，第二缓冲剂(例如Tris HCl)以至少0.5mg/mL、至少0.55mg/mL、至少0.6mg/mL、至少0.65mg/mL、至少0.7mg/mL、至少0.75mg/mL、至少0.8mg/mL、至少0.85mg/mL、至少0.9mg/mL、至少0.95mg/mL、至少1mg/mL、至少1.05mg/mL、至少1.10mg/mL、至少1.15mg/mL、至少1.20mg/mL、至少1.25mg/mL、至少1.30mg/mL、至少1.35mg/mL、至少1.40mg/mL、至少1.45mg/mL、或至少1.50mg/mL的浓度包括在液体组合物中。在一些实施方式中，第二缓冲剂(例如Tris HCl)以0.5与0.6mg/mL之间、0.6与0.7mg/mL之间、0.7与0.8mg/mL之间、0.8与0.9mg/mL之间、0.9与1mg/mL之间、1与1.10mg/mL之间、1.10与1.20mg/mL之间、1.20与1.30mg/mL之间、1.30与1.40mg/mL之间、或1.40与1.50mg/mL之间的浓度包括在液体组合物中。
在特定实施方式中，第二缓冲剂(例如Tris HCl)以或以约1.25～1.40mg/mL的浓度包括在液体组合物中。在特定实施方式中，第二缓冲剂(例如Tris HCl)以或以约1.30～1.40mg/mL的浓度包括在液体组合物中。在特定实施方式中，第二缓冲剂(例如Tris HCl)以或不以以下的浓度或至少、至多、恰好以下或在以下任何两者之间(包括性或排他性)或约以下的浓度包括在液体组合物中：1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.30、1.31、1.32、1.33、1.34、或1.35、1.36、1.37、1.38、1.39或1.40mg/mL。在特定实施方式中，第二缓冲剂(例如Tris HCl)以或以约1.32mg/mL的浓度包括在液体组合物中。
在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物为包含Tris缓冲液的冻干组合物。在一些实施方式中，Tris缓冲液包含第一缓冲剂。在一些实施方式中，第一缓冲剂为缓血酸胺。在一些实施方式中，第一缓冲剂(例如缓血酸胺)以或不以至少以下、至多以下、以下之间(包括性或排他性)或恰好以下的复原后浓度包括在冻干组合物中：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49或0.5mg/mL。在一些实施方式中，第一缓冲剂(例如缓血酸胺)以至少0.01、至少0.05、至少0.1、至少0.15、至少0.2、至少0.25、至少0.3、至少0.35、至少0.4、至少0.45或至少0.5mg/mL的复原后浓度包括在冻干组合物中。在一些实施方式中，第一缓冲剂(例如缓血酸胺(Tris碱))以0.01与0.05mg/mL之间、0.05与0.1mg/mL之间、0.1与0.15mg/mL之间、0.15与0.2mg/mL之间、0.2与0.25mg/mL之间、0.25与0.3mg/mL之间、0.3与0.35mg/mL之间、0.35与0.4mg/mL之间、0.4与0.45mg/mL之间、或0.45与0.5mg/mL之间的复原后浓度包括在冻干组合物中。
在特定实施方式中，第一缓冲剂(例如缓血酸胺)以或以约0.01与0.15mg/mL的复原后浓度包括在冻干组合物中。在特定实施方式中，第一缓冲剂(例如缓血酸胺)以或以约0.01与0.10mg/mL的复原后浓度包括在冻干组合物中。在特定实施方式中，第一缓冲剂(例如缓血酸胺)以或以约0.05与0.15mg/mL的复原后浓度包括在冻干组合物中。在特定实施方式中，第一缓冲剂(例如缓血酸胺)以或不以以下的复原后浓度或至少、至多、恰好以下或在以下任何两者之间(包括性或排他性)或约以下的复原后浓度包括在冻干组合物中：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14或0.15mg/mL。在特定实施方式中，第一缓冲剂(例如缓血酸胺)以或以约0.09mg/mL的复原后浓度包括在冻干组合物中。
在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物为包含有包含第二缓冲剂的Tris缓冲液的冻干组合物。在一些实施方式中，第二缓冲剂包含Tris HCl。在一些实施方式中，第二缓冲剂(例如Tris HCl)以或不以至少以下、至多以下、以下之间(包括性或排他性)或恰好以下的复原后浓度包括在冻干组合物中：0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.7、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1mg/mL。在一些实施方式中，第二缓冲剂(例如Tris HCl)以至少0.1mg/mL、至少0.2mg/mL、至少0.3mg/mL、至少0.4mg/mL、至少0.5mg/mL、至少0.6mg/mL、至少0.7mg/mL、至少0.8mg/mL、至少0.9mg/mL、或至少1mg/mL的复原后浓度包括在冻干组合物中。在一些实施方式中，第二缓冲剂(例如Tris HCl)以0.1与0.2mg/mL之间、0.2与0.3mg/mL之间、0.3与0.4mg/mL之间、0.4与0.5mg/mL之间、0.5与0.6mg/mL之间、0.6与0.7mg/mL之间、0.7与0.8mg/mL之间、0.8与0.9mg/mL之间、或0.9与1mg/mL之间的复原后浓度包括在冻干组合物中。
在特定实施方式中，第二缓冲剂(例如Tris HCl)以或以约0.5与0.65mg/mL的复原后浓度包括在冻干组合物中。在特定实施方式中，第二缓冲剂(例如Tris HCl)以或以约0.5与0.6mg/mL的复原后浓度包括在冻干组合物中。在特定实施方式中，第二缓冲剂(例如TrisHCl)以约0.55与0.65mg/mL的复原后浓度包括在冻干组合物中。在特定实施方式中，第二缓冲剂(例如Tris HCl)以或不以以下的复原后浓度或至少、至多、恰好以下或在以下任何两者之间(包括性或排他性)或约以下的复原后浓度包括在冻干组合物中：0.5、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6、0.61、0.62、0.63、0.64或0.65mg/mL。在特定实施方式中，第二缓冲剂(例如Tris HCl)以或以约0.57mg/mL的复原后浓度包括在冻干组合物中。
在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物包含稳定剂。稳定剂可包含本文所揭示的任何一或多种稳定剂。在一些实施方式中，稳定剂也充当低温保护剂。在特定实施方式中，稳定剂包含蔗糖。在一些实施方式中，稳定剂(例如蔗糖)以或不以至少以下、至多以下、以下之间(包括性或排他性)或恰好以下的浓度包括在组合物中：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200ng/μg/mg/mL。
在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物为液体组合物，且稳定剂(例如蔗糖)以或不以至少以下、至多以下、以下之间(包括性或排他性)或恰好以下的浓度包括在液体组合物中：70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130mg/mL。在一些实施方式中，稳定剂(例如蔗糖)以至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少105、至少110、至少115、至少120、至少125或至少130mg/mL的浓度包括在液体组合物中。在一些实施方式中，稳定剂(例如蔗糖)以70与80mg/mL之间、80与90mg/mL之间、90与100mg/mL之间、100与110mg/mL之间、110与120mg/mL之间、或120与130mg/mL之间的浓度包括在液体组合物中。
在特定实施方式中，稳定剂(例如蔗糖)以或以约95～110mg/mL的浓度包括在液体组合物中。在特定实施方式中，稳定剂(例如蔗糖)以或以约95～105mg/mL的浓度包括在液体组合物中。在特定实施方式中，稳定剂(例如蔗糖)以或以约100～110mg/mL的浓度包括在液体组合物中。在特定实施方式中，稳定剂(例如蔗糖)以或不以以下的浓度或至少、至多、恰好以下、在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)或约以下的浓度包括在液体组合物中：95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或110mg/mL。在特定实施方式中，稳定剂(例如蔗糖)以或以约103mg/mL的浓度包括在液体组合物中。
在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物为冻干组合物，且稳定剂(例如蔗糖)以或不以至少以下、至多以下、以下之间(包括性或排他性)或恰好以下的复原后浓度包括在冻干组合物中：20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80mg/mL。在一些实施方式中，稳定剂(例如蔗糖)以至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75或至少80mg/mL的复原后浓度包括在冻干组合物中。在一些实施方式中，稳定剂(例如蔗糖)以20～30mg/mL之间、30～40mg/mL之间、40～50mg/mL之间、50～60mg/mL之间、60～70mg/mL之间、或70～80mg/mL之间的复原后浓度包括在冻干组合物中。
在特定实施方式中，稳定剂(例如蔗糖)以或以约35～50mg/mL的复原后浓度包括在冻干组合物中。在特定实施方式中，稳定剂(例如蔗糖)以或以约35～45mg/mL的复原后浓度包括在冻干组合物中。在特定实施方式中，稳定剂(例如蔗糖)以或以约40～50mg/mL的复原后浓度包括在冻干组合物中。在特定实施方式中，稳定剂(例如蔗糖)以或不以以下的复原后浓度或至少、至多、恰好以下、在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)或约以下的复原后浓度包括在冻干组合物中：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50mg/mL。在特定实施方式中，稳定剂(例如蔗糖)以或以约44mg/mL的复原后浓度包括在冻干组合物中。
在一些实施方式中，冻干组合物在适合载剂和/或稀释剂中复原。载剂和/或稀释剂可包含本文所揭示的任何一或多种载剂和/或稀释剂。在特定实施方式中，载剂和/或稀释剂包含盐稀释剂，诸如氯化钠(NaCl)(例如盐水，例如生理盐水(physiological/normalsaline))。氯化钠可包含用于注射的0.9％氯化钠。在一些实施方式中，冻干组合物在或不在至少以下、至多以下、以下之间(包括性或排他性)或恰好以下的盐水中复原：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.50、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.60、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.70、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1mL。在一些实施方式中，冻干组合物在至少0.1、至少0.2、至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7、至少0.8、至少0.9或至少1mL的氯化钠中复原。
在特定实施方式中，冻干组合物在或在约0.6～0.75mL的氯化钠/盐水中复原。在特定实施方式中，冻干组合物在或在约0.65～0.75mL的氯化钠/盐水中复原。在特定实施方式中，冻干组合物在或不在至少、至多、恰好以下、在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)或约以下的氯化钠/盐水中复原：0.6、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.7、0.71、0.72、0.73、0,74或0.75mL。
在一些实施方式中，盐稀释剂(例如NaCl)以或不以至少以下、至多以下、以下之间(包括性或排他性)或恰好以下的复原后浓度包括在冻干组合物中：每毫升0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5、35、35.5、36、36.5、37、37.5、38、38.5、39、39.5、40、40.5、41、41.5、42、42.5、43、43.5、44、44.5、45、45.5、46、46.5、47、47.5、48、48.5、49、49.5或50ng/μg/mg。在一些实施方式中，盐稀释剂(例如NaCl)以或不以至少以下、至多以下、以下之间(包括性或排他性)或恰好以下的复原后浓度包括在冻干组合物中：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5或20mg/mL。在一些实施方式中，盐稀释剂(例如NaCl)以至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少20mg/mL的复原后浓度包括在冻干组合物中。
在特定实施方式中，盐稀释剂(例如NaCl)以在5与15mg/mL之间或在约其间的复原后浓度包括在冻干组合物中。在一些实施方式中，盐稀释剂(例如NaCl)以在5与10mg/mL之间或在约其间的复原后浓度包括在冻干组合物中。在特定实施方式中，盐稀释剂(例如NaCl)以或不以以下的复原后浓度或至少、至多、恰好以下、在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)或约以下的复原后浓度包括在冻干组合物中：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mg/mL。在特定实施方式中，盐稀释剂(例如NaCl)以或以约9mg/mL的复原后浓度包括在冻干组合物中。
RSV RNA-LNP组合物的pH可呈或可不呈至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)的pH：6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5，或其中可导出的任何范围或值。在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物呈至少6.5、至少7.0、至少7.5、至少8.0或至少8.5的pH。在特定实施方式中，RSVRNA-LNP组合物呈6.0与7.5之间、6.5与7.5之间、7.0与8.0之间、7.5与8.5之间的pH。在特定实施方式中，RSV RNA-LNP组合物在7.0与8.0之间的pH。在特定实施方式中，RSV RNA-LNP组合物呈或不呈至少、至多、恰好以下、在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)或约以下的pH：7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。在特定实施方式中，RSV RNA-LNP组合物呈或呈约pH 7.4。在一些实施方式中，氢氧化钠缓冲液可用于缓冲液pH调节。
在特定实施方式中，RSV RNA-LNP组合物包含本文所揭示的编码RSV多肽的RSVRNA多核苷酸，该多核苷酸囊封于具有以下的脂质组成的LNP中：浓度为或为约0.8～0.95mg/mL的阳离子脂质、浓度为或为约0.05～0.15mg/mL的聚乙二醇化脂质、浓度为或为约0.1～0.25mg/mL的第一结构脂质、及浓度为或为约0.3～0.45mg/mL的第二结构脂质。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在RSV RNA-LNP组合物外。
在特定实施方式中，RSV RNA-LNP组合物包含本文所揭示的编码RSV多肽的RSVRNA多核苷酸，该多核苷酸囊封于具有以下的脂质组成的LNP中：浓度为或为约0.8～0.95mg/mL的ALC-0315、浓度为或为约0.05～0.15mg/mL的ALC-0159、浓度为或为约0.1～0.25mg/mL的DSPC、及浓度为或为约0.3～0.45mg/mL的胆固醇。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在RSV RNA-LNP组合物外。
