ES2237920T3

ES2237920T3 - Combinacion de compuestos que contienen selenio con gemcitabina o mitomicina c.

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Publication number: ES2237920T3
Application number: ES99927815T
Authority: ES
Inventors: Thomas Stiefel; Helmut Rohrer
Original assignee: Biosyn Arzneimittel GmbH
Current assignee: Biosyn Arzneimittel GmbH
Priority date: 1998-06-09
Filing date: 1999-05-31
Publication date: 2005-08-01
Anticipated expiration: 2019-05-31
Also published as: WO1999064018A1; ATE290388T1; EP1085884B1; EP1085884A1; US6656509B1; DE19825746A1; CA2334527C; CA2334527A1; DE59911734D1; PT1085884E

Abstract

Uso de selenio y/o al menos un compuesto de selenio para aumentar el efecto del citostático gemcitabina o del citostático mitomicina C.

Description

Combinación de compuestos que contienen selenio con gemcitabina o mitomicina C.

La presente invención se refiere al uso de selenio y/o un derivado de éste, en combinación con el citostático gemcitabina o con el citostático mitomicina C.

El elemento químico selenio es un oligoelemento esencial para seres humanos y animales, que ante todo influye en procesos de oxidación, así como en el metabolismo de la tiroxina. En el ser humano pudo comprobarse que la enzima glutationperoxidasa y la selenoproteína P, que está presente en el plasma, respectivamente contienen selenio en forma del aminoácido selenocisteína. La glutationperoxidasa, que contiene selenio, es un componente del sistema protector antioxidante de la célula del mamífero. En presencia de cantidades suficientes de sustrato, es decir, glutatión reducido, la glutationperoxidasa transforma un gran número de diferentes hidroperóxidos en los correspondientes alcoholes. Pudo demostrarse, que la integridad de las membranas celulares y subcelulares depende decisivamente de la integridad del sistema de la glutationperoxidasa. El selenio como componente de la glutationperoxidasa puede reducir la tasa de peroxidación de lípidos y los daños de membrana resultantes de ésta.

En animales, hace poco tiempo se caracterizó la yodotironina-5'-deyodasa del tipo I como enzima que contiene selenio. La yodotironina-deyodasa también en el ser humano transforma tiroxina (T_{4}) en triyodotironina (T_{3}), la hormona activa de la glándula tiroides, en la glándula tiroides, en el hígado y en los riñones. En el caso de una deficiencia de selenio, por ejemplo, en la fenilcetonuria y la fibrosis quística, pudieron comprobarse valores aumentados de T_{4} y simultáneamente un nivel reducido de T_{3}. Por la administración de selenito de sodio (Na_{2}SeO_{3}) se normaliza nuevamente el metabolismo tiroideo.

Como otra enzima dependiente del selenio, hace poco tiempo, se ha descrito una tiorredoxinreductasa humana de células pulmonares, que contiene selenio como cofactor (Tamura y Stadtman, 1996, Biochemistry, Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 1006-1011). Hasta ahora, pudo aislarse la enzima a partir de células T, tejidos pulmonares y placenta (Gladyshev y col., 1996, Biochemistry, Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 6146-6151). La enzima dependiente del selenio tiorredoxinreductasa reduce la tiorredoxina. La tiorredoxina se sobreexpresa en una serie de tumores, y algunos estudios experimentales han demostrado que la tiorredoxina contribuye al crecimiento y a la transformación maligna de algunas células cancerosas humanas. La enzima tiorredoxinreductasa, por ello, desempeña un papel en la regulación del crecimiento de células normales y cancerosas.

La relevancia patofisiológica de las reacciones dependientes del selenio está demostrada mediante la observación de fenómenos de deficiencia de selenio en seres humanos y animales. Una deficiencia de este oligoelemento aumenta daños hepáticos inducidos mediante oxidación o reacción química, así como la toxicidad de metales pesados como mercurio y cadmio.

En el ser humano, como fenómenos de deficiencia de selenio, se describen la enfermedad de Keshan, una cardiomiopatía que aparece en forma endémica, y la llamada enfermedad de Kaschin-Beck, una osteoatropatía que también aparece en forma endémica, con graves deformaciones de las articulaciones. También se observó una deficiencia de selenio clínicamente manifestada, como consecuencia de alimentación parenteral prolongada y de dietas balanceadas. Aquí, ante todo, se presentan cardiomiopatías y miopatías de la musculatura esquelética, así como un desplazamiento de la relación T_{3}/T_{4}.

Los exámenes epidemiológicos señalan una correlación inversa entre el nivel sanguíneo de selenio y la incidencia de enfermedades cardiocirculatorias (cardiomiopatías, arteriosclerosis, infarto de miocardio), así como de enfermedades tumorales, en particular, del tracto digestivo, de las mamas y del hígado. Pueden darse niveles plasmáticos reducidos del selenio en pacientes con insuficiencia renal, así como en enfermedades gastrointestinales. Una deficiencia de selenio puede comprobarse por un nivel reducido de selenio en sangre entera o en el plasma, y por actividad reducida de la glutationperoxidasa en la sangre entera, en plasma o en trombocitos.

La sustitución de selenio, en los fenómenos de deficiencia, activa reacciones de la defensa inmune, en particular, las reacciones humorales no específicas, ligadas a las células. La glutationperoxidasa, que contiene selenio, influye en el metabolismo de leucotrienos, tromboxano y prostaciclinas. A continuación, se enumeran los efectos inmunomoduladores de compuestos que contienen selenio:

\bullet: estimulación de la proliferación de linfocitos

\bullet: activación de células T y células NK, citotóxicas

\bullet: aumento de la expresión de los receptores de interleucina 2

\bullet: reducción selectiva del número de células supresoras T

\bullet: aumento de la síntesis de \gamma-interferón

\bullet: reducción general de la frecuencia de infecciones.

El selenio en forma de selenito (SeO_{3}^{2-}) no se introduce directamente en proteínas. En la sangre, en primer lugar, el selenito es absorbido principalmente por los eritrocitos y es reducido en forma enzimática para formar seleniuro de hidrógeno. El seleniuro de hidrógeno sirve como depósito central de selenio para la secreción y para la introducción selectiva en selenoproteínas. En esta forma reducida, el selenio se enlaza a proteínas plasmáticas que migran al hígado y a otros órganos. El transporte secundario plasmático desde el hígado hacia los tejidos meta que sintetizan glutationperoxidasa probablemente se efectúa en forma de una selenoproteína P que contiene selenocisteína. Hasta ahora, sólo se conoce el transcurso metabólico subsiguiente de la biosíntesis de la selenoproteína de modelos procarióticos de organismos. En éstos, la selenocisteína se introduce específicamente en la cadena peptídica de la glutationperoxidasa en el transcurso de la traducción.

