ES2237753T3 - Mimeticos de superoxido dismutasa. - Google Patents
Mimeticos de superoxido dismutasa.Info
- Publication number
- ES2237753T3 ES2237753T3 ES94930729T ES94930729T ES2237753T3 ES 2237753 T3 ES2237753 T3 ES 2237753T3 ES 94930729 T ES94930729 T ES 94930729T ES 94930729 T ES94930729 T ES 94930729T ES 2237753 T3 ES2237753 T3 ES 2237753T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- sod
- cells
- mice
- uelm
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/545—Heterocyclic compounds
- A61K47/546—Porphyrines; Porphyrine with an expanded ring system, e.g. texaphyrine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
- C07D487/22—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE, EN GENERAL, A UN METODO PARA MODULAR PROCESOS FISIOLOGICOS Y PATOLOGICOS Y EN CONCRETO A UN METODO DE MODULAR NIVELES INTRA Y EXTRACELULARES DE RADICALES DE SUPEROXIDO Y DE ESTE MODO, PROCEDIMIENTOS EN LOS QUE TALES RADICALES PARTICIPEN. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A COMPUESTOS Y COMPOSICIONES APROPIADAS PARA SU UTILIZACION EN DICHOS METODOS.
Description
Miméticos de superóxido dismutasa.
La presente invención se refiere, en general, a
un procedimiento para modular procesos fisiológicos y patológicos,
y, en particular, a un procedimiento para modular los niveles intra
y extracelulares de radicales superóxido y por lo tanto, los
procesos en los que dichos radicales participan.
Los radicales libres de oxígeno son producidos
como parte del metabolismo normal de todas las células, pero
constituyen asimismo un componente importante de la patogénesis de
muchos procesos patológicos. Por ejemplo, los radicales libres de
oxígeno constituyen elementos críticos de la patogénesis de
enfermedades del pulmón, del sistema nervioso central y del músculo
esquelético. Los radicales libres de oxígeno juegan asimismo un
papel en la modulación de los efectos del óxido nítrico (NO\cdot).
En este contexto, contribuyen a la patogénesis de los trastornos
vasculares, de las enfermedades inflamatorias y del proceso de
envejecimiento.
Se requiere un equilibrio crítico de las enzimas
defensivas respecto a los radicales de oxígeno para mantener la
función normal de las células y órganos. Las superóxido dismutasas
(SODs), una familia de metaloenzimas que cataliza la conversión
intra y extracelular de O_{2}- a H_{2}O_{2} más O_{2},
representan la primera línea de defensa contra los efectos
perjudiciales de los radicales superóxido. Los mamíferos producen
tres SODs distintas. Una es una enzima dimérica que contiene cobre y
zinc (CuZn SOD) que se encuentra en el citosol de todas las células.
Una segunda es una SOD tetramérica que contiene manganeso (Mn SOD)
que se encuentra en el interior mitocondrial, y la tercera es una
enzima tetramérica y glicosilada que contiene cobre y zinc
(EC-SOD) que se encuentra en los fluidos
extracelulares y que se une a la matriz extracelular. Se sabe que
existen, en el interior de las células, otras varias importantes
enzimas antioxidantes, que incluyen la catalasa y la glutatión
peroxidasa. Mientras que los fluidos extracelulares y la matriz
extracelular contienen sólo pequeñas cantidades de estas enzimas, se
sabe que existen otros antioxidantes extracelulares, que incluyen
"barrenderos" de radicales e inhibidores de la peroxidación de
lípidos, tales como el ácido ascórbico, el ácido úrico, y el
\alpha-tocoferol (Halliwell et al, Arch.
Biochem. Biophys. 280:1 (1990)). La falta relativa de enzimas
antioxidantes extracelulares puede reflejar la función posible de
tipos de oxígeno reactivo extracelular como moléculas bioefectoras
(Halliwell et al, Arch. Biochem. Biophys. 280:1 (1990)). La
deficiencia relativa de dichas enzimas puede también dar lugar a una
susceptibilidad más acusada para el estrés oxidante
extracelular.
La enzima EC-SOD, en muchas
localizaciones extracelulares, existe sólo a concentraciones bajas.
Mientras que su papel fisiológico in vivo tiene que definirse
todavía, en muchas localizaciones extracelulares no se cree que
EC-SOD funcione como un "barrendero" en masa de
O_{2}^{-}. Tal como se ha indicado anteriormente,
EC-SOD es una glicoproteína tetramérica que contiene
Cu/Zn, con un peso molecular de la subunidad de 30.000 (Marklund,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7634 (1982); Tibell et al,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6634 (1987); véase también USP
5.130.245 y WO 91/04315). Los datos bioquímicos sugieren que
EC-SOD se une a proteoglicanos de sulfato de heparán
en las células endoteliales, donde se ha especulado que sirve como
una "capa protectora" (Marklund, J. Clin. Invest. 74:1398
(1984); Karlsson et al, Biochem. J. 255:223 (1988)). Las
células endoteliales secretan tanto O_{2}^{-} (Halliwell, Free
Radical Res. Commun. 5:315 (1989) como el factor de relajación
derivado del endotelio, que se identifica putativamente como óxido
nítrico (NO\cdot). (Noak and Murphy, en Oxidative Stress
Oxidants and Antioxidants, eds Sies, H. (Academic, San Diego), págs.
445-489 (1991). NO funciona como un vasoregulador y
como un regulador de la neurotransmisión (Schuman y Madison, Science
254:1503 (1991)). El NO puede, sin embargo, ser tóxico para las
neuronas en algunas situaciones (Dawson et al, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88:6368 (1991). Se sabe que O_{2}- inactiva la
relajación vascular inducida por NO (Gryglewski et al, Nature
320:454 (1986); Rubanyi y Vanhoutte, Am. J. Physiol. 250:H822
(1986); Rubanyi y Vanhoutte, Am. J.Physiol. 250: H815 (1986); Bull
et al, Br. J. Pharmacol. 95:1308 (1988); Nucci et al,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2334 (1988)). Así, una función posible
para EC-SOD es proteger el NO que se libera de las
células de la inactivación mediada por el O_{2}^{-}.
También se sabe que la reacción de O_{2}^{-}
con NO produce un intermediario potencialmente tóxico en forma del
anión peroxinitrito (ONOO^{-}) (Beckman et al, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87:1620 (1990); Mulligan et al, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88:6338 (1991); Hogg et al, Biochem. J.
281:419 (1992); Matheis et al, Am. J. Physiol. 262:H616
(1992). De este modo, EC-SOD puede asimismo
funcionar para evitar la formación de ONOO^{-}.
Sorprendentemente, se ha descubierto que
EC-SOD aumenta, más que disminuye, la toxicidad del
O_{2} para el sistema nervioso central, y que este efecto de
EC-SOD tiene lugar a través de la modulación del NO.
Este resultado implica a NO como un importante mediador en la
toxicidad del O_{2}. La invención, pues, se refiere a
procedimientos para manipular la función del óxido nítrico que
implican la utilización de antioxidantes extracelulares. Estos
procedimientos encuentran aplicación en varios estados patológicos y
no patológicos, en los que el estrés oxidativo juega un papel,
incluyendo la inflamación. En un sentido más amplio, la invención se
refiere generalmente a procedimientos para modular los procesos
intra y extracelulares en los que O_{2}^{-} participa.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para modular los niveles intra o extracelulares de
radicales superóxido. Más particularmente, la invención se refiere a
un procedimiento para modular los procesos normales o patológicos
que implican a los radicales superóxido, utilizando, por ejemplo,
miméticos de la SOD de bajo peso molecular.
En un aspecto, la invención proporciona la
utilización de un mimético de la superóxido dismutasa de fórmula
o de una sal suya farmacéuticamente
aceptable, en la
que
R_{1} es un enlace,
en la que X es un halógeno e Y es
un grupo alquilo, y en la
que
indica el enlace a R_{2} en
cualquier posición;
e
indica el enlace a R_{2} y el
sustituyente en cualquier posición;
y
R_{2} es un enlace, -(CY'_{2})_{n}-,
-(CY'_{2}-CY'=CY')_{n}-,
-(CY'_{2}-CY'_{2}-CH=CH)_{n}-,
-(CY'=CY')_{n}-, o
--- (CY'_{2}
---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}})_{n^{-}},
en la que Y' es hidrógeno o un
grupo alquilo y en la que n es 1 a 8;
y
R_{3} es -Y'', -OH, -NH_{2},
-N^{+}(Y'')_{3}, -COOH, -COO-, -SO_{3}H, -SO_{3},
-CH_{2}-PO_{3}H_{2} o
-CH_{2}-PO_{3}H-, en la que Y'' es un grupo
alquilo,
que forma un complejo con el manganeso;
en la preparación de un medicamento para proteger
a las células de la toxicidad inducida por el radical superóxido en
cualquiera o varias de las siguientes aplicaciones:
1. la protección contra las lesiones isquémicas
de reperfusión asociadas al infarto de miocardio, ictus, trauma
cefálico agudo, reperfusión de órganos después de trasplante,
isquemia intestinal, infarto pulmonar, oclusión quirúrgica del flujo
sanguíneo, o lesiones de los tejidos blandos;
2. la protección contra lesiones esqueléticas de
reperfusión:
3. la protección contra la agresión a la piel y a
los ojos de la luz solar;
4. la protección contra la agresión ocular del
glaucoma o de la degeneración macular;
5. la protección contra las enfermedades
óseas;
6. la protección contra los trastornos del tejido
conjuntivo asociados a defectos en la síntesis o degradación del
colágeno;
7. el tratamiento de las enfermedades del sistema
nervioso central;
8. el tratamiento de las enfermedades de la
musculatura;
9. el tratamiento de los trastornos
neurológicos;
10. el tratamiento de la artritis, hipertensión
sistémica, arteriosclerosis, edema, shock séptico, hipertensión
pulmonar, impotencia, infertilidad, endometriosis, contracciones
uterinas prematuras, trastornos de la memoria, infecciones
microbianas, y/o gota;
11. el tratamiento de inflamaciones; y
12. el tratamiento de sinusitis crónica, y/o de
enfermedades autoinmunes.
En otro aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para proteger las células vegetales de la toxicidad
inducida por los radicales superóxido, que comprende el contacto de
dichas células con una cantidad que no sea tóxica y sea suficiente
para llevar a cabo dicha protección, de un mimético de la superóxido
dismutasa de fórmula
o de una sal de la misma
farmacéuticamente aceptable, en la
que
R_{1} es un enlace,
en la que X es un halógeno e Y es
un grupo alquilo, y en la
que
\vskip1.000000\baselineskip
indica el enlace a R_{2} en
cualquier posición;
e
\vskip1.000000\baselineskip
indica el enlace a R_{2} y el
sustituyente en cualquier posición;
y
R_{2} es un enlace, -(CY'_{2})_{n}-,
-(CY'_{2}-CY'=CY')_{n}-,
-(CY'_{2}-CY'_{2}-CH=CH)_{n}-,
-(CY'=CY')_{n}-, o
--- (CY'_{2}
---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}})_{n^{-}},
en la que Y' es hidrógeno o un
grupo alquilo y en la que n es 1 a 8;
y
R_{3} es -Y'', -OH, -NH_{2},
-N^{+}(Y'')_{3}, -COOH, -COO-, -SO_{3}H, -SO_{3}-,
-CH_{2}-PO_{3}H_{2} o
-CH_{2}-PO_{3}H-, en la que Y'' es un grupo
alquilo,
que forma un complejo con el manganeso;
Los objetivos y ventajas de la presente invención
resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción.
La Figura 1 muestra el vector de expresión de
EC-SOD utilizado para producir ratones transgénicos.
Los ratones transgénicos se recuperaron una vez que la cámara
alcanzó 6 ATA. *p<0,05 se ensayó mediante análisis de varianza
con el ensayo-F de Scheffe, comparada con los
ratones no transgénicos tratados con solución salina.
La Figura 2 muestra el análisis Northern de
tejidos procedentes de ratones transgénicos. 20 \mug del ARN total
de los tejidos de los ratones transgénicos se desnaturalizaron con
gloxal y se sometieron a electroforesis mediante un gel de agarosa
al 1,2%, y se transfirieron a nitrocelulosa. El filtro se sometió a
sondeo con el cADN EC-SOD humano completo. La banda
de 2,5 Kb corresponde al ARNm del transgén humano
EC-SOD que contiene la secuencia de intervención de
1 Kb (véase Figura 1). La banda de 1,5 Kb corresponde al ARNm
completamente procesado del transgén EC-SOD
humano.
La Figura 3 muestra la tasa de supervivencia de
los ratones transgénicos y no transgénicos expuestos a 6 ATA de
oxígeno durante 25 minutos. A los ratones se les inyectó una
solución salina o se les administraron 20 mg/kg de
N-\omega-nitro-L-arginina
(LNNA) por vía intraperitoneal, 10 minutos antes de compresión. Se
inyectaron intraperitonealmente 400 mg/kg de dietilditiocarbamato
(DDC) en solución salina 55 minutos antes de la compresión. Se
ensayó *p<0,017 mediante \chi^{2} con la corrección de
Bonferroni, comparada con los ratones transgénicos tratados con
solución
salina.
salina.
La Figura 4 muestra el tiempo para el inicio del
primer ataque en los ratones transgénicos y no transgénicos
expuestos a 6 ATA de oxígeno. A los ratones se les inyectó una
solución salina o se les administraron 20 mg/kg de
N-\omega-nitro-L-arginina
(LNNA) por vía intraperitoneal, 10 minutos antes del inicio de la
compresión. Se inyectaron 400 mg/kg de dietilditiocarbamato (DDC)
intraperitonealmente 55 minutos antes de la compresión. Los
resultados se expresan como la media \pm S.D. del tiempo para el
inicio del primer ataque con el tiempo 0 tomado una vez que la
cámara alcanzó 6 ATA. Se ensayó *p<0,05 mediante análisis de
varianza con el ensayo-F de Scheffe, comparada con
los ratones no transgénicos tratados con solución salina.
La Figura 5 muestra el efecto del
dietilditiocarbamato y del \beta-mercaptoetanol
sobre la supervivencia en 6 ATA de oxígeno durante 30 minutos. A
ratones (C57BL/6 X C3H)F1 se les inyectó intraperitonealmente
solución salina, con 180 mg/kg de
\beta-mercaptoetanol (2-ME), o 400
mg/kg de dietilditiocarbamato (DDC) en solución salina, 55 minutos
antes de la compresión. *p<0,025 se ensayó mediante
"\chi^{2}" cuadrado con la corrección de Bonferroni,
comparada con los ratones tratados con solución salina.
La Figura 6 muestra la latencia del ataque en los
ratones de tipo salvaje expuestos a 6 ATA de oxígeno después de
haber sido tratados con solución salina o con 20 mg/kg de
N-\omega-nitro-L-arginina
(LNNA) o 20 mg/kg de
N-\omega-nitro-L-arginina
más 50 mg/kg de L-arginina (LNNA +
L-Arg). Se ensayó *p<0,05 mediante análisis de
varianza con un ensayo-t pareado de Student,
comparada con los ratones tratados con solución salina.
La Figura 7 muestra la tasa de supervivencia en
los ratones de tipo salvaje expuestos a 6 ATA de oxígeno. A los
ratones se les administró una inyección intraperitoneal de solución
salina normal (0,008 cc/g) o 20 mg/kg de
N-\omega-nitro-arginina
(LNNA) (0,008 cc/g) 15 minutos antes de la compresión. Los ratones
se expusieron a 6 ATA de oxígeno durante 20 minutos (n = 10, sólo
solución salina), 25 minutos (n = 10, ambos grupos), 30 minutos (n =
10, sólo solución salina), 50 minutos (n = 6 sólo LNNA), 75 minutos
(n = 12, sólo LNNA), 90 minutos (n = 14, sólo LNNA), 105 minutos (n
= 6 sólo LNNA) y 120 minutos (n = 6, sólo LNNA), midiéndose la tasa
de supervivencia para cada grupo.
La Figura 8 muestra la curva dosis respuesta de
supervivencia para la
N-\omega-nitro-arginina
(LNNA). A los ratones de tipo salvaje se les administró una
inyección intraperitoneal de solución salina normal (0,008 cc/g), ó
0, 2, 10, 20 ó 30 mg/kg LNNA (0,008 cc/g) 15 minutos antes de la
compresión, exponiéndolos entonces a los 75 minutos a 6 ATA de
oxígeno. La tasa de supervivencia se calculó para cada grupo de
tratamiento.
La Figura 9 muestra la tasa de supervivencia en
ratones de tipo salvaje pretratados con solución salina, 20 mg/kg de
N-\omega-nitro-L-arginina
(LNNA), o 20 mg/kg de
N-\omega-nitro-L-arginina
más 50 mg/kg de L-arginina (LNNA +
L-Arg), exponiéndose entonces por vía
intraperitoneal a 75 minutos de 6 ATA de oxígeno. *p<0,05 se
ensayó mediante \chi-cuadrado con la corrección de
Bonferroni.
La Figura 10 muestra la tasa de supervivencia en
ratones transgénicos y no transgénicos expuestos a 6 ATA de oxígeno
durante 75 minutos. Los ratones se inyectaron con solución salina, o
se les administraron 20 mg/kg de
N-\omega-nitro-L-arginina
(LNNA) intraperitonealmente 10 minutos antes de compresión.
*p<0,05 se ensayó mediante "\chi^{2}" cuadrado con los
ratones no transgénicos tratados con solución salina.
\dagger*p<0,05 se ensayó mediante \chi^{2}comparado con los
ratones transgénicos tratados con solución salina.
La Figura 11 muestra la comparación de la
formación de edema en los ratones transgénicos
EC-SOD con la formación de edema en la descendencia
no transgénica, después de la lesión inducida por el frío en el
hemisferio cerebral derecho, así como en los ratones sin lesiones.
Los valores están representados como la media \pm el error
estándar. *p<0,05 se comparó con el índice de edema de los
respectivos controles no transgénicos utilizando un ensayo t pareado
de Student.
La Figura 12 muestra el efecto de los niveles
aumentados de EC-SOD sobre los cambios en la
permeabilidad vascular después de la lesión cerebral inducida por
el frío. La permeabilidad vascular se demuestra como la fuga del
azul de Evan en los hemisferios cerebrales derechos con lesiones de
los ratones no transgénicos (controles) y de los ratones
transgénicos EC-SOD.
La Figura 13 muestra un análisis de transferencia
Western de rh-EC-SOD y de un
homogenado pulmonar humano para demostrar la especificidad del
anticuerpo. Se separaron las proteínas sobre un gel de
SDS-poliacrilamida de 0,75 mm al 10%, y se
transfirieron a nitrocelulosa. Las proteínas se hibridizaron con el
anticuerpo para el EC-SOD recombinante humano (4,3
\mug/ml) y el anticuerpo se detectó mediante hibridación con la
^{125}I-proteína A, seguido por autoradiografía.
El carril EC-SOD contenía 0,05 \mug de la proteína
CEC-SOD del carril, recombinante pura de tipo
humano. El carril pulmonar contenía 10 \mug de un sobrenadante
20000 x g de un homogenado pulmonar humano.
Las Figuras 14A-14C muestran la
localización inmunohistoquímica con el microscopio óptico de
BC-SOD en el pulmón humano. Los tejidos se marcaron
utilizando el anticuerpo para el BC-SOD humano
recombinante (5,4 mg/ml;
anti-EC-SOD) o el mismo anticuerpo
en el cual la IgG anti-EC-SOD se
absorbió fuera utilizando EC-SOD recombinante
purificado unido a CNBr-sepharose
(EC-SOD absorbido). El anticuerpo se detectó
utilizando una técnica de marcado con
biotina/estreptavidina-peroxidasa de rábano. A, Gran
arteria pulmonar elástica marcada con
anti-EC-SOD. Nótese el marcado
alrededor de las células musculares lisas bajo el endotelio y bajo
la capa elástica del vaso (flecha corta) y la falta de marcado para
EC-SOC en la superficie de las células endoteliales
(flechas abiertas) y sobre la elastina (flechas largas). B, Arteria
pulmonar muscular marcada con
anti-EC-SOD. Nótese el marcado
abundante en la matriz de tejido conjuntivo que rodea el vaso y los
linfáticos (flechas largas), en la matriz que rodea las células
musculares (flechas cortas), y la falta de marcado en la superficie
de las células endoteliales (flechas abiertas). C, Arteria pulmonar
muscular marcada con el antisuero absorbido con
EC-SOD. La absorción de Ig
anti-EC-SOD abolió todos los
marcados en el vaso muscular (bares = 50 \mum).