在特定实施方式中，RSV RNA-LNP组合物为液体RSV RNA-LNP组合物，且液体RSVRNA-LNP组合物进一步包含含有以下的缓冲组合物：浓度为或为约0.15～0.3mg/mL的第一缓冲剂、浓度为或为约1.25～1.4mg/mL的第二缓冲剂、及浓度为或为约95～110mg/mL的稳定剂。在特定实施方式中，RSV RNA-LNP组合物为液体RSV RNA-LNP组合物，且液体RSV RNA-LNP组合物进一步包含含有以下的Tris缓冲组合物：浓度为或为约0.1～0.3mg/mL的缓血酸胺、浓度为或为约1.25～1.4mg/mL的Tris HCl、及浓度为或为约95～110mg/mL的蔗糖。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在RSV RNA-LNP组合物外。
因此，在特定实施方式中，液体RSVRNA-LNP组合物包含：阳离子脂质，其浓度为或为约0.8～0.95mg/mL；聚乙二醇化脂质，其浓度为或为约0.05～0.15mg/mL；第一结构脂质，其浓度为或为约0.1～0.25mg/mL；第二结构脂质，其浓度为或为约0.3～0.45mg/mL；且进一步包含：第一缓冲剂，其浓度为或为约0.1～0.3mg/mL；第二缓冲剂，其浓度为或为约1.25～1.4mg/mL；及稳定剂，其浓度为或为约95～110mg/mL。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在RSV RNA-LNP组合物外。
因此，在特定实施方式中，液体RSVRNA-LNP组合物包含：ALC-0315，其浓度为或为约0.8～0.95mg/mL；ALC-0159，其浓度为或为约0.05～0.15mg/mL；DSPC，其浓度为或为约0.1～0.25mg/mL；胆固醇，其浓度为或为约0.3～0.45mg/mL；且进一步包含Tris缓冲组合物，该Tris缓冲组合物包含：缓血酸胺，其浓度为或为约0.1～0.3mg/mL；Tris HCl，其浓度为或为约1.25～1.4mg/mL；及蔗糖，其浓度为或为约95～110mg/mL。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在RSV RNA-LNP组合物外。
在特定实施方式中，RSV RNA-LNP组合物为冻干RSV RNA-LNP组合物，且冻干RSVRNA-LNP组合物进一步包含(在复原之后)：第一缓冲剂，其浓度为或为约0.01～0.15mg/mL；第二缓冲剂，其浓度为或为约0.5～0.65mg/mL；稳定剂，其浓度为或为约35～50mg/mL；及盐稀释剂，其浓度为或为约5～15mg/mL。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在RSV RNA-LNP组合物外。
在特定实施方式中，RSV RNA-LNP组合物为冻干RSV RNA-LNP组合物，且冻干RSVRNA-LNP组合物进一步包含(在复原之后)Tris缓冲组合物，该Tris缓冲组合物包含：缓血酸胺，其浓度为或为约0.01～0.15mg/mL；Tris HCl，其浓度为或为约0.5～0.65mg/mL；蔗糖，其浓度为或为约35～50mg/mL；及氯化钠(NaCl)，其浓度为或为约5～15mg/mL。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在RSV RNA-LNP组合物外。
因此，在特定实施方式中，冻干RSVRNA-LNP组合物包含(在复原之后)：阳离子脂质，其浓度为或为约0.8～0.95mg/mL；聚乙二醇化脂质，其浓度为或为约0.05～0.15mg/mL；第一结构脂质，其浓度为或为约0.1～0.25mg/mL；第二结构脂质，其浓度为或为约0.3～0.45mg/mL；且进一步包含：第一缓冲剂，其浓度为或为约0.01～0.15mg/mL；第二缓冲剂，其浓度为或为约0.5～0.65mg/mL；稳定剂，其浓度为或为约35～50mg/mL；及盐稀释剂，其浓度为或为约5～15mg/mL。在特定实施方式中，冻干组合物在0.6～0.75mL的盐稀释剂中复原。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在RSV RNA-LNP组合物外。
因此，在一些实施方式中，冻干RSVRNA-LNP组合物包含(在复原之后)：ALC-0315，其浓度为或为约0.8～0.95mg/mL；ALC-0159，其浓度为或为约0.05～0.15mg/mL；DSPC，其浓度为或为约0.1～0.25mg/mL；胆固醇，其浓度为或为约0.3～0.45mg/mL；且进一步包含：缓血酸胺，其浓度为或为约0.01～0.15mg/mL；Tris HCl，其浓度为或为约0.5～0.65mg/mL；蔗糖，其浓度为或为约35～50mg/mL；及NaCl，其浓度为或为约5～15mg/mL。在特定实施方式中，冻干组合物在0.6～0.75mL的NaCl(盐水)中复原。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在RSV RNA-LNP组合物外。
以上冻干RSV RNA-LNP组合物中的浓度系在复原后测定。
在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物(冻干前)包含：阳离子脂质，其浓度为或为约1.0～3.0mg/mL；聚乙二醇化脂质，其浓度为或为约0.10～0.35mg/mL；第一结构脂质，其浓度为或为约0.4～0.55mg/mL；第二结构脂质，其浓度为或为约0.85～1.0mg/mL；且进一步包含：第一缓冲剂，其浓度为或为约0.1～0.3mg/mL；第二缓冲剂，其浓度为或为约1.25～1.40mg/mL；稳定剂，其浓度为或为约95～110mg/mL。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在RSV RNA-LNP组合物外。
因此，在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物(冻干前)包含：ALC-0315，其浓度为或为约1.0～3.0mg/mL；ALC-0159，其浓度为或为约0.10～0.35mg/mL；DSPC，其浓度为或为约0.4～0.55mg/mL；胆固醇，其浓度为或为约0.85～1.0mg/mL；且进一步包含：缓血酸胺，其浓度为或为约0.1～0.3mg/mL；Tris HCl，其浓度为或为约1.25～1.40mg/mL；蔗糖，其浓度为或为约95～110mg/m。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在RSV RNA-LNP组合物外。
RSV RNA-LNP组合物进一步包含囊封于LNP中的本文所述的RSV RNA。
在特定实施方式中，RSV RNA-LNP组合物为液体RSV RNA-LNP组合物，其包含浓度为至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)的本文所揭示的编码RSV多肽的RSV RNA多核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90mg/mL，优选为或为约0.01～0.09mg/mL，所述多核苷酸囊封于具有以下的脂质组成的LNP中：阳离子脂质，其浓度为或为约0.8～0.95mg/mL；聚乙二醇化脂质，其浓度为或为约0.05～0.15mg/mL；第一结构脂质，其浓度为或为约0.1～0.25mg/mL；及第二结构脂质，其浓度为或为约0.3～0.45mg/mL；且其进一步包含缓冲组合物，该缓冲组合物包含：第一缓冲剂，其浓度为或为约0.15～0.3mg/mL；第二缓冲剂，其浓度为或为约1.25～1.4mg/mL；及稳定剂，其浓度为或为约95～110mg/mL。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在RSV RNA-LNP组合物外。
在特定实施方式中，液体RSV RNA-LNP组合物包含浓度为至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)的本文所揭示的编码RSV多肽的RSV RNA多核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90mg/mL，优选为或为约0.01～0.09mg/mL，且更优选为或为约0.06mg/mL，该多核苷酸囊封于具有以下的脂质组成的LNP中：ALC-0315，其浓度为或为约0.8～0.95mg/mL；ALC-0159，其浓度为或为约0.05～0.15mg/mL；DSPC，其浓度为或为约0.1～0.25mg/mL；及胆固醇，其浓度为或为约0.3～0.45mg/mL；且进一步包括Tris缓冲组合物，该Tris缓冲组合物包含：缓血酸胺，其浓度为或为约0.1～0.3mg/mL；Tris HCl，其浓度为或为约1.25～1.4mg/mL；及蔗糖，其浓度为或为约95～110mg/mL。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在RSV RNA-LNP组合物外。
在特定实施方式中，RSV RNA-LNP组合物为冻干RSV RNA-LNP组合物，其包含浓度为至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)的本文所揭示的编码RSV多肽的RSV RNA多核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90mg/mL，优选为或为约0.01～0.09mg/mL，该多核苷酸囊封于具有以下的脂质组成的LNP中：阳离子脂质，其浓度为或为约0.8～0.95mg/mL；聚乙二醇化脂质，其浓度为或为约0.05～0.15mg/mL；第一结构脂质，其浓度为或为约0.1～0.25mg/mL；及第二结构脂质，其浓度为或为约0.3～0.45mg/mL；且进一步包含：第一缓冲剂，其浓度为或为约0.01～0.15mg/mL；第二缓冲剂，其浓度为或为约0.5～0.65mg/mL；稳定剂，其浓度为或为约35～50mg/mL；及盐稀释剂，其浓度为或为约5～15mg/mL。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在RSV RNA-LNP组合物外。在特定实施方式中，冻干组合物在0.6～0.75mL的盐稀释剂中复原。冻干RSV RNA-LNP组合物中的浓度系在复原后测定。
在特定实施方式中，冻干RSV RNA-LNP组合物包含浓度为至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)的本文所揭示的编码RSV多肽的RSV RNA多核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90mg/mL，优选为或为约0.01～0.09mg/mL，且更优选为或为约0.06mg/mL，该多核苷酸囊封于具有以下的脂质组成的LNP中：ALC-0315，其浓度为或为约0.8～0.95mg/mL；ALC-0159，其浓度为或为约0.05～0.15mg/mL；DSPC，其浓度为或为约0.1～0.25mg/mL；及胆固醇，其浓度为或为约0.3～0.45mg/mL；且进一步包含：缓血酸胺，其浓度为或为约0.01～0.15mg/mL；Tris HCl，其浓度为或为约0.5～0.65mg/mL；蔗糖，其浓度为或为约35～50mg/mL；及NaCl，其浓度为或为约5～15mg/mL。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在RSV RNA-LNP组合物外。在特定实施方式中，冻干组合物在0.6～0.75mL的NaCl稀释剂(盐水)中复原。冻干RSV RNA-LNP组合物中的浓度系在复原后测定。
在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物(冻干前)包含浓度为至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)的本文所揭示的编码RSV多肽的RSV RNA多核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90mg/mL，优选为或为约0.01～0.09mg/mL，该多核苷酸囊封于具有以下的脂质组成的LNP中：阳离子脂质，其浓度为或为约1.0～3.0mg/mL；聚乙二醇化脂质，其浓度为或为约0.10～0.35mg/mL；第一结构脂质，其浓度为或为约0.4～0.55mg/mL；第二结构脂质，其浓度为或为约0.85～1.0mg/mL；且进一步包含：第一缓冲剂，其浓度为或为约0.1～0.3mg/mL；第二缓冲剂，其浓度为或为约1.25～1.40mg/mL；稳定剂，其浓度为或为约95～110mg/mL。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在RSVRNA-LNP组合物外。
因此，在一些实施方式中，RSV RNA-LNP组合物(冻干前)包含浓度为至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)的本文所揭示的编码RSV多肽的RSV RNA多核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90mg/mL，优选为或为约0.01～0.09mg/mL，且更优选地0.15mg/mL，该多核苷酸囊封于具有包含以下的脂质组成的LNP中：ALC-0315，其浓度为或为约1.0～3.0mg/mL；ALC-0159，其浓度为或为约0.10～0.35mg/mL；DSPC，其浓度为或为约0.4～0.55mg/mL；胆固醇，其浓度为或为约0.85～1.0mg/mL；且进一步包含：缓血酸胺，其浓度为或为约0.1～0.3mg/mL；Tris HCl，其浓度为或为约1.25～1.40mg/mL；蔗糖，其浓度为或为约95～110mg/mL。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在RSV RNA-LNP组合物外。
在一些实施方式中，液体RNA-LNP免疫原性组合物包含浓度为至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)的本文所揭示的编码RSV多肽的RNA分子/多核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90mg/mL，优选为或为约0.01～0.09mg/mL，该多核苷酸囊封于LNP中，且进一步包含或包含约5～15mM Tris缓冲液及pH呈或呈约7.0～8.0的约200～400mM蔗糖。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在液体RNA-LNP免疫原性组合物外。
在一些实施方式中，液体RNA-LNP免疫原性组合物包含浓度为至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)的本文所揭示的编码RSV多肽的RNA分子/多核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90mg/mL，优选为或为约0.01至0.09mg/mL，且更优选为或为约0.06mg/mL，所述RNA分子/多核苷酸囊封于LNP中，且进一步包含或包含约10mMTris缓冲液及pH呈或呈约7.4的300mM蔗糖。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在液体RNA-LNP免疫原性组合物外。
在一些实施方式中，RNA-LNP免疫原性组合物(冻干前)包含浓度为至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)的本文所揭示的编码RSV多肽的RNA分子/多核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90mg/mL，优选为或为约0.01～0.09mg/mL，所述RNA分子/多核苷酸囊封于LNP中，且进一步包含或包含约5～15mM Tris缓冲液及pH呈或呈约7.0～8.0的200～400mM蔗糖，且用0.9％氯化钠稀释剂复原。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在RNA-LNP免疫原性组合物外。
在一些实施方式中，RNA-LNP免疫原性组合物(冻干前)包含浓度为至少、至多、恰好以下或在以下之间(包括性或排他性)的本文所揭示的编码RSV多肽的RNA分子/多核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90mg/mL，优选为或为约0.01～0.09mg/mL，且更优选地0.15mg/mL，所述RNA分子/多核苷酸囊封于LNP中，且进一步包含或包含约10mM Tris缓冲液及pH呈或呈约7.4的300mM蔗糖，且用0.9％氯化钠稀释剂复原。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在RNA-LNP免疫原性组合物外。
