ES2349356T3

ES2349356T3 - Procedimiento para la identificacion de compuestos para la terapia de procesos de envejecimiento del sistema cardiovascular.

Info

Publication number: ES2349356T3
Application number: ES02758248T
Authority: ES
Inventors: Evi Kostenis; Vera Regitz-Zagrosek; Andreas Busch
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2001-06-29
Filing date: 2002-06-19
Publication date: 2010-12-30
Anticipated expiration: 2022-06-19
Also published as: EP1405082B1; ATE478341T1; CY1110850T1; AR036117A1; US7348155B2; PT1405082E; US20030100484A1; WO2003003018A3; TWI249617B; DE50214594D1; DE10131458A1; JP4351907B2; JP2005500042A; DK1405082T3; EP1405082A2; WO2003003018A2

Abstract

Procedimiento in vitro para la identificación de un compuesto capaz de modificar la actividad del receptor de urotensina II de tal manera que influye sobre la actividad o cantidad de un gen o producto génico que interviene en la composición, formación o degradación de la matriz extracelular, en donde a] se proporciona una célula en la que se forma el receptor de urotensina II, b] se proporciona un compuesto químico, c] se hace contactar la célula de a] con el compuesto químico de b], d] a continuación, se determina la actividad o cantidad de un gen o de su producto génico a partir de las células de c], en donde este gen o producto génico interviene en la composición, formación o degradación de la matriz extracelular, e] se compara la actividad o cantidad obtenidas en d] con la actividad o cantidad del mismo gen o producto génico a partir de una célula de control correspondiente, que no ha sido puesta en contacto con el compuesto del apartado b], en donde, en el apartado d] se selecciona al menos un gen del grupo consistente en Col 1, MMP2, TGF-beta 1 o CTGF.

Description

La invención se refiere a un procedimiento in vitro para la identificación de un compuesto que modifica la actividad del receptor de urotensina II, influyendo de este modo sobre los procesos de envejecimiento del sistema cardiovascular.

La urotensina II (UII) es un péptido que actúa sobre los vasos sanguíneos. Dependiendo del tipo de vaso y de la especie, genera efectos vasodilatadores y vasoconstrictores. La actividad es comparable, en numerosos aspectos, a la de la angiotensina II (All). Tanto la urotensina II como su receptor, GPR14, se encuentran presentes en el sistema cardiovascular humano, por ejemplo, en las células endoteliales, las células musculares lisas de las arterias coronarias, en el miocardio o en el ateroma coronario. Por lo tanto, se atribuye a ambos factores una función importante en la organización cardiovascular a nivel celular y, por consiguiente, en los procesos fisiopatológicos. La urotensina II es conocida como ligando natural de GPR14. GPR14 pertenece al grupo de los GPCR (receptores acoplados a la proteína G).

Experimentos llevados a cabo con urotensina II sobre monos anestesiados condujeron a modificaciones llamativas de los parámetros hemodinámicos. El aumento de la resistencia periférica, junto con un debilitamiento de la contractilidad cardiaca y una reducción del volumen sistólico llevaron al colapso del sistema cardiovascular. También en el ser humano tienen lugar procesos comparables.

Los receptores acoplados a la proteína G (GPCR, por sus siglas en inglés) juegan un papel fundamental en una pluralidad de procesos fisiológicos muy diversos. Se supone que en el genoma humano aproximadamente 1000 genes codifican esta familia de receptores. Se estima que entre 40 y 50% de los medicamentos disponibles actualmente bajo prescripción médica actúan como agonistas o antagonistas de los GPCR. Esto pone de manifiesto el importante papel que juega esta clase de receptores en la industria farmacéutica. En virtud del tamaño e importancia de la familia de proteínas y considerando el hecho de que para numerosos GPCR no se conocen todavía ligandos fisiológicos (GPCR huérfanos), se debe aceptar que esta clase de receptores será en el futuro una de las principales reservas de proteínas diana apropiadas en la investigación de nuevos medicamentos.

Los GPCR constituyen una familia de proteínas integrales de membrana, que se localizan en la superficie celular. Reciben señales extracelulares (por ejemplo, hormonas, neurotransmisores, péptidos, lípidos), y transmiten estas señales a través de una familia de proteínas que se unen al nucleótido guanina, las llamadas proteínas G, hacia el interior de la célula. De esta forma, activan diferentes vías de transducción de señales, en función de la especificidad del receptor, de la proteína G activada y del tipo de célula. Las cadenas de polipéptidos de todos los GPCR están formadas por siete hélices α que se extienden a lo largo de la doble capa fosfolipídica de la membrana celular. En base a los siete canales que atraviesan la membrana, se producen bucles extra e intracelulares que hacen posible la fijación extracelular de ligandos y el acoplamiento intracelular de proteínas G. Por esta razón, los GPCR reciben también el nombre de receptores transmembrana de 7 dominios.

Todos los receptores acoplados a la proteína G funcionan según un modelo básico común: La unión de un ligando extracelular lleva a una modificación de la conformación de la proteína del receptor, de modo que puede entrar en contacto con una proteína G. A través de las cascadas de transducción de señales, mediadas por la proteína G en el interior de la célula, se produce en último término una respuesta biológica de las células.