Las Figuras 15A-15C muestran la
localización inmunohistoquímica de EC-SOD en el
pulmón humano. Los tejidos se marcaron utilizando el anticuerpo para
el EC-SOD recombinante humano (5,4 mg/ml;
anti-EC-SOD). El anticuerpo se
detectó utilizando una técnica de marcado
biotina/estreptavidina-peroxidasa de rábano. A, Gran
vía aérea cartilaginosa marcada con
anti-EC-SOD. Nótese el marcado
intenso para EC-SOD en la matriz alrededor de las
células musculares lisas (flechas cortas), entre las células
epiteliales (flechas largas) y la falta de marcado en la superficie
de las células epiteliales (flechas abiertas), y en la matriz del
cartílago (asterisco). B, Vía aérea no cartilaginosa marcada con
anti-EC-SOD. Nótese el marcado
intenso para EC-SOD a través de la matriz entera,
por debajo del epitelio (flechas cortas), y la falta de marcado en
la superficie del epitelio (flechas abiertas). Parénquima pulmonar
marcado con anti-EC-SOD. El Marcado
EC-SOD se localiza primariamente en las puntas de
los septos alveolares (flecha cortas) y en la matriz que rodea a los
pequeños vasos (flechas largas). No se apreció marcado para
EC-SOD en la superficie de las células epiteliales
alveolares (flechas abiertas) (Bares = 50 \muM).
Las Figuras 16A-16C muestran la
inmunolocalización con el microscopio electrónico de
EC-SOD en el tejido conjuntivo vascular. Los tejidos
se marcaron utilizando el anticuerpo para el EC-SOD
recombinante humano
(40 \mug/ml; anti-EC-SOD) o el mismo anticuerpo después de que la IgG anti-EC-SOD se absorbiera fuera utilizando el EC-SOD recombinante purificado unido a CNBr-sepharose (EC-SOD absorbido). El anticuerpo se detectó utilizando 10 nm de proteína-A oro. A, colágeno vascular marcado con anti-EC-SOD. B, elastina vascular marcada con anti-EC-SOD. C, colágeno vascular marcado con antisuero absorbido con EC-SOD. Nótese el intenso marcado de EC-SOD en asociación con el colágeno de tipo I y la falta de marcado en asociación con la elastina (E). Además, la absorción del anticuerpo anti-EC-SOD abolió todos los marcados para EC-SOD en asociación con el colágeno de tipo I (Bares = 200 nm).
(40 \mug/ml; anti-EC-SOD) o el mismo anticuerpo después de que la IgG anti-EC-SOD se absorbiera fuera utilizando el EC-SOD recombinante purificado unido a CNBr-sepharose (EC-SOD absorbido). El anticuerpo se detectó utilizando 10 nm de proteína-A oro. A, colágeno vascular marcado con anti-EC-SOD. B, elastina vascular marcada con anti-EC-SOD. C, colágeno vascular marcado con antisuero absorbido con EC-SOD. Nótese el intenso marcado de EC-SOD en asociación con el colágeno de tipo I y la falta de marcado en asociación con la elastina (E). Además, la absorción del anticuerpo anti-EC-SOD abolió todos los marcados para EC-SOD en asociación con el colágeno de tipo I (Bares = 200 nm).
La Figura 17 muestra la inmunolocalización
electrón microscópica de EC-SOD alrededor del
músculo liso vascular. Los tejidos se marcaron utilizando el
anticuerpo para el EC-SOD recombinante humano (40
\mug/ml). El anticuerpo se detectó utilizando 10 nm de proteína
A-oro. Existe un alto grado de marcado en la matriz
del tejido conjuntivo alrededor de las células musculares lisas
vasculares en asociación con el colágeno de tipo I (flechas cortas),
y otros elementos matriciales no identificados (flechas largas)
(bares = 200 nm)
Las Figuras 18A-18B muestran la
inmunolocalización con el microscopio electrónico de
EC-SOD en la superficie de las células endoteliales
pulmonares. Los tejidos se marcaron utilizando el anticuerpo para el
EC-SOD recombinante humano (40 \mug/ml). El
anticuerpo se detectó utilizando 10 nm de la proteína -A oro. A,
célula endotelial de una pequeña arteria pulmonar muscular, B,
célula endotelial de un capilar pulmonar. En la superficie de las
células endoteliales, el EC-SOD no fue marcado
(flechas cortas). EC-SOD se aprecia en el plasma (P)
y se asocia con las proteínas de la matriz extracelular por debajo
del endotelio (flechas largas). (Bares = 200 nm).
La Figura 19 muestra la inmunolocalización con el
microscopio electrónico de EC-SOD alrededor de
las células epiteliales bronquiales. Los tejidos se marcaron
utilizando el anticuerpo para el EC-SOD recombinante
humano (40 \mug/ml).El anticuerpo se detectó utilizando 10 nm de
la proteína-A oro. EC-SOD se
encontró en la unión entre las células epiteliales (flecha) y
asimismo, también se apreció en algún grado en el interior de las
células (Bares = 200 nm).
Las Figuras 20A-20D muestran un
mapa de restricción parcial, estrategia secuencial, estructura
genómica, y estructura proteica del Clon #7 EC-SOD
humano. Figura 20A, un mapa de restricción parcial del clon #7
genómico EC-SOD humano se muestra en el sentido 5' a
3'. Se indica un marcador de 1 kb de tamaño. B, BamH I; H, Hind III;
P, Pst I; S, Sal I; K, Kpn I; E, Eco RI. En la Figura 20B, se
muestran la subclonación y la estrategia secuencial. Fragmentos de
restricción, de varios tamaños, que se solapaban, se subclonaron en
el vector plasmídico pGEM3Zf(+) para el subsiguiente análisis
secuencial del ADN. Todo el ADN fue secuenciado en las dos cadenas
utilizando Sequenase (USB) y una matriz de ADN bicatenario, excepto
para ^{-}2 kb del fragmento 3' 7K36 en el cual sólo se secuenció
un sentido. En la Figura 20C, se muestra la estructura exon/intrón
del gen EC-SOD humano. La posición de la región que
codifica preEC-SOD en el exón 3 se muestra mediante
las líneas rayadas. En la Figura 20D, se esquematizan los cuatro
dominios estructurales de la proteína EC-SOD humana.
El péptido señal está indicado por una flecha. Éste es seguido por
el dominio del péptido terminal amino glicosilado maduro (CHO). Una
tercera región posee una homología secuencial muy alta de
aminoácidos respecto al CuZn-SOD humano. El dominio
terminal carboxilo posee múltiples residuos básicos cargados (+),
que son críticos para la unión del glucosaminoglicano heparina.
Las Figuras 21A-21B muestran
transferencias Northern de EC-SOD de múltiples
tejidos humanos. Fig 21A, 2 \mug de poli A(+) ARN_{m} de ocho
distintos tejidos humanos se sometieron a electroforesis en un gel
desnaturalizante de agarosa, se transfirieron a una membrana de
nylon cargada, y se sondearon con cARN EC-SOD humano
antisentido marcado con [^{32}P]. Los marcadores de tamaño
molecular del ARN (kilobases) se muestran a la derecha. Se controló
la transferencia cuantitativa mediante tinción con bromuro de
etidio. Los resultados mostraron un único ARNm de 1,4 kb que se
encontraba en la totalidad de los 8 tejidos examinados. De modo
interesante, el músculo esquelético demuestra un segundo y más
grande ARNm de aproximadamente 4,2 kb, mientras que el cerebro
muestra una banda ligera de aproximadamente 2,2 kb. En la Figura
21B, las bandas que corresponden al ARNm EC-SOD se
cuantificaron mediante rastreo densitométrico con laser, que se
normalizaron en la banda cerebral de 1,4 kb, y se expresaron como
unidades relativas de absorbancia.
Las Figuras 22A-22B muestran el
análisis del sitio de iniciación de la transcripción. La técnica de
amplificación rápida 5' de los extremos del cADN (5'RACE) se utilizó
para identificar el sitio de iniciación de la transcripción para
el gen humano EC-SOD. En la Fig 22A, un diagrama
esquemático ilustra los sitios de hibridización para los distintos
oligonucleótidos. La línea oscura representa la primera cadena del
cADN transcrito inversamente del poly A (+) ARMm del corazón humano
que se cebó con EC7 (un iniciador específico del gen
EC-SOD) y a la que se añadió una cola poly C
utilizando la desoxinucleotidil transferasa (TdT). HEC1, HEC2, EC4 y
EC7 son iniciadores específicos del gen EC-SOD
humano en el extremo 5'. El iniciador de anclaje se suministra con
el equipo 5' RACE (GIBCO BRL) y se hibridiza a la cola poly C. En la
Figura 22B, se utilizó PCR para amplificar los segmentos del ADN
utilizando [el anclaje + EC4] o [HEC1 + EC7] como iniciadores y el
cADN con una cola poly C añadida (+TdT, carriles 1 & 4) o sin la
cola poly C (-TdT, carriles 2 & 5), como matriz. El carril 3
incluye ADN amplificado mediante PCR utilizando [HEC1 + EC7] como
iniciadores y un cADN EC-SOD humano completo como
matriz. Los ADNs resultantes amplificados resultantes se sometieron
a electroforesis sobre un gel de agarosa al 2%, se transfirieron a
membranas de nylon cargadas y se sondearon con HEC2 marcado con
[^{32}P], un iniciador empalmado con el extremo 5', específico del
gen EC-SOD. Los marcadores de peso molecular del ADN
se procesaron entre los carriles 2 y 3. El tamaño esperado de la
región amplificada mediante PCR, en los carriles 3, 4 y 5, es de 217
pares de bases. Sólo en el carril 1 se apreció una banda única, con
un tamaño molecular de aproximadamente 185 a 200 pares de
bases.
bases.
La Figura 23 muestra el análisis genómico de la
transferencia Southern del gen humano EC-SOD. 10
microgramos del ADN humano genómico se digirieron completamente con
cada uno de los enzimas de restricción que se muestran, se
sometieron a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1% y se
transfirieron a membranas de nylon cargadas. Las transferencias se
probaron con un ARNc de longitud parcial del EC-SOD
marcado con [^{32}P] que corresponde a los primeros 1050
nucleótidos aproximadamente, y que se autoradiografió. La
endonucleasa específica de restricción se muestra en la parte
superior de cada carril. Los marcadores de tamaño molecular del ADN
(en kilobases), se indican a la derecha.
La Figura 24 muestra la secuencia nucleótida y la
secuencia aminoácida deducida del gen humano EC-SOD.
Se muestra la secuencia nucleótida completa del gen humano. La
secuencia aminoácida deducida del péptido señal y de la proteína
madura, se indica utilizando el código aminoácido de letras
únicas.
La Figura 25 muestra un gráfico de
Lineweaver-Burk que demuestra la inhibición no
competitiva de la xantina oxidasa por MnTBAP.
La Figura 26 muestra la protección de las células
endoteliales de la arteria pulmonar ejercida por MnTBAP, de la
lesión inducida por la xantina-oxidasa. Control
\boxempty; MnTBAP 100 .
La Figura 27 muestra la protección de las células
epiteliales pulmonares ejercida por los miméticos SOD, de la lesión
inducida por el paraquat.
La Figura 28 muestra la protección de las células
endoteliales de la arteria pulmonar ejercida por MnTBAP, de la
lesión inducida por el paraquat.
La Figura 29 muestra la ausencia de protección de
la lesión inducida por el paraquat en las células endoteliales de la
arteria pulmonar, ejercida por ZnTBAP.
La Figura 30 muestra la protección de MnTBAP de
la lesión pulmonar inducida por el paraquat.
La presente invención se refiere a la protección
contra los efectos perniciosos de los radicales superóxido y a
evitar y tratar estados patológicos que implican o tienen como causa
el estrés oxidativo. La invención se refiere asimismo a modular los
procesos biológicos que implican a los radicales superóxido.
Los miméticos de SOD que son apropiados para su
utilización en estos procedimientos incluyen derivados mangánicos de
porfinas metino sustituidas, o sus sales farmacéuticamente
aceptables. Los miméticos preferidos tienen la fórmula:
en la que R_{1}, R_{2} y
R_{3} son tal como se ha definido
anteriormente
En una forma de realización más específica,
R_{1} es un enlace,
en la que X es Cl o Br e Y es un
grupo alquilo
C_{1}-_{4};
R_{2} es un enlace, -(CY'_{2})_{n}-,
-(CY'_{2}-CY'=CY')_{n}-,
-(CY'_{2}-CY'_{2}-CH=CH)_{n}-,
-(CY'=CY')_{n}-, o
--- (CY'_{2}
---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}})_{n^{-}},
en la que Y' es hidrógeno o un
grupo alquilo C_{1}-_{4} y en la que n es 1 a 4;
y
R_{3} es -Y'', -OH, -NH_{2},
-N^{+}(Y'')_{3}, -COO-, -COO^{-}, -SO_{3}-,
-SO_{3}; -C-PO_{3}H^{-} o
-C-PO_{3}H^{-}, en la que Y'' es un grupo
alquilo C_{1}-_{4}.
En otra forma de realización específica,
R_{1} es un enlace,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X es Cl o Br e Y es
metilo ó etilo,
y
R_{2} es un enlace, -(CY'_{2})_{n}-,
-(CY'_{2}-CY'=CY')_{n}-,
-(CY'_{2}-CY'_{2}-CH=CH)_{n}-,
-(CY'=CY')_{n}-, o
--- (CY'_{2}
---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}})_{n^{-}};
en la que Y' es hidrógeno o metilo
o etilo y en la que n es 1 ó 2;
y
R_{3} es metilo, etilo, -OH, -NH_{2},
-N^{+}(CH_{3})_{3},
N^{+}(CH_{2}CH_{3})_{3}, -COO-, -COO^{-},
-SO_{3}-, -SO_{3}^{-} -C-PO_{3}H_{-} o
-C-PO_{3}H^{-}.
En otra forma de realización específica,
R_{1} es un enlace,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Y es alquilo,
preferentemente alquilo C_{1}-_{4}, más
preferentemente metilo o
etilo,
R_{2} es un enlace, -(CY'_{2})_{n}-,
-(CY'=CY')_{n}-, o
--- (CY'_{2}
---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}})_{n^{-}},
en la que Y' es hidrógeno o un
grupo alquilo (preferentemente C_{1}-_{4}
alquilo, más preferentemente metilo o etilo), y en la que n es 1 a 4
(preferentemente 1 ó 2);
y
R_{3} es C_{1}-_{4}
alquilo, (preferentemente metilo o etilo), -OH, -NH-,
N^{+}(CH_{3})_{3},
-N^{+}(CH_{2}CH_{3})_{3} -COO-, -COO^{-},
-SO_{3}-, -SO_{3}^{-}, -C-PO_{3}H ó
-C-PO_{3}H^{-},
En todavía otra forma de realización
específica,
R_{1} es un enlace,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R_{2} es un enlace, -(CY'_{2})_{n}-,
o -(CY'=CY')_{n}-, en la que Y' es hidrógeno o álcali
(preferentemente álcali C_{1-4}, más
preferentemente metilo o etilo), y en la que n es 1 a 4
(preferentemente 1 ó 2) y
R_{3} es C_{1}-_{4}
alquilo, (preferentemente metilo o etilo), -OH, -NH-,
N^{+}(CH_{3})_{3},
N^{+}(CH_{2}CH_{3})_{3} -COO-, -COO^{-},
-SO_{3}-, -SO_{3}^{-}, -C-PO_{3}H^{-} ó
-C-PO_{3}H^{-}.
Además de los sustituyentes que se han descrito
anteriormente, uno o más de los anillos pirrólicos de la porfirina
pueden ser sustituidos con un grupo que retire los electrones, por
ejemplo, un grupo NO_{2}, un halógeno (por ejemplo, Cl), o un
nitrito.
Miméticos específicos apropiados para su
utilización en estos procedimientos incluyen Mn (III)tetrakis
(1-metil-4-piridil)porfirina
(MnTMPyP), Mn(III) tetrakis
(4-trimetil-aminofenil)porfirina
(MnTMAP) y Mn (III) tetrakis (4-ácido benzoico)porfirina
(MnTBAP).
Pueden producirse formas dirigidas de los
miméticos acoplando directamente o mediante un engarce a una
superficie celular o a la matriz extracelular, la fracción que va a
hacer diana. Los miméticos dirigidos pueden utilizarse para imitar a
EC-SOD. Ya que se conoce la secuencia del
EC-SOD humano (Hjalmarsson et al, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:6340 (1987)), el oligopéptido
C-terminal puede prepararse y unirse al "núcleo
mimético" (por ejemplo, una
Mn(III)-porfirina) a través, por ejemplo, de
un grupo amino o carboxilo libre, con una reacción de acoplamiento
de la
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)
carbodiimida (EDC). (Yamada et al, Biochemistry 20:4836
(1981); Davis y Preston, Anal. Biochem. 116:402 (1981) (nótese el
grupo R' en las estructuras que se dan a conocer seguidamente). Este
simple procedimiento de acoplamiento hace posible vincular una
amplia variedad de distintos dominios de unión, para dirigir a los
miméticos de EC-SOD. La afinidad de unión por la
heparina de un mimético puede evaluarse haciendo pasar el mimético
sobre una columna CL-6B de
heparina-sepharose (Karlsson et al, Biochem.
J. 256:29
(1988)).
(1988)).
Las fracciones candidatas que van a hacer diana,
apropiadas para unirse a los miméticos del SOD (por ejemplo
EC-SOD), para conferir propiedades de unión GAG,
incluyen las siguientes:
i) la hélice A+ del inhibidor de la proteína C
(Boissinot et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:250
(1993)), -NH_{2}-His Arg His His Pro Arg Glu Met
Lys Lys Arg Val Glu Asp Leu-COOH;
ii) el extremo C-terminal del
EC-SOD humano (dominio de unión de heparina)
(Karlsson et al, Biochem. J. 255:223 (1988)) -
NH_{2}-Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg
Glu Ser Glu Cys Lys Ala Ala-COOH;
iii) variantes del extremo
C-terminal del EC-SOD humano que
tienen afinidad de unión por la heparina (Sandström et al, J.
Biol. Chem. 267:18205 (1992))-
a. NH_{2} - Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg
Arg Arg Glu - COOH;
b. NH_{2} - Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg
Arg Arg Ala - COOH;
c. NH_{2} - Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg
Arg Arg Ala Ser Glu Cys Lys Ala Ala - COOH;
d. NH_{2} - Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg
Arg Arg Glu Ser Glu Ala Lys Ala Ala - COOH;
e. NH_{2} - Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg
Arg Arg Glu Ser Glu Cys Ala Ala Ala - COOH;
f. NH_{2} - Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg
Arg Arg Ala Ser Ala Cys Lys Ala Ala - COOH;
g. NH_{2} - Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg
Arg Arg Ala Ser Glu Cys Ala Ala Ala - COOH;
h. NH_{2} - Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Gly
Arg Arg Ala Ser Glu Cys Ala Ala Ala - COOH;
iv) Cualquier combinación de aminoácidos
repetitivos cambiados positivamente (es decir poly
(Arg)_{n}, poly (Lys)_{n}, poly (Arg)_{n}
(Lys)_{n}, o poly (Arg Lys)_{n} o poly (Lys
Arg)_{n}, poly (Lys Lys Arg Arg)_{n}, en los que n
es, preferentemente, del orden de 1 a 12, más preferentemente de 1 a
8, y, muy preferentemente, de 1 a 6, con o sin un Glu o Ala
C-terminal (Sandström et al, J. Biol. Chem.
267:18205 (1992)); y
v) polietileneimina, por ejemplo
(NH-CH_{2}-CH_{2}-NH)nH,
en la que n es 1 a 6.
Además de lo anterior, las fracciones que van a
hacer diana incluyen asimismo generalmente, proteínas que se unen a
la heparina e hidratos de carbono, que incluyen manosa y
oligosacáridos.