【B.疫苗】
在一些实施方式中，本文所述的医药组合物为用于诱导免疫反应的免疫原性组合物。举例而言，在一些实施方式中，免疫原性组合物为疫苗。在一些实施方式中，本文所述的组合物包括至少一种本文所述的经分离核酸或多肽分子。在特定实施方式中，免疫原性组合物包含核酸，且免疫原性组合物为核酸疫苗。在一些实施方式中，免疫原性组合物包含RNA(例如mRNA、saRNA)，且疫苗为RNA疫苗。在其他实施方式中，免疫原性组合物包含DNA，且疫苗为DNA疫苗。在又其他实施方式中，免疫原性组合物包含多肽，且疫苗为多肽疫苗。可用核酸和/或肽或多肽组合物治疗的病状和/或疾病包括但不限于由感染引起和/或影响的那些病状和/或疾病、癌症、罕见病以及由蛋白质或核酸的过度产生、不足产生和/或不当产生引起的其他疾病或病状。
在一些实施方式中，组合物实质上不含一或多种杂质或污染物，且例如包括以下纯度的核酸或多肽分子：至少、至多、恰好等于90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％纯度或其中之间(包括性或排他性)的纯度；至少98％纯度；或至少99％纯度。
本发明包括用于预防、治疗和/或改善个体的感染、疾病或病状的方法，其包括向个体施用有效量的包括至少一个编码本文所述的多肽或组合物的开放阅读框的RNA分子。因此，本发明涵盖用于主动及被动免疫接种实施方式的疫苗。提议适用作疫苗的免疫原性组合物可由编码一或多种多肽(诸如RSV preF多肽)的RNA分子制备。在某些实施方式中，免疫原性组合物经冻干以便更容易调配至所需媒剂中。
含有核酸和/或肽或多肽作为活性成分的疫苗的制备一般为此项技术中充分了解的，如由美国专利4,608，251；4，601,903；4,599，231；4,599,230；4,596,792；及4,578,770所例示，以上所有者均以引用的方式并入本文中。通常，此类疫苗系以呈液体溶液或悬浮液的可注射剂形式制备；也可制备适合于在注射之前在液体中形成溶液或在液体中形成悬浮液的固体形式。制剂也可乳化。活性免疫原性成分通常与医药学上可接受的且与活性成分兼容的赋形剂混合。适合的赋形剂例如为水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。另外，必要时，疫苗可含有大量辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂或增强疫苗的有效性的佐剂。在特定实施方式中，疫苗用物质组合调配，如美国专利6,793,923及6,733，754中所描述，其以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，前述要素中的一或多者可排除在疫苗外。
疫苗可习知地由例如皮下或肌肉内注射以非经肠方式施用。适合于其他施用模式的额外调配物包括栓剂及在一些情况下口服调配物。对于栓剂而言，传统粘合剂及载剂可包括例如聚亚烷二醇或三酸甘油酯；此类栓剂可由含有在或约在0.5％～约10％的范围内的活性成分的混合物形成。在一些实施方式中，栓剂可由含有在或约在1％～约2％的范围内的活性成分的混合物形成。口服调配物包括常用赋形剂，诸如医药级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁及其类似物。在一些实施方式中，前述赋形剂中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在口服调配物外。这些组合物采用溶液、悬浮液、锭剂、丸剂、胶囊、持续释放调配物或散剂的形式，且含有或含有约10％～约95％的活性成分。
可将编码多肽的核酸构建体以及多肽调配成呈中性或盐形式的疫苗。“医药学上可接受的盐”包括酸加成盐及碱加成盐两者。“医药学上可接受的酸加成盐”是指保持游离碱的生物有效性及特性的那些盐，其在生物学或其他方面无不良反应，且由以下形成：无机酸，诸如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及其类似物；及有机酸，诸如但不限于乙酸、2，2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环己胺磺酸、十二烷基硫酸、乙烷-1，2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羟基乙烷磺酸、甲酸、反丁烯二酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡萄糖庚酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、顺丁烯二酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲烷磺酸、粘液酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟碱酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。在一些实施方式中，可排除前述无机酸中的1、2、3、4、5者或更多者。“医药学上可接受的碱加成盐”是指保留游离酸的生物有效性及特性，合乎生物学或其他方面需要的盐。这些盐由无机碱或有机碱与游离酸加成制备。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。在一些实施方式中，可排除前述无机碱中的1、2、3、4、5者或更多者。较佳无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐及镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下各者的盐：伯胺、仲胺及叔胺、经取代的胺(包括天然存在的经取代胺)、环胺及碱性离子交换树脂，诸如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇(deanol)、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、离氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡碱、普鲁卡因(procaine)、海卓胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、苄苯乙胺、苄星青霉素(benzathine)、乙二胺、葡萄糖胺、甲基还原葡萄糖胺、可可豆碱、三乙醇胺、缓血酸胺、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、多元胺树脂等。尤其较佳有机碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱及咖啡碱。在一些实施方式中，可排除前述有机碱中的1、2、3、4、5者或更多者。
编码多肽的核酸构建体以及多肽或其医药学上可接受的盐可含有一或多个不对称中心，且因此可产生镜像异构物、非镜像异构物以及就绝对立体化学而言可对于氨基酸界定为(R)-或(S)-或界定为(D)-或(L)-的其他立体异构形式。本发明意谓包括所有所述可能的异构物，以及其外消旋及光学纯形式。具光学活性的(+)及(-)、(R)-及(S)-、或(D)-及(L)-异构物可使用对掌性合成子或对掌性试剂来制备，或使用习知技术(例如层析及分步结晶)来解析。用于制备/分离个别镜像异构物的习知技术包括自适合的光学纯前体进行对掌性合成或使用例如对掌性高压液相层析(HPLC)对外消旋体(或盐或衍生物的外消旋体)进行解析。当本文所述的化合物含有烯系双键或其他几何不对称中心时且除非另外说明，否则旨在化合物包括E与Z型几何异构物。同样，也旨在包括所有互变异构形式。“立体异构物”是指由相同键所键结的相同原子构成但具有不可互换的不同三维结构的化合物。本发明涵盖各种立体异构物及其混合物且包括“镜像异构物”，镜像异构物是指分子彼此间为不可重叠的镜像的两种立体异构物。“互变异构物”是指质子自分子的一个原子转移至同一分子的另一原子。本发明揭示任何所述化合物的互变异构物。
以游离碱或酸形式存在的本文所述的化合物可由用适当无机或有机碱或酸，由本领域技术人员已知的方法来转化成其医药学上可接受的盐。化合物的盐可由标准技术转化成其游离碱或酸形式。
本领域技术人员应了解，在本文所述的方法中，中间化合物的官能基可能需要由适合的保护基保护。此类官能基包括羟基、氨基、巯基及羧酸。羟基的适合的保护基包括三烷基硅烷基或二芳基烷基硅烷基(例如叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基或三甲基硅烷基)、四氢哌喃基、苯甲基及类似者。氨基、甲脒基及胍基的适合的保护基包括叔丁氧羰基、苯甲氧羰基及类似者。巯基的适合保护基包括-C(O)-R"(其中R"为烷基、芳基或芳烷基)、对甲氧基苯甲基、三苯甲基及类似者。适用于羧酸的保护基包括烷基、芳基或芳基烷基酯。如本领域技术人员将了解，保护基也可为聚合物树脂，如王树脂(Wang resin)、林克树脂(Rink resin)或2-氯三苯甲基氯化物树脂。在一些实施方式中，可排除前述保护基中的1、2、3、4、5者或更多者。可根据本领域技术人员已知(参见例如Green,T.W.及P.G.M.Wutz,Protective Groups in Organic Synthesis(1999),第3版,Wiley)及本文所述的标准技术来添加或移除保护基。
本领域技术人员也应了解，虽然本发明化合物的此类受保护衍生物可能不具有同样的药理学活性，但其可施用哺乳动物且此后在体内代谢，从而形成具有药理学活性的本发明化合物。此类衍生物可因此描述为“前药”。本发明化合物的所有前药包括在本发明的范畴内。
通常，疫苗以与剂型兼容的方式，且以诸如将为治疗有效及免疫原性的量施用。待施用的数量取决于待治疗的个体，包括个体免疫系统合成抗体的能力及所需防护等级。需要施用的活性成分的精确量视从业者的判断而定。然而，适合的剂量范围为每次疫苗接种大致数百微克活性成分。适合于初次施用及加强注射的方案也为可变的，但典型的是进行初次施用，接着进行后续接种和/或其他施用。
施用方式可广泛变化。可应用用于施用疫苗的习知方法中的任一种。认为这些方法包括在生理学上可接受的固体基质内口服施用或在生理学上可接受的分散液中由注射或其类似方式而非经肠施用。疫苗剂量将视施用途径而定且将根据个体的体型及健康状况而变化。
在某些实施方式中，将需要施用一次疫苗。在一些实施方式中，将需要多次施用疫苗，例如施用2、3、4、5、6或更多次。疫苗接种可间隔1、2、3、4、5、6、7、8至5、6、7、8、9、10、11或12周，包括其间所有范围。在一些实施方式中，疫苗接种可间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，包括其间所有范围。可能需要以1～5年的间隔周期性加强来维持抗体的保护性水平。
【i.载剂】
医药学上可接受的载剂可包括组合物的液体或非液体基体。若组合物以液体形式提供，则载剂可为水，诸如无热原水；等张盐水或缓冲(水)溶液，例如磷酸盐、柠檬酸盐缓冲溶液。可使用水或含有钠盐、钙盐和/或钾盐的缓冲液，诸如水性缓冲液。钠盐、钙盐和/或钾盐可以其卤化物(例如氯化物、碘化物或溴化物)的形式存在，以其氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或硫酸盐等形式存在。钠盐的实施例包括但不限于NaCl、NaI、NaBr、Na2CO3、NaHCO3、Na2SO4、Na2HPO4、Na2HPO4·2H2O，钾盐的实施例包括但不限于KCl、KI、KBr、K2CO3、KHCO3、K2SO4、KH2PO4，且钙盐的实施例包括但不限于CaCl2、CaI2、CaBr2、CaCO3、CaSO4、Ca(OH)2。其他载剂的实施例可包括糖，诸如乳糖、葡萄糖、海藻糖及蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉或马铃薯淀粉；右旋糖；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、乙酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；动物脂；固体滑动剂，诸如硬脂酸、硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，诸如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油及来自可可的油；多元醇，诸如聚丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇及聚乙二醇；褐藻酸。其他载剂的实施例可包括胶体氧化硅、硬脂酸镁、纤维素及月桂基硫酸钠。额外适合的医药载剂及稀释剂以及其使用的医药需求描述于Remington′sPharmaceutical Sciences中。在一些实施方式中，可排除前述载剂中的1、2、3、4、5者或更多者。
【ii.佐剂】
适合佐剂包括所有可接受的免疫刺激化合物，诸如细胞因子、毒素或合成组合物。多种佐剂可用于增强抗体反应。佐剂包括但不限于水包油乳液、油包水乳液、矿物盐、多核苷酸及天然物质。可使用的特定佐剂包括弗氏佐剂(Freund′s adjuvant)、油(诸如ISA51)、IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL12、α-干扰素、PTNGg、GM-CSF、GMCSP、BCG、LT-a、铝盐(诸如氢氧化铝或其他铝化合物)、MDP化合物(诸如thur-MDP及nor-MDP)、CGP(MTP-PE)、脂质A、单磷酰基脂质A(MPL)、脂肽(例如Pam3Cys)。RIBI，其含有于2％角鲨烯/吐温80乳液中的自细菌提取的三种组分，即MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)及细胞壁骨架(CWS)。甚至可使用MHC抗原。
达成针对疫苗的佐剂效应的各种方法分别包括：使用诸如氢氧化铝或磷酸铝(明矾)的药剂，其常以于磷酸盐缓冲盐水中的约0.05％～约0.1％溶液的形式使用；与以约0.25％溶液形式使用的合成糖聚合物混合；由在约70℃～约101℃之间的温度下热处理30秒～2分钟时间而使疫苗中的蛋白质聚集。也可采用以下步骤来产生佐剂效应：由用针对白蛋白的经胃蛋白酶处理的(Fab)抗体再活化来发生聚集；与细菌细胞(例如微小隐孢子虫(C.parvum))、内毒素或革兰氏阴性细菌的脂多糖组分混合；在生理学上可接受的油媒剂(诸如二缩甘露糖醇单油酸酯(AracelA))中乳化；或使用用作阻断替代物的全氟化碳的20％溶液乳化。
在一些实施方式中，可排除前述佐剂中的1、2、3、4、5者或更多者。
除佐剂的外，可能需要共同施用生物反应调节剂(BRM)以增强免疫反应。BRM已显示上调T细胞免疫或下调抑制细胞活性。此类BRM包括但不限于西咪替丁(Cimetidine)(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline,PA)；或低剂量环磷酰胺(CYP；300mg/m2)(Johnson/Mead,NJ)及细胞因子，诸如γ-干扰素、IL-2、或IL-12、或编码免疫辅助功能中涉及的蛋白质的基因，诸如B-7。
【C.组合疗法】
本发明的组合物及相关方法，特别而言编码RSV preF多肽的RNA分子的施用，也可与一或多种其他治疗剂的施用组合使用。这些包括但不限于传统疗法的施用，所述传统疗法例如抗病毒疗法，诸如阿昔洛韦(acyclovir)、发昔洛韦(valacyclovir)及泛昔洛韦(famciclovir)，或抗病毒剂的各种组合。也包括施用一或多种用以治疗RSV感染的一或多个症状的疗法，包括但不限于类固醇(包括皮质类固醇)、抗炎剂(包括乙酰胺苯酚或布洛芬(ibuprofen))、止痛剂、缓解瘙痒的乳膏或洗剂、冷敷法或其各种组合。在一些实施方式中，可排除前述治疗剂中的1、2、3、4、5者或更多者。
此类组合疗法包括本发明的组合物及一或多种额外活性剂的单一医药剂型的施用、以及以其自身分开的医药剂型形式的本发明的组合物及各活性剂的施用。举例而言，本发明的组合物及其他活性剂可以单一剂量组合物(诸如注射或锭剂或胶囊)形式一起向患者施用，或各药剂以分开的口服剂量调配物形式施用。当使用分开的剂量调配物时，本发明的化合物及一或多种额外活性剂可在基本上相同的时间(例如并行)或在分开的错开时间(例如依序)施用；组合疗法应理解为包括所有这些方案。
