ES2249784T3 - Antioxidantges de oxidantes. - Google Patents
Antioxidantges de oxidantes.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE, EN GENERAL, A UN METODO PARA MODULAR PROCESOS FISIOLOGICOS Y PATOLOGICOS Y, EN PARTICULAR, A UN METODO PARA MODULAR NIVELES INTRA Y EXTRACELULARES DE OXIDANTES, Y POR LO TANTO PROCESOS EN LOS QUE DICHOS OXIDANTES PARTICIPAN. LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO A COMPUESTOS Y COMPOSICIONES ADECUADAS PARA SU USO EN DICHOS METODOS.
Description
Antioxidantes de oxidantes.
La presente invención se refiere, en general, a
la modulación de procesos fisiológicos y patológicos y, en
particular, a la modulación de concentraciones de oxidantes intra y
extracelulares tales como los radicales superóxido y el peróxido de
hidrógeno y en consecuencia procesos en los que participan dichos
radicales. La invención se refiere así mismo a compuestos y
composiciones adecuadas para su utilización en dichos métodos.
Los oxidantes se producen como parte del
metabolismo normal de todas las células pero también son un
componente importante de la patogénesis de muchos procesos
patológicos. Las especies con oxígeno reactivo, por ejemplo, son
elementos críticos de la patogénesis de las enfermedades del pulmón,
del sistema nervioso central y del músculo del esqueleto. Los
radicales libres con oxígeno también desempeñan una función en la
modulación de los efectos del óxido nítrico (NO\cdot). En este
contexto, contribuyen a la patogénesis de trastornos vasculares,
enfermedades inflamatorias y procesos de envejecimiento.
Se necesita un equilibrio crítico de las enzimas
defensivas contra los oxidantes para mantener la función celular y
orgánica normales. Las superóxido dismutasas (SOD) son una familia
de metaloenzimas que catalizan la conversión intra y extracelular
del O_{2}^{-} en H_{2}O_{2} más O_{2}, y representan la
primera línea de defensa contra los efectos superficiales de los
radicales superóxido. Los mamíferos producen tres SOD distintas. Una
es una enzima dimérica que contiene cobre y cinc (CuZn SOD)
descubierta en el citosol de todas las células. Una segunda es una
SOD tetramérica que contiene manganeso (Mn SOD) descubierta en el
interior de las mitocondrias y la tercera es una enzima tetramérica
glucosilada que contiene cobre y zinc (EC-SOD)
descubierta en los fluidos extracelulares y ligada a la matriz
extracelular. Se conocen varias otras enzimas antioxidantes
importantes que existen en el interior de las células, incluyendo la
catalasa y la glutatión peroxidasa. Mientras que los fluidos
extracelulares y la matriz extracelular contienen únicamente
pequeñas cantidades de esta enzimas, se conocen otros oxidantes
extracelulares que existen, incluyendo antioxidantes radicales e
inhibidores de peroxidación de lípidos, tales como el ácido
ascórbico, ácido úrico y \alpha-tocoferol
(Halliwell et al., Arch. Biochem. Biophys. 280:1
(1990)). La carencia relativa de enzimas antioxidantes
extracelulares puede reflejar la posible función de las especies con
oxígeno reactivo extracelulares como moléculas bioefectoras
(Halliwell et al., Arch. Biochem. Biophys. 280:1
(1990)). La insuficiencia relativa de dichas enzimas puede también
producir mayor sensibilidad a las agresiones oxidantes
extracelulares.
En muchos emplazamientos extracelulares la enzima
EC-SOD existe únicamente a bajas concentraciones.
Aunque su función fisiológica in vivo está aún por definir,
en muchos emplazamientos extracelulares, se cree que
EC-SOD no funciona como un antioxidante principal de
O_{2}^{-}. Como se indicó anteriormente, EC-SOD
es una glucoproteína tetramérica que contiene Cu/Zn con un peso
molecular de la subunidad de 30.000 (Marklund, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 79:7634 (1982); Tibell et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:6634 (1987); véase también la patente US nº
5.130.245 y WO 91/04315). Los datos bioquímicos sugieren que
EC-SOD se une a proteoglucanos de sulfato de heparán
en las células endoteliales, donde se ha especulado que sirve como
"capa protectora" (Marklund, J. Clin. Invest. 74:1398
(1984), Karlsson et al., Biochem. J. 25:223
(1988)).Las células endoteliales segregan tanto O_{2}^{-}
(Halliwell, Free Radical Res. Commun. 5:315 (1989)) como
factor relajante derivado del endotelio, supuestamente identificado
como óxido nítrico (NO\cdot) (Noak y Murphy, en Oxidative
Stress Oxidants and Antioxidants, eds. Sies, H. (Academic, San
Diego), págs. 445-489 (1991)). NO\cdot funciona
como vasorregulador y como regulador de neurotransmisión (Schuman y
Madison, Science 254:1503 (1991)). NO\cdot, sin embargo,
puede ser tóxico para las neuronas en algunas situaciones (Dawson
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6368 (1991)).
O_{2}^{-} es conocido porque inactiva la vasorrelajación
producida por NO\cdot (Gryglewski et al., Nature
320:454 (1986); Rubanyi y Vanhoutte, Am. J. Physiol.
250:H822 (1986); Rubanyi y Vanhoutte, Am.J. Physiol.
250:H815 (1986); Bult et al., Br. J. Pharmacol.
95:1308 (1988); Nucci et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85:2334 (1998)). Por esta razón, una función posible de EC
SOD consiste en proteger el NO\cdot liberado en las células
procedente de la inactivación mediada por O_{2}^{-}.
La reacción de O_{2}^{-} con NO\cdot es
también conocida porque produce un producto intermedio
potencialmente tóxico en forma de anión peroxinitrito (ONOO^{-})
(Beckman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1620
(1990); Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:6338 (1991); Hoog et al., Biochem. J. 281:419 (1992);
Matheis et al., Am. J. Physiol. 262:H616 (1992)). Por
lo tanto EC-SOD también puede funcionar para impedir
la formación de ONOO^{-}.
Sorprendentemente, se ha descubierto que
EC-SOD aumenta, en lugar de disminuir, la toxicidad
del O_{2} en el sistema nervioso central y que este efecto de
EC-SOD tiene lugar en toda la modulación de
NO\cdot. Este resultado implica a NO\cdot como importante
mediador en la toxicidad del O_{2}. La invención por lo tanto se
refiere a los métodos de manipulación de la función del óxido
nítrico que implican la utilización de antioxidantes
extracelulares.
Además de los radicales superóxido, el peróxido
de hidrógeno es una especie importante que se produce bajo una gran
variedad de condiciones de agresión oxidante. La invención por lo
tanto también permite la manipulación de concentraciones de peróxido
de hidrógeno.
Los métodos de la invención encuentran aplicación
en varios estados patológicos y no patológicos en los que la
agresión oxidativa desempeña una función, que incluye la
inflamación.
En un sentido más amplio, la invención se refiere
generalmente a los métodos de modulación de procesos intra y
extracelulares en los que participa un oxidante tal como el
O_{2}^{-} o el peróxido de hidrógeno.
La presente invención se refiere, a la modulación
de concentraciones de oxidantes intra y extracelulares tales como
los radicales superóxido, peróxido de hidrógeno y peroxinitrito. Más
particularmente, la invención se refiere a la modulación de procesos
normales o patológicos que implican radicales superóxido, peróxido
de hidrógeno, óxido nítrico o peroxinitrito que utilizan
antioxidantes de peso molecular bajo, por ejemplo, miméticos de SOD,
catalasa o peroxidasa.
En una primera forma de realización, la presente
invención proporciona un antioxidante del oxidante de la fórmula
siguiente:
o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, o un complejo metálico del mismo en la que
dicho metal se selecciona de entre el grupo constituido por
manganeso, cobre o hierro, en la
que:
cada R_{1} es independientemente
en la que Y'' es un grupo alquilo,
y en la
que
indica que se une a R_{2}' en
cualquier posición
y
indica que se une a R_{2}' y al
sustituyente R_{1}' fenilo en cualquier
posición;
cada R_{2}' es independientemente un enlace o
-(CH_{2})_{n}-
en la que n es de 1 a 4,
cada R_{3}' es independientemente -Y'', -Y''',
-H, -OH, -OY'', -NO_{2}, -CN, -NH_{2}, -COOH, -COY'',
-COO^{-} o un grupo heterocíclico, en el que Y'' es tal como se
definió anteriormente e Y''' es una amina primaria, secundaria,
terciaria o cuaternaria,
en la que cuando R_{1}' es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R_{3}' no es COOH, COY'' o COO^{-},
en la que cuando R_{1}' es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R_{3}' no es -NO_{2}, y
en la que
-R_{1}'-R_{2}-R_{3}',
conjuntamente, no son
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, Y''' es una amina secundaria,
terciaria o cuaternaria y cada grupo de sustitución de hidrógeno en
el nitrógeno amínico es un grupo alquilo
C_{1}-C_{4}.
El antioxidante puede presentar la estructura
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
El antioxidante puede presentar la estructura
siguiente:
El antioxidante puede presentar la estructura
siguiente:
El antioxidante puede presentar la estructura
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona un
método de protección de células vegetales de la toxicidad producida
por el oxidante al poner en contacto dichas células con una cantidad
no tóxica de un antioxidante de la fórmula siguiente:
o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, o un complejo metálico del mismo en la que
dicho metal se selecciona de entre el grupo constituido por
manganeso, cobre o hierro, en la
que:
cada R_{1}' es independientemente un enlace
en las que Y'' es un grupo alquilo,
y en la
que
indica que se une a R_{2}' en
cualquier posición
y
indica que se une a R_{2}' y al
sustituyente R_{1}' fenilo en cualquier
posición;
cada R_{2}' es independientemente un enlace o
-(CH_{2})_{n}- en la que n es de 1 a 4,
cada R_{3}' es independientemente -Y'', -Y''',
-H, -OH, -OY'', -NO_{2}, -CN, -NH_{2}, -COOH, -COY'',
-COO^{-} o un grupo heterocíclico, en el que Y'' es tal como se
definió anteriormente e Y''' es una amina primaria, secundaria,
terciaria o cuaternaria,
en la que cuando R_{1}' es
R_{3}' no es COOH, COY'' o COO^{-}, y
en la que cuando R_{1}' es
R_{3}' no es -NO_{2}, y
en la que
-R_{1}'-R_{2}'-R_{3}',
conjuntamente, no son -H,
suficiente para efectuar dicha protección.
La presente invención proporciona asimismo la
utilización de dicho antioxidante para la preparación de un
medicamento destinado a la protección de las células de mamíferos de
la toxicidad provocada por el oxidante al poner en contacto dichas
células con una cantidad no tóxica de antioxidante suficiente para
efectuar dicha protección.
La presente invención proporciona asimismo la
utilización de un antioxidante de la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o una sal farmacéuticamente
aceptable de la misma, o un complejo metálico de la misma en la que
dicho metal se selecciona de entre el grupo constituido por
manganeso, cobre o hierro, en la
que:
cada R_{1}' es independientemente un enlace
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en las que Y'' es un grupo alquilo,
y en la
que
indica que se une a R_{2}' en
cualquier posición
y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
indica que se une a R_{2}' y al
sustituyente R_{1}' fenilo en cualquier
posición;
cada R_{2}' es independientemente un enlace o
-(CH_{2})_{n}- en la que n es 1 a 4,
cada R_{3}' es independientemente -Y'', -Y''',
-H, -OH, -OY'', -NO_{2}, -CN, -NH_{2}, -COOH, -COY'',
-COO^{-} o un grupo heterocíclico, en el que Y'' es tal como se
definió anteriormente e Y''' es una amina primaria, secundaria,
terciaria o cuaternaria,
en la que cuando R_{1}' es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R_{3}' no es COOH, COY'' o
COO^{-},
y
en la que cuando R_{1}' es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R_{3}' no es -NO_{2}, y en la
que -R_{1}'-R_{2}'-R_{3}',
conjuntamente, no son
-H,
para la preparación de un medicamento destinado a
inhibir la actividad de xantina oxidasa de una célula o tejido al
poner en contacto dicha célula o tejido con una cantidad de dicho
antioxidante suficiente para efectuar dicha inhibición.
La presente invención proporciona asimismo la
utilización de un antioxidante de la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o de una sal farmacéuticamente
aceptable de la
misma,
en la que:
R_{1} es un enlace
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X es un halógeno e Y es
un grupo alquilo y en la
que
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
indica que se une a R_{2} en
cualquier posición
y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
indica que se une a R_{2} y al
sustituyente en cualquier posición;
y
R_{2} es un enlace -(CY'_{2})_{n}-,
-(CY'_{2}-CY'=CY')_{n},
-CY'_{2}-CY'_{2}-CH=CH)_{n}-,
-(CY'=CY')_{n}- o -(CY'_{2}-CO)_{n}- en
las que Y' es hidrógeno o un grupo alquilo y en las que n es 1 a 8;
y
R_{3} es -Y'', -OH, -NH_{2}, -N+(Y'')_{3},
-COOH, -COO^{-}, -SO_{3}H, -SO_{3}^{-},
CH_{2}-PO_{3}H_{2} o
-CH_{2}-PO_{3}H^{-}, en las que Y'' es un
grupo alquilo,
opcionalmente acomplejado con un metal
seleccionado de entre el grupo constituido por manganeso, cobre y
hierro, para la preparación de un medicamento destinado a la
modulación de la función de NO\cdot como neurotransmisor en un
mamífero al poner en contacto dicho mamífero con una cantidad de
antioxidante del oxidante suficiente para efectuar dicha
modulación.
La presente invención proporciona asimismo la
utilización de un antioxidante de la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o de una sal farmacéuticamente
aceptable de la misma, o de un complejo metálico de la misma en la
que dicho metal se selecciona de entre el grupo constituido por
manganeso, cobre o hierro, en la
que:
\newpage
cada R_{1}' es independientemente un enlace
en las que Y'' es un grupo alquilo,
y en las
que
indica que se une a R_{2}' en
cualquier posición
y
indica que se une a R_{2}' y al
sustituyente R_{1}' fenilo en cualquier
posición;
cada R_{2}' es independientemente un enlace o
-(CH_{2})_{n}- en la que n es de 1 a 4,
cada R_{3}' es independientemente -Y'', -Y''',
-H, -OH, -OY'', -NO_{2}, -CN, -NH_{2}, -COOH, -COY'',
-COO^{-} o un grupo heterocíclico, en el que Y'' es tal como se
definió anteriormente e Y''' es una amina primaria, secundaria,
terciaria o cuaternaria,
en la que cuando R_{1}' es
R_{3}' no es COOH, COY'' o COO^{-}, y
en la que cuando R_{1}' es
R_{3}' no es -NO_{2}, y en la que
-R_{1}'-R_{2}'-R_{3}',
conjuntamente, no son -H,
para la preparación de un medicamento destinado a
modular la función del NO\cdot como neurotransmisor en un mamífero
al poner en contacto dicho mamífero con una cantidad de dicho
antioxidante del oxidante suficiente para efectuar dicha
modulación.
La presente invención proporciona asimismo un kit
que comprende el antioxidante de la primera forma de realización de
la invención dispuesto en el interior de un recipiente.
En una segunda forma de realización, la presente
invención proporciona asimismo la utilización de un antioxidante del
oxidante de la fórmula siguiente:
o de una sal farmacéuticamente
aceptable de la misma, o de un complejo metálico de la misma en la
que dicho metal se selecciona de entre el grupo constituido por
manganeso, cobre o
hierro,
en la que:
cada R_{1}' es independientemente un enlace
en las que Y'' es un grupo alquilo,
y en las
que
indica que se une a R_{2}' en
cualquier posición
y
indica que se une a R_{2}' y al
sustituyente R_{1}' fenilo en cualquier
posición;
cada R_{2}' es independientemente un enlace o
-(CH_{2})_{n}- en la que n es de 1 a 4,
cada R_{3}' es independientemente -Y''', -COY''
o un grupo heterocíclico, en el que Y'' es tal como se definió
anteriormente e Y''' es una amina primaria, secundaria, terciaria o
cuaternaria,
en la que cuando R_{1}' es
R_{3}' no es COY'' y
en la que
-R_{1}'-R_{2}'-R_{3}',
conjuntamente, no son
\vskip1.000000\baselineskip
Los objetivos y ventajas de la presente invención
se pondrán de manifiesto a partir de la descripción siguiente.
La Figura 1 presenta el vector de expresión de
EC-SOD utilizado para crear ratones transgénicos. Se
generaron ratones transgénicos con el fragmento
ECO-RI-XbaI. IVS1: secuencia 1 que
interviene del activador de \beta-actina
humano.
La Figura 2 presenta el análisis Northern de los
tejidos de ratones transgénicos. Se desnaturalizaron veinte \mug
del ARN total de los tejidos de ratones transgénicos con glioxal y
se realizó la electroforesis a través de gel de agarosa al 1,2% y se
transfirieron a nitrocelulosa. El filtro se sondó con ADNc de
EC-SOD humano completo. La banda de 2,5 Kb
corresponde al ARNm del transgén de EC-SOD humano
que contiene la secuencia de 1 Kb que interviene (véase la Figura
1). La banda de 1,5 Kb corresponde al ARNm totalmente procesada del
transgén de EC-SOD humano.
La Figura 3 presenta el porcentaje de
supervivencia de ratones transgénicos y no transgénicos expuestos a
6 ATA de oxígeno durante 25 minutos. Se inyectó a los ratones
solución salina o se les administró 20 mg/kg de
N-\omega-nitro-L-arginina
(LNNA) por vía intraperitoneal 10 minutos antes de la compresión. Se
inyectó por vía intraperitoneal 400 mg/kg de ditiocarbamato de
dietilo (DDC) en solución salina 55 min antes de la compresión.
*p<0,017 determinado por \chi^{2} con corrección de
Bonferroni, se comparó con los ratones transgénicos tratados con
solución salina.
La Figura 4 presenta el tiempo al comienzo del
primer ataque en ratones transgénicos y no transgénicos expuestos a
6 ATA de oxígeno. Se inyectó a los ratones solución salina o se les
administró 20 mg/kg de
N-\omega-nitro-L-arginina
(LNNA) por vía intraperitoneal 10 minutos antes del comienzo de la
compresión. Se inyectaron por vía intraperitoneal 400 mg/kg de
ditiocarbamato de dietilo (DDC) 55 minutos antes de la compresión.
Los resultados se expresan como media \pm S.D. de tiempo hasta el
primer ataque con tiempo cero tomado una vez en la cámara que
alcanza 6 ATA. *p<0,05 determinada mediante análisis de varianza
con la prueba de la F de Scheffe se comparó con la de los ratones no
transgénicos tratados con solución salina.
La Figura 5 presenta el efecto del ditiocarbamato
de dietilo y del \beta-mercaptoetanol en la
supervivencia en 6 ATA de oxígeno durante 30 minutos. Se inyectaron
por vía intraperitoneal ratones (C57BL/6 \times C3H) F1 con
solución salina, 180 mg/kg de \beta-mercaptoetanol
(2-ME) o con 400 mg/kg de ditiocarbamato de dietilo
(DDC) en solución salina 55 min. antes de la compresión. *p<0,025
determinada mediante \chi^{2} con corrección de Bonferroni se
comparó con los ratones tratados con solución salina.
La Figura 6 presenta la latencia del ataque en
ratones naturales expuestos a 6 ATA de oxígeno después de ser
tratados con solución salina o con 20 mg/kg de
N-\omega-nitro-L-arginina
(LNNA) o con 20 mg/kg de
N-\omega-nitro-L-arginina
más 50 mg/kg de L-arginina (LNNA +
L-Arg). Una prueba de la t de Student para datos
emparejados se comparó con la de los ratones tratados con solución
salina.
La Figura 7 presenta el porcentaje de
supervivencia en ratones naturales expuestos a 6 ATA de oxígeno. Se
administró a los ratones una inyección intraperitoneal de solución
salina normal (0,008 cc/g) o 20 mg/kg de
N-\omega-nitro-L-arginina
(LNNA) (0,008 cc/g) 15 minutos antes de la compresión. Se expusieron
los ratones a 6 ATA de oxígeno durante 20 minutos (n=10, solución
salina solamente), 25 minutos (n=10, ambos grupos), 30 minutos
(n=10, solución salina solamente), 50 minutos (n=6, LNNA solamente),
75 minutos (n=12, LNNA únicamente), 90 minutos (n=14, LNNA
únicamente), 105 minutos (n=6, LNNA únicamente) y 120 minutos (n=6,
LNNA únicamente) y se midió el porcentaje de supervivencia en cada
grupo.
La Figura 8 presenta la curva de dosis y
respuesta de supervivencia para
N-\omega-nitro-L-arginina
(LNNA). Se administró a los ratones naturales una inyección
intraperitoneal de solución salina normal (0,008 cc/g) o 0, 2, 10,
20 ó 30 mg/kg de LNNA (0,008 cc/g) 15 minutos antes de la compresión
y a continuación se expusieron a 75 minutos de oxígeno a 6 ATA. Se
calculó el porcentaje de supervivencia para cada grupo de
tratamiento.
La Figura 9 presenta el porcentaje de
supervivencia en ratones naturales pretratados con solución salina,
20 mg/kg de
N-\omega-nitro-L-arginina
(LNNA) o 20 mg/kg de
N-\omega-nitro-L-arginina
más 50 mg/kg de L-arginina (LNNA +
L-Arg) y a continuación se expusieron a 75 minutos
de oxígeno a 6 ATA. *p<0,05 determinada con una prueba de \chi
al cuadrado con corrección de Bonferroni.
La Figura 10 presenta el porcentaje de
supervivencia en ratones transgénicos y no transgénicos expuestos a
oxígeno a 6 ATA durante 75 minutos. Los ratones se inyectaron con
solución salina o se les administró 20 mg/kg de
N-\omega-nitro-L-arginina
(LNNA) por vía intraperitoneal 10 minutos antes de la compresión.
*p<0,05 determinada por \chi^{2} en comparación con los
ratones tratados con solución salina no transgénicos. \dagger
p<0,05 determinada mediante \chi^{2} en comparación con
los ratones transgénicos tratados con solución salina.
La Figura 11 presenta la comparación de la
formación de edema en ratones transgénicos con
EC-SOD para formación de edema en camadas no
transgénicas después de la lesión provocada por frío en el
hemisferio cerebral derecho así como en ratones no lesionados. Los
valores se presentan como media \pm error estándar. *p<0,05
comparado con el índice de edema de las referencias no transgénicas
respectivas utilizando una prueba de la t de Student para datos
emparejados.
La Figura 12 presenta el efecto de las
concentraciones aumentadas de EC-SOD sobre los
cambios de permeabilidad vascular después de la lesión en el cerebro
provocada por frío. La permeabilidad vascular se demuestra como la
pérdida de azul de Evan en los hemisferios cerebrales derechos
lesionados de ratones no transgénicos (referencia) y transgénicos
con EC-SOD.