Las proteínas G son proteínas heterotrímeras, que constan de subunidades α, β y γ, y que se encuentran localizadas en la cara interior de la membrana celular mediante anclajes lipídicos. El acoplamiento de GPCR activados determina un intercambio GDP/GTP de la subunidad Gα, así como la disociación del heterotrímero en una subunidad α y una subunidad βγ. Tanto la subunidad alfa activada como el complejo beta-gamma pueden influir sobre las proteínas efectoras intracelulares.

La activación de la adenilciclasa (AC) presente en la membrana por medio de las proteínas G del tipo Gαs da lugar, por ejemplo, al incremento del nivel intracelular de AMPc o a su reducción por la activación de proteínas G del tipo Gαi. Las proteínas G del tipo Gq activan la fosfolipasa C (PLC), que cataliza la formación de inositol-1,4,5trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG). Por su parte, estas moléculas conducen a la liberación de Ca2+ desde los depósitos intracelulares, o a la activación de la proteinquinasa C (PKC) que, en ambos casos, tienen efectos adicionales. Además de los tipos de proteínas G (Gαi/s, Gq) citados anteriormente, existen otros tipos adicionales, que se designan como G16, G12/13 etc. La pluralidad de estas proteínas G refleja la pluralidad de muy diversas funciones de los GPCR.

En la Solicitud Internacional WO 01/14888 se describe un procedimiento que sirve para identificar agonistas y antagonistas del receptor de urotensina II. Este procedimiento utiliza una señal de la cascada de transducción de señales influida por el receptor modificado para determinar el estado del receptor en relación con su interacción con un agonista o antagonista.

En la publicación de Douglas et al. en TCM Vol. 10, No. 6, 2000 se describe que el receptor de urotensina II humano aumenta la expresión de ARNm procolágeno α1-(1). De aquí se deduce que existe la posibilidad, como sucede con otros espasmogénicos (por ejemplo, ET-1, angiotensina-II, norepinefrina, entre otros), de que el receptor genere fibrosis en los vasos sanguíneos del corazón y en los vasos periféricos.

En la publicación de Chen et al. en J. Mol. Cell. Cardiol. 32, 1802-1819 (2000) se señala que el TGF-β es un regulador específico de CTGF tanto en los miocitos como en los fibroblastos del corazón. En este caso, la inducción de CTGF a través del TFG-β se correlaciona con un incremento significativo de fibronectina, colágeno y PAI1 en los fibroblastos cardiacos.

Fitzgerald et al. indican en Atherosclerosis 145, 97-106 (1999) que, en el conejo, la excitación de sus carótidas por ensayos de balonamiento induce simultáneamente la producción de heparanasa y MMP2 activo, y que en pacientes en el estadio final de lesiones ateroscleróticas complejas, se observa una actividad simultánea de la heparanasa, MMP2 y MMP9.

En el documento WO 00/75168 se da a conocer el receptor de urotensina II del ratón. Así mismo, se conocen métodos para la identificación de agonistas y antagonistas de GPR14, por ejemplo en el documento WO 99/40192.

Hasta la fecha, en el estado de la técnica en relación con métodos de análisis, no se ha encontrado ninguna referencia especial al uso del receptor de urotensina II para la detección de compuestos tales como genes o productos génicos que intervienen en la generación, composición o degradación de la matriz extracelular. Por este motivo, no es posible investigar, desde el punto de vista farmacéutico, sustancias que actúen de forma suficientemente eficaz contra enfermedades que cursan con un incremento del tejido conjuntivo.

Por lo tanto, la invención se refiere a un procedimiento in vitro para identificar un compuesto capaz de modificar la actividad del receptor de urotensina II de tal manera que sea posible influir sobre la actividad o la cantidad de un gen o producto génico que interviene en la composición, formación o degradación de la matriz extracelular, en donde a] se utiliza una célula en la que se forma el receptor de urotensina II, b] se utiliza un compuesto químico, c] se hace contactar la célula de a] con el compuesto químico de b], d] a continuación, se determina la actividad o cantidad de un gen o de su producto

génico a partir de las células de c], en donde este gen o producto génico interviene

en la composición, formación o degradación de la matriz extracelular, e] se compara la actividad o cantidad obtenidas en d] con la actividad o cantidad del

mismo gen o producto génico a partir de una célula de control correspondiente,

que no ha sido puesta en contacto con el compuesto del apartado b],

en donde, en el apartado d], se selecciona al menos un gen del grupo consistente

en Col1, MMP2, TGF beta 1 o CTGF.

La célula utilizada, en la que se forma un receptor de urotensina II, es preferentemente la célula de un mamífero, por ejemplo, de ratón, rata, cobaya o hámster. De forma especialmente preferida, se emplea una célula humana. En una forma de realización especialmente preferida, esta célula es una célula cardiaca.

El compuesto químico que se utiliza para el procedimiento tiene, preferentemente, un peso molecular entre 100 y 50.000 kDa y, de manera especialmente preferida, entre 100 y 5.000 kDa.

