TWI849993B - 具有受機械性壓力細胞模型之藥效測試平台及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示一種具有受機械性壓力細胞模型之藥效測試平台及其應用，其中，該機械性壓力細胞模型包括待測細胞，表現有壓力生物標記達第一表現量，其中，該待測細胞包括心臟細胞；另一方面，該藥效測試平台可用於實現一種藥效測試方法，其包含提供一如前所述之藥效測試平台，並以待測藥物接觸該待測細胞達測試時間，以使該待測細胞轉型成受測細胞，接著測量該受測細胞中該壓力細胞標記之表現量為第二表現量，與該第一表現量比較以評估該待測藥物是否具有藥效；本發明可用於多種缺血性心臟病的潛在藥物篩選，且建立離體機械性壓力細胞模型可實現大規模潛在藥物篩選，節省了建立模式動物所耗費的時間，並排除個體差異所導致的複雜變因，利於產業聚焦於高潛力之候選藥物。
Description
本發明涉及藥效測試平台及測試方法，尤其涉及以細胞模型作為藥效測試平台，特別是與心臟疾病關聯之藥效測試。
在全球範圍內，缺血性心臟病(Coronary artery disease，CAD)已逐漸成為主要的致死原因，其每年造成近1670萬人的死亡；急性心肌梗塞(Acute myocardial infarction，AMI)是導致缺血性心臟病的重要關鍵，當AMI侵襲心臟，冠狀動脈血流阻塞並逐漸導致心肌局部缺血性；AMI或心臟病發最終將導致心衰竭；通常AMI伴隨著突發性的冠狀動脈血流中斷，對於患者生命威脅性相當高，並需要快速且及時的處置；於本領域中，多個風險因子直接或間接地導致AMI關聯心臟病已被識別出來，例如糖尿病、高血壓、高膽固醇血症、吸煙、飲酒、肥胖和久坐不動的生活方式。
處於高血壓狀態的心臟可能誘發心衰竭，其特徵在於機械性壓力過載，例如在高於140mmHg的血壓下；機械力例如拉伸力、彎曲力或壓縮力已被報導對於心血管細胞構造與功能之調控有所影響；為本領域所公知，機械力所活化的蛋白質或許在克服心肌過載(cardiac overloading)問題中扮演相當的角色；然而，上述機制尚未在心肌細胞中獲得驗證；體內研究指出，心肌過載為過量機械刺激的其中一種形式，且機械拉伸會導致氧化壓力並促進ERK蛋白質表現，而
一氧化氮(NO)可以作為心臟肥大(hypertrophy)的指標；內皮細胞的一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthetase，eNOS)均表現於心血管細胞及心肌細胞，而於心臟肥大的狀態下，eNOS是功能失調的；此外，在心臟肥大的狀態下，二型腎上腺受器(β-adrenergic receptor，β-AR)展現出對於不正常eNOS的補償功能；更甚者，eNOS的過量表現已被知悉與心肌收縮功能下降有所關聯，並對於先天性心衰竭病患的存活率有所影響；令人訝異的是，表現出收縮功能下降的心肌細胞仍可在心肌過載的情況下存活，其具體機制仍為未知。
在心肌細胞中，鈉離子平衡為多種不同的離子運輸蛋白(ion transporter)、離子道(ion channel)及磷酸激酶(kinase)所協同控制；心肌細胞為心肌組織功能的核心基礎，其鈉離子平衡在興奮-收縮配合(excitation-contraction coupling)機制及正常粒線體代謝中扮演重要角色；心衰竭之特徵為細胞鈉離子過載，其為鈉離子入通量(influx)及出通量(efflux)失衡的結果；在心肌細胞中，增加的鈉離子流入主要肇因於：(1)晚期鈉離子流(late sodium ion current)增加；(2)Na+/H+離子交換器活性增加；(3)Na+/Ca2+離子交換器由於胞內鈣離子過多而持續維持在鈉離子流入狀態；由於鈉離子平衡在興奮-收縮配合機制以及心肌代謝機制中扮演的角色，鈉離子失調為心衰竭發展與病程進展之主因並不令人意外；二型鈉離子-葡萄糖共運輸蛋白抑制子(Sodium-glucose co-transporter 2 inhibitors，SGLT2i)為近期最新的心衰竭治療策略；SGLT2i已知可緩解收縮型心衰竭(Heart failure with reduced ejection fraction，HFrEF)，並也可望改善舒張型心衰竭(Heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF)。
近期SGLT2i被列入歐洲心臟病學會(European Society of Cardiology，ESC)所發布的心衰竭指南中，並具體實施於患有HFrEF的心衰竭病
患身上；該指南所發布知建議係獨立於任何糖尿病史之外，縱使SGLT2i長期以來被分類為抗糖尿病藥物之一，但這反映出本領域正在重新認識關於SGLT2i於葡萄糖尿效應(glucosuric effect)之外的分子機制；體內(in vivo)研究顯示了，恩格列淨(empagliozin)的預處理，在左側主冠狀動脈結紮5分鐘後並再灌注20分鐘時，可以完全排除致命性心室型心律不整的發生率；然而，ERK抑制劑抵消了恩格列淨的效果，顯示出ERK可能為SGLT2i的潛在下游目標；在以高鹽飲食餵養Dahl/SS鹽敏感大鼠所建構的HFpEF型心衰竭模型中，以達格列淨(dapagliflozin)實施治療減緩了Ca2+及Na+之過載，並提高了鈣瞬變(Ca2+ transient amplitude)；除此之外，在患病心臟中上調控的Na+/H+離子交換器(NHE1)、一型鈉離子-葡萄糖共運輸蛋白(SGLT1)以及二型鈣離子/鈣調素依賴性蛋白激酶(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)可以透過長期的恩格列淨治療而消除，但在上述處置中，離體的心肌細胞並沒有發生任何Na+或Ca2+的急性反應。