La Figura 13 presenta un análisis por
transferencia Western de rh-EC-SOD y
un homogeneizado de pulmón humano para demostrar la especificidad
del anticuerpo. Se separaron proteínas en 0,75 mm de
SDS-gel de poliacrilamida al 10% y se transfirieron
a nitrocelulosa. Se hibridaron las proteínas con el anticuerpo a
EC-SOD recombinante humano (4,3 \mug/ml) y se
detectó el anticuerpo por hibridación con
^{125}I-proteína-A seguida de
autorradiografía. La banda EC-SOD contenía 0,05
\mug de proteína pura de la banda EC-SOD de tipo
recombinante humano. La banda del pulmón contenía 10 \mug de un
sobrenadante a 20.000 \times g de un homogeneizado de pulmón
humano.
Las Figuras 14A a 14C presentan la localización
inmunohistoquímica al microscopio óptico de EC-SOD
en el pulmón humano. Se marcaron tejidos utilizando el anticuerpo
contra EC-SOD recombinante humano (5,4 mg/ml;
anti-EC-SOD) o el mismo anticuerpo
en el que se observó IgG anti-EC-SOD
utilizando EC-SOD recombinante purificado acoplado a
CNBr-sefarosa (EC-SOD absorbida). Se
detectó el anticuerpo utilizando una técnica de marcado con
biotina/estreptavidina-peroxidasa de rábano picante.
A, arteria pulmonar elástica grande marcada con
anti-EC-SOD. Obsérvese el marcado
alrededor de las células del músculo liso debajo del endotelio y
debajo de la capa elástica del vaso (flecha corta) y la ausencia de
marcado para EC-SOD en la superficie de las células
endoteliales (flecha abierta) y en elastina (flecha larga). B,
arteria pulmonar muscular marcada con
anti-EC-SOD. Obsérvese gran cantidad
de marcado en la matriz de tejido conectivo que rodea el vaso y los
ganglios linfáticos (flecha larga), en la matriz que rodea las
células del músculo liso (flecha corta) y la ausencia de marcado en
la superficie de las células endoteliales (flecha abierta). C,
arteria pulmonar muscular marcada con antisuero absorbido en
EC-SOD. La absorción de IgG de
anti-EC-SOD suprimió todo el marcado
en el vaso muscular. (Barras = 50 \mum).
Las Figuras 15A a 15C presentan la localización
inmunohistoquímica de EC-SOD en el pulmón humano. Se
marcaron tejidos utilizando el anticuerpo contra
EC-SOD recombinante humana (5,4 mg/ml;
anti-EC-SOD). Se detectó el
anticuerpo utilizando una técnica de marcado con
biotina/estreptavidina-peroxidasa de rábano picante.
A, vía respiratoria cartilaginosa grande marcada con
anti-EC-SOD. Obsérvese el intenso
marcado para EC-SOD en la matriz alrededor de las
células de músculo liso (flecha corta), entre las células
epiteliales (flecha larga) y la ausencia de marcado en la superficie
de las células epiteliales (flechas abiertas) y en la matriz de
cartílago (asterisco). B, vía respiratoria no cartilaginosa marcada
con anti-EC-SOD. Obsérvese el
intenso marcado para EC-SOD en toda la matriz
completa bajo el epitelio (flecha corta) y la ausencia de marcado en
la superficie del epitelio (flecha abierta). C, parénquima pulmonar
marcado con anti-EC-SOD. El marcado
con EC-SOD es principalmente en las puntas del
tabique alveolar (flecha corta) y en la matriz alrededor de los
vasos pequeños (flecha larga). No se observó ningún marcado para
EC-SOD en la superficie de las células epiteliales
alveolares (flecha abierta). (Barras = 50 \mum).
Las Figuras 16A a 16C presentan la
inmunolocalización de EC-SOD en el tejido conectivo
vascular al microscopio electrónico. Los tejidos se marcaron
utilizando el anticuerpo contra EC-SOD recombinante
humana (40 \mug/ml; anti-EC-SOD) o
el mismo anticuerpo después de absorber IgG de
anti-EC-SOD utilizando
EC-SOD recombinante purificada acoplada a
CNBr-sefarosa (EC-SOD absorbida). Se
detectó el anticuerpo utilizando 10 nm de proteína-A
oro. A, colágeno vascular marcado con
anti-EC-SOD, B, elastina vascular
marcada con anti-EC-SOD. C, colágeno
vascular marcado con antisueros absorbidos en
EC-SOD. Obsérvese el intenso marcado de
EC-SOD junto con el colágeno tipo I y la ausencia de
marcado asociado a la elastina (E). Además, la absorción del
anticuerpo anti-EC-SOD suprimió todo
el marcado para EC-SOD asociada al colágeno de tipo
I. (Barras = 200 nm).
La Figura 17 presenta la inmunolocalización al
microscopio electrónico de EC-SOD en torno al
músculo liso vascular. Se marcaron tejidos utilizando el anticuerpo
contra EC-SOD recombinante humana (40 \mug/ml). Se
detectó el anticuerpo utilizando 10 nm de proteína-A
oro. Existe un alto grado de marcado en la matriz de tejido
conectivo alrededor de la células de músculo liso vascular (S)
asociada a colágeno de tipo I (flecha corta) y otros elementos de la
matriz no identificados (flecha larga). (Barras = 200 nm).
Las Figuras 18A y 18B presentan la
inmunolocalización al microscopio electrónico de
EC-SOD sobre la superficie de las células
endoteliales pulmonares. Se marcaron tejidos utilizando el
anticuerpo contra EC-SOD recombinante humana (40
\mug/ml). Se detectó el anticuerpo utilizando 10 nm de oro con
proteína-A. A, célula endotelial de una arteria
pulmonar muscular pequeña, B, célula endotelial de un capilar
pulmonar. No había ningún marcado para EC-SOD en la
superficie de las células endoteliales (flechas cortas). Se observa
EC-SOD en el plasma (P) y está asociada a las
proteínas de la matriz extracelular debajo del endotelio (flechas
largas). (Barras = 200 nm).
La Figura 19 presenta la inmunolocalización de
EC-SOD al microscopio electrónico en torno a las
células del epitelio bronquial. Se marcaron tejidos utilizando el
anticuerpo contra EC-SOD recombinante humana (40
\mug/ml). Se detectó el anticuerpo utilizando 10 nm de
proteína-A oro. Se observó EC-SOD en
la intersección entre las células epiteliales (flecha) y se observó
también en alguna medida en el interior de las células. (Barras =
200 nm).
Las Figuras 20A a 20D (sólo como referencia)
presentan una cartografía de restricción parcial, estrategia de
secuenciado, estructura genómica y estructura proteica del clon nº 7
de EC-SOD humano. Fig. 20A, se presenta una
cartografía de restricción parcial del clon genómico de
EC-SOD humano nº 7 en la orientación 5' a 3'. Se
indica un marcador de 1 kb de tamaño. B, BamH I; H; Hind III; P, Pst
I; S, Sal I; K, Kpn I; E, EcoR I. En la Fig. 20B, se presenta la
estrategia de subclonación y secuenciado. Se subclonaron varios
fragmentos de restricción por solapamiento de tamaño en el vector
del plásmido pGEM3Zf (+) para el análisis de la secuencia de ADN
posterior. Se secuenció todo el ADN en ambas cadenas utilizando
Sequenase (USB) y plantilla de ADN de doble cadena, excepto para
\sim2 kb del fragmento 3' 7K36 en el que únicamente se secuenció
una orientación. En la Fig. 20C, se presenta la estructura del
exón/intrón del gen de EC-SOD humano. Se muestra la
posición de la zona de codificación para preEC-SOD
en el exón 3 mediante líneas de puntos. En la Fig. 20D, se
esquematizan los cuatro dominios estructurales de la proteína
EC-SOD. El péptido con señal está indicado por una
flecha. Éste es seguido por el dominio del péptido amino terminal
(CHO) glucosilado maduro. Una tercera zona presenta homología de la
secuencia de aminoácidos muy elevada a CuZn-SOD
humana. El dominio con terminal carboxi tiene residuos básicos
múltiples cargados (+) que son críticos para la unión heparina
glucosaminoglucano.
Las Figuras 21A a 21B (sólo como referencia)
presentan transferencias Northern de EC-SOD humana
de múltiples tejidos. Fig. 21A, se realizó la transferencia de dos
\mug de poli A (+) ARNm de ocho tejidos humanos diferentes en un
gel de agarosa desnaturalizado, se transfirió a una membrana de
nilón cargada y se sondó con ARNc de EC-SOD humana
de cadena complementaria marcado con [^{32}P]. A la derecha se
presentan marcadores con tamaño molecular de ARN (kilobases). Se
controló la transferencia cuantitativa mediante tinción con bromuro
de etidio. Los resultados demuestran un único ARNm de 1,4 kb
presente en los ocho tejidos examinados. El músculo del esqueleto
demuestra de manera interesante, un ARNm mayor de \sim4,2 kb,
mientras que el cerebro presenta una banda tenue de aproximadamente
2,2 kb. En la Fig. 21B, se cuantificaron las bandas que corresponden
al ARNm de EC-SOD por barrido densitométrico con
láser, normalizado a la banda del cerebro de 1,4 kb y se expresaron
como relativas.
Las Figuras 22A a 22B (sólo como referencia)
presentan el análisis del punto de iniciación de la transcripción.
Se utilizó la técnica de ampliación rápida en 5' de los extremos del
ADNc (5' RACE) para identificar el punto de iniciación de la
transcripción para el gen de EC-SOD humano. En la
Fig. 22A, un diagrama esquemático ilustra los puntos de hibridación
para varios oligonucleótidos. La línea gruesa representa el ADNc
transcrito a la inversa de la primera cadena de poli A(+) ARNm del
corazón humano que ha sido cebado con EC7 (cebador específico del
gen de EC-SOD) y poli C de cola utilizando
desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT). HEC1, HEC2, EC4 y EC7
son cebadores específicos del gen de EC-SOD humano
5'. El cebador de anclaje se suministra con el kit RACE de 5' (GIBCO
BRL) y se híbrida con la cola del poli C. En la Fig. 22B, se utilizó
PCR para ampliar los segmentos de ADN utilizando [anclaje + EC4] o
[HEC1 + EC7] como cebadores y poli C de cola (+TdT, bandas 1 y 4) o
no poli C de cola (-TdT, bandas 2 y 5) ADNc como plantilla. La
banda 3 incluye ADN amplificado por PCR utilizando [HEC1 + F7] como
cebadores y un ADNc de EC-SOD humana completo como
plantilla. Se realizó la electroforesis de los ADN amplificados
resultantes en un gel de agarosa al 2%, se transfirieron a membranas
de nilón cargadas y se sondaron con HEC2 marcado con [^{32}P],
cebador de EC-SOD específico del gel anidado en 5'.
Se introdujeron marcadores de peso molecular de ADN entre las bandas
2 y 3. El tamaño esperado de la zona ampliada por PCR en las bandas
3, 4 y 5 es de 217 bp. Se observa únicamente una sola en la banda 1,
con un tamaño molecular de aproximadamente 185 a 200 bp.
La Figura 23 presenta el análisis genómico por
transferencia Southern del gen de EC-SOD humano. Se
digirieron completamente diez microgramos de ADN genómico humano con
cada una de las enzimas de restricción mostradas, se realizó la
electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se transfirió a
membranas de nilón cargadas. Se sondaron las transferencias con un
ARNc de longitud parcial de EC-SOD marcada con
[^{32}P] que corresponde a aproximadamente los primeros 1050
nucleótidos y se autorradiografió. Se presenta la endonucleasa de
restricción específica en la parte superior de cada banda. A la
derecha se presentan los marcadores de tamaño molecular de ADN (en
kilobases).
La Figura 24 (sólo como referencia) presenta la
secuencia de nucleótidos y la secuencia deducida de aminoácidos del
gen de EC-SOD humano. Se presenta la secuencia
completa de nucleótidos del gen humano. Se indica la secuencia
deducida de aminoácidos del péptido señal y de la proteína madura
utilizando el código de aminoácidos de una sola letra.
La Figura 25 presenta un gráfico de
Lineweaver-Burk que demuestra la inhibición no
competitiva de la xantina oxidasa por MnTBAP.
La Figura 26 presenta la protección de las
células endoteliales de la arteria pulmonar contra la lesión
producida por xantina oxidasa por MnTBAP. Referencia = MnTBAP
1000 .
La Figura 27 presenta la protección de las
células epiteliales del pulmón contra la lesión provocada por
paraquat de miméticos de SOD.
La Figura 28 presenta la protección de las
células endoteliales de la arteria pulmonar contra la lesión
provocada por paraquat por MnTBAP.
La Figura 29 presenta la falta de protección de
las células endoteliales de la arteria pulmonar contra la lesión
provocada por paraquat por ZnTBAP.
La Figura 30 presenta la protección de MnTBAP
contra la lesión pulmonar provocada por paraquat.
La Figura 31 presenta un gráfico de la constante
de frecuencia de segundo orden para los miméticos de catalasa.
La Figura 32 presenta el efecto de MnTBAP sobre
la lesión endotelial provocada por H_{2}O_{2}.
Las Figuras 33A y 33B presentan la reducción por
MnTBAP y MnTmPyP de las lesiones de la célula endotelial producidas
por exposición a peróxido de hidrógeno producido por glucosa
oxidasa. La Figura 33C demuestra que ZnTBAP no reduce la lesión de
las células endoteliales provocada por el peróxido de hidrógeno. La
Figura 33D demuestra que las células endoteliales no están
protegidas de la lesión provocada por peróxido de hidrógeno por
CuZnSOD.
Las Figuras 34A y 34B presentan la inactivación
de aconitasa provocada por NMDA y KA a lo largo del tiempo. Fig.
34A. Células corticales tratadas con vehículo o con NMDA 50 \muM
durante 0, 5, 15, 30, 60 y 240 min. y actividad de aconitasa medida
en los lisados celulares. Cada punto representa la media \pm
S.E.M. (n=6-8). Fig. 34B. Células corticales
tratadas con vehículo o con kainato 300 \muM durante 0, 60, 240 y
360 min. y actividad de aconitasa medida en los lisados celulares.
Cada punto representa la media \pm S.E.M.
(n=4-8).
Las Figuras 35A a 35C representan la correlación
de toxicidad con inactivación de aconitasa. Se determinaron la
dependencia de la concentración de KA (Fig. 35A),
PQ^{++}(Fig. 35B) y NMDA (Fig. 35C) para provocar toxicidad
(ejes de la izquierda) y la activación de la aconitasa (ejes de la
derecha). Se normalizaron los valores como porcentaje de liberación
de LDH o inhibición de aconitasa y se representaron para evaluar la
correlación entre la liberación de LDH y la inactivación de
aconitasa. Los cuadros negros representan LDH y los cuadros blancos
representan aconitasa. Se generaron curvas por ordenador utilizando
un análisis de regresión lineal que utiliza la ecuación: Y= fondo +
(parte superior - fondo)/1+10^{LogEC50-X}
(GraphPad Prism). Cada punto representa el valor medio
(n=4-6).
Las Figuras 36A y 36B presentan el bloqueo de la
inactividad de la aconitasa y la neurotoxicidad por MnTBAP. Fig.
36A. Se trataron células corticales con PQ^{++} 150 \muM durante
3 h. (barras negras), NMDA 50 \muM durante 1 h. (barras blancas) o
KA 300 \muM durante 6 h. (barras sombreadas) en presencia o
ausencia de MnTBAP 200 \muM (presente 15 min. antes y durante la
duración del tratamiento) y se midió la actividad de aconitasa en
los lisados celulares. Las barras representan la media \pm S.E.M.
(n=8-12). El asterisco indica una diferencia de los
demás tratamientos (p<0,05, ANOVA de una vía). Fig. 36B. Se
trataron células corticales con PQ^{++} 150 \muM (barras
negras), NMDA 50 \muM (barras blancas) o KA 300 \muM (barras
sombreadas) en presencia de cantidades variables de MnTBAP (presente
15 min. antes y durante la duración del tratamiento durante 18 h. y
se midió la liberación de LDH en el medio. El asterisco representa
una diferencia en las referencias (agonista en ausencia de MnTBAP;
p<0,05 prueba de Dunnet). Las barras representan la media \pm
S.E.M. (n=3-6).
La Figura 37 presenta la inhibición de la
toxicidad de NMDA por MnTBAP. Se trataron células corticales con
concentraciones variables de NMDA en presencia y ausencia de 200
\muM de MnTBAP durante 18 h y se midió la LDH en el medio. Cada
uno de los puntos representa la media \pm S.E.M.,
n=3-4.
Las Figuras 38A a 38C presentan el efecto
diferencial de MnTBAP y ZnTBAP en la muerte de las células. Se
trataron células corticales con PQ^{++} 150 \muM (Fig. 38A),
NMDA 50 \muM (Fig. 38B) o KA 300 \muM (Fig. 38C) en presencia o
ausencia de concentraciones variables de MnTBAP (cuadrados blancos)
o ZnTBAP (cuadrados negros) y las células muertas se tiñeron con
EthD-1. Se almacenaron las imágenes de las células
positivas a EthD-1 y se hizo el recuento en los
campos seleccionados al azar utilizando un analizador de imagen
digital. Los datos se expresan como el número de células muertas por
campo. Cada punto representa las mediciones realizadas en 1.200 a
1.500 células.
La Figura 39 presenta el efecto sobre el
aprendizaje de la eliminación del gen de EC SOD en un modelo de
ratón.
Figura 40. Efecto de Mn (III)tetrakis
(ácido 4-benzoico) porfirina (MnTBAP) (3 a 100
\muM) sobre la oxidación de dihidrorrodamina 123 a rodamina 123 en
respuesta al peroxinitrito (5 \muM). Los datos se expresan como
media \pm s.e.m. de las determinaciones por triplicado.
Figura 41. Supresión por el peroxinitrito (Fig.
41A) y por los compuestos del donante de NO
S-nitroso-N-acetil-DL-penicilamina
(SNAP, 3 mM) (Fig. 41B) y dietilamina: NONOato de NO (DNO) (Fig.
41C) sobre la respiración mitocondrial (expresada como porcentaje de
la respiración de las células no estimuladas) en macrófagos J774 y
el efecto protector de Mn (III) tetrakis (ácido
4-benzoico) porfirina (MnTBAP)
(10-300 \muM) frente a esta supresión. Los datos
se expresan como medias \pm s.e.m. de n=12 pocillos. **p<0,01
representa el efecto significativo de SNAP en comparación con los
valores de referencia (C); ^{\alm{1}, \alm{2}} representan efectos
protectores significativos de MnTBAP (p<0,05 y p<0,01,
respectivamente).
Las Figuras 42A a D representan los esquemas de
la reacción de síntesis
La presente invención se refiere al suministro de
protección contra los efectos perjudiciales de oxidantes,
particularmente, radicales superóxido, peróxido de hidrógeno y
peroxinitrito y a la prevención y tratamiento de los estados
patológicos que implican o proceden de la agresión oxidante. La
invención también se refiere a la modulación de procesos biológicos
que comportan oxidantes, incluyendo radicales superóxido, peróxido
de hidrógeno, óxido nítrico y peroxinitrito. La invención se refiere
además a compuestos y composiciones, que comprenden antioxidantes de
bajo peso molecular, por ejemplo miméticos de antioxidantes de
especies con oxígeno reactivo, incluyendo los miméticos de SOD,
catalasas y peroxidasas, y formulaciones de los mismos, adecuadas
para las utilizaciones anteriores.
Los miméticos de antioxidantes de especies con
oxígeno reactivo apropiadas para las utilizaciones mencionadas
anteriormente comprenden derivados mangánicos de porfinas
sustituidas con metina o las sales farmacéuticamente aceptables de
las mismas. Los sustituyentes con metina pueden seleccionarse a fin
de facilitar el intercambio electrónico entre el metal mimético (p.
ej., Mn) y el radical oxígeno. Los sustituyentes que ceden
electrones del anillo ayudan a deslocalizar la carga del metal y de
este modo aumenta la actividad catalítica. Por consiguiente, se
pueden seleccionar sustituyentes a fin de modular el potencial redox
de la porfina. Se pueden seleccionar asimismo sustituyentes a fin de
hacer resistente a la porfirina a la degradación por la
hemooxigenasa. La hemooxigenasa, enzima clave en la degradación
normal de la porfirina y una enzima que desempeña una función en la
regulación de la inflamación, ataca en los carbonos del puente de la
metina. Al diseñar compuestos no sensibles al ataque (p. ej.,
introduciendo sustituyentes en los carbonos del puente de la
metina), puede aumentarse la vida media de la porfirina. Dichos
compuestos presentan la ventaja adicional de que no interfieren con
el metabolismo normal de la porfirina. La selección de los
sustituyentes puede realizarse también basándose en el resultado
buscado que se debe alcanzar. Por ejemplo, cuando el paso a través
de las membranas celulares es ventajoso en un régimen de tratamiento
dado, pueden seleccionarse sustituyentes no polares a fin de hacer
soluble el líquido mimético. Los sustituyentes pueden también
seleccionarse a fin de permitir al mimético ser capaz de unirse a la
superficie celular o a los elementos de la matriz extracelular.
Dichos sustituyentes pueden seleccionarse a fin de dirigir el
mimético basándose en la carga, forma, estructura, etc. Los
sustituyentes de direccionamiento pueden ser específicos, por
ejemplo, para determinados receptores de la superficie celular (p.
ej., receptores de manosa hallados en las células epiteliales) o
para determinados azúcares o lectinas presentes en la superficie
celular.
En una forma de realización, los miméticos
utilizados según la invención son los de la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
R_{1} es un enlace
en la que X es un halógeno e Y es
un grupo alquilo y en la
que
indica que se une a R_{2} en
cualquier posición
y
indica que se une a R_{2} y al
sustituyente en cualquier posición;
y
R_{2} es un enlace -(CY'_{2})_{n}-,
-(CY'_{2}-CY'=CY')_{n}^{-},
-CY'_{2}-CY'_{2}-CH=CH)_{n}-,
-(CY'=CY')_{n}- o -(CY'_{2}-CO)_{n}-,
en las que Y' es hidrógeno o un grupo alquilo y en las que n es de 1
a 8;
R_{3} es -Y'', -OH, -NH-, -N+(Y'')_{3},
-COOH, -COO^{-}, -SO_{3}H, -SO_{3}^{-},
CH_{2}-PO_{3}H_{2} o
-CH_{2}-PO_{3}H^{-}, en las que Y'' es un
grupo alquilo.
En una forma de realización más específica,
R_{1} es un enlace
en la que X es Cl o Br e Y es un
grupo alquilo
C_{1-4};
R_{2} es un enlace -(CY'_{2})_{n}-,
-(CY'_{2}-CY'=CY')_{n},
-CY'_{2}-CY'_{2}-CH=CH)_{n}-,
-(CY'=CY')_{n}- o -(CY'_{2}-CO)_{n}-,
en las que Y' es hidrógeno o un grupo alquilo y en las que n es 1 a
4;
R_{3} es -Y'', -OH, -NH_{2}, -N^{+}
(Y'')_{3}, -COOH, -COO^{-}, -SO_{3}H, -SO_{3}^{-},
CH_{2}-PO_{3}H- o
-CH_{2}-PO_{3}H^{-}, en las que Y'' es un
grupo alquilo C_{1-4}.