Un compuesto químico de este tipo, disponible para este procedimiento, es preferentemente una sustancia natural, una proteína, un polinucleótido, un compuesto que contiene azúcares o un compuesto que contiene lípidos. Un compuesto de este tipo, adicionalmente preferido, es urotensina II.

El gen del procedimiento según la invención, o el correspondiente producto génico para el que se debe determinar la actividad o cantidad es, preferentemente, el gen o producto génico responsable de Coll (Colágeno Tipo 1), MMP2 (Metaloproteinasa Tipo 2), TGF-beta (Factor Transformador del Crecimiento [Transforming Growth Factor] beta) o CTGF (Factor de Crecimiento de Tejido Conectivo [Connective Tissue Growth Factor]).

La determinación de la actividad o cantidad del gen o producto génico del procedimiento según la invención se lleva a cabo, preferentemente, por medio de la PCR cuantitativa de una reacción enzimática, o con la ayuda de anticuerpos.

La invención se refiere, adicionalmente, al uso de un compuesto, identificado a través de un procedimiento según la invención, tal como se ha descrito anteriormente, para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades del sistema cardiovascular. En este sentido, enfermedades del sistema cardiovascular son, por ejemplo, el infarto cardiaco, una enfermedad vascular coronaria, los trastornos patológicos de los vasos sanguíneos tales como, por ejemplo, la aterosclerosis o la angina de pecho. De manera especial, estas enfermedades del sistema cardiovascular están comprendidas entre las relacionadas con la formación de la matriz extracelular, en donde esta formación puede estar patológicamente alterada. En una forma de realización preferida, para la aplicación de este compuesto, éste tiene un peso molecular entre 100 y 50.000 kDa y, en una forma de realización especialmente preferida, un peso molecular entre 100 y 5.000 kDa.

La modificación de la actividad de un receptor de urotensina II significa que la transmisión de la señal mediada por él puede ser incrementada, interrumpida o debilitada. La modificación de la actividad de un receptor de urotensina II tiene lugar, de manera especial, por medio de agonistas o antagonistas de la urotensina II. Sin embargo, la modificación del receptor de urotensina II puede producirse por medio de los llamados moduladores alostéricos. Un agonista de la urotensina II es un compuesto que favorece, mantiene o aumenta la acción que la urotensina II desarrolla de manera natural en una célula determinada, en tanto que el antagonista debilita o potencia esta acción de la urotensina II. Un modulador alostérico del receptor de urotensina II puede ser un compuesto que, en sí mismo, posee sólo una afinidad reducida por el receptor, pero que potencia o inhibe la acción de los agonistas o antagonistas.

La actividad o cantidad de un gen o producto génico resultan afectadas cuando la actividad o cantidad del gen o producto génico correspondiente aumentan o disminuyen en una célula determinada, en comparación con un control. Por lo tanto, el control consiste en una célula comparable que no está sometida a las medidas que dan lugar a la influencia sobre esa actividad o cantidad. Como medidas se entiende, en este contexto, especialmente la puesta en contacto de un compuesto con la célula. En el sentido mencionado anteriormente, el término célula puede significar una o múltiples células de un órgano o tejido de un vertebrado. Estas células pueden proceder del cerebro, pulmones, músculo, tejido graso, tejido conectivo, corazón o de otros órganos. Las células pueden estar presentes de manera aislada, o pueden estar todavía en contacto con el tejido. Estas células comprenden, de forma especial, también células de cultivos celulares. Vertebrados son, por ejemplo, la rata, ratón, hámster, cobaya y el ser humano.

La urotensina II es un polipéptido. En el ser humano, está formada por 11 aminoácidos. La urotensina II tiene una acción muy eficaz como hormona vasoconstrictora. En los primates, provoca una contracción vascular sistémica, la disfunción contráctil del miocardio y un colapso circulatorio total. La acción de la urotensina II está mediada a través del receptor GPC GPR14. Las secuencias de GPR14 son conocidas. Por ejemplo, en la solicitud internacional WO 00/75168 se da a conocer la secuencia del GPR14 del ratón. El receptor de urotensina II humano recombinante está disponible comercialmente, por ejemplo, en la compañía "Euroscreen".

La matriz extracelular (ECM, por sus siglas en inglés) desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la identidad estructural de los tejidos. La ECM rodea las estructuras de los tejidos o de las células individuales. La ECM está compuesta por colágenos, glicoproteínas no colágenas y proteoglicanos. En este contexto, la composición varía en los diferentes tejidos. La ECM forma una red altamente especializada, compleja y dinámica. Además de su función de soporte, interviene, entre otras, en la transmisión de señales, la diferenciación, adhesión, regeneración y migración celulares. Adicionalmente, la ECM juega un papel importante en la transformación fibrótica de tejidos, por la que se debe entender un incremento de la incorporación de tejido conectivo. Esto es lo que sucede, por ejemplo, en la cicatrización posterior a las lesiones sufridas por el corazón tras un infarto cardiaco, en las alteraciones fibrosas de los pulmones, o en los cambios fibrosos del hígado tras una intoxicación hepática con disolventes orgánicos o por un alcoholismo excesivo y prolongado. Esta situación afecta a los órganos también en el transcurso del proceso de envejecimiento como resultado del paso del tiempo o de un desgaste excesivo. Los trastornos en la formación de la matriz extracelular desempeñan un papel importante especialmente en la fibrosis. La fibrosis se asocia con una formación excesiva de tejido de cicatrización consecutiva a procesos de reparación de tejidos. Pueden verse afectados órganos tales como el corazón, riñones, hígado, pulmones, ojos o la piel. La fibrosis se caracteriza por la formación aumentada de colágeno y pérdidas funcionales de los órganos afectados.