El exceso de seleniuro de hidrógeno en el ser humano se metaboliza, pasando por metilselenol y seleniuro de dimetilo, para formar el ión trimetilselenonio, el producto principal de excreción. Después de la administración oral, el selenito se absorbe preponderantemente desde el intestino delgado. La absorción intestinal de selenito de sodio no está regulada en forma homeostática. Dependiendo de la concentración, y de sustancias acompañantes, asciende a entre 44% y 89%, ocasionalmente, a más del 90%. El aminoácido cisteína promueve la absorción de selenito de sodio.

Los compuestos orgánicos de selenio también deben transformarse en primer lugar en seleniuro de hidrógeno, antes de que estén a disposición para la síntesis de selenoproteínas. La selenometionina, contenida principalmente en los alimentos, durante la biosíntesis de proteínas también puede ser introducida en lugar de la metionina en forma no específica, al azar, en proteínas que no contienen selenio.

La cantidad total de selenio en el cuerpo humano, en un metabolismo de selenio equilibrado, se encuentra entre 4 mg y 20 mg. La excreción del selenio en el ser humano, según la dosis administrada, se realiza mediante la orina, las heces y por el pulmón. En primer término, se excreta el selenio por vía renal, en forma de los iones de trimetilselenonio, ya mencionados anteriormente.

En el ser humano, hasta ahora se han descrito pocas veces intoxicaciones agudas por selenio. Como signos de una sobredosificación aguda, valen un aliento con olor similar al ajo, cansancio, náuseas, diarrea y dolores abdominales. De observaciones acerca de la toxicidad crónica del selenio en el ser humano, se dedujo una absorción máxima segura diaria de selenio de 820 \mug, mientras que una dosificación de hasta 550 \mug por día se considera inocua aún en personas susceptibles. Como signos clínicos de la selenosis, que aparece en forma endémica, en un estudio realizado en China, después de la administración diaria de 3200-6700 \mug de selenio, se observaron caída del cabello, uñas quebradizas, alteraciones de la piel y trastornos del sistema nervioso. En diversas especies, como síntoma de la selenosis, se ha descrito una limitación de la capacidad reproductora, debido a una motilidad reducida de los espermatozoides.

En un estudio con escalada de dosis, se infundieron entre 10 y 50 mg de selenio en forma de pentrahidrato de selenito de sodio a pacientes con tumores. En el transcurso de 30 minutos, después de administrar 10 mg de selenio como selenito de sodio, el nivel plasmático de selenio aumentó desde 200 \mug/l hasta 1200 \mug/l. Después de 8 y de 16 horas, el nivel plasmático de selenio había bajado a 770 \mug/l y 430 \mug/l respectivamente. Después de 24 horas, el nivel plasmático había alcanzado otra vez su valor inicial. La toxicidad gastrointestinal se presentaba a partir de aproximadamente 20 mg de selenio como selenito de sodio y fue reversible después de suspender la administración del preparado (Röhrer H., 1989, Erfahrungsheilkunde 38: 10a, 761).

Como medidas para remediar una intoxicación, entran en consideración el lavado de estómago, diuresis forzada o administración de altas dosis de vitamina C. En el caso de una sobredosificación extrema (exceso de 1000 a 10000 veces), puede intentarse eliminar el selenito mediante diálisis.

El oligoelemento selenio en el ser humano es absorbido preponderantemente por la ingestión de yema de huevo, pescado y carne, en particular, pollo y cerdo, así como de entrañas. El suministro mínimo necesario de selenio para el ser humano depende de la forma química del elemento absorbido y de la composición de la dieta en la que se encuentra. En la China se suministró en forma experimental una cantidad de 15 a 20 \mug de selenio por día, como cantidad suficiente para proteger de enfermedades endémicas por deficiencia de selenio. El Consejo Nacional de Investigación (NRC) de los Estados Unidos recomienda un suministro diario de 70 \mug de selenio para hombres y de 55 \mug de selenio para mujeres. El NRC antes (hasta 1989) clasificaba cantidades diarias de 50 a 200 \mug de selenio como adecuadas e inocuas. La sociedad alemana de alimentación recomienda de 20 a 100 \mug diarios de selenio.

El suministro diario medio de selenio, cubierto en dos terceras partes por el suministro de proteína animal, en los antiguos estados federados alemanes se encuentra en 38 \mug para mujeres y 47 \mug para hombres. En cambio, en el ámbito de los nuevos estados federados se suministran valores de 20 a 25 \mug de selenio. Estos números demuestran que el suministro nutritivo de selenio no siempre está cubierto en Alemania. El riesgo de un abastecimiento insuficiente con selenio existe especialmente en situaciones de necesidad mayor (por ejemplo, durante el embarazo y la lactancia), en personas con carga de metales pesados y oxidantes, en pacientes con complicaciones gastrointestinales (por ejemplo, enfermedades inflamatorias crónicas del intestino) y en personas alimentadas en forma parenteral o con dietas especiales (por ejemplo, en el caso de fenilcetonuria).