En una forma de realización más específica,
R_{1} es un enlace
en la que X es Cl o Br e Y es
metilo o etilo,
y
R_{2} es un enlace -(CY'_{2})_{n}-,
-(CY'_{2}-CY'=CY')_{n}-,
-CY'_{2}-CY'_{2}-CH=CH)_{n}-,
-(CY'=CY')_{n}- o -(CY'_{2}-CO)_{n}- en
las que Y' es hidrógeno, metilo o etilo y en las que n es 1 ó 2;
y
R_{3} es metilo, etilo, -OH, -NH_{2},
-N^{+} (CH_{3})_{3},
-N^{+}(CH_{2}CH_{3})_{3}, -COOH, -COO^{-},
-SO_{3}H, -SO_{3}^{-}, CH_{2}-PO_{3}H- o
-CH_{2}-PO_{3}H^{-}.
En otra forma de realización específica,
R_{1} es un enlace
en la que Y es alquilo,
preferentemente, alquilo C_{1-4}, más
preferentemente metilo o
etilo,
R_{2} es un enlace -(CY'_{2})_{n}-,
-(CY'=CY')_{n}-, o -(CY'_{2}-CO)_{n}-
en las que Y' es hidrógeno o alquilo (preferentemente alquilo
C_{1-4}, más preferentemente metilo o etilo) y en
las que n es 1 a 4 (preferentemente 1 ó 2); y
R_{3} es alquilo C_{1-4}
(preferentemente metilo o etilo), -OH, -NH_{2},
-N^{+}(CH_{3})_{3},
-N^{+}(CH_{2}CH_{3})_{3}, -COOH, -COO^{-},
-SO_{3}H, -SO_{3}^{-}, -CH_{2}-PO_{3}H- o
-CH_{2}-PO_{3}H^{-}.
Todavía en otra forma de realización
específica,
R_{1}' es un enlace
R_{2} es un enlace -(CY'_{2})_{n}- o
-(CY'=CY')_{n}- en las que Y' es hidrógeno o alquilo
(preferentemente alquilo C_{1-4}, más
preferentemente metilo o etilo) y en las que n es de 1 a 4
(preferentemente 1 ó 2);
R_{3} es alquilo C_{1-4}
(preferentemente metilo o etilo), -OH, -NH_{2},
-N^{+}(CH_{3})_{3},
-N^{+}(CH_{2}CH_{3})_{3}, -COOH, -COO^{-},
-SO_{3}H, -SO_{3}^{-}, -CH_{2}-PO_{3}H- o
-CH_{2}-PO_{3}H^{-}.
Cada P es hidrógeno. Los miméticos específicos
adecuados para su utilización en los presentes métodos comprenden Mn
(III) tetrakis
(1-metil-4-piridil)porfirina
(MnTMPyP), Mn(III) tetrakis
(4-trimetil-aminofenil)porfirina
(MnTMAP) y Mn(III) tetrakis (ácido
4-benzoico)porfirina (MnTBAP).
Aunque los miméticos anteriores se describen como
quelatos de manganeso, también pueden utilizarse otros metales
aparte del manganeso, tales como hierro (III) y cobre (II). La
presente invención se refiere también al ligando macrocíclico que
contiene nitrógeno exento de metales. Se valorará que el metal
seleccionado pueda presentar varios estados de valencia, por
ejemplo, pueden utilizarse manganeso II, III o V. El cambio de la
carga dependerá de la aceptación o liberación de electrones.
Además de los miméticos anteriores, la invención
comprende también la utilización de los compuestos de la fórmula
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o de una sal farmacéuticamente
aceptable de la misma, o de un complejo metálico de la misma en la
que dicho metal se selecciona de entre el grupo constituido por
manganeso, cobre o
hierro,
en la que:
cada R_{1}' es independientemente un enlace
en las que Y'' es un grupo alquilo
(p. ej., C_{1}-C_{4}) y en las
que
indica que se une a R_{2}' en
cualquier posición
y
indica que se une a R_{2}' y al
sustituyente R_{1}' fenilo en cualquier
posición;
cada R_{2}' es independientemente un enlace o
-(CH_{2})_{n}- en la que n es 1 a 4,
cada R_{3}' es independientemente -Y'', -Y''',
-H, -OH, -OY'', -NO_{2}, -CN, -NH_{2}, -COOH, -COY'',
-COO^{-} o un grupo heterocíclico, en las que Y'' es tal como se
definió anteriormente e Y''' es una amina primaria, secundaria,
terciaria o cuaternaria (preferentemente una alquilamina en la que
los grupos alquilo son, por ejemplo, alquilos
C_{1}-C_{5})
en la que cuando R_{1}' es,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R_{3}' no es COOH, COY'' o COO^{-},
en la que cuando R_{1}' es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R_{3}' no es -NO_{2}, y en la que
-R_{1}'-R_{2}'-R_{3}',
conjuntamente, no son -H.
En determinadas formas de realización de la
invención,
-R_{1}'-R_{2}'-R_{3}',
conjuntamente, no son
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
por ejemplo, cuando Y'' es un
metilo.
Tal como se indicó anteriormente R_{3}' puede
representar un grupo heterocíclico. Los heterocíclicos posibles
comprenden tetrazoles, furanos, tiofenos, indoles, imidazoles,
piridinas, oxadiazoles y quinolinas sustituidos o no sustituidos.
Los posibles sustituyentes en dichos grupos comprenden halógeno (p.
ej., Br o Cl), -NO_{2}, alquilo C_{1-4} y
grupos de alcohol alquílico C_{1-4}.
P es hidrógeno.
Cuando son posibles los isómeros rotacionales,
todos los isómeros de los miméticos descritos en la presente memoria
(antioxidantes de oxidantes) pueden utilizarse según la
invención.
A continuación se indican ejemplos específicos de
miméticos adecuados de utilización o para utilización en la
invención:
R' =
NH_{2}-ArgGluHisSerGluArgLysLysArgArgArgGluSerGluCysLysAlaAla-COOH
porfirinas de 5,10,15,20-tetra kis [grupo R]
manganeso (III)
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden seleccionarse miméticos adecuados para su
utilización en la presente invención analizando la actividad y
estabilidad de SOD, catalasa y/o peroxidasa. La inactivación
selectiva, reversible y sensible a SOD de la aconitasa mediante
generadores de O^{-}_{2} conocidos puede utilizarse como
marcador de generación de O^{-}_{2}. De este modo, pueden
seleccionarse miméticos adecuados analizando la capacidad para
proteger la actividad de la aconitasa.
La actividad de SOD puede controlarse en
presencia y ausencia de EDTA utilizando el método de McCord y
Fridovich (J. Biol. Chem. 244:6049 (1969)). La eficacia de un
mimético puede determinarse midiendo el efecto del mimético sobre el
crecimiento de una cepa de E. coli sin SOD frente a una cepa
natural. Específicamente, E. coli natural (AB1157) y E.
coli sin SOD (JI132) pueden cultivarse en un medio M9 que
contiene casminoácidos al 0,2% y glucosa al 0,2% a pH 7,0 y 37ºC; el
cultivo puede controlarse en función de la turbidez seguida a 700 nm
por espectrofotometría. Puede analizarse la toxicidad en los
miméticos activos en un cultivo de células de mamífero midiendo la
liberación de lactato deshidrogenasa (LDH). Específicamente, las
células L2 de rata (células pulmonares semejantes al tipo II;
(Kaighn y Douglas, J. Cell Biol. 59:160a (1973)) pueden
cultivarse en el medio F-12 de Ham enriquecido con
suero de ternero fetal al 10% a pH 7,4 y 37ºC. Las células pueden
sembrarse a densidades iguales en placas de cultivo de 24 pocillos y
cultivarse a aproximadamente 90% de confluencia; pueden añadirse
miméticos de SOD a las células a dosis log (p. ej. dosis
micromolares en medio esencial mínimo (MEM)) e incubarse durante 24
horas. La toxicidad puede evaluarse por morfología y midiendo la
liberación del marcador de lesión citosólica, LDH (p. ej., en un
lector de placas termocinético), según describe Vassault (en:
Methods of Enzymatic Analysis, Bergmeyer (ed) págs.
118-26 (1983); la oxidación de NADH se mide a 340
nm). La eficacia de los miméticos activos puede evaluarse
determinando su capacidad para proteger las células del mamífero
frente a la toxicidad provocada por metilviologen (paraquat).
Particularmente, las células L2 de rata cultivadas según se
describió anteriormente y sembradas en placas de 24 pocillos pueden
preincubarse con varias concentraciones del mimético de SOD y a
continuación incubarse con una concentración de metilviologen que
demostró anteriormente que produce un LC_{75} en las células L2 de
referencia. La eficacia del mimético puede correlacionarse con una
disminición en la liberación de LDH provocada por metilviologen (St.
Clair et al., FEBS Lett. 293:199 (1991)). La eficacia
de los miméticos de SOD puede evaluarse in vivo con modelos
de ratón y/o rata utilizando tanto administración de aerosol como
inyección parenteral. Por ejemplo, pueden escogerse al azar ratones
macho de Balb/c en 4 grupos de 8 ratones cada uno para formar un
modelo patrón de contingencia estadística 2\times2. Los animales
pueden tratarse con paraquat (40 mg/kg, ip) o con solución salina y
tratarse con mimético de SOD o con vehículo de referencia. La lesión
pulmonar puede evaluarse 48 horas después del tratamiento con
paraquat mediante análisis de los parámetros (LDH, proteínas y % de
PMN) de la lesión con fluido de lavado broncoalveolar (BALF) como se
describió anteriormente (Hampson et al., Tox. Appl. Pharm.
98:206 (1989); Day et al., J. Pharm. Methods 24:1
(1990)). Los pulmones de 2 ratones de cada grupo pueden fijarse por
instilación con paraformaldehído al 4% y procesarse para
histopatología en el nivel microscópico óptico.
La actividad de la catalasa puede controlarse
midiendo la absorbancia a 240 nm en presencia de peróxido de
hidrógeno (véase Beers y Sizer, J. Biol. Chem. 195:133
(1952)) o midiendo la evolución del oxígeno con un electrodo de
oxígeno de Clark (Del Rio et al., Anal. Biochem.
80:409 (1997)). La actividad de la peroxidasa se puede medir
espectrofotométricamente como fue descrito anteriormente por Putter
y Becker: Peroxidases. En: Methods of Enzymatic Analysis,
H.U. Bergmeyer (ed.), Verlag Chemie, Weinheim, págs.
286-292 (1983). La actividad de la aconitasa se
puede medir como se describe en el Ejemplo XI a continuación.
La Tabla IX proporciona a continuación un resumen
de actividades de varios antioxidantes de oxidantes de la invención.
La nota al pie de esta Tabla proporciona detalles de los análisis
utilizados.
La síntesis de miméticos adecuados para su
utilización en la presente invención se puede efectuar utilizando
protocolos reconocidos en la técnica. El Ejemplo XIV incluye una
descripción detallada de la síntesis de cuatro miméticos
específicos. En el caso de los miméticos de
Mn(III)-porfirina, los anillos de porfirina
con varios grupos laterales de carbón con puente de metina se pueden
adquirir en el mercado y el ión metálico Mn(III) se puede
insertar en el anillo de porfirina mediante métodos que comprenden
los siguientes: (1) mezcla de acetato de Mn(II) con porfirina
en presencia de oxígeno, en cuyas condiciones la estabilización
selectiva de Mn (III) por la porfirina produce la autooxidación del
Mn(II);
(2) preparación de Mn(III)
(OH)_{3} por modificación del método de Winkler (Sastry
et al., Anal. Chem. 41:857 (1969)) seguido de reacción
con la porfirina; (3) agitación de MnO_{2} con la porfirina en
presencia de NH_{2}OH, que sirve para reducir el Mn(IV) a
Mn(III), que es atrapado a continuación por la porfirina; o
(4) un método modificado de Pasternack et al.
(Biochemistry 22:2406 (1983)) que refluja el exceso de
MnCl_{3} con la porfirina. Los complejos de
Mn(III)-porfirina pueden precipitarse de la
solución con perclorato sódico, lavarse y eliminar el residuo de
perclorato mediante resina de intercambio aniónico fuerte. La
formación del complejo Mn(III)-porfirina
puede seguirse por espectrofotometría controlando una banda de Sorét
característica a 468 nm. La síntesis de compuestos que llevan grupos
que ceden electrones en uno o más carbonos pirrólicos se puede
realizar tal como describe Richards et al., Inorg. Chem.
35:1940 (1996).
La purificación de los miméticos se puede
efectuar utilizando técnicas reconocidas en la materia tales como
recristalización, cromatografía, etc. El acoplamiento de un dominio
de enlace al "núcleo mimético" se puede realizar tal como se
describió anteriormente.
Una forma de realización de la presente invención
procede, al menos en parte, de la realización que regula
específicamente con EC-SOD la función de NO\cdot.
Además, la invención se basa en la realización de que
EC-SOD es sintetizado por las células epiteliales y
está localizada principalmente en el intersticio, sobre los
elementos de la matriz y el colágeno y alrededor de las células del
músculo liso (particularmente en las vías respiratorias pulmonares y
en el sistema vascular). NO\cdot es una señal intercelular y, como
tal, NO\cdot debe atravesar la matriz extracelular para ejercer
sus efectos. Sin embargo, NO\cdot es muy sensible a la
inactivación mediada por O_{2}^{-} presente en los espacios
extracelulares. EC-SOD es por lo tanto una enzima
teóricamente adecuada para aumentar la biodisponibilidad de
NO\cdot impidiendo su degradación por el O_{2}^{-}.
Una forma de realización de la presente invención
se refiere a la regulación de las concentraciones de NO\cdot
extracelular utilizando polipéptidos con actividad de
EC-SOD. La invención, sin embargo, no se limita a la
manipulación del NO\cdot como el único mecanismo de actuación de
los compuestos, miméticos, etc., de la invención. Más bien, la
invención se refiere al radical oxígeno, al peróxido de hidrógeno y
al antioxidante de peroxinitrito generalmente.
La presente invención se refiere, en una forma de
realización específica adicional, a la inhibición de la producción
de radicales superóxido. En esta forma de realización, los miméticos
de la invención se utilizan para inhibir oxidasas, tal como la
xantina oxidasa, que son responsables de la producción de radicales
superóxido (véase el Ejemplo VII). La capacidad de un mimético para
proteger las células de mamífero de la lesión provocada por
xantina/xantina oxidasa puede evaluarse, por ejemplo, cultivando
células L2 de rata en placas de 24 pocillos. Las células pueden
preincubarse con varias concentraciones de un mimético y a
continuación se puede añadir xantina oxidasa (XO) al cultivo junto
con xantina (X). La cantidad apropiada de XO/X utilizada en el
estudio puede predeterminarse para cada línea celular realizando una
curva de dosis-respuesta para la lesión. Puede
utilizarse X/XO en una cantidad que produzca aproximadamente un
LC_{75} en el cultivo. La eficacia del mimético se puede
correlacionar con una disminución en la liberación de LDH producida
por XO/X. La capacidad de los miméticos para inhibir la producción
de dichos radicales permite la utilización de miméticos como
productos terapéuticos para el tratamiento de la gota y las lesiones
por reperfusión.
Los miméticos de la invención pueden utilizarse
como antioxidantes catalíticos de especies con oxígeno reactivo para
protegerse contra las lesiones de isquemia por reperfusión asociadas
con el infarto de miocardio, apoplejía, traumatismo craneal agudo,
reperfusión orgánica tras el trasplante, isquemia intestinal,
infarto pulmonar, oclusión quirúrgica de la circulación sanguínea y
lesión tisular leve. Los miméticos pueden además utilizarse para
proteger contra las lesiones esqueléticas por reperfusión del
músculo. También pueden utilizarse los miméticos para proteger
contra lesiones a los ojos debido a la luz solar (y a la piel) así
como del glaucoma y de la degeneración macular del ojo. Las
enfermedades óseas son asimismo adecuadas para el tratamiento con
miméticos. Además, puede esperarse que los trastornos del tejido
conectivo asociados a efectos en la síntesis o degradación del
colágeno sean sensibles al tratamiento con los presentes
miméticos.
Además de la antioxidación del superóxido, la
capacidad de los miméticos de la invención para antioxidar el
peróxido de hidrógeno protegería contra la posible formación del
radical hidroxilo muy reactivo interfiriendo con la química de
Fenton (Aruoma y Halliwell, Biochem. J. 241:273 (1987); Mello
Filho et al., Biochem. J. 218:273 (1984); Rush y
Bielski, J. Phys. Chem. 89:5062 (1985). Estas
metaloporfirinas han demostrado que secuestran el peroxinitrito como
se demostró indirectamente por inhibición de la oxidación de
dihidrorrodamina 123 a rodamina 123 (véase el Ejemplo XIII) y
directamente mediante la aceleración de la degradación del
peroxinitrito interrumpiendo el análisis de flujo.
Además de lo anterior, pueden utilizarse
miméticos como antioxidantes catalíticos o como especies de oxígeno
reactivo para aumentar la viabilidad de almacenamiento muy limitada
de los corazones, riñones, piel y otros órganos y tejidos
trasplantados. Pueden utilizarse también miméticos en los métodos de
inhibición de la lesión debida a la autooxidación de las sustancias
que producen la formación de O_{2}^{-} incluyendo los productos
alimenticios, productos farmacéuticos, sangre almacenada, etc. Para
efectuar este objetivo, se añaden miméticos a productos
alimenticios, productos farmacéuticos, sangre almacenada y
similares, en una cantidad suficiente para medir o prevenir el daño
por oxidación y de este modo inhibir o prevenir la degradación
relacionada con las reacciones de autooxidación. (Para otras
utilizaciones de los miméticos de la invención, véase la patente US
nº 5.227.405). Un experto en la técnica puede determinar la cantidad
de mimético que se debe utilizar en un tratamiento determinado o que
debe relacionarse con una sustancia determinada.
La disponibilidad de los miméticos también
permite los estudios de procesos mediados por O_{2}^{-},
peróxido de hidrógeno, óxido nítrico y peroxinitrito.
Para efectuar la modulación de la eficacia del
NO\cdot extracelular, p. ej., en la relajación del músculo liso,
se administran moléculas (agentes) con actividad de
EC-SOD en condiciones tales que se alteran las
concentraciones de O_{2}^{-}.
Las moléculas adecuadas para su utilización en la
presente invención comprenden los miméticos de
EC-SOD tal como se describieron anteriormente.
Los requisitos generales de dichos miméticos son
que ellos: (a) sean lo suficiente estables como para mantener el
metal ligado (p. ej., Cu o Mn) en presencia de los múltiples agentes
quelantes presentes en los sistemas vivos, (b) sean lo suficiente
activos para que las dosis razonables puedan servir para aumentar de
manera significativa la actividad total de SOD en los espacios
extracelulares, (c) sean capaces de adherirse a las superficies de
las células o a los elementos de la matriz extracelular (p. ej.,
colágeno) cuando se necesita la protección contra las fuentes
extracelulares de O_{2}^{-} y (d) sean de baja toxicidad.
Ejemplos de miméticos adecuados comprenden complejos de
Mn(III) de porfirinas con sustituyentes catiónicos
voluminosos en los carbonos con puente de metina, tales como los
descritos anteriormente (p. ej., MnTMAP y MnTMPyP). Dichos complejos
son muy activos y son lo bastante estables para conservar toda la
actividad en presencia de excesos de EDTA o en presencia de
extractos de tejidos.
Los miméticos descritos anteriormente pueden
formularse en composiciones farmacéuticas adecuadas para su
utilización en los presentes métodos. Dichas composiciones incluyen
el agente activo (mimético) junto con un vehículo, excipiente o
diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición puede estar
presente en forma de dosificación unitaria por ejemplo, comprimidos,
cápsulas o supositorios. La composición puede también estar en forma
de una solución esterilizada adecuada para inyectables o
nebulización. Las composiciones pueden estar en una forma adecuada
para su utilización oftálmica. La invención también comprende
composiciones formuladas para administración tópica, tomando dichas
composiciones la forma, por ejemplo, de una loción, crema, gel o
pomada. La concentración de agente activo que debe incluirse en la
composición puede seleccionarse basándose en la naturaleza del
agente, el régimen de dosificación y el resultado buscado.
La dosis de la composición de la invención que se
ha de administrar se puede determinar sin experimentación indebida y
dependerá de varios factores incluyendo la naturaleza del agente
activo, la vía de administración, el paciente y el resultado buscado
que se debe conseguir.
Las dosis adecuadas de miméticos variarán, por
ejemplo, con el mimético y con el resultado buscado. Los resultados
de Faulkner et al. (J. Biol. Chem. 269:23471 (1994))
indican que la actividad de la oxidorreductasa in vivo de los
miméticos sea tal que una dosis farmacéuticamente eficaz sea lo
suficiente baja para impedir problemas de toxicidad. Las dosis que
se pueden utilizar incluyen las que están comprendidas dentro del
intervalo entre 1 y 50 mg/kg.
Otros ejemplos de enfermedades o trastornos
apropiados para el tratamiento que utilizan los compuestos y
composiciones de la presente invención comprenden enfermedades del
sistema nervioso central (incluyendo la demencia por SIDA,
apoplejía, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), enfermedad de
Parkinson y enfermedad de Huntington) y enfermedades de la
musculatura (incluyendo enfermedades del diafragma (p. ej. fatiga
respiratoria en enfisema, bronquitis y fibrosis quística), fatiga
cardíaca de la insuficiencia cardiaca congestiva, síndromes de
debilidad muscular asociados con miopatías, ALS y esclerosis
múltiple). Muchos trastornos neurológicos (incluyendo apoplejía,
enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, ALS, mal de
Alzheimer y demencia por SIDA) están asociados a una
sobrestimulación del principal subtipo de receptor de glutamato, el
subtipo NMDA (o
N-metil-D-aspartato).
En la estimulación del receptor de NMDA, las concentraciones
excesivas de calcio neuronal contribuyen a una serie de casos de
membrana y citoplásmicos que conducen a la producción de radicales
libres con oxígeno y óxido nítrico (NO\cdot). Se ha demostrado que
las interacciones entre los radicales libres con oxígeno y el
NO\cdot contribuyen a la muerte de las células neuronales. Se han
desarrollado modelos de toxicidad a NMDA de cultivo cortical
neuronal bien probados y se han utilizado como base para el
desarrollo de fármacos. En estos mismos sistemas, los miméticos de
la invención inhiben la lesión producida por NMDA. Los resultados
presentados en el Ejemplo XI demuestran que la formación de
radicales con O^{-}_{2} es una etapa obligada en los casos
intracelulares que culmina en la muerte excitotóxica de las neuronas
corticales y demuestra además que los miméticos de la invención
pueden utilizarse como antioxidantes de radicales O^{-}_{2} y de
este modo sirven como protectores contra la lesión excitotóxica. El
compuesto 10303 (véase Tabla IX) disminuye la excitotoxicidad
producida por NMDA y kainato en las células corticales de rata de
una manera que depende de la dosis con el 100% de protección contra
la excitotoxicidad producida por NMDA (50 \muM) consiguiéndose el
compuesto 10303 a 25 \muM, el compuesto 10303 a 100 \muM en caso
de exotoxicidad provocada por el kainato (300 \muM).
