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ES2342453T3 - Procedimiento de amplia aplicacion para identificar moduladores de receptores acoplados a la proteina g. - Google Patents

Procedimiento de amplia aplicacion para identificar moduladores de receptores acoplados a la proteina g. Download PDF

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ES2342453T3
ES2342453T3 ES01951650T ES01951650T ES2342453T3 ES 2342453 T3 ES2342453 T3 ES 2342453T3 ES 01951650 T ES01951650 T ES 01951650T ES 01951650 T ES01951650 T ES 01951650T ES 2342453 T3 ES2342453 T3 ES 2342453T3
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Sanofi Aventis Deutschland GmbH
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Abstract

Procedimiento para la identificación de un compuesto químico que modifica la acción de al menos una vía de transducción de señales dependiente del receptor acoplado a la proteína G (GPCR) de un organismo biológico, en donde dicho procedimiento contiene las siguientes etapas de procedimiento: a) preparación de al menos una célula que contiene al menos una vía de transducción de señales dependiente de un GPCR, en donde se prepara una o más de una proteína G; b) preparación de al menos un compuesto químico por ensayar; c) puesta en contacto de una célula de acuerdo con a) con un compuesto químico por ensayar de acuerdo con b); d) determinación del efecto cuantitativo o cualitativo de un compuesto químico por ensayar de b) sobre la vía de transducción de señales de una célula de a) por medio de una señal medible dependiente de la vía de transducción de señales, caracterizado porque al menos una proteína G está seleccionada de -6qi4myr o -6qs5myr, en donde "-6qi4" significa que la subunidad α de la proteína G de la clase Gαq lleva una deleción N-terminal de 6 aminoácidos y presenta en el término C una secuencia αi, y en donde "6qs5" significa que la subunidad α de la proteína G de la clase Gαs lleva una deleción N-terminal de 6 aminoácidos y que presenta en el término C una secuencia αs, y "myr" significa que la correspondiente proteína G en el término amino presenta una secuencia de reconocimiento de miristoilación/palmitoilación MGCC en lugar de la secuencia específica de Gαq MACC.

Description

Procedimiento de amplia aplicación para identificar moduladores de receptores acoplados a la proteína G.
La invención se refiere a un procedimiento de amplia aplicación para identificar compuestos químicos que modulan la proteína G de receptores acoplados, por medio de nuevas proteínas híbridas G con una especificidad de receptores muy amplia, así como a compuestos químicos que se pueden identificar por medio de tal procedimiento.
Los receptores acoplados a la proteína G (GPCR, por sus siglas en inglés) juegan un papel importante en una pluralidad de procesos fisiológicos. Representan una de las familias de proteínas más importantes conocidas hasta ahora y se supone que en el genoma humano aproximadamente 1000 genes codifican esta clase de receptores. Los GPCR tienen una estructura característica: Se trata de cadenas peptídicas que se enrollan siete veces en forma de hélices \alpha a través de la capa doble de fosfolípido de la membrana celular, disponiéndose en forma circular. Se estima que aproximadamente el 60% de los medicamentos con venta bajo receta, actualmente disponibles, se unen con los GPCR. Esto destaca el papel importante de esta clase de receptores para la industria investigadora de medicamentos.
Todos los receptores acoplados a la proteína G funcionan según un modelo básico común: La unión de un ligando extracelular lleva a una modificación de la conformación de la proteína del receptor de modo que puede tomar contacto con una proteína G. Las proteínas G ubicadas del lado citoplasmático de la membrana plasmática son los mediadores de la señal extracelular en el interior de la célula y allí pueden provocar diversas reacciones.
Los GPCR representan las proteínas blanco terapéuticas hasta ahora más significativas. Estimativamente, el 40% de los medicamentos prescriptos por el médico actúan como agonistas o antagonistas de los GPCR. En virtud del tamaño y la importancia de la familia de proteínas y en vista al hecho de que para muchos GPCR aún no se conocen pares de unión químicos (GPCR huérfanos), se ha de partir del hecho de que esta clase de receptores será en un futuro uno de los reservorios más importantes para proteínas blanco apropiadas en la búsqueda de nuevos medicamentos.
Los GPCR son proteínas de membrana integrales. Transmiten una señal mediada por una sustancia de señal mayormente hidrofílica que se une en el lado exterior de la célula a través de una familia de proteínas de unión a guanina-nucleótido, llamadas proteínas G, hacia el interior de la célula. En este caso, se desencadenan, en función de la especificidad del receptor y de las proteínas G activadas de esta manera, diversas vías de transducción de señales. Según el tipo de receptor, se producen diversos efectos que tienen como consecuencia la formación de "second messengers". De esta manera, se puede elevar el nivel de cAMP intracelular a través de la activación de una adenilato-ciclasa en posición de membrana o bien se puede reducir en caso de una inhibición. La estimulación de una fosfodiesterasa específica de cGMP puede llevar a la reducción del nivel de cGMP. Por otra parte, la proteína G activada a través de la unión con un canal iónico puede llevar, por ejemplo, al aumento de iones Ca^{2+} o K^{+}. Además, a través de una proteína G activada puede producir la activación de una fosfolipasa y, así, la formación de inositol-1,4,5-trisfosfato y diacilglicerol. A su vez, llevan al aumento de Ca^{2+} o a la activación de una proteína quinasa C, con otros efectos en ambos casos. Los second messengers son moléculas mensajeras intracelulares como, por ejemplo, cAMP, cGMP, Ca^{2+} u otras, que desencadenan reacciones en la célula a través de la activación o desactivación de proteínas intracelulares.