Engarces apropiados incluyen
---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}} --- NH ---
\hskip0.3cmo
\hskip0.3cm--- NH ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}},
-SO_{2}-NH-,
PO_{3}-NH- o
--- PO_{3}
---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
A continuación, se dan a conocer ejemplos
específicos de miméticos SOD apropiados (por ejemplo,
EC-SOD):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
5,10,15,20-Tetrakis
[R-grupo]
manganeso (III)
porfirina
Los miméticos apropiados para su utilización en
la presente invención pueden seleccionarse ensayando la actividad y
la estabilidad de SOD. La actividad SOD puede controlarse en
presencia y ausencia de EDTA, utilizando el procedimiento de McCord
y Fridovich (J. Biol. Chem. 244 (1969)). La eficacia de un mimético
puede determinarse midiendo el efecto del mimético sobre el
crecimiento de una cepa de E. coli "nula" SOD respecto a
una cepa de tipo salvaje. Específicamente, la E. coli de tipo
salvaje (AB1157) y la E. coli "nula" SOD (JI132) pueden
crecer en medio M9 que contiene casaminoácidos al 0,2% y glucosa al
0,2% a un pH de 7,0 y a 37ºC: el crecimiento puede controlarse en
términos de turbidez, haciendo un seguimiento espectrofotométrico a
700 nm. Los miméticos activos pueden ensayarse respecto a la
toxicidad en cultivos celulares de mamíferos midiendo la liberación
de lactato deshidrogenasa (LDH). Específicamente, las células L2 de
la rata (una célula de tipo II pulmonar; (Kaighn y Douglas, J. Cell
Biol. 59:160a(1973)) pueden crecer en medio
F-12 de Hams con un 10% de suplemento de suero fetal
de ternera a un pH de 7,4 y 37ºC; las células pueden sembrarse a
densidades iguales en placas de cultivo con 24 pocillos y
desarrollarse hasta obtener una confluencia aproximadamente del 90%;
los miméticos SOD pueden añadirse a las células a dosis logarítmicas
(por ejemplo, dosis micromolares en medio esencial mínimo (MEM)) e
incubarse durante 24 horas. La toxicidad puede evaluarse por
morfología y midiendo la liberación del marcador de lesión
citosólica, la LDH (por ejemplo, en un lector termocinético de
placa, tal como se describe por Vassault (en Methods of Enzymatic
Analysis, Bergmeyer (ed) pág 118-26 (1983); la
oxidación de NADH se mide a 340 nm). La eficacia de los miméticos
activos puede evaluarse determinando su capacidad para proteger a
las células de mamífero contra la toxicidad inducida por
metilvilógeno (paraquat). Específicamente, las células L2 de ratas
que crecieron tal como se describe anteriormente y se sembraron en
placas de 24 pocillos, pueden preincubarse con varias
concentraciones del mimético SOD, e incubarse entonces con una
concentración de metilviológeno que previamente se haya mostrado que
da lugar a una LC_{75} en las células L2 de control. La eficacia
de los miméticos puede correlacionarse con una disminución en la
liberación de LDH inducida por el metilviológeno (St. Clair et
al, FEBS Lett, 293:199 (1991). La eficacia de los miméticos SOD
puede ensayarse in vivo con los modelos de rata y/o ratón
utilizando tanto la administración aerosólica como la inyección
parenteral. Por ejemplo, ratones Balb/c machos pueden ser
introducidos al azar en 4 grupos de 8 ratones cada uno, para formar
un modelo estadístico de contingencia estandar 2X2. Los animales
pueden tratarse con paraquat (40 mg/kg, vía intraperitoneal), o
solución salina, y ser tratados con el mimético SOD o con un
vehículo de control. La lesión pulmonar puede evaluarse 48 horas
después del tratamiento con paraquat mediante el análisis de los
parámetros de la alteración del fluido de lavado broncoalveolar
(BALF) (LDH, proteínas y tasa PMN), tal como se ha descrito
anteriormente (Hampson et al, Tox. Appl. Pharm. 98:206
(1989); Day et al, J. Pharm. Methods 24:1 (1990). Los
pulmones de los 2 ratones de cada grupo pueden fijarse mediante
instilación con paraformaldehído al 4% y procesarse para
histopatología a nivel de microscopio óptico.
La síntesis de miméticos apropiados para su
utilización en la presente invención puede llevarse a cabo
utilizando protocolos reconocidos en la técnica. En el caso de los
miméticos de Mn(III)-porfirina, los anillos
de porfirina con varios grupos laterales de carbono que enlazan con
grupos metino pueden obtenerse comercialmente y el ión metálico
Mn(III) insertarse en el anillo de porfirina mediante
procedimientos que incluyen los siguientes: (1) mezcla de acetato de
Mn(III) con porfirina en presencia de oxígeno, bajo la cual
la estabilización selectiva de Mn(III) por la porfirina
provoca la autooxidación de Mn(II); (2) preparación de Mn
(III) (OH_{3}) mediante una modificación del procedimiento Winkler
(Sastry et al, Anal. Chem. 41: 857 (1969)) seguido por
reacción con la porfirina; (3) agitando MnO_{2} con la porfirina
en presencia de NH_{2}OH, que sirve para reducir el Mn(IV)
a Mn(III), que es atrapado entonces por la porfirina; o (4)
un procedimiento modificado de Pasternack et al (Biochemistry
22: 2406 (1983)) que somete a reflujo el exceso de MnCl_{3} con la
porfirina. Los complejos Mn(III)-porfirina
pueden precipitarse de la solución con perclorato sódico, lavarse y
eliminar el residuo de perclorato mediante una resina fuerte de
intercambio aniónico. Puede hacerse espectrométricamente un
seguimiento de la formación de
Mn(III)-porfirina controlando una banda
característica de Sorét a 468 nm. El acoplamiento de un dominio de
unión al "núcleo del mimético" puede llevarse a cabo tal como
se ha descrito anteriormente.
La presente invención se deriva, por lo menos en
parte, de la comprensión de que EC-SOD regula
específicamente la función del NO. Además, la invención se basa en
la comprensión de que EC-SOD es sintetizado por las
células epiteliales y se localiza primariamente en el intersticio,
en elementos matriciales y en el colágeno, y alrededor de las
células musculares lisas (particularmente en las vías aéreas
pulmonares y en los vasos sanguíneos). NO\cdot es una señal
intercelular y, como tal, debe atravesar la matriz extracelular para
ejercer sus efectos. NO\cdot, sin embargo, es muy sensible a la
inactivación mediada por el O_{2}^{-} que está presente en los
espacios extracelulares. EC-SOD es, así, una enzima
que se adapta de modo ideal para aumentar la biodisponibilidad del
NO\cdot, evitando su degradación por el O_{2}-.
Tal como se ha indicado anteriormente, la
invención se refiere asimismo a miméticos de EC-SOD
que pueden hacer diana en localizaciones estratégicas, y la
utilización de dichos miméticos en la manipulación de los niveles
extracelulares de NO\cdot. La invención, sin embargo, no se limita
a la manipulación del NO\cdot como el único mecanismo de acción de
los miméticos. Antes bien, la invención se refiere, generalmente, al
barrido de los radicales de oxígeno.
La presente invención se refiere, en otro aspecto
específico, a la inhibición de la producción de radicales
superóxido. En este aspecto, los miméticos SOD se utilizan para
inhibir oxidasas, tales como xantina oxidasa, que son responsables
de la producción de radicales superóxido (véase Ejemplo VII). La
capacidad de un mimético para proteger a las células de los
mamíferos de la lesión inducida por la xantina/xantina oxidasa,
puede evaluarse, por ejemplo, haciendo crecer células L2 de rata en
placas de 24 pocillos. Las células pueden preincubarse con varias
concentraciones de un mimético SOD y entonces puede añadirse la
xantina-oxidasa (XO) al cultivo, junto con la
xantina (X). La cantidad apropiada de XO/X utilizada en el estudio
puede predeterminarse para cada progenie celular llevando a cabo una
curva de dosis-respuesta respecto a la lesión. X/XO
puede utilizarse en una cantidad que produzca aproximadamente una
LC_{75} en el cultivo. La eficacia del mimético puede
correlacionarse con una disminución en la liberación de LDH
inducida por XO/X. La capacidad de los miméticos para inhibir la
producción de dichos radicales hace posible la utilización de los
miméticos como terapéuticos para el tratamiento de las lesiones
gotosas y de reperfusión.
Los miméticos pueden utilizarse para barrer el
peróxido de hidrógeno, así como los radicales superóxido. Como
barrenderos del peróxido de hidrógeno, los miméticos sirven como
miméticos de la catalasa o la peroxidasa. Pueden seleccionarse
barrenderos miméticos apropiados haciendo el seguimiento de la
absorbancia a 240 nm en presencia de peróxido de hidrógeno (véase
Beers y Sizer, J. Biol. Chem. 195:133 (1952)). Las terapias que se
basan en esta actividad, se corresponden con las que se ponen de
manifiesto a continuación.
Los miméticos pueden utilizarse como barrenderos
catalíticos de los radicales superóxido, para proteger contra las
lesiones isquémicas de reperfusión asociadas con el infarto de
miocardio, ictus, trauma cefálico agudo, reperfusión de órganos
después de trasplante, isquemia intestinal, infarto pulmonar,
oclusión quirúrgica del flujo sanguíneo, y lesiones de los tejidos
blandos. Los miméticos pueden utilizarse asimismo para la protección
contra las lesiones del músculo esquelético de reperfusión. Los
miméticos pueden utilizarse asimismo para la protección contra
agresiones oculares debidas a la luz solar (y a la piel), así como
al glaucoma y a la degeneración macular del ojo. Las enfermedades
óseas también sensibles al tratamiento con los miméticos. Además,
los trastornos del tejido conjuntivo asociados con defectos en la
síntesis o degradación del colágeno, puede esperarse que sean
susceptibles de tratamiento con estos miméticos.
Además de lo anterior, los miméticos pueden
utilizarse como barrenderos catalíticos de los radicales superóxido
para aumentar la viabilidad de almacenamiento muy limitada de los
corazones, riñones, piel trasplantados y otros órganos y
tejidos.
La cantidad de mimético para utilizarse en un
tratamiento particular o para asociarse con una sustancia
particular, puede determinarse por un experto en la materia.
La disponibilidad de los miméticos hace posible
asimismo estudios de los procesos mediados por el O_{2}-.
Los protocolos de diagnóstico son posibles debido
a la disponibilidad de la secuencia del gen BC-SOD
(véase el Ejemplo V y la Figura 24). Es más probable que tenga lugar
un defecto en el gen BC-SOD que un defecto en la
síntesis del óxido nítrico, debido a la naturaleza y número de
funciones fisiológicas servidas por NO\cdot. La detección de un
defecto del gen EC-SOD señalará la necesidad de que
se tomen medidas para elevar los niveles del EC-SOD
funcional, o de los compuestos relacionados que barren los
superóxidos en localizaciones estratégicas, para corregir los
desequilibrios del NO\cdot y, por lo tanto, los trastornos
implicados en el estrés oxidativo.
Para llevar a cabo la modulación de la eficacia
del NO extracelular, por ejemplo, para relajar el músculo liso, se
administran moléculas (agentes) que tengan actividad
EC-SOD bajo condiciones tales que los niveles de
O_{2}- extracelular estén alterados. Las moléculas apropiadas para
utilizarse, incluyen formas de SOD que unen el sulfato de heparina u
otros glicosaminoglicanos (GAG), por ejemplo, en virtud del hecho de
que contienen aminoácidos cargados positivamente que están cerca de
su extremo carboxilo terminal.
Los requerimientos generales de los miméticos son
que: (a) sean lo bastante estables como para retener el metal ligado
(es decir, Mn) en presencia de los múltiples agentes quelantes
presentes en los sistemas vivientes, (b) que sean lo bastante
activos para que dosis razonables puedan servir para aumentar
significativamente la actividad SOD total en los espacios
extracelulares, (c) que sean capaces de adherirse a las superficies
celulares o a los elementos matriciales extracelulares (por ejemplo,
colágeno) cuando la protección contra las fuentes extracelulares de
O_{2}- sea necesaria, y d) sean de baja toxicidad. Ejemplos de
miméticos apropiados incluyen ligandos macro cíclicos que contienen
nitrógeno, efectivos como catalizadores para la superóxido
dismutasa, que incluyen complejos Mn(III) de porfirinas con
sustituyentes catiónicos voluminosos sobre los carbonos que unen
metinos, tal como los descritos anteriormente (por ejemplo MnTMAP y
MnTMPyP). Dichos complejos son muy activos y son lo bastante
estables para retener la actividad completa en presencia de EDTA en
exceso o en presencia de extractos tisulares.
Los miméticos descritos anteriormente pueden
formularse en composiciones farmacéuticas apropiadas para su
utilización en la presente invención. Dichas composiciones incluyen
el agente activo junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable,
excipiente o diluyente. La composición puede estar presente en una
forma unitaria de dosificación, por ejemplo, comprimidos, cápsulas,
o supositorios. La composición puede también estar en forma de
solución estéril apropiada para inyección o inhalación. Las
composiciones pueden estar asimismo en una forma apropiada para
utilización oftálmica. La invención incluye también la utilización
de composiciones formuladas para la administración tópica, tomando
dichas composiciones la forma, por ejemplo, de una loción, crema,
gel o pomada. La concentración del agente activo para inclusión en
la composición, puede seleccionarse basándose en la naturaleza del
agente, en el régimen de dosificación y en el resultado buscado.
La dosificación de la composición para
administración puede determinarse sin experimentación indebida, y
dependerá de varios factores incluyendo la naturaleza del agente
activo, la vía de administración, el paciente, y el resultado que se
quiera alcanzar. Las dosis apropiadas de miméticos variarán, por
ejemplo, con el mimético y con el resultado que se busque. Los
resultados de Faulkner et al (J. Biol. Chem. 269:23471
(1994), indican que la actividad oxidoreductasa in vivo de
los miméticos es tal que una dosis farmacéuticamente efectiva será
lo bastante baja para evitar problemas de toxicidad. Las dosis que
pueden utilizarse incluyen las que son del orden de 1 a 50
mg/kg.
Otros ejemplos de enfermedades o trastornos
apropiados para el tratamiento utilizando la presente invención,
incluyen enfermedades del sistema nervioso (que incluyen demencia
del SIDA, ictus, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), enfermedad de
Parkinson y enfermedad de Huntington), y enfermedades de la
musculatura (incluyendo enfermedades diafragmáticas (por ejemplo,
fatiga respiratoria en el enfisema, bronquitis y fibrosis quística),
fatiga de la insuficiencia cardíaca, síndromes de debilidad muscular
asociados con miopatías, ALS y esclerosis múltiple). Muchos
trastornos neurológicos (que incluyen ictus, enfermedad de
Huntingon, enfermedad de Parkinson, ALS, demencia de Alzheimer y del
SIDA), se asocian con una superestimulación del subtipo más
importante de receptor del glutamato, el subtipo NMDA (o
N-metil-D-aspartato).
Al estimular el receptor NMDA, concentraciones excesivas de calcio
neuronal contribuyen a una serie de sucesos citoplásmicos y de
membrana que conducen a la producción de radicales libres de oxígeno
y de óxido nítrico (NO\cdot)). Las interacciones entre los
radicales libres de oxígeno y el NO, han mostrado contribuir a la
muerte celular neuronal. Se han desarrollado modelos bien
establecidos de cultivo de neuronas corticales de toxicidad NMDA,
utilizándose como base para el desarrollo de medicamentos. En estos
mismos sistemas, los miméticos SOD de la invención inhiben la lesión
inducida en NMDA.
La presente invención se refiere asimismo al
tratamiento de la artritis, hipertensión sistémica,
arterioesclerosis, edema, shock séptico, hipertensión pulmonar, que
incluye la hipertensión pulmonar primaria, la impotencia,
infertilidad, endometriosis, contracciones uterinas prematuras,
trastornos de la memoria, infecciones microbianas y gota.
Los regímenes terapéuticos, que incluyen el modo
que administración, apropiados para llevar a cabo el tratamiento de
las situaciones descritas anteriormente, pueden determinarse
fácilmente por el experto en la materia.
Inflamaciones, particularmente inflamaciones del
pulmón, son sensibles al tratamiento utilizando la presente
invención (ténganse en cuenta particularmente los trastornos del
asma basados en la inflamación, de ARDS incluyendo la toxicidad del
oxígeno, neumonía (especialmente la pulmonía relacionada con el
SIDA), fibrosis quística, sinusitis crónica y enfermedades
autoinmunes (tales como artritis reumatoide)).
EC-SOD se localiza en los espacios intersticiales
alrededor de las vías aéreas y en las células musculares lisas de
los vasos sanguíneos. EC-SOD y O_{2}- median el
equilibrio antiinflamatorio-proinflamatorio en el
septo alveolar. El NO liberado por las células septales alveolares,
actúa para suprimir la inflamación a menos que reaccione con
O_{2}- para formar ONOO-. Barriendo O_{2}-,
EC-SOD inclina el equilibrio en el septo alveolar
contra la inflamación. Cantidades significativas de ONOO- se
formarán sólo cuando BC-SOD sea deficiente o cuando
exista un gran aumento en la liberación de O_{2}-. Los miméticos
de EC-SOD, tales como los descritos en la
presente memoria, pueden utilizarse para proteger contra la
destrucción causada por la hiperoxia. Pueden establecerse
fácilmente, por el experto en la materia, regímenes terapéuticos
apropia-
dos.
dos.
Tal como se indicó anteriormente, se espera que
los defectos en el gen EC-SOD, que están claros en
la misma proteína, puedan de hecho, ser la causa de los problemas
patológicos relacionados con la función del NO, más que defectos en
la óxido nítrico sintasa. Así, los protocolos diagnósticos
apropiados para su utilización en la identificación de los defectos
del gen EC-SOD, se dan a conocer en la presente
memoria. Este aspecto se basa en la disponibilidad de la secuencia
del gen EC-SOD. La Figura 24 presenta una secuencia
del gen, así como partes de las regiones no codificantes de esa
secuencia, de por lo menos 15 bases, preferentemente, de por lo
menos 50 bases, más preferentemente, de por lo menos 100 bases y,
muy preferentemente, de por lo menos 500 bases. Dichas partes, y sus
complementos, pueden utilizarse como sondas o iniciadores en
protocolos que incluyen los descritos en el Ejemplo VI.
El rastreo de individuos por defectos en el gen
EC-SOD puede realizarse utilizando el planteamiento
empleado para identificar mutaciones en el gen del receptor
\beta-adrenérgico (Reihaus et al, Am. J.
Respir. Cell Mol. Biol. 8;334 (1993). Dicho planteamiento es similar
al utilizado por Rosen et al (Nature 262:59) (1993) (véase el
Ejemplo VI)
Los siguientes son lugares predichos de
importantes mutaciones génicas:
Posiciones 1-558: Esta
representa una región que flanquea el extremo 5', que contiene
elementos reguladores transcripcionales. Puede esperarse que las
mutaciones en este lugar lleven a niveles deficientes de
EC-SOD o a una potenciación defectuosa o a una
reducción en los niveles de EC-SOD, bajo condiciones
que requieren manipular la concentración de EC-SOD.
Las siguientes regiones se han identificado como regiones
reguladoras putativas. Puede esperarse que en estas regiones las
mutaciones tengan como resultado niveles deficientes de
EC-SOD:
Posiciones 560-570: Puede
esperarse que aquí las mutaciones conduzcan a una incapacidad para
cortar y empalmar el intrón 1. Esto podrá llevar a que
EC-SOD no se produzca (o a que se reduzca mucho),
debido a la iniciación de la traducción en múltiples sitios
crípticos ATG localizados en el intrón 1, que se encuentran por
encima del codón de iniciación ATG de EC-SOD. Por
ejemplo, los pares de bases 653, 656, 720, 743, 748 etc, iniciarán
potencialmente la traducción.
Posiciones 564-1135: El
intrón 1 contiene una secuencia de ADN única para
EC-SOD. Además, existen regiones reguladoras
potenciales de la transcripción en el interior de este trozo del ADN
que se listan a continuación; las mutaciones en el intrón 1
conducirán a niveles deficientes de EC-SOD o a una
potenciación defectuosa o a una reducción en los niveles de
EC-SOD bajo condiciones que requieren manipular la
concentración de EC-SOD:
Posiciones 71-95: Puede
esperarse que aquí las mutaciones conduzcan a una incapacidad para
cortar y empalmar el intrón 1. Esto podrá llevar a que
EC-SOD no se produzca (o a que se reduzca mucho),
debido a la iniciación de la traducción en múltiples sitios
crípticos ATG localizados en el intrón 1, que se encuentran por
encima del codón de iniciación ATG de EC-SOD. Por
ejemplo, los pares de bases 653, 656, 720, 743, 748 etc, iniciarán
potencialmente la traducción.