Estudios epidemiológicos han mostrado que una baja absorción de selenio y una concentración plasmática correspondientemente baja de selenio, están relacionadas con una incidencia aumentada de diversos tipos de cáncer (Glattre y col., 1989, Int. J. Epedemiol., 18:45-49; Knekt y col., 1990; J. Natl. Cancer Inst., 82:864-868; Burney y col., 1997, J. Clin. Nutr., 49:895-900). También se demostró que el selenio en dosis altas (10 a 100 \mum), in vitro puede inhibir notablemente el crecimiento de diversas células tumorales, por ejemplo, de células cancerosas humanas de mama, células cancerosas de ovario y células cancerosas de intestino (Yan y col., 1991; Biol. Trace Elem. Res., 30:145-162; Chen y col., 1995, FASEB J., 9(3):A159; Nano y col., 1989, Biol. Trace Elem. Res. 20:31-43; Stewart y col., 1997, Cancer Lett., 117:35-40). En contraste con esto, varios científicos informan acerca de un efecto estimulante del crecimiento, de bajas cantidades de selenito de sodio (0,001-1 \muM) sobre diversas células tumorales que fueron incubadas en condiciones exentas de suero (Nano y col., 1989, Biol. Trace Elem. Res., 20:31-43; Golczewski y Frenkel, 1989, Biol. Trace Elem. Res. 20:115-125). Además, se observó que compuestos orgánicos de selenio ejercen un efecto preventivo en cuanto al desarrollo de tumores, en carcinoma de mama en ratones y ratas (El-Bayoumy y col., 1995, J. Cell. Biochemistry, anexo 22: 29-100). El mecanismo, mediante el cual el selenio influye en la proliferación o en la regresión de tumores no es mayormente conocido. Sin embargo, se supone que la inducción de roturas de cordones de ADN y apoptosis, ocasionadas por selenio y/o metabolitos del selenio, como selenioglutatión y seleniuro de hidrógeno, así como por la formación de selenoproteínas, como glutationperoxidasa y tiorredoxinreductasa, desempeñan un papel importante aquí (Thompson y col., 1994, Carcinogenesis 15: 183-185; Wu y col., 1995, Carcinogenesis 16: 1579-1584; Lu y col., 1994, Biochem. Pharmacol., 47: 1531-1535; Milner, 1985, Fed. Proc., 44: 2568-2572; Schrauzer, 1992, Biol. Trace Elem. Res., 33: 51-62; Gallegos y col., 1997, Cancer Res., 75: 4965-4979). Así, por ejemplo, un aumento de la actividad de la tiorredoxinreductasa por selenio podría bajar la concentración celular de tiorredoxina e influir de esta manera en la regulación del crecimiento de células cancerosas (Gallegos y col., 1997, Cancer Res., 75: 4965-4979).

En experimentos de combinación se observó que la administración de bajas cantidades de selenio o, en su caso, de compuestos que contienen selenio, junto con citostáticos, no origina una reducción del efecto antitumoral, sin embargo, es capaz de reducir considerablemente los efectos secundarios condicionados por citostáticos, como nefrotoxicidad o cardiotoxicidad.

Mientras que para algunos tipos de cáncer pudieron desarrollarse procedimientos de terapia bastante eficaces, -la tasa de mortalidad, después de enfermar de cáncer de intestino, por ejemplo, pudo bajarse en aproximadamente 17% entre 1992 y 1993- para la gran mayoría de los tipos de cáncer hasta ahora no está a disposición ninguna terapia o sólo una terapia muy insuficiente.

Además de la extirpación operativa del tumor y de la terapia por rayos, la quimioterapia es considerada el procedimiento terapéutico hasta ahora más eficaz. Los medicamentos quiminoterápicos, esencialmente pueden clasificarse en los siguientes cuatro grupos: antimetabolitos, inhibidores de la topoisomerasa, agentes alquilantes y alcaloides vegetales, inhibiendo los tres grupos nombrados en primer lugar una replicación correcta de la sustancia hereditaria y teniendo el último grupo un efecto inhibidor de la mitosis. En el tratamiento de, en particular, tumores sólidos, el efecto de los citostáticos la mayoría de las veces no alcanza para tratar a los tumores en forma curativa.

Por ello, el objetivo de la presente invención es especificar una posibilidad de lograr un aumento de la eficacia de principios activos antitumorales, así como proporcionar estos principios activos en una forma farmacéutica apropia-
da.

Se alcanza este objetivo por el uso de selenio y/o al menos un compuesto de selenio, para aumentar el efecto del citostático gemcitabina o del citostático mitomicina C.

Además, se alcanza este objetivo proporcionando un kit que comprende:

a): selenio y/o al menos un compuesto de selenio y

b): el citostático gemcitabina o el citostático mitomicina C

como preparado combinado para el uso simultáneo, separado o en tiempos sucesivos, en la terapia citostática, caracterizado porque se usa el selenio y/o el compuesto de selenio en una concentración de 0,1 mg/kg de peso corporal a 1,25 mg/kg de peso corporal y el citostático se usa en una concentración de 2 mg/m^{2} de superficie corporal, a 240 g/m^{2} de superficie corporal.

Además, se alcanza este objetivo por el uso de selenio y/o al menos un compuesto que contiene selenio, en combinación con el citostático gemcitabina o con el citostático mitomicina C, para preparar un medicamento para el tratamiento del cáncer, caracterizado porque el selenio y/o el compuesto de selenio se usa en una concentración de 0,1 mg/kg de peso corporal a 1,25 mg/kg de peso corporal, y se usa el citostático en una concentración de 2 mg/m^{2} de superficie corporal a 240 g/m^{2} de superficie corporal.

La presente invención se refiere al uso de selenio y/o al menos un compuesto de selenio, para aumentar la eficacia de dos citostáticos, es decir, de gemcitabina o de mitomicina C, o una mezcla de éstos.

Los ejemplos expuestos a continuación demuestran que un tratamiento simultáneo con los componentes nombrados anteriormente, in vitro conduce sorprendentemente a un efecto antitumoral notablemente sinérgico, es decir, más que aditivo.

Se usan compuestos orgánicos e inorgánicos de selenio para combinar con los citostáticos antes nombrados. En una realización preferida, se usa un compuesto orgánico de selenio. El uso de compuestos orgánicos de selenio debe servir para reducir la toxicidad, en comparación con compuestos de selenio inorgánicos, con una eficacia antitumoral igual o mejorada. Los selenoaminoácidos selenometionina y selenocisteína, así como el compuesto fenilbis(metilen)selenocianato, así como derivados de éstos (El-Bayonmi y col., 1995, J. Cell. Biochemistry, anexo 22: 92-100), son especialmente preferidos. El compuesto nombrado en último término inhibe la timidincinasa en líneas celulares humanas de carcinoma de mama. Además, se informó que este compuesto puede originar una inhibición del crecimiento celular, así como la inducción de muerte celular mediante apoptosis.

Además, se prefiere un óxido de selenio como compuesto de selenio para lograr un aumento del efecto de un citostático o de una mezcla de citostáticos. En una realización especialmente preferida, el compuesto de selenio es una sal de SeO_{2}, por ejemplo, la sal Na_{2}SeO_{3}.

La gemcitabina es un citostático preferido, que inhibe la síntesis de ácidos nucleicos. Otro citostático también preferido que inhibe la síntesis de ácidos nucleicos, es el compuesto mitomicina C. A continuación, están representadas las fórmulas estructurales de estos dos compuestos:

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La mitomicina C pertenece al grupo de los agentes alquilantes. Después de la reducción de la unidad quinónica, se libera metanol, lo que facilita la apertura del anillo de aziridina para formar un metabolito alquilante. Otra molécula alquilante se forma por separación química o enzimática de las cadenas laterales de carbamato. Además, la reducción de la unidad quinónica está ligada a la formación de moléculas de oxígeno reactivo, que también tienen un efecto alquilante. El efecto antitumoral de la mitomicina C es atribuible principalmente a la alquilación de ADN.