在一个实施方式中，经考虑，疫苗和/或疗法与抗病毒治疗结合使用。或者，疫苗和/或疗法可以在数分钟至数周的范围内的间隔在用另一药剂处理之前或之后。在分开地施用其他药剂和/或疫苗的实施方式中，通常将确保在每次递送之间有意义的时段没有到期，以使得药剂及免疫原性组合物将仍能够对个体发挥有利的组合作用。在此类实施方式中，经考虑，可彼此间隔或间隔约12～24h或彼此间隔或间隔约6～12h(例如间隔至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时)施用两种模态。在一些情况中，可能需要显著地延长施用时段，其中在各别施用之间流逝若干天(2、3、4、5、6、7或更长)至若干周(1、2、3、4、5、6、7、8周或更长)。
可采用各种组合，例如抗病毒疗法“A”及作为免疫疗法方案“B”的一部分给与的免疫原性多肽：
本发明的免疫原性组合物向患者/个体的施用将遵循用于施用此类化合物的一般方案，考虑RSV RNA疫苗组合物或本文所述的其他组合物的毒性(若存在)。预期治疗周期将视需要重复进行。也考虑，不同标准疗法(诸如保湿)可与所描述的疗法组合应用。
【D.施用】
本文所述的组合物的施用可经由用于起类似功用的药剂的任一可接受施用模式进行。在一些实施方式中，本文所述的医药组合物可经静脉内、鼻内、皮下、皮内或肌肉内施用。在特定实施方式中，RSV RNA分子和/或RNA-LNP组合物经肌肉内施用。在某些实施方式中，医药组合物经调配用于局部施用或全身施用。全身施用可包括经肠施用(其涉及经由胃肠道吸收)或非经肠施用。如本文所用，“非经肠施用”是指以除经由胃肠道以外的任何方式施用，诸如由静脉内注射。在一个实施方式中，医药组合物经调配用于肌肉内施用。在另一实施方式中，医药组合物经调配用于全身施用，例如用于静脉内施用。在一些实施方式中，可排除前述施用途径中的1、2、3者或更多者。
医药组合物可调配成呈固体、半固体、液体、冻干、冷冻和/或气体形式的制剂，诸如锭剂、胶囊、散剂、颗粒、软膏、溶液、悬浮液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球体及气雾剂。在一些实施方式中，可排除前述制剂中的1、2、3者或更多者。施用此类医药组合物的典型途径包括但不限于口服、局部、经皮、吸入、非经肠、舌下、经颊、经直肠、经阴道及鼻内。如本文所使用的术语非经肠包括皮下注射、静脉内、肌肉内、皮内、鼻内、胸骨内注射或输注技术。本文所述的医药组合物经调配以便允许在向患者施用组合物时其中所含的活性成分为生物可用的。将向个体或患者施用的组合物呈一或多个剂量单位的形式，其中例如锭剂可为单一剂量单位，且呈气雾剂形式的化合物的容器可容纳多个剂量单位。待施用的组合物将在任何情况下含有治疗和/或预防有效量的在本发明的范畴内的化合物或其医药学上可接受的盐，以根据本文所述的教导治疗所关注的疾病或病状。
在本发明的范畴内的医药组合物可呈固体或液体的形式，且可经冷冻或冻干。在一个实施方式中，一或多种载剂为微粒，以使得组合物例如呈锭剂或散剂形式。一或多种载剂可为液体，使得组合物为例如口服糖浆、可注射液体或适用于例如吸入施用的气雾剂。在一些实施方式中，当旨在用于口服施用时，医药组合物呈固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮液及凝胶形式包括在本文视为固体或液体的形式内。
作为用于口服施用的固体组合物，医药组合物可调配成散剂、颗粒、压缩锭剂、丸剂、胶囊、口嚼锭、粉片或其类似形式。此类固体组合物将通常含有一或多种惰性稀释剂或可食载剂。另外，可存在或排除以下中的一或多者：粘合剂，诸如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉、乳糖或糊精；崩解剂，诸如褐藻酸、褐藻酸钠、玉米淀粉及其类似物；润滑剂，诸如硬脂酸镁或滑动剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；调味剂，诸如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂；及着色剂。当医药组合物呈胶囊(例如明胶胶囊)形式时，除以上类型的物质的外，其可含有诸如聚乙二醇或油的液体载剂。在一些实施方式中，前述要素中的1、2、3者或更多者可排除在固体组合物外。
医药组合物可呈液体形式，例如酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。举两个例子，液体可用于口服施用或用于由注射递送。在一些实施方式中，当旨在用于口服施用时，除本发明化合物以外，组合物也含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂及增香剂中的一或多者。在旨在由注射施用的组合物中，可包括或排除表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂及等张剂中的一或多者。
液体医药组合物，无论其为溶液、悬浮液或其他类似形式，均可包括或排除以下佐剂中的一或多者：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液(例如生理盐水)、林格氏溶液、等张氯化钠、不挥发性油(诸如可充当溶剂或悬浮介质的合成单酸甘油酯或二酸甘油酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；及张力调节剂，诸如氯化钠或右旋糖；充当低温保护剂的药剂，诸如蔗糖或海藻糖。非经肠制剂可封装于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。在一个实施方式中，生理盐水为佐剂。在一个实施方式中，可注射医药组合物为无菌的。旨在用于非经肠或口服施用的液体医药组合物应含有一定数量的化合物，使得将获得适合剂量。
医药组合物可包括各种材料，所述材料调节固体或液体剂量单位的物理形式。举例而言，组合物可包括围绕活性成分形成包覆壳层的材料。形成包覆壳层的材料通常为惰性的，且可为例如糖、虫胶或其他肠溶包衣剂。
医药组合物可包括可以气雾剂形式施用的剂量单位。术语气雾剂表示介于胶态性质的那些系统至由加压封装组成的系统的范围内的多种系统。递送可由液化或压缩气体或由分配活性成分的适合泵系统。化合物的气雾剂可以单相、双相或三相系统递送以便递送一或多种活性成分。气雾剂的递送包括必需容器、活化剂、阀门、次容器等，其在一起可形成试剂盒。本领域技术人员无需过度实验即可确定较佳气雾剂。
医药组合物可由医药技术中熟知的方法制备。举例而言，可由将核酸或多肽与无菌蒸馏水或其他载剂组合以便形成溶液来制备旨在由注射施用的医药组合物。可添加表面活性剂以促进形成均匀溶液或悬浮液。表面活性剂为与同本文中的教导一致的化合物非共价相互作用以便促进该化合物溶解或均匀悬浮于水性递送系统中的化合物。
根据本发明的医药组合物或其医药学上可接受的盐一般以“治疗有效量”或“预防有效量”且以“医药学上可接受的制剂”施用。术语“医药学上可接受”是指不与医药组合物的活性组分的作用相互作用的物质的非毒性。术语“治疗有效量”及“预防有效量”是指单独或与其他剂量一起达成所需反应或所需作用的量。在治疗特定疾病的情况下，在一个实施方式中，所需反应涉及抑制该疾病的病程。此包含减缓疾病进展，且尤其中断和/或逆转疾病进展。治疗疾病的所需反应也可为延迟该疾病或该病状的发作和/或预防该疾病或该病状的发作。
本发明范畴内的组合物以治疗和/或预防有效量施用，该治疗和/或预防有效量将视各种因素变化，包括：所采用的特定治疗剂和/或预防剂的活性；治疗剂和/或预防剂的代谢稳定性及作用时长；患者的个体参数，包括患者的年龄、体重、一般健康状况、性别及饮食；施用的模式、时间和/或持续时间；分泌速率；药物组合；特定病症或病状的严重程度；及个体正进行的疗法。在一些实施方式中，所述因素中的1、2、3、4、5者或更多者可排除在确定治疗和/或预防有效量外。因此，本文所述的组合物的施用剂量可视各种此类参数而定。在患者中的反应在初始剂量下不充分的情况中，可使用较高剂量(或由另一更局部的施用途径来达成的有效较高剂量)。在一些实施方式中，组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)可以足以递送以下量的剂量水平施用：每天每公斤个体体重0.0001ng/μg/mg～100ng/μg/mg、0.001ng/μg/mg～0.05ng/μg/mg、0.005ng/μg/mg～0.05ng/μg/mg、0.001ng/μg/mg～0.005ng/μg/mg、0.05ng/μg/mg～0.5ng/μg/mg、0.01ng/μg/mg～50ng/μg/mg、0.1ng/μg/mg～40ng/μg/mg、0.5ng/μg/mg～30ng/μg/mg、0.01ng/μg/mg～10ng/μg/mg、0.1ng/μg/mg～10ng/μg/mg、或1ng/μg/mg～25ng/μg/mg，一天一或多次、每周、每月等施用，以获得所需治疗性、诊断性、预防性和/或成像作用(参见例如国际公开第WO2013/078199号中所描述的单位剂量范围，该文献以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方式中，组合物(例如RSVRNA-LNP组合物)可以或可不以足以递送至少、至多、恰好以下或在以下任何两者之间(包括性或排他性)的量的剂量水平施用：每天每公斤个体体重0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100ng/μg/mg，一天一或多次、每周、每月等施用，以获得所需治疗性、诊断性、预防性和/或成像作用。
在一些实施方式中，组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)可以或可不以至少、至多、恰好以下总剂量或在以下任何两者之间(包括性或排他性)的总剂量施用或以足以递送至少、至多、恰好以下总剂量或在以下任何两者之间的总剂量的剂量水平施用：每天0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100ng/μg/mg，一天一或多次、每周、每月等施用，以获得所需治疗性、诊断性、预防性和/或成像作用。
在特定实施方式中，组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)可以或可不以至少、至多、恰好以下总剂量或在以下其中任何两者之间(包括性或排他性)的总剂量施用或以足以递送至少、至多、恰好以下总剂量或在以下其中任何两者之间的总剂量的剂量水平施用：0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100mg/mL的囊封于LNP中的RSV RNA。
在例示性实施方式中，组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)可以或可不以至少、至多、恰好以下剂量水平或在以下其中任何两者之间(包括性或排他性)的剂量水平施用：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90mg/mL的囊封于LNP中的RSV RNA。在例示性实施方式中，组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)可以或可不以至少、至多、恰好以下剂量水平或在以下其中任何两者之间(包括性或排他性)的剂量水平施用：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90mg的囊封于LNP中的RSV RNA。
在特定实施方式中，组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)可以或可不以至少、至多、恰好以下总剂量或在以下其中任何两者之间(包括性或排他性)的总剂量施用或以足以递送至少、至多、恰好以下总剂量或在以下其中任何两者之间(包括性或排他性)的总剂量的剂量水平施用：0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100μg/mL的囊封于LNP中的RSV RNA。
在例示性实施方式中，组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)可以或可不以至少、至多、恰好以下剂量水平或在以下其中任何两者之间(包括性或排他性)的剂量水平施用：1、15、30、45、60、75、90、100或更高微克/毫升的囊封于LNP中的RSV RNA。在例示性实施方式中，组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)可以或可不以至少、至多、恰好以下剂量水平或在以下其中任何两者之间(包括性或排他性)的剂量水平施用：1、15、30、45、60、75、90、100或更多微克的囊封于LNP中的RSV RNA。
所需剂量可一天多次(例如一天1、2、3、4、5或更多次)、每隔一天、每三天、每周、每两周、每三周、每四周、每2个月、每三个月、每6个月或每年等递送。在某些实施方式中，所需剂量可使用单次剂量施用进行递送。在某些实施方式中，所需剂量可使用多次施用(例如两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)进行递送。当采用多次施用时，可使用分次施用方案。组合物的初次施用与组合物之后续施用之间的施用时间可为但不限于1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或超过99年。
在一些实施方式中，组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)可以单次剂量施用。在一些实施方式中，组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)可施用两次(例如第0天及在或在约第7天、第0天及在或在约第14天、第0天及在或在约第21天、第0天及在或在约第28天、第0天及在或在约第60天、第0天及在或在约第90天、第0天及在或在约第120天、第0天及在或在约第150天、第0天及在或在约第180天、第0天及在或在约1个月后、第0天及在或在约2个月后、第0天及在或在约3个月后、第0天及在或在约6个月后、第0天及在或在约9个月后、第0天及在或在约12个月后、第0天及在或在约18个月后、第0天及在或在约2年后、第0天及在或在约5年后、或第0天及在或在约10年后)，其中每次施用至少、至多、恰好以下总剂量或在以下其中任何两者之间(包括性或排他性)的总剂量或足以递送至少、至多、恰好以下总剂量或在以下其中任何两者之间(包括性或排他性)的总剂量的剂量水平：0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100ng/μg/mg的囊封于LNP中的RSV RNA。本发明涵盖较高及较低的施用剂量及频率。举例而言，组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)可施用三次或四次。
可能需要以1～5年的间隔周期性加强来维持抗体的保护性水平。如本文所用，术语“加强(booster)”是指组合物(例如RSVRNA-LNP组合物)的额外施用。加强可在组合物的早期施用之后给与。
在一些实施方式中，组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)以或不以至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的单次剂量向个体施用：0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100ng/μg/mg的囊封于LNP中的RSV RNA。在一些实施方式中，组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)以或不以至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的单次剂量向个体施用：1μg、15μg、30μg、45μg、60μg、75μg、90μg、100μg或更高剂量的囊封于LNP中的RSV RNA。
在一些实施方式中，组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)以或不以至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的两次剂量向个体施用：0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100ng/μg/mg的囊封于LNP中的RSV RNA。在一些实施方式中，组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)以或不以至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的两次剂量向个体施用：1μg、15μg、30μg、45μg、60μg、75μg、90μg、100μg或更高剂量的囊封于LNP中的RSV RNA。