Las proteínas G heterotrímeras se encuentran en la cara interna de la membrana plasmática. Están compuestas por las tres subunidades \alpha, \beta y \gamma. Un receptor activado entra en contacto con el heterotrímero de la proteína G que, consiguientemente, lo disocia en una subunidad alfa y un complejo beta-gamma. Tanto la subunidad alfa activada como el complejo beta-gamma pueden influir sobre las proteínas efectoras intracelulares. La familia de la subunidad \alpha de la proteína G se clasifica actualmente en cuatro clases diferentes (clase G\alphas, G\alphai, G\alphaq y G\alpha12). Los GPCR se clasifican según la proteína G incorporada en la transducción de señales.
Es decir, los GPCR de la clase Gs median, a través de la activación de G\alphas, la estimulación de la adenilciclasa y elevan la concentración intracelular de AMPc.
Los GPCR de la clase Gi median a través de la activación de G\alphai una inhibición de la clase de adenilato y reducen los GPCR de cAMP intracelular de la clase Gq que median a través de una activación de G\alphaq una estimulación de distintas isoformas de PLC\beta y llevan a una hidrólisis de fosfatidil-inositol-4.5-bisfosfato en posición de membrana en diacilglicerol y trifosfato de inositol (IP3). IP3 libera Ca^{2+} a partir de los depósitos intracelulares.
La mayoría de los GPCRs puede entrar en contacto solamente con una subunidad alfa de la proteína G, es decir, poseen selectividad para una vía determinada de transducción de señales. A los fines de desarrollar un procedimiento con cuya ayuda se han de identificar compuestos químicos que modulan las vías de transducción de señales dependientes de GPCR, esta estrecha especificidad es muy embarazosa. Más allá de ello, tales vías de transducción de señales proporcionan sólo una señal apropiada que se puede aprovechar en un tipo de ensayo con alto rendimiento de muestras (= High Throughput Screening = HTS)), en las que, por ejemplo, la activación de la proteína G lleva al aumento del nivel intracelular de Ca^{2+}.
Es posible construir estas proteínas G con especificidad modificada para los receptores y diferente fijación a una vía de transducción de señales mediante la unión de componentes de distintas proteínas G a proteínas G híbridas, a través de métodos de biología molecular y bioquímica.
Las proteínas G híbridas son construcciones de fusión, que unen en el interior de una proteína secuencias de diferentes subunidades G\alpha. De esta forma, por ejemplo, se puede fabricar un híbrido G\alphaq/i a través de la fusión de la región de reconocimiento del receptor de G\alphai con la región de activación del efector de G\alphaq, capaz de captar señales de receptores acoplados a Gi, pero que conecte la vía de transducción de la señal de G\alphaq-PLC\beta. Conklin et al., Nature 363, 274276 (1993) describieron por primera vez un híbrido de este tipo, en el que los 5-aminoácidos C-terminales de G\alphaq habían sido sustituidos por la correspondiente secuencia G\alphai (G\alphaiq5).
Este "reacoplamiento" de receptores tiene la ventaja de que se puede acceder de manera más sencilla al parámetro final del ensayo (elevación de la concentración intracelular de Ca^{2+}, comparada con la inhibición de la adenilato-ciclasa) mediante procedimientos técnicos de medición, y se puede utilizar en la Exploración de Alto Rendimiento.
Sin embargo, es desventajoso en estos constructos de fusión G\alphaq/G\alphai que algunos GPCR como, pj, el receptor SSTR1 no puedan activar qi5 (Conklin et al., Mol. Pharmacol. 50, 885-890 (1996)).
Asimismo, se describieron constructos de fusión entre G\alphaq y G\alphas. También ellos poseen la desventaja de que no todos los receptores acoplados a Gs como, por ejemplo, el receptor adrenérgico \beta2 o el receptor de dopamina D1 se pueden unir con la vía de transducción de señales de PLC\beta.
Además de las modificaciones C-terminales para la modificación de la unión de receptores a determinadas vías de transducción de señales, se describió una modificación N-terminal de G\alphaq que lleva a una promiscuidad de receptores. Por promiscuidad de receptores, se ha de entender en este caso la capacidad de una proteína G de poder captar y transmitir señales de distintos receptores. Se trata de una proteína G\alphaq en la que se suprimió la región que comprende 6aa N-terminal altamente conservada; (Kostenis et al., J. Biol. Chem. 272, 19107-19110 (1997)). Esta supresión permite a Gq resultante (también denominado -6q) recibir no sólo señales de Gq, sino también de receptores acoplados con Gs o Gi/o y de transmitirlas a PLC\beta.