La gemcitabina es un antimetabolito pirimidínico. Después de la absorción por la célula, se metaboliza formando trifosfonato de 2',2'-difluorodeoxicitidina. La incorporación de gemcitabina en el ADN interrumpe la síntesis del cordón de ADN, de manera que por consecuencia ya no es posible la división celular.

La gemcitabina y la mitomicina C tienen diferentes maneras de actuar, pero ambos compuestos se integran directamente al ADN celular y conducen a fallas, es decir, la interrupción de la replicación de ADN.

Para preparar un medicamento para el tratamiento del cáncer, se usa el selenio y/o al menos un compuesto de selenio en una concentración de 0,1 mg/kg de peso corporal a 1,25 mg/kg de peso corporal y el citostático en una concentración de 2 mg/m^{2} de superficie corporal a 240 g/m^{2} de superficie corporal. La concentración preferida de selenio o de un compuesto de selenio se encuentra en el intervalo de 0,1 mg/kg de peso corporal a 0,3 mg/kg de peso corporal, y la del citostático se encuentra en el intervalo de 20 mg/m^{2} de superficie corporal a 1000 mg/m^{2} de superficie corporal.

El uso de la combinación citada en la terapia citostática es especialmente preferido.

Además, la invención proporciona un kit que comprende selenio y/o al menos un compuesto de selenio, y un citostático o una mezcla de citostáticos, como preparado combinado para la administración simultánea, separada o en tiempos sucesivos, en la terapia citostática. Se prefiere que el compuesto de selenio contenido en el kit sea un compuesto orgánico de selenio. Los selenoaminoácidos selenometionina y selenocisteína, así como el compuesto fenilenbis(metilen)selenocianato son compuestos orgánicos de selenio particularmente preferidos. Además, en otra realización, como compuesto de selenio se usa un óxido de selenio. Se prefiere especialmente una sal de SeO_{2}, por ejemplo, Na_{2}SeO_{3}.

El kit conforme a la invención contiene selenio y/o al menos un compuesto de selenio que deben administrarse en una concentración de 0,1 mg/kg de peso corporal a 1,25 mg/kg de peso corporal, y uno de los citostáticos descritos anteriormente, que debe administrarse en una concentración de 2 mg/m^{2} de superficie corporal a 240 mg/m^{2} de superficie corporal. Aquí se prefiere un intervalo de concentraciones de 0,1 mg/kg de peso corporal a 0,3 mg/kg de peso corporal para el selenio o compuesto de selenio, y un intervalo de concentraciones de 20 mg/kg de peso corporal hasta 1000 mg/m^{2} de superficie corporal, de un citostático caracterizado anteriormente.

Las combinaciones de compuesto de selenio y citostático o citostáticos pueden administrarse en forma sólida o líquida. La administración puede ser por vía oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo intramuscular, subcutánea y endovenosa), o por inhalación. Pueden ofrecerse juntos con coadyuvantes, vehículos y/o diluyentes tradicionales.

Las formas farmacéuticas sólidas comprenden comprimidos, cápsulas, polvos, píldoras, pastillas, supositorios y formas farmacéuticas granuladas. También pueden incluir aditivos, como saborizantes, colorantes, diluyentes, plastificantes, aglutinantes, conservantes, disgregantes y/o materiales envolventes.

Las formas farmacéuticas líquidas comprenden soluciones, suspensiones y emulsiones. Éstas también pueden ofrecerse juntas con los aditivos citados precedentemente.

Las siguientes figuras y los siguientes ejemplos ilustran la presente invención.

Figura 1: Efecto de selenito de sodio (3 \muM y 30 \muM) sobre la formación de colonias de xenotransplantes tumorales pancreáticos (PAXF 546 y 736) en el ensayo clonogénico in vitro, en diferentes experimentos, T/C = cantidad de colonias tumorales en muestras tratadas con selenio, dividida por la cantidad de colonias en las muestras no tratadas en %.

Figura 2: Efecto del selenio o de la mitomicina C solos o juntos, sobre el crecimiento in vitro del xenotransplante tumoral pancreático PAXF 546 (ensayo clonogénico, exposición continua al principio activo) A-C: curvas de dosis/efecto de mitomicina C y mitomicina C en combinación con selenio 3 \muM (A) o selenio 30 \muM (B, C). El efecto del selenio solo está representado por líneas interrumpidas.

Figura 3: Comparación de los valores T/C observados experimentalmente y los esperados, de combinaciones de selenio/mitomicina C. Los valores de T/C esperados para un efecto aditivo de principios activos están representados en forma de barras en blanco, los valores T/C observados experimentalmente están representados por barras rellenadas; * denominaba una diferencia significativa (p < 0,01) entre T/C_{esperado} y T/C_{observado} y por ello, un sinergismo de los principios activos. A-C: combinación de mitomicina C con selenio 3 \muM (A) o selenio 30 \muM (B, C).

Figura 4: Efecto del selenio y de la gemcitabina solos o en combinación, sobre el crecimiento in vitro del xenotransplante tumoral pancreático PAXF 546 (ensayo clonogénico, exposición continua al principio activo). A-C: curva de dosis/efecto de gemcitabina sola y gemcitabina en combinación con selenio 3 \muM (A) o selenio 30 \muM (B, C). El efecto del selenio solo se representa por líneas interrumpidas.

Figura 5: Comparación de los valores T/C observados experimentalmente y los esperados, de combinaciones de selenio/gemcitabina. Los valores T/C esperados para el efecto aditivo de principios activos están representados por barras en blanco, los valores T/C observados experimentalmente están representados por barras rellenadas; * indica una diferencia significativa (p < 0,01) entre T/C_{esperado} y T/C_{observado} y por ello, un sinergismo de los principios activos. A/C: combinación de gemcitabina con selenio 3 \muM (A) o selenio 30 \muM (B, C).

Ejemplos 1. Material y procedimientos

El selenito de sodio (Selenase®) fue provisto por G. N. Pharm GmbH, Fellbach, Alemania. La solución de NaCl al 0,9% contenía 50 \mug/ml (0,63 mM) de selenio, como Na_{2}SeO_{3} x 5 H_{2}O. La gemcitabina y la mitomicina C fueron adquiridas en una farmacia y se usaron como formulaciones clínicas.