在特定实施方式中，组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)可施用可不施用两次(例如第0天及第28天、第0天及第60天、第0天及第180天、第0天及2个月后、第0天及6个月后、第0天及一年后等)，其中每次施用至少、至多、恰好以下总剂量或在以下其中任何两者之间(包括性或排他性)的总剂量或足以递送至少、至多、恰好以下总剂量或在以下其中任何两者之间(包括性或排他性)的总剂量的剂量水平：1μg、15μg、30μg、45μg、60μg、75μg、90μg、100μg或更高剂量的囊封于LNP中的RSV RNA。
【IX.使用方法】
本文提供用于预防和/或治疗人类及其他哺乳动物的RSV的组合物(例如包含RSVRNA分子和/或RSV RNA-LNP的医药组合物)、方法、试剂盒及试剂。
RSV RNA组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)可用作治疗剂和/或预防剂。其可用于药物中以预防和/或治疗传染病。在例示性实施方式中，RSV RNA组合物用于提供对任何基因型、株系或分离株的急性下呼吸道感染(ALRI)的预防保护。设想可存在其中人处于感染超过一种RSV株系的风险下的情况。RSV RNA组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)尤其适合于组合疫苗接种途径，此由于包括但不限于以下的多种因素：制造速度、快速调整疫苗以适应感知到的地理威胁的能力等。此外，因为RSV RNA组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)使用人体来产生抗原性蛋白质，所以RSV RNA组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)适合于产生较大、较复杂的抗原性蛋白质，从而允许在人类个体中适当折叠、表面表达、抗原呈递等。为了保护免于超过一种RSV株系，可施用组合RSV RNA组合物，其包括编码第一RSV的至少一种抗原性多肽蛋白质(或其抗原性部分)的RNA且进一步包括编码第二RSV的至少一种抗原性多肽蛋白质(或其抗原性部分)的RNA。本发明的RSV疫苗可用于预防RSV(感染相关病症，包括肺炎及支气管炎)，且尤其可用于预防和/或治疗免疫功能不全且老年患者以预防RSV感染或降低其严重程度和/或持续时间。
在一些实施方式中，向个体(例如哺乳动物个体，诸如人类个体)施用本发明的RSVRNA组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)，且RNA多核苷酸在活体内翻译以产生抗原性多肽。可诱导RSV RNA组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)以在细胞、组织或生物体中翻译多肽(例如抗原或免疫原)。在例示性实施例中，此类翻译发生在活体内，但可设想存在其中此类翻译离体、在培养物中或在活体外发生的实施例。在例示性实施例中，将细胞、组织或生物体与有效量的RSV RNA组合物(例如RSV RNA-LNP组合物)接触，该RSV RNA组合物包括具有至少一个编码抗原性多肽(例如RSV抗原)的可翻译区域的RNA分子。
在一些实施方式中，本发明的RSV RNA组合物可用于致敏免疫效应细胞，例如离体活化周边血液单核细胞(PBMC)，接着将其输注(再输注)至个体中。
在一些实施方式中，在施用本文所述的RSV RNA分子(例如调配为RNA-LNP)之后，将至少一部分的RNA递送至目标细胞。
在一些实施方式中，RNA的至少一部分递送至目标细胞的胞溶质。在一些实施方式中，RNA由目标细胞翻译以产生其编码的多肽或蛋白质。在一些实施方式中，目标细胞为脾脏细胞。在一些实施方式中，目标细胞为脾脏中的抗原呈递细胞，诸如专职抗原呈递细胞。在一些实施方式中，目标细胞为树突状细胞和/或巨噬细胞。RNA分子(诸如本文所述的RNA-LNP)可用于将RNA递送至此类目标细胞。因此，本发明也涉及一种用于将RNA递送至个体中的目标细胞的方法，其包含向该个体施用本文所述的RNA颗粒。
在一些实施方式中，RNA被递送至目标细胞的胞溶质。在一些实施方式中，RNA由目标细胞翻译以产生RNA编码的多肽或蛋白质。“编码”是指诸如基因、cDNA或mRNA的多核苷酸中的核苷酸的特异性序列在生物过程中充当合成其他聚合物及大分子的模板的固有特性，所述聚合物及大分子具有已确定的核苷酸序列(例如rRNA、tRNA及mRNA)或已确定的氨基酸序列及由其获得的生物特性。因此，若与基因相对应的mRNA的转录及翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则基因编码该蛋白质。核苷酸序列与mRNA序列一致且通常提供于序列表中的编码链与用作基因或cDNA转录的模板的非编码链均可被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
在一些实施方式中，本文所述的核酸组合物(例如包含RSV RNA-LNP的组合物)的特征在于(例如当向个体施用时)随细胞中的抗原产生变化的诱导和/或加强的免疫反应。抗原产生增加可由例如以下来证实：细胞转染(经RNA疫苗转染的细胞的百分比)增加、自多核苷酸的蛋白质翻译增加、核酸降解减少(例如由自经修饰的多核苷酸的蛋白质翻译的持续时间增加所证实)和/或宿主细胞的抗原特异性免疫反应改变。
在一些实施方式中，本发明涉及一种诱导个体中针对RSV的免疫反应的方法。该方法包括向个体施用有效量的本文所述的RNA分子、RNA-LNP和/或组合物以产生针对RSV的免疫反应。
在另一实施方式中，本发明涉及一种对个体进行疫苗接种的方法。该方法包括向有需要的个体施用有效量的本文所述的RNA分子、RNA-LNP和/或组合物。
在另一实施方式中，本发明涉及一种治疗和/或预防传染病的方法。该方法包括向个体施用有效量的本文所述的RNA分子、RNA-LNP和/或组合物。
在另一实施方式中，本发明涉及一种治疗和/或预防RSV感染和/或由RSV引起的病症和/或降低其严重程度的方法。该方法包括向个体施用有效量的本文所述的RNA分子、RNA-LNP和/或组合物。
在另一实施方式中，本发明涉及一种由例如诱导个体中针对传染病的免疫反应来治疗和/或预防个体患传染病和/或降低其严重程度的方法。在一些实施方式中，该方法包括施用包括有效量的本文所述的RNA分子、RNA-LNP和/或组合物的初打组合物，及施用包括有效量的RNA分子、RNA-LNP和/或组合物的加强组合物。在一些实施方式中，组合物引发免疫反应，包括抗体反应。在一些实施方式中，组合物引发免疫反应，包括T细胞反应和/或B细胞反应。在一些实施方式中，免疫反应包含T细胞反应及B细胞反应。在一些实施方式中，组合物引发中和免疫反应。中和免疫反应为作为中和抗体反应和/或有效中和T细胞反应的免疫反应。在一些实施例中，中和抗体反应产生满足或超过血清保护临限值的抗体水平。在一些实施方式中，组合物引发有效T细胞反应。有效T细胞反应为制造基线水平的传染病活化的和/或传染病特异性T细胞(包括CD8+及CD4+T辅助1型细胞)的反应。在一些实施方式中，相对于基线水平(在未处理个体中)，有效T细胞包含高比例的CD8+T细胞和/或CD4+T细胞。在一些实施例中，这些T细胞朝向共表达CD27及CD28的早期分化的记忆表型分化。
在另一实施方式中，本发明涉及一种由例如诱导个体中针对RSV的免疫反应来治疗和/或预防个体感染RSV和/或由RSV引起的病症和/或降低其严重程度的方法。在一些实施方式中，该方法包括施用包括有效量的本文所述的RNA分子、RNA-LNP和/或组合物的初打组合物，及施用包括有效量的本文所述的RNA分子、RNA-LNP和/或组合物的加强组合物。在一些实施方式中，组合物引发免疫反应，包括抗体反应。在一些实施方式中，组合物引发免疫反应，包括T细胞反应和/或B细胞反应。在一些实施方式中，免疫反应包含T细胞反应及B细胞反应。在一些实施方式中，组合物引发中和免疫反应。中和免疫反应为作为中和抗体反应和/或有效中和T细胞反应的免疫反应。在一些实施例中，中和抗体反应产生满足或超过血清保护临限值的抗体水平。在一些实施方式中，组合物引发有效T细胞反应。有效T细胞反应为制造基线水平的传染病活化的和/或传染病特异性T细胞(包括CD8+及CD4+T辅助1型细胞)的反应。在一些实施方式中，相对于基线水平(在未处理个体中)，有效T细胞包含高比例的CD8+T细胞和/或CD4+T细胞。在一些实施例中，这些T细胞朝向共表达CD27及CD28的早期分化的记忆表型分化。
本文所揭示的方法可涉及向个体施用包含至少一种具有编码至少一种RSV抗原性多肽的开放阅读框的RSV RNA分子的RSV RNA-LNP组合物，从而在个体中诱导对RSV抗原性多肽具有特异性的免疫反应，其中相对于疫苗接种预防有效剂量(例如在临床上可接受含量下预防感染病毒的治疗有效剂量)的针对RSV的传统疫苗的个体中的抗-抗原性多肽抗体效价，个体中的抗-抗原性多肽抗体效价在疫苗接种之后增加。“抗-抗原性多肽抗体”为特异性结合于抗原性多肽的血清抗体。在一些实施方式中，相对于施用预防有效剂量的针对RSV的传统组合物(例如重组或经纯化RSV蛋白疫苗、减毒或失活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的标准照护剂量)的个体中的抗-抗原性多肽抗体效价，个体中的抗-抗原性多肽抗体效价在施用RSV RNA-LNP组合物后增加或不增加至少以下、至多以下、以下中的任何两者之间(包括性或排他性)或恰好以下的量：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10log。在一些实施方式中，相对于施用预防有效剂量的针对RSV的传统组合物(例如重组或经纯化RSV蛋白疫苗、减毒或失活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的标准照护剂量)的个体中的抗-抗原性多肽抗体效价，个体中的抗-抗原性多肽抗体效价在施用RSV RNA-LNP组合物后增加或不增加至少以下、至多以下、以下中的任何两者之间(包括性或排他性)或恰好以下的量：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100或1000倍。
在一些实施方式中，相对于针对RSV的传统组合物(例如重组或经纯化RSV蛋白疫苗、减毒或失活RSV疫苗或RSV VLP疫苗的标准照护剂量)，有效量的包含至少一种具有编码至少一种RSV抗原性多肽的开放阅读框的RSV RNA分子的RSV RNA-LNP组合物引起针对RSV的血清中和抗体增加2倍～200倍(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200倍)。
在一些实施方式中，包含至少一种具有编码至少一种RSV抗原性多肽的开放阅读框的RSV RNA分子的RSV RNA-LNP组合物的有效量为等效于针对RSV的传统组合物的标准照护剂量的至少2倍降低的剂量。举例而言，RSV RNA-LNP组合物的有效量可为或可不为等效于针对RSV的传统组合物的标准照护剂量的至少以下降低的剂量：2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、250、500或1000倍。在一些实施例中，施用有效量的RSV RNA-LNP组合物的个体中产生的抗RSV抗原性多肽抗体效价等效于施用针对RSV的传统组合物的标准照护剂量的对照个体中产生的抗RSV抗原性多肽抗体效价。在一些实施例中，RSV RNA-LNP组合物的有效量为或不为等效于针对RSV的传统组合物的标准照护剂量的2倍～1000倍降低(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、1280、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、4360、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、5760、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000倍降低)的剂量，其中个体中产生的抗RSV抗原性多肽抗体效价等效于施用针对RSV的传统组合物的标准照护剂量的对照个体中产生的抗RSV抗原性多肽抗体效价。在一些实施方式中，个体中产生的抗RSV抗原性多肽抗体效价等效于施用针对RSV的传统组合物的标准照护剂量的对照个体中产生的抗RSV抗原性多肽抗体效价。
如本文所用，针对RSV的传统组合物是指除本文所述的RNA分子、RNA-LNP和/或组合物以外的组合物。举例而言，传统组合物包括但不限于活微生物疫苗、经杀灭的微生物疫苗、减毒疫苗、次单位疫苗、含有异源表达系统中产生或自大量病原性生物体纯化的重组蛋白的蛋白质抗原疫苗、DNA疫苗、含有病毒壳体蛋白质(例如融合前和/或融合后F蛋白)但缺乏病毒基因组的病毒样颗粒(VLP)疫苗等。在例示性实施例中，传统疫苗为已实现监管批准和/或由国家药物监管机构(例如美国食品与药物管理局(Food and DrugAdministration；FDA)或欧洲药物管理局(European Medicines Agency；EMA))登记的疫苗。如本文所提供，“标准照护”是指医学或精神治疗指南且可为通用或特异性的。“标准照护”基于科学证据及涉及给定病状的治疗的医学专业人士之间的协作规定适当治疗。其为医师/临床医师应遵循某一类型的患者、病症或临床情形的诊断及治疗方法。如本文所提供，“标准照护剂量”是指医师/临床医师或其他医疗专业人士将向个体施用以治疗和/或预防RSV或RSV相关病状，同时遵循用于治疗和/或预防RSV或RSV相关病状的标准照护指南的针对RSV的传统组合物的剂量。
在一些实施方式中，本文所述的RNA分子、RNA-LNP和/或组合物(例如包含至少一种具有编码至少一种RSV抗原性多肽的开放阅读框的RSV RNA分子的RSV RNA-LNP组合物)在个体的血液或血清中产生预防和/或治疗有效水平、浓度和/或效价的抗原特异性抗体。如本文所定义，术语抗体效价是指在个体(例如人类个体)中产生的抗原特异性抗体的量。在例示性实施例中，抗体效价表示为仍产生阳性结果的最大稀释度(在连续稀释中)的倒数。在例示性实施方式中，由酶联免疫吸附分析(ELISA)测定或测量抗体效价。在例示性实施例中，由中和分析，例如由微中和分析测定或测量抗体效价。在某些实施方式中，抗体效价测量表示为比率，诸如1:40、1:100等。
在例示性实施方式中，有效的本文所述的RNA分子、RNA-LNP和/或组合物(例如包含至少一种具有编码至少一种RSV抗原性多肽的开放阅读框的RSV RNA分子的RSV RNA-LNP组合物)产生大于1:10、大于1:100、大于1:400、大于1:1000、大于1:2000、大于1∶3000、大于1:4000、大于1:5000、大于1:6000、大于1:7500或大于1:10000的抗体效价。在例示性实施方式中，在疫苗接种之后10天、疫苗接种之后20天、疫苗接种之后30天、疫苗接种之后40天或疫苗接种之后50天或更多天产生或达到该抗体效价。在例示性实施方式中，在向个体施用的单次剂量的疫苗之后产生或达到该效价。在其他实施方式中，在多次剂量后，例如在第一次及第二次剂量(例如追加剂量)后产生或达到该效价。
本文所揭示的方法可涉及向个体施用包含至少一种具有编码至少一种RSV抗原性多肽的开放阅读框的RSV RNA分子的RSV RNA-LNP组合物，从而在个体中诱导对RSV抗原性多肽具有特异性的免疫反应，其中个体中的免疫反应等效于施用针对RSV的传统组合物的个体的免疫反应，相对于RNA组合物，其为或不为至少以下、至多以下、以下中的任何两者之间(包括性或排他性)或恰好以下量的剂量水平：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98或100倍。
在一些实施方式中，RNA分子、RNA-LNP和/或组合物用作疫苗。在一些实施方式中，RNA分子、RNA-LNP和/或组合物可在各种治疗或预防方法中使用以用于预防、治疗或改善急性下呼吸道感染(ALRI)或与呼吸道病症相关的病症，包括肺炎及支气管炎。
在一些实施方式中，RNA分子、RNA-LNP和/或组合物可在各种治疗或预防方法中使用以用于预防、治疗或改善急性下呼吸道感染(ALRI)，包括肺炎及支气管炎。