本領域中尚未見達格列淨或恩格列淨在調控心肌細胞SGLT1/2依賴型(SGLT1/2-dependent)的生物功能的機制研究，係由於缺乏功能相近的體外細胞模型作為藥物研究與測試平台；現階段於先前技術中，關於缺血性心臟病(CAD)潛在藥物效果之測試，例如SGLT1/2依賴型生物功能機制的研究，仍需仰賴模式生物執行體內研究(in vivo)，而建置模式動物之手法繁複，並且需要考量不同模式生物個體中的複雜變因，這使得藥物投入後所產生的效應為直接或間接效應難以確知；是以，在體外(in vitro)建立穩定的細胞膜型將有助於潛在藥物的篩選，為本領域所亟待解決之議題。
在人體的微環境中，細胞面臨的不只是生物化學變化的衝擊，還有許多物理因素如細胞生物力學參與其中，包括拉伸、擠壓、剪力、基質的軟硬；機械物理作用無時無刻在微觀層面影響著人體，每一顆細胞都有機械力的感受器、接受器，特定蛋白質組成的細胞骨架，做為鋼筋、大小支柱和拉桿，進而影響細胞的訊息傳遞、存活、生長、分化以及死亡等功能，是以細胞培養將不再只有靜態結合化學的單一選擇，而是讓細胞培養邁向可以是動靜皆宜。
於患病心肌細胞中，機械力誘導上調控葡萄糖及Na+/Ca2+離子失衡對於ERK-eNOS訊號傳遞鏈調節之假設，本發明人得益於其啟發，進一步嘗試建立體外細胞模型，利用細胞感應微環境中機械訊號(mechanical cues)而觸發細胞內微調控變化，來模擬受機械力過載逆境影響之細胞環境，從而建立由機械力過載導致之病理細胞模型，並將其投入藥物測試。
爰此，本發明之一目的即在於提供一種具有受機械性壓力細胞模型之藥效測試平台，其中，該受機械性壓力細胞模型包括一待測細胞，其表現有一壓力生物標記達一第一表現量，其中，該待測細胞包括心臟細胞(cardiac cell)。
如前所述之藥效測試平台，其中，該心臟細胞(cardiac cell)包含心臟肌纖維細胞(heart muscle fiber cell)、心臟平滑肌細胞(heart smooth muscle cell)、傳導細胞(conduction cell)、心房心肌細胞(atrial cardiomyocyte)或心室心肌細胞(ventricular cardiomyocyte)。
如前所述之藥效測試平台，其中，該壓力生物標記包括乙型轉化生長因子(transforming growth factor Beta，TGF-β)、肌鈣蛋白(Troponin T)、肌鈣蛋白I(Troponin I)、肌酸激酶-MB(Creatine kinase-MB)、肌紅蛋白(Myoglobin)、心房利鈉肽(Atrial Natriuretic Peptide，ANP)、心房利鈉肽訊號肽(Atrial Natriuretic Peptide Signal Peptide，ANP-SP)、乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase，LDH)、天
冬氨酸轉氨酶(Aspartate aminotransferase)、心臟型脂肪酸結合蛋白(Heart-type Fatty Acid-Binding Protein，H-FABP)、缺血修飾白蛋白(Ischemia modified albumin)、內皮素(Endothelin)、腎上腺髓質素(Adrenomedullin)、腎素(Renin)、血管緊張素(Angiotensin II)、內皮糖蛋白(Endoglin)或至少其中的二者。
如前所述之藥效測試平台，其中，該待測細胞之製備方法(100)包括：接種處理(101)：接種一原型細胞(P)於一基體(Sb)上達一貼附時間以使該原型細胞(P)貼附於該基體(Sb)上以獲得一原型細胞基體(P-Sb)；及壓力處理(102)：實施一機械力(F)於該原型細胞基體(P-Sb)上達一壓力過載時間以使該原型細胞轉型為該待測細胞(T)，其中，該機械力包括剪切力(shear force)、拉伸力(stretch force)或壓縮力(compress force)。
如前所述之藥效測試平台，其中，該機械力(F)包括拉伸力，該壓力處理(102)更包括：以一循環頻率循環拉伸該原型細胞基體(P-Sb)達該壓力過載時間，於任一次循環拉伸步驟中，分別於該原型細胞基體(P-Sb)之兩端施以該拉伸力，以使該原型細胞基體(P-Sb)朝兩端延展達一延展度，並於達該延展度時，解除該拉伸力，其中，該壓力過載時間為0至48小時但不為0小時，該循環頻率為0.5至2.0Hz，該延展度為15至30%。
如前所述之藥效測試平台，其中，該基體(Sb)更包括一基質塗層，設置於該原型細胞(P)及該基體(Sb)之間，其中，該基質塗層之材料包含明膠(gelatin)、一型膠原蛋白(type-I collagen)、二型膠原蛋白(type-II collagen)、纖維粘連蛋白(fibronectin)或層黏連蛋白(laminin)。
如前所述之藥效測試平台，其中，該待測細胞未包含有編碼該壓力生物標記之外源性核酸片段。
本發明之另一目的在於提供一種藥效測試方法(200)，其包含：提供一如前所述之藥效測試平台；接觸該待測細胞(T)以一待測藥物達一測試時間
以使該待測細胞(T)轉型成一受測細胞(Td)；測量該受測細胞(Td)中該壓力細胞標記之表現量為一第二表現量；及比較該第一表現量及該第二表現量，若該第一表現量與該第二表現量之比值大於1，評估該待測藥物具有藥效，若該第一表現量與該第二表現量之比值小於或等於1且大於0，評估該待測藥物不具藥效。
如前所述之方法，其中，該待測細胞未包含有編碼該壓力生物標記之外源性核酸片段。