Posiciones 1211-1230:
Puede esperarse que aquí las mutaciones conduzcan a una incapacidad
para cortar y empalmar el intrón 2. Esto podrá llevar a que
EC-SOD no se produzca (o a que se reduzca mucho),
debido a la iniciación de la traducción en múltiples sitios
crípticos ATG localizados en el intrón 2, que se encuentran por
encima del codón de iniciación ATG de EC-SOD.
Ejemplos de sitios de inicio de traducción por encima de ATG pueden
encontrarse en 1339 y 1518.
Posiciones 5055-5080:
Puede esperarse que aquí las mutaciones conduzcan a una incapacidad
para cortar y empalmar el intrón 2. Esto podrá llevar a que
EC-SOD no se produzca (o a que se reduzca mucho),
debido a la iniciación de la traducción en múltiples sitios
crípticos ATG localizados en el intrón 2, que se encuentran por
encima del codón de iniciación ATG de EC-SOD.
Ejemplos de sitios de inicio de traducción por encima de ATG pueden
encontrarse en 1339 y 1518.
Posiciones 5085-5138:
Aquí, las mutaciones interferirán (1) en la eficiencia de traducción
de EC-SOD, dando lugar a que niveles deficientes de
la enzima (2) interfieran en el envío de EC-SOD al
retículo endoplásmico, que es necesario para la secreción de
EC-SOD, (3) interfieran en el procesamiento
co-traduccional del péptido señal (es decir, la
eliminación del péptido señal), que puede conducir a niveles
deficientes debidos a la incapacidad para fragmentar
proteolíticamente el péptido señal a partir de la proteína madura
que, a su vez, dará lugar a la proteína que sería atrapada en el
retículo endoplásmico, (4), interfieran en el procesamiento
post-traduccional (específicamente, la
glicosilación), que puede dar lugar a niveles deficientes debido a
la síntesis de una proteína poco soluble.
Posiciones 5139-5150: Aquí
las mutaciones pueden interferir en el sitio de división de la señal
peptidasa, dando lugar a un mutante EC-SOD que
contendrá un extremo amino alterado que lleva a una función
defectuosa del EC-SOD de niveles deficientes.
Posiciones 5403-5405:
Puede esperarse que aquí las mutaciones den lugar a una pérdida de
la glicosilación, que puede conducir a niveles defectuosos, debido
a la síntesis de proteínas poco solubles.
Posiciones 5424-5720:
Puede esperarse que aquí las mutaciones conduzcan a una actividad
defectuosa de EC-SOD. Esta región es crítica para la
unión al substrato y para la catálisis de la dismutación del radical
aniónico superóxido. Además, esta región afectará asimismo
cualesquiera otras actividades de esta enzima, incluyendo la
reducción de otras sustancias, tal como el óxido nítrico, etc.
Posiciones 5721-5804: Las
mutaciones en esta región provocarán defectos en la unión de
EC-SOD a los tejidos diana tales como el colágeno
tipo I en la matriz extracelular, y alrededor de las células
musculares lisas tanto en los vasos como en los bronquios. Es muy
probable que dichas mutaciones, aquí, causen patologías.
Posiciones 6385-6395:
Puede esperarse que estas mutaciones, aquí, den lugar a una
poliadenilación defectuosa que pueda conducir a niveles deficientes
de EC-SOD debido a la disminución en la semivida
biológica de los tipos de ARNm EC-SOD.
Ciertos detalles de la presente invención se
describen más detalladamente en los siguientes ejemplos no
limitativos.
Construcción del vector de expresión
EC-SOD humano: El vector de expresión de
EC-SOD (Figura 1) se construyó de la siguiente
manera: El fragmento EC-SOD cADN humano entero
(Hjalmarrson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6340
(1987); Hendrickson et al, Genomics 8:736 (1990)) flanqueado
por los sitios de restricción EcoRI se convirtió con nucleasa de
judía de Lima para formar extremos romos, se unió a engarces Sall,
se digirió con Sall, e se insertó entonces en el sitio Sall del
vector de expresión pH\betaAPr-1 de la
\beta-actina. El fragmento
EcoRI-HindIII del plásmido resultante que contiene
el promotor de la \beta-actina humana
(suministrado por el Dr. Larry Kedes de la University of Southern
California., Los Angeles, California), intrón, y el
EC-SOD cADN, fué aislado. Además, el sitio Hpal del
SV40 en la posición 2666 en el plásmido pMSG (Pharmacia LKB
Biotechnology, Piscataway, New Jersey), se convirtió a un sitio
HindIII mediante unión del engarce, aislándose el fragmento
HindIII-Pstl que contenía el sitio de
poliadenilación de la región temprana del SV40. Estos dos fragmentos
de ADN se unieron entonces a un vector pKS digerido por EcoRI + Pstl
(Stratogene, la Jolla, California). El fragmento
EcoRI-Xbal que contenía el constructo completo de
expresión, libre de las secuencias plasmídicas, se aisló y utilizó
para establecer los ratones transgénicos. Todos los procedimientos
del ADN recombinante se llevaron a cabo según procedimientos
establecidos (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual 3, Cold Spring Harbor; Cold Spring Harbor Laboratory,
1989).
Desarrollo de los ratones transgénicos: Se
inyectaron ADN purificado a 2,5 \mug/ml en 5 mM
Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, en los pronucleos de
huevos fertilizados aislados de ratones (C57BL/6 X C3H)F1 X
(C57BL/6 X C3H)F1. Los ratones ((C57BL/6 X C3H)F1 se
consiguieron de Charles River). Los huevos de los ratones hembras
que sobrevivieron a la microinyección se implantaron entonces en los
oviductos de las madres adoptivas pseudoembarazadas (CD1) (los
ratones CD1 se obtuvieron de Charles River) según procedimientos
descritos por Hogan et al (Hogan et al, Manipulating
the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor; Cold Spring Harbor Laboratory,
1986, 32). Los ratones que vehiculaban el transgén se identificaron
mediante análisis de transferencia Southern del ADN de la cola y se
sondearon con el cADN EC-SOD humano completo. Los
fundadores transgénicos se encontraron en la primera camada
rastreada. Estos ratones se habían criado con (C57BL/6 X
C3H)F1 para producir descendencia para estudios ulteriores.
(En la totalidad de los experimentos siguientes con los ratones
transgénicos EC-SOD, los ratones no transgénicos se
refieren a las camadas de los ratones transgénicos que no contenían
el transgén para el EC-SOD humano. En experimentos
en los que los ratones transgénicos EC-SOD no se
utilizaron, se utilizaron F1 (C57BL/6 X C3H) de tipo salvaje.
Producción de ratones transgénicos
EC-SOD homocigóticos: Se produjeron ratones
transgénicos homocigotos mediante un cruzamiento F_{1} de ratones
transgénicos heterocigóticos. ADN de la cola de ratones F_{2} se
aisló y se trató con RNAasa. 10 \mug del ADN de cada ratón se
seccionaron con Pstl y se sometieron entonces a electroforesis
mediante un gel de agarosa al 1,2%. Se llevó entonces a cabo un
análisis de transferencia Southern del ADN de la cola, al que se
sondeó con el cADN EC-SOD humano completo. El cADN
EC-SOD no reaccionó cruzadamente con el gen
EC-SOD del ratón. La intensidad de la banda se
comparó visualmente para determinar que ratones eran homocigóticos,
heterocigóticos, o negativos para el transgén EC-SOD
humano.
Análisis Northern: Los ratones
transgénicos y las camadas no transgénicas se sacrificaron con una
sobredosis de pentobarbital. Los tejidos se extirparon rápidamente y
se congelaron en nitrógeno liquido hasta que estuvieron listos para
un procesamiento ulterior. El ARN total se aisló entonces mediante
el procedimiento de CsCl que se ha descrito (Sambrook et al,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3. Cold Spring Harbor, Cold
Spring Harbor Laboratory, 1989). 20 \mug del ARN total de los
tejidos de los ratones transgénicos y de las camadas no
transgénicas, y un ARN escalar se desnaturalizaron entonces con
glioxal, se sometieron a electroforesis mediante un gel de agarosa
al 1,2% y se transfirieron a nitrocelulosa tal como se describe en
(Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual.3.
Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Las
transferencias se sondearon con el cADN EC-SOD
humano completo.
Separación de isoenzimas de SOD mediante
cromatografía de concanavalina A sepharose: Los tejidos que se
habían obtenido de 3 ratones, se pesaron, combinándose entonces y
homogenizándose en 10 volúmenes de 50 mM de fosfato potásico
enfriado con hielo, pH 7,4, con 0,3 M KBr, 3 mM ácido
dietilenotriaminopentaacético y 0,5 mM de fluoruro de
fenilmetilsulfonilo. La separación de EC-SOD de CuZn
SOD y Mn SOD se llevó a cabo haciendo pasar homogenados hísticos por
una columna de concanavalina A sepharose, tal como se ha descrito
(Marklund et al, Clin. Chim. Acta 126: 4 (1982)).
Actividad de SOD: La actividad de SOD y
la actividad SOD total (CuZn SOD y Mn SOD) que permanecen después de
la extracción de EC-SOD, se midieron por la
inhibición de la reducción del citocromo C a pH 10. tal como se ha
descrito previamente (Crapo et al, Methods Enzymol. 53:382
(1978)). Se determinaron las proteínas totales mediante el ensayo
BCA de proteínas (Pierce, Rockford, IL). Las actividades de SOD se
expresaron entonces como unidades/mg de proteínas totales.
Caracterización de los ratones
transgénicos: Los ratones que vehiculizan el transgén humano
EC-SOD se detectaron mediante análisis de
transferencia Southern. En la Figura 2 se muestra el análisis
Northern de varios tejidos de la F1 de un ratón que se descubrió que
vehiculizaba el transgén. En el corazón, músculo esquelético y
cerebro de los ratones transgénicos se detectaron altos niveles de
transmisión de señales para el EC-SOD humano, siendo
estos niveles escasos o no existiendo en el pulmón, hígado y bazo.
En las camadas no transgénicas, no se detectó dicha transmisión de
señales.
Los ratones homocigóticos se generaron criando
dos ratones F1 heterocigóticos. Los ratones homocigóticos se
detectaron mediante intensidades de banda diferenciales que se
descubrieron utilizando el análisis de transferencia Southern de
cantidades iguales de ADN digerido por Pstl procedente de la
descendencia. Se encontró que la actividad de EC-SOD
en los ratones aumentaba en respuesta a las copias totales del
transgén EC-SOD.
Exposiciones al oxígeno: 5 ratones, de
7-8 semanas de edad, se expusieron a la vez a
oxígeno hiperbárico en una pequeña jaula para animales (Bethlehem,
Pennsylvania). Después de inundar la jaula con oxígeno puro, se
llevó a cabo la compresión a 50 metros (6 ATA) en 5 minutos. La
concentración de oxígeno en la jaula se controló continuamente con
un analizador de oxígeno Servomex (modelo 572, Sybron, Norwood,
Massachusetts) y se mantuvo a \geq 99%. La concentración de
dióxido de carbono se analizó a partir de muestras intermitentes del
gas de la jaula con un detector IR (IR Industries, Santa Bárbara,
California) y no se dejó que sobrepasara el 0,1%. La temperatura de
la cámara se mantuvo a 25-26ºC, pero la compresión
de oxígeno en la jaula alcanzó la temperatura de
30-32ºC transitoriamente, pero un sistema de control
del entorno restauró la temperatura normal de la jaula a los 3
minutos. Las exposiciones tardaron de 25 a 75 minutos y se siguieron
de descompresión durante 5 minutos. Los ratones se observaron
continuamente en relación a los síntomas de toxicidad debida al
oxígeno, desde el comienzo de la exposición hasta 4 horas después de
la salida de la jaula. El tiempo hasta la primera convulsión
generalizada (latencia del ataque) y el tiempo hasta la muerte se
registraron. Estas condiciones de exposición se diseñan para
provocar la toxicidad del oxígeno para el CNS, sin evidencia
apreciable de la toxicidad pulmonar del oxígeno.
Tratamiento con dietilditiocarbamato: Una
hora antes de la exposición a 6 ATA de oxígeno, a los ratones se les
administraron inyecciones intravenosas de 0,008 cc/g de solución
salina o de 400 mg/kg de dietilditiocarbamato disuelto en solución
salina normal (0,008 cc/g). Los ratones se expusieron entonces a 6
ATA de oxígeno durante 25 minutos, tal como se describe
anteriormente.
Para determinar el grado de inhibición de
EC-SOD y CuZn SOD por el dietilditiocarbamato, a los
ratones se les administró éste, sacrificándose una hora más tarde.
Los cerebros se extrajeron y se ensayaron respecto a la actividad
EC-SOD y CuZn SOD, tal como se ha descrito
anteriormente.
Tratamiento con
\beta-mercaptoetanol: Una hora antes de la
exposición a 6 ATA de oxígeno, a los ratones se les administraron
inyecciones intravenosas de 0,008 cc/g de solución salina o de 180
mg/kg de \beta-mercaptoetanol (0,008 cc/g). Esta
dosis de \beta-mercaptoetanol se seleccionó
debido a que contiene un número similar de tioles reductores que la
dosis de dietilditiocarbamato. Los ratones se expusieron entonces a
6 ATA de oxígeno durante 30 minutos, tal como se describe
anteriormente.
Tratamiento con
N-\omega-nitro-L-arginina,
un inhibidor de la óxido nítrico sintasa: Diez minutos antes de
que empezara la compresión, 0,008 cc/g de solución salina o 20 mg/kg
(0,008 cc/g) de
N-\omega-nitro-L-arginina
disueltos en agua estéril, se administraron intraperitonealmente a
ratones transgénicos y no transgénicos. Los ratones se expusieron
entonces a 6 ATA de oxígeno durante 25 o 75 minutos, tal como se
describe anteriormente.
Análisis estadístico: Se utilizó un
ensayo-t de Student apareado para comparar las
actividades enzimáticas en los ratones transgénicos y no
transgénicos. Se utilizó un ensayo \chi^{2} cuadrado con
corrección de Bonferroni para evaluar si las diferencias de
supervivencia respecto a las exposiciones hiperbáricas eran
significativas. El análisis de varianza con un ensayo F de Scheffe
se utilizó para comparar las diferencias en la latencia d del ataque
en los distintos grupos de ratones.
Exposiciones al oxígeno hiperbárico: Para
ensayar los efectos del aumento de los niveles cerebrales de
EC-SOD respecto a la toxicidad del oxígeno sobre el
CNS, ratones, tanto transgénicos como no transgénicos (véase Ejemplo
I) se expusieron a 6 ATA de oxígeno durante 25 minutos. Los ratones
transgénicos fueron más susceptibles (mortalidad del 83%) a la
toxicidad del oxígeno sobre el CNS que los ratones no transgénicos
(mortalidad del 33%) (Figura 3).
Los ratones transgénicos y no transgénicos se
trataron subsiguientemente con un inhibidor de CuZn SOD,
dietilditiocarbamato, para confirmar que el aumento de la
sensibilidad de los ratones transgénicos a la toxicidad del oxígeno
sobre el CNS era el resultado de la actividad incrementada de SOD.
Tanto en los ratones transgénicos como en los no transgénicos, el
tratamiento con 400 mg/kg de dietilditiocarbamato dio lugar a una
inhibición del 80% de EC-SOD y a una inhibición del
60% de CuZn SOD en el cerebro. Esto está de acuerdo con hallazgos
previos (Frank et al, Biochem. Pharmacol. 27:251 (1978);
Heikkila et al, J.Biol. Chem. 251:2182 (1976)). El
tratamiento con dietilditiocarbamato confirió un aumento de la
resistencia a la toxicidad del oxígeno sobre el CNS, tanto para los
ratones transgénicos como para los no transgénicos. La supervivencia
aumentó hasta un 100% en los ratones transgénicos y al 93% en los no
transgénicos (Figura 3). El comienzo de los ataques también se
retrasó cuatro veces en los ratones tratados con
dietilditiocarbamato (Figura 4).
Para evaluar si el dietilditiocarbamato protege o
no contra la toxicidad del oxígeno sobre el CNS, actuando como un
agente reductor mas que como un inhibidor de la actividad SOD, los
ratones se trataron con una cantidad equimolar de tioles reductores
en forma de \beta-mercaptoetanol y se expusieron a
oxígeno hiperbárico. La Figura 5 muestra que el
\beta-mercaptoetanol no protegió contra la
toxicidad del oxígeno sobre el CNS.
Una posibilidad que podría explicar porqué
EC-SOD exacerba la toxicidad del oxígeno sobre el
CNS, sería que el óxido nítrico es un mediador de la toxicidad del
oxígeno sobre el CNS y EC-SOD protege al óxido
nítrico de la inactivación mediada por el superóxido. Para ensayar
la hipótesis de que el óxido nítrico contribuye a la toxicidad del
oxígeno sobre el CNS, ratones F1 (C57BL/6 X C3H) de tipo salvaje se
trataron con un inhibidor de la óxido nítrico sintasa, la
N-\omega-nitro-L-arginina.
La Figura 6 m muestra los efectos de la
N-\omega-nitro-L-arginina
sobre la latencia del ataque en los ratones. El pretratamiento con
la
N-\omega-nitro-L-arginina
dio lugar a un aumento significativo en la latencia del ataque
(13,50 \pm 5,6 min), cuando se comparó con los ratones tratados
con una solución salina (2,75 \pm 1 min). La Figura 7 muestra que
la inhibición de la óxido nítrico sintasa aumentó asimismo
significativamente la supervivencia después de la exposición al
oxígeno hiperbárico. Los ratones a los que se administró el
inhibidor de la óxido nítrico sintasa mostraron una mortalidad del
50% después de la exposición durante 90 minutos de 6 ATA de oxígeno,
no obteniéndose una mortalidad del 100% hasta que transcurrieron 2
horas de esta exposición. Los ratones tratados con solución salina,
sin embargo, tenían una mortalidad del 50% después de sólo 25
minutos de exposición, con una mortalidad del 100% después de sólo
30 minutos de 6 ATA de oxígeno. La Figura 8 muestra que la tasa de
supervivencia en el oxígeno hiperbárico dependía de la dosis que se
administró del inhibidor. La protección ofrecida por este inhibidor
competitivo de la óxido nítrico sintasa podría revertirse cuando se
administró un exceso de L-arginina (Figura 6 y
Figura 9).
Los efectos del inhibidor de la óxido nítrico
sintasa,
N-\omega-nitro-L-arginina,
sobre la toxicidad del oxígeno sobre el CNS, se estudiaron entonces
en los ratones transgénicos. Este tratamiento redujo de forma
importante la toxicidad del oxígeno sobre el CNS, tanto en los
ratones transgénicos como en los no transgénicos. La supervivencia
después de una exposición de 25 minutos a 6 ATA de oxígeno aumentó
hasta el 100% en ambos grupos (Figura 3). La latencia del ataque se
retrasó, asimismo, significativamente (Figura 4). El tiempo de
exposición se aumentó entonces a 75 minutos para investigar si los
ratones transgénicos eran más sensibles todavía que los ratones no
transgénicos al o oxígeno hiperbárico. Los resultados en la Figura
10 indican que el tratamiento con
N-\omega-nitro-L-arginina
anuló la diferencia en la sensibilidad que se observó entre los
ratones transgénicos y no transgénicos no tratados durante la
exposición de 25 minutos que se muestra en la Figura 3.
Modelo de lesión: Ratones jóvenes
(6-7 semanas) (véase Ejemplo I) se anestesiaron con
60 mg/kg de pentobarbital (Nembutal, Abbott Laboratories, Chicago,
Illinois). Se llevó entonces a cabo una incisión en el cuero
cabelludo y una varilla de acero de 20 cm de largo y de 3 mm de
diámetro, equilibrada con un baño de nitrógeno líquido de 8 cm, 4 cm
a partir del extremo de la varilla, se situó sobre el cuero
cabelludo por encima del hemisferio cerebral derecho durante 30
segundos. La incisión en la piel fue entonces suturada.
Dos horas después de la lesión, al ratón se le
administró una dosis inicial de pentobarbital. Se abrió la cavidad
torácica, se extirparon los pulmones, y el animal se perfundió
entonces con 20 ml de solución salina a través del ventrículo
izquierdo del corazón. El cerebro se extrajo entonces y el cerebelo
se extirpó. Los hemisferios derecho (R) e izquierdo (L) se separaron
y se pesaron inmediatamente (peso húmedo, W). Cada hemisferio se
secó entonces a 70ºC durante 2-3 días en un horno de
aire caliente hasta que se alcanzó un peso constante (peso seco, D).