Esta subunidad G\alpha comprende ahora también receptores como el receptor de SSTR1-somatostatina, el receptor de dopamina D1 y el receptor adrenérgico \beta2. Sin embargo, el receptor edg5 también puede no estar comprendido por esta proteína G. Más allá de ello, la intensidad de las señales de esta proteína G es tan débil que en la práctica no se puede usar (Kostenis et al., J. Biol. Chem. 272, 19107-19110 (1997)).
Además, se conoce con G\alpha16 una subunidad G\alpha que une los GPCR de distintas clases funcionales con la vía de transducción de señales de PLC\beta-Ca^{2+}. Prácticamente se trata de una proteína G no selectiva por naturaleza. Pero también esta subunidad no es empleable de modo universal, porque los receptores como el receptor edg5 o el receptor de SSTR1-somatostatina no se acoplan o sólo se acoplan débilmente con G\alpha16. Por este motivo, sería de gran utilidad si una proteína G estuviese a disposición, la cual se pudiese activar por medio de otras clases funcionales de los GPCR y, más allá de ello, pudiese dar en la célula una señal suficientemente potente que pudiera utilizarse en un ensayo en especial un ensayo de High Throuhput para la identificación de compuestos que modulan los GPCR y/o las vías de transduc-
ción de señales dependientes, como, por ejemplo, el aumento o la reducción de la concentración intracelular de Ca^{2+}.
Los documentos WO 97/48820 y WO 99/05177 describen ahora procedimientos para la identificación de un modulador de un GPCR, en los que se emplean proteínas \alpha mixtas, por ejemplo, de acuerdo con el documento WO 99/05177, una proteína \alpha mutada de la clase Gq.
El objeto de la presente invención consiste, en consecuencia, en poner a disposición otras proteínas G híbridas para el procedimiento de screening para identificar compuestos químicos que se caracterizan porque presentan una especificidad muy amplia en cuanto a los GPCR reconocibles y estas proteínas G se acoplan a una vía de señales que lleva a un aumento de la concentración intracelular de Ca^{2+}. Adicionalmente, se expresan tan alto que se mejora la intensidad de las señales.
La invención se refiere a un procedimiento para la identificación de un compuesto químico que modifica la acción de al menos una de las vías de transducción de señales de un organismo biológico dependiente de un receptor acoplado a la proteína G (GPCR),
en donde dicho procedimiento contiene las siguientes etapas de procedimiento:
a)
Preparación de al menos una célula que contiene al menos una vía de transducción de señales dependiente de un GPCR, en donde se prepara una o más de una proteína G;
b)
Preparación de al menos un compuesto químico por ensayar;
c)
Puesta en contacto de una célula de acuerdo con a) con un compuesto químico por ensayar de acuerdo con b);
d)
Determinación del efecto cuantitativo o cualitativo de un compuesto químico por ensayar de b) sobre la vía de transducción de señales de una célula de a) por medio de una señal medible dependiente de la vía de transducción de señales,
caracterizado porque al menos una proteína G está seleccionada de -6qi4myr o -6qs5myr.
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La modificación de la acción de al menos una de las vías de transducción de señales dependiente de un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) de un organismo biológico puede resultar inhibidora o estimulante. Una acción inhibidora de un compuesto químico está presente cuando la señal medible dependiente de la vía de transducción de señales se produce más débilmente en presencia del compuesto químico que cuando se deja de lado. Los compuestos que producen tal efecto también se denominan antagonistas. Por otra parte, hay una acción estimulante de un compuesto químico cuando la señal medible dependiente de la vía de transducción de señales es más potente que cuando se deja de lado el compuesto químico. Estos compuestos también son denominados agonistas.
El procedimiento se basa en una forma de ejecución preferida de una célula, en donde al menos se producen dos proteínas G. Estas proteínas G pueden depender de uno o de diferentes GPCR. Básicamente, se utilizan para la realización del procedimiento todas las proteínas G apropiadas sin tener en cuenta su especificidad receptora, su secuencia, su estructura, el origen respecto de célula, tejido u órgano o respecto de la especie para la que son específicas. Con preferencia, se prepara en la célula al menos una proteína G proveniente de -6qi4myr, -6qs5myr, -6qi4, -6qs5. En el caso de las proteínas G -6qi4myr, -6qs5myr, -6qi4, -6qs5, se trata de proteínas G híbridas que se formaron por partes de diferentes proteínas G de ratón y que, en algunos casos, contienen modificaciones adicionales. Las proteínas G pueden ser producidas por la célula de forma individual o en combinación. En especial, por la célula se puede producir, independientemente de las proteínas G híbridas recién mencionadas, también Galpha16. Cada una de las proteínas G puede estar presente de forma individual o en combinación con una o varias otras proteínas G en una célula. La preparación de Galpha16 en una célula siempre se debe llevar a cabo de modo tal que se nunca se produzca sola sino en combinación con otra de las proteínas G antes mencionadas.