如前所述之方法，其中，該待測細胞之製備方法(100)包括：接種處理(101)：接種一原型細胞(P)於一基體(Sb)上達一貼附時間以使該原型細胞(P)貼附於該基體(Sb)上以獲得一原型細胞基體(P-Sb)；及壓力處理(102)：以一循環頻率循環拉伸該原型細胞基體(P-Sb)達該壓力過載時間，於任一次循環拉伸步驟中，分別於該原型細胞基體(P-Sb)之兩端施以該拉伸力，以使該原型細胞基體(P-Sb)朝兩端延展達一延展度，並於達該延展度時，解除該拉伸力，其中，該壓力過載時間為12至24小時，該循環頻率為0.8至1.8Hz，該延展度為20至25%。
T:待測細胞
P:原型細胞
Sb:基體
P-Sb:原型細胞基體
F:機械力
100:製備方法
101:接種處理
102:壓力處理
200:藥物測試方法
S1至S4:步驟
圖1A至1B為說明受機械性壓力細胞模型之製備方法流程；圖2為說明利用藥效測試平台進行藥效測試之步驟流程；圖3A至3B為盒鬚圖用以說明TGF-β1及CD105於急性心肌梗塞AMI患者樣本中表現量上升之情形；圖3C至3D為接受者操作特徵曲線(AUCROC)用以說明急性心肌梗塞AMI患者樣本中TGF-β1及CD105作為生物標記之靈敏度；圖4A至4B為免疫螢光染色圖及其定量直方圖，用以評估實施例1中機械性壓力過載對於肌鈣蛋白I及CD105之表現量影響；
圖5A為西方氏墨點圖及其定量直方圖，用以定量分析實施例1中機械性壓力過載對於SGLT2及ERK活化之影響；圖5B至5D為免疫螢光染色圖及其定量直方圖，其依序用以定量分析實施例1中機械性壓力過載對於p-ERK、SGLT1及p-eNOS活化之影響；圖6A至6C為免疫螢光染色圖及其定量直方圖，其依序用以定量分析實施例2中機械性壓力過載對於肌鈣蛋白I及CD105、SGLT1及SGLT2活化之影響；圖7A至7C為免疫螢光染色圖及其定量直方圖，其用以定量分析實驗例1中藥物處理對於機械性壓力過載心肌細胞模型中肌鈣蛋白I及CD105表現量之影響；圖7D為線性回歸分析圖用以說明實驗例1中肌鈣蛋白I及CD105之相關性；及圖8A至8E為免疫螢光染色圖及其定量直方圖，其用以定量分析實驗例1中藥物處理對於機械性壓力過載心肌細胞模型中SGLT1、SGLT2、p-ERK及p-eNOS表現量之影響。
本發明之一實施方式係所提供一種具有受機械性壓力細胞模型之藥效測試平台，其中，該受機械性壓力細胞模型包括一待測細胞(T)，其表現有一壓力生物標記達一第一表現量，其中，該待測細胞(T)包括心臟細胞(cardiac cell)；所述第一表現量為該壓力生物標記相較於基礎表現量(basal expression level)所定義，例如以未受機械性壓力處理之細胞的壓力生物標記表現量為基準
表現量，來定量待測細胞(T)之第一表現量，具體為該第一表現量與該基準表現量之比值，其介於1至30之間，較佳為1.5至20之間，更佳為2至10之間。
於一些實施例中，該心臟細胞(cardiac cell)可列舉如心臟肌纖維細胞(heart muscle fiber cell)、心臟平滑肌細胞(heart smooth muscle cell)、傳導細胞(conduction cell)、心房心肌細胞(atrial cardiomyocyte)或心室心肌細胞(ventricular cardiomyocyte)，但不限於此，舉凡由該些細胞所建立之細胞株也可以作為實施本發明之待測細胞；舉例來說，細胞株可列舉如人類心肌細胞株AC16、人類心臟平滑肌細胞株T/G HA-VSMC、大鼠心肌細胞株H9c2(2-1)、大鼠心臟平滑肌細胞株A7r5、大鼠心臟平滑肌細胞株SV40LT-SMC Clone HEP-SA、小鼠心肌細胞株HL-1、或小鼠心臟平滑肌細胞株MOVAS，但不限於此。
於本實施方式中，該壓力生物標記可列舉如乙型轉化生長因子(transforming growth factor Beta，TGF-β)、肌鈣蛋白(Troponin T)、肌鈣蛋白I(Troponin I)、肌酸激酶(Creatine kinase)、肌酸激酶-MB(Creatine kinase-MB)、肌紅蛋白(Myoglobin)、心房利鈉肽(Atrial Natriuretic Peptide，ANP)、心房利鈉肽訊號肽(Atrial Natriuretic Peptide Signal Peptide，ANP-SP)、乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase，LDH)、天冬氨酸轉氨酶(Aspartate aminotransferase)、心臟型脂肪酸結合蛋白(Heart-type Fatty Acid-Binding Protein，H-FABP)、細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)、磷酸化細胞外信號調節激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinases，p-ERK)、一型鈉依賴型葡萄糖共同運輸蛋白(Sodium-dependent glucose cotransporters，SGLT1)、二型鈉依賴型葡萄糖共同運輸蛋白(Sodium-dependent glucose cotransporters，SGLT2)、內皮一氧化氮合成酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、缺血修飾白蛋白(Ischemia modified albumin)、內皮素(Endothelin)、腎上腺髓質素(Adrenomedullin)、
腎素(Renin)、血管緊張素(Angiotensin II)及內皮糖蛋白(Endoglin)之中的至少二者。