Se calculó entonces un índice del edema (I), tal como se muestra en
la ecuación 13.
[13]I = (W/D \
R-W/D \ L)/(W/D \ L) \ X \
100
Este cálculo permitió que el hemisferio izquierdo
sirviera como control interno para el hemisferio derecho lesionado
en cada ratón.
Tratamientos químicos: Se llevaron a cabo
seis grupos de experimentos para investigar la importancia de los
superóxidos extracelulares, del hierro y del óxido nítrico en el
edema cerebral inducido por el frío. En todos los grupos, los
medicamentos se disolvieron en solución salina y se inyectaron a
0,008 cc/g 15 minutos antes de la lesión debida al frío. En el Grupo
1, la formación del edema de los ratones transgénicos
EC-SOD se comparó con la de las camadas no
transgénicas. El Grupo 2 comparó la formación del edema entre los
ratones F1 (C57BL/6 X C3H) de tipo salvaje tratados con solución
salina y ratones F1 (C57BL/6 X C3H) tratados con 0,33 mg/g de
deferoxamina (0,51 \mumoles/g). El Grupo 3 comparó los ratones F1
(C57BL/6 X C3H) tratados con solución salina con ratones F1 (C57BL/6
X C3H) tratados con 0,51 \mumoles/g de deferoxamina saturada con
Fe^{3++}. El Grupo 4 estuvo formado por ratones F1 (C57BL/6 X C3H)
tratados con solución salina y ratones F1 (C57BL/6 X C3H) tratados
con 0,02 mg/g del éster metílico de la
N-\omega-nitro-L-arginina.
El Grupo 5 estuvo formado por ratones F1 (C57BL/6 X C3H) tratados
con solución salina y ratones F1 (C57BL/6 X C3H) tratados con 0,02
mg/g del éster metílico de la
N-\omeganitro-L-arginina
más 0,05 m mg/g de L-arginina. El Grupo 6 comparó la
formación del edema entre los ratones no transgénicos, los ratones
transgénicos EC-SOD tratados con solución salina y
ratones transgénicos EC-SOD tratados con 0,02 mg/g
del éster metílico de la
N-\omega-nitro-L-arginina.
La deferoxamina saturada con hierro se obtuvo
disolviendo cantidades equimolares de deferoxamina y a continuación
de cloruro férrico en solución salina. La saturación de la
deferoxamina con el hierro férrico se determinó
espectrofotométricamente midiendo la absorbancia a 425 nm
(\varepsilon = 2500 M^{-1} cm^{-1} para
deferoxamina-Fe^{3+}) (Monzyk y Crumbliss. J.
Amer. Chem. Soc. 104: 4921 (1982)).
Tratamiento con azul de Evan: Una hora y
50 minutos después de la lesión con el frío, 5 ml/kg de Azul de
Evans al 1% en solución salina se inyectaron en la arteria femoral
de ratones transgénicos y no transgénicos. Los ratones se
sacrificaron 10 minutos después. Los pulmones se extirparon y los
ratones se perfundieron entonces con solución salina normal a través
del ventrículo izquierdo, hasta que ya no se apreció más color azul
en el flujo de salida. Los cerebros se extrajeron entonces y se
fotografiaron.
Análisis estadístico: Se utilizó un
ensayo-t apareado de Student para comparar la
significación del desarrollo del edema, comparado con los ratones no
transgénicos o con los ratones tratados con solución salina para
cada uno de los grupos examinados. El análisis de varianza con un
ensayo Fisher PLSD se utilizó para comparar la significación en el
Grupo 6. El valor P inferior a 0,05 se consideró como
significativo.
Edema cerebral inducido por el frío:
Cuando los ratones transgénicos y las camadas no transgénicas se
sometieron a lesiones inducidas por el frío para el hemisferio
cerebral derecho, se descubrió que los ratones transgénicos estaban
significativamente protegidos contra la formación del edema,
comparados con las camadas no transgénicas (Figura 11). La tasa de
edemas fue un 44% menor en los ratones transgénicos que en las
camadas no transgénicas y la extravasación del colorante azul de
Evan fue visiblemente menor en los ratones transgénicos que en las
camadas no transgénicas (Figura 12).
Para ensayar la contribución del hierro a la
formación del edema en este modelo, los ratones se pretrataron con
inyecciones intravenosas de deferoxamina o solución salina
previamente a la lesión inducida por el frío. La Tabla II muestra
que el pretratamiento con deferoxamina produjo una disminución en la
tasa de formación del edema de un 43%, comparado con los ratones a
los que sólo se administró la solución salina. Los ratones se
pretrataron entonces con inyecciones intraperitoneales de
deferoxamina saturada con hierro o solución salina, antes de las
lesiones inducidas por el frío, para ver si las propiedades
quelantes del hierro de este compuesto eran verdaderamente
necesarias para proteger contra la formación del edema. La Tabla IV
muestra que, incluso cuando la deferoxamina se saturó con hierro,
todavía era capaz de proteger contra la formación del edema,
produciéndose una disminución en la tasa de dicha formación de un
32-48% que el que se encontró en los controles
tratados con la solución salina. Se encontró que los valores
absolutos para el índice del edema eran completamente variables,
pero sin embargo, experimentos repetidos mostraron de modo
consistente las mismas tendencias significativas en la protección
contra la formación del edema en los diversos tratamientos que se
examinaron.
| * \begin{minipage}[t]{150mm} p<0,05 comparada con el índice de Edema de los respectivos controles tratados con la solución salina utilizando un ensayo -t pareado de Student.\end{minipage} |
Estos resultados indican que la deferoxamina es
capaz de proteger contra la formación del edema mediante un
mecanismo independiente de su capacidad para barrer (eliminar) el
hierro. A causa de que la deferoxamina es capaz de barrer tanto los
aniones peroxinitrito (Radi et al, Arch.Biochem. Biophys. 288
(2):481 (1991), como el radical hidroxilo (Hoe et al,
Chemico-Biological interactions 41:75 (1982)), se
sugirió la hipótesis de que son estas propiedades de la deferoxamina
las que permiten proteger contra el edema vasogénico.
Para ensayar esta hipótesis, la síntesis del
óxido nítrico fue inhibida con el éster metilo de la
N-\omega-nitro-L-arginina,
un inhibidor competitivo de la enzima óxido nítrico sintasa, para
determinar si esto protegería contra la formación del edema después
de una lesión inducida por el frío. La Tabla III muestra que el
tratamiento con el éster metilo de la
N-\omega-nitro-L-arginina
protegió significativamente a los ratones contra la formación del
edema, dando lugar a que ésta fuera un 37% menor que la que tuvo
lugar en los controles tratados con solución salina. Esta protección
mediante éster metilo de la
N-\omega-nitro-L-arginina
se invirtió por la administración simultánea a los ratones de un
exceso de L-arginina (Tabla III).
\vskip1.000000\baselineskip
| * \begin{minipage}[t]{150mm} p<0,05 comparada con el índice de Edema de los respectivos controles tratados con la solución salina utilizando un ensayo -t pareado de Student.\end{minipage} |
En los experimentos finales, ratones transgénicos
EC-SOD se trataron con la solución salina o con el
éster metilo de la
N-\omega-nitro-L-arginina,
para determinar si existía un efecto aditivo para evitar la
formación del edema en ratones que presentaban tanto niveles
aumentados de EC-SOD, como del inhibidor de la
óxido- nítrico sintasa. La Tabla IV muestra que cuando a los ratones
transgénicos EC-SOD se les administró el inhibidor
de la óxido nítrico sintasa, no se detectó una protección añadida
contra la formación del edema respecto a los ratones transgénicos
protegidos sólo por niveles aumentados de EC-SOD en
el cerebro.
\vskip1.000000\baselineskip
| * p<0,05 comparada con el índice de Edema de los ratones no transgénicos. |
Pulmón humano: Se obtuvieron 5 muestras de
pulmones humanos para evaluar la distribución de
EC-SOD en el tejido pulmonar humano. Una muestra se
consiguió a partir de una pieza procedente de patología quirúrgica
del lóbulo superior derecho del que se había hecho una resección en
una mujer blanca de 43 años de edad con una historia de fumadora de
50 cajetillas de cigarrillos al año (equivalente a una cajetilla por
día durante un año) y con un único nódulo que se encontró mediante
rayos X. A la paciente se le diagnosticó carcinoma de células
escamosas. En los estudios que se presentan en la presente memoria,
se utilizó tejido procedente de una región de este lóbulo que no
estaba relacionada con el carcinoma. Se obtuvo una segunda muestra a
partir de una pieza procedente de la patología quirúrgica del lóbulo
superior derecho de un hombre blanco de 51 años de edad, con una
historia de fumador de 60 cajetillas de cigarrillos al año, en el
que también se encontró mediante rayos X un único nódulo. El
paciente no tenía ninguna otra enfermedad y se le diagnosticó
carcinoma de células escamosas. Para la localización de
EC-SOD, se utilizó tejido pulmonar que no estaba
relacionado con el carcinoma. Una tercera muestra procedía de una
autopsia rápida (tejido obtenido 6 horas después de la muerte) de un
hombre blanco afecto de demencia, de 66 años de edad, pero sin
antecedentes de fumador o de enfermedad pulmonar. La cuarta muestra
pulmonar que se examinó se obtuvo de las sobras de un tejido
pulmonar, tejido que era demasiado grande para el receptor de un
trasplante de pulmón. El pulmón fue donado por una mujer blanca de
45 años de edad sin antecedentes de fumadora o de enfermedad
pulmonar. La quinta muestra que se examinó en estos estudios
provenía asimismo de las sobras de un tejido pulmonar utilizado en
un trasplante de pulmón, procedente de un hombre blanco de 39 años
de edad sin antecedentes de fumador o de enfermedad pulmonar.
Notablemente, no se apreciaron diferencias en los patrones de
marcado entre las muestras de patología quirúrgica y los tejidos de
la autopsia de los donadores para el trasplante pulmonar.
Los tejidos se fijaron en paraformaldehído al
2%/gluteraldehído al 0,2% en solución salina tamponada con 0,01 M de
fosfato (PBS; 1,2 g NaH_{2}PO_{4}, 8 g NaCl, 0,2 g KCl, en 1
litro, pH 7,3) durante 1 hora, seguido por fijación durante la noche
en paraformaldehído al 4% a 4ºC y entonces en un compuesto O.C.T.
Los tejidos se congelaron en hexano refrigerado con nitrógeno
líquido y se guardaron a -70ºC hasta que se seccionaron para llevar
a cabo estudios con el microscopio óptico.
Para estudios de microscopía electrónica, los
tejidos pulmonares se procesaron como en los estudios de microscopía
óptica, hasta equilibrarlos en sacarosa. Después de esto, los
tejidos pulmonares se infiltraron con gelatina al 10% a 37ºC durante
10 minutos. Los cortes tisulares, en gelatina, se solidificaron
entonces en hielo, se cortaron en cubos de 2 mm de lado, y se
crioprotegieron entonces durante la noche en alcohol polivinílico al
4% que contenía 2 M de sacarosa. Estas muestras se montaron entonces
en tocones, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido,
conservándose entonces en éste, hasta que se seccionaron para llevar
a cabo los estudios de microscopía electrónica.
EC-SOD: El
EC-SOD recombinante humano (suministrado por S.L.
Marklund, Ume\ring{a}, Suecia; Tibell et al, Proc. Natl.
Acad. Sci, USA 84:6634 (1987)) y el sobrenadante 20000 x g de un
homogenado de pulmón humano, se desnaturalizaron en presencia de
\beta-mercaptoetanol y sulfato dodecil sódico,
hirviendo durante 5 minutos y sometiéndolos entonces a
electroforesis mediante un gel de poliacrilamida al 12% en presencia
de sulfato dodecil sódico. La proteína se transfirió entonces
electroforéticamente a nitrocelulosa. La transferencia se incubó
entonces con 4,3 \mug/ml de una fracción purificada IgG de
anti-rh-EC-SOD de
conejo (suministrado por S.M. Marklund, Ume\ring{a} University
Hospital, Ume\ring{a}, Suecia), purificada por afinidad con
rh-EC-SOD, seguido por incubación
con ^{125}I-proteína A y autorradiografía.
Absorción de IgG
anti-EC-SOD: La sefarosa
activada mediante CNBr se hinchó en PBS. El gel hinchado se mezcló
con PBS, de forma que el gel que se estableció ocupaba el 50% del
volumen. El gel se suspendió y 100 \mul se mezclaron con 100
\mug de rh-EC-SOD puro durante 2
horas a temperatura ambiente, mientras se agitaba suavemente. El gel
se lavó entonces 4 veces con PBS + albúmina sérica bovina al 1%
(BSA), obteniéndose hasta 100 \mul con PBS + BSA al 1%. Se
añadieron entonces y se mezclaron durante 2 horas con agitación
suave a temperatura ambiente, 100 \mul de
anti-rh-EC-SOD de
conejo a una concentración doble de la utilizada para el marcado
inmunológico. Se añadió entonces al sobrenadante IgG no inmune de
conejo, a una concentración equivalente a la concentración predicha
de IgG
anti-rh-EC-SOD
eliminada por el procedimiento. Este sobrenadante se utilizó
entonces para marcados inmunológicos subsiguientes.
Inmunohistoquímica en microscopio óptico:
Cortes seriados de 4 \mum de tejido fijado en O.C.T. se
seccionaron en un crióstato a -20ºC, disponiéndose en portas
revestidos con poly-L-lisina (3
cortes/porta). Los cortes se conservaron a -70ºC hasta que se llevó
a cabo el marcado. Los cortes se marcaron entonces para
EC-SOD utilizando un procedimiento indirecto
inmunoperoxidásico (Milde et al, J. Histochem. Cytochem.
37:1609 (1989); Randell et al, Am. J. Respir. Cell. Mol.
Biol. 4:544 (1991) con una IgG de biotinilada de cabra
anti-conejo, y peroxidasa de rábano- estreptavidina
(Jackson, ImmunoResearch Laboratories (West Grove, Pennsylvania)
(Tabla V). Para reducir la tinción anterior, los cortes se incubaron
en H_{2}O_{2} al 1% en metanol para inactivar las peroxidasas
endógenas, en 10 mM de hidruro de boro para bloquear los aldehídos,
y la unión no específica se bloqueó incubando con suero normal de
cabra al 5% (NGS), leche al 5%, y BSA al 1% en PBS. Las diluciones
óptimas primarias y secundarias del anticuerpo se determinaron
empíricamente y se llevaron a cabo en PBS con leche al 1% más BSA al
1% (la leche no se incluyó en la solución de estreptavidina). Los
portas se revelaron utilizando diaminobenzidina (10 mg de
diaminobenzidina, 50 ml de 0,05 M Tris-Cl, pH 7,6,
100 \mul de H_{2}O_{2} al 3%) y se contrastaron con verde
metilo al 1%. Como control, cortes seriados se marcaron
separadamente con
anti-rh-EC-SOD
(EC-SOD) de conejo, IgG no inmune de conejo, o
anti-rh-BC-SOD de
conejo, a partir de los cuales la IgG unida a EC-SOD
se había absorbido fuera (EC-SOD absorbido; véase lo
expuesto anteriormente).
Inmunocitoquímica de microscopía
electrónica: Cortes crio ultrafinos (70 nm) de tejido pulmonar
humano se marcaron inmunológicamente con anti
rh-EC-SOD de conejo y 10 nm de
proteína A-oro, tal como se ha descrito
anteriormente (Crapo et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:10405 (1992)) (Tabla VI). Brevemente, los cortes se incubaron
primero tres veces durante cinco minutos a temperatura ambiente en
glicina al 0,15% en PBS, para bloquear los grupos aldehído. Las
uniones no específicas se bloquearon posteriormente mediante
incubación en BSA al 1% en PBS durante 10 minutos. Las diluciones
primarias y secundarias del anticuerpo se determinaron empíricamente
y se realizaron en PBS que contenía BSA al 1%. Los cortes se tiñeron
con oxalato de uranilo y acetato de uranilo en metil celulosa, tal
como se ha descrito anteriormente (Crapo et al, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89:10405 (1992)). Los grupos de control fueron como
los descritos anteriormente para la microscopía óptica.
Características del anticuerpo
EC-SOD: El anticuerpo para
rh-EC-SOD se caracterizó mediante
análisis de transferencia Western de
rh-EC-SOD y un homogenado pulmonar
humano. La Figura 13 muestra que el anticuerpo reaccionó con las dos
subunidades: la EC-SOD de tipo C (banda superior) y
la de tipo A (banda inferior)(Sandström et al, Biochem. J.
267:18205 (1992) en un homogenado pulmonar humano. La subunidad de
tipo A no existe en el intersticio tisular in vivo (Sandström
et al, Biochem. J. 290:623 (1993). El anticuerpo reaccionó
con tres bandas en el carril que contiene el tipo C
rh-BC-SOD purificado. Los dos tipos
de peso molecular más bajo en la Figura 13 son debidos a la
glicosilación insuficiente parcial de rh-ECSOD en
las células CHO intensamente sobreproductoras.
Inmunohistoquímica en el microscopio óptico:
Utilizando un anticuerpo para
rh-EC-SOD, esta proteína se localizó
inmunológicamente en los pulmones humanos. La inmunohistoquímica en
el microscopio óptico reveló que BC-SOD está
asociado principalmente con la matriz tisular conjuntiva alrededor
de los vasos y de las vías aéreas en el pulmón (Figura 14a y 14b,
Figura 15a, 15b, y 15c). EC-SOD se encontró muy
cerca de los vasos y de los músculos lisos de las vías aéreas
(Figura 14a y b, y Figura 15a). EC-SOD se apreció
asimismo en el tejido conjuntivo de las puntas de los septos
alveolares (Figura 15c), sugiriendo una afinidad de
BC-SOD para la matriz del tejido conjuntivo. No se
apreció marcado en asociación con las células endoteliales
vasculares en las grandes arterias elásticas, vasos de tamaño medio,
o capilares (Figura 14a y b). EC-SOD estuvo
notablemente ausente en las superficies celulares epiteliales de las
vías aéreas (Figura 15a y b) y tampoco se encontró en el cartílago
(Figura 15a).
El anticuerpo para EC-SOD fue un
anticuerpo IgG policlonal de conejo que se purificó por afinidad
utilizando rh-EC-SOD. Para ensayar
la especificidad del marcado para EC-SOD, la IgG
específica para EC-SOD fue absorbida fuera del
antisuero utilizando rh-EC-SOD puro
unido a sepharose bromuro de cianógeno. Entonces, se añadió IgG no
inmune de conejo a este anticuerpo absorbido en una cantidad
suficiente para reemplazar la IgG absorbida. El marcado de los
tejidos pulmonares con esta preparación del anticuerpo preabsorbido
dio lugar a la ausencia de marcado en todas las áreas del pulmón,
incluyendo los vasos sanguíneos pulmonares (Figura 14c). El marcado
de los tejidos pulmonares con sólo la IgG no inmune, produjo la
ausencia de marcado en todas las áreas del pulmón. Los controles
indican que el marcado observado con el anticuerpo primario es
específico para EC-SOD en el pulmón.
Inmunocitoquímica en el microscopio
electrónico: En la Tabla VII se comprendía un resumen del
marcado para EC-SOD que se encontró en el pulmón
utilizando la inmunocitoquímica en el microscopio electrónico.
EC-SOD se asoció principalmente con las proteínas de
la matriz extracelular en todas las regiones del pulmón. En
particular, se apreció un alto grado de marcado en las áreas ricas
en el colágeno de tipo I (Figura 16) y en asociación con otros
proteoglicanos no identificados en la matriz extracelular (Figura
17). Notablemente, no se apreció marcado para EC-SOD
en las áreas ricas en elastina (Figura 16). Se observó un alto grado
de marcado cerca de la superficie de las células musculares lisas y
en la matriz del tejido conjuntivo que rodea las células musculares
lisas en los vasos (Figura 17) y en las vías aéreas. El marcado
estuvo notablemente ausente de la superficie de las células
endoteliales en los grandes, medianos y pequeños vasos (Figuras 18a
y 18b). La ausencia de marcado celular endotelial hallada mediante
la inmunohistoquímica en el microscopio óptico confirma los datos
del microscopio electrónico. Se espera la localización de
EC-SOD en el plasma, ya que esta proteína se
descubrió primero en el plasma (Marklund, Acta Physiol. Scand.,
5492:19 (1980)). Se observó el marcado de EC-SOD en
las uniones intercelulares entre las células epiteliales bronquiales
(Figura 19), pero no se encontró en la superficie apical de estas
células. Finalmente, el marcado de EC-SOD estuvo
ausente de la superficie de las células de tipo I y de tipo II. Una
cantidad consistente pero moderada de EC-SOD
intracelular se encontró en las células epiteliales de tipo II y en
las células epiteliales bronquiales (Figura 19).