Las secuencias de aminoácidos de las proteínas G se publican para G\alphaq en Seq ID Nro. 2, para -6qi4myr en Seq ID Nro. 4, para -6qi4 en Seq ID Nro. 6 y Seq ID Nro. 8 y para Galpha16 en Seq ID Nro. 10.
La puesta a disposición de un compuesto químico se realiza usualmente en forma disuelta. Con preferencia, para la solución del compuesto químico se usa agua. La solución puede contener, además del disolvente, sustancias tampón, sales o excipientes como solubilizantes, detergentes, conservantes u otros.
La puesta en disposición de una célula comprende su producción, cría y posterior procesamiento. La puesta a disposición se realiza, por ejemplo, por preparación de un material celular apropiado de órganos o tejidos o por reproducción de líneas celulares o microorganismos apropiados. Para la cría, se pueden usar diferentes medios nutrientes apropiados. Las células se mantienen a la temperatura óptima para el organismo. Eventualmente, se añade al medio de crecimiento utilizado en cada caso conservantes, antibióticos, indicadores del pH, componentes de suero sanguíneo, suero sanguíneo, excipientes u otros. Los procedimientos para la preparación, cría y posterior procesamiento se describen en obras estándar. (Ejemplo: Basic Cell Culture; Ed. J.M. Davis; IRL Press; 1994).
En el procedimiento previamente descrito, se pone a disposición, en formas de realización preferidas, la célula de una especie de vertebrado, una especie de insecto, un C. elegans o una levadura. En formas de realización de especial preferencia, se pone a disposición la célula de una célula de HeLa, 293, COS, CHO o Saccharomyces cerevisiae.
Para la determinación del efecto cuantitativo o cualitativo de un compuesto químico por ensayar sobre la vía de transducción de señales de una célula de una señal medible dependiente de la vía de transducción de señales, se usará en una forma de realización preferida la concentración intracelular de Ca^{2+}. La modificación de la concentración intracelular de Ca^{2+} se puede comprobar, por ejemplo, por uso de aequorina, un colorante o la tecnología FLIPR^{TM} de la empresa "Molecular Devices".
Los procedimientos previamente descritos se pueden usar en una forma de realización preferida para la identificación de un medicamento.
Los compuestos químicos que modifican la acción de al menos una de las vías de transducción de señales dependiente de un receptor acoplado con una proteína G (GPCR) de un organismo biológico se pueden identificar por medio de al menos un procedimiento de esta invención. Estos compuestos químicos podrían comprender, por ejemplo, transformaciones respecto de la estructura química de sustancias señal hidrofílicas, que inducen GPCR, como determinadas hormonas, aromatizantes, determinados medicamentos.
La presente revelación se refiere, además, a una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido con la propiedad de una proteína G, en donde el polipéptido está seleccionado de una de las siguientes secuencias:
a)
un polipéptido con una secuencia de aminoácidos según la Seq ID Nro. 2, Seq ID Nro. 4, Seq ID Nro. 6 o Seq ID Nro. 8;
b)
un polipéptido según a), al que le faltan uno o varios aminoácidos;
c)
un polipéptido según a), al que se la añaden uno o varios aminoácidos;
d)
una variante alélica del polipéptido según a).
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Las variantes alélicas comprenden todos los polipéptidos que resultan de la composición de bases de la forma característica del gen en el locus del gen definido para las parejas proporcionales de las proteínas híbridas.
La revelación se refiere, además, a un polinucleótido que contiene una secuencia de polinucleótidos, en donde la secuencia de polinucleótidos se selecciona de una de las siguiente secuencias:
a)
una secuencia de polinucleótidos según la Seq ID Nro. 1, Seq ID Nro. 3, Seq ID Nro. 5 o Seq ID Nro. 7 o su correspondiente secuencia complementaria;
b)
una secuencia de polinucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de polinucleótidos según a).
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La rigurosidad de una solución se determina por medio de su temperatura y contenido de sal. Con la rigurosidad, se puede regular la dimensión de los pares de bases de dos secuencias homólogas de nucleótidos. La rigurosidad depende de la longitud y la composición de las bases de un polinucleótido. Las condiciones de rigurosidad en el sentido de esta invención existen cuando la secuencia de polinucleótidos y la secuencia hibridante presentan una concordancia del 95% o más.