在一些實施例中，該壓力生物標記包括乙型轉化生長因子(transforming growth factor Beta，TGF-β)、肌鈣蛋白(Troponin T)、肌鈣蛋白I(Troponin I)、肌酸激酶(Creatine kinase)、肌酸激酶-MB(Creatine kinase-MB)、肌紅蛋白(Myoglobin)、細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)、磷酸化細胞外信號調節激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinases，p-ERK)、一型鈉依賴型葡萄糖共同運輸蛋白(Sodium-dependent glucose cotransporters，SGLT1)、二型鈉依賴型葡萄糖共同運輸蛋白(Sodium-dependent glucose cotransporters，SGLT2)、內皮一氧化氮合成酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、內皮素(Endothelin)、腎上腺髓質素(Adrenomedullin)、腎素(Renin)、血管緊張素(Angiotensin II)及內皮糖蛋白(Endoglin)之中的至少二者。
在另一些實施例中，該壓力生物標記包括乙型轉化生長因子(transforming growth factor Beta，TGF-β)、肌鈣蛋白(Troponin T)、肌鈣蛋白I(Troponin I)、肌酸激酶(Creatine kinase)、肌酸激酶-MB(Creatine kinase-MB)、細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)、磷酸化細胞外信號調節激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinases，p-ERK)、一型鈉依賴型葡萄糖共同運輸蛋白(Sodium-dependent glucose cotransporters，SGLT1)、二型鈉依賴型葡萄糖共同運輸蛋白(Sodium-dependent glucose cotransporters，SGLT2)、內皮一氧化氮合成酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、及內皮糖蛋白(Endoglin)之中的至少二者。
在一些較佳實施例中，該壓力生物標記包括乙型轉化生長因子(transforming growth factor Beta，TGF-β)、肌鈣蛋白(Troponin T)、肌鈣蛋白I(Troponin I)、磷酸化細胞外信號調節激酶(phosphorylated extracellular signal-
regulated kinases，p-ERK)、一型鈉依賴型葡萄糖共同運輸蛋白(Sodium-dependent glucose cotransporters，SGLT1)、二型鈉依賴型葡萄糖共同運輸蛋白(Sodium-dependent glucose cotransporters，SGLT2)、內皮一氧化氮合成酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、及內皮糖蛋白(Endoglin)之中的至少二者；更佳地，該壓力生物標記包括乙型轉化生長因子(transforming growth factor Beta，TGF-β)、肌鈣蛋白I(Troponin I)、及內皮糖蛋白(Endoglin)之中的至少二者。
於本實施方式中，該待測細胞係透過機械性壓力誘導細胞而表現該壓力生物標記，其非利用基因轉殖工程將外源基因轉殖入待測細胞中以誘導表現該壓力生物標記，例如透過轉染(transfection)或轉導(transduction)等習知技術，是以，該待測細胞未包含有編碼該壓力生物標記之外源性核酸片段。
以下說明該待測細胞透過機械性壓力誘導表現該壓力生物標記之具體方法，請參閱圖1A至1B，該待測細胞(T)之製備方法(100)包括：接種處理(101)：接種一原型細胞(P)於一基體(Sb)上達一貼附時間以使該原型細胞(P)貼附於該基體(Sb)上以獲得一原型細胞基體(P-Sb)；及壓力處理(102)：實施一機械力(F)於該原型細胞基體(P-Sb)上達一壓力過載時間以使該原型細胞轉型為該待測細胞(T)，其中，該機械力包括剪切力(shear force)、拉伸力(stretch force)或壓縮力(compress force)。
當可理解的是，該原型細胞(P)包括心臟細胞(cardiac cell)，與待測細胞之區別在於，原型細胞(P)所表現之壓力生物標記僅達基礎表現量，可列舉如心臟肌纖維細胞(heart muscle fiber cell)、心臟平滑肌細胞(heart smooth muscle cell)、傳導細胞(conduction cell)、心房心肌細胞(atrial cardiomyocyte)或心室心肌細胞(ventricular cardiomyocyte)，但不限於此，舉凡由該些細胞所建立之細胞株也可以作為實施本發明之待測細胞；舉例來說，細胞株可列舉如人類心肌細胞株
AC16、人類心臟平滑肌細胞株T/G HA-VSMC、大鼠心肌細胞株H9c2(2-1)、大鼠心臟平滑肌細胞株A7r5、大鼠心臟平滑肌細胞株SV40LT-SMC Clone HEP-SA、小鼠心肌細胞株HL-1、或小鼠心臟平滑肌細胞株MOVAS，但不限於此。