En la presente memoria se describe también la
utilización de compuestos para la preparación de un medicamento
destinado a su utilización en el tratamiento de la artritis,
hipertensión generalizada, aterosclerosis, edema, choque séptico,
hipertensión pulmonar, incluyendo la hipertensión pulmonar primaria,
impotencia, infertilidad, endometriosis, contracciones uterinas
prematuras, infecciones microbianas, gota y para el tratamiento de
la diabetes mellitus de tipo II. Los antioxidantes de la invención
se pueden utilizar para mejorar los efectos tóxicos asociados a
endotoxinas, por ejemplo, conservando el tono vascular e impidiendo
la lesión del sistema multiorgánico.
Se describe también la utilización de compuestos
para la preparación de un medicamento destinado a la utilización en
el tratamiento de trastornos de la memoria. Aunque no se desea estar
ligado a la teoría, se cree que el óxido nítrico es un
neurotransmisor involucrado en la potenciación de la memoria a largo
plazo. Utilizando un modelo de ratón con EC-SOC
modificada genéticamente, se puede demostrar que el deterioro del
aprendizaje se correlaciona con la reducción del antioxidante
superóxido en los espacios extracelulares del cerebro (véase el
Ejemplo XII). La reducción de antioxidante produce concentraciones
mayores de O^{-}_{2} extracelular. Se cree que O^{-}_{2}
reacciona con el óxido nítrico impidiendo o inhibiendo de este modo
la neurotransmisión medicada con óxido nítrico y por lo tanto la
potenciación de la memoria a largo plazo. Los miméticos de la
invención pueden utilizarse para tratar demencias y trastornos de la
memoria o del aprendizaje.
Un experto en la materia puede determinar
fácilmente los regímenes terapéuticos, incluyendo el modo de
administración, apropiados para efectuar el tratamiento de las
enfermedades descritas anteriormente.
Las inflamaciones, particularmente las
inflamaciones de los pulmones, son adecuadas al tratamiento
utilizando los medicamentos preparados que utilizan los compuestos
de la presente invención (obsérvese particularmente los trastornos
inflamatorios del asma, ARDS que incluye la toxicidad al oxígeno,
neumonía (especialmente la neumonía relacionada con el SIDA),
fibrosis quística, sinusitis crónica y enfermedades autoinmunitarias
tales como la artritis reumatoide)). EC-SOD está
localizada en los espacios intersticiales que rodean las vías
respiratorias y las células del músculo liso del sistema vascular.
EC-SOD y O_{2}^{-} median el equilibrio
antiinflamatorio-proinflamatorio en el tabique
alveolar. El NO\cdot liberado por las células del tabique alveolar
actúa para suprimir la inflamación a menos que reaccione con el
O_{2}^{-} para formar ONOO^{-}. Mediante antioxidación con
O_{2}^{-}, la EC-SOD desplaza el equilibrio en
el tabique alveolar contra la inflamación. Cantidades significativas
de ONOO^{-} se formarán únicamente cuando EC-SOD
sea insuficiente o cuando exista un gran aumento de liberación de
O_{2}^{-}. Los miméticos de EC-SOD, tales como
los descritos en la presente memoria, pueden utilizarse para
proteger contra la destrucción causada por hiperoxia. Un experto en
la materia puede demostrar fácilmente los regímenes terapéuticos
apropiados.
Determinados aspectos de la presente invención se
describen con mayor detalle en los siguientes Ejemplos no
limitativos.
\newpage
Ejemplo
I
Construcción del vector de expresión de
EC-SOD humano: El vector de expresión de
EC-SOD (Figura 1) se construyó de la forma
siguiente: el fragmento completo de ADNc de la
EC-SOD humana (Hjalmarrson et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84:6340 (1987); Hendrickson et al.,
genomics 8:736 (1990)) flanqueado por los puntos de
restricción EcoRI fue transformado con la nucleasa de alubia mung
para formar extremos truncados, se ligó a SalI, se digerió con SalI
y a continuación se insertó en el punto SalI del vector de expresión
de \beta-actina humano
pH\betaAPr-1. Se aislaron el fragmento
EcoRI-HindIII del plásmido resultante que contiene
el activador de \beta-actina humano,
(proporcionado por el Dr. Larry Kedes de la Universidad del sur de
California, Los Angeles, California), el intrón y el ADNc de
EC-SOD. Además, el sitio HpaI del SV40 en la
posición 2666 en el plásmido pMSG (Pharmacia LKB Biotechnology,
Piscataway, Nueva Jersey) fue transformado en el punto HindIII
mediante ligadura del enlazador y se aisló el fragmento
HindIII-PstI que contiene el punto de
poliadenilación de la zona inicial SV40. Estos dos fragmentos de ADN
se ligaron a continuación a un vector EcoRI más pKS digerido con
PstI (Stratagene, La Jolla, California). Se aisló el fragmento
EcoRI-XbaI que contiene el montaje de expresión
completo exento de secuencias de plásmido y se utilizó para crear
ratones transgénicos. Todos los procedimientos de ADN recombinante
se realizaron según los métodos admitidos (Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3, Cold Spring Harbor;
Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).
Desarrollo de ratones transgénicos: Se
inyectó ADN purificado a razón de 2,5 \mug/ml en
Tris-HCl 5 mM, pH 7,4, EDTA 0,1 mM en los pronúcleos
de óvulos fertilizados aislados de ratones, los ratones ((C57BL/6 X
C3H)F1 X (C57BL/6 X C3H) F1) ((C57BL/6 X C3H)F1 se
adquirieron en Charles River). Se implantaron a continuación los
óvulos de ratón supervivientes a la microinyección en los oviductos
de madres adoptivas pseudopreñadas (CD1) (los ratones CD1 se
adquirieron en Charles River) siguiendo los procedimientos descritos
por Hogan et al. (Hogan et al., Manupulating the
Mouse Embryo, Cold Spring Harbor; Cold Spring Harbor Laboratory
1986, 32). Los ratones que llevan el transgén fueron identificados
mediante análisis de transferencia Southern del ADN de la cola
sondado con ADNc completo de EC-SOD humana. Se
descubrieron fundadores transgénicos en la primera camada examinada.
Estos ratones se cruzaron con (C57BL/6 X C3H)FI para producir
descendencia para estudios ulteriores. (En todos los experimentos
siguientes con ratones transgénicos EC-SOD, los
ratones transgénicos se refieren a las camadas de ratones
transgénicos que no contienen el transgén para la
EC-SOD humana. En los experimentos en los que no se
utilizaron ratones transgénicos con EC-SOD, se
utilizaron ratones naturales (C57BL/6 X C3H) FI).
Producción de ratones transgénicos con
EC-SOD homozigóticos: Se produjeron ratones
transgénicos homocigóticos por cruce F_{1} de ratones transgénicos
heterocigóticos. Se aisló ADN de la cola de ratones F_{2} y se
trató con ARNasa. Se cortó 10 \mug de ADN de cada ratón con PstI y
a continuación se realizó la electroforesis a través de un gel de
agarosa al 1,2%. A continuación se realizó el análisis de
transferencia Southern del ADN de la cola sondado con el ADNc
completo de la EC-SOD humana. El ADNc de
EC-SOD humana no interreaccionó con el gen de
EC-SOD de ratón. Se comparó a simple vista la
intensidad de la banda para determinar qué ratones eran
homocigóticos, heterocigóticos o negativos para el transgén de
EC-SOD humana.
Análisis Northern: Se sacrificaron los
ratones transgénicos y las camadas no transgénicas con una
sobredosis de pentobarbital. Se escindieron rápidamente los tejidos
y se congelaron en nitrógeno líquido hasta que estuvieron listos
para tratamiento ulterior. Se aisló a continuación ARN total por el
procedimiento del CsCl descrito en Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3. Cold Spring
Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. Veinte \mug de ARN
total de los tejidos de ratones transgénicos y de las camadas no
transgénicas y un escalón de ARN se desnaturalizaron a continuación
con glioxal, se realizó la electroforesis a través de un gel de
agarosa al 1,2% y se transfirió a nitrocelulosa tal como se describe
(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. 3. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory,
1989). Las transferencias se sondaron a continuación con el ADNc
completo de EC-SOD humana.
Separación de isoenzimas de SOD mediante
cromatografía con concanavalina A sefarosa: Se pesaron los
tejidos tomados de 3 ratones, a continuación se combinaron y se
homogeneizaron en 10 volúmenes de fosfato de potasio 50 mM enfriado
en hielo, pH 7,4, con KBr 0,3 M, ácido dietilentriaminpentaacético 3
mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,5 mM. La separación de
EC-SOD de la CuZn SOD y de la Mn SOD se realizó
pasando homogeneizados de tejido sobre una columna de concanavalina
A sefarosa según describe (Marklund et al., Clin. Chim.
Acta 126:4 (1982)).
Actividad de SOD: La actividad de
EC-SOD y la actividad de SOD total (CuZn SOD y Mn
SOD) que permanece después de la extracción de
EC-SOD se midieron por inhibición de la reducción de
citocromo C a pH 10, tal como se describió anteriormente (Crapo
et al., Methods Enzymol. 53:382 (1978)). Se determinó
la proteína total mediante el análisis de proteínas BCA (Pierce,
Rockford, IL). Las actividades de SOD se expresaron a continuación
en unidades/mg de proteína total.
Caracterización de ratones transgénicos:
Los ratones que llevan el transgén EC-SOD humano se
detectaron por análisis de transferencia Southern. En la Figura 2 se
muestra el análisis Northern de varios tejidos del ratón F1 y de un
ratón que se descubrió que lleva el transgén. Se detectaron altas
concentraciones de mensaje para la EC-SOD humana en
el corazón, músculo esquelético y cerebro de ratones transgénicos,
con poco o ningún mensaje observado en el pulmón, hígado y bazo. No
se detectó ningún mensaje en las camadas no transgénicas.
Se generaron ratones homocigóticos cruzando dos
ratones F1 heterocigóticos. Se detectaron ratones homocigóticos
mediante las intensidades de la banda diferencial observada
utilizando análisis de transferencia Southern de cantidades iguales
de ADN digerido con PstI en la descendencia. Se descubrió que la
actividad de EC-SOD en los ratones aumenta en
respuesta a las copias totales del transgén de
EC-SOD (Tabla I).
| Tejido | No transgénico | Heterocigótico | Homocigótico |
| Cerebro | 18 | 38 | 50 |
| Corazón | 35 | 69 | 102 |
Ejemplo
II
Exposiciones al oxígeno: Se expusieron
cinco ratones a la vez de 7 a 8 semanas a oxígeno hiperbárico en una
pequeña cámara para animales (Bethlehem, Pensilvania). Tras el
arrastre en la cámara con oxígeno puro, se realizó la compresión a
50 metros (6 ATA) durante 5 minutos. Se controló la concentración de
oxígeno en la cámara continuamente con un analizador de oxígeno
Servomex (modelo 572, Sybron, Norwood, Massachusetts) y se mantuvo a
\geq99%. Se analizó la concentración de dióxido de carbono en las
muestras intermitentes de gas de la cámara con un detector IR (IR
Industries, Santa Barbara, California) y no se permitió subir de
aproximadamente el 0,1%. La temperatura de la cámara se mantuvo
entre 25 y 26ºC, excepto la compresión de oxígeno en la cámara que
alcanzó transitoriamente la temperatura comprendida entre 30 y 32ºC,
excepto un sistema de control medioambiental que restablecía la
temperatura normal en la cámara cada 3 minutos. Las exposiciones
duraron 25 a 75 minutos y eran seguidas de descompresión durante 5
minutos. Se observaron en los ratones continuamente los síntomas de
toxicidad por oxígeno desde el principio de la exposición hasta 4
horas después de la retirada de la cámara. Se registraron el tiempo
hasta la primera convulsión generalizada (latencia de ataque) y el
tiempo hasta la muerte. Estas condiciones de exposición están
diseñadas para producir toxicidad de oxígeno en el SNC sin pruebas
apreciables de toxicidad por oxígeno pulmonar.
Tratamiento con ditiocarbamato de dietilo:
Una hora antes de la exposición a 6 ATA de oxígeno, se administró a
los ratones inyecciones i.p. de 0,008 cc/g de solución salina o 400
mg/kg de ditiocarbamato de dietilo disuelto en solución salina
(0,008 cc/g). Se expusieron los ratones a continuación a 6 ATA de
oxígeno durante 25 minutos tal como se describió anteriormente.
Para determinar la magnitud de la inhibición de
EC-SOD y de CuZn SOD por ditiocarbamato de dietilo,
se administró a los ratones ditiocarbamato de dietilo y se
sacrificaron una hora después. Se extirparon los cerebros y se
analizó la actividad de EC-SOD y de CuZn SOD tal
como se describió anteriormente.
Tratamiento con
\beta-mercaptoetanol: Una hora antes de la
exposición a 6 ATA de oxígeno, se administró a los ratones
inyecciones i.p. de 0,008 cc/g de solución salina o 180 mg/kg de
\beta-mercaptoetanol (0,008 cc/g). Se seleccionó
esta dosis de \beta-mercaptoetanol debido a que
contiene un número igual de tioles reductores que la dosis de
ditiocarbamato de dietilo. Se expusieron a continuación los ratones
a 6 ATA de oxígeno durante 30 minutos tal como se describió
anteriormente.
Tratamiento con
N-\omega-nitro-L-arginina,
inhibidor de óxido nítrico sintetasa: Diez minutos antes del
comienzo de la compresión, se administraron i.p. 0,008 cc/g de
solución salina o 20 mg/kg (0,008 cc/g) de
N-\omega-nitro-L-arginina
disueltos en agua estabilizada a ratones transgénicos y no
transgénicos. Se expusieron a continuación los ratones a 6 ATA de
oxígeno durante 25 ó 75 minutos tal como se describió
anteriormente.
Análisis estadístico: Se utilizó la prueba
de la t de Student para datos emparejados para comparar las
actividades enzimáticas en ratones transgénicos y no transgénicos.
Se utilizó la prueba de la \chi^{2} con corrección de
Bonferroni para evaluar el significado en las diferencias de
supervivencia a exposiciones hiperbáricas. Se utilizó el análisis de
la varianza con una prueba de la F de Scheffe para comparar las
diferencias en la latencia de ataque en diferentes grupos de
ratones.
Exposiciones a oxígeno hiperbárico: Para
probar los efectos del aumento de las concentraciones de
EC-SOD en el cerebro sobre la toxicidad del oxígeno
en el SNC, se expusieron tanto los ratones transgénicos como los no
transgénicos (véase Ejemplo I) a oxígeno a 6 ATA durante 25 minutos.
Los ratones transgénicos fueron más sensibles (mortalidad del 83%) a
la toxicidad por oxígeno en el SNC que los ratones no transgénicos
(mortalidad del 33%) (Figura 3).
Se trataron posteriormente ratones transgénicos y
no transgénicos con un inhibidor de CuZn SOD, ditiocarbamato de
dietilo, para confirmar que el aumento de sensibilidad de los
ratones transgénicos a la toxicidad por oxígeno en el SNC era el
resultado del aumento de actividad de SOD. Tanto en los ratones
transgénicos como en los no transgénicos, el tratamiento con 400
mg/kg de ditiocarbamato de dietilo produjo el 80% de inhibición de
EC-SOD y el 60% de inhibición de CuZn SOD en el
cerebro. Esto concuerda con los descubrimientos anteriores (Frank
et al., Biochem. Pharmacol. 27:251 (1978); Heikkila
et al., J. Biol. Chem. 251:2182 (1976)). El
tratamiento con ditiocarbamato de dietilo confirió aumento de
resistencia a la toxicidad por oxígeno en el SNC tanto para los
ratones transgénicos como no transgénicos. La supervivencia aumentó
hasta el 100% en los ratones transgénicos y al 93% en los ratones no
transgénicos (Figura 3). El comienzo de los ataques se retardó
también cuatro veces en los ratones tratados con ditiocarbamato de
dietilo (Figura 4).
Para evaluar si el ditiocarbamato de dietilo
protege o no contra la toxicidad por oxígeno en el SNC actuando como
agente reductor en lugar de como inhibidor de la actividad de SOD,
se trataron los ratones con una cantidad equimolar de tioles
reductores en forma de \beta-mercaptoetanol y se
expusieron a oxígeno hiperbárico. La Figura 5 demuestra que el
\beta-mercaptoetanol no protegió contra la
toxicidad por oxígeno en el SNC.
Una posibilidad que puede explicar por qué
EC-SOD empeora la toxicidad por oxígeno en el SNC
consistiría en que el óxido nítrico es un mediador de la toxicidad
por oxígeno en el SNC y EC-SOD es el óxido nítrico
que protege de la inactivación mediada por superóxido. Para
demostrar la hipótesis de que el óxido nítrico contribuye a la
toxicidad por oxígeno en el SNC, se trataron ratones naturales
(C57BL/6 X C3H)F1 con un inhibidor de óxido nítrico
sintetasa,
N-\omega-nitro-L-arginina.
La Figura 6 presenta los efectos de
N-\omega-nitro-L-arginina
en la latencia de ataque en ratones. El pretratamiento con
N-\omega-nitro-L-arginina
produjo un aumento significativo en la latencia de ataque (13,50
\pm 5,6 min) en comparación con los ratones tratados con solución
salina (2,75 \pm 1 min). La Figura 7 demuestra que la inhibición
del óxido nítrico sintetasa también aumentó de forma significativa
la supervivencia después de la exposición a oxígeno hiperbárico. Los
ratones a los que se administró inhibidor de óxido nítrico sintetasa
presentaban el 50% de mortalidad después de la exposición a 90
minutos de 6 ATA de oxígeno y el 100% de mortalidad no se obtuvo
hasta 2 horas después de esta exposición. Los ratones tratados con
solución salina, sin embargo, presentaban un 50% de mortalidad
después de solamente 25 minutos de exposición con el 100% de
mortalidad después de solamente de 30 minutos a oxígeno a 6 ATA. La
Figura 8 demuestra que el porcentaje de supervivencia en oxígeno
hiperbárico dependía de la dosis de inhibidor administrada. La
protección ofrecida por este inhibidor competitivo de óxido nítrico
sintetasa podría invertirse cuando se administre un exceso de
L-arginina (Figura 6 y Figura 9).
A continuación se estudiaron los efectos del
inhibidor de óxido nítrico sintetasa,
N-\omega-nitro-L-arginina,
sobre la toxicidad por oxígeno en el SNC en los ratones
transgénicos. Este tratamiento redujo drásticamente la toxicidad por
oxígeno en el SNC tanto en los ratones transgénicos como en los no
transgénicos. La supervivencia tras 25 minutos de exposición a
oxígeno a 6 ATA aumentó hasta el 100% en ambos grupos (Figura 3). La
latencia de ataque se retardó también de manera significativa
(Figura 4). A continuación se aumentó el tiempo de exposición a 75
minutos para investigar si los ratones transgénicos eran todavía más
sensibles que los ratones no transgénicos al oxígeno hiperbárico.
Los resultados en la Figura 10 indican que el tratamiento con
N-\omega-nitro-L-arginina
suprimió la diferencia de sensibilidad que se observó entre los
ratones no tratados y los ratones no transgénicos durante los 25
minutos de exposición mostrados en la Figura 3.
Ejemplo
III
Modelo de lesión: Se anestesiaron ratones
jóvenes (de 6 a 7 semanas) (véase el Ejemplo I) con 60 mg/kg de
pentobarbital (Nembutal, Abbot Laboratories, Chicago, Illinois). Se
practicó a continuación una incisión en el cuero cabelludo y se
colocó un rodillo de acero de 20 cm de longitud, 3 mm de diámetro,
equilibrado en nitrógeno líquido con un baño de 8 cm de 4 cm de
nitrógeno líquido en el extremo del rodillo, en el cráneo sobre el
hemisferio cerebral derecho durante 30 segundos. La incisión en la
piel se suturó a continuación.
Dos horas después de la herida se administró al
ratón una dosis adicional de pentobarbital. Se abrió la cavidad
torácica, se escindieron los pulmones y a continuación se perfundió
al ratón con 20 ml de solución salina a través del ventrículo
izquierdo del corazón. A continuación se extirpó el cerebro y se
escindió el cerebelo. Se separaron los hemisferios cerebrales
derecho (R) e izquierdo (L) y se pesaron inmediatamente (peso
húmedo, W). Cada hemisferio se secó a continuación a 70ºC durante 2
a 3 días en una estufa de aire caliente hasta que se consiguió un
peso constante (peso seco, D). Se calculó a continuación el índice
de edema (I) como se muestra en la ecuación 13.
[13]I=(W/D R -
W/D L)/(W/D L) \times
100
Este cálculo permitió servir al hemisferio
izquierdo como referencia interna para el hemisferio derecho
lesionado en cada ratón.
Tratamientos químicos: Se realizaron seis
grupos de experimentos para investigar la importancia del superóxido
extracelular, del hierro y del óxido nítrico en el edema cerebral
provocado por el frío. En todos los grupos, se disolvieron los
fármacos en solución salina y se inyectaron a 0,008 cc/g 15 minutos
antes del traumatismo por el frío. En el grupo 1, la formación del
edema de los ratones transgénicos con EC-SOD se
comparó con la de las camadas no transgénicas. El grupo 2 comparó la
formación de edema entre los ratones naturales (C57BL/6 X
C3H)F1 tratados con solución salina y los ratones (C57BL/6 X
C3H)F1 tratados con 0,33 mg/g de deferoxamina (0,51
\mumoles/g). El grupo 3 comparó los ratones (C57BL/6 X
C3H)F1 tratados con solución salina con ratones (C57BL/6 X
C3H)F1 tratados con 0,51 \mumoles/g de deferoxamina
saturada con Fe^{3+}. El grupo 4 estaba constituido por ratones
(C57BL/6 \times C3H)F1 tratados con solución salina y
ratones (C57BL/6 \times C3H)F1 tratados con 0,02 mg/g de
éster metílico de
N-\omega-nitro-L-arginina.
El grupo 5 estaba constituido por ratones (C57BL/6 \times
C3H)F1 tratados con solución salina y ratones (C57BL/6
\times C3H)F1 tratados con 0,02 mg/g de éster metílico de
N-\omega-nitro-L-arginina
más 0,05 mg/g de L-arginina. El grupo 6 comparó la
formación de edema entre ratones no transgénicos, ratones
transgénicos con EC-SOD tratados con solución salina
y ratones transgénicos con EC-SOD tratados con 0,02
mg/ng de éster metílico de
N-\omega-nitro-L-arginina.
Se preparó deferoxamina saturada con hierro
disolviendo cantidades equimolares de deferoxamina y a continuación
cloruro férrico en solución salina. La saturación de deferoxamina
con ión férrico se determinó por espectrofotometría midiendo la
absorbancia a 425 nm (e=2500 M^{-1} cm^{-1} para Fe^{3+}
-deferoxamina) (Monzyk y Crumbliss, J. Amer. Chem. Soc.
104:4921 (1982)).
Tratamiento con azul de Evan: Una hora y
50 minutos tras el traumatismo por el frío, se inyectó 5 ml/kg de
azul de Evan al 1% en solución salina en la arteria femoral de
ratones transgénicos y no transgénicos. Se sacrificaron los ratones
10 minutos después. Se escindieron a continuación los pulmones y se
prefundió a continuación los ratones con solución salina normal a
través del ventrículo izquierdo hasta que no hubo más color azul en
el efluente. Se extrajeron a continuación los cerebros y se
fotografiaron.