在一些实施方式中，本发明的方法涉及对疑似患有传染病(例如RSV)、患有传染病(例如RSV)、处于患传染病(例如RSV)和/或患传染病(例如RSV)的症状的风险下的个体的预后、诊断、测试、监测和/或治疗。该个体可能患有传染病(例如RSV)的一或多种症状。可由一或多种诊断测试(例如用于检测皮肤病变中的RSV的PCR测试；Tzanck涂片；IgM血清测试；用于IgG检测的ELISA、基于糖蛋白的ELISA、乳胶凝集和/或间接荧光抗体；直接荧光抗体分析、病毒培养等)，来测试个体的一或多种来自传染病(例如RSV)的抗原性多肽或蛋白质(或其抗原性部分)。在一些实施方式中，由一或多种诊断测试(例如用于检测RSV的PCR测试；Tzanck涂片；IgM血清测试；用于IgG检测的ELISA、基于糖蛋白的ELISA、乳胶凝集和/或间接荧光抗体；直接荧光抗体分析、病毒培养物等)，基于对来自个体的样品(例如血液、唾液、组织、骨骼、肌肉、软骨和/或皮肤)中的一或多种来自传染病(例如RSV)的抗原性多肽或蛋白质(或其抗原性部分)进行的测量、分析或检测，对已患有传染病(例如RSV)、患有传染病(例如RSV)、处于患传染病(例如RSV)和/或患有传染病(例如RSV)的症状的风险下的个体进行预后、诊断、监测和/或治疗传染病(例如RSV)。
可向健康个体或在感染早期在潜伏期期间或在症状发作之后的活动性感染期间预防性地施用RSV RNA组合物。在一些实施方式中，个体具有免疫能力。在一些实施方式中，个体免疫功能不全。
在一些实施方式中，RNA分子、RNA-LNP和/或组合物以单次剂量施用。在一些实施方式中，可给与第二、第三或第四剂量。在一些实施方式中，RNA分子、RNA-LNP和/或组合物以多次剂量施用。
在一些实施方式中，RNA分子、RNA-LNP和/或组合物经肌肉内(IM)或皮内(ID)施用。
本发明进一步提供一种试剂盒，其包含RNA分子、RNA-LNP和/或组合物。
在一些实施方式中，向小于约1岁、或约1岁～约10岁、或约10岁～约20岁、或约20岁～约50岁、或约60岁～约70岁或更大的个体施用本文所述的RNA分子、RNA-LNP和/或组合物。
在一些实施方式中，个体为至少、至多、恰好以下岁数或其中任何两者之间的岁数：小于1岁、大于1岁、大于5岁、大于10岁、大于20岁、大于30岁、大于40岁、大于50岁、大于60岁、大于70岁或更大。在一些实施方式中，个体大于50岁。
在一些实施方式中，个体为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的年龄：约1岁或更大、约5岁或更大、约10岁或更大、约20岁或更大、约30岁或更大、约40岁或更大、约50岁或更大、约60岁或更大、约70岁或更大，或更大。在一些实施方式中，个体的年龄可为约50岁或更大。
在一些实施方式中，个体为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)的年龄：1岁或更大、5岁或更大、10岁或更大、20岁或更大、30岁或更大、40岁或更大、50岁或更大、60岁或更大、70岁或更大，或更大。在一些实施方式中，个体可为50岁或更大。
【X.临床研究】
本发明的RSV RNA-LNP疫苗包含编码来自RSV的融合前F(preF)多肽的核苷修饰的mRNA(经修饰的RNA；modRNA)。RSV RNA-LNP疫苗可包含RNA，所述RNA包含在进入细胞之后翻译的单链、5'加帽且多腺苷酸化的经修饰的RNA。RNA包含编码RSV preF多肽的变体的开放阅读框(ORF)。此外，如本文所述，RNA可包含针对RNA的高功效优化的结构组件，诸如非翻译区(UTR)。RSV RNA-LNP可包含本文所揭示的实施例1的表5中所提供的RNA。RSV RNA-LNP可包含本文所揭示的实施例6的表1～3中所提供的RNA。RNA也可包含1-甲基-假尿苷对尿苷的取代以减少先天免疫传感器(诸如铎样受体(TLR)7及8)对疫苗RNA的识别，从而引起先天免疫活化的降低及蛋白质翻译的增加。
本文所述的RNA分子经调配/囊封于脂质纳米颗粒(LNP)中，以使得能够在例如肌肉内(IM)、皮内(ID)或鼻内(IN)注射之后将RNA递送至宿主细胞中。LNP调配物可包含两种功能性脂质(ALC-0315及ALC-0159)及两种结构脂质(DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)及胆固醇)。在一些实施方式中，前述脂质中的1、2、3者或更多者可排除在LNP调配物外。RNA疫苗的效能由LNP囊封优化，LNP囊封保护RNA免于细胞外RNase降解且有助于在细胞中的递送。在IM注射RSV RNA-LNP疫苗之后，LNP由细胞吸收，且RNA释放至胞溶质中。在胞溶质中，RNA被翻译，且产生所编码病毒抗原。
本文中的实施例证实本发明的RSV RNA-LNP疫苗在小鼠中具有免疫原性且在小鼠中诱导体液免疫反应及细胞介导的免疫反应两者。
本发明的临床研究评估针对RSV的RSV RNA-LNP疫苗的安全性、耐受性及免疫原性。举例而言，可指示RSV RNA-LNP疫苗用于主动免疫接种以预防成年人(例如≥45、≥50、≥55、≥60、≥70岁等或50～69岁)的急性下呼吸道感染(ALRI)，包括由RSV引起的肺炎及支气管炎。RSV RNA-LNP疫苗可以本文所述的不同的一或多种剂量水平、剂量调配物、剂量次数及施用时程进行施用，包括但不限于：
-单次剂量时程或两次剂量时程(例如第0天及在或在约2个月后，或第0天及在或在约6个月后)
-以不同剂量水平(例如每次施用为或为约15μg、30μg、60μg、90μg、100μg或更高)
-以不同调配物(非冻干和/或冻干)
RSV RNA-LNP可以液体或冻干调配物形式呈现。RSV RNA-LNP疫苗的施用可以或可不以在或在约以下的范围内施用：每剂量15μg、30μg、60μg、90μg、100μg或更高，其中注射体积为或为约0.25～1mL(例如为或为约0.25、0.5、1mL)。可能需要用无菌0.9％氯化钠(生理盐水)进行稀释。
RSV RNA-LNP临床研究的目标可包括但不限于：
-描述以所选剂量水平及时程施用的RSV RNA-LNP疫苗在参与者中的安全性及耐受性概况。
-描述由以所选择剂量水平及时程施用的市售的针对RSV的疫苗以及RSV RNA-LNP疫苗在参与者中引起的免疫反应。
在一些实施方式中，本文所揭示的编码RSV多肽的RNA分子、RNA-LNP及其组合物针对RSV的功效(或有效性)大于或不大于50％(例如至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间：50％、60％、70％、80％、90％、或更多)。可使用标准分析评定疫苗功效(参见例如Weinberg等人,J Infect Dis.2010年6月1日；201(11):1607-10)。举例而言，可由双盲、随机分组的临床受控试验(诸如本文所述的那些)来测量疫苗功效。疫苗功效可表示为未经疫苗接种(ARU)与经疫苗接种(ARV)研究小组之间的疾病侵袭率(AR)的成比例降低，且可使用以下公式由疫苗接种组中的疾病的相对风险(RR)来计算：
功效＝(ARU-ARV)/ARU×100；及
功效＝(1-RR)×100。
同样地，可使用标准分析来评定疫苗有效性(参见例如Weinberg等人,JInfectDis.2010年6月1日；201(11):1607-10)。疫苗有效性为对疫苗(其可能已证实具有高疫苗功效)如何减少群体中的疾病的评定。此测量可评定疫苗接种程序而非仅疫苗本身在天然现场条件下而非在受控临床试验中的益处与不良作用的净平衡。疫苗有效性与疫苗功效(效力)成比例，但也受群体中的目标群免疫接种的程度以及影响住院治疗、动态问诊和/或费用的真实结果的其他非疫苗相关因素影响。举例而言，可使用回溯性病例控制分析，其中比较一组感染病例及适当对照当中的疫苗接种比率。疫苗有效性可表示为率差，其中使用在疫苗接种后仍发生感染的几率比(OR)：
有效性＝(1-OR)×100。
在一些实施方式中，相对于未进行疫苗接种的对照个体，RSV多肽、RNA-LNP及其组合物的功效为至少60％。举例而言，相对于未进行疫苗接种的对照个体，功效可为至少、至多、恰好以下或在以下中的任何两者之间(包括性或排他性)：65％、70％、75％、80％、85％、95％、98％或100％。
【实施例】
下文为用于实施本发明的特定实施方式的实施例。包括以下实施例以说明本发明的实施方式。实施例仅出于说明性目的提供，且不旨在以任何方式限制本发明的范畴。本领域技术人员应了解，以下实施例中所揭示的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术。然而，本领域技术人员应理解，根据本发明，在不背离本发明的精神及范畴的情况下可对所揭示的特定实施方式作出许多改变且仍获得相同或类似结果。已尽力确保关于所用数字(例如量、温度等)的准确性，但当然应该允许一些实验误差及偏差。
【实施例1：产生RSV preF modRNA构建体】
本文中产生的RNA构建体编码RSV F蛋白野生型(WT)及RSV F蛋白变体/突变体(即RSV融合前F蛋白)。表4显示WT F蛋白(WT F)及变异RSV preF蛋白。
【表4.RSV F蛋白及描述】
制备编码RSV F蛋白的DNA序列且将其用于活体外转录反应以产生RNA。RNA的活体外转录为此项技术中已知且在本文中描述。将DNA模板克隆至具有用于改良RNA稳定性及翻译效率的主链序列组件(T7启动子、5'及3'UTR、多A尾)的质粒载体中。DNA经纯化，以分光光度法定量，且在三核苷酸帽1类似物((m2 7,3′-O)Gppp(m2′-O)ApG)(TriLink)存在下由T7 RNA聚合酶活体外转录，且其中N1-甲基假尿苷(Ψ)置换尿苷(经修饰的RNA(modRNA))。
RSV RNA由密码子优化(CO)DNA产生以实现稳定性及优良蛋白质表达。表5显示包含5'UTR、编码呼吸道合胞体病毒(RSV)多肽的开放阅读框、3′UTR及多A尾的本发明的RNA构建体及对应序列。
【表5.RSV F modRNA构建体】
*5'UTR序列包括5'帽序列
**多A尾长度可含有+1/-1A
【实施例2：产生RSV preF saRNA构建体】
saRNA合成经由活体外转录(IVT)进行且由超滤/渗滤(UFDF-1)纯化。接着，saRNA被酶促加帽且由层析及最终UFDF-2纯化，随后最终过滤且施配。
【表6.按顺序包含5'帽-5'UTR-nsP1-nsP2-nsP3-nsP4-亚基因组启动子-RSV[ORF]-3'UTR-多A尾的RSV F 847A saRNA构建体(编码具有SEQ ID NO：4的RSV F蛋白)】
【表7.按顺序包含5'帽-5'UTR-nsP1-nsP2-nsP3-nsP4-亚基因组启动子-RSV[ORF]-3'UTR-多A尾的RSV F 847B saRNA构建体(编码具有SEQ ID NO：6的RSV F蛋白)】
RNA构建体 起始[SEQ ID NO：16] 终止[SEQ ID NO：16] SEQ ID NO
5'-CAP 1 1 -
5'-UTR 2 45 52
NSP1 46 1650 55
NSP2 1651 4032 56
NSP3 4033 5703 57
NSP4 5704 7527 58
亚基因组启动子 7528 7562 54
RSV[ORF] 7563 9290 12
3'-UTR 9291 9407 24
多A尾 9408 9487 26
【实施例3：制备调配于LNP中的RSV preF RNA】
LNP调配物含有2种功能性脂质ALC-0315及ALC-0159，以及2种结构脂质DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)及胆固醇。4种脂质的物理化学特性及结构显示于下表8中。
根据美国专利9737619(PCT公开第WO2015/199952号)及美国专利10166298(WO2017/075531)及WO2020/146805(其各自以全文引用的方式并入本文中)中所描述的通用程序来制备及测试脂质纳米颗粒。简言之，阳离子脂质、DSPC、胆固醇及PEG-脂质以约47.5:10:40.7:1.8的摩尔比溶解于乙醇中。
【表8.LNP调配物中的脂质】
CAS＝化学摘要服务(ChemicalAbstract Service)；DSPC＝1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱
【实施例4：RSV preF表达】
此实施例用以捕获针对本文所述的呼吸道合胞体病毒(RSV)modRNA脂质纳米颗粒(LNP)药物产品所产生的活体外表达(in vitro expression；IVE)结果。LNP中囊封的构建体分别编码来自A株系及B株系病毒的全长RSV三聚融合体糖蛋白(F-蛋白)。
【表9.抗体的清单】
项目 来源 分析中浓度
人类mAb抗RSV mAb1 内部(In-house) 500ng/mL
小鼠mAb抗RSV L4-6 内部 500ng/mL
山羊抗小鼠IgG AF647 Invitrogen 500ng/mL
山羊抗人类κ-PE Southern Biotech 500ng/mL
【表10.测试物品的清单】
项目 测试物品
1 含有RSV F modRNA_847A的LNP
2 含有RSV F modRNA_847B的LNP
3 含有RSV F modRNA_847A-折叠子的LNP
4 含有RSV F modRNA_851A的LNP
5 含有RSV F modRNA_852A的LNP
6 含有RSV F modRNA_DS-Cav1A的LNP
7 含有RSV F modRNA_野生型(WT)A的LNP
8 含有RSV F saRNA_847A的LNP
9 含有RSV F saRNA_847B的LNP
以下方案的描述系针对全染色(表面+细胞内蛋白质)，对于仅表面染色方案而言，改变固定及洗涤缓冲液以移除渗透剂，所有其他步骤及试剂均相同。简言之，以2.5×105个细胞/孔的密度对96孔培养盘接种HEK293F细胞，且将其置于振荡温育器(350RPM，37℃，潮湿，5％ CO2)中，同时准备样品滴定。将LNP药物产品稀释于DPBS中至80ng/μL的浓度，且以4的稀释因子连续稀释8点。接着，自温育器移出96孔培养盘，且将50μL各步骤的所稀释LNP添加至96孔培养盘的重复孔中，以产生在8,000ng/孔-1.95ng/孔的范围内的滴定曲线。将96孔培养盘放回振荡温育器中过夜。在温育之后，将250μL细胞转移至96孔u形底聚苯乙烯培养盘中，且使用摆动斗式离心机(500rcf，5min，在室温)集结(pelleted)。移除上清液，且将细胞再悬浮于100μL Aqua405活/死染色溶液中。在室温避光温育培养盘30min。在温育之后，细胞用洗涤缓冲液洗涤且使用离心(500rcf，5min，在室温)集结。移除上清液，且将细胞再悬浮于100μL固定/渗透缓冲液中，且在2～8℃避光温育培养盘30分钟。一旦温育完成，则使用摆动斗式离心机(500rcf，5min，在室温)使细胞集结。移除上清液，且细胞用250μL洗涤缓冲液再悬浮，重复此总共2次洗涤。在最终洗涤步骤之后，使细胞集结，移除上清液，且再悬浮于50μL第一抗体溶液中。将培养盘密封且在2～8℃避光温育45分钟。一旦完成，则使用摆动斗式离心机(500rcf，5min，在室温)使细胞集结。移除上清液，且细胞用250μL洗涤缓冲液再悬浮，重复此总共2次洗涤。在最终洗涤步骤之后，使细胞集结，移除上清液，且再悬浮于50μL第二抗体溶液中。将培养盘密封且在2～8℃避光温育45分钟。一旦完成，则使用摆动斗式离心机(500rcf，5min，在室温)使细胞集结。移除上清液，且细胞用250μL洗涤缓冲液再悬浮，重复此总共2次洗涤。在最终洗涤步骤之后，使细胞集结，移除上清液，且再悬浮于200μL洗涤缓冲液中，并且由流式细胞分析技术获取数据。
由转染HEK293F细胞，用剂量滴定曲线，以及进行抗体染色评定modRNA LNP药物产品的活体外表达(IVE)，所述抗体为对三聚RSV F-蛋白具有特异性的RSV mAb1及对总RSVF-蛋白具有特异性的L4-6。已显示这些抗体识别A株系及B株系RSV F-蛋白，且用于用渗透或非渗透条件的分析中以评定RSV F-蛋白的总细胞含量与细胞表面含量。所测量的阳性细胞％(2,000ng/孔输入)及药物产品批次的剂量反应曲线的EC50显示于表11中。
【表11.药物产品IVE结果】
【实施例5：免疫反应(活体内实验)】
在第0天及第21天，以不同剂量，对雌性BALB/c小鼠免疫接种WO2017/109629中所描述的呈二价蛋白质亚基形式(RSV 847A+847B)的RSV融合前F(847)或本文所述的呈一价(RSV 847A)或二价(RSV 847A+847B)形式的modRNA-LNP调配物或呈二价调配物形式的saRNA-LNP。由测量RSV中和抗体反应及RSV F特异性T细胞反应来评估免疫原性。在第21天及第35天(剂量2后(PD2)2周)收集血清用于RSV中和分析，且在第35天(PD2 2周)收集脾脏用于T细胞分析(ELISpot及细胞内细胞因子染色ICS分析)。
【中和分析】