1.1. Ensayo de formación de colonias Preparación de una suspensión de célula individual de xenotransplantes humanos

Se extrajeron en condiciones estériles xenotransplantes tumorales sólidos humanos, que crecían en forma subcutánea por pasajes seriales en ratones desnudos con aplasia de timo (cepa NMRI. nu/nu, de cría propia), se individualizaron las células en forma mecánica y, a continuación, se incubaron con una mezcla de enzimas compuesta por colagenasa (1,2 a 1,8 U/ml, Worthington), ADNasa (375 U/ml, Boehringer Mannheim) e hialuronidasa (29 U/ml, Boehringer Mannheim) en RPMI 1640 a 37ºC, durante 30 minutos. La mezcla celular fue pasada por tamices con tamaños de poros de 200 \mum y de 50 \mum y después fue lavada dos veces con PBS (solución salina tamponada que contiene fosfatos). Se determinó el porcentaje de células vivas en una cámara celular de Neubauer, usando exclusión por azul de tripano.

1.2. Procedimiento de cultivo

Se llevó a cabo el ensayo clonogénico conforme al ensayo descrito por Hamburger y Salmon modificado, de agar blando de 2 capas (Hamburger und Salmon, Science, 197: 461-463, 1997). La capa inferior estaba compuesta por 0,2 ml de medio Dulbecco modificado por Iscoves, con 20% de suero fetal bovino y 0,75% de agar. Se adicionaron de 8 x 10^{3} a 1,6 x 10^{4} células a 0,2 ml del mismo medio, junto con agar al 0,4% y se colocaron en placas de 24 pocillos ya recubiertas. Las sustancias en ensayo fueron adicionadas en 0,2 ml de medio mediante exposición continua (superposición por un fármaco). Cada placa incluía 6 pocillos de control que contenían por triplicado grupos tratados con vehículo y con sustancia en ensayo en 6 concentraciones.

Se incubaron los cultivos a 37ºC y 7% de CO_{2} en una atmósfera humedecida, durante 5 a 15 días, dependiendo del tiempo de duplicación de las células tumorales madres, y se observó el crecimiento de colonias bajo un microscopio inverso. En este lapso de tiempo, el crecimiento tumoral in vitro condujo a la formación de colonias con un diámetro = 50 \mum. Cuando se había alcanzado la formación máxima de colonia, se efectuaron recuentos en un sistema automático de análisis de imágenes (OMNICOM Fas IV, Biosys GmbH). 24 horas antes de este ensayo, se colorearon colonias vivas con una solución acuosa estéril de cloruro de 2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-feniltetrazolio (1 mg/ml, 100 \mul/pocillo). Se representó el efecto de las sustancias en ensayo en por ciento de células sobrevivientes, obtenido por la comparación de las cantidades medias de colonias de las placas tratadas con la cantidad media de colonias del control no tratado (valor del grupo ensayo versus control, T/C = número de colonias_{\text{grupo tratado*}} 100/número de colonias_{grupo \ control}).

Un ensayo fue considerado de valor informativo, cuando se cumplían los siguientes criterios de control:

\bullet: número medio de colonias de las placas de grupos control para 24 pocillos: \geq 20 colonias con un diámetro de colonia \geq 50 \mum,

\bullet: número de colonias sobrevivientes en pocillos que fueron tratados con el compuesto de referencia positivo 5-fluorouracilo (a una dosis tóxica de 1000 \mug/ml): < 30% de los controles,

\bullet: coeficiente de variación en el grupo control: \leq 50%.

Se determinaron los valores de CI_{50} y de CI_{70} por la representación de la concentración de los compuestos versus tasa de supervivencia celular. Los valores medios de CI_{50} y de CI_{70} fueron calculados mediante la siguiente fórmula:

CI_{50} e CI_{70} medias = \frac{ \sum\limits^{n}_{x=1} log (CI_{50,70})_{x} }{N}

con x = xenotransplante tumoral específico y n = número total de xenotransplantes tumorales examinados. Si no pudo determinarse ningún valor de CI_{50} o de CI_{70} en el intervalo de dosis examinado, se recurrió a la concentración mayor o, en su caso, menor examinada para el cálculo.

1.3. Estudios de combinación

Se examinó la inhibición de formación de colonias por los quimioterápicos gemcitabina y mitomicina C solos o en combinación con selenio, en xenotransplantes tumorales pancreáticos humanos PAXF 546 y 736, usando el ensayo Clonogénico descrito anteriormente. Cada experimento comprende 6 concentraciones de quimioterápicos, 2 concentraciones de selenio (3 y 30 \muM) y la combinación de todas las dosis con selenio 3 y 30 \muM. Todos los compuestos y combinaciones fueron examinados tres veces. Se eligieron de tal manera las concentraciones de los quimioterápicos que resultaran valores de T/C de 0 a 100%. Cada experimento fue realizado dos veces. Se calculó el efecto de una combinación de compuestos por comparación del valor T/C observado experimentalmente de una combinación de selenio/citostático (T/C_{observado} (A + B) con el valor T/C esperado para esta combinación (T/C_{esperado} (A + B)), calculado por multiplicación de la cantidad de colonias sobrevivientes, obtenida después del tratamiento de las células con las respectivas sustancias individuales (T/C (A) y T/C (B)), usando la siguiente ecuación (procedimiento de multiplicación descrito, por ejemplo, por Berenbaum, 1989, Pharmacol. Rev., 41:93-141):

T/C_{esperado}(A + B) = T/C (A) x T/C (B)/100

Para una combinación de principios activos de interacción cero (efectos aditivos de principios activos), es T/C_{esperado} (A + B) = T/C_{observado} (A + B). Una combinación de principios activos es sinérgica, cuando T/C_{observado} (A + B) > T/C_{esperado} con significancia estadística. Se determinó la significancia estadística mediante el ensayo T.

2. Resultados 2.1. Actividad antitumoral in vitro de selenito de sodio sobre xenotransplantes tumorales humanos

Usando el ensayo clonogénico, se examinó la actividad citotóxica del selenito de sodio en los siguientes xenotransplantes tumorales humanos:

TABLA 1 Xenotransplantes tumorales humanos examinados

2

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Se usaron concentraciones de selenito de sodio de entre 0,001 y 100 \muM. Los valores de T/C que fueron obtenidos en los diferentes xenotransplantes tumorales están mostrados en la tabla 2. Los valores de la CI_{50} y de la CI_{70}, así como un diagrama de barras de la CI_{70}, que muestra la sensibilidad de los diferentes tumores frente al tratamiento con selenio, están indicados en la tabla 3.