En la constitución de la ECM intervienen colágenos, por ejemplo, colágeno Tipo 1 o colágeno Tipo 2, laminina u otras proteínas. En la degradación de la ECM participan proteinasas pertenecientes al grupo de las metaloproteinasas, serin proteinasas o cisteína proteinasas.

Las metaloproteinasas muestran dominios funcionales característicos. En los diferentes miembros de la familia están conservados la secuencia de señales, los pro-dominios, dominios catalíticos y los dominios similares a la hemopexina C-terminales. MMP2 y MMP9 contienen dominios similares a la fibronectina adicionales. MMP2 se conoce también con el nombre de gelatinasa A. Los sustratos de la MMP2 son los colágenos I, II, IV, V, VII, X, XI, XIV, elastina, fibronectina, gelatina y laminina. La vía de señalización TGF-beta y la activación de CTGF son procesos clave para la activación de genes de proteínas de la matriz extracelular tales como colágeno Tipo 1. Por lo tanto, el CTGF recibe también el nombre de citoquina fibrogénica.

La puesta a disposición de una célula comprende su producción, cultivo y posterior procesamiento. La puesta a disposición se realiza, por ejemplo, por la preparación de un material celular apropiado de órganos o tejidos o por reproducción de líneas celulares o microorganismos apropiados. Para el cultivo, se pueden usar diferentes medios de nutrición apropiados. Las células se mantienen a la temperatura óptima para el organismo. Eventualmente, se añaden al medio de crecimiento utilizado en cada caso, conservantes, antibióticos, indicadores del pH, componentes de suero sanguíneo, suero sanguíneo, aditivos u otros. Los procedimientos para la preparación, cultivo y posterior procesamiento se describen en obras estándares. (Ejemplo: Basic Cell Culture; Ed. J.M. Davis; IRL Press; 1994).

Células apropiadas son, preferentemente, las de mamíferos. Estas células pueden consistir en células primarias o líneas celulares. Ejemplos de estas células son células primarias de órganos de mamíferos (por ejemplo, cerebro, músculo, tejido graso, tejido conectivo, corazón, pulmones, hígado, riñones, vasos sanguíneos, glándulas endocrinas, etc.). Las células pueden ser células nerviosas, células musculares, células grasas, fibroblastos, leucocitos, células pulmonares, células hepáticas, células renales y de otro tipo. Líneas celulares apropiadas son, preferentemente, células CHO, HEK 293, COS, 3T3 de ratón, Hela u otras. Además, preferentemente, se pueden usar células de levaduras.

Se pone a disposición un compuesto químico, especialmente a través de síntesis química o por aislamiento de sustancias químicas a partir de material biológico. El material biológico contiene células vivas o muertas, o componentes de las mismas.

Para la síntesis química de un compuesto o el aislamiento de una sustancia a partir de células biológicas, el experto puede recurrir a métodos convencionales. Estos métodos se encuentran a disposición del experto en libros de texto tales como "Organic Synthesis Workbook; 1995; John Wiley & Sons; ISBN 3-527-30187-9", "The Organic Chemistry of Drug Synthesis; 1998; John Wiley & Sons; ISBN 0-471-24510-0" o "Bioactive Compounds from Natural Sources; 2001; Taylor & Francis; ISBN 0-74840890-8".

Los compuestos obtenidos por síntesis o aislamiento pueden estar disueltos en un disolvente apropiado. Los disolventes apropiados pueden contener agua, sustancias tampón (por ejemplo, Tris, Hepes, Mops, etc.), iones mono- o bivalentes (por ejemplo, K+, Na+, Mg2+, Ca2+, etc.), ácidos (por ejemplo, HCL, H2SO4, ácido fórmico, ácido acético, etc.), sosa (por ejemplo, NaOH, etc.), alcohol (por ejemplo, metanol, etanol, glicerina), detergentes (por ejemplo, dodecilsulfato sódico, etc.), disolventes orgánicos (por ejemplo, formamida, acetona, dimetilsulfóxido, etc.), así como otros componentes, especialmente solubilizadores o estabilizantes. Un compuesto químico para el procedimiento según la invención debe ser adecuado como ligando para un GPCR.

Un compuesto de este tipo se puede obtener, en especial, a partir de tejidos u órganos de animales vertebrados tales como, por ejemplo, tejido endotelial, tejido cardiaco, tejido cerebral, sangre, suero o plasma.