於一些實施例中，該機械力(F)包括拉伸力，該壓力處理(102)更包括：以一循環頻率循環拉伸該原型細胞基體(P-Sb)達該壓力過載時間，於任一次循環拉伸步驟中，分別於該原型細胞基體(P-Sb)之兩端施以該拉伸力，以使該原型細胞基體(P-Sb)朝兩端延展達一延展度，並於達該延展度時，解除該拉伸力；具體地，該壓力過載時間為0至48小時但不為0小時，該循環頻率為0.5至2.0Hz，該延展度為15至30%；較佳地，該壓力過載時間為12至36小時，該循環頻率為0.8至1.8Hz，該延展度為18至28%；更佳地，該壓力過載時間為18至24小時，該循環頻率為1.0至1.5Hz，該延展度為20至25%。
於一些實施例中，該基體(Sb)為多孔性高分子材料所製成的彈性膜，其中高分子材料可列舉如聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)、聚N-異丙基丙烯酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide))、聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene，PTFE)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyetheline terephthalate，PET)、或聚碳酸酯(polycarbonate，PC)，但不限於此。
於該些實施例中，該基體(Sb)上更包括有一基質塗層，以增加原型細胞(P)之貼附穩定性，其設置於該原型細胞(P)及該基體(Sb)之間，其中，該基質塗層之材料可列舉如明膠(gelatin)、一型膠原蛋白(type-I collagen)、二型膠原蛋白(type-II collagen)、纖維粘連蛋白(fibronectin)或層黏連蛋白(laminin)，或其混合物，並不以此為限；於一些示例中，明膠(gelatin)的塗佈密度為100至200微克/平方公分，一型膠原蛋白(type-I collagen)的塗佈密度為5至10微克/平方公分，二型膠原蛋白(type-II collagen)的塗佈密度為5至10微克/平方公分，纖維粘連蛋白(fibronectin)的塗佈密度為1至10微克/平方公分，層黏連蛋白(laminin)的塗佈密
度為1至15微克/平方公分，其可依據細胞種類及實驗條件如基底培養液種類、血清種類、處理藥物種類等進行調整以達到促進細胞貼附穩定性的目的。
於一些示例中，該製備方法(100)可透過二維或三維動態培養系統而實現，例如ATMS周期性拉伸細胞培養系統(ATMS Boxer，TAIHOYA Corporation)，該系統具有二維/三維動態拉伸細胞培養模式(2D/3D dynamic stretch cell culture)、活體組織拉伸培養模式(Tissue sample dynamic stretch culture)及三維動態擠壓細胞培養模式(3D dynamic compression cell culture)，該些模式使操作者可以調整不同的拉伸或擠壓變形量、頻率等條件下，以模擬原型細胞(P)、其細胞群集(cluster)或其細胞組織的不同生理或病理環境條件，進而在離體(in vitro)環境中模擬心血管脈動、肺部呼吸、咀嚼、肌肉、韌帶、皮膚的牽張延展、關節軟骨的壓縮、胃腸蠕動、膀胱系統的縮脹等生理環境；如圖1A所示，藉由上述動態培養系統給予原型細胞(P)一特定機械壓力後，其逐漸生長為相近於測試目標組織的細胞排列狀態，例如心肌組織的排列。
本發明之另一實施方式係提供一種藥效測試方法(200)，如圖2所示，其包含：步驟S1：提供一如前所述之藥效測試平台；步驟S2：接觸該待測細胞(T)以一待測藥物達一測試時間以使該待測細胞(T)轉型成一受測細胞(Td)；步驟S3：測量該受測細胞(Td)中該壓力細胞標記之表現量為一第二表現量；步驟S4：比較該第一表現量及該第二表現量，若該第一表現量與該第二表現量之比值大於1，評估該待測藥物具有藥效，若該第一表現量與該第二表現量之比值小於或等於1且大於0，評估該待測藥物不具藥效。
於一些較佳實施例中，該第一表現量與該第二表現量之比值介於20至2之間，較佳為15至3之間；於本發明中，基礎表現量、第一表現量及第二表現量均可由習知手段偵測而得，例如西方氏墨點、定量PCR(qPCR)、免疫螢光染色等方式，透過影像分析等手段測算其表現量，其技術細節於此不加贅述。
以下通過數個實施例及實驗例以說明本發明所達到的技術功效，惟其僅係用以說明本發明之核心精神，但非用以限制本發明之實施態樣。
材料與方法
1.臨床樣本
本發明所涉及的臨床樣本之取得均由高雄榮總研究倫理委員會所核准實施，核准IRB編號VGHKS19-CT3-16；臨床試驗同意書所載之條款均為受試者所閱覽並同意，包括預告外科手術及可能之併發症；所有樣本在分析前均匿名處理，並基於代碼ICD-9識別具有急性心肌梗塞(AMI)的研究結果；急性心肌梗塞(AMI)之發表係基於其初次診斷出具有急性心肌梗塞(AMI)之日期，以使急性心肌梗塞(AMI)發作日與其發表日相同；案例排除的條件包括有急性或慢性感染、發炎症狀、嚴重的肝腎失能、惡性腫瘤或血液腫瘤病變；缺血性心臟病(CAD)之患者進一步分為兩組：其一為未診斷出急性心肌梗塞(AMI)之患者，其二則為診斷出急性心肌梗塞(AMI)之患者，其中，該些樣本均由生物銀行(biobank)所衍生而得。
請見表1，其說明了所有受試者之人數及臨床特徵，並基於病理類型將缺血性心臟病(CAD)患者分為兩組：AMI(+)及AMI(-)，這當中其他變因諸如性別、年齡、糖尿病或高血壓等之間並無明顯區別。
表1
2.細胞培養
人類心肌細胞株AC16購自默克(Merck，產品編號#SCC109，特曼庫拉，美國加州)；細胞以含有青黴素(penicillin)、鏈黴素(streptomycin)及12.5%胎牛血清(FBS，Fisher Scientific)之DMEM/F12(Gene Direx Incorporation)培養於37℃、5% CO2之濕潤環境中；細胞每3至4天繼代培養一次，於下述實驗中所使用的細胞為繼代2至10次以內的細胞。