Análisis estadístico: Se utilizó la prueba
de la t de Student para datos emparejados para comparar la
significación del desarrollo del edema en comparación con ratones no
transgénicos o con ratones tratados con solución salina para cada
uno de los grupos examinados. Se utilizó análisis de varianza en una
prueba de PLSD de Fisher para comparar la significación.
| Tratamiento | n | Índice de edema |
| Solución salina | 6 | 5,77 \pm 0,29 |
| LNAME | 6 | 3,65 \pm 0,51* |
| Solución salina | 6 | 6,56 \pm 0,21 |
| LNAME + L Arg | 6 | 6,03 \pm 0,71 |
| * \begin{minipage}[t]{150mm}p<0,05 comparada con el índice del edema de las referencias tratadas con la solución salina respectiva utilizando una prueba de la t de Student para datos emparejados.\end{minipage} | ||
En los experimentos finales, se trataron ratones
transgénicos EC-SOD con solución salina o con éster
metílico de
N-\omega-nitro-L-arginina
para determinar si existía un efecto aditivo para prevenir la
formación de edema en ratones que habían aumentado las
concentraciones de EC-SOD así como las del inhibidor
de óxido nítrico sintetasa. La Tabla IV demuestra que cuando se
administra a los ratones transgénicos con EC-SOD el
inhibidor de óxido nítrico sintetasa, no se detectó ninguna
protección contra la formación de edema en comparación con los
ratones transgénicos protegidos únicamente por el aumento de
concentraciones de EC-SOD en el cerebro.
| Tratamiento | n | Índice de edema |
| No transgénico | 6 | 7,91 \pm 0,67 |
| Transgénico | 6 | 4,91 \pm 0,78* |
| Transgénico + LNAME | 6 | 4,30 \pm 0,96* |
| *p<0,05 comparada con el índice de edema de ratones no transgénicos |
Ejemplo
IV
Pulmón humano: Se obtuvieron cinco
muestras de pulmón humano para evaluar la distribución de
EC-SOD en el tejido pulmonar humano. Se obtuvo una
muestra de un espécimen de patología quirúrgica del lóbulo superior
derecho extirpado de una mujer blanca de 43 años con antecedentes de
fumadora de 50 cajetillas al año (equivalente a una cajetilla al día
durante 1 año) y un nódulo aislado observado en el pecho por rayos
X. La paciente fue diagnosticada de carcinoma epidermoide. El tejido
de una zona no afectada por el carcinoma de este lóbulo se utilizó
en los estudios presentados en la presente memoria. Se obtuvo un
segundo pulmón de un espécimen de la patología quirúrgica del lóbulo
superior extirpado de un hombre blanco de 51 años con antecedentes
de fumador de 60 paquetes al año observando que presentaba un nódulo
aislado por rayos X. El paciente no presentaba otra enfermedad y se
diagnosticó de carcinoma epidermoide. El tejido pulmonar no afectado
por el carcinoma de este espécimen se utilizó para la localización
de EC-SOD. Se obtuvo un tercer pulmón en una
autopsia rápida (tejido obtenido 6 horas tras la muerte) de un
hombre blanco de 66 años con demencia, pero sin historia de fumador
o de neumopatía. El cuarto pulmón examinado se obtuvo del tejido
pulmonar en exceso de un pulmón demasiado grande para el receptor de
un trasplante pulmonar. El pulmón donado procedía de una mujer
blanca de 45 años sin antecedentes de fumadora o de neumopatía. El
quinto pulmón examinado en estos estudios fue también de tejido
pulmonar excedente utilizado para el trasplante de pulmón procedente
de un hombre blanco de 39 años sin antecedentes de fumador o de
neumopatía. No se observaron de manera destacada diferencias en los
modelos de marcado entre los especímenes de patología quirúrgica y
los tejidos de autopsia de los donantes para trasplante
pulmonar.
Los tejidos se fijaron en paraformaldehído al
2%/glutaraldehído al 0,2% en solución salina tamponada con fosfato
0,01 M (PBS; 1,2 g de NaH_{2}PO_{4}, 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl,
en 1 litro pH 7,3) durante 1 hora seguido de fijado durante la noche
en paraformaldehído al 4% a 4ºC y a continuación en compuesto O.C.T.
Los tejidos se congelaron en hexano enfriado en nitrógeno líquido y
se almacenaron a -70ºC hasta que se seccionaron para estudios al
microscopio
óptico.
óptico.
Para los estudios al microscopio electrónico, los
tejidos pulmonares se procesaron como en los estudios al microscopio
óptico hasta el equilibrado en sacarosa. Tras el equilibrado en
sacarosa, los tejidos pulmonares se infiltraron con gelatina al 10%
a 37ºC durante 10 minutos. Las secciones de tejido, en gelatina, se
solidificaron a continuación en hielo, se cortaron en cubos de 2
mm/cara y a continuación se protegieron en frío en alcohol
polivinílico al 4% que contenía sacarosa 2 M durante la noche. Estas
muestras se montaron a continuación en trozos, se congelaron por
evaporación rápida en nitrógeno líquido y a continuación se
almacenaron en nitrógeno líquido hasta que se seccionaron para
estudios al microscopio electrónico.
Caracterización de anticuerpos contra
EC-SOC recombinante humana:
EC-SOD recombinante humana (proporcionada por S.L.
Marklund, Ume\ring{a}, Suecia; Tibell et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84: 6634 (1987)) y el sobrenadante a 20.000
\times g de un homogeneizado de pulmón humano se desnaturalizó en
presencia de \beta-mercaptoetanol y dodecilsulfato
de sodio hirviendo durante 5 minutos y a continuación se realizó la
electroforesis a través de gel de poliacrilamida al 12% en presencia
de dodecilsulfato de sodio. A continuación se transfirió la proteína
a nitrocelulosa por electroforesis. La transferencia se incubó a
continuación con 4,3 \mug/ml de una fracción purificada en IgG de
anti-rh-EC-SOD de
conejo proporcionada por S.M. Marklund, Ume\ring{a} University
Hospital, Ume\ring{a}, Suecia purificada por afinidad con
rh-EC-SOD seguida de incubación con
^{125}I-proteína A y autorradiografía.
Absorción de IgG
anti-EC-SOD: Se hinchó en PBS
sefarosa activada por CNBr. El gel hinchado se mezcló con PBS a fin
de que el gel sedimentado ocupase el 50% del volumen. Se puso en
suspensión el gel y se mezclaron 100 \mul con 100 \mug de
rh-EC-SOD puro durante 2 horas a
temperatura ambiente agitando suavemente. Se lavó a continuación el
gel 4 veces con PBS + albúmina de suero bovino al 1% (BSA) y se
prepararon 100 \mul con PBS + BSA al 1%. Se añadieron a
continuación 100 \mul de
anti-rh-EC-SOD al
doble de la concentración utilizada para el inmunomarcado y se
mezclaron durante 2 horas en agitación suave a temperatura ambiente.
Se añadió a continuación IgG de conejo no inmunizado al sobrenadante
en una concentración equivalente a la concentración prevista de IgG
de anti-rh-EC-SOD
eliminada por el procedimiento. A continuación se utilizó este
sobrenadante para el inmunomarcado
posterior.
posterior.
Inmunohistoquímica microscópica óptica: Se
cortaron secciones en serie de 4 \mum de tejido empapado en
O.C.T. en un criostato a -20ºC y se colocaron en secciones
recubiertas de poli-L-lisina (3
secciones/sección). Las secciones se almacenaron a -70ºC hasta que
se realizó el marcado. A continuación se marcaron las secciones para
EC-SOD utilizando un método indirecto de
inmunoperoxidasa (Milde et al., J. Histochem. Cytochem.
37: 1609 (1989); Randell et al., Am. J. Resp. Cell.
Mol. Biol. 4: 544 (1991)) con una IgG
anti-conejo de cabra biotinilada y
estreptavidina-peroxidasa de rábano picante
(Jackson, ImmunoResearch Laboratories (West Grove, Pensilvania))
(Tabla V). Para reducir la tinción de fondo, se incubaron las
secciones en H_{2}O_{2} al 1% en metanol para inactivar las
peroxidasas endógenas, borohidruro 10 mM para bloquear los aldehídos
y la unión no específica se bloqueó por incubación con suero de
cabra normal al 5% (NGS), leche al 5% y BSA al 1% en PBS. Se
determinaron empíricamente las diluciones primarias y secundarias
óptimas del anticuerpo y se prepararon en PBS con leche al 1% más
BSA al 1% (la leche no estaba incluida en la solución de
estreptavidina). Se revelaron las secciones utilizando
diaminobencidina (10 mg de diaminobencidina, 50 ml de Tris\cdotCl
0,05 M, pH 7,6, 100 \mul de H_{2}O_{2} al 3%) y se tiñeron por
contraste con verde de metilo al 1%. Como referencia, se marcaron
por separado las secciones en serie con
anti-rh-EC-SOD de
conejo (EC-SOD), IgG de conejo no inmunizada o
anti-rh-EC-SOD de
conejo de las cuales la IgG que se une a EC-SOD
había sido absorbida (EC-SOD absorbida; véase
anteriormente).
\vskip1.000000\baselineskip
| Tiempo de incubación | ||
| Etapa 1 | H_{2}O_{2} al 1% en metanol | 30 minutos |
| Etapa 2 | Borohidruro 10 mM en PBS (tejido fijado en glutaraldehído solamente) | 30 minutos |
| Etapa 3 | NGS al 5%, leche al 5%, BSA al 1%/PBS | 30 minutos |
| Etapa 4 | Anticuerpo primario, leche al 1%, BSA al 1%/PBS (varias diluciones) | 1 hora |
| Etapa 5 | IgG anti-conejo de cabra marcado con biotina (1:6000 en leche al 1%, BSA | 1 hora |
| al 1%/PBS) | ||
| Etapa 6 | estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (1:2000 en BSA al 1%/PBS) | 1 hora |
| Etapa 7 | diaminobencidina | 15 minutos |
| Etapa 8 | verde de metilo al 1% en agua | 15 minutos |
\vskip1.000000\baselineskip
Inmunocitoquímica al microscopio
electrónico: Se inmunomarcaron secciones criogénicas ultrafinas
(70 nm) de tejido pulmonar humano con anti
rh-EC-SOD de conejo y
10-nm de proteína A-oro como se
describió anteriormente (Crapo et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89: 10405 (1992)) (Tabla VI). En resumen, se incubaron
las secciones en primer lugar tres veces durante cinco minutos a
temperatura ambiente en glicina al 0,15% en PBS para bloquear los
grupos aldehído. Se bloqueó más la unión no específica por
incubación en BSA al 1% en PBS durante 10 minutos. Se determinaron
empíricamente las diluciones primaria y secundaria de anticuerpo y
se prepararon en PBS que contenía BSA al 1%. Se tiñeron las
secciones con oxalato de uranilo y acetato de uranilo en
metilcelulosa tal como se describió anteriormente (Crapo et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10405 (1992)). Los
grupos de referencia eran tal como los descritos anteriormente para
la microscopía óptica.
| Tiempo de incubación | ||
| Etapa 1 | PBS + glicina al 0,15% | 3 \times 5 minutos |
| Etapa 2 | BSA al 1%/PBS | 5 minutos |
| Etapa 3 | Anticuerpo primario en BSA al 1%/PBS | 45 minutos |
| Etapa 4 | Proteína -A oro | 30 minutos |
| Etapa 5 | oxalato de uranilo | 5 minutos |
| Etapa 6 | acetato de uranilo/metilcelulosa | 10 minutos |
\vskip1.000000\baselineskip
Característica del anticuerpo de
EC-SOD: Se caracterizó el anticuerpo contra
rh-EC-SOD mediante análisis de
transferencia Western de rh-EC-SOD y
un homogeneizado de pulmón humano. La Figura 13 demuestra que el
anticuerpo reaccionó tanto con las subunidades
EC-SOD de tipo C (banda superior) como con las de
tipo A (banda inferior) (Sandström et al., Biochem. J.
267: 18205 (1992) en un homogeneizado de pulmón humano. La
subunidad de tipo A no existe en el intersticio de los tejidos in
vivo (Sandström et al., Biochem. J. 290: 623
(1993)). El anticuerpo reaccionó con estas tres bandas en la banda
que contenía rh-EC-SOD de tipo C
purificado. Las dos especies de peso molecular más bajo en la Figura
13 son debidas a la glucosilación parcial y suficiente del
rh-EC-SOD en la sobreproducción en
exceso de células CHO.
Inmunohistoquímica al microscopio óptico:
Utilizando un anticuerpo contra
rh-EC-SOD, se inmunolocalizó esta
proteína en pulmones humanos. La inmunohistoquímica al microscopio
óptico revelada con EC-SOD está principalmente
relacionada con la matriz de tejido conectivo alrededor de los vasos
y de las vías respiratorias en el pulmón (Figura 14a y b, Figura
15a, b y c). Se observó la EC-SOD en estrecha
proximidad al músculo liso vascular y de las vías respiratorias
(Figura 14a y b, y Figura 15a). Se observó también la
EC-SOD en tejido conectivo de tiras de tabique
alveolar (Figura 15c) lo que sugiere una afinidad de
EC-SOC con la matriz de tejido conectivo. No se
observó marcado en relación con las células endoteliales vasculares
en las arterias elásticas grandes, los vasos de tamaño medio o los
capilares (Figura 14a y b). EC-SOD estuvo
notablemente ausente de las superficies de las células endoteliales
de las vías respiratorias (Figura 15a y b) y tampoco estuvo presente
en el cartílago (Figura 15a).
El anticuerpo contra EC-SOD fue
un anticuerpo de conejo policlonal de IgG que fue purificado por
afinidad utilizando rh-EC-SOD. Para
probar la especificidad del marcado para EC-SOD, se
absorbió IgG específico de EC-SOD del antisuero
utilizando rh-EC-SOD puro unido a
sefarosa con bromuro de cianógeno. Se añadió a continuación IgG de
conejo no inmunizada a este anticuerpo absorbido en cantidad
suficiente para sustituir la IgG absorbida. El marcado de los
tejidos de pulmón con esta preparación de anticuerpo preabsorbida
dio como resultado la ausencia de marcado en todas las áreas del
pulmón incluyendo el sistema vascular pulmonar (Figura 14c). El
marcado del tejido pulmonar con IgG no inmunizada sola también dio
como resultado la ausencia de marcado en todas las áreas del pulmón.
Las referencias indican que el marcado observado con el anticuerpo
primario es específico de EC-SOD en el pulmón.
Inmunocitoquímica al microscopio
electrónico: En la Tabla VII se resume el marcado de
EC-SOD en el pulmón observado utilizando
inmunocitoquímica al microscopio electrónico. EC-SOD
se relacionó principalmente con las proteínas de la matriz
extracelular en todas las zonas del pulmón. En particular, se
observó un alto grado de marcado en las áreas en colágeno de tipo I
(Figura 16) y en relación con otros proteoglucanos no identificados
en la matriz extracelular (Figura 17). No se observó ningún marcado
de EC-SOD de forma notable en las áreas ricas en
elastina (Figura 16). Se observó un alto grado de marcado cerca de
la superficie de las células del músculo liso y en la matriz de
tejido conectivo en torno a las células de músculo liso en los vasos
sanguíneos (Figura 17) y en las vías respiratorias. El marcado
estuvo ausente de forma notable en la superficie de las células
endoteliales en los vasos pequeños, medios y grandes (Figuras 18a y
b). La falta de marcado en las células endoteliales observada en la
inmunoquímica al microscopio óptico apoya las observaciones al
microscopio electrónico. Se observó también marcado de
EC-SOD en el plasma dentro del lumen de los vasos
sanguíneos (Figura 18a). Es de esperar localización de
EC-SOD en el plasma ya que esta proteína fue
descubierta en primer lugar en el plasma (Marklund, Acta Physiol.
Scand., 5492: 19 (1980)). El marcado de EC-SOD
se observó en las uniones intercelulares entre las células
epiteliales bronquiales (Figura 19), pero estuvo ausente en la
superficie apical de estas células. Por último, el marcado de
EC-SOD estuvo ausente de la superficie de las
células de tipo I y de tipo II. Se observó una cantidad moderada
pero uniforme de EC-SOD intracelular en las células
epiteliales de tipo II y en las células epiteliales bronquiales
(Figura 19).
| Situación | EC-SOD |
| Superficies celulares | |
| \hskip0,5cm Endotelial | - |
| \hskip0,5cm Célula de tipo I | - |
| \hskip0,5cm Célula de tipo II | - |
| \hskip0,5cm Célula de músculo liso | + |
| \hskip0,5cm Fibroblasto | \pm |
| Matriz extracelular | |
| \hskip0,5cm Colágeno de tipo I | + |
| \hskip0,5cm Elastina | - |
| \hskip0,5cm Cartílago | - |
| \hskip0,5cm Elementos no identificados de la matriz | + |
| Intracelular | |
| \hskip0,5cm Célula endotelial | \pm |
| \hskip0,5cm Célula de tipo I | - |
| \hskip0,5cm Célula de tipo II | + |
| \hskip0,5cm Célula epitelial bronquial | + |
| \hskip0,5cm Célula de músculo liso | - |
| \hskip0,5cm Fibroblasto | \pm |
| Sangre | |
| \hskip0,5cm Plasma | + |
| \hskip0,5cm Célula de glóbulo rojo | - |
Se realizaron controles absorbiendo anticuerpo
específico de EC-SOD fuera del anticuerpo primario y
sustituyendo este anticuerpo absorbido por IgG de ratón no
inmunizada producida en ausencia de marcado en todas las áreas del
pulmón incluyendo las áreas ricas en colágeno de tipo I tal como se
observa en la Figura 16c. Además, la utilización de IgG de conejo no
inmunizada en lugar del antisuero primario también produjo ausencia
de marcado en todas las áreas del pulmón. La falta de marcado con
estos controles indica que el marcado observado con el antisuero
primario es específico de EC-SOD en el pulmón.
La localización de EC-SOD en la
superficie de las células de músculo liso y en la matriz
extracelular alrededor de estas células tanto en los vasos
sanguíneos como en las vías respiratorias indica que
EC-SOD puede presentar una función importante en
esta posición. El superóxido es conocido porque reacciona
rápidamente con el óxido nítrico e inactiva sus propiedades como
relajante del músculo liso. Por consiguiente, la presencia de
EC-SOD a lo largo del curso de la dilución del óxido
nítrico en las células de músculo liso debería aumentar la vida
media de este breve mensajero intracelular activo en esta zona
particular y aumentar de este modo su potencia como vasodilatador.
El elevado marcado para EC-SOD observado alrededor
de las células de músculo liso vasculares y de las vías
respiratorias indica una función para EC-SOD como
mediador de la actividad del óxido nítrico en el mantenimiento de
las presiones vasculares pulmonares bajas y de la resistencia de las
vías respiratorias.
Además del marcado de EC-SOD
juntamente con las células de músculo liso, EC-SOD
también parece localizarse firmemente en el colágeno de tipo I. Se
ha demostrado anteriormente que el colágeno es susceptible de ser
atacado por especies de oxígeno reactivo tal como el anión
superóxido. Además, el anión superóxido puede ser capaz de activar
colagenasas latentes de leucocitos polimorfonucleares (PMN) lo que
puede conducir a una degradación adicional del colágeno. Debido a
que se ha demostrado que los fragmentos de colágeno atraen
químicamente y activan los PMN, cualquier aumento producido de
superóxido que produzca degradación del colágeno puede acelerar las
reacciones inflamatorias y la destrucción del tejido mediante
regeneración y activación de PMN. Por consiguiente, la asociación de
EC-SOD con el colágeno puede ser importante en la
prevención de la degradación mediada por superóxido del colágeno y
por consiguiente, representa un medio de control de las respuestas
inflamatorias.
Ejemplo
V
(Únicamente como
referencia)
[\alpha^{-35}S]dATP (\sim1400
Ci/mmol), [\gamma^{-3}2P]ATP (3000 Ci/mmol) y
[\alpha^{-35}P] CTP (800 Ci/mmol) se adquirieron en New England
Nuclear. ADN genómico humano, T_{7}, T_{3} y SP6 ARN polimerasa,
RNasin y plásmido pGEM3Zf (+) se adquirieron en Promega Biotec. El
kit de secuenciado Sequenase (V 2.0) se adquirió en United States
Biochemicals Corporation. Poli A+ ARN humano se adquirió en
Clontech. SeaPlaque GTG agarosa fue de FMC BioProducts. Las enzimas
de restricción fueron de New England Biolabs. Los demás reactivos
utilizados fueron de calidad de biología molecular. Los
oligonucleótidos se sintetizaron utilizando una instalación de
síntesis de ADN de Applied Biosystems 380B o 392 por el Departamento
de Botánica de la Universidad de Duke. Las membranas cargadas de
nilón (GeneScreen Plus) fueron de Dupont.
Se purificaron dos \mug de poli A+ ARN de ocho
tejidos humanos diferentes. Se realizó la electroforesis de estos
ARNm en un gel de agarosa al 1,2% en formaldehído desnaturalizado y
se transfirió a una membrana de nilón modificada con carga seguido
de fijado por irradiación UV. La membrana se hibridó previamente en
formamida al 50%, NaPO_{4} 0,25 M (pH 7,2), NaCl 0,25 M, EDTA 1
mM, SDS al 7% y polietilenglicol al 5% (peso molecular 8000). La
transferencia se hibridó en el mismo tampón durante la noche a 60ºC
con 1 \times 10^{6} cpm/ml de ARN de EC-SOD
marcado con [^{32}P] generado por transcripción del ADNc completo
utilizando T_{3} ARN polimerasa en presencia de
[\alpha-^{32}P]CTP. La transferencia se
lavó en NaPO_{4} 0,25 M (pH 7,2), SDS al 1% y EDTA 1 mM a 75ºC
seguido de un segundo lavado utilizando Na_{3}PO_{4} 0,04 M (pH
7,2), SDS al 1% y EDTA 1 mM a 75ºC durante 30 minutos. Esto fue
seguido de exposición a una película XAR-5
utilizando una pantalla intensificadora Lightening Plus a -70ºC. Se
exploró el autorradiograma utilizando un densitómetro láser LKB
Ultrascan XL y se cuantificaron por integración los picos utilizando
el integrador digital interno del densitómetro o cortando el pico de
un trazado de impresora y pesándolo.
Se realizó la transcripción inversa de 0,5 \mug
de poli A+ ARNm de corazón humano utilizando 2 pmoles de EC7,
oligonucleótido de la cadena complementaria específico del gen 5' de
EC-SOD
(5'-ATGACCTCCTGCCAGATCTCC-3'),
siguiendo un protocolo de GIBCO BRL (sistema 5' RACE). La
plantilla del ARN se degradó por adición de ARNasa H a 55ºC durante
10 minutos. El ADNc resultante se aisló utilizando un cartucho de
aislamiento giratorio glassMAX ADN (GIBCO BRL). El ADNc purificado
se puso a la cola de dC utilizando la desoxinucleotidil transferasa
terminal (TdT, 0,5 unidades/\mul). 200 \muM de dCTP,
Tris-HCl 10 mM (pH 8,4), KCl 25 mM, MgCl_{2} 1,25
mM y 50 \mug/ml de albúmina de suero bovino durante 10 minutos a
37ºC. El TdT se inactivo térmicamente durante 10 minutos a 70ºC.