Los controles realizados absorbiendo el
anticuerpo específico de EC-SOD fuera del anticuerpo
primario y reemplazando este anticuerpo absorbido con la IgG no
inmune de conejo, dieron lugar a la ausencia de marcado en todas las
áreas del pulmón, incluyendo las áreas ricas en colágeno de tipo I,
tal como se aprecia en la Figura 16c. Además, la utilización de la
IgG no inmune del conejo en vez del antisuero primario dio lugar
asimismo a la ausencia de marcado en todas las áreas del pulmón. La
marca de marcado con estos controles indica que el marcado que se
observa con el antisuero primario es específico para
EC-SOD en el pulmón.
La localización de EC-SOD en la
superficie de las células musculares lisas y en la matriz
extracelular alrededor de estas células, tanto en los vasos
sanguíneos como en las vías aéreas, indica que
EC-SOD puede tener una importante función en esta
localización. Se sabe que el superóxido reacciona rápidamente con
óxido nítrico e inactiva sus propiedades como relajante del músculo
liso. Por tanto, la presencia de EC-SOD a lo largo
de la vía de difusión del óxido nítrico a las células musculares
lisas, deberá aumentar la semivida biológica de este mensajero
intercelular de vida corta en esta región particular, y, de este
modo, aumentar su potencia como vasodilatador. El marcado intenso de
EC-SOD que se aprecia alrededor de las células
vasculares y musculares lisas de las vías aéreas, indica una función
para EC-SOD mediadora de la actividad del ácido
nítrico en el mantenimiento de las presiones vasculares pulmonares
bajas y en la resistencia de las vías aéreas.
Además del marcado de EC-SOD en
asociación con las células musculares lisas, EC-SOD
parece también colocalizarse intensamente con el colágeno de tipo I.
Previamente, se ha demostrado que el colágeno es susceptible de ser
atacado por las especies de oxígeno reactivo tales como el anión
superóxido. Además, el anión superóxido puede ser capaz de activar
colagenasas latentes a partir de los leucocitos polimorfonucleares
(PMN) que pueden conducir a una ulterior degradación del colágeno. A
causa de que se ha mostrado que los fragmentos de colágeno atraen
químicamente y activan los PMN, cualquier aumento que se produzca de
superóxido que provoque la degradación del colágeno puede acelerar
reacciones inflamatorias y la destrucción tisular a través del
reclutamiento y activación de PMN. Consecuentemente, la asociación
de EC-SOD con el colágeno puede ser importante para
evitar la degradación del colágeno mediada por el superóxido y por
lo tanto, representa un medio de controlar las respuestas
inflamatorias.
[\alpha-^{35}S] dATP
(\sim1400 Ci/mmol), [\gamma^{32}P]ATP (3000 Ci/mmol), y
[\alpha^{-35}P] CTP (800 Ci/mmol), se obtuvieron de New England
Nuclear. El ADN genómico humano, T_{7}, T_{3}, y la SP6 ARN
polimerasa, la RNasin, y el plásmido pGEM3Z (+) se obtuvieron de
Promega Biotec. El equipo de secuenciación de la sequenasa (V 2.0)
procedía de United States Biochemicals Corporation. El polyA + ARN
humano se obtuvo de Clontech. La SeaPlaque GTG agarosa procedía de
FMC BioProducts. Las enzimas de restricción procedían de New England
Biolabs. Todos los otros reactivos utilizados fueron a nivel de
biología molecular. Los oligonucléotidos se sintetizaron utilizando
un 380 B o 392 Applied Biosystems por la Duke University, Department
of Botany DNA Synthesis facility. Las membranas de nylon cargadas
(GeneScreen Plus) procedían de DuPont.
Se purificaron 2 \mug de poli A(+) ARN a partir
de ocho tejidos humanos distintos. Estos ARNm se sometieron a
electroforesis sobre un gel desnaturalizante de formaldehído-
agarosa al 1,2% y se transfirieron a una membrana de nylon de carga
modificada, seguido por fijación mediante irradiación UV. La
membrana se prehibridizó en formamida al 50%, 0,25 M NaPO_{4} (pH
de 7,2), 0,25 M NaCl, 1 mM EDTA, SDS al 7%, y polietilenglicol al 5%
(peso molecular de 8000). La transferencia se hibridizó en el mismo
tampón por la noche a 60ºC con 1 X 10^{6} cpm/ml de ARN
EC-SOD humano marcado con [^{32}P], generado
mediante transcripción del cADN de longitud completa, utilizando
T_{3} ARN polimerasa en presencia de [\alpha^{-32}P] CTP. La
transferencia se lavó en 0,25 M NaPO_{4} (pH de 7,2), 1 mM EDTA,
SDS al 1%, a 75ºC, seguido por un segundo lavado utilizando 0,04 M
NaPO_{4} (pH de 7,2), 1 mM EDTA, SDS al 1%, a 75º durante 30
minutos. Esto fue seguido por la exposición a una película
XAR-5 utilizando una pantalla de intensificación
Lightening Plus a -70ºC. El autoradiograma se rastreó utilizando un
densitómetro de laser LKB Ultrascan XL, y los picos se cuantificaron
por integración, empleando el integrador digital interno del
densitómetro o seccionando el pico de un trazado de la impresora, y
pesándolo.
0,5 \mug de poly A + ARNm del corazón humano se
transcribieron inversamente utilizando 2 pmoles de EC7, un
oligonucleótido antisentido específico del gen 5'
EC-SOD
(5'-ATGACCTCCTGCCAGATCTCC-3'),
siguiendo un protocolo mediante GIBCO BRL (Sistema 5'RACE). La
matriz de ARN fue degradada añadiendo RNasa H a 55ºC durante 10
minutos. El cADN resultante se aisló utilizando un cartucho GlassMAX
DNA (GIBCO BRL) de aislamiento. Al cADN purificado se le añadió una
cola utilizando una desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT, 0,5
unidades/ul), 200 \muM dCTP, 10 mM Tris-HCl (pH
8,4), 25 mM KCl, 1,25 mM MgCl_{2} y 50 \mug/ml de albúmina
sérica bovina durante 10 minutos a 37ºC. El TdT fue inactivado
térmicamente durante 10 minutos a 70ºC.
Los productos de esta reacción se amplificaron a
continuación mediante PCR utilizando el iniciador de "anclaje"
(GIBCO BRL), que se hibridiza a la cola homopolimérica, y EC4 un
oligonucleótido
(5'-AGGCAGGAACA
CAGTAGC-3') antisentido específico interno empalmado al gen 5' EC-SOD. Alternativamente, los productos a los que se había añadido una cola se amplificaron mediante PCR utilizando BC7 y HECl (un iniciador 5'-TGGGTG
CAGCTCTCTTTTCAGG-3') con sentido, específico del gen EC-SOD. La composición final de la reacción incluía 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl_{2}, 100 \mug/ml de albúmina sérica bovina, 400 nM iniciador de anclaje, 200 nM de iniciador gen específico, y 200 \muM cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP. Después de incubar la reacción PCR durante 5 minutos a 94ºC, se añadió amplitaq (Perkin Elmer Cetus) a una concentración final de 0,04 unidades/\mul. La ciclación PCR se llevó a cabo en un Perkin Elmer 9600 durante 35 ciclos con una fusión a 94ºC durante 45 segundos e hibridizando a 53ºC durante 15 segundos y ampliándose a 72ºC durante 90 segundos. El cADN EC-SOD de longitud completa (6 ng) se utilizó como un control positivo en la reacción PCR. Los productos PCR se sometieron a electroforesis en un gel SeaPlaque GTG de agarosa al 2%, se transfirieron a membranas de nylon cargadas mediante el procedimiento de Southern (Southern, J. Mol. Biol. 98:503 (1975)), utilizando el protocolo de transferencia alcalina (Reed et al, Nuc. Acids Res. 13:7207 (1985)). El ADN se fijó a la membrana secando hasta 80ºC en un horno de vacío durante 2 horas. La transferencia subsiguiente se hibridizó a HBC2 marcado en el extremo con [^{32}P] (un iniciador 5'-TCCAGCTCCTCCAAGAGAGC-3') interno, empalmado al EC-SOD específico) por la noche a 37ºC. La transferencia se lavó entonces con restricción creciente, hasta que se eliminó la hibridación anterior. Esto fue seguido por la exposición a la película XAR-5 utilizando una pantalla de intensificación Lightening Plus a -70ºC.
CAGTAGC-3') antisentido específico interno empalmado al gen 5' EC-SOD. Alternativamente, los productos a los que se había añadido una cola se amplificaron mediante PCR utilizando BC7 y HECl (un iniciador 5'-TGGGTG
CAGCTCTCTTTTCAGG-3') con sentido, específico del gen EC-SOD. La composición final de la reacción incluía 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl_{2}, 100 \mug/ml de albúmina sérica bovina, 400 nM iniciador de anclaje, 200 nM de iniciador gen específico, y 200 \muM cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP. Después de incubar la reacción PCR durante 5 minutos a 94ºC, se añadió amplitaq (Perkin Elmer Cetus) a una concentración final de 0,04 unidades/\mul. La ciclación PCR se llevó a cabo en un Perkin Elmer 9600 durante 35 ciclos con una fusión a 94ºC durante 45 segundos e hibridizando a 53ºC durante 15 segundos y ampliándose a 72ºC durante 90 segundos. El cADN EC-SOD de longitud completa (6 ng) se utilizó como un control positivo en la reacción PCR. Los productos PCR se sometieron a electroforesis en un gel SeaPlaque GTG de agarosa al 2%, se transfirieron a membranas de nylon cargadas mediante el procedimiento de Southern (Southern, J. Mol. Biol. 98:503 (1975)), utilizando el protocolo de transferencia alcalina (Reed et al, Nuc. Acids Res. 13:7207 (1985)). El ADN se fijó a la membrana secando hasta 80ºC en un horno de vacío durante 2 horas. La transferencia subsiguiente se hibridizó a HBC2 marcado en el extremo con [^{32}P] (un iniciador 5'-TCCAGCTCCTCCAAGAGAGC-3') interno, empalmado al EC-SOD específico) por la noche a 37ºC. La transferencia se lavó entonces con restricción creciente, hasta que se eliminó la hibridación anterior. Esto fue seguido por la exposición a la película XAR-5 utilizando una pantalla de intensificación Lightening Plus a -70ºC.
10 \mug de ADN genómico humano se digirieron
con los enzimas endonucleásicos de restricción BamHI, EcoRI, Kpn I,
y Pst, hasta que la digestión se hubo completado. El ADN se sometió
entonces a electroforesis en un gel de agarosa al 1% y mediante la
técnica de Southern se transfirió a una membrana de nylon cargada
(Southern, J. Mol. Biol. 98:503 (1975)), después de
desnaturalización alcalina (Reed et al, Nuc. Acids Res.
13:7207 (1985)). El ADN se fijó a la membrana calentando hasta 80ºC
en un horno de vacío durante 2 horas. El cARN cadena antisentido del
EC-SOD humano marcado con [^{32}P]CTP se
sintetizó utilizando el cADN EC-SOD que se había
linearizado con Stu I. La transferencia se hibridizó (500 X 10^{3}
cpm/ml) en formamida al 50%, 0,25 M NaPO_{4} (pH 7,2), 0,25 M
NaCl, 1 mM EDTA, SDS al 7%, y polietilenglicol al 5% (peso molecular
8000), a 50ºC. Después de la hibridación durante toda la noche, se
lavaron en 0,25 M NaPO_{4} (pH de 7,2), 1 mM EDTA, SDS al 2%,
seguido por 0,04 M NaPO_{4} (pH 7,2), SDS al 1%, y 1 mM EDTA con
restricciones crecientes, hasta que la hibridación anterior se
minimizó. La transferencia se expuso a una película
XAR-5 utilizando una pantalla de intensificación
Lightening Plus a -70ºC.
A partir de Clontech, se obtuvo una biblioteca
genómica leucocitaria de una hembra adulta humana construida en el
vector EMBL-3. Se rastrearon aproximadamente 1 x
10^{6} pfu, con una densidad de \sim50.000 pfu/placa, utilizando
cARN EC-SOD humano marcado con [^{32}P]CTP
(1 X 10^{6} dpm/ml). Los rastreos primarios a terciarios
identificaron aproximadamente 7 únicas placas positivas putativas.
Se aislaron placas individuales y se purificó el ADN lambda
utilizando adsorbente fágico LambdaSorb. (Promega Biotec). El tamaño
del ADN insertado de cada clon se evaluó mediante digestión con
endonucleasas de restricción SaI I, seguido por electroforesis en
agarosa al 0,7%. Los clones seleccionados experimentaron una extensa
elaboración de mapas mediante endonucleasas de restricción.
Basándose en los resultados de la elaboración de los mapas de
restricción y en la hibridación asimétrica utilizando los
oligonucléotidos EC-SOD de hibridación 5' y 3', se
seleccionó el Clon #7 para todos los análisis subsiguientes
secuenciales del ADN. El Clon #7 contiene un fragmento aproximado de
18-20 kb.
La estrategia global utilizada para secuenciar el
clon #7 se ilustra en la Figura 20. Fragmentos endonucleásicos de
restricción de ADN del clon #7, de varios tamaños, se subclonaron en
el ADN del vector pGEM3Z(+). Se utilizaron el procedimiento didesoxi
de secuenciación utilizando ADN bicatenario como matriz (Ausubel
et al, Current Protocols in Molecular Biology, Green
Publishing Assoc. and Wiley Interscience, New York (1992) y la
enzima Sequenase (United States Biochemicals) (Sanger et al,
Proc. Natl. Sci. USA 74:5463 (1977)). Para iniciar la secuenciación
del ADN para cada fragmento subclonado, se utilizaron tanto el
iniciador Universal como el -40 M13. Los oligonucleótidos derivados
de estos datos iniciales de secuenciación, se sintetizaron
aproximadamente cada 250 pares de bases, hasta que se obtuvo la
secuencia nucleótida completa. Los datos de secuenciación se
obtuvieron de ambas cadenas, tal como se muestra en la Figura 20B,
excepto en la parte 3' del gen, en el que la secuencia de ADN se
obtuvo sólo en una cadena.
El programa IntelliGenetics Geneworks (Versión
2.2) se utilizó para organizar los datos secuenciales del ADN. Se
llevó a cabo la búsqueda de homología en el NCBI utilizando el
servicio de la red BLAST (Altschul et al, J. Mol. Biol.
215:403 (1990)) y la base de datos de secuencias de nucleótidos no
redundantes (GenBank(77.0) + EMBL (35.0) + EMBLUpdate +
GBU-date). La búsqueda de bases de datos del factor
transcripcional se llevó a cabo utilizando tanto el algoritmo SIGNAL
SCAN 3.0 (Prestidge et al, CABIOS 9: 113(1993), como
el programa FINDPATTERNS del GCG Package (V 7.2), utilizando el
Release 6.3 de la base de datos del Factor de Transcripción (Gosh,
Nuc. Acids Res. 18:1749 (1990)). Para predecir el sitio de división
del péptido señal, se utilizaron los programas SIGSEQ1 (Folz et
al, J. Biol Chem. 261: 14752 (1986)) y SIGSEQ2 (Folz et
al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 146:870 (1987)).
Para investigar la expresión del
EC-SOD humano, poly A(+)ARNm procedente de 8 tejidos
humanos distintos, se fraccionó en un gel desnaturalizante de
agarosa y se transfirió a una membrana de nylon cargada. A causa de
que un documento previo informó de largos tiempos de exposición para
identificar bandas específicas de EC-SOD durante el
análisis Southern genómico (Hendrickson et al, Genomics 8:736
(1990)), se utilizó una sonda cARN antisentido marcada
radioactivamente, derivada del cADN BC-SOD humano
completo (Oury et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:9715
(1992)). En la totalidad de los ocho tejidos humanos analizados,
puede apreciarse una banda discreta de 1,4 kb aproximadamente
(Figura 21A). Además, el músculo esquelético contiene un mensaje
aproximado de 4,2 kb, no detectado en los otros tejidos. Mediante
rastreo densitométrico de las bandas de 4,2 y 1,4 kb, puede
calcularse que el mensaje más grande representaba alrededor del 32%
del mensaje de EC-SOD del músculo esquelético total.
En el cerebro, puede apreciarse una banda muy ligera de 2,2 kb. Esta
banda fue demasiado débil para la cuantificación mediante el
densitómetro laser. La cuantificación de estas bandas se llevó a
cabo mediante densitometría laser e integración de picos de
autoradiogramas obtenidos en la gama lineal de exposición (Figura
21B). Después de la normalización del cerebro, el corazón mostró la
máxima expresión con 10,1 veces la del cerebro. Esto fue seguido por
la placenta, páncreas, y pulmón, que dieron lugar a 13,6, 10,2 y 7,5
respectivamente. La expresión en el músculo esquelético fue de 4,7
para la banda de 1,4 kb o de 6,9 para los mensajes, tanto de 1,4 kb
como de 4,2 kb, mientras que el riñón e hígado dieron lugar a 6,3 y
4,1 veces la expresión respecto al cerebro. Estos patrones de
expresión se han reproducido, basándose en el sondeo de una
transferencia adicional Northern tisular múltiple independiente.
Las bandas son específicas, basadas en las relativamente altas
restricciones de lavado y en los datos que utilizan una cadena cARN
EC-SOD con sentido como sonda, que no mostró
hibridación bajo las condiciones dadas.
Inicialmente, la elaboración del mapa del sitio
de iniciación de la transcripción se intentó utilizando el
procedimiento de extensión de los iniciadores. Utilizando distintos
oligonucleótidos marcados en el extremo 5' y el poly A+ ARNm tanto
del pulmón humano como del corazón humano, así como el ARN total
aislado de los fibroblastos del prepucio humano, no se obtuvo una
señal positiva, después incluso de tiempos de exposición largos.
Esto no pareció deberse a la técnica, ya que no fue posible obtener
señales positivas utilizando ARN generado por la transcripción in
vitro del cADN EC-SOD. No está claro si la falta
de éxito al utilizar esta técnica se debió a la escasa cantidad de
ARNm que codificaba EC-SOD o a algún otro u otros
problemas. Trabajando con la suposición de la escasa cantidad de
ARNm, se intentó la técnica de amplificación rápida de los extremos
de cADN para amplificar esta señal mediante PCR. Se utilizó el
iniciador EC7 específico del gen EC-SOD para la
hibridación y la transcripción inversa del poly A + ARNm del corazón
humano, tal como se muestra en la Figura 22. A la mitad de esta
reacción se le añadió una cola dC en el extremo 3' utilizando la
desoxinucleotidil transferasa terminal, y a la otra mitad (de la
reacción), no. Estas matrices se sometieron entonces a amplificación
PCR utilizando los iniciadores específicos génicos HEC1 + EC7, así
como el iniciador + EC4 de anclaje. Los productos de estas
reacciones se fraccionaron mediante electroforesis en agarosa, se
transfirieron a membranas de nylon, y se sondearon con el iniciador
HEC2 empalmado interno específico del gen. En la Figura 22A se
muestra un autoradiograma de este experimento. Utilizando cADN
EC-SOD como una matriz de control y HEC1 + EC7, se
espera una banda de 217 pares de bases (carril 3 de la Figura 22A).
Ya que se espera que los iniciadores HEC1 y EC7 lleven a cabo la
amplificación independientemente de la adición dC de la cola, se
aprecian bandas de idéntica intensidad en los carriles 4 y 5, que
son asimismo del mismo tamaño que el control EC-SOD.