RSV微中和分析为使用A549细胞(人类肺泡基底上皮细胞)进行的3天分析，其用于测量血清中中和RSV活性从而预防宿主细胞单层感染的功能性抗体。在第0天，以2.5×104个细胞/孔将A549细胞(人类肺泡基础上皮细胞；ATCC，目录号CCL-185)接种于96孔组织培养处理的培养盘中，且温育至少20小时，以形成汇合单层。在第1天，将稀释的病毒(RSV A，M37；RSV B，B18537；500FFU/孔)添加至所制备的热灭活测试血清的3倍连续稀释液中，重复两次，且温育1小时，以使抗体与病毒结合。接着，将中和反应转移至所制备的A549细胞单层上且温育2小时。在过夜温育(至少16小时)之前，将额外介质补充至培养盘上。在第2天，培养盘用甲醇固定且用小鼠抗RSV F(Pfizer，N50-9)第一抗体染色，随后用Alexa 488荧光标记的第二抗体染色以检测病毒灶。50％中和效价计算为与仅含有病毒的孔相比50％病毒被中和的最后血清稀释度倒数。效价报导为各样品的两个重复效价的几何平均效价(GMT)。分析效价范围为20～43,740。将效价＞43,740的任何样品预稀释且重复以扩大效价极限。低于检测下限(LLOD)的任何样品均以LLOD为20报导。
【T细胞反应测量】
由在RSV F(A+B)肽池存在下离体刺激脾细胞以活化抗原特异性T细胞中各种细胞因子(诸如IFN-γ)的产生来评定疫苗诱导的针对RSV F的T细胞反应。可由ELISpot(表示为斑点形成细胞SFC/百万细胞)来测量分泌在细胞外部的细胞因子，或可阻断由ICS(表示为表达细胞因子的CD4+T细胞及CD8+T细胞的百分比)测量的细胞内部的细胞因子分泌。
在ELISpot的情况下，活化T细胞所分泌的细胞因子IFN-γ被涂覆至微量盘上孔底的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上的抗IFN-γ抗体捕获。所捕获IFN-γ由另一非竞争性生物素标记的抗IFN-γ第二抗体显色为斑点，随后使用链球菌亲生物素蛋白-碱性磷酸酶(ALP)结合物及受质溶液硝基蓝四唑鎓及5-溴-4-氯-3'-吲哚磷酸(BCIP/NBT-plus)进行酶促颜色反应，其产生深紫色沉淀或斑点。使用Mabtech小鼠IFN-γELISpot PLUS试剂盒(ALP)来测量T细胞IFN-γ反应，且其表示为斑点形成细胞(SFC)/百万细胞。
ICS染色可检测在抗原肽刺激之后在CD4+及CD8+T细胞中产生的多种细胞因子，包括IFN-γ。在具有培养基-DMSO(未刺激)或表示RSV F A+B的特定肽池(15aa，11aa重叠，2μg/mL/肽)的cRPMI中，在37℃，在抗CD107a APC抗体及蛋白质运输抑制剂GolgiPlug及GolgiStop存在下，离体培养脾细胞的单细胞悬浮液(2×106个细胞/孔)5小时。在刺激之后，将脾细胞与针对表面蛋白质CD19、CD3、CD4、CD8、CD44的荧光结合抗体一起温育(25±5分钟，在18～25℃)，随后固定及渗透且针对IFN-γ、TNF-α、IL-2及CD40L/CD154进行染色(25±5分钟，在18～25℃)。在染色之后，洗涤细胞且再悬浮于FC缓冲液中。在LSR Fortessa上收集细胞且由FlowJo(10.7.1)分析资料。结果为减去背景(培养基-DMSO)的，且显示为表达细胞因子的CD4+T细胞及CD8+T细胞的百分比。
【结果】
【活体外表达(IVE)】
RNA-LNP的IVE分析的结果在表11中详述。在RSV F设计的modRNA-LNP调配物中，基于三聚构形特异性RSVmAb1，847A-折叠子、DS-Cav1及WT显示相对更低的表达，但总F表达(L4-6)显示类似含量。此外，对于三聚F及总F表达，与modRNA-LNP相比，RSV 847A及847B的saRNA-LNP调配物显示类似的更佳表达。这些结果表明，与来自RSV亚组A或B的全长847、851及852抗原相比，自mRNA编码的部分稳定的全长DS-Cav1及天然全长WT F抗原呈递降低比例的呈融合前构形的抗原。在847的可溶性形式(即847-折叠子)的情况下观测到的有限融合前mAb结合系归因于在短暂转染之后很大程度上存在于细胞培养物上清液中的蛋白质，且IVE方法检测定位于胞内或仅定位于细胞表面的蛋白质。
【免疫原性】
在第35天(2周PD2)的中和分析的结果揭露，对小鼠免疫接种呈一价RSV 847A或二价形式RSV 847A及847B的RSV 847的modRNA-LNP调配物诱导针对RSV A及RSV B两者的强力中和抗体反应，该中和抗体反应与二价蛋白质亚基形式相比更高(图1A及图1B、表10)。此外，由modRNA-LNP的二价调配物RSV847A+RSV847B诱导的RSV B中和反应比一价调配物RSV847A的反应更高(图1B、表12)，支持对RSV preFmodRNA疫苗的二价形式用于人类中的最佳免疫反应的需求。
接下来评估在小鼠中由这些RSV preF的modRNA-LNP调配物诱导的T细胞反应。IFN-γELISpot结果显示，RSV 847modRNA疫苗诱导强力T细胞反应，趋势与RSV中和反应类似(图1C、表12)。此外，ICS分析结果揭露，RSV 847modRNA疫苗以剂量依赖性方式诱导高频率的F特异性的表达IFN-γ的CD4+T细胞以及CD8+T细胞(图1D及图1E、表12)。值得注意的是，由二价调配物(RSV 847A+847B)诱导的RSV A+BF特异性T细胞反应比一价调配物(RSV847A)更高，进一步支持RSV 847的二价形式诱导更高量值的T细胞反应，与中和反应类似。
总而言之，研究结果证实与未处理小鼠中的蛋白质亚基疫苗相比，RSV融合前F构建体的modRNA-LNP调配物的免疫原性更高。
【表12.小鼠中由蛋白质亚基及RSV融合前F的modRNA-LNP调配物诱导的免疫反应】
NA：未分析
接下来，评估本文所述的编码不同RSV融合前F(preF)抗原设计的modRNA-LNP的免疫原性。中和分析结果揭露，与DS-CAV1及WT以及设计为具有折叠子的胞外域的847A-折叠子相比，呈全长形式的突变型融合前设计847、851及852诱导更高效价(图2)。这些结果进一步确认，当自mRNA编码时，使突变以及RSV F抗原的全长(胞外域+TM+CT)形式稳定的融合前对于RSV preF抗原的最佳免疫原性至关重要。
自扩增RNA(saRNA)为利用RNA复制酶来扩增编码抗原的mRNA且预期比modRNA平台更强效的mRNA平台。使用RSVpreF的二价(A及B)调配物，将saRNA-LNP的免疫原性与modRNA-LNP及蛋白质亚基比较。在剂量1后3周(3W PD1)，在由针对RSV A及B病毒的modRNA及saRNA疫苗诱导的中和反应中观测到剂量依赖性影响。此外，由在0.02μg剂量下的saRNA诱导的中和反应实质上高于接受0.2μg剂量的小鼠中的modRNA疫苗(图3A及图3B)，表明由saRNA诱导的剂量节省反应。在剂量2后2周(2W PD2)，由saRNA诱导出强力剂量依赖性中和反应，且对于RSV A及B，该反应与在0.2μg剂量水平下的modRNA相当(图3C及图3D)。在2W PD2由ICS分析所分析的脾脏中的T细胞反应显示，由modRNA及saRNA疫苗诱导出稳固且剂量依赖性的RSV A+B F特异性的表达IFN-γ的CD4+以及CD8+T细胞反应(图3E及图3F)。由在0.02μg剂量水平下的saRNA群组诱导的CD8+T细胞反应实质上高于在0.2μg剂量下的modRNA疫苗群组(图3E及图3F)，表明由saRNA诱导的剂量节省反应。
总而言之，这些全面活体外表达及免疫原性结果证实，编码RSV preF设计的modRNA-LNP及saRNA-LNP支持在小鼠中RSV preF抗原的稳固表达且产生高效RSV F特异性免疫反应。
【实施例6：RSV抗原】
本发明的RSV抗原/多肽、RSV DNA及RSV RNA的序列提供于表1～3中。序列可包含任何终止密码子，包括但不限于下表中所提供的终止密码子。
【表1.RSV多肽】
【表2.RSV DNA】
【表3.RSV RNA】
以下段落描述本发明的额外实施方式：
1.一种RNA分子，其包含至少一个编码呼吸道合胞体病毒(RSV)多肽的开放阅读框。
2.根据段落1的RNA分子，其中所述RSV多肽为RSV糖蛋白。
3.根据段落2的RNA分子，其中所述RSV糖蛋白为RSV F蛋白。
4.根据段落1～3之任一项的RNA分子，其中所述RSV多肽为全长多肽、截短多肽、其片段或变体。
5.根据段落1～4之任一项的RNA分子，其中所述RSV多肽包含至少一个突变。
6.根据段落1～5之任一项的RNA分子，其中所述RSV多肽包含表1的氨基酸，包括但不限于SEQ ID NO：1～6或71～74中的任一者。
7.根据段落1～6之任一项的RNA分子，其中所述RSV多肽与SEQ ID NO：1～6或71～74中的任一者的氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
8.根据段落1～7之任一项的RNA分子，其中所述RSV多肽包含SEQ ID NO：1～6或71～74中的任一者的氨基酸序列。
9.根据段落1～8之任一项的RNA分子，其中所述开放阅读框系转录自表2的核酸序列，包括但不限于SEQ ID NO：7～10或59～62中的任一者。
10.根据段落1～9之任一项的RNA分子，其中所述开放阅读框系转录自与SEQ IDNO：7～10或59～62中的任一者的序列具有至少90％、95、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
11.根据段落1～10之任一项的RNA分子，其中所述开放阅读框包含表3的核酸序列，包括但不限于SEQ ID NO：11～16或63～70中的任一者。
12.根据段落1～11之任一项的RNA分子，其中所述开放阅读框包含与SEQ ID NO：11～16或63～70中的任一者的序列具有至少90％、95、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
13.根据段落1～12之任一项的RNA分子，其中所述开放阅读框包含SEQ ID NO：11～16或63～70的核酸序列。
14.根据段落1～13之任一项的RNA分子，其中各尿苷经N1-甲基假尿苷(Ψ)置换。
15.根据段落1～14之任一项的RNA分子，其进一步包含5′非翻译区(5′UTR)。
16.根据段落15的RNA分子，其中所述5'UTR包含选自SEQ ID NO：17～19中的任一者的序列。
17.根据段落1～16之任一项的RNA分子，其进一步包含3'非翻译区(3'UTR)。
18.根据段落17的组合物，其中所述3'UTR包含选自SEQ ID NO：20～25中的任一者的序列。
19.根据段落1～18之任一项的RNA分子，其中所述RNA分子包含5'帽部分。
20.根据段落1～19之任一项的RNA分子，其进一步包含3'多A尾。
21.根据段落20的RNA分子，其中所述多A尾包含具有SEQ ID NO：26的序列，其视情况包含±1或±2腺苷(A)。
22.根据段落1～21之任一项的RNA分子，其中所述RNA分子包含5'UTR及3'UTR。
23.根据段落1～22之任一项的RNA分子，其中所述RNA分子包含5′帽、5′UTR及3′UTR。
24.根据段落1～23之任一项的RNA分子，其中所述RNA分子包含5'帽、5'UTR、3'UTR及多A尾。
25.根据段落1～24之任一项的RNA分子，其包含：5'UTR，其包含SEQ ID NO：18或19的序列；开放阅读框，其包含SEQ ID NO：11～16或63～70中的任一者的序列；及3'UTR，其包含SEQ ID NO：20～25的序列。
26.根据段落1～25之任一项的RNA分子，其包含：5'UTR，其包含SEQ ID NO：18或19中的任一者的序列；开放阅读框，其包含SEQ ID NO：11～16或63～70中的任一者的序列；3'UTR，其包含SEQ ID NO：20～25中的任一者的序列；及多A尾，其包含SEQ ID NO：26中的任一者的序列。
27.根据段落1～26之任一项的RNA分子，其中所述开放阅读框由密码子优化DNA产生。
28.根据段落1～27之任一项的RNA分子，其中所述开放阅读框包含至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％、为或为约50％至75％或55％至70％、或者为或为约58％、66％或62％的G/C含量。
29.根据段落1～28之任一项的RNA分子，其中所编码RSV多肽位于细胞膜中、位于高尔基体中和/或锚定在膜中且分泌。
30.根据段落1～29之任一项的RNA分子，其中所述RNA分子包含经稳定化的RNA。
31.根据段落1～30之任一项的RNA分子，其中所述RNA包含至少一个经修饰的核苷酸。
32.根据段落31的RNA分子，其中所述经修饰的核苷酸为假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫-1-甲基-假尿苷、2-硫-5-氮杂-尿苷、2-硫-二氢假尿苷、2-硫-二氢尿苷、2-硫-假尿苷、4-甲氧基-2-硫-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫-1-甲基-假尿苷、4-硫-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷或2'-O-甲基尿苷。
33.根据段落32的RNA分子，其中所述经修饰的核苷酸为N1-甲基假尿苷(Ψ)。
34.根据段落1～33之任一项的RNA分子，其中所述RNA为mRNA。
35.根据段落34的RNA分子，其中所述RNA为modRNA或saRNA。
36.一种组合物，其包含如段落1～35之任一项的RNA分子，其中所述RNA分子调配于脂质纳米颗粒中(RNA-LNP)。
37.根据段落36的组合物，其中脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、PEG-脂质、中性脂质及类固醇或类固醇类似物中的至少一者。
38.根据段落36或37的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含阳离子脂质。
39.根据段落38的组合物，其中所述阳离子脂质为(4-羟丁基)氨叉基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)。
40.根据段落36～39之任一项的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含聚乙二醇化脂质。
41.根据段落40的组合物，其中所述聚乙二醇化脂质为PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二(十四烷基)乙酰胺、二醇-脂质(包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA、PEG-s-DMG、N-[(甲氧基聚乙二醇)2000)氨甲酰基]-1,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)及PEG-2000-DMG)、聚乙二醇化二酰基甘油(PEG-DAG)(诸如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG))、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEG-S-DAG)(诸如4-O-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-((ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、聚乙二醇化神经酰胺(PEG-cer)、或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯(诸如共甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2，3-(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯)。
42.根据段落40或41的组合物，其中所述PEG-脂质为2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二(十四烷基)乙酰胺(ALC-0159)。
43.根据段落36～42之任一项的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含中性脂质。
44.根据段落43的组合物，其中所述中性脂质为二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)及二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-顺丁烯二酰亚氨基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)或1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。
45.根据段落43或44的组合物，其中所述中性脂质为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。
46.根据段落36～45之任一项的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含类固醇或类固醇类似物。