Los productos de esta reacción se ampliaron a
continuación por PCR utilizando el cebador "de anclaje" (GIBCO
BRL), que se híbrida con la cola homopolimérica y EC4
(oligonucleótido de cadena complementaria específico del gen 5' de
EC-SOD interno anidado,
5'-AGGCAGGAACACAGTAGC-3'). Como
alternativa, los productos de cola en dC se amplificaron por PCR
utilizando EC7 y HECl, cebador específico del gen de
EC-SOD de cadena transcrita,
5'-TGGGTGCAGCTCTCTTTTCAGG-3'). La
composición final de la reacción incluía Tris-HCl 20
mM (pH 8,4), KCl 50 mM, MgCl_{2} 2,5 mM, 100 \mug/ml de albúmina
de suero bovino, cebador de anclaje 400 nM, cebador específico de
genes 200 nM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP.
Después de incubar la reacción PCR durante 5 minutos a 94ºC, se
añadió amplitaq (Perkin Elmer Cetus) a una concentración final de
0,04 unidades/\mul. Se realizó la ciclación por PCR en un Perkin
Elmer 9600 durante 35 ciclos con fusión a 94ºC durante 45 segundos e
hibridación a 53ºC durante 15 segundos y extensión a 72ºC durante 90
segundos. Se utilizó ADNc de EC-SOD (6 ng) completo
como referencia positiva en la reacción PCR. Se realizó la
electroforesis de los productos de PCR en un gel de agarosa
SeaPlaque GTG al 2%, se transfirió a membranas de nilón cargadas por
el método de Southern (Southern, J. Mol. Biol. 98: 503
(1975)) utilizando el protocolo de transferencia alcalina (Reed
et al., Nuc. Acids Res.13: 7207 (1985)). El ADN se
fijó a la membrana calentándolo a 80ºC en una estufa de vacío
durante 2 horas. La transferencia posterior se hibridó a HEC2
marcado en el extremo [^{32}P] (cebador interno, específico de
EC-SOD anidado,
5'-TCCAGCTCCTCCAAGAGAGC-3') durante
la noche a 37ºC. Se lavó la transferencia a severidades crecientes
hasta que se eliminó la hibridación de fondo. Esto fue seguido de
exposición a película XAR-5 utilizando una pantalla
intensificadora Lightening Plus a -70ºC.
Se digirieron diez \mug de ADN genómico humano
con enzimas endonucleasas de restricción BamH I, EcoR I, Kpn I y Pst
I hasta la terminación. A continuación se realizó la electroforesis
del ADN en gel de agarosa al 1% y se transfirió a una membrana de
nilón cargada por la técnica de Southern (Southern, J. Mol. Biol.
98:503 (1975)), tras la desnaturalización alcalina (Reed et
al., Nuc. Acids Res. 13:7207 (1985)). El ADN se fijó a la
membrana por calentamiento a 80ºC en una estufa de vacío durante 2
horas. Se sintetizó ARNc de cadena complementaria de
EC-SOD humano marcado con [^{32}P]CTP
utilizando el ADNc de EC-SOD que se había
linealizado con Stu I. La transferencia se hibridó (500 \times
10^{3} cpm/ml) en formamida al 50%, NaPO_{4} 0,25 M (pH 7,2),
NaCl 0,25 M, EDTA 1 mM, SDS al 7% y polietilenglicol al 5% (peso
molecular 8000) a 50ºC. Tras hibridación toda la noche, se lavaron
en NaPO_{4} 0,25 M (pH 7,2), SDS al 2% y EDTA 1 mM seguido de
NaPO_{4} 0,04 M (pH 7,2), SDS al 1% y EDTA 1 mM a severidades
crecientes hasta que se minimizó la hibridación de fondo. La
transferencia e expuso en película XAR-5 utilizando
la pantalla intensificadora Lightening Plus a -70ºC.
Se adquirió en Clontech una genoteca de leucocito
de mujer adulta construida en el vector EMBL-3. Se
cribaron aproximadamente 1 \times 10^{6} pfu a una densidad de
\sim50.000 pfu/placa utilizando ARNc de EC-SOD
humano marcado con [^{32}P] CTP (1 \times 10^{6} dpm/ml). Las
pantallas primaria a la terciaria identificaron aproximadamente 7
supuestas placas positivas únicas. Se aislaron placas individuales y
se purificó el ADN lambda utilizando adsorbente de fago LambdaSorb
(Promega Biotec). El tamaño del ADN de inserción de cada clon se
evaluó mediante la digestión con endonucleasa de restricción Sal I
seguido de electroforesis en agarosa al 0,7%. Los clones
seleccionados experimentaron cartografía de endonucleasa de
restricción extensa. Basándose en los resultados de la cartografía
de restricción y en la hibridación asimétrica que utiliza
oligonucleótidos de EC-SOD de hibridación en 5' y
3', se seleccionó el clon nº 7 para todos los análisis de la
secuencia de ADN ulteriores. El clon nº 7 contiene un fragmento de
18 a 20 kb aproximadamente.
La estrategia general utilizada para el
secuenciado del clon nº 7 se ilustra en la Figura 20. Se subclonaron
fragmentos de ADN de endonucleasa de restricción de varios tamaños
procedentes del clon nº 7 en el ADN del vector pGEM3Zf (+). Se
empleó el método de secuenciado didesoxi que utiliza ADN de doble
cadena (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular
Biology, Green Publishing Assoc. y Wiley Interscience, Nueva
York (1992)) como plantilla y enzima Sequenasa (United States
Biochemicals) (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 74: 5463 (1977)). Se utilizaron cebadores de secuenciado
tanto Universal como -40 M13 para iniciar el secuenciado del ADN
para cada fragmento subclonado. Los oligonucleótidos procedentes de
estos datos del secuenciado inicial se sintetizaron aproximadamente
cada 250 pares de bases hasta que se obtuvo la secuencia completa
del nucleótido. Los datos de secuenciado se obtuvieron a partir de
ambas cadenas como se muestra en la Figura 20B excepto en la
posición 3' del gen en que la secuencia de ADN se obtuvo en una
cadena solamente.
Se utilizó el programa IntelliGenetics geneworks
(versión 2.2) para organizar los datos de la secuencia del ADN. La
investigación de la homología se realizó en el NCBI utilizando el
servicio de red BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol.
215: 403 (1990)) y la base de datos de la secuencia de
nucleótidos no redundante (GenBank (77.0) + EMBL (35.0) + EMBLUpdate
+ GBUdate). Se realizó la investigación de la base de datos del
factor de transcripción utilizando tanto el algoritmo SIGNAL SCAN
3.0 (Prestridge et al., CABIOS 9:113 (1993)) como el programa
FINDPATTERNS del paquete GCG (V 7.2) utilizando la edición 6.3 de la
base de datos del factor de transcripción (Gosh, Nuc. Acids Res.
18:1749 (1990)). Para una predicción de la zona de escisión del
péptido señal, se emplearon los programas SIGSEQ1 (Folz et
al., J. Biol. Chem. 261:14752 (1986)) y SIGSEQ2 (Folz
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 146:870
(1987)).
Para investigar la expresión de
EC-SOD humano, se fraccionó poli A (+) ARNm
procedente de ocho tejidos humanos diferentes en un gel de agarosa
desnaturalizado y se transfirió a una membrana de nilón cargada.
Debido a que un artículo anterior dio cuenta de tiempos de
exposición prolongados a fin de identificar las bandas específicas
de EC-SOD durante el análisis de Southern genómico
(Hendrickson et al., Genomics 8:736 (1990)), se
utilizó una sonda de ARNc de cadena complementaria radiomarcado
procedente de ADNc completo de EC-SOD humano (Oury
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9715 (1992)).
Una banda discreta de aproximadamente 1,4 kb puede observarse en los
ocho tejidos humanos analizados (Figura 21A). Además, el músculo
esquelético contiene un mensaje aproximado de 4,2 kb, no detectado
en los demás tejidos. Por exploración densitométrica de las bandas
de 4,2 y 1,4 kb, se puede calcular que el mensaje mayor para
preparar aproximadamente 32% del mensaje total de
EC-SOD de músculo esquelético. En el cerebro, se
puede apreciar una banda muy simulada de 2,2 kb. Esta banda era
demasiado débil para la cuantificación por el densitómetro de láser.
La cuantificación de estas bandas se realizó por densitometría de
láser así como la integración de los picos de los autorradiogramas
obtenidos en el intervalo lineal de exposición (Figura 21B). Tras la
normalización en el cerebro, el corazón presentó la mayor parte de
expresión con 10,1 veces la del cerebro. Esto fue seguido de la de
la placenta, páncreas y pulmón que dieron 13,6, 10,2 y 7,5,
respectivamente. La expresión en el músculo esquelético fue de 4,7
para la banda de 1,4 kb o de 6,9 tanto para el mensaje de 1,4 kb
como para el de 4,2 kb, mientras que el riñón y el hígado dieron una
expresión de 6,3 y 4,1 veces sobre la del cerebro. Estos modelos de
expresión han sido reproducidos basándose en sondar una
transferencia Northern de tejido múltiple adicional independiente.
Las bandas son específicas basadas en las severidades relativamente
altas de lavado y de los datos utilizando un ARNc de
EC-SOD de cadena transcrita como sonda que no
presentó ninguna hibridación en las condiciones dadas.
Inicialmente, se ensayó la cartografía de la zona
de iniciación de la transcripción utilizando el método de extensión
del cebador. Utilizando varios 5' oligonucleótidos diferentes
marcados en el extremo y poli A+ ARNm tanto de pulmón humano como de
corazón humano así como ARN total aislado de fibroblastos de
prepucio humano, no se obtuvo una señal positiva incluso tras
periodos de exposición prolongados. Esto no pareció ser debido a la
técnica ya que no fue posible obtener señales positivas utilizando
ARN generado por transcripción in vitro del ADNc de
EC-SOD. No está claro si la falta de éxito
utilizando esta técnica fue debida a muy poca abundancia de ARNm que
codifica a EC-SOD o algún otro problema o problemas.
Trabajando bajo la suposición de una baja abundancia de ARNm, se
ensayó la técnica de ampliación rápida de los extremos del ADNc a
fin de ampliar por PCR esta señal. Tal como se muestra en la Figura
22 se utilizó cebador EC7 específico del gen de
EC-SOD para la hibridación y la transcripción
inversa de poli A+ ARNm de corazón humano. La mitad de esta reacción
fue en la cola 3' dC utilizando desoxinucleotidil transferasa
terminal y la mitad restante sin utilizarla. Estas plantillas se
sometieron a continuación a ampliación por PCR utilizando los
cebadores HEC1 + EC7 específicos del gen así como el cebador de
anclaje + EC4. Los productos de estas reacciones se fraccionaron por
electroforesis con agarosa, se transfirieron a membrana de nilón y
se sondaron con el cebador HEC2 específico del gen interno anidado.
En la Figura 22A se presenta un autorradiograma de este experimento.
Utilizando ADNc de EC-SOD como plantilla de
referencia y HEC1 + EC7, es de esperar una banda de 217 bp (banda 3
de la Figura 22A). Como es de esperar que los cebadores HEC1 y EC7
se amplíen independientemente de la cola de dC, se observan bandas
de igual intensidad en las bandas 4 y 5, que son también del mismo
tamaño que la referencia EC-SOD. Utilizando el
cebador de anclaje (que se híbrida con la cola dC) y EC4, se observó
únicamente una banda de \sim190 bp (banda 1). Como la plantilla no
era de cola poli C, como era de esperar la banda 2 no presenta
ninguna señal. Sustrayendo 48 bp (tamaño del cebador de anclaje), el
tamaño del ADN transcrito a la inversa correspondería con 5' de
\sim136 bp del cebador EC4. Este análisis preveía que existe
aproximadamente 6 pares de bases de secuencia 5' adicional en el
clon de ADNc y que la iniciación de la transcripción comienza
aproximadamente 6 bp corriente arriba del primer intrón (indicado
por una casilla de puntos). Aunque la iniciación de la transcripción
eucariótica comienza normalmente en el resto de adenosina, es de
esperar que comience en una G (Breathnach et al., Ann.
Rev. Biochem. 50: 349 (1981)).
Para comenzar a caracterizar el gen de humano
EC-SOD, se digirieron con restricción 10 \mug del
ADN genómico humano total y los productos de reacción se sometieron
a electroforesis en un gel de agarosa seguido de transferencia a una
membrana de nilón. La transferencia se sondó con un ARNc de
EC-SOD parcial marcado con [^{32}P]. En la Figura
23 se muestra un autorradiograma de esta transferencia. Como se
puede apreciar para cada banda, existen bandas únicas asociadas a
cada digesto de restricción. No se observaron bandas sombreadas que
podrían sugerir pseudomonas. Cuando se utilice una sonda de ARNc
completo para ADN digerido con Kpn I, se observa una banda adicional
de \sim4000 bp que corresponde al extremo 3' del gen. Además, la
banda Kpn I presenta una banda de 0,5 kb que se observó mejor en
otras transferencias. Este modelo de banda fue similar a una
cartografía de restricción del clon EC-SOD humano nº
7 (véase la Figura 20A).
Se identificaron clones positivos independientes
múltiples procedentes de una genoteca de linfocitos adultos humanos
construida en EMBL-3. Estos clones experimentaron
cartografía de endonucleasa de restricción extensa y se sondaron con
oligonucleótidos 5' y 3' específicos de EC-SOD para
determinar la orientación relativa de las inserciones. Basándose en
estos resultados, se seleccionó el clon nº 7 para análisis ulterior.
El clon nº 7 es aproximadamente de 18 a 20 kb y contiene por lo
menos 5000 bp de ADN que flanquean a 5' y por lo menos 4000 bp de
ADN que flanquean a 3'. En la Figura 20B se presenta la cartografía
de restricción del clon nº 7. Esta cartografía es similar a los
resultados obtenidos con los datos del análisis de transferencia
Southern genómicos que indican que el clon nº 7 contiene el gen de
EC-SOD. En la Figura 20A se presenta la estrategia
para subclonar y secuenciar el clon nº 7. Se subclonaron fragmentos
de restricción contiguos y solapantes de varios tamaños en el vector
del plásmido pGEM32f(+) (Figura 20B). Se secuenciaron las
inserciones de ADN en ambas cadenas utilizando una combinación de
cebador migratorio y de vector específico, cebadores universales de
secuenciado. Se secuenció la mitad 3' de la inserción 7K36 solamente
en una cadena. Los datos de secuencia publicados para el ADNc de
EC-SOD humano (Hjalmarsson et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84: 6340 (1987)) así como la información de
la secuencia de ADN obtenida a partir de un clon independiente de
ADNc que contenía datos adicionales no traducidos de 5' (Hendrickson
et al., Genomics 8:736 (1990)) se utilizaron para
determinar la estructura genómica del intrón/exón. Basándose en una
comparación de estos datos con la información de la secuencia
genómica, se determinó el gen de EC-SOD humano que
contenía tres exones y dos intrones (Figura 20C). El exón 1 contiene
por lo menos 5 pares de bases y es probablemente mayor (por
aproximadamente 6 pares de bases), ya que el comienzo exacto de la
iniciación de la transcripción no se determinó (nota a
continuación). El exón 2 contiene 84 bp y se separa del exón 1
mediante una secuencia de intervención de 572 bp marcada como intrón
1. El exón 3 se separa del exón 2 mediante el intrón 2, un segmento
de 3849 bp. El exón 3 contiene un total de 1336 bp y a 17 bp en este
exón se inicia el comienzo de la secuencia de codificación completa
para preEC-SOD (Figura 20D). Esto comprende un
péptido de señal de 18 aminoácidos que precede a la secuencia de la
proteína madura de 222 aminoácidos. No existen intrones que separen
los diversos dominios estructurales de EC-SOD. Estos
dominios se presentan esquemáticamente en la Figura 20D y comprenden
1 a 95 aminoácidos que contienen un Asn-89
glucosilado y no presentan homología de secuencia con otras
proteínas. Los restos 96 a 193 presentan homología acusada con las
secuencias de la proteína CuZn-SOD con preservación
de aminoácidos críticos importantes en la catálisis y estructura de
la enzima. Los aminoácidos 194 a 222 contienen múltiples restos
cargados que se ha demostrado que son importantes en la unión a los
proteoglucanos sulfatados. Se secuenciaron además 558 bp de la zona
flanqueante a 5' que contiene supuestos elementos reguladores y 3675
bp de la zona que flanquea a 3'. Los datos de la secuencia de ADN
exógenos están de acuerdo con la secuencia de ADNc publicada
(Hjalmarsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:6340 (1987)). En la Tabla VIII se presentan los límites
intrón-exón y conforme a la secuencia de corte y
empalme eucariótica de consenso (Senapathy et al., Methods
Enzymol. 183: 252 (1990)). Ambos intrones dividen las secuencias
en la zona 5' no traducida del gen de
EC-SOD.
EC-SOD.
El tamaño de los intrones y exones se presenta en
pares de bases (bp). Las letras de la casilla superior indican la
secuencia del exón mientras que las letras de la casilla inferior
indican la secuencia del intrón. Las uniones de corte y empalme se
presentan de acuerdo con las secuencias de consenso publicadas
anteriormente para las uniones de corte y empalme (Senapathy et
al., Methods Enzymol. 183: 252 (1990)).
\vskip1.000000\baselineskip
| Donante | Tamaño del intrón (bp) | Aceptor | Exón | ||
| TGCGGG | gt ggac | 572 | gccc ag | GCTCCA | 84 |
| GGAAAG | gt gggt | 3549 | ccgc ag | GTGCCC | 1336 |
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 24 presenta la secuencia completa para
el gen de EC-SOD humano. Las secuencias exónicas se
presentan en letras contenidas en la casilla superior mientras que
la secuencia intrónica que flanquea a 5' y 3' se presenta en la
casilla inferior. El exón 3 que contiene la zona de codificación
completa ininterrumpida para EC-SOD y la secuencia
de la proteína se presentan utilizando el código de aminoácidos de
una sola letra. El péptido con señal de 18 aminoácidos y la
secuencia de la proteína madura de 222 aminoácidos se resaltan. La
identificación del punto de escisión del péptido con señal es
coherente con los algoritmos por ordenador que predicen el punto de
escisión del péptido con señal eucariótico (Folz et al.,
Biochem. Biophys. Res. Comm. 146: 870 (1987)); Von Heijne,
Eur. J. Biochem. 133: 17 (1983)).
Se utilizó la investigación de la base de datos
del factor de transcripción para identificar supuestamente los
elementos reguladores de la transcripción. Aunque casi todos los
activadores eucarióticos utilizan un elemento con la secuencia TATA
para fijar la posición de iniciación de la transcripción, no puede
discernirse una secuencia TATA obvia para el gen de
EC-SOD. Se identificaron dos elementos con secuencia
CAAT. Uno está en orientación opuesta y situado aproximadamente 20
bp corriente arriba del primer exón, mientras que el segundo puede
hallarse aproximadamente 335 bp corriente arriba. Se presenta la
supuesta señal para la poliadenilación y se indica el punto de poli
A adenilación. La investigación de la base de datos del factor de
transcripción de la zona no traducida de 5' y el primer intrón
identificaron varios elementos reguladores potenciales. Un elemento
sensible a AMPc (CREB) (TGACGT) que es similar al elemento del virus
de transcripción del adenovirus (ATF) puede encontrarse partiendo en
121 bp (Fink et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:
6662 (1988); Sassone-Corsi Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85: 7192 (1988)). La mitad de la zona para el elemento
glucocorticoide de respuesta (GRE) (TGTCCT) está situado a 370 bp
(Karin et al., Nature 308: 513 (1984)). Un elemento de
respuesta del factor de transactivación específico del músculo
esquelético (M-CAT) (CATTCCT) se encuentra al
comienzo de la orientación opuesta en la posición 238 (Mar et
al., Mol. Cell. Biol. 10: 4271 (1990)). Dentro del primer
intrón en la posición 1085 bp se encuentra un elemento sensible
xenobiótico (XRE) (CACGCW) (Rushmore et al., J. Biol.
Chem. 265: 14648 (1990)). En la posición 89 se encuentra un
elemento metálico regulador (MRE) (TGCRCYC) (Culotta et al.,
Mol. Cell. Biol. 9: 1376 (1989)). En la posición 650 y 5022
se encuentran dos supuestos elementos antioxidantes de respuesta
(ARE) (RGTGACNNNGC) (Rushmore et al., J. Biol. Chem.
266: 11632 (1991)). En la posición 251 en orientación opuesta se
encuentra un elemento sensible a sis (SIF) (CCCGTC) importante para
la producción del protooncogén c-fos (Wagner et
al., EMBO J. 9: 4477 (1990)). Existe una zona de unión a
AP1 o un elemento sensible a TPA (TRE) (TGACTCA) descubierto en la
posición 162 (Risse et al., EMBO J. 8: 3825 (1989)).
La zona AP4 del potenciador SV40 (CAGCTGTGG) puede encontrarse en la
posición 171 (Jones et al., genes Dev. 2: 267
(1988)).
\newpage
Ejemplo
VI
(Únicamente como
referencia)
Preparación de ADN genómico procedente de
leucocitos de pacientes: Se identificarán pacientes de
referencia sanos normales y pacientes con asma, hipertensión
pulmonar primaria e hipertensión pulmonar secundaria. Se purificará
ADN genómico utilizando un kit Qiagen Blood PCR. Se extraerá un ml
de sangre que contiene \sim10^{7} leucocitos/ml en citrato de
sodio de cada paciente o individuo de referencia. La sangre se
coloca en una columna Qiagen-spin y los leucocitos
se atrapan en la resina por breve centrifugación, mientras que los
eritrocitos y la hemoglobina se lavan completamente. Los leucocitos
se lisan mediante la adición de 0,7 ml de tampón de lisis y se
incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos. El ADN que se
libera, se une a la resina en el tubo. El residuo celular restante
es arrastrado mediante múltiples ciclos de lavado/centrifugado. El
ADN es eluido por elución de KCl 1,2 M, MPOS 50 mM, etanol al 15%,
pH 8,3. Esto da normalmente \sim10 \mug de ADN genómico
(Reihsaus et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol.
8:334 (1993)).
Diseño del cebador y ampliación por PCR de
secuencias exónicas de EC-SOD: Se diseñarán
cebadores de oligonucleótido de cadena transcrita y de cadena
complementaria (o la utilización de cebadores ya obtenidos a partir
del secuenciado del ADN genómico) que contienen una grapa 3'GC
(Sheffeld et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 232
(1989)). Estos cebadores codificarán la zona de codificación sin
intrón del gen EC-SOD. Una zona de 172 bp en la zona
3' no traducida ha sido ampliada utilizando cebadores de secuenciado
de ADN y ADN genómico humano. Las condiciones de la PCR son tal como
se describe (Reihause et al., Am. J. Respir. Cell. Mol.