Utilizando el iniciador de anclaje (que se hibridiza a la cola dC) y
EC4, sólo se apreció una banda de \sim190 pares de bases (carril
1). Ya que la matriz no presentaba añadida la cola poly C, el carril
2 no muestra señal, tal como se esperaba. Restando 48 pares de bases
(el tamaño del iniciador de anclaje), el tamaño del ADN transcrito
inversamente correspondería \sima 136 pares de bases en el extremo
5' del iniciador EC4. Este análisis predeciría que en el clon cADN
existen aproximadamente 6 pares de bases adicionales de la secuencia
del extremo 5' y que la iniciación de la transcripción se inicia 6
pares de bases aproximadamente por encima del primer intron
(indicado por un cuadrado resaltado). Aunque la iniciación de la
transcripción eucariótica empieza habitualmente en un residuo de
adenosina, se espera que comenzará en una G (Breathnach et
al, Ann. Rev. Biochem. 50:349
(1981)).
(1981)).
Para empezar a caracterizar el gen
EC-SOD humano, 10 \mug del ADN genómico humano
total, se digirió con enzimas de restricción y los productos de la
reacción se sometieron a electroforesis en un gel agarosa, seguido
por la transferencia a una membrana de nylon. La transferencia se
sondeó con un cARN EC-SOD parcial marcado con
[^{32}P). En la Figura 23 se muestra un autorradiograma de esta
transferencia. Como puede apreciarse para cada carril, existen
bandas únicas asociadas con cada digesto de restricción. No se
apreciaron bandas que resaltaran que pudieran sugerir pseudogenes.
Cuando una sonda cARN completa se utilizó para el ADN digerido por
Kpn I, se apreció una banda adicional de \sim4000 pares de bases
que corresponde al extremo 3' del gen. Además, el carril Kpn I
muestra una banda de 0,5 kb que se apreció mejor en otras
transferencias. Este patrón de bandas fue similar a un mapa de
restricción del clon #7 del EC-SOD humano (véase la
Figura 20 A).
Se identificaron múltiples clones positivos
independientes a partir de una biblioteca genómica leucocitaria de
un adulto humano, construida en BMBL-3. Estos clones
experimentaron la elaboración extensa de mapas mediante las
endonucleasas de restricción, sondeándose con oligonucleótidos 3' y
5' específicos de EC-SOD para determinar la
orientación relativa de las inserciones. Basándose en estos
resultados, el clon #7 se seleccionó para un análisis posterior. El
clon #7 tiene alrededor de 18 a 20 kb y contiene por lo menos 5000
pares de bases de ADN que franquean el extremo 5' y por lo menos
4000 pares de bases del ADN que franquean el extremo 3'. El mapa de
restricción del clon #7 se muestra en la Figura 20A. Este mapa es
similar a los resultados obtenidos con los datos genómicos del
análisis de transferencia Southern que indicaban que el clon #7
contiene el gen EC-SOD. La estrategia para subclonar
y secuenciar el clon #7 se muestra en la Figura 20B. Varios
fragmentos de restricción contiguos en tamaño y que se solapaban, se
subclonaron en el vector plasmídico pGEM32f (+) (Figura 20B). Las
inserciones de ADN se secuenciaron en ambas cadenas utilizando una
combinación de desplazamiento de iniciadores e iniciadores
universales vector específicos de secuenciación. La mitad del
extremo 3'de la inserción 7K36 se secuenció sólo en una cadena. Los
datos secuenciales publicados para el cADN EC-SOD
(Rjalmarsson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6340
(1987)), así como la información de la secuencia del ADN obtenida a
partir de un clon independiente cADN que contenía datos adicionales
no traducidos del extremo 5' (Hendrickson et al, Genomics 8:
736 (1990)), se utilizaron para determinar la estructura genómica
intrón/exón. Basándose en una comparación de estos datos con la
información de la secuencia genómica, se determinó que el gen
EC-SOD humano contenía tres exones y dos intrones
(Figura 20C). El exón 1 contiene por lo menos 5 pares de bases y es
probablemente más grande (alrededor de 6 pares de bases), ya que el
inicio exacto de la iniciación de la transcripción no se determinó
(obsérvese a continuación). El exón 2 contiene 84 pares de bases y
está separado del exón 1 por una secuencia de intervención de 572
pares de bases, que se marca como intrón 1. El exón 3 está separado
del exón 2 por el intrón 2, un segmento de 3849 pares de bases. El
exón 3 contiene un total de 1336 pares de bases y en el par de bases
17 en el interior de este exón, empieza la secuencia codificante
completa para preEC-SOD (Figura 20 D). Esto incluye
un péptido señal de 18 aminoácidos que precede a la secuencia
proteica madura de 222 aminoácidos. No existen intrones que separen
los diversos dominios estructurales de EC-SSOD.
Estos dominios se muestran esquemáticamente en la Figura 20D e
incluyen los aminoácidos 1-95 que contienen una
Asn-89 glicosilada y no muestran homología
secuencial con otras proteínas. Además, los aminoácidos
96-103 muestran una intensa homología con las
secuencias proteicas CuZn-SOD, conservándose los
aminoácidos críticos importantes en la catálisis enzimática y en la
estructura. Los aminoácidos 194-222 contienen
múltiples residuos cargados que se han mostrado importantes para
unirse a proteoglicanos sulfatados. También se secuenciaron 558
pares de bases de la región que flanquea al extremo 5' que contiene
elementos reguladores putativos y 3675 pares de bases de la región
que flanquea el extremo 3' de ésta. Los datos de la secuencia
exónica de ADN están de acuerdo con la secuencia publicada del cADN
(Hjalmarsson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6340
(1987)). Los límites intrón-exón se muestran en la
Tabla VIII y se ajustan a la secuencia eucariótica consensuada de
corte y empalme (Senapathy et al, Methods Enzymol 183:252
(1990). Ambos intrones dividen secuencias en la región no traducida
del extremo 5' del gen EC-SOD.
El tamaño de los intrones y exones se muestra en
pares de bases (bp). Las letras mayúsculas indican la secuencia
exónica, mientras que las letras minúsculas indican la secuencia
intrónica. Las uniones de corte y empalme se muestran ajustadas a
las secuencias consenso previamente publicadas para las uniones de
corte y empalme (Senapathy et al, Methods Enzymol. 183:252
(1990)).
La Figura 24 muestra la secuencia completa para
el gen EC-SOD humano. Se muestran las secuencias
exónicas en letras mayúsculas en recuadro, mientras que la secuencia
intrónica que flanquea los extremos 5' y 3', se muestra en
minúsculas. El exón 3 contiene la región codificante completa
ininterrumpida para EC-SOD y la secuencia proteica
se muestra utilizando el código aminoácido de letras únicas. El
péptido señal de 18 aminoácidos y la secuencia de la proteína
madura de 222 aminoácidos están destacados. La identificación del
sitio de división del péptido señal está de acuerdo con algoritmos
de computación que predicen el sitio de la división del péptido
señal eucariótico (Folz et al, Biochem. Biophys. Res. Comm.
146:870 (1987); Von Heijne, Eur. J. Biochem. 133:17 (1983)).
Se utilizó la búsqueda de bases de datos de
factores transcripcionales para identificar putativamente elementos
reguladores transcripcionales. Aunque casi todos los promotores
eucarióticos utilizan un elemento de la secuencia TATA para fijar la
posición del inicio de la transcripción, no puede distinguirse para
el gen EC-SOD una secuencia TATA obvia. Se
identificaron dos elementos secuenciales CAAT. Uno se encuentra en
orientación inversa y se localiza alrededor de 20 pares de bases por
encima del primer exón, mientras que el segundo puede encontrarse
alrededor de 335 pares de bases por encima. Se muestra la señal
putativa para la poliadenilación y se indica el sitio de la poly A
adenilación.
La búsqueda de bases de datos de factores
transcripcionales de la región no traducida del extremo 5' y del
primer intrón identificó varios elementos reguladores potenciales.
Un elemento sensible cAMP (CREB) (TGACGT), que es similar al
elemento de transcripción del adenovirus (ATF), puede encontrarse
empezando en 121 pares de bases (Fink et al, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85:6662 (1988); Sassone-Corsi, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85:7192 (1988)). Un sitio intermedio para el
elemento de respuesta glucocorticoide (GRE) (TGTCCT) se localiza en
los 370 pares de bases (Karin et al, Nature 308:513 (1984)).
Un elemento de respuesta del factor transactivante específico del
músculo esquelético (M-CAT) (CATTCCT) se encuentra
al comienzo de la orientación inversa, que empieza en la posición
238 (Mar et al, Mol. Cell. Biol. 10:4271 (1990)). Un elemento
sensible xenobiótico (XRE) (CACGCW) se encuentra en el interior del
primer intrón, en posición 1085 pares de bases (Rushmore et
al, J. Biol. Chem. 265:14648 (1990)). Un elemento regulador
metálico (MRE) (TGCRCYC) se encuentra en posición 89 (Culotta et
al, Mol. Cell. Biol. 9:1376 (1989)). Dos elementos antioxidantes
putativos de respuesta (ARE) (RGT-GACNNNGC) se
encontraron en posición 650 y 5022 (Rushmore et al, J. Biol.
Chem. 266:11632 (1991). Un elemento sensible sis (SIF) (CCCGTC),
importante en la inducción del
c-fos-proto-oncogén,
se encontró en la orientación inversa en posición 251 (Wagner et
al, EMBO J. 9:4477 (1990)). Existe un sitio de unión AP1 o un
elemento sensible TPA (TRE) (TGACTCA) encontrado en posición 162
(Risse et al, EMBO J. 8:3825 (1989)). La región potenciadora
de SV40 AP4 (CAGCT-GTGG) puede encontrarse en
posición 171 (Jones et al, Genes Dev. 2:267 (1988)).
Preparación de ADN genómico derivado de
leucocitos de pacientes: Se identificarán pacientes sanos
normales de control y pacientes con asma, hipertensión pulmonar
primaria, e hipertensión pulmonar secundaria. El ADN genómico se
purificará utilizando un equipo Qiagen Blood PCR. 1 ml de sangre
que contenía aproximadamente 10^{7} leucocitos/ml, se recuperará
en citrato sódico a partir de cada paciente o individuo control. La
sangre se dispone en una columna QIAGEN rotante, y los leucocitos
son atrapados en la resina mediante una rápida centrifugación,
mientras que los eritrocitos y la hemoglobina se desechan. Los
leucocitos son lisados añadiendo 0,7 ml de tampón de lisis,
incubándose a temperatura ambiente durante 30 minutos. El ADN que se
libera, se une a la resina en el tubo. Los restos celulares que
permanecen son arrastrados mediante múltiples ciclos de
lavado/rotación. El ADN se eluyó añadiendo 1,2 M KCl, 50 mM MOPS,
etanol al 15%, pH 8,3. Esto da lugar de modo típico a
aproximadamente 10 \mug de ADN genómico. (Reihsaus et al,
Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:334 (1993)).
Diseño de iniciadores y amplificación PCR de
secuencias exónicas de EC-SOD: Iniciadores
oligonucleótidos con y sin sentido (o se utilizan iniciadores ya
obtenidos de secuenciar el ADN genómico) se diseñarán conteniendo
una abrazadera 3'GC (Sheffeld et al, Proc. Natl Acad. Sci,
USA 86:232 (1989)). Estos iniciadores codificarán la región menos
codificante del intrón del gen EC-SOD. Una región de
172 pares de bases en la región no traducida del extremo 3' se
amplió, utilizando iniciadores de secuenciación de ADN y ADN
genómico humano. Las condiciones PCR son tal como las que se
describen (Reihause et al, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol.
8:334 (1993)); Innis et al (eds) Academic Press San Diego
págs 1-12 (1990) utilizando Taq polimerasa, con
ciclos térmicos de la manera siguiente: desnaturalización inicial a
95ºC durante 5 minutos, seguido por 35 ciclos de desnaturalización a
94ºC durante 20 segundos, hibridación a 57ºC durante 15 segundos, y
alargamiento a 72ºC durante 45 segundos. A causa de la composición
GC y de la secuencia actual del iniciador, será necesario optimizar
experimentalmente las condiciones para la amplificación PCR
utilizando cada conjunto de iniciadores. Se utilizarán tres
conjuntos de iniciadores para abarcar la región codificante
completa.
Identificación de mutaciones con análisis del
polimorfismo conformacional monocatenario (SSCP): El análisis
SSCP se ha utilizado para detectar desemparejamientos únicos de
pares de bases (Orita et al, Genomics 5:874 (1989)). Se
utilizará la electroforesis en gel de gradiente térmico (TGGE) para
detectar diferencias en la movilidad (Wartell et al, Nuc.
Acids Res. 18:2669 (1990). Se prepararán muestras para TGGE mediante
desnaturalización térmica del producto PCR a 98ºC durante 5 minutos,
volviéndose entonces a renaturalizar a 500ºC durante 15 minutos con
el correspondiente ADN de tipo salvaje derivado de la PCR del gen
clonado. La electroforesis se llevará a cabo en un gel de acrilamida
al 5%, 8 M urea con un gradiente de temperatura. El gradiente de
temperatura se optimizará para cada uno de los segmentos ADN de
EC-SOD. Gradientes típicos para la detección de
mutaciones del receptor \beta_{2}-adrenérgico
estuvieron entre 35ºC y 60ºC, y necesitaron de 4 a 6 horas de tiempo
de procesamiento (Rosen, Nature 262:59 (1993)).
Todas las muestras PCR que se encontró eran
positivas para mutaciones por TGGE, serán secuenciadas directamente
utilizando la técnica del didesoxi (Sanger et al, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 74:5463 (1977)).
En un primer estudio, se llevaron a cabo ensayos
en una cubeta de cuarzo de 1 ml que contenía 50 mM de tampón
carbonato, pH 10, 0,1 mM EDTA, 1 nM xantina oxidasa (Boehringer
Mannheim) a 25ºC. La actividad de la xantina oxidasa se midió
espectrofotométricamente haciendo el seguimiento de la pérdida de
xantina a lo largo del tiempo a 295 nm. Se utilizaron cuatro
concentraciones de xantina (25, 50, 250, 500 \muM) y 2
concentraciones de MnTBAP (5, 10 \muM). Se derivaron entonces dos
c constantes de inhibición de las intersecciones de la curva (Kii =
5,5 \muM) y de las pendientes de ella (Kis = 15 \muM). Los
resultados que se presentan en la Figura 25 muestran que MnTBAP
inhibe la xantina oxidasa de forma no competitiva.
En un segundo estudio, cultivos de células
endoteliales de arterias pulmonares (CPA-47 (Tissue
and Cell 10:535 (1978)) se desarrollaron hasta confluencia en medio
F-12K de Ham con suero bovino fetal al 10% a pH 7,4
y 37ºC. Las células se tripsinizaron entonces y se sembraron con
densidades similares en placas de 24 pocillos y se hicieron crecer
hasta obtener una confluencia del 90%. Las células se lavaron
entonces y se preincubaron durante 1 hora con 50 \muM de MnTBAP en
medio esencial mínimo (MEM) o sólo en MEM. Se añadieron cantidades
variables de xantina oxidasa (XO) más 200 \muM de xantina (X) y se
permitió que se incubaran durante 24 horas. La lesión celular se
cuantificó midiendo la liberación de lactato deshidrogenasa celular
(LDH) en el medio. La eficacia de MnTBAP se muestra en la Figura 26
por la disminución en la liberación de LDH inducida por XO/X.
Cultivos de células epiteliales pulmonares de
rata (L2 (Kaighn y Douglas J. Cell Biol. 59:160a (1973)), se
hicieron crecer hasta confluencia en medio F-12K de
Ham con suero bovino fetal al 10%, a pH 7,4 y a 37ºC. Las células se
tripsinizaron entonces y sembraron con densidades iguales en placas
con 24 pocillos, y se dejó que se desarrollaran hasta una
confluencia del 90%. Las células se lavaron y se preincubaron
durante 1 hora con 100 \muM de MnTBAP o MnTMPyP en MEM o sólo MEM.
Se añadió Paraquat (2,5 mM) y se dejó que se incubara durante 48
horas. La lesión celular se cuantificó midiendo la liberación de la
lactato deshidrogenasa celular (LDH) al medio. La Figura 27 muestra
que MnTPyP (líneas rayadas) y MnTBAP (lineas grises) disminuyen la
liberación de LDH inducida por el paraquat.
En un estudio posterior, cultivos de células
endoteliales de la arteria pulmonar (CPA-47
(Tissue and Cell 10:535 (1987)) se hicieron crecer hasta confluencia
en medio F-12K de Ham con suero bovino fetal al 10%
a un pH de 7,4 y 37ºC. Las células se tripsinizaron entonces y se
sembraron con idénticas densidades en placas con 24 pocillos y se
desarrollaron hasta alcanzar una confluencia del 90%. Las células se
lavaron y se preincubaron durante 1 hora con concentraciones
variables de MnTBAP en MEM o sólo MEM. Se añadió Paraquat (2 mM) y
se dejó incubar durante 24 horas. La lesión celular se cuantificó
midiendo la liberación de la lactato deshidrogenasa celular (LDH) al
medio. MnTBAP disminuye la liberación de LDH inducida por el
paraquat de forma dependiente de la dosis (véase Figura 28).
En contraste con MnTBAP, ZnTBAP no protege contra
la lesión inducida por el Paraquat. Cultivos de células endoteliales
de la arteria pulmonar de terneros (CPA-47 se
hicieron crecer hasta confluencia en medio F-12K de
Ham con suero bovino fetal al 10% a un pH de 7,4 y 37ºC. Las
células se tripsinizaron entonces y se sembraron con idénticas
densidades en placas con 24 pocillos y se desarrollaron hasta
alcanzar una confluencia del 90%. Las células se lavaron y se
preincubaron durante 1 hora con concentraciones variables de ZnTBAP
en MEM o sólo MEM. Se añadió Paraquat (2 mM) y se dejó incubar
durante 24 horas. La lesión celular se cuantificó midiendo la
liberación de la lactato deshidrogenasa celular (LDH) al medio. Los
resultados que se presentan en la Figura 29 demuestran que ZnTBAP no
posee actividad de tipo SOD. ZnTBAP puede utilizarse como un control
negativo para mostrar que el metal redox es importante en la
protección contra la toxicidad del Paraquat.
Se trataron ratones con Paraquat (PQ, 45 mg/kg,
vía intraperitoneal), o con solución salina (10 mg/kg, vía
intraperitoneal) y se expusieron a MnTBAP (2,5 mg/ml, nebulizado en
una cámara de 2 l a 2 l/min durante 30 minutos, dos veces al día
durante 2 días) o al aire libre. Se sacrificaron los animales 48
horas después del comienzo del tratamiento y se evaluaron las
lesiones pulmonares mediante análisis del fluido del lavado
broncoalveolar (BALF). Los marcadores de la lesión de BALF fueron la
lactato deshidrogenasa (LDH, como unidades/l), la concentración
proteica (como mg/dl), y la tasa de leucocitos polimorfonucleares
(PMN). El tratamiento con MnTBAP proporcionó una protección parcial
contra la lesión pulmonar inducida por el Paraquat (véase Figura
30).
Todos los documentos anteriormente citados se
incorporan completos a la presente memoria como referencia.