Para hacer contactar el compuesto químico con la línea celular mencionada, el experto puede utilizar métodos convencionales de laboratorio. Por ejemplo, el contacto tiene lugar en matraces Erlenmayer, tubos, recipientes Eppendorf o placas de microtitulación. Para establecer el contacto se pueden utilizar incubadoras de temperatura regulable, en las que se puede fijar una temperatura constante de, por ejemplo, 30°C o 37°C, así como condiciones homogéneas de CO2 o de humedad ambiental. El contacto se puede llevar a cabo, de manera especial, en dispositivos automatizados de laboratorio previstos para tal efecto. El contacto se puede realizar durante diferentes periodos de tiempo, que van desde pocos segundos, minutos hasta múltiples horas. Las condiciones seleccionadas en cada caso dependen del receptor, la línea celular y el compuesto químico.

La actividad o cantidad de un gen o de su producto génico pueden estar referidas a la actividad del gen en relación con su promotor, a la cantidad de ARN y ARNm formado, así como a la actividad enzimática o cantidad de proteína codificada por este gen. La determinación de la cantidad de ARNm en una célula se puede llevar a cabo por diferentes métodos tales como, por ejemplo, técnicas de PCR o de hibridación. Como técnicas de PCR, el experto tiene a su disposición en especial los sistemas de PCR en tiempo real, distribuidos en el comercio por diversas compañías. Estas compañías son Applied Biosystems, Bio-Rad, Cepheid, Cortett Research, Roche Molecular Biochemicals o Stratagene. Los sistemas de PCR en tiempo real pertenecen a los instrumentos convencionales del experto. Como técnicas de hibridación para determinar la cantidad de ARN resultan adecuadas, por ejemplo, la hibridación Dot-Blot (puntiforme) o la hibridación de Northern. Ambas técnicas utilizan la formación de una molécula de ácido nucleico de cadena doble, causada por el apareamiento de bases a partir de dos cadenas individuales separadas, en donde una cadena se fija sobre la superficie del soporte y la otra cadena, móvil, exhibe una marca de carácter radiactivo o de otro tipo, detectable de manera relativamente sencilla. El experto está familiarizado con las técnicas de hibridación. Puede acceder a ellas en libros de texto estándares tales como, en particular, "Current Protocols in Molecular Biology; editado por Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D. Moore, J. G. Seidman, John A. Smith, Keven Struhl; John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 2001.

La determinación de la actividad o cantidad de una proteína se puede efectuar a través de su actividad enzimática, o con ayuda de anticuerpos específicos. En la actividad enzimática, se determina la reacción de la correspondiente enzima en relación con su sustrato. Para ello, se prepara un ensayo que garantiza a la enzima las condiciones óptimas de actividad con respecto a pH, co-factores, medio iónico, temperatura y concentración del sustrato, haciendo posible así una medición dentro del intervalo de reacción proporcional. La determinación de la reacción con el sustrato se puede llevar a cabo, por ejemplo, tras la incorporación de precursores marcados radiactivamente en macromoléculas o la degradación de macromoléculas marcadas radiactivamente en sus productos de descomposición, y su posterior separación y determinación de las correspondientes cantidades radiactivas. En la aplicación de anticuerpos para la determinación cuantitativa de una proteína, el experto utiliza técnicas tales como la hibridación de Southern, RIA (radioinmunoensayo), ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas) y otras.

El experto encontrará también instrucciones detalladas para la realización de estos métodos de detección en la obra citada anteriormente "Current Protocols in Molecular Biology".

El compuesto está presente en el medicamento, preferentemente, en forma de una composición farmacéutica con un excipiente aceptable. El excipiente debe ser, por supuesto, aceptable, en el sentido de que sea compatible con los otros componentes de la composición y no sea perjudicial para la salud del paciente. El excipiente puede ser un sólido o líquido, o ambos, y preferentemente se formula con el compuesto en forma de una dosis unitaria, por ejemplo, como comprimido, que puede contener desde 0,05 % hasta 95 % en peso del ingrediente activo.

Las composiciones farmacéuticas según la invención se pueden preparar según uno de los métodos farmacéuticos conocidos, los cuales consisten esencialmente en mezclar los componentes con excipientes y/o coadyuvantes farmacológicamente aceptables. Composiciones farmacéuticas según la invención son aquellas apropiadas para la administración oral, rectal, tópica, peroral (por ejemplo, sublingual) y parenteral (por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intradérmica o intravenosa).

5 La cantidad necesaria de un compuesto para obtener un efecto biológico deseado depende de una serie de factores tales como, por ejemplo, el compuesto específico seleccionado, uso previsto, tipo de administración, o estado clínico del paciente. Los datos cuantitativos citados a continuación se refieren a un ligando.