Biol. 8:334 (1993); Innis et al. (eds.) Academic Press
San Diego págs. 1-12 (1990)) utilizando Taq
polimerasa, con el ciclo de temperatura siguiente: desnaturalización
inicial a 95ºC durante 5 minutos seguida de 35 ciclos de
desnaturalización a 94ºC durante 20 segundos, hibridación a 57ºC
durante 15 segundos y alargamiento a 72ºC durante 45 s. Debido a la
composición de GC y de la secuencia del cebador existente, será
necesario optimizar experimentalmente las condiciones para la
ampliación por PCR utilizando cada serie de cebadores. Se utilizarán
tres series de cebadores para abarcar la zona de codificación
completa.
Identificación de mutaciones con el análisis
de polimorfismo conformacional de una sola cadena (SSCP): Se ha
utilizado el análisis SSCP para detectar una sola incompatibilidad
de un par de bases (Orita et al., Genomics 5: 874
(1989)). Se utilizará la electroforesis en gel con gradiente de
temperatura (TGGE) para detectar las diferencias de movilidad
(Wartell et al., Nuc. Acids Res. 18: 2699 (1990)). Se
prepararán muestras para TGGE mediante desnaturalización térmica del
producto por PCR a 98ºC durante 5 minutos, a continuación
renaturalización a 50ºC durante 15 minutos con el correspondiente
ADN natural procedente de la PCR del gen clonado. Se realizará la
electroforesis en un gel de urea 8 M, acrilamida al 5% durante un
gradiente de temperatura. Se optimizará el gradiente de temperatura
para cada uno de los segmentos del ADN de EC-SOD.
Los gradientes típicos para la detección de las mutaciones del
receptor \beta_{2}-adrenérgico estaban
comprendidos entre 35ºC y 60ºC y necesitaron de 4 a 6 horas de
tiempo de ejecución (Rosen, Nature 262:59 (1993)).
Todas las muestras de PCR encontradas que eran
positivas a las mutaciones por TGGE se secuenciarán directamente
utilizando la técnica didesoxi (Sanger et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 74: 5463 (1977)).
Ejemplo
VII
En un primer estudio, se realizaron análisis en
una cubeta de cuarzo de 1 ml que contenía tampón de carbonato 50 mM,
pH 10, EDTA 0,1 mM, xantina oxidasa 1 nM (Boehringer Mannheim) a
25ºC. Se midió por espectrofotometría la actividad de la xantina
oxidasa siguiendo la pérdida de xantina a lo largo del tiempo a 295
nm. Se utilizaron cuatro concentraciones de xantina (25, 50, 250 y
500 \muM) y dos concentraciones de MnTBAP (5 y 10 \muM). Las dos
constantes de inhibición se obtuvieron a continuación de las
ordenadas en el origen de la curva (Kii=5,5 \muM) y de las
pendientes (Kis=15 \muM). Los resultados presentados en la Figura
25 demuestran que MnTBAP inhibe la xantina oxidasa de manera no
competitiva.
En un segundo estudio, los cultivos de células
endoteliales de la arteria pulmonar de ternera
(CPA-47 (Tissue and Cell 10:535 (1978)) se
cultivaron hasta confluencia en medio F-12K de Ham
con suero bovino fetal al 10% a pH 7,4 y 37ºC. Se trataron las
células a continuación con tripsina y se sembraron a densidades
iguales en placas de 24 pocillos y se cultivaron hasta confluencia
del 90%. Se lavaron las células y se preincubaron durante 1 hora con
50 \muM de MnTBAP en medio esencial mínimo (MEM) o MEM únicamente.
Se añadieron cantidades variables de xantina oxidasa (XO) más
xantina (X) 200 \muM y se dejaron incubar durante 24 horas. Se
cuantificó el daño celular midiendo la liberación de lactato
deshidrogenasa celular (LDH) en el medio. En la Figura 26 se
presenta la eficacia de MnTBAP mediante la disminución de la
liberación de LDH producida por XO/X.
\newpage
Ejemplo
VIII
Se cultivaron cultivos de células epiteliales
pulmonares de rata (L2 (Kaighn y Douglas J. Cell Biol. 59:
160a (1973)) hasta confluencia en medio F-12K de Ham
con suero bovino fetal al 10% a pH 7,4 y 37ºC. Se trataron a
continuación las células con tripsina y se sembraron a densidades
iguales en placas de 24 pocillos y se cultivaron hasta confluencia
del 90%. Se lavaron las células y se preincubaron durante 1 hora con
100 \muM de MnTBAP o MnTMPyP en MEM o MEM solamente. Se añadió
Paraquat (2,5 mM) y se dejó incubar durante 48 horas. Se
cuantificó el daño celular midiendo la liberación de lactato
deshidrogenasa celular (LDH) en el medio. La Figura 27 demuestra que
MnTPyP (barras con trama) y MnTBAP (barras grises) disminuyen la
liberación de LDH producida por Paraquat.
En otro estudio, los cultivos de células
endoteliales de la arteria pulmonar de ternera
(CPA-47 (Tissue and Cell 10:535 (1987)) se
cultivaron hasta confluencia en medio F-12K de Ham
con suero bovino fetal al 10% a pH 7,4 y 37ºC. Se trataron a
continuación las células con tripsina y se sembraron a densidades
iguales en placas de 24 pocillos y se cultivaron hasta confluencia
del 90%. Se lavaron las células y se preincubaron durante 1 hora con
concentraciones variables de MnTBAP en MEM o MEM solamente. Se
añadió Paraquat (2 mM) y se dejó incubar durante 24 horas. Se
cuantificó el daño celular midiendo la liberación de lactato
deshidrogenasa celular (LDH) en el medio. MnTBAP disminuye la
liberación de LDH producida por Paraquat en función de la dosis
(véase la Figura 28).
En contraste con MnTBAP, ZnTBAP no protege contra
la lesión producida por Paraquat. Los cultivos de células
endoteliales de la arteria pulmonar de ternera
(CPA-47 se cultivaron hasta confluencia en medio
F-12K de Ham con suero bovino fetal al 10% a pH 7,4
y 37ºC. Se trataron a continuación las células con tripsina y se
sembraron a densidades iguales en placas de 24 pocillos y se
cultivaron hasta confluencia del 90%. Se lavaron las células y se
preincubaron durante 1 hora con concentraciones variables de ZnTBAP
en MEM o MEM solamente. Se añadió Paraquat (2 mM) y se dejó incubar
durante 24 horas. Se cuantificó el daño celular midiendo la
liberación de lactato deshidrogenasa celular (LDH) en el medio. Los
resultados presentados en la Figura 29 demuestran que ZnTBAP no
posee actividad similar a SOD. ZnTBAP puede utilizarse como
referencia negativa para demostrar que el metal redox es importante
en la protección contra la toxicidad por Paraquat.
Ejemplo
IX
Se trataron ratones con Paraquat (PQ, 45 mg/kg,
ip) o con solución salina (10 ml/kg, ip) y se expusieron a MnTBAP
(2,5 mg/ml, nebulizado en una cámara de 2 l a razón de 2 l/min
durante 30 minutos dos veces al día durante 2 días) o al aire
ambiente. Se sacrificaron los ratones 48 horas después del comienzo
del tratamiento y se evaluó la lesión pulmonar mediante análisis del
fluido de lavado broncoalveolar (BALF). Los marcadores de alteración
del BALF utilizados fueron lactato de deshidrogenasa (LDH, en
unidades/l), la concentración de proteína (en mg/dl) y el porcentaje
de leucocitos mononucleares (PMN). El tratamiento con MnTBAP
proporcionó protección parcial contra la lesión pulmonar producida
por Paraquat (véase la Figura 30).
Ejemplo
X
Se midió la actividad de la catalasa mediante un
electrodo de oxígeno de Clark utilizando un análisis modificado
previamente descrito por Del Río et al., Anal. Biochem.
80: 409 (1977). En resumen, se llevaron a cabo reacciones en un
tampón de fosfato desgasificado con nitrógeno (50 mM, pH 7,8) que
contenía EDTA 0,1 mM a 25ºC. Se utilizaron tres concentraciones de
peróxido de hidrógeno (1 a 4 mM) y cuatro concentraciones de
metaloporfirina (0,5 a 50 \muM) para determinar las constantes de
velocidad de segundo orden. Se siguió la evolución de la velocidad
del oxígeno durante 2 minutos. Los resultados se presentan en la
Figura 31.
Se cultivó la línea celular endotelial pulmonar
de ternero (CPA-47) para aproximarse a la
confluencia en placas de 12 pocillos con medio F-12K
que contenía suero de ternero fetal al 10%. Se cargaron células
CPA-47 con Cr^{51} tal como describió
anteriormente Simon et al. J. Clin. Invest. 78:1375
(1986) en medio esencial mínimo con alto contenido de glucosa
(DMEM). Se pretrataron las células con MnTBAP (100 \muM) durante 1
hora y a continuación se expusieron a varias concentraciones de
generador de peróxido de hidrógeno, glucosa oxidasa, durante 4
horas. Se cuantificó a continuación la lesión celular como la
liberación específica de Cr^{51} de las células
CPA-47 que se habían ajustado para la liberación
espontánea de Cr^{51}. Los resultados se presentan en la Figura
32.
Se cultivó la línea celular endotelial pulmonar
de ternero (CPA-47) para aproximarse a la
confluencia en placas de 12 pocillos con medio F-12K
que contenía suero de ternero fetal al 10%. Se cargaron células
CPA-47 con Cr^{51}tal como describió anteriormente
Simon et al. J. Clin. Invest. 78:1375 (1986) en medio
esencial mínimo con alto contenido de glucosa (DMEM). Se pretrataron
las células con varias concentraciones de: (A) MnTBAP; (B) MnTMPyP;
(C) ZnTBAP; o (D) CuZnSOD durante 1 hora y a continuación se
expusieron al generador de peróxido de hidrógeno, glucosa oxidasa
(100 Mu/ml), durante 4 horas. Se cuantificó a continuación la lesión
celular como la liberación específica de Cr^{51} de las células
CPA-47 que se habían ajustado para la liberación
espontánea de Cr^{51}. Los resultados se presentan en las Figuras
33A a 33D.
Ejemplo
XI
Cultivo tisular: Se prepararon cultivos
neuronales y gliales mezclados a partir de cortezas cerebrales de
rata embriónica de 18 días (Sprague-Dawley, Zivic
Miller). En resumen, se diseccionaron las cortezas cerebrales y se
disociaron enzimáticamente mediante incubación en solución salina
equilibrada de Hank exenta de Ca^{++} y mg^{++} (HBSS)
enriquecida con HEPES 10 mM y tripsina al 0,25% durante 20 min. a
37ºC. El tejido se enjuagó y se dispersó en suspensión de una sola
célula mediante el paso suave a través de una pipeta Pasteur
esterilizada al fuego. Se centrifugó la suspensión celular y se
volvió a poner en suspensión en medio esencial mínimo (MEM), que
contenía sales de Earle enriquecidas con 3 g/l de glucosa, suero de
caballo al 5% y suero de ternero fetal al 5% (medio de cultivo). Las
células se colocaron en placas multipocillo recubiertas con
poli-D-lisina: placas de 12 pocillos
para la medición de la aconitasa y placas de 24 pocillos para los
experimentos de toxicidad. Las células se mantuvieron a 37ºC en un
incubador humidificado con CO_{2} al 5%/aire al 95% en medio de
crecimiento. El medio no se sustituyó a fin de reducir el
sobrecrecimiento glial y la pérdida neuronal. Se utilizaron células
maduras (14 a 17 días in vitro) para todos los
experimentos.
Tratamiento de las células: Se sustituyó
el medio de cultivo con MEM enriquecido con glucosa 25 mM
(MEM-g). Para ambos estudios de neurotoxicidad y de
medición de aconitasa, se incubaron las células en el tratamiento
diseñado para la duración indicada a 37ºC. A menos que se
especifique de otro modo, los antagonistas o miméticos de SOD se
añadieron 15 min. antes de los agonistas. Para la medición de la
neurotoxicidad, las células se incubaron con tratamientos durante 18
h a 37ºC en MEM-g. Para evaluar la capacidad de los
antagonistas para inhibir la toxicidad aguda por NMDA o rescate de
las células de una agresión por NMDA continua, se utilizó un
paradigma alternativo de tratamiento de NMDA además del descrito
anteriormente. En este paradigma, el medio de cultivo fue sustituido
por HBSS^{-} (solución salina equilibrada de Hank exenta de Ca^{-
-} y mg^{- -} enriquecida con CaCl_{2} 2 mM, NaHCO_{3} 1 mM,
HEPES 10 mM y glicina 5 \muM), las células se trataron con el
vehículo o con NMDA 100 \muM durante 15 min. tras lo cual se
sustituyó HBSS^{+} por MEM-g y las células se
retornaron a la incubadora durante 18 h más. Se añadieron
antagonistas o miméticos de SOD a las células 15 min. antes de la
exposición a NMDA o 15, 30 ó 60 min. después de la sustitución media
final. Para la determinación de la dependencia a Ca^{- -}, se
incubaron las células en HBSS^{-} sin añadir Ca^{- -}. Cuando se
utilizó el kainato (KA) como agonista, se incluyó de forma rutinaria
D-APV 100 \muM para bloquear la activación del
receptor secundario de NMDA. Se incluyó siempre catalasa (100 u/ml)
cuando se utilizó xantina más xantina oxidasa (X+XO) como
tratamiento para regular la contribución del peróxido de
hidrógeno.
Estudios de neurotoxicidad: Se determinó
la neurotoxicidad mediante el tratamiento de la LDH liberada en el
medio sobrenadante tal como se describió anteriormente (Patel et
al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 115: 124 (1991) y
Neurotoxicology14: 35 (1992)). Se midió LDH por el método de
la lactato deshidrogenasa de Vassault. En: Methods of Enzymatic
Analysis, Bergmeyer HU (ed), Verlag Chemie, Weinheim, págs.
118-126 (1983). Además, se confirmó la muerte
celular con el homodímero de etidio-1
(EthD-1). En resumen se lavaron las células con
HBSS, se cargaron con EthD-1 20 \muM durante 30
min., se enjuagaron y se observaron a través de lentes de
fluorescencia. El número de células muertas marcadas con
EthD-1 se contaron en 4 a 6 campos seleccionados al
azar, se promediaron los números para dar una estimación de la
muerte celular y el experimento se repitió 3 veces.
Medición de aconitasa: Para la medición de
aconitasa, siguiendo el tratamiento con agentes, se eliminó el medio
y se lisaron las células en Tris/HCl 50 mM enfriado en hielo, pH 7,4
que contenía MnCl_{2} 0,6 mM, L-cisteína 1 mM,
citrato 1 mM y Triton-X 100 al 0,5%. Se midió por
espectrofotometría la actividad de la aconitasa de los lisados
celulares controlando la formación de cis-aconitato en
isocitrato a 240 nm en Tris/HCl 50 mM, pH 7,4, que contenía
MnCl_{2} 0,6 mM e isocitrato 20 mM a 25ºC (Kreb y Holzach,
Biochem. J. 52: 527 (1952); Gardner y Fridovich, J. Biol.
Chem. 267: 8757 (1992)). Se reactivó la aconitasa inactiva
mediante una incubación de 30 min. de los lisados de las células
corticales (90 \mul) con DTT 0,5 M (10 \mul), Na_{2}S 20 mM
(1 \mul) y sulfato ferroso amónico 20 mM (1 \mul) en Tris/HCl 50
mM, pH 8,0 a 37ºC. Se inhibió la actividad de la aconitasa en los
lisados de las células corticales mediante ferricianuro de potasio
0,1 mM o hirviendo la muestra.
Análisis estadístico: Se utilizó análisis
de varianza de una vía (ANOVA) para comparar tres o más tratamientos
y el ensayo de Dunnet para comparar los grupos de tratamiento
múltiples con un grupo de referencia. Se utilizó el ensayo de
comparaciones múltiples de Tukey-Kramer para
detectar las diferencias entre los tratamientos. Se utilizó la
prueba de la t de Student para la comparación de dos
tratamientos.
Validación de la actividad de la aconitasa
como marcador de la formación del radical O_{2}^{-} en el
cultivo de células corticales: Con la utilización de agentes que
son conocidos por generar O_{2}^{-} (X+XO y PQ^{++}), se
determinó la actividad de la aconitasa como marcador válido de
O_{2}^{-}. Los generadores de O_{2}^{-} inactivaron de
manera selectiva y reversible la aconitasa y esto se realizó de este
modo de manera evitable por SOD.
La inactivación de la aconitasa producida por
PQ^{++}, NMDA y KA se correlaciona con la muerte celular: Se
trataron células corticales con concentraciones variables de KA,
NMDA y PQ^{++} durante 18 h. y se analizó la actividad de LDH en
el medio. Se trataron cultivos similares con concentraciones
variables de KA, NMDA o PQ^{++} durante 6, 1 ó 3 h.,
respectivamente y se analizó la actividad de la aconitasa en los
lisados celulares; se evaluó la actividad de la aconitasa durante un
periodo más corto de incubación porque la muerte de las neuronas
conduce a la inactivación irreversible de la actividad de la
aconitasa, debido supuestamente a la degradación de las proteínas.
Por consiguiente, se seleccionó un punto de tiempo anterior para
medir la actividad de la aconitasa basado en el tiempo de
aproximación del estado estacionario de la actividad reversible
(Fig. 34 A y B para NMDA 50 \muM y KA 300 \muM,
respectivamente).
El tratamiento con KA produjo disminuciones
proporcionadas en la actividad de la aconitasa y en la muerte
celular controladas por la liberación de LDH (Fig. 35 A). Asimismo,
el tratamiento con PQ^{++} produjo una disminución proporcional de
la actividad de la aconitasa y de la cantidad de liberación de LDH
(Fig. 35 B). A concentraciones mayores (30 a 1000 \muM), NMDA
produjo una disminución proporcional en la actividad de la aconitasa
y también de la muerte celular. Sin embargo, concentraciones bajas
(3 y 10 \muM) de NMDA produjeron la muerte celular (liberación de
LDH) pero no la inactivación detectable de la aconitasa (Fig. 35
C).
MnTBAP impide la inactivación de la aconitasa
y la muerte celular producida por PQ, NMDA y KA: Para determinar
si MnTBAP puede producir la inactivación de la aconitasa y la muerte
celular producida por NMDA, PQ^{++} y KA, se incubaron células
corticales con PQ^{++}, NMDA y KA en ausencia y presencia de
MnTBAP 200 \muM. PQ^{++}, NMDA y KA produjeron una disminución
del 70%, 40% y 42% en la actividad de la aconitasa después de 3, 1 y
6 h., respectivamente; MnTBAP 200 \muM inhibió de forma acusada
las disminuciones de actividad de la aconitasa mediadas por
PQ^{++}, NMDA y KA (Fig. 36 A). Efectos paralelos se pusieron de
manifiesto en la muerte celular medida por liberación de LDH. MnTBAP
(200 \muM) inhibió de forma marcada la muerte celular mediada por
PQ^{++}, NMDA y KA (Fig. 36 B). Los efectos de MnTBAP sobre la
muerte celular eran dependientes de la concentración (Fig. 36 B).
MnTBAP (200 \muM) produjo un desplazamiento hacia la derecha y
hacia abajo en la curva de respuesta a la concentración para NMDA,
proporcionando una protección completa a bajas concentraciones de
NMDA (Fig. 37).
La posibilidad de que MnTBAP impida simplemente
la activación de los receptores de NMDA o AMPA se examinó y se
eliminó.
Para consolidar la posibilidad de que MnTBAP
disminuya la inactivación de la aconitasa y evite la muerte celular
por su acción mimética de SOD, se examinaron los efectos del
congénere relacionado estructuralmente, ZnTBAP, con actividad de SOD
disminuida (es decir, 10 veces menos). Se utilizó
EthD-1 para cuantificar la muerte celular en estos
experimentos porque los estudios preliminares demostraron que ZnTBAP
interfería con la medición de LDH (se observó que MnTBAP no presenta
ningún efecto en la medición de LDH). Las curvas de respuesta a la
concentración para NMDA y KA demostraron una fuerte correlación
entre la muerte celular medida utilizando la liberación de LDA y las
células muertas cuantificadas por EhtD-1. Las curvas
de respuesta a la concentración dieron a conocer que MnTBAP
presentaba efectos neuroprotectores aumentados de manera acusada en
comparación con ZnTBAP contra las toxicidades por PQ^{++}, NMDA y
KA (Fig. 38).
Para determinar si la adición de MnTBAP después
de la iniciación de la agresión excitotóxica ejercía efectos
neuroprotectores, se incluyó NMDA 100 \muM durante 15 min. en
HBSS^{-} (HBSS exento de Ca^{- -} y mg^{- -} que contenía
glucosa 5,6 mM y enriquecido con CaCl_{2} 2 mM, NaHCO_{3} 1 mM,
HEPES 10 mM y glicina 5 \muM). Este paradigma de exposición aguda
produjo la muerte neuronal retardada (medida 18 h. después) y
permitió la determinación de la relación temporal entre la
exposición y la neuroprotección de MnTBAP. Los efectos
neuroprotectores de MnTBAP se evaluaron cuando estaba: 1) presente
15 min. antes y durante 15 min. de aplicación de NMDA (pero no
durante el periodo de 18 h. después del cambio del medio) (condición
"pre"); 2) presente 15 min. antes y durante una aplicación de
NMDA de 15 min. y durante las siguientes 18 h. (condición "pre +
post"); 3) se añadió 15, 30 ó 60 min. después de una incubación
de 15 min. con NMDA 100 \muM y se dejó en el medio durante las
siguientes 18 h. La condición "pre" produjo una reducción del
25% de la liberación de LDH medida 18 h. después; utilizando un
ciclo de aplicación de tiempo idéntico de D-APV 100
\muM en la condición "pre", se observó un bloqueo completo de
la liberación de LDH. En cambio, MnTBAP incubada como en la
condición "pre + post" produjo una reducción del 51% de la
liberación de LDH. La adición de MnTBAP 200 \muM 15, 30 o 60 min.
después de una exposición de 15 min. a NMDA 100 \muM produjo una
reducción del 38%, 30% y 25% de la liberación de LDH
respectivamente. En cambio, la adición de MK801 10 \muM 15 min.
después del tratamiento con NMDA ejerció un efecto protector modesto
(17%) cuando se añadió 15 min. después de la agresión por NMDA. A
fin de investigar la posibilidad de que la inactivación de aconitasa
producida por NMDA proceda de la formación del peroxinitrito, se
examinaron los efectos de los inhibidores de la óxido nítrico
sintetasa (NOS) sobre la inactivación y la muerte celular de la
aconitasa producida por NMDA. La inactivación de la aconitasa
producida por NMDA y la liberación de LDH no se alteraron por la
presencia de 1 mM de éster metílico de N^{G}-
nitro-L-arginina,
N^{G}-nitro-L-arginina
o
N^{G}-monometil-L-arginina.
Sin embargo, NOS se expresó en la preparación neuronal cortical
utilizada. Por esta razón, el peroxinitrito no parecería desempeñar
una función etiológica en la inactivación de la aconitasa producida
por NMDA o en la muerte celular en las condiciones utilizadas.