Los expertos en la materia apreciarán, a partir
de la lectura de esta exposición, que pueden realizarse varios
cambios en la forma y en el detalle sin desviarse del alcance de la
invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: DUKE UNIVERSITY
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: OFFICE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, P.O. BOX 90083, 001E ALLEN BUILDING
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: DURHAM
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: NC
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 27708-0083
\vskip0.800000\baselineskip
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: UNIVERSITY OF ALABAMA AT BIRMINGHAM RESEARCH FOUNDATION
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 701 20^{th} STREET SOUTH
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: BIRMINGHAM
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: AL
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PÁIS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 35294-0111
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Miméticos de superóxido dismutasa
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 22
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/322,766
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 13-OCT-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/136,207
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-OCT-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Arg His His Pro Arg Glu Met Lys Lys Arg
Val Glu Asp Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg
Glu Ser Glu Cys Lys}
\sac{ Ala Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg
Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg
Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg
Ala Ser Glu Cys Lys}
\sac{Ala Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg
Glu Ser Glu Ala Lys}
\sac{Ala Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg
Glu Ser Glu Cys Ala}
\sac{Ala Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg
Ala Ser Ala Cys Lys}
\sac{Ala Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg
Ala Ser Glu Cys Ala}
\sac{Ala Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGACCTCCT GCCAGATCTC C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGCAGGAAC ACAGTAGC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGGTGCAGC TCTCTTTTCA GG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCAGCTCCT CCAAGAGAGC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCGGGGTGG AC
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAAAGGTGG GT
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCCAGGCTA CA
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGCAGGTGC CC
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipRGTGACNNNG C
\hfill11
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCTGTGG
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10079 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 5085...5804
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 240 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Gly Arg Arg
Ala Ser Glu Cys Ala}
\sac{Ala Ala}
Claims (17)
1. Utilización de un mimético de la superóxido
dismutasa de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o de una sal de la misma
farmacéuticamente aceptable, en la
que
R_{1} es un enlace,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X es un halógeno e Y es
un grupo alquilo, y en la
que
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
indica el enlace a R_{2} en
cualquier posición;
e
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
indica el enlace a R_{2} y el
sustituyente en cualquier posición
y
R_{2} es un enlace, -(CY'_{2})_{n}-,
-(CY'_{2}-CY'=CY')_{n}-,
-(CY'_{2}-CY'_{2}-CH=CH)_{n}-,
-(CY'=CY)_{n}-, o
--- (CY'_{2}
---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}})_{n^{-}},en la que Y' es hidrógeno o un
grupo alquilo y en la que n es 1 a 8;
y
R_{3} es -Y'', -OH, -NH_{2},
-N^{+}(Y'')_{3}, -COOH, -COO-, -SO_{3}H, -SO_{3}-,
-CH_{2}-PO_{3}H_{2} o
-CH_{2}-PO_{3}H-, en la que Y'' es un grupo
alquilo,
que forma un complejo con el manganeso;
en la preparación de un medicamento para proteger
a las células de la toxicidad inducida por el radical superóxido en
cualquiera o varias de las siguientes aplicaciones:
1. la protección contra las lesiones isquémicas
de reperfusión asociadas al infarto de miocardio, ictus, trauma
cefálico agudo, reperfusión de órganos después de trasplante,
isquemia intestinal, infarto pulmonar, oclusión quirúrgica del flujo
sanguíneo, o lesiones de los tejidos blandos;
2. la protección contra lesiones esqueléticas de
reperfusión:
3. la protección contra la agresión a la piel y a
los ojos de la luz solar;
4. la protección contra la agresión ocular del
glaucoma o de la degeneración macular;
5. la protección contra las enfermedades
óseas;
6. la protección contra los trastornos del tejido
conjuntivo asociados a defectos en la síntesis o degradación del
colágeno;
7. el tratamiento de las enfermedades del sistema
nervioso central;
8. el tratamiento de las enfermedades de la
musculatura;
9. el tratamiento de los trastornos
neurológicos;
10. el tratamiento de la artritis, hipertensión
sistémica, arteriosclerosis, edema, shock séptico, hipertensión
pulmonar,impotencia, infertilidad, endometriosis, contracciones
uterinas prematuras, trastornos de la memoria, infecciones
microbianas, y/o gota;
11. el tratamiento de inflamaciones; y
12. el tratamiento de sinusitis crónica, y/o de
enfermedades autoinmunes.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dichas células son células de mamífero.
3. Utilización según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2 para el tratamiento de la demencia del SIDA, ictus,
esclerosis lateral amiotrófica (ALS), enfermedad de Parkinson,
enfermedad de Huntington), enfermedades diafragmáticas que
incluyen:
- fatiga respiratoria en el enfisema, bronquitis y fibrosis quística, fatiga cardíaca de la insuficiencia cardíaca congestiva, síndromes de debilidad muscular asociados con miopatías, ALS o esclerosis múltiple; Alzheimer, asma, ARDS, neumonía, o artritis reumatoide.
4. Procedimiento para proteger las células
vegetales de la toxicidad inducida por el radical superóxido, que
comprende poner en contacto dichas células con una cantidad no
tóxica, suficiente para efectuar dicha protección, de un mimético de
la superóxido dismutasa de fórmula:
o de una sal de la misma
farmacéuticamente aceptable, en la
que
R_{1} es un enlace,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X es un halógeno e Y es
un grupo alquilo, y en la
que
indica el enlace a R_{2} en
cualquier posición
e
indica el enlace a R_{2} y el
sustituyente en cualquier posición;
y
R_{2} es un enlace, -(CY'_{2})_{n}-,
-(CY'_{2}-CY'=CY')_{n}-,
-(CY'_{2}-CY'_{2}-CH=CH)_{n}-,
-(CY'=CY')_{n}-, o
--- (CY'_{2}
---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}})_{n^{-}},en la que Y' es hidrógeno o un
grupo alquilo y en la que n es 1 a 8;
y
R_{3} es -Y'', -OH, -NH_{2},
-N^{+}(Y'')_{3}, -COOH, -COO-, -SO_{3}H, -SO_{3}-,
-CH_{2}-PO_{3}H_{2} o
-CH_{2}-PO_{3}H-, en la que Y'' es un grupo
alquilo,
que forma un complejo con el manganeso;
5. Utilización de un mimético de la superóxido
dismutasa de fórmula
o de una sal de la misma
farmacéuticamente aceptable, en la
que
R_{1} es un enlace,
en la que X es un halógeno e Y es
un grupo alquilo, y en la
que
indica el enlace a R_{2} en
cualquier posición;
e
indica la unión a R_{2} y el
sustituyente en cualquier posición;
y
R_{2} es un enlace -(CY'_{2})_{n}-,
-(CY'_{2}-CY'=CY')_{n}-,
-(CY'_{2}-CY'_{2}-CH=CH)_{n}-,
(CY'=CY')_{n}-, o
--- (CY'_{2}
---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}})_{n^{-}},en la que Y' es hidrógeno o un
grupo alquilo y en la que n es 1 a 8;
y
R_{3} es -Y'', -OH, -NH_{2},
-N^{+}(Y'')_{3}, -COOH, -COO-, -SO_{3}H, -SO_{3}-,
-CH_{2}-PO_{3}H_{2} o
-CH_{2}-PO_{3}H-, en la que Y'' es un grupo
alquilo,
que forma un complejo con el manganeso;
en la preparación de un medicamento para inhibir
el daño debido a la oxidación de una sustancia con la formulación
subsiguiente de O_{2}- en cualquiera o varias de las aplicaciones
definidas según la reivindicación 1.
6. Utilización de un mimético de la superóxido
dismutasa según la reivindicación 1, para aumentar la viabilidad de
almacenamiento de los corazones, riñones, piel trasplantados y de
otros órganos y tejidos.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US13620793A | 1993-10-15 | 1993-10-15 | |
| US136207 | 1993-10-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2237753T3 true ES2237753T3 (es) | 2005-08-01 |
Family
ID=22471830
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES94930729T Expired - Lifetime ES2237753T3 (es) | 1993-10-15 | 1994-10-13 | Mimeticos de superoxido dismutasa. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5747026A (es) |
| EP (2) | EP1442747A1 (es) |
| JP (1) | JPH09505805A (es) |
| AT (1) | ATE291351T1 (es) |
| AU (1) | AU702596B2 (es) |
| CA (1) | CA2174236C (es) |
| DE (1) | DE69434313T2 (es) |
| ES (1) | ES2237753T3 (es) |
| WO (1) | WO1995010185A1 (es) |
Families Citing this family (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6127356A (en) * | 1993-10-15 | 2000-10-03 | Duke University | Oxidant scavengers |
| US5747026A (en) * | 1993-10-15 | 1998-05-05 | University Of Alabama At Birmingham Research Foundation | Antioxidants |
| US5994339A (en) * | 1993-10-15 | 1999-11-30 | University Of Alabama At Birmingham Research Foundation | Oxidant scavengers |
| WO1996009053A1 (en) * | 1994-09-20 | 1996-03-28 | Duke University | Oxidoreductase activity of manganic porphyrins |
| DE69635304T2 (de) * | 1995-06-07 | 2006-07-20 | Duke University | Faenger fuer oxidantien |
| JPH11511168A (ja) * | 1995-08-17 | 1999-09-28 | モンサント カンパニー | 窒素含有大環状リガンドの金属錯体の生体分子結合体を使用する診断造影検査方法 |
| US5747495A (en) * | 1995-08-22 | 1998-05-05 | Hiroshi Maeda | Method for treating hypertension using pyrazolopyrimidine derivatives |
| IL125889A0 (en) * | 1996-03-13 | 1999-04-11 | Monsanto Co | Bioconjugates of manganese or iron complexes of nitrogen-containing macrocyclic ligands effective as catalysts for dismutating superoxide |
| CA2309154C (en) | 1997-11-03 | 2010-02-16 | Duke University | Substituted porphyrins |
| AU771259B2 (en) * | 1998-04-24 | 2004-03-18 | Aeolus Sciences, Inc. | Substituted porphyrins |
| US6632808B1 (en) | 1998-08-11 | 2003-10-14 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors of amyloid formation |
| GB9817845D0 (en) | 1998-08-17 | 1998-10-14 | Glaxo Group Ltd | Chemical compounds |
| WO2000023568A2 (en) * | 1998-10-06 | 2000-04-27 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Methods and compositions for decreasing mitochondrial overproduction of reactive oxygen species in cells |
| US6695830B2 (en) * | 1999-01-15 | 2004-02-24 | Scimed Life Systems, Inc. | Method for delivering medication into an arterial wall for prevention of restenosis |
| US6210392B1 (en) * | 1999-01-15 | 2001-04-03 | Interventional Technologies, Inc. | Method for treating a wall of a blood vessel |
| ATE552260T1 (de) * | 1999-01-25 | 2012-04-15 | Nat Jewish Health | Substituierte porphyrine und deren therapeutische verwendung |
| IT1306716B1 (it) * | 1999-06-21 | 2001-10-02 | Mendes S U R L | Associazione di batteri lattici e suo uso per la prevenzione e/o iltrattamento terapeutico di infezioni e di stati infiammatori. |
| SE9903985D0 (sv) * | 1999-11-03 | 1999-11-03 | Aga Ab | Use of nitric oxide |
| FR2806911B1 (fr) * | 2000-03-28 | 2003-01-10 | Univ Rene Descartes | Utilisation de mimetiques de la sod dans le traitement d'insuffisances hepatocellulaires |
| US6403788B1 (en) | 2000-07-11 | 2002-06-11 | Eukarion, Inc. | Non-genotoxic metalloporphyrins as synthetic catalytic scavengers of reactive oxygen species |
| JP2005524601A (ja) * | 2000-09-15 | 2005-08-18 | ザ スクリップス リサーチ インスティテュート | 抗体による過酸化水素およびスーパーオキシド生成に関する方法および組成物 |
| US20020072512A1 (en) * | 2000-12-08 | 2002-06-13 | Metaphore Pharmaceuticals, Inc | Method of preventing and treating HIV-mediated central nervous system damage |
| ATE439134T1 (de) * | 2001-01-19 | 2009-08-15 | Nat Jewish Med & Res Center | Medikament zum schutz in der radiotherapie |
| WO2002058686A2 (en) * | 2001-01-26 | 2002-08-01 | Metaphore Pharmaceuticals, Inc. | Method of treatment of neurodegenerative disorders using pentaaza-macrocyclic ligand complexes |
| AU2002312194B8 (en) * | 2001-06-01 | 2008-05-15 | Aeolus Sciences, Inc. | Oxidant scavengers for treatment of diabetes or use in transplantation or induction of immune tolerance |
| US20040116350A1 (en) * | 2001-09-17 | 2004-06-17 | Paul Wentworth Jr | Methods and compositions relating to hydrogen peroxide and superoxide production by antibodies |
| US20050129680A1 (en) * | 2001-09-17 | 2005-06-16 | Paul Wentworth | Antimicrobial activity of antibodies |
| US20040157280A1 (en) * | 2001-09-17 | 2004-08-12 | Paul Wentworth | Antibody mediated ozone generation |
| WO2003072053A2 (en) | 2002-02-22 | 2003-09-04 | The Curators Of The University Of Missouri | Compounds for treatment of copper overload |
| EP1513537A4 (en) * | 2002-06-07 | 2006-09-06 | Univ Duke | Substituted porphyrins |
| WO2004044582A2 (en) * | 2002-11-14 | 2004-05-27 | Novartis Ag | Antibody- or neutrophil-mediated ozone generation |
| ZA200509229B (en) | 2003-05-01 | 2007-03-28 | Cornell Res Foundation Inc | Method and carrier complexes for delivering molecules to cells |
| EA010834B1 (ru) | 2004-03-29 | 2008-12-30 | Инотек Фармасьютикалз Корпорейшн | Пиридилзамещённые порфириновые соединения и способы их применения |
| WO2008018932A2 (en) | 2006-05-01 | 2008-02-14 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method and use of nano-scale devices for reduction of tissue injury in ischemic and reperfusion injury |
| WO2009140408A2 (en) | 2008-05-13 | 2009-11-19 | University Of Kansas | Metal abstraction peptide (map) tag and associated methods |
| EP2732817B1 (en) | 2008-05-23 | 2016-08-24 | National Jewish Health | A compound for use in treating injury associated with exposure to phosgene or chlorine gas |
| JP4891367B2 (ja) | 2009-05-21 | 2012-03-07 | トヨタ自動車株式会社 | 溶媒組成物 |
| US10531655B2 (en) | 2011-12-02 | 2020-01-14 | The Regents Of The University Of California | Reperfusion protection solution and uses thereof |
| WO2013181461A2 (en) | 2012-06-01 | 2013-12-05 | University Of Kansas | Metal abstraction peptide with superoxide dismutase activity |
| CN104190927B (zh) | 2014-08-11 | 2016-05-18 | 苏州大学 | 一种同步送粉空间激光加工与三维成形方法及装置 |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4963367A (en) * | 1984-04-27 | 1990-10-16 | Medaphore, Inc. | Drug delivery compositions and methods |
| US4758422A (en) * | 1985-01-04 | 1988-07-19 | Salutar Inc. | Ferrioxamine paramagnetic contrast agents for MR imaging |
| ATE78158T1 (de) * | 1985-05-22 | 1992-08-15 | Liposome Technology Inc | Verfahren und system zum einatmen von liposomen. |
| DK402785D0 (da) * | 1985-09-03 | 1985-09-03 | Syn Tek Ab | Fremgangsmaade til fremstilling af et enzym |
| EP0282899B1 (de) * | 1987-03-14 | 1996-01-10 | BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH | Humane Mangan-Superoxiddismutase (hMn-SOD) |
| US5227405A (en) * | 1987-03-31 | 1993-07-13 | Duke University | Superoxide dismutase mimic |
| US5223538A (en) * | 1987-03-31 | 1993-06-29 | Duke University | Superoxide dismutase mimic |
| US5171680A (en) * | 1988-06-14 | 1992-12-15 | Chiron Corporation | Superoxide dismutase analogs having novel binding properties |
| WO1990010694A1 (fr) * | 1989-03-06 | 1990-09-20 | Suntory Limited | Nouvelle superoxyde dismutase |
| DK455789D0 (da) * | 1989-09-15 | 1989-09-15 | Symbicom Ab | Polypeptid |
| EP0424033A3 (en) * | 1989-10-19 | 1991-07-31 | Pola Chemical Industries Inc | External skin preparation |
| EP0462836A3 (en) * | 1990-06-20 | 1992-08-26 | Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. | Recombinant vector plasmid capable of expressing human manganese superoxide dismutase, and process of producing this enzyme |
| US5202317A (en) * | 1990-09-13 | 1993-04-13 | The Regents Of The University Of California | Synthetic drug molecules that mimic metalloenzymes |
| US5217966A (en) * | 1990-09-13 | 1993-06-08 | The Regents Of The University Of California | Synthetic drug molecules that mimic metalloenzymes |
| WO1992007935A1 (en) * | 1990-11-01 | 1992-05-14 | The Scripps Research Institute | Glycosaminoglycan-targeted fusion proteins, their design, construction and compositions |
| DE69224839T2 (de) * | 1991-07-19 | 1998-10-08 | Monsanto Co | Mangan-Komplexe mit Stickstoff enthaltenden makrozyklischen Liganden, wirksam als Superoxiddismutasekatalysatoren. |
| US5696109A (en) * | 1992-12-07 | 1997-12-09 | Eukarion, Inc. | Synthetic catalytic free radical scavengers useful as antioxidants for prevention and therapy of disease |
| US5747026A (en) * | 1993-10-15 | 1998-05-05 | University Of Alabama At Birmingham Research Foundation | Antioxidants |
| WO2000023568A2 (en) * | 1998-10-06 | 2000-04-27 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Methods and compositions for decreasing mitochondrial overproduction of reactive oxygen species in cells |
| ATE552260T1 (de) * | 1999-01-25 | 2012-04-15 | Nat Jewish Health | Substituierte porphyrine und deren therapeutische verwendung |
| US6448239B1 (en) * | 1999-06-03 | 2002-09-10 | Trustees Of Princeton University | Peroxynitrite decomposition catalysts and methods of use thereof |
-
1994
- 1994-02-02 US US08/190,504 patent/US5747026A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 AU AU79763/94A patent/AU702596B2/en not_active Expired
- 1994-10-13 WO PCT/US1994/011558 patent/WO1995010185A1/en not_active Ceased
- 1994-10-13 ES ES94930729T patent/ES2237753T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 EP EP04010434A patent/EP1442747A1/en not_active Withdrawn
- 1994-10-13 DE DE69434313T patent/DE69434313T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 AT AT94930729T patent/ATE291351T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-10-13 EP EP94930729A patent/EP0723398B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 JP JP7512010A patent/JPH09505805A/ja not_active Ceased
- 1994-10-13 CA CA002174236A patent/CA2174236C/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU702596B2 (en) | 1999-02-25 |
| EP0723398A4 (en) | 1999-03-24 |
| EP0723398B1 (en) | 2005-03-23 |
| DE69434313T2 (de) | 2006-03-30 |
| CA2174236C (en) | 2008-02-12 |
| EP0723398A1 (en) | 1996-07-31 |
| ATE291351T1 (de) | 2005-04-15 |
| JPH09505805A (ja) | 1997-06-10 |
| EP1442747A1 (en) | 2004-08-04 |
| CA2174236A1 (en) | 1995-04-20 |
| WO1995010185A1 (en) | 1995-04-20 |
| AU7976394A (en) | 1995-05-04 |
| US5747026A (en) | 1998-05-05 |
| DE69434313D1 (de) | 2005-04-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2237753T3 (es) | Mimeticos de superoxido dismutasa. | |
| US5994339A (en) | Oxidant scavengers | |
| US6583132B1 (en) | Oxidant scavengers | |
| ES2249784T3 (es) | Antioxidantges de oxidantes. | |
| ES2316148T3 (es) | Acidos nucleicos compactados y su suministro a celulas. | |
| ES2287952T3 (es) | Proteinas de trebol intestinal. | |
| Oury et al. | Extracellular superoxide dismutase, nitric oxide, and central nervous system O2 toxicity. | |
| ES2247780T3 (es) | Un conejo transgenico que expresa una lipoproteina (a) humana funcional. | |
| AU2003279236B2 (en) | Pharmaceutical use of nitric oxide, heme oxygenase-1 and products of heme degradation | |
| ES2825999T3 (es) | Un inhibidor negativo dominante del TNF-alfa para su uso en el tratamiento de trastornos neurológicos del SNC | |
| Guo et al. | Gene transfer of human manganese superoxide dismutase protects small intestinal villi from radiation injury | |
| Pran Babu et al. | Ferrochelatase regulates retinal neovascularization | |
| Subramanian et al. | Mitochondrially targeted antioxidants for the treatment of cardiovascular diseases | |
| US5439824A (en) | Increased expression of α-1-antitrypsin in expression vectors through the inclusion of intron II | |
| Park et al. | Skeletal muscle reperfusion injury is enhanced in extracellular superoxide dismutase knockout mouse | |
| ES2749076T3 (es) | DNasa para uso en el tratamiento de crisis vaso-oclusivas | |
| KR102419006B1 (ko) | Apoa1의 투여를 위한 조성물 및 투여량 | |
| Rosenthal | Role of renal and extrarenal reninangiotensin system in the mechanism of arterial hypertension and its sequelae | |
| AU677379B2 (en) | Arteriosclerosis remedy | |
| AU769217B2 (en) | Oxidant scavengers | |
| CA2614621A1 (en) | Superoxide dismutase and mimetics thereof | |
| US20050250725A1 (en) | Regulation of the P21 gene and uses thereof | |
| AU2004201624A1 (en) | Oxidant Scavengers | |
| JPH0780784B2 (ja) | 微小循環障害に基づく心筋虚血傷害治療薬 | |
| Ishizuka et al. | Theophylline protects against glycerol-induced acute renal failure: Regulation of heme oxygenase-1 and glutathione in rat kidney |