3.循環拉伸實驗
循環拉伸設備採用ATMS Boxer，其購自TAIHOYA Corporation(Taiwan,R.O.C.)，放置於37℃、5% CO2之培養箱中；循環拉伸設備具有培養腔(chamber)，其可使細胞種植於其內之聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)膜上；聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)膜上塗佈有一型膠原蛋白，並以每平方公分4×104個細胞之密度種植原型細胞於膜上；接著，設定循環拉伸條件為延展度5至25%、循環頻率0.5至2.0Hz，循環拉伸時間24小時。
4.免疫螢光染色測試
細胞以4%之多聚甲醛固定20分鐘，並以磷酸緩衝液PBS清洗，隨後放置於0.5%(v/v)之Triton X-100中達10分鐘；接著，以5%(w/v)之牛血清白蛋
白(bovine serum albumin，BSA)阻斷30分鐘，以磷酸緩衝液PBS清洗後，於4℃中與一級抗體共孵化(incubate)隔夜；於下述實驗例中分別使用了肌鈣蛋白I(Troponin I)抗體(GeneTex，GTX113028)、P-ERK抗體(Cell Signaling；CS4370S)、P-eNOSS633抗體(BD 612665)、SGLT1抗體(Abcam；ab14686)及SGLT2抗體(Abcam；ab85626)；在完成了與一級抗體雜交後，細胞進一步與Alexa螢光耦聯抗兔抗體或Alexa螢光耦聯抗鼠抗體(Jackson Immunoresearch)共孵化1小時，其稀釋倍率為1：1000；最後，以含有DAPI染劑之覆蓋液(Prolong® Diamond Antifade Mounting Medium containing DAPI，Life Technology)覆蓋並染色細胞，並以Olympus D71顯微鏡觀察分析細胞之免疫螢光染色狀態，放大倍率分別為100及200倍。
5.人類內皮糖蛋白(Endoglin)/CD105檢測
為了測量乙型轉化生長因子(transforming growth factor Beta，TGF-β)及內皮糖蛋白(Endoglin)之表現量，人類CD105 ELISA套組(Boster Biological Technology,CatEK0644)及人類TGF-b assay ELISA套組(Boster Biological Technology,CatEK0513)分別被用來檢測血清中CD105及TGF-β之表現量；該些檢測於血清之上清液取得後立即實施，或於細胞團塊(cell pellet)取得後立即實施；ELISA於96孔盤中進行，而吸光度設定為波長575奈米。
6.西方氏墨點法(Western blotting)
於細胞處理後以裂解液(lysis buffer)收集細胞裂解物(cell lysate)，並以Bio-rad定量套組(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)測定其蛋白質含量；細胞裂解物之蛋白質以SDS-PAGE進行解析，並轉漬到PVDF膜上與一級抗體雜合；於下述測試例及實驗例中，使用到Actin Antibody,clone C4(Merck Millipore,MAB1501)、p-ERKT202/Y204(Cell Signaling #4370)、T-ERK(Cell Signaling 9102)、p-GATAS262(Enogene Biotech；E11-0934A)、T-GATA4
(Proteintech；19530-1-AP)、Histone H3(Genetex；GTX122148)、α-tublin(Abcam；ab7291)等抗體，而免疫墨點訊號藉由ECL冷光顯影方法獲得影像。
7.統計分析
上述所有檢測均獨立實施至少3次，其統計結果以平均值±平均值標準誤差(mean±SEM)顯示；以學生t檢定之雙側用於比較以取得常態分佈數據之P值；P值小於0.05者視為統計上具有顯著意義，其中*為P<0.05，**為P<0.01，而***為P<0.001。
驗證例1：驗證生物標記CD105及TGF-β1與AMI病理性之相關性
如圖3A至3B所示，相較於AMI(-)患者，所有AMI(+)患者之血清TGF-β1及CD105含量均顯示有增加的情形；為了評估該模型的鑑別力，取自衍生樣本的模型被應用於測試樣本和驗證樣本，並進一步確定所有數據集的接受者操作特徵曲線(Receiver Operating Characteristic curve and area under the curve AUC，AUCROC)下的面積；如圖3C至3D所示，AUC顯示了TGF-β1及CD105均為具有鑑別力的AMI生物標記，其AUCROC分數分別達到0.701(P=0.01)及0.731(P=0.006)；於先前技術中已揭示了數個生化指標，用以偵測早期心肌損壞，其包括肌鈣蛋白I(Troponin I)、肌酸激酶(Creatine kinase)、肌酸激酶-MB(Creatine kinase-MB)。
在這些生化指標中，心臟肌鈣蛋白於AMI發作初期的48小時中與肌酸激酶-MB具有相同的靈敏度；基於該些指標物，AMI診斷可以最早在症狀發作的1.5至3小時內建立；為了進一步解釋TGF-β1及CD105的潛在機制，本發明人評估他們與肌鈣蛋白I(Troponin I)、肌酸激酶(Creatine kinase)及肌酸激酶-MB(Creatine kinase-MB)之間的相互關聯性，而具有出色性能和較短週期的新式檢測方法將使快速檢測心臟生物標記物的方法得以實現。