La inhibición de la formación de colonias depende de la dosis de selenio. Hasta 1 \muM no pudo observarse ningún efecto citotóxico evidente. Con selenio 10 \muM se obtuvieron valores de T/C de entre 30% en 2 de 12 xenotransplantes (LXFL 529, PRXF DU145X). Con concentraciones muy altas de selenio, de 100 \muM, se alcanzaron valores de T/C menores del 20% en todos los xenotransplantes, lo que señala un efecto citotóxico inespecífico.

TABLA 2 Efecto in vitro de selenito de sodio sobre xenotransplantes tumorales humanos

3

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Leyenda de la tabla:\cr   \begin{minipage}[t]{140mm} LXF:
pulmón, A: adeno, L: xenotransplante canceroso de células grandes,
S: xenotransplante canceroso de células pequeñas; MAXF:
xenotransplante de  cáncer de mama; OVXF: xenotransplante de cáncer
de ovario, PAXF: páncreas, PRXF:  xenotransplante de cáncer de
próstata; RXF: xenotransplante de cáncer de
riñón\end{minipage} \cr   \begin{minipage}[t]{140mm} - (T/C
 \geq  50%); + (30%  \leq  T/C < 50%); ++ (10% < T/C <
30%); +++ (T/C   \leq  10%), s: resultado de una
placa\end{minipage} \cr}

En el diagrama de barras de la CI_{70} (representación de la CI_{70}, tabla 3) están representadas desviaciones de valores individuales de la CI_{70} del valor medio como barras de representación logarítmica. Barras hacia la izquierda muestran valores de la CI_{70} que son más bajos que el valor medio. Barras hacia la derecha muestran valores que son más altos que el valor medio. La representación de la CI_{70} por ello muestra un perfil antiproliferativo característico del compues-
to.

El valor medio de la CI_{50} de selenito de sodio era 15,5 \muM, el valor medio de la CI_{70} era de 27 \muM. Esto corresponde a una concentración de selenio de 1,2 \mug/ml (valor medio de la CI_{50}) y de 2,1 \mug/ml (valor medio de la CI_{70}). En comparación con la eficacia de quimioterápicos estándar, en este ensayo, los valores se encuentran en el intervalo de los valores de la CI_{50} y la CI_{70} de los agentes alquilantes ifosamida y ciclofosfamida. La mayoría de los otros agentes alquilantes estándar tienen valores medios de CI_{70} < 0,1 \mug/ml.

Los xenotransplantes tumorales más sensibles, representados mediante valores de CI_{70} y barras hacia la izquierda en la tabla 3, eran el xenotransplante de cáncer pulmonar de células grandes LXFL 529, el xenotransplante de cáncer de riñón RXF 393 y los xenotransplantes de próstata PC3M y DU145X.

TABLA 3 Efecto in vitro de selenito de sodio sobre xenotransplantes tumorales humanos

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4

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2.2. Estudios de combinación in vitro

Para examinar si el selenio en forma de selenito de sodio puede potenciar el efecto antiproliferativo de quimioterápicos estándar, se expusieron dos xenotransplantes tumorales pancreáticos humanos (PAXF 546 y PAXF 736 ) a gemcitabina, mitomicina C o selenito de sodio solos o selenito de sodio en combinación con uno de los dos quimioterápicos.

Se adicionaron concentraciones establecidas de selenito de sodio (3 ó 30 \muM) a las células, junto con 6 diferentes concentraciones de los quimioterápicos. Conforme a los valores mostrados en la tabla 2, se esperó que una concentración de selenito de sodio de 3 \muM influyera sólo en forma marginal en la formación de colonias de dos líneas celulares de tumor pancreático. Esto fue confirmado por los resultados, cuando se usó selenito de sodio solo a esta concentración en los estudios de combinación (figura 1). La concentración más alta de selenito de sodio, de 30 \muM, debería ejercer una influencia más fuerte en la formación de colonias tumorales, ya que la tasa de formación de colonias tumorales de ambos tumores pancreáticos decae rápidamente cuando la concentración de selenito de sodio aumenta de 10 a 100 \muM (tabla 2). Esto se muestra en otros experimentos en la figura 1. La desviación de los valores T/C con 30 \muM en ambos experimentos (figura 1) se origina por la curva muy empinada de los valores dosis/efecto de selenito de sodio a concentraciones en el entorno de 30 \muM. Por ello, se evaluaron en forma separada los experimentos de combinación con PAXF 546 con esta concentración de selenio. En el caso de PAXF 736, pudo recurrirse sólo al experimento X265 para la evaluación, porque en el experimento X290, el selenio 30 \muM ya manifestaba un efecto fuertemente citotóxico con un valor de T/C de 5%.

Las siguientes tablas 4a a 4d muestran los resultados de la incubación de dos xenotransplantes pancreáticos con diferentes concentraciones de selenio y los citostáticos mitomicina C y gemcitabina. Para determinar si una combinación de principios activos presenta un efecto aditivo de los principios activos individuales, se compararon los valores de T/C obtenidos experimentalmente para una combinación específica, con los valores que se esperaban para un efecto aditivo (ver material y procedimientos). Cuando el xenotransplante tumoral pancreático PAXF 736 se trataba simultáneamente con selenito de sodio y mitomicina C o gemcitabina, no podía constatarse un efecto sinérgico ni a una concentración de 3 \muM ni a una concentración de 30 \muM de selenito de sodio. Tampoco se observó un efecto sinérgico de selenito de sodio 3 \muM y todas las concentraciones ensayadas de quimioterápicos en el xenotransplante PAXF 546 o si se combinaban cantidades bajas de quimioterápicos con selenito de sodio 30 \muM. Sin embargo, si se usaban dosis más altas de los quimioterápicos, a las que se observaban efectos citotóxicos, junto con selenito de sodio 30 \muM, se observó un sinergismo en combinación con mitomicina C y gemcitabina (tabla 4a,
4b).