Una forma de realización preferida de una secuencia de polinucleótidos o de un polinucleótido tal como se describió previamente es un polinucleótido que es componente de una construcción de vector recombinante. Las construcciones de vector recombinante se pueden generar con la ayuda de los conocimientos científicos pertinentes, tal como se reflejan, por ejemplo, en "F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York". En este caso, se incorpora un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos según una de las informaciones de secuencia descritas previamente (Seq ID Nro. 2, 4, 6, 8) o una secuencia de polinucleótidos de acuerdo con una de las informaciones de secuencia descritas previamente (Seq ID Nro. 1, 3, 5, 7) en un vector de base. Como vector de base se entiende un vector en el cual se puede incorporar una secuencia de polinucleótidos de un polinucleótido, por medio de los métodos de la biología molecular, clonándolo entonces en un microorganismo, por ejemplo, una bacteria, hongo o en las células de un cultivo celular. El vector básico puede estar compuesto, por ejemplo, por un plásmido con un marcador de resistencia a un antibiótico, un "origin of replication" ("origen de replicación") apropiado para la multiplicación del plásmido en bacterias o cultivos celulares, así como un promotor adecuado para la expresión de una proteína. El vector básico puede estar formado, por ejemplo, también por un vector fago, un fagómido, un fásmido, un cósmido, un vector vírico, un vector YAC u otro tipo de vector. Ejemplos de vectores básicos son pUC 18, pUC19, pBluescript, pKS, pSK y otros. La introducción del polinucleótido que se debe incorporar se lleva a cabo a través de puntos de corte de restricción por medio de las correspondientes enzimas de restricción, comercializadas por compañías tales como BioLabs, Roche Diagnostics, Stratagene y otras. Estos puntos de corte de restricción pueden ser, por ejemplo, los puntos de reconocimiento de las enzimas de restricción BamHI, EcoRI, SalI, EcoRV
y otras.
En una forma de realización preferida, la construcción del vector recombinante se compone de un vector de expresión utilizable en eucariotas y/o procariotas. Un vector de expresión contiene un promotor que puede estar unido funcionalmente con una secuencia de polinucleótidos, de modo que se puede sintetizar una proteína codificada por esta secuencia de polinucleótidos en un organismo biológico, por ejemplo, una bacteria, hongo o en las células de una línea celular eucariota. El promotor puede ser inducible, por ejemplo, por triptófano, o puede ser constitutivo en su actividad. Ejemplos de vectores de expresión son pUC18, pUC19, pBluescript, pcDNA3.1 u otros.
La presente revelación se refiere también a una célula huésped que puede contener un polinucleótido o una construcción de vector recombinante descrita como con anterioridad. La célula huésped está compuesta, en una forma de realización preferida, de una célula humana. En otras formas de realización preferidas, la célula huésped está compuesta por una especie vertebrada, una especie de insecto, un C. elegans, una bacteria o una levadura. En formas de realización de muy especial preferencia, la célula está compuesta por una célula HeLa, 293, COS, CHO, la célula de un Escherichia coli o de las células de un Saccharomyces cerevisiae. Más allá de ello, también se pueden usar células eucariotas, en especial, líneas celulares, bacterias, en especial Bacillus spec., Streptomyces spec. u hongos, en especial Penicillium spec, Aspergillus spec.
La revelación se refiere también a la preparación de una célula huésped descrita como con anterioridad por introducción de un polinucleótido de acuerdo con una o varias de las secuencias de polinucleótidos tal como se describe en la Seq ID Nro. (1-8) o una de las construcciones de vectores recombinantes caracterizadas como con anterioridad en una célula eucariota o procariótica. La introducción de las secuencias de polinucleótidos se puede realizar, por ejemplo, por electroporación o transformación de las células eucariotas o procariotas con la secuencia de polinucleótidos, además por precipitación de fosfato de Ca^{2+} de las células eucariotas o procariotas junto con la secuencia de polinucleótidos u otros métodos.
Una célula huésped de este tipo se puede usar para realizar un procedimiento de esta invención descrito previamente.
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Más allá de ello, la presente revelación se refiere a un procedimiento para la preparación de una proteína compuesta por una secuencia de aminoácidos seleccionada de una de las secuencias Seq ID Nro. 2, Seq ID Nro. 4, Seq ID Nro. 6, Seq ID Nro. 8 que contiene las siguientes etapas de procedimiento:
a)
preparación de una célula huésped que contiene una correspondiente secuencia de polinucleótidos y se prepara tal como se describió precedentemente;
b)
cultivo de esta célula huésped en un medio de crecimiento apropiado para la célula huésped, así como eventualmente la inducción de la expresión de la proteína;
c)
obtención del material celular y descomposición de las células;
d)
separación de una proteína por medio de métodos bioquímicos para la purificación de las proteínas.
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Para la preparación y la purificación de las proteínas designadas, se pueden utilizar correspondientemente métodos conocidos tal como se describen en "F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley &Sons, New York".