如表2所示，以斯皮爾曼等級相關係數(Spearman's rank correlation coefficient)分別評價CD105與肌鈣蛋白I(p=0.032)、肌酸激酶(p=0.014)及肌酸激酶-MB(p=0.003)之間的相關性，並顯示上述組合為高度正相關，而肌鈣蛋白I與肌酸激酶(p<0.001)及肌酸激酶-MB(p<0.001)同樣具備高度正相關性；另一方面，TGF-β1則未顯示出與肌鈣蛋白I、肌酸激酶及肌酸激酶-MB之間有顯著的相關性，這說明了TGF-β1及CD105這兩種細胞激素可以連結到AMI的病理性。
實施例1：拉伸誘導建立機械性壓力過載心肌細胞模型(I)
取心肌細胞AC16投入了循環拉伸測試中，並將拆分成延展度5%及25%兩組別，其中，延展度5%之組別係模擬正常生理狀態下心跳的拉伸延展度及頻率，而延展度25%之組別則模擬機械性壓力過載的條件；如圖4A至4B所示，在拉伸頻率為1.0Hz，拉伸時間為24小時及48小時，延展度25%之組別的心肌細胞生物標記物肌鈣蛋白I及CD105的蛋白質表現量顯著的高於延展度5%之組別；該些生物標記物在心肌細胞受損時會被釋放至血液循環中，而檢測血清或血漿中該些生物標記物的含量將有助於AMI之診斷；此外，肌鈣蛋白I為心肌壞死(myocardial necrosis)相當行之有效的生物標記物；肌鈣蛋白I以及CD105作為肌肉細胞的特徵生物標記物，同時也表現於心肌細胞株AC16；增量表現的肌鈣蛋白I以及CD105暗示著其肌細胞特徵出現了減少的現象。
為了檢驗機械性壓力過載之心肌細胞模型所具備的細胞生理特徵，於實施例1中進一步測試SGLT2及ERK活化之間的關聯度，以評估該模型用於SGLT2抑制劑之AMI治療藥效的測試潛力；為本領域所知，ERK除了作為應對
胞外訊息之胞內中介物，其活化對於心臟肥大及心衰竭進程具有關鍵作用；據此，本發明人檢驗上述機械性壓力過載心肌細胞模型是否顯示出SGLT2及ERK的活性提升；由圖5A可見，在48小時循環拉伸後，延展度25%組別之SGLT2及p-ERK的蛋白表現量，相較於延展度5%組別有顯著上升的情形。
如圖5B所示，由免疫螢光染色可見，在24小時循環拉伸後，延展度25%組別之細胞核內p-ERK及其所調節的轉錄活動也有顯著活化的情形；除此之外，如圖5C至5D所示，免疫螢光染色更顯示了，在24小時循環拉伸後，延展度25%組別相較於延展度5%之組別，其SGLT1及p-eNOS的表現量也有顯著上升的情形。
實施例2：拉伸誘導建立機械性壓力過載心肌細胞模型(II)
於實施例2中，具體細胞種類及拉伸條件與實施例1相同，惟其延展度25%之組別的拉伸頻率為1.5Hz；如圖6A所示，在24小時的循環拉伸後，延展度25%之組別的心肌細胞生物標記物肌鈣蛋白I及CD105的蛋白質表現量顯著的高於延展度5%之組別，同樣顯示其肌細胞特徵開始有減少的現象。
進一步地，藉由測試實施例2中細胞模型的SGLT1及SGLT2的活化程度以其用於SGLT2抑制劑之AMI治療藥效的測試潛力；由圖6B至6C可見，免疫螢光染色顯示了，在24小時循環拉伸後，延展度25%組別相較於延展度5%之組別，其SGLT1及SGLT2的表現量也有顯著上升的情形。
實驗例1：機械性壓力過載心肌細胞模型作為藥效測試平台之可行性評估
於實驗例1中，評估實施例1作為SGLT抑制劑用於AMI之藥效測試平台的可行性，其以25mM SGLT2抑制劑DAPA做為測試組，並以30mM ERK抑制劑PD98059作為陽性對照組；如圖7A至7C所示，實施例1所提供的機械性壓力過載心肌細胞模型，其延展度25%之組別細胞質中肌鈣蛋白I及CD105的蛋白
表現量均有顯著上升的情形，而在SGLT2抑制劑及ERK抑制劑的作用下，肌鈣蛋白I及CD105的蛋白表現量都顯著的下降，顯然透過抑制SGLT2及ERK的活化可以下調節肌鈣蛋白I及CD105的蛋白表現量，從而恢復心肌細胞的原有的肌細胞功能；此外，如表2所示，實驗例1也驗證了AMI與肌鈣蛋白I及CD105的胞內濃度之間有相當顯著的關聯性；並請參閱圖7D，在機械性拉伸所導致的心肌細胞受潛在機械性傷害的事件中，肌鈣蛋白I與CD105同樣有著顯著的相關性(p<0.001)。
請參閱圖8A至8E，以SGLT2抑制劑DAPA所處理的機械性壓力過載心肌細胞模型顯示了，活化之SGLT1/2、p-ERK及p-eNOS在SGLT2受到抑制後，其活性有顯著下降的情形，與ERK活性抑制所導致的效果相似，顯示了SGLT2抑制劑DAPA對於保存心肌細胞的收縮功能有所助益，也進一步驗證了機械性壓力過載心肌細胞模型作為AMI藥物測試平台的可行性。
本發明透過機械性壓力誘導心臟細胞成為機械性壓力過載細胞模型，其過量表現有壓力生物標記如乙型轉化生長因子(transforming growth factor Beta，TGF-β)、肌鈣蛋白I(Troponin I)及內皮糖蛋白(Endoglin/CD105)，可用於模擬CAD患者之心臟細胞狀態，並經SGLT2抑制劑驗證其具備做為心臟疾病藥物測試平台之條件，模型建立方法簡單，所需時間短，可預期用於大規模的藥物篩檢，利於新藥開發。
T:待測細胞
P:原型細胞
Sb:基體
P-Sb:原型細胞基體
F:機械力
Claims (10)
- 一種具有受機械性壓力細胞模型之藥效測試平台，其中，該受機械性壓力細胞模型包括一基體(Sb)及其上之一待測細胞(T)，其中，該待測細胞(T)表現有一壓力生物標記達一第一表現量，其中，該待測細胞(T)包括心臟細胞(cardiac cell)。
- 如請求項1所述之藥效測試平台，其中，該心臟細胞(cardiac cell)包含心臟肌纖維細胞(heart muscle fiber cell)、心臟平滑肌細胞(heart smooth muscle cell)、傳導細胞(conduction cell)、心房心肌細胞(atrial cardiomyocyte)或心室心肌細胞(ventricular cardiomyocyte)。