La dosis diaria se sitúa generalmente en el intervalo de 0,3 mg a 100 mg (típi

10 camente de 3 mg a 50 mg) por día y por kilogramo de peso corporal, por ejemplo 3-10 mg/kg/día. Una dosis intravenosa puede situarse, por ejemplo, en el intervalo de 0,3 mg a 1,0 mg/kg, y puede ser administrada adecuadamente como infusión de 10 ng a 100 ng por kilogramo y minuto. Las soluciones para infusión adecuadas para este fin pueden contener, por ejemplo, de 0,1 ng a 10 mg por mililitro, típicamente de 1 ng a 10

15 mg por mililitro. Las dosis unitarias pueden contener, por ejemplo, de 1 mg a 10 g de principio activo. De esta forma, las ampollas inyectables pueden contener, por ejemplo, 1 mg hasta 100 mg, y las formulaciones de dosis unitaria para administrar por vía oral tales como, por ejemplo, comprimidos o cápsulas, pueden contener, por ejemplo, 1,0 hasta 1000 mg, típicamente 10 hasta 600 mg.

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Abreviaturas

All Angiotensina II Coll Colagenasa I Con Control MMP2 Metaloproteinasa II de matriz UII Urotensina II.

Ejemplos

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1. Aislamiento y cultivo de fibroblastos de corazón humano

El aislamiento de fibroblastos a partir de corazón humano se llevó a cabo de la forma descrita en Cell and Tissue Research 286, 145-153 (1996). El cultivo celular resultante estuvo compuesto en 96 a 98 % por fibroblastos.

Para la realización, se seccionó tejido cardiaco en trozos pequeños, que se incubaron tres veces en KHB (tampón Krebs-Henseleit) que contuvo 2 mg/ml de colagenasa y 2 mg/ml de dispasa, durante 20 minutos a 37°C. Los homogeneizados se suministraron conjuntamente y, a continuación, se sometieron a centrifugación. Los sedimentos se recogieron en 10 ml de KHB. Las células se depositaron en recipientes no recubiertos de material sintético, en porciones de 2 a 3 ml. Se enrasó hasta un volumen de 10 ml con DMEM (Medio de Eagle Modificado por Dulbecco) que contuvo 4,5 mg/l de glucosa y 10 % de FCS (suero fetal bovino). Después de incubar durante 1 hora a 37 °C, las células se lavaron dos veces con PBS (solución salina tamponada con fosfato) y, a continuación, se cultivaron durante aprox. 4 a 8 semanas a 37°C y 5% de CO2, hasta alcanzar un grado de confluencia de 90%. Seguidamente, se llevaron a cabo dos pases adicionales de 4 semanas de duración cada uno. Las células de los presentes ensayos se utilizaron después del segundo pase con una confluencia de 70% hasta 90% (aprox. 3 meses después del aislamiento).

2. Estimulación de fibroblastos de corazón humano con angiotensina II y urotensina II

Los reactivos para llevar a cabo las técnicas de cultivo celular fueron suministrados por Gibco BRL Life Technologies. En primer lugar, las células se mantuvieron en DMEM libre de suero que contuvo 4000 mg de glucosa/I, L-glutamina 2mM, 100 µg/0,1 mg/ml de penicilina/estreptomicina y 0,1% de BSA (albúmina de suero bovino) a 37 °C antes de agregar angiotensina II o urotensina II hasta una concentración final de 0,1 µM. Por último, al cabo de 6 horas se preparó el ARN a partir de las células.

3. Realización de la cuantificación de ARN específico por PCR en tiempo real

El ARN se aisló por procedimientos convencionales, con ayuda de cloruro de guanidinio.

A partir de cada muestra, se transcribieron con transcriptasa inversa (10 unidades/ng de ARN) 500 ng de ARN en ADN. Para la degradación del ADN, se incubó el volumen total con aprox. 8 a 10 ng de ARN con DNasa I.

La cuantificación del ARN tuvo lugar con el dispositivo Light-Cycler y el kit Fast Start Sybr-Green RT-PCR de Roche Molecular Biochemicals. Para el mismo objetivo son apropiados también los kits correspondientes de otras compañías tales como Applied Biosystems, Bio-Rad o Stratagene. Como cebador se utilizaron para ColI los cebadores correspondientes a SEC ID No. 1 y 2, para MMP2 los cebadores correspondientes a SEC ID No. 3 y 4, para GAPDH, como control, los cebadores correspondientes a las SEC ID No. 5 y 6, para TGF-beta los cebadores correspondientes a las SEC ID No. 7 y 8, y para CTGF los cebadores correspondientes a las SEC ID No. 9 y 10. La reacción se mantuvo inicialmente constante durante 10 min a 95°C. Seguidamente, se llevaron a cabo 40 ciclos, cada uno de ellos compuesto por una incubación de 10 seg. a 95°C, 5 seg. a 60°C y 12 seg. a 72°C. La especificidad de la reacción se confirmó por medio de una curva de fusión. La comparación de las cantidades se llevó a cabo usando ARNm de GAPDH como control.