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Ejemplos Ejemplo 1 Activación de una vía de transducción de señales por medio de la mutante de de proteína G\alpha -6q a través de distintos receptores
Se cultivaron células COS7 en DMEM (medio Eagle modificado con Dulbecco) con adición de 10% de FCS (suero fetal de ternero) a 37ºC (5% de CO_{2}). Para las transfecciones, se sembraron 1 x 10^{6} células en placas de 100 mm. Aprox. 24 h más tarde, se cotransformaron las células con los plásmidos de expresión \alphaq o -6q (1 \mug de ADN/placa de 100 mm) y en cada caso uno de los siguientes constructos de receptores (4 \mug de ADN/placa de 100 mm): M2 (receptor muscarínico en pCD), D2 (receptor de dopamina en pCDNAI), kappa (receptor de opioides en pCDNA3), SSTR1 (receptor de somatostatina en pCMV), A1 (receptor de adenosina en CDM7), D1 (receptor de dopamina en pCDNAI), V2 (receptor de vasopresina en pCD-ps), \beta2 (receptor adrenérgico en pSVL).
Aprox. 24 h después de la transfección, se dividieron las células en placas de 6 cavidades en porciones iguales y se añadieron en DMEM 3 \muCi/ml de [^{3}H]mio-inositol (20 Ci/mmol). Después de incubar durante 24 horas, las células se incubaron a temperatura ambiente con HBSS (+ 10 mM de LiCI) durante 20 min. Luego se estimularon las células durante una hora con los correspondientes agonistas y se determinó el incremento de los monofosfatos de inositol intracelular por cromatografía de intercambio aniónico.
A los mutantes de proteína G\alpha -6q les faltan en comparación con la secuencia de tipo salvaje los seis restos de aminoácidos altamente conservados del extremo aminoterminal. Los resultados se obtuvieron a continuación con la construcción de la proteína G\alpha -6q. La preparación de tales mutantes o de los constructos receptores utilizados se realizó con ayuda de métodos estándar de la biología molecular tal como se describió exhaustivamente, por ejemplo, en "F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York".
Se incubaron células COS7 que expresan WTq o -6q y distintos receptores acoplados con Gi/o (A) o Gs (B) durante 1 h (37ºC) en presencia y en ausencia de los correspondientes agonistas (ver más abajo). El aumento de la concentración intracelular de IP1 se midió como en el protocolo 1 adjunto. Los datos representan valores medios + D.E. de 3-7 experimentos independientes, en cada caso, ejecutados como determinaciones triples. Los siguientes ligandos fueron utilizados: A m2 (receptor muscarínico): carbacol (100 \muM); D2 (receptor de dopamina): (-)-Quinpirol (10 \muM); kappa (receptor de opioides): (-)-U50488 (10 \muM); SSTR1 (receptor de somatostatina): somatostatina 14 (1 \muM); B, A1 (receptor de adenosina): R(-)-PIA (10 mM);
B D1 (receptor de dopamina): dopamina (1 mM); V2 (receptor de vasopresina): AVP (1 nM); \beta2 (receptor adrenérgico): (-)-isoproterenol (200 \muM).
Se comprobó que la mutante de proteína G\alpha -6q estimula una formación de IP1 en función de distintas clases de receptores. 1P1 es una molécula señal que se produce en la vía de transducción de señales PLC-\beta y que lleva en el curso ulterior de la transmisión de señales a un aumento de la concentración intracelular de Ca^{2+}. La liberación de IP1 por medio del constructo de -6q resulta tanto con receptores acoplados a Gi/o (A: m2, D2, k-OR, SSTR1, A1) como también a Gs (B: D1, V2, \beta2).
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Ejemplo 2 Preparación de mutantes altamente expresadas de proteínas G\alpha con amplia especificidad por receptores
Primero se construyen subunidades \alpha de proteína G híbrida a las que les faltan los seis aminoácidos altamente conservados del término amino y que presentan al mismo tiempo en el término C ya sea una secuencia \alphai o \alphas. Respecto de la secuencia \alphai o \alphas contenida, la denominación resulta como -6qi4 o -6qs5. El constructo -6qi4 une los receptores acoplados a Gs como a algunos Gi/o con la vía de transducción de señales de PLC\beta. Estos receptores comprenden también el receptor SSTR1 o edg5. El receptor edg5 no se puede unir con G\alpha16 a la vía de transducción de señales de PLC\beta. G\alpha16 es una proteína G con amplia especificidad por receptores que está revelada en el documento WO 97/48820 (título: Promiscuous G-protein compositions and their use).
El constructo -6qs5 une los receptores Gi/o- así como receptores adicionales acoplados a Gs con la vía de transducción de señales de PLC\beta y comprende también receptores como el receptor de dopamina D1 o el receptor \beta2 adrenérgico.
Una combinación de estas dos subunidades \alpha de la proteína G en una línea celular comprende así un amplio espectro de GPCR como toda subunidad por sí misma o G\alpha16.
La aplicabilidad en procedimientos técnicos de screening se podría mejorar si se aumentara la expresión de estas subunidades G\alpha (-6qi4; -6qs5), porque, de esa manera, también se podría lograr una señal más potente.