- 如請求項1所述之藥效測試平台，其中，該壓力生物標記包括乙型轉化生長因子(transforming growth factor Beta，TGF-β)、肌鈣蛋白(Troponin T)、肌鈣蛋白I(Troponin I)、肌酸激酶(Creatine kinase)、肌酸激酶-MB(Creatine kinase-MB)、肌紅蛋白(Myoglobin)、心房利鈉肽(Atrial Natriuretic Peptide，ANP)、心房利鈉肽訊號肽(Atrial Natriuretic Peptide Signal Peptide，ANP-SP)、乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase，LDH)、天冬氨酸轉氨酶(Aspartate aminotransferase)、心臟型脂肪酸結合蛋白(Heart-type Fatty Acid-Binding Protein，H-FABP)、細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)、磷酸化細胞外信號調節激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinases，p-ERK)、一型鈉依賴型葡萄糖共同運輸蛋白(Sodium-dependent glucose cotransporters，SGLT1)、二型鈉依賴型葡萄糖共同運輸蛋白(Sodium-dependent glucose cotransporters，SGLT2)、內皮一氧化氮合成酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、缺血修飾白蛋白(Ischemia modified albumin)、內皮素(Endothelin)、腎上腺髓質素(Adrenomedullin)、腎素(Renin)、血管緊張素(Angiotensin II)、內皮糖蛋白(Endoglin)或至少其中的二者。
- 如請求項1至3任一項所述之藥效測試平台，其中，該待測細胞(T)之製備方法(100)包括：接種處理(101)：接種一原型細胞(P)於該基體(Sb)上達一貼附時間以使該原型細胞(P)貼附於該基體(Sb)上以獲得一原型細胞基體(P-Sb)；及壓力處理(102)：實施一機械力(F)於該原型細胞基體(P-Sb)上達一壓力過載時間以使該原型細胞(P)轉型為該待測細胞(T)，其中，該機械力包括剪切力(shear force)、拉伸力(stretch force)或壓縮力(compress force)。
- 如請求項4所述之藥效測試平台，其中，該機械力(F)包括拉伸力，該壓力處理(102)更包括：以一循環頻率循環拉伸該原型細胞基體(P-Sb)達該壓力過載時間，於任一次循環拉伸步驟中，分別於該原型細胞基體(P-Sb)之兩端施以該拉伸力，以使該原型細胞基體(P-Sb)朝兩端延展達一延展度，並於達該延展度時，解除該拉伸力，其中，該壓力過載時間為0至48小時但不為0小時，該循環頻率為0.5至2.0Hz，該延展度為15至30%。
- 如請求項4所述之藥效測試平台，其中，該基體(Sb)更包括一基質塗層，設置於該原型細胞(P)及該基體(Sb)之間，其中，該基質塗層之材料包含明膠(gelatin)、一型膠原蛋白(type-I collagen)、二型膠原蛋白(type-II collagen)、纖維粘連蛋白(fibronectin)或層黏連蛋白(laminin)。
- 如請求項1至3任一項所述之藥效測試平台，其中，該待測細胞(T)未包含有編碼該壓力生物標記之外源性核酸片段。
- 一種藥效測試方法(200)，其包含：提供一如請求項1至3任一項所述之具有受機械性壓力細胞模型之藥效測試平台；接觸該待測細胞(T)以一待測藥物達一測試時間以使該待測細胞(T)轉型成一受測細胞(Td)；測量該受測細胞(Td)中該壓力細胞標記之表現量為一第二表現量；及比較該第一表現量及該第二表現量，若該第一表現量與該第二表現量之比值大於1，評估該待測藥物具有藥效，若該第一表現量與該第二表現量之比值小於或等於1且大於0，評估該待測藥物不具藥效。
- 如請求項8所述之方法，其中，該待測細胞未包含有編碼該壓力生物標記之外源性核酸片段。
- 如請求項8所述之方法，其中，該待測細胞(T)之製備方法(100)包括：接種處理(101)：接種一原型細胞(P)於該基體(Sb)上達一貼附時間以使該原型細胞(P)貼附於該基體(Sb)上以獲得一原型細胞基體(P-Sb)；及壓力處理(102)：以一循環頻率循環拉伸該原型細胞基體(P-Sb)達該壓力過載時間，於任一次循環拉伸步驟中，分別於該原型細胞基體(P-Sb)之兩端施以該拉伸力，以使該原型細胞基體(P-Sb)朝兩端延展達一延展度，並於達該延展度時，解除該拉伸力，其中，該壓力過載時間為12至24小時，該循環頻率為0.8至1.8Hz，該延展度為20至25%。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 期刊 Wong et al Mechanical stretching simulates cardiac physiology and pathology through mechanosensor piezo1 Journal of Clinical Medicine 7(11) 2018 p410-p454 * |
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