4. Inducción de genes que intervienen en la construcción de la membrana basal, en fibroblastos cardiacos

Se aislaron fibroblastos de tres corazones humanos y se utilizaron en el primer pase. Las células se cultivaron hasta una confluencia de aprox. 80%, se mantuvieron sin suero durante 24 horas más, y fueron estimuladas con urotensina II 1 µM, angiotensina II 1 µM o sustancias tampón como control durante 6 horas, siempre en forma de parejas. Se cuantificaron los ARNm (colágeno1, metaloproteinasa 2 de matriz, TGF-beta1, CTGF) por medio de "PCR en tiempo real" utilizando un dispositivo Light Cycler®. Como referencia estándar se utilizó el ARNm de GAPDH (gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa). La PCR en tiempo real (reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real) permite la detección cuantitativa de ácidos nucleicos específicos. La técnica se basa en el uso combinado de colorantes fluorescentes con la reacción en cadena de la polimerasa de ARN inversamente transcrito. En la actualidad, existen diferentes proveedores de kits para ensayos. Por ejemplo, el sistema está disponible en el comercio a través de Applied Biosystems, Bio-Rad, Cepheid, Carbett Research, Roche Molecular Biochemicals o Stratagene.

La estimulación con urotensina II condujo a un incremento significativo del ARNm de colágeno I, MMP2, TGF-beta1 y CTGF.

Col 1 MMP 2 TGF-beta1 CTGF Con 0,56 +/- 0,1 0,43 +/- 0,2 0,60 +/- 0,09 0,45 +/- 0,27 UII 0,92 +/- 0,3* 0,65 +/- 0,3* 0,81 +/- 0,1* 0,88*/- 0,2* All 0,56 +/- 0,27 0,22 +/- 0,1 0,71 +/- 0,07 0,34 +/- 0,9 *: p< 0.05 frente a control;

La formación de este ARN demuestra la enorme importancia de la urotensina II y de su receptor para la síntesis de la matriz y el remodelamiento de los tejidos vascu5 lar y cardiaco. Por consiguiente, los correspondientes agonistas y antagonistas poseen un alto valor farmacológico en lo que se refiere a alteraciones del corazón, en especial después de un ataque cardiaco de las regiones afectadas, para la prevención, evitación o reversión de la formación de tejido cicatricial en el tejido cardiaco, pero también, de forma especial, en la hipertensión arterial o las enfermedades pulmonares obstruc

10 tivas. La angiotensina II es la principal molécula efectora del sistema reninaangiotensina. La hormona peptídica desarrolla diversos efectos fisiológicos. De esta forma, la angiotensina II interviene en la modificación de la resistencia periférica. Influye sobre la función renal y, entre otras, regula la reabsorción de sodio. Además, actúa como factor de crecimiento.

15

5. Inducción de la síntesis de colágeno mediante urotensina en fibroblastos cardiacos humanos

Se aislaron fibroblastos cardiacos humanos a partir de siete corazones humanos explantados en la fase terminal de una insuficiencia cardiaca causada por una 20 cardiomiopatía dilatada. Igualmente, se realizaron cuatro preparaciones celulares procedentes de corazones de donantes sanos. Los fibroblastos se aislaron y cultivaron de forma descrita anteriormente, en placas Petri estériles de 10 cm. Las células alcanzaron después de aproximadamente 12 semanas de cultivo el segundo pase, con una confluencia de aprox. 80%. En esta etapa, se retiró el suero durante 48 horas y, a con25 tinuación, se procedió a la estimulación durante diferentes intervalos de tiempo (desde 6 hasta 24 horas) con UII, AngII, TNF-alfa, TGFβ, UII + TNFa, (respectivamente, 10-7 mol/I) o tampón (control). Se llevaron a cabo determinaciones dobles o triples. Después de la estimulación, las células se lavaron, se retiraron de las placas Petri mediante 1 ml de PBS, y se sometieron a centrifugación en tubos de Eppendorf (100 rpm, 5 30 min, 4°C). Se eliminó el sobrenadante. A aproximadamente 50 µl de células se agre

garon 100 µl de tampón de lisis (Nonidet P40, 0,5%, SDS 0,5%), y se incubó sobre hielo durante 20 minutos adicionales. El lisado se centrifugó nuevamente (20 min, 1400 rpm, 4°C) y se utilizó el sobrenadante para experimentos posteriores. La determinación de proteínas se llevó a cabo con el ensayo BCA (ácido bicinconínico). Los homogeneizados se diluyeron hasta una concentración de proteína de 2 µg/µl.

Los péptidos C de procolágeno Tipo I de los fibroblastos de todos los corazones se determinaron por medio de un ensayo ELISA de fase sólida, disponible en el comercio, en una placa de microtitulación de 96 pocillos (TaKaRa Biomedicals, Shuzo Co, Ltd.). El ensayo se efectuó siguiendo las instrucciones del fabricante. En este caso, no se evidenció ninguna reactividad cruzada con fibronectina, vitronectina, laminina, colágeno Tipo I o colágeno Tipo III humanos. La determinación de los valores del péptido C de procolágeno Tipo I se llevó a cabo con ayuda de una curva estándar de 10 a 640 ng/ml. Los patrones estándares son suministrados por el fabricante. Los valores de absorción de las estimulaciones en los controles (tampón) se consideraron como 100%. Los valores de absorción para las células estimuladas se compararon con los valores de control del mismo corazón. En cada caso, se tomaron en consideración para los cálculos los valores medios de dos o tres determinaciones. Para la valoración estadística de la comparación de las respuestas a la estimulación entre las células de control y las células de insuficiencia cardiaca se utilizó un test T no apareado y bilateral.