Por este motivo, se incorporaron secuencias de reconocimiento adicionales de miristoilación/palmitoilación en el área aminoterminal de las subunidades G\alpha. Esto llevó a la construcción de las proteínas G -6qi4myr y -6qs5myr. La secuencia proteica de -6qi4myr y -6qs5myr respecto del término amino es MGCC a diferencia de MACC de la secuencia inicial de las variantes 6q. Los nuevos constructos -6qi4myr y -6qs5myr contienen ahora una secuencia de consenso para la miristoilación/palmitoilación. -6qi4myr se preparó de -6qi4 y -6qs5myr se preparó de -6qs5. Se sabe que la separación de restos de miristilo o palmitilo en proteínas G llevan a una distribución en la célula: la pérdida de restos de palmitato o miristato influyen sobre el modelo de expresión de las proteínas G de modo que la eliminación del resto de ácido graso tiene como consecuencia una localización principalmente citosólica. Las subunidades \alpha de proteína G se hallan tanto en la membrana celular como también en el citosol. Sin embargo, sólo las proteínas G en posición de membrana pueden seguir conduciendo las señales de los GPCR en los efectores intracelulares. Sólo eran conocidas las consecuencias de la eliminación de una secuencia de consenso para la palmitoilación/miristoilación por mutación. Por el contrario, no era conocido que la introducción del sitio de consenso adicional para la miristoilación/palmitoilación en las mutantes de deleción G\alpha lleva al aumento de la expresión. Se pudo demostrar que la introducción de sitios adicionales de palmitoilación/miristoilación aumenta la cantidad expresada en la membrana celular de la subunidad G\alpha. En el Westernblot de SDS-PAGE (Westernblot por electroforesis de gel de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida) se ha de reconocer que la expresión de -6qi4myr en comparación con -6qi4 está claramente aumentada. Un Westernblot de SDS-PAGE de un fraccionamiento en una fracción particulada (p; con contenido de membranas) y fracción soluble (s; sc) de qwt y -6qi4myr muestra que la variante más miristoilada/palmitoilada -6qi4myr sólo está contenida en la fracción particulada.
20 \mug de proteínas de membrana se prepararon para ello a partir de células transfectadas COS7, se separaron por electroforesis de gel SDS-PAGE (10%) y se analizaron por medio de análisis Westernblot usando el anticuerpo monoclonal 12CA5 (Roche Biosciences).
Todas las subunidades \alpha de proteína G se detectaron con el anticuerpo monoclonal 12CA5 (acoplado con peroxidasa de rábano picante), que está dirigido contra el rótulo de epitopo HA. El rótulo HA está contenido en todos los constructos de proteína G. En qwt qi5, reemplaza a los aminoácidos 125-130, en las proteínas G suprimidas N-terminales (-6q, -6qi4, -6qi4myr), los aminoácidos 119-124. 20 \mug de proteína de membrana, preparados a partir de células transfectadas de COS7, se separaron por medio de electroforesis de gel SDS PAGE, se sometieron a blot en nitrocelulosa y se detectaron las subunidades \alpha de proteína G con el anticuerpo 12CA5. Las proteínas G inmunorreactivas se hicieron visibles con un sistema de quimioluminiscencia (Amersham).
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Ejemplo 3 Estimulación de distintas proteínas G\alpha altamente expresadas con amplia especificidad por receptores a través de diferentes receptores
Se ensayó la estimulación de las variantes de G\alpha altamente expresadas -6qs5myr y -6qi4myr por medio de diferentes receptores. Se reconoció que -6qi4myr (=\Delta6qi4myr) se conecta por medio de receptores acoplados a Gi/o (por ejemplo, dopamina D2, edg5, CCR5, SSTR1, KOR) a la vía de transducción de señales de PLC\beta y lleva a una alta señal que es proporcional a la liberación de Ca^{2+}. Como controles, se utilizaron un constructo de vector, así como la proteína G\alpha16 (+16). Se mostró que los receptores acoplados a Gs se unen por medio de -6qs5myr (=\Delta6qs5myr) a la vía de transducción de señales de PLC\beta. Como referencia también sirve aquí la proteína G G\alpha16.
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Para la determinación experimental del Ca^{2+} liberado por medio del sistema de aequorina, se cotransfectaron células CHO con el plásmido de expresión de apoaequorina cytAEQ/pCDNAI, el receptor de ADN indicado (SSTR1, KOR, D2, D1, beta2), así como las subunidades \alpha de la proteína G G16 y -6qi4myr utilizando lipofectamina. Después de incubar durante 10 horas en medio OPTIMEM, se lavaron las células una vez con medio RPMI 1640 y se incubaron con 5 \muM de coelenterazina f en RPMI 1640 durante 2 h a 37ºC. Luego se lavaron las células dos veces con PBS y se estimularon con los correspondientes agonistas de receptores: somatostatina 14 para el receptor SSTR1, U50488 para el receptor de kappa opioides, (-)-Quinpirol para el receptor de dopamina D2, dopamina para el receptor de dopamina D1 e isoproterenol para el receptor beta2. La estimulación del agonista de los receptores acoplados a Gi/o (SSTR1, KOR, D2) y los receptores acoplados a Gs (D1, beta2) lleva a la activación de las proteínas G G16, así como -6qi4myr con posterior estimulación de PLC\beta y liberación intracelular de Ca. La unión de Ca con el complejo de apoaequorina-coelenterazina lleva a emisión de luz que se midió con un luminómetro (TOPCount, Hewlett Packard).