47.根据段落46的组合物，其中所述类固醇或类固醇类似物为胆固醇。
48.根据段落36～47之任一项的组合物，其中脂质纳米颗粒的平均直径为约1～约500nm。
49.根据段落36～48之任一项的组合物，其中所述RNA来自RSV亚型A。
50.根据段落36～48之任一项的组合物，其中所述RNA来自RSV亚型B。
51.根据段落36～48之任一项的组合物，其中所述RNA来自：(i)RSV亚型A及(ii)RSV亚型B。
52.根据段落36～51之任一项的组合物，其包含浓度为或为约0.01～0.09mg/mL的调配于脂质纳米颗粒(LNP)中的RNA分子，该脂质纳米颗粒包含：阳离子脂质，其浓度为或为约0.8～0.95mg/mL；聚乙二醇化脂质，其浓度为或为约0.05～0.15mg/mL；中性脂质，其浓度为或为约0.1～0.25mg/mL；及类固醇或类固醇类似物，其浓度为或为约0.3～0.45mg/mL。
53.根据段落36～52之任一项的组合物，其包含浓度为或为约0.01～0.09mg/mL的调配于脂质纳米颗粒(LNP)中的RNA分子，该脂质纳米颗粒包含：(4-羟丁基)氨叉基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)，其浓度为或为约0.8～0.95mg/mL；2-[(聚乙二醇)-2000]-N，N-二(十四烷基)乙酰胺(ALC-0159)，其浓度为或为约0.05～0.15mg/mL；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)，其浓度为或为约0.1～0.25mg/mL；胆固醇，其浓度为或为约0.3～0.45mg/mL。
54.根据段落36～53之任一项的组合物，其包含浓度为或为约0.06mg/mL的调配于脂质纳米颗粒(LNP)中的RNA分子。
55.根据段落36～54之任一项的组合物，其进一步包含缓冲剂、稳定剂、盐、表面活性剂、防腐剂、赋形剂和/或佐剂中的至少一者。
56.根据段落36～55之任一项的组合物，其进一步包含至少缓冲剂及稳定剂及视情况存在的盐稀释剂。
57.根据段落36或56的组合物，其中所述缓冲剂为Tris缓冲液。
58.根据段落57的组合物，其中所述Tris缓冲液包含缓血酸胺及Tris盐酸(HCl)。
59.根据段落58的组合物，其中所述缓血酸胺的浓度为或为约0.1～0.3mg/mL、或者为或为约0.01～0.15mg/mL。
60.根据段落57或58的组合物，其中所述Tris HCl的浓度为或为约1.25～1.40mg/mL、或者为或为约0.5～0.65mg/mL。
61.根据段落56～60之任一项的组合物，其中所述稳定剂为蔗糖。
62.根据段落61的组合物，其中所述蔗糖的浓度为或为约95～110mg/mL、或者为或为约35～50mg/mL。
63.根据段落55～62之任一项的组合物，其中用于复原的该盐稀释剂为氯化钠。
64.根据段落63的组合物，其中所述氯化钠的浓度为或为约5～15mg/mL。
65.根据段落36～64之任一项的组合物，其中所述组合物为液体或冻干的。
66.根据段落65的组合物，其包含浓度为或为约0.01～0.09mg/mL的调配于脂质纳米颗粒(LNP)中的RNA分子，该脂质纳米颗粒包含：阳离子脂质，其浓度为或为约0.8～0.95mg/mL；聚乙二醇化脂质，其浓度为或为约0.05～0.15mg/mL；中性脂质，其浓度为或为约0.1～0.25mg/mL；及类固醇或类固醇类似物，其浓度为或为约0.3～0.45mg/mL；且进一步包含Tris缓冲液，该Tris缓冲液包含：缓血酸胺，其浓度为或为约0.1～0.3mg/mL；及Tris盐酸(HCl)，其浓度为或为约1.25～1.40mg/mL；及蔗糖，其浓度为或为约95～110mg/mL，其中所述组合物为液体组合物。
67.根据段落65的组合物，其包含浓度为或为约0.01～0.09mg/mL的调配于脂质纳米颗粒(LNP)中的RNA分子，该脂质纳米颗粒包含：阳离子脂质，其浓度为或为约0.8～0.95mg/mL；聚乙二醇化脂质，其浓度为或为约0.05～0.15mg/mL；中性脂质，其浓度为或为约0.1～0.25mg/mL；及类固醇或类固醇类似物，其浓度为或为约0.3～0.45mg/mL；且进一步包含Tris缓冲液，该Tris缓冲液包含：缓血酸胺，其浓度为或为约0.01～0.15mg/mL；及Tris盐酸(HCl)，其浓度为或为约0.5～0.65mg/mL；蔗糖，其浓度为或为约35～50mg/mL。
68.根据段落65的组合物，其中所述组合物用浓度为或为约5～15mg/mL的氯化钠复原。
69.根据段落65的组合物，其中所述组合物用或用约0.6～0.75mg/mL氯化钠复原。
70.根据段落65的组合物，其进一步包含或包含约5～15mM Tris缓冲液、pH呈或呈约7.0～8.0的200～400mM蔗糖及视情况存在的用于复原的0.9％氯化钠稀释剂。
71.一种诱导个体中的免疫反应的方法，其包含向该个体施用有效量的如段落1～70之任一项的RNA分子、RNA-LNP和/或组合物。
72.一种预防、治疗或改善个体的感染、疾病或病状的方法，其包含向个体施用有效量的如段落1～70之任一项的RNA分子、RNA-LNP和/或组合物。
73.根据段落72的方法，其中所述感染、疾病或病状与RSV相关。
74.根据段落72或73的方法，其中所述感染、疾病或病状为RSV感染诱导的急性呼吸道病症，包括肺炎及支气管炎。
75.一种如段落1～70之任一项的RNA分子、RNA-LNP和/或组合物的用途，其用于制造用于诱导个体中针对RSV的免疫反应的药剂。
76.一种如段落1～70之任一项的RNA分子、RNA-LNP和/或组合物的用途，其用于制造用于预防、治疗或改善个体的感染、疾病或病状的药剂。
77.根据段落76的用途，其中所述感染、疾病或病状与RSV相关。
78.根据段落76或77的用途，其中所述感染、疾病或病状为RSV感染相关呼吸道病症，包括肺炎及支气管炎。
79.根据段落71～78之任一项的方法或用途，其中所述个体的年龄为小于约1岁、约1岁或更大、约5岁或更大、约10岁或更大、约20岁或更大、约30岁或更大、约40岁或更大、约50岁或更大、约60岁或更大、约70岁或更大，或更大。
80.根据段落71～79之任一项的方法或用途，其中所述个体的年龄为约50岁或更大。
81.根据段落71～79之任一项的方法或用途，其中所述个体为孕妇。
82.根据段落71～81之任一项的方法或用途，其中所述RNA分子或组合物系作为疫苗施用。
83.根据段落71～82之任一项的方法或用途，其中所述RNA分子或组合物由皮内或肌肉内注射施用。
84.根据段落83的RNA分子，其中所述modRNA包含具有SEQ ID NO：13的核苷酸。
85.根据段落83的RNA分子，其中所述modRNA包含具有SEQ ID NO：14的核苷酸。
86.根据段落83的RNA分子，其中所述saRNA包含具有SEQ ID NO：15的核苷酸。
87.根据段落83的RNA分子，其中所述modRNA包含具有SEQ ID NO：16的核苷酸。
88.根据段落71～87之任一项的方法或用途，其中向该个体施用单次剂量、两次剂量、三次剂量或更多次剂量的所述RNA分子和/或组合物。
89.根据段落71～88之任一项的方法或用途，其中向该个体施用单次剂量的所述RNA分子和/或组合物。
90.根据段落71～89之任一项的方法或用途，其中向该个体施用两次剂量的所述RNA分子和/或组合物。
91.根据段落71～90之任一项的方法或用途，其中在第0天及在或在约2个月后向该个体施用两次剂量的所述RNA分子和/或组合物。
92.根据段落71～91之任一项的方法或用途，其中在第0天及在或在约6个月后向该个体施用两次剂量的所述RNA分子和/或组合物。
93.根据段落71～92之任一项的方法或用途，其中向该个体施用至少一次追加剂量的所述RNA分子和/或组合物。
94.根据段落71～93之任一项的方法或用途，其中每次施用向该个体施用至少或至少约15μg、30μg、60μg、90μg、100μg或更高剂量的RNA分子和/或组合物。
95.根据段落71～94之任一项的方法或用途，其中向该个体施用体积为或为约0.25～1mL，包括但不限于为或为约0.25、0.5、1mL的注射液。
本文所揭示及主张的所有方法可在不依据本发明进行不当实验的情况下进行及执行。虽然本发明的组合物及方法已根据某些实施方式加以描述，但本领域技术人员将显而易见的系，变化形式可适用于本文所述的方法以及方法的步骤或方法的步骤顺序，而不脱离本发明的概念、精神及范畴。更确切而言，显而易知化学上及生理学上均相关的某些药剂可取代本文所述的药剂，同时达成相同或类似结果。本领域技术人员显而易知的所有此类类似取代及修改视为在由随附申请专利范围所界定的本发明的精神、范畴及概念内。
在本申请中叙述的所有引用的参考文献(包括如在整个本申请中引用的文献参考、发布专利、公开专利申请及登录号)的内容在其提供补充本文所阐述的那些的例示性程序或其他细节的程度上在此特定且明确地以引用的方式并入。当以引用的方式并入本文中的文献中的术语的定义与本文所使用的定义冲突时，以本文所使用的定义为准。

Claims (36)

1.RNA分子，其包含至少一个编码呼吸道合胞体病毒(respiratory syncytial virus；RSV)融合蛋白F(F)多肽的开放阅读框。
2.根据权利要求1的RNA分子，其中所述RSV多肽为全长多肽、截短多肽、其片段或变体。
3.根据权利要求1的RNA分子，其中所述RSV多肽包含至少一个突变。
4.根据权利要求1的RNA分子，其中所述RSV多肽与选自SEQ ID NO：1～6及71～74的氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
5.根据权利要求1的RNA分子，其中所述开放阅读框系转录自与SEQ ID NO：7～10及59～62的序列中的任一者具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
6.根据权利要求1的RNA分子，其中所述开放阅读框包含与SEQ ID NO：11～16及63～70的序列中的任一者具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
7.根据权利要求1的RNA分子，其中所述开放阅读框包含SEQ ID NO：11～16及63～70中的任一者的核酸序列。
8.根据权利要求1的RNA分子，其进一步包含5'非翻译区(5'UTR)。
9.根据权利要求8的RNA分子，其中所述5'UTR包含选自SEQ ID NO：17～19中的任一者的序列。
10.根据权利要求1的RNA分子，其进一步包含3'非翻译区(3'UTR)。
11.根据权利要求10的RNA分子，其中所述3'UTR包含SEQ ID NO：20～25中的任一者的序列。
12.根据权利要求1的RNA分子，其中所述RNA分子进一步包含5'帽部分或3'多A尾。
13.根据权利要求12的RNA分子，其中所述多A尾包含具有SEQ ID NO：26的序列。
14.根据权利要求1的RNA分子，其中所述开放阅读框包含至少55％、60％、65％、70％或75％，或为或约50％～75％或55％～70％的G/C含量。
15.根据权利要求1的RNA分子，其中所编码RSV多肽定位于细胞膜中，定位于高尔基体(Golgi)中和/或被分泌出。
16.根据权利要求1的RNA分子，其中所述RNA包含至少一个经修饰的核苷酸。
17.根据权利要求16的RNA分子，其中所述经修饰的核苷酸为假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫-1-甲基-假尿苷、2-硫-5-氮杂-尿苷、2-硫-二氢假尿苷、2-硫-二氢尿苷、2-硫-假尿苷、4-甲氧基-2-硫-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫-1-甲基-假尿苷、4-硫-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷或2'-O-甲基尿苷。
18.根据权利要求17的RNA分子，其中所述经修饰的核苷酸为N1-甲基假尿苷(Ψ)。
19.根据权利要求1的RNA分子，其中所述RNA为mRNA。
20.根据权利要求19的RNA分子，其中所述RNA为modRNA或saRNA。
21.组合物，其包含根据权利要求1的RNA分子，其中所述RNA分子调配于脂质纳米颗粒(LNP)中。
22.根据权利要求21的组合物，其中脂质纳米颗粒包含以下至少一者：阳离子脂质、聚乙二醇化脂质、中性脂质及类固醇或类固醇类似物。
23.根据权利要求22的组合物，其中所述阳离子脂质为(4-羟丁基)氨叉基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)。
24.根据权利要求22的组合物，其中所述聚乙二醇化脂质为PEG修饰的磷脂酰乙醇胺；PEG修饰的磷脂酸；PEG修饰的神经酰胺(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)；PEG修饰的二烷基胺；PEG修饰的二酰基甘油；PEG修饰的二烷基甘油；2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二(十四烷基)乙酰胺；二醇脂质，包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA、PEG-s-DMG、N-[(甲氧基聚乙二醇)2000)氨甲酰基]-1,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)及PEG-2000-DMG；聚乙二醇化二酰基甘油(PEG-DAG)，诸如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)；聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)；PEG琥珀酸二酰基甘油(PEG-S-DAG)，诸如4-O-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-((ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)；聚乙二醇化神经酰胺(PEG-cer)；或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯，诸如共甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。
25.根据权利要求24的组合物，其中所述聚乙二醇化脂质为2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二(十四烷基)乙酰胺(ALC-0159)。
26.根据权利要求22的组合物，其中所述中性脂质为二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)及二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-顺丁烯二酰亚氨基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)或1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。
27.根据权利要求26的组合物，其中所述中性脂质为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。
28.根据权利要求22的组合物，其中所述类固醇或类固醇类似物为胆固醇。
29.诱导个体中针对RSV的免疫反应的方法，其包括向个体施用有效量的根据权利要求1的RNA分子。
30.预防、治疗或改善个体的与RSV相关的感染、疾病或病状的方法，其包括向个体施用有效量的根据权利要求1的RNA分子。
31.根据权利要求30的方法，其中所述感染、疾病或病状为RSV感染诱导的急性呼吸道病症，包含肺炎及支气管炎。
32.根据权利要求29或30的方法，其中所述个体的年龄为小于约1岁、约1岁或更大、约5岁或更大、约10岁或更大、约20岁或更大、约30岁或更大、约40岁或更大、约50岁或更大、约60岁或更大、约70岁或更大，或更大。
33.根据权利要求29或30的方法，其中所述RNA分子作为疫苗施用。
34.根据权利要求29或30的方法，其中所述个体被施用单次剂量、两次剂量、三次剂量或更多次剂量的所述RNA分子及视情况追加剂量的所述RNA分子。
35.诱导个体中针对RSV的免疫反应的方法，其包括向个体施用有效量的根据权利要求22的组合物。
36.预防、治疗或改善个体的与RSV相关的感染、疾病或病状的方法，其包括向个体施用有效量的根据权利要求22的组合物。
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