En los fibroblastos cardiacos explantados de los corazones con insuficiencia cardiaca, la proteína procolágeno I está aumentada tras la estimulación con UII (173 +/- 42% del control), AngII (205 +/- 67%), TGF-β (202 +/- 52%) y, en menor medida, con TNF-alfa (139 +/- 26%) (Tabla 1). El incremento tuvo lugar de manera dependiente del tiempo, si bien ya fue detectable después de 6 horas. Por el contrario, la cantidad de proteína colágena no se modificó en los fibroblastos de corazones de donantes estimulados con los mismos péptidos: UII (98% del control), AngII (88%), TGF-β (97%) y TNF-alfa (86%). Las diferencias entre las células de los corazones de control y las células de los corazones con insuficiencia cardiaca fueron estadísticamente significativas tras la estimulación con UII y TNF-alfa. Se registraron las mismas tendencias también con Angll y TGF-beta.

Tabla 1

Síntesis de colágeno en fibroblastos de corazones en la etapa terminal de insuficiencia

cardiaca (EFH)

Corazón Tiempo Control AngII TGFβ UII TNFa UII+TNF

(No.) (Horas) (Absorción, en % de los controles)

1 24 h 100 142 166 198 166

4 24 h 100 471 377 458 262

10 5 h 100 94 142 102 67

11 5 h 100 113 123 243 91

12 12 h 100 --117 107 128

13 12 h 100 --165 126 139

14 12 h 100 --226 190 218

Valor 100 205 202 173 139 162 medio EEM 67 52 42 26 18

5 Síntesis de colágeno en los corazones de control (Control) Corazón Tiempo Control AngII TGFβ UII TNFa (No.) (Horas) (Absorción, en % de los controles) 3 6h 100 84 84 103 81 3 12 h 100 92 123 80 92 5 6h 100 88 71 106 77 6 6h 100 -110 104 92 Valor 100 88 97 98 86 medio EEM 2 12 6 4

p (EFH frente a controles) 0,3 0,16 0,05 0,02 (No.): número de código interno para los corazones

PROTOCOLO DE SECUENCIAS

<110> Aventis Pharma Deutschland GmbH

<120> Procedimiento para la identificación de compuestos para el tratamiento de los procesos de envejecimiento del sistema cardiovascular

<130> AVE D-2001/A032

<140>

<141>

<160> 10

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1 cgttggacct cctggtaatc 20

<210> 2

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 2 ccttgttacc gctctctcct 20

<210> 3

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 3 acctggatgc cgtcgtggac: 20

<210> 4 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 4 tgtggcagca ccagggcagc: 20

<210> 5 <211> 18 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 5 gcaggaggca ttgctgat: 18

<210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 6 caccatcttc caggagcgag: 20

<210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 7 gttgtaatgg caggcacagg: 20

<210> 8 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 8 cacactgcaa gtggacatca acg: 23

<210> 9 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 9 tctccgtgga gctgaagcaa tagt: 24

<210> 10 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 10 ggcttaccga ctggaagaca: 20

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento in vitro para la identificación de un compuesto capaz de modificar la actividad del receptor de urotensina II de tal manera que influye sobre la actividad o cantidad de un gen o producto génico que interviene en la composición, formación o degradación de la matriz extracelular, en donde a] se proporciona una célula en la que se forma el receptor de urotensina II, b] se proporciona un compuesto químico, c] se hace contactar la célula de a] con el compuesto químico de b], d] a continuación, se determina la actividad o cantidad de un gen o de su producto

génico a partir de las células de c], en donde este gen o producto génico interviene en la composición, formación o degradación de la matriz extracelular,

e] se compara la actividad o cantidad obtenidas en d] con la actividad o cantidad del mismo gen o producto génico a partir de una célula de control correspondiente, que no ha sido puesta en contacto con el compuesto del apartado b],

en donde, en el apartado d] se selecciona al menos un gen del grupo consistente en Col 1, MMP2, TGF-beta 1 o CTGF.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la célula utilizada es una célula de mamífero.

3 Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la célula utilizada es una célula humana.
4.

Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula utilizada es una célula cardiaca o un fibroblasto.
5.

Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el compuesto utilizado tiene un peso molecular entre 100 y 50.000 kDa.
6.

Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el peso molecular se encuentra entre 100 y 5.000 kDa.
7.

Procedimiento según la reivindicación 5 ó 6, en el que el compuesto es una sustancia natural, una proteína, un polinucleótido, un compuesto que contiene azúcares o un compuesto que contiene lípidos.

5 8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el compuesto es urotensina II.
9. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 8, en el que

la determinación según los apartados d] o e] se lleva a cabo por medio de una PCR 10 cuantitativa.
10. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la determinación según los apartados d] o e] se lleva a cabo por medio de una reacción enzimática.

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11. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la determinación según los apartados d] o e] se lleva a cabo por medio de un anticuerpo.