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(Tabla pasa a página siguiente)

5

7

9

11

TABLA 5a Efectos sinérgicos in vitro de selenio en combinación con gemcitabina

13

TABLA 5b Efectos sinérgicos in vitro de selenio en combinación C

130

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \text{*}  \+  \begin{minipage}[t]{135mm}  El valor de T/C
determinado experimentalmente para la combinación de principios
activos es notablemente menor (+) o no menor (-) que el valor de T/C
 esperado para esta combinación;\end{minipage} \cr  n. b.: \+ 
no
determinado.\cr}

En las figuras 2 y 3 está representado el efecto del selenito de sodio y de la mitomicina C sobre el crecimiento in vitro de PAXF 546. Cuando se adicionaba selenito de sodio 3 \muM a diferentes concentraciones de mitomicina C, no podía observarse ninguna modificación en la curva de dosis/efecto de mitomicina C, por lo que se concluye que a esta baja concentración de selenito no se produce sinergismo entre ambos principios activos (figuras 2a y 3a).

Sin embargo, cuando se administraba selenito de sodio 30 \muM simultáneamente con mitomicina C, se observaba un efecto sinérgico a concentraciones de mitomocina C > 0,01 \muM (figuras 2b, c, 3b, c y tabla 5b).

Se lograron resultados similares con la combinación de selenito de sodio y gemcitabina (figuras 4 y 5, tabla 5a). También se constató una inhibición sinérgica de la formación de colonias en PAXF 546 a una concentración de selenio de 30 \muM y una concentración de gemcitabina mayor de 0,1 nM (figura 5, tabla 5a).

En resumen, los resultados muestran que dosis altas de selenio reducen el crecimiento de muchos xenotransplantes tumorales humanos in vitro. De un tratamiento simultáneo de las células cancerosas pancreáticas PAXF 546 con selenio 30 \muM y citostáticos que reaccionan directamente con el ADN celular (por ejemplo, gemcitabina y mitomicina C), resulta una inhibición sinérgica del crecimiento tumoral in vitro.

3. Estudios de casos

A continuación, se exponen las documentaciones de cinco casos de pacientes masculinos con tumores, que recibieron una terapia combinada de selenio en alta dosis (10-30 mg) y diferentes citostáticos. Dos de los pacientes con carcinoma de páncreas (pacientes Nº 4 y Nº 5), a pesar de enfermedad avanzada, manifestaban una buena reacción a la terapia, igual que dos pacientes (pacientes Nº 1 y Nº 3) con carcinomas de próstata con metástasis, resistentes a hormonas. Un paciente (paciente Nº 2), con hipernefroma con metástasis, reaccionó a la terapia con una remisión parcial.

Paciente Nº 1

1.): Diagnóstico: carcinoma de próstata con metástasis, resistente a hormonas

2.): Fecha del diagnóstico (mes/año): junio de 1994

3.): Histología: carcinoma cribiforme de próstata, grado III

4.): Estado del tumor en el momento de comenzar la terapia: T3, N2, M1

: (T = extensión del tumor primario

: N = presencia de metástasis en ganglios linfáticos

: M = presencia de metástasis distantes)

5.): Localización de las metástasis distantes: ganglios linfáticos, huesos

6.): Tratamiento previo del tumor: hormonoterapia desde VI/94 a XI/94

7.): Terapia con quimioterapia/selenio:

a): Quimioterápico: 5-fluorouracilo, 750 mg i.v., desde XI/94 hasta V/95, mitomicina, 10 mg i.v., desde XI/94 hasta V/95

b): Selenio: Selenase®, 10 mg i.v., desde XI/94 hasta V/95

c): Reacción a la terapia: remisión parcial, remisión completa de los edemas linfáticos

d): Duración del tratamiento: 7 meses

e): Motivo de la finalización de la terapia: progresión

f): Tolerabilidad de la terapia: buena

8.): Enfermedades previas y acompañantes: enfermedad coronaria desde 1991, todavía existente al comenzar la terapia

9.): Terapia previa y acompañante durante la terapia de quimioterápico/selenio: Kerlone, Adalat, desde 1991 hasta V/95

10.): Estado de supervivencia: difunto

: Fecha de defunción: 31.08.1994; condicionado por el tumor.

Paciente Nº 2

1.): Diagnóstico: hipernefroma con metástasis

2.): Fecha del diagnóstico (mes/año): abril de 1996

3.): Histología: hipernefroma

4.): Estado del tumor en el momento de comenzar la terapia: T2, N1, M1

: (T = extensión del tumor primario

: N = presencia de metástasis en ganglios linfáticos

: M = presencia de metástasis distantes)

5.): Localización de las metástasis distantes: pulmón, hígado

\newpage

6.): Tratamiento previo del tumor:

: Nefrectomía en 1996: interleucina II desde IX/97 hasta I/98

7.): Terapia con quimioterapia/selenio:

a): Quimioterápico: Gemzar, 2 g i.v., desde 1/98 hasta V/98

b): Selenio: Selenase®, 30 mg i.v., desde 1/98 hasta V/98

c): Reacción a la terapia: remisión parcial

d): Duración del tratamiento: hasta ahora 5 meses

e): Motivo para finalizar la terapia: ninguno

f): Tolerabilidad de la terapia: buena

8.): Enfermedades previas y acompañantes: policitemia desde 1990; aún existente al comenzar la terapia

9.): Terapia acompañante durante la terapia de quimioterápico/selenio: ninguna

10.): Estado de supervivencia: vive; ultima observación: 18.05.1998.

Paciente Nº 3

2.): Fecha del diagnóstico (mes/año): mayo de 1997

3.): Histología: adenocarcinoma, grado II

4.): Estado del tumor en el momento de comenzar la terapia: T3, N1, M1

: (T = extensión del tumor primario

: N = presencia de metástasis en ganglios linfáticos

: M = presencia de metástasis distantes)

5.): Localización de las metástasis distantes: huesos

6.): Tratamiento previo del tumor: orquiectomía bilateral en 1997

7.): Terapia con quimioterápico/selenio:

a): Quimioterápico: Adriblastina, 40 mg i.v., desde II/98 hasta V/98

b): Selenio: Selenase®, 30 mg i.v., desde II/98 hasta V/98

c): Reacción a la terapia: remisión completa

d): Duración del tratamiento: hasta ahora 3 meses

e): Motivo para finalizar la terapia: ninguno

f): Tolerabilidad de la terapia: buena

8.): Enfermedades previas y acompañantes: ninguna

9.): Terapia acompañante durante la terapia quimioterápico/selenio: bisfosfonato (Bondronato) desde II/98 hasta V/98

10.): Estado de supervivencia: vive; última observación: el 20.05.1998

Paciente Nº 4

1.): Diagnóstico: carcinoma de páncreas

2.): Fecha del diagnóstico (mes/año): octubre de 1994

3.): Histología: adenocarcinoma, grado II

4.): Estado del tumor en el momento de comenzar la terapia: T4, N1, M0

: (T = extensión del tumor primario

: N = presencia de metástasis en ganglios linfáticos

: M = presencia de metástasis distantes)