Resumen de los resultados:
1.
Alineación de las áreas aminoterminales de distintas proteínas G\alpha.
2.
Estimulación de la vía de transducción de señales de PLC\beta por medio de la variación proteica -6q-G\alpha por receptores acoplados a Gi/o (A) y receptores acoplados a Gs (B) usando la mayor concentración posible del correspondiente agonista.
3.
Aumento de la expresión de -6qi4myr en comparación con -6qi4 según Westernblot SDS-PAGE. Además, se muestra la expresión de otras proteínas G\alpha.
4.
Fraccionamiento en fracción particulada (p; con contenido de membranas) y fracción soluble (s; sc) de qwt y -6qi4myr según Westernblot SDS-PAGE. Las subunidades de proteína G se detectaron con el anticuerpo monoclonal 12CA5 y dan como resultado bandas de proteínas en un tamaño de -42KD.
5.
Unión de distintos receptores acoplados a Gi/o por medio de -6qi4myr (=\Delta6qi4myr) con la vía de transducción de señales de PLC\beta. D2, kappa y SSTR1 son receptores acoplados a Gi/o. Como controles, se utilizaron un constructo de vector, así como la proteína G\alpha16 (+16).
6.
Unión de receptores acoplados a Gs por medio de -6qs5myr (=\Delta6qs5myr) con la vía de transducción de señales de PLC\beta. \beta1, \beta2 y D1 son receptores acoplados a Gs. Como referencia, sirve un constructo de vector y la proteína G G\alpha16 (+16).
7.
Unión del receptor de dopamina D2 acoplado a Gi/o con la vía de transducción de señales de PLC\beta-Ca en presencia de la subunidad \alpha G16 menos sensible, en presencia de la subunidad G \alpha muy sensible -6qi4myr, así como en combinación con G16 y -6qi4myr. Es evidente que la potente activación de la liberación del calcio por -6qi4myr no se perjudica mediante la presencia de G16.
<110> Aventis Pharma Deutschland GmbH
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<120> Procedimiento con amplio intervalo de aplicaciones para identificar moduladores de los receptores acoplados a la proteína G.
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<130> AVE D-2000/A033
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<140>
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<141>
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<160> 10
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 1080
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<212> DNA
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<213> Mus musculus 
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<400> 1
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1 
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<210> 2
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<211> 359
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<212> PRT
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<400> 2
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3 
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<210> 3
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<211> 1062
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13
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<400> 10
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16
17

Claims (7)

1. Procedimiento para la identificación de un compuesto químico que modifica la acción de al menos una vía de transducción de señales dependiente del receptor acoplado a la proteína G (GPCR) de un organismo biológico, en donde dicho procedimiento contiene las siguientes etapas de procedimiento:
a)
preparación de al menos una célula que contiene al menos una vía de transducción de señales dependiente de un GPCR, en donde se prepara una o más de una proteína G;
b)
preparación de al menos un compuesto químico por ensayar;
c)
puesta en contacto de una célula de acuerdo con a) con un compuesto químico por ensayar de acuerdo con b);
d)
determinación del efecto cuantitativo o cualitativo de un compuesto químico por ensayar de b) sobre la vía de transducción de señales de una célula de a) por medio de una señal medible dependiente de la vía de transducción de señales,
caracterizado porque al menos una proteína G está seleccionada de -6qi4myr o -6qs5myr, en donde "-6qi4" significa que la subunidad \alpha de la proteína G de la clase G\alphaq lleva una deleción N-terminal de 6 aminoácidos y presenta en el término C una secuencia \alphai, y en donde "6qs5" significa que la subunidad \alpha de la proteína G de la clase G\alphas lleva una deleción N-terminal de 6 aminoácidos y que presenta en el término C una secuencia \alphas, y "myr" significa que la correspondiente proteína G en el término amino presenta una secuencia de reconocimiento de miristoilación/palmitoilación MGCC en lugar de la secuencia específica de G\alphaq MACC.
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2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que en la célula, que se pone a disposición según a), se preparan al menos dos proteínas G.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que en la célula, que se pone a disposición según a), se preparan al menos dos proteínas G seleccionadas de -6qi4myr, 6qs5myr, -6qi4, -6qs5 o Galpha16.
4. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula según a) es la célula de una especie de vertebrados, una especie de insectos, una C. elegans o una levadura.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la célula es una célula de HeLa, 293, COS, CHO o una célula de Saccharomyces cerevisiae.
6. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, en el que para determinar el efecto cuantitativo o cualitativo de un compuesto químico por ensayar por medio de una señal medible en función de la vía de transducción de señales de acuerdo con la reivindicación 1 d) se usa la concentración intracelular de Ca^{2+}.
7. Procedimiento para la identificación de un medicamento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 6.
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