5.): Localización de las metástasis distantes: ninguna

6.): Tratamiento previo del tumor: laparotomía explorativa en 1994, gastroenterostomía

7.): Terapia con quimioterapia/selenio:

a): Quimioterápico: 5-fluorouracilo, 750 mg i.v., desde X/94 hasta VI/95, mitomicina, 10 mg i.v., desde X/94 hasta VI/95

b): Selenio: Selenase® 10 mg i.v., desde X/94 hasta VI/95

c): Reacción a la terapia: remisión completa, ausencia de dolor, aumento de peso

d): Duración del tratamiento: 9 meses

e): Motivo para finalizar la terapia: VI/95 metástasis en el cerebro

f): Tolerabilidad de la terapia: buena

8.): Enfermedades previas y acompañantes: ninguna

9.): Terapia acompañante durante la terapia quiminoterápico/selenio: ninguna

10.): Estado de supervivencia: fecha de defunción: 29.08.1995; condicionada por tumor.

Paciente Nº 5

1.): Diagnóstico: carcinoma de páncreas y carcinoma gástrico

2.): Fecha del diagnóstico (mes/año): noviembre de 1997

3.): Histología: adenocarcinoma, grado III

4.): Estado del tumor en el momento de comenzar la terapia: T4, N1, M1

: (T = extensión del tumor primario

: N = presencia de metástasis en ganglios linfáticos

: M = presencia de metástasis distantes)

5.): Localización de las metástasis distantes: hígado, ganglios linfáticos

6.): Tratamiento previo del tumor:

a): Operación: laparotomía de prueba, gastroenterostomía en 1997

b): Quimioterapia: Gemza, desde XI/97 hasta I/98, alta dosis de 5-fluorouracilo y leucovorinas de I/98 hasta III/98, Oxaliplatino desde III/98 hasta IV/98

7.): Terapia con quimioterápico/selenio:

a): Quimioterápico: Gemzar, 1,2 mg i.v., desde IV/98 hasta V/98, mitomicina, 10 mg i.v., desde IV/98 hasta V/98

b): Selenio: Selenase®, 30 mg, i.v., desde IV/98 hasta V/98

c): Reacción a la terapia: remisión parcial, considerable reducción del dolor

d): Duración del tratamiento: 1 mes

e): Motivo de la finalización de la terapia: defunción

f): Tolerabilidad de la terapia: estomatitis pronunciada

8.): Enfermedades previas o acompañantes: ninguna

10.): Estado de supervivencia: difunto

: Fecha de defunción: 13.05.1998;

: Causa de muerte: pancitopenia.

Claims

1. Uso de selenio y/o al menos un compuesto de selenio para aumentar el efecto del citostático gemcitabina o del citostático mitomicina C.

2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto de selenio es un compuesto orgánico de selenio.

3. Uso según la reivindicación 2, caracterizado porque el compuesto orgánico de selenio es selenometionina.

4. Uso según la reivindicación 2, caracterizado porque el compuesto orgánico de selenio es selenocisteína.

5. Uso según la reivindicación 2, caracterizado porque el compuesto orgánico de selenio es fenilenbis(metilen)selenocianato.

6. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto de selenio es un óxido de selenio.

7. Uso según la reivindicación 6, caracterizado porque el compuesto de selenio es una sal de SeO_{2}.

8. Uso de selenio y/o al menos un compuesto que contiene selenio, en combinación con el cistostático gemcitabina o con el citostático mitomicina C, para preparar un medicamento para el tratamiento del cáncer, caracterizado porque se usa el selenio y/o el compuesto de selenio en una concentración de 0,1 mg/kg de peso corporal a 1,25 mg/kg de peso corporal y el citostático en una concentración de 2 mg/m^{2} de superficie corporal a 240 g/m^{2} de superficie corpo-
ral.

9. Uso según la reivindicación 8, caracterizado porque se usa el selenio y/o el compuesto de selenio en una concentración de 0,1 mg/kg de peso corporal a 0,3 mg/kg de peso corporal, y el citostático en una concentración de 20 mg/m^{2} de superficie corporal a 1000 mg/m^{2} de superficie corporal.

10. Uso según las reivindicaciones 8 ó 9, caracterizado porque el compuesto de selenio es un compuesto orgánico de selenio.

11. Uso según la reivindicación 10, caracterizado porque el compuesto orgánico de selenio es selenometionina.

12. Uso según la reivindicación 10, caracterizado porque el compuesto orgánico de selenio es selenocisteína.

13. Uso según la reivindicación 10, caracterizado porque el compuesto orgánico de selenio es fenilenbis(metilen)selenocianato.

14. Uso según las reivindicaciones 8 ó 9, caracterizado porque el compuesto de selenio es un óxido de selenio.

15. Uso según al menos una de la reivindicación 14, caracterizado porque el compuesto de selenio es una sal de SeO_{2}.

16. Kit que comprende

a) selenio y/o al menos un compuesto de selenio y

b) el citostático gemcitabina o el citostático mitomicina C, como preparado combinado para la administración simultánea, separada o en tiempos sucesivos, en la terapia citostática, caracterizado porque se usa el selenio y/o el compuesto de selenio en una concentración de 0,1 mg/kg de peso corporal a 1,25 mg/kg de peso corporal, y el citostático en una concentración de 2 mg/m^{2} de superficie corporal a 240 g/m^{2} de superficie corporal.

17. Kit según la reivindicación 16, caracterizado porque se usa el selenio y/o el compuesto de selenio en una concentración de 0,1 mg/kg de peso corporal a 0,3 mg/kg de peso corporal y el citostático en una concentración de 20 mg/m^{2} de superficie corporal a 1000 mg/m^{2} de superficie corporal.

18. Kit según las reivindicaciones 16 ó 17, caracterizado porque el compuesto de selenio es un compuesto orgánico de selenio.

19. Kit según la reivindicación 18, caracterizado porque el compuesto orgánico de selenio es selenometionina.

20. Kit según la reivindicación 18, caracterizado porque el compuesto orgánico de selenio es selenocisteína.

21. Kit según la reivindicación 18, caracterizado porque el compuesto orgánico de selenio es fenilenbis(metilen)selenocianato.

22. Kit según las reivindicaciones 16 ó 17, caracterizado porque el compuesto de selenio es un óxido de selenio.

23. Kit según la reivindicación 22, caracterizado porque el compuesto de selenio es una sal de SeO_{2}.