Ejemplo
XII
Se consiguieron ratones modificados genéticamente
con EC-SOD del Dr. Lena Carlsson y del Dr. Stephan
Marklund, Umeä;, Suecia. Se evaluó el aprendizaje en ratones
modificados genéticamente y ratones de referencia (las referencias
procedían de camadas (+/+) que llevaban concentraciones normales de
EC-SOD) utilizando un laberinto radical de ocho
brazos en el cual se colocó pienso en un pocillo al final de cada
brazo. El pienso fue ocultado a los ratones durante un periodo de
ocho horas y a continuación se colocaron los ratones en el
laberinto. Se realizó un recuento del número de brazos que los
ratones bajaron para recuperar el pienso antes de que bajaran algún
brazo durante un segundo periodo. Los animales naturales bajaron al
azar entre cuatro y cinco brazos diferentes del laberinto antes de
comenzar a repetir.
Los resultados presentados en la Figura 39
demuestran que cuando el experimento se realiza en 24 días
sucesivos, los ratones de referencia aprenden la configuración y son
capaces de aumentar el número de brazos que bajan para encontrar el
pienso sin error. Los animales modificados genéticamente con
EC-SOD no pudieron presentar ningún aprendizaje
significativo durante las 24 sesiones completas.
Ejemplo
XIII
Cultivo celular: Se cultivaron macrófagos
J774 en medio DMEM, enriquecido con L-glutamina
(3,5 mmoles/l) y suero de ternera fetal al 10%. Se cultivaron
células en placas de 96 pocillos (200 \mul de medio/pocillo) hasta
confluencia. Para producir la isoforma inducible de óxido nítrico
sintetasa (iNOS), se añadió medio de cultivo reciente que contenía
LPS de E. coli (011:B4; 10 \mug/ml) solo o en combinación
con \gamma-interferón murino
(\gamma-IFN, 10 u/ml) en presencia o ausencia del
inhibidor NOS, mimético de SOD de la combinación de los dos
compuestos durante 24 h. Además, se expusieron las células a los
compuestos del donante de NO,
S-nitroso-N-acetil-DL-penicilamina
(SNAP) (3 mM) y dietilamina: NONOato de NO (DNO) (3 mM) durante 24 h
o a peroxinitrito (1 mM) auténtico durante 1 h. La concentración de
nitrito/nitrato en el medio y la respiración mitocondrial se
midieron después tal como se describe a continuación.
Medición de la producción de
nitrito/nitrato: Se midió la producción de nitrito/nitrato en el
sobrenadante, como indicador de la síntesis de NO. En primer lugar,
se redujo el nitrato en el medio de cultivo a nitrito por incubación
con nitrato reductasa (670 mU/ml) y NADPH (160 \muM) a temperatura
ambiente durante 2 h. Tras 2 h, se midió la concentración de nitrito
en las muestras mediante la reacción de griess, añadiendo 100 \mul
de reactivo de griess (sulfanilamida al 1% y naftiletilendimida al
0,1% en ácido fosfórico al 5%) a 100 \mul de muestras de medio
acondicionado. Se midió la densidad óptica a 550 nm (DO_{550})
utilizando un lector de microplacas Spectramax 250 (Molecular
Devices, Sunnyvale, CA). Se calcularon las concentraciones de
nitrato por comparación con la DO_{550} de soluciones patrón de
nitrato de sodio preparadas en medio de cultivo. Se corrigieron
todas las mediciones para la interferencia de MnTBAP a esta longitud
de onda. MnTBAP (hasta 300 \muM) no autooxidó el nitrito o nitrato
y no interfirió con la actividad de la nitrato reductasa.
Medición de la respiración mitocondrial:
Se evaluó la respiración celular mediante la reducción dependiente
de mitocondrias de bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
(MTT) a formazán. Se incubaron las células en placas de 96 pocillos
a 37ºC con MTT (0,2 mg/ml) durante 1 hora. Se eliminó el medio de
cultivo por aspiración y las células se solubilizaron en DMSO (100
\mul). La extensión de la reducción de MTT a formazán con células
fue cuantificada mediante la medición de la DO_{550}. Se
corrigieron todas las mediciones para la interferencia de MnTBAP a
esta longitud de onda.
Medición de la oxidación de dihidrorodamina
123 producida por el peroxinitrito: Se midió la oxidación de
dihidrorrodamina 123 a rodamina 123 dependiente del peroxinitrito,
basándose en los principios del método descrito por Kooy et
al., Free Radical Biol. Med. 16: 149 (1994). En resumen,
se añadió peroxinitrito a 5 \muM en solución salina tamponada con
fosfato que contenía dihidrorrodamina 123 10 \muM, en ausencia o
presencia de MnTBAP (3 a 100 \muM). Después de una incubación de
10 min. a 22ºC, se midió la fluorescencia de rodamina 123 utilizando
un fluorímetro de Perkin-Elmer (modelo LS50B;
Perkin-Elmer, Norwalk, CT) a una longitud de onda de
excitación de 500 mn, longitud de onda de emisión de 536 nm
(anchuras de rendija de 2,5 y 3,0 nm, respectivamente).
Medición de relajaciones vasculares producidas
por NO: Se anestesiaron conejos blancos de Nueva Zelanda de 3 a
4 kg de peso con pentobarbital (30 mg/kg). Se aisló la aorta
torácica descendente, se extrajo, se limpió y se colocó en tampón de
Krebs (pH 7,5). Los vasos se cortaron en anillos de 5 mm y se
colgaron en estribos conectados a transductores de fuerza. Los
anillos se pusieron en suspensión en baños encamisados de 20 ml que
se mantuvieron a 37ºC y se barbotearon con O_{2} al 95% y CO_{2}
al 5%. Los anillos se equilibraron con tensión de reposo de 2 g
durante 1 h antes de su utilización y se concentraron con
fenilefrina. Se preparó solución saturada de NO barboteando gas NO
comprimido a través de una trampa de NaOH y a continuación en agua
anaerobia desionizada. Se añadieron alícuotas de las soluciones de
óxido nítrico (concentración final: 75 a 300 nM) a los anillos (en
presencia o ausencia de MnTBAP 100 \muM) y se registraron las
respuestas relajantes.
Análisis de los datos: Todos los valores
se expresan como media \pm error estándar de la media de n
observaciones, en donde n representa el número de
pocillos estudiados (12 pocillos de 2-3 experimentos
independientes). Se examinaron las series de datos por análisis de
varianza y las medias individuales del grupo se compararon a
continuación con la prueba de la t de Student para datos no
emparejados. Un valor de p menor de 0,05 se consideró
significativo.
MnTBAP no es un antioxidante del óxido
nítrico: MnTBAP no inhibió las relajaciones en los anillos
vasculares en respuesta al NO auténtico. Además, MnTBAP, a 300
\muM, no inhibió la acumulación de nitrito/nitrato en el medio de
cultivo en respuesta al compuesto SNAP donante de NO y produjo una
ligera inhibición en respuesta a DNO. Estos datos, y el
descubrimiento de que NO no afecta los cambios espectrales de la
banda Sorét de MnTBAP, indican que NO no se acompleja con el
manganeso en la MnTBAP.
MnTBAP inhibe la oxidación mediada por
peroxinitrito: El peroxinitrito produjo una oxidación
significativa de hidrorrodamina 123 a rodamina 123, que fue inhibida
en función de la dosis por MnTBAP con una inhibición del 50% a 30
\muM (Fig. 40). Esto sugiere que MnTBAP, como la cisteína, urato,
ascorbato y alfa-tocoferol, inhibe las oxidaciones
producidas por el peroxinitrito.
MnTBAP inhibe la supresión de la respiración
mitocondrial mediante el peroxinitrito auténtico en las células
J774. La respiración mitocondrial fue inhibida profundamente por
exposición a peroxinitrito 1 mM en 1 h (Fig. 41A). Este efecto fue
impedido en parte y en función de la dosis por MnTBAP.
MnTBAP inhibe la supresión de la respiración
mitocondrial mediante donantes de NO en las células J774: La
respiración mitocondrial fue inhibida también por la exposición al
compuesto SNAP donante de NO (Fig. 41B) y DNO durante 24 h (Fig.
41C). Este efecto fue impedido en parte y en función de la dosis por
MnTBAP.
Efectos de MnTBAP sobre la supresión de NO y
la supresión de la respiración mitocondrial en macrófagos J744
inmunoestimulados: La inmunoestimulación de las células por el
lipopolisacárido (LPS; 10 \mug/ml) solo, y de forma más acentuada,
en presencia de interferón gamma (IFN; 10 u/ml), produjo la
formación de nitrito/nitrato y una inhibición acentuada de la
respiración mitocondrial. La administración de IFN solo no ocasionó
una producción detectable de nitrito/nitrato y solamente produjo una
supresión suave (<15%) de la respiración (n=12).
MnTBAP produjo una inhibición en función de la
dosis de la producción de nitrito/nitrato en las células estimuladas
con LPS. Sin embargo, en las células inmunoestimuladas con la
combinación de LPS e IFN, MnTBAP produjo una inhibición menos
acentuada de la acumulación de nitrito y nitrato (300 \muM). Por
ejemplo, a 100 \muM y a 300 \muM, MnTBAP produjo una inhibición
significativa del 63 y 86%, de la acumulación de nitrito/nitrato
producida por LPS. Cuando se administra en la presencia combinada de
LPS e IFN, MnTBAP 100 \muM solo produjo un 25% de inhibición de la
acumulación de nitrito/nitrato y una inhibición acentuada (61%) se
observó solamente a la concentración mayor de MnTBAP probada (300
\muM). L-NMA
(N^{G}-metil-L-arginina)
produjo una inhibición casi completa de la producción de NO en las
células estimuladas con LPS o LPS e IFN; y MnTBAP no ejerció efecto
adicional sobre la formación de nitrito/nitrato en presencia de
L-NMA. La inhibición de la acumulación de
nitrito/nitrato por MnTBAP en los macrófagos estimulados por LPS
disminuyó en más del 50% cuando se aplicó el agente 6h después de
LPS, mientras que en el caso de la inhibición observado con
L-NMA, la extensión de la inhibición observada fue
similar cuando el compuesto se administró junto con LPS o 6 h
después (n=6).
MnTBAP produjo un restablecimiento de la
supresión producida por inmunoestimulación parcial, dependiente de
la dosis de la respiración mitocondrial tanto en las células
tratadas con LPS (menos potencialmente) como en las células tratadas
con LPS e IFN. La inhibición de NOS con L-NMA
produjo un restablecimiento de la respiración en una medida
comparable con la de MnTBAP 300 \muM. La administración combinada
de MnTBAP 300 \muM y L-NMA 3 mM produjo un
restablecimiento adicional de la respiración mitocondrial. En
presencia de L-NMA y MnTBAP, la respiración se
restableció a los niveles iniciales en las células estimuladas con
LPS, pero permaneció por debajo de los normales en las células
estimuladas con LPS e IFN.
Ejemplo
XIV
A una solución de ácido
2-hidroxi-3-metilbenzoico
(2,22 g, 14,6 mmoles), K_{2}CO_{3} anhidro finamente molido
(8,06 g, 58,3 mmoles) y acetona (150 ml) agitada magnéticamente se
añadió (CH_{3}O)_{2}SO_{2} (2,9 ml, 30,6 mmoles). La
solución se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas, a
continuación se calentó a reflujo hasta que el análisis por TLC
indicó que la reacción había terminado (1 a 2 horas). La mezcla de
reacción se enfrió a temperatura ambiente, se filtró y la torta de
K_{2}CO_{3} en exceso se lavó intensamente con acetona. Se
evaporó el filtrato y el residuo se volvió a disolver en EtOAc (100
a 125 ml) y se añadió trietilamina (\sim5 a 9 ml). La mezcla de
reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, se
transfirió a un embudo separador y se lavó sucesivamente con
H_{2}O (100 ml), HCl 2 N (hasta ligeramente ácida), H_{2}O (100
ml) y salmuera (100 ml), a continuación se filtró (Na_{2}SO_{4})
y se evaporó a presión reducida. La cromatografía del residuo sobre
gel de sílice (altura de sílice: 15 cm, diámetro: 3 cm, eluyente:
hexanos/Et_{2}O 1:1) proporcionó 2,50 g (95%) de (1) puro.
Una solución de 1 (24,43 g, 135,6 mmoles), NBS
(54,41 g, 305,7 mmoles) y CCl_{4} (1 l) agitada magnéticamente se
expuso a una lámpara de 100 vatios durante 6 horas. El análisis por
TLC indicó que la mezcla de reacción estaba compuesta de benzoatos
de mono, di y tribromados, en la que el dibromuro era el producto
principal. La mezcla de reacción se enfrió con H_{2}O (200 ml, a
continuación se añadió Na_{2}S_{2}O_{3} saturado (500 ml) para
destruir Br_{2}. La mezcla se transfirió a un embudo separador, se
agitó a fondo y a continuación se separó. Se secó (Na_{2}SO_{4})
la capa orgánica, se filtró y se evaporó a presión reducida. El
espectro de ^{1}H RMN en bruto indicó que el
metil-2-metoxi-4-(\alpha,\alpha-dibromo-metil)
benzoato era el producto principal y se utilizó sin purificación
ulterior.
Se disolvió el producto 2 en bruto en
acetona/H_{2}O (200 ml, 83:17) a continuación se añadió AgNO_{3}
(47,25 g, 278,2 mmoles). El matraz se cubrió con papel de aluminio
para evitar la descomposición del AgNO_{3} por la luz. La mezcla
de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas, a
continuación se filtraron las sales de AgBr procedentes de la
solución. El filtrado se diluyó con EtOAc (400 ml, se transfirió a
un embudo de separación, se lavó a continuación con NaHCO_{3}
saturado (300 ml) para extraer el ácido del aldehído. La capa
orgánica se lavó sucesivamente con H_{2}O (300 ml) y salmuera (300
ml), se secó (Na_{2}SO_{4}) se filtró y se evaporó a presión
reducida. La cromatografía del residuo sobre gel de sílice (altura
de sílice: 15 cm, diámetro: 5 cm, eluyente: hexanos/Et_{2}O 1:1)
proporcionó 11,92 g (42%) de aldehído (3) puro.
A una solución de
4-formil-2-metoxi
benzoato de metilo (3) (1,82 g, 9,37 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (35
ml) agitada magnéticamente a 0ºC y en N_{2} se añadió gota a gota,
BCl_{3} 1 M (18,7 ml, 18,7 mmoles). La mezcla de reacción se agitó
a 0ºC durante 10 a 30 minutos, a continuación se enfrió con H_{2}O
(50 ml). Se añadió éter (100 ml) a la mezcla, a continuación se
transfirió a un embudo separador y se decantó. La capa acuosa se
extrajo con éter (35 ml) los extractos orgánicos combinados se
lavaron con salmuera (100 ml), se secaron (Na_{2}SO_{4}), se
filtraron y se evaporaron a presión reducida. La cromatografía sobre
gel de sílice (altura de sílice: 12,5 cm, diámetro: 5 cm, eluyente:
hexanos/Et_{2}O 1:1) proporcionó 1,60 g (95%) de
4-formil-2-hidroxi
benzoato de metilo como un aceite.
En un matraz de 1 l de fondo redondo, con 3
bocas, cubierto con papel de aluminio, equipado con un condensador a
reflujo, un agitador magnético y una entrada para N_{2} se añadió
4-formil-2-hidroxi
benzoato de metilo (1,01 g, 5,6 mmoles), pirrol (397 \mul, 5,6
mmoles) y CH_{2}Cl_{2} anhidro (560 ml). La mezcla de reacción
se agitó a temperatura ambiente durante 10 a 30 minutos, a
continuación se añadió BF_{3}\cdotOEt_{2} (69 \mul, 0,56
mmoles). La extensión de la reacción fue seguida por
espectrofotometría uv-vis. Tras 1,5 horas a
temperatura ambiente se añadió
tetracloro-1,4-benzoquinona (1,03 g,
4,2 mmoles) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 3,5
horas. Se dejó enfriar a temperatura ambiente la mezcla de reacción,
a continuación se evaporó el disolvente a presión reducida. Tras 2
purificaciones cromatrográficas en gel de sílice, se obtuvieron 0,38
g (30%) de (5) como un sólido violeta.
A escala de 1 g de aldehído, se combinó el
producto en bruto normalmente con 2 a 3 g de gel de sílice para
preparar una mezcla que se dividió a continuación en 2 lotes para 2
purificaciones cromatográficas por separado en gel de sílice (altura
de sílice: 12 a 15 cm, diámetro 5 cm). El primer eluyente utilizado
fue hexanos/Et_{2}O 1:1 o hexanos/EtOAc 4:1 (dependiendo de cómo
se comporta la porfirina en la TLC) para eliminar los subproductos
de hidroquinona y otras impurezas no polares. Después de eliminar
todas las impurezas no polares, el eluyente se cambió por
CH_{2}Cl_{2} o CHCl_{3} para eluir la porfirina.
Una solución de 5 (0,38 g, 0,42 mmoles) y
MnCl_{2} (0,26 g, 2,1 mmoles) en DMF (25 ml) se calentó a reflujo
durante 1,5 horas, a continuación se barboteó aire durante 1,5 h a
medida que la solución se enfriaba a temperatura ambiente. Se
evaporó el DMF a presión reducida. A continuación se combinó el
residuo con gel de sílice (1 g) y CH_{2}Cl_{2} (10 ml) para
preparar una suspensión. Se evaporó el CH_{2}Cl_{2} dejando una
mezcla sólida que se cargó seca en una columna rellena con gel de
sílice (altura de la columna: 12,5 cm, diámetro: 5 cm, eluyente MeOH
al 3%/CH_{2}Cl_{2}). La purificación anterior dio 124 mg (32%)
de 6 puro como un sólido verde oscuro. (punto de fusión >300ºC;
\lambda_{max} UV-VIS 467 nm (131.000);
FAB-MS calculado para
C_{51}H_{34}MnN_{4}O_{12} 949, obtenido 949).
En un matraz de 2 l de fondo redondo, con 3
bocas, cubierto con papel de aluminio, equipado con un condensador a
reflujo, un agitador magnético y una entrada para N_{2} se añadió
4-formil benzonitrilo (1,13 g, 8,6 mmoles), pirrol
(0,6 ml, 8,6 mmoles) y CH_{2}Cl_{2} (850 ml). La mezcla de
reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos, a
continuación se añadió BF_{3}\cdotOEt_{2} (105 \mul, 0,85
mmoles). La extensión de la reacción fue seguida por
espectrofotometría uv-vis. Tras 2 horas se añadió
tetracloro-1,4-benzoquinona (1,56 g,
6,34 mmoles) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 2
horas. La mezcla de reacción se evaporó hasta un volumen de 50 a 100
ml, a continuación se añadió a 2,8 g de gel de sílice. El resto del
disolvente se evaporó a presión reducida para dar una mezcla sólida
para purificaciones cromatográficas. Tras 3 purificaciones por
separado, se obtuvieron 700 mg (46%) de 7 puro como un sólido
violeta en polvo.
Una solución de 7 (0,30 g, 0,42 mmoles),
NaN_{3} (0,24 g, 3,69 mmoles), NH_{4}Cl (0,18 g, 3,37 mmoles) y
DMF (25 ml) se calentó a 120ºC durante 3 días. Se añadieron más
NaN_{3} (0,17 g, 2,59 mmoles) y NH_{4}Cl (0,11 g, 2,05 mmoles)
en porciones durante el día 2 para llevar la reacción a su
terminación. El DMF se evaporó a presión reducida, se añadió a
continuación H_{2}O en frío (10 ml). La solución resultante se
acidificó con HCl 6N y a continuación se añadió CH_{2}CL_{2} (10
ml). Se recogió el precipitado resultante y se secó al vacío para
dar 0,37 g (99%) de 8 como un sólido verdoso que se utilizó
sin más purificación.
Se calentó a reflujo durante 4 a 5 horas una
solución de 8 (0,35 g, 0,4 mmoles) y MnCl_{2} (0,25 g, 2 mmoles)
en DMF (20 ml). La mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura
ambiente, a continuación se evaporó el DMF a presión reducida. El
producto en bruto se adsorbió sobre 1,5 g de gel de sílice con 10 a
15 ml de CH_{2}Cl_{2}. El CH_{2}Cl_{2} se evaporó dejando un
sólido que se cargó seco en una columna rellena con suspensión de
gel de sílice (altura de sílice: 12,5 cm, diámetro: 5 cm, eluyente:
6 CHCl_{2}/3 MeOH/1 NH_{4}OH). La purificación cromatográfica
dio 0,19 g (50%) de 9 puro como un sólido verde oscuro. (Punto de
fusión > 320ºC; \lambda_{max}UV-VIS 469 nm
(42.000); FAB-MS calculado para
C_{48}H_{28}MnN_{20} 939, obtenido 939).
A una solución de ácido
3-hidroxi-4-metilbenzoico
(15,1 g, 99,2 mmoles), K_{2}CO_{3} anhidro finamente molido
(43,7 g, 317 mmoles) y acetona (250 ml) agitada magnéticamente se
añadió (MeO)_{2} SO_{2} (21 ml, 222 mmoles). La mezcla de
reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas, a
continuación se filtró el K_{2}CO_{3} en exceso. Se eliminó por
evaporación la acetona y se redisolvió el residuo en EtOAc (250 ml),
a continuación se añadió Et_{3}N (15 ml). Se agitó la solución a
temperatura ambiente durante 30 minutos, se transfirió a un embudo
separador y se lavó sucesivamente con H_{2}O (100 ml), HCl 1 N
(hasta ligeramente ácido), NaHCO_{3} (100 ml), H_{2}O (100 ml) y
salmuera (100 ml), se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se
evaporó a presión reducida. La cromatografía de residuo en gel de
sílice (altura de gel de sílice: 25 cm, diámetro: 4 cm, eluyente:
CH_{2}Cl_{2}/hexanos 1:1) proporcionó 16,84 g (94%) de 10
puro.
A una solución agitada magnéticamente de 10 (5,87
g, 32,6 mmoles) en CH_{3}CN/H_{2}O 1:1 (250 ml) se añadió
consecutivamente CuSO_{4}\cdot5H_{2}O (8,13 g, 32,6 mmoles) y
K_{2}S_{2}O_{8} (26,4 g, 97,7 mmoles). La mezcla de reacción
se calentó a reflujo durante 50 minutos, a continuación se
transfirió a un embudo separador y se extrajo con EtOAc
(2 \times 100 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron
sobre Na_{2}SO_{4}, se filtraron y evaporaron. La purificación
sobre gel de sílice por cromatografía de gravedad (altura de gel de
sílice: 33 cm, diámetro: 4 cm, eluyente: hexanos/EtOAc 5:1, a
continuación hexanos/EtOAc 4:1) proporcionó 1,47 g (23%) de 11
puro.
En un matraz de 2 l de fondo redondo, con 3
bocas, cubierto con papel de aluminio, equipado con un condensador
de reflujo, un agitador magnético y una entrada para N_{2} se
añadió
4-formil-3-metoxi
benzoato (11) (1,23 g, 6,3 mmoles), pirrol (448 \mul, 6,3 mmoles)
y CH_{2}Cl_{2} (630 ml). La mezcla de reacción se agitó durante
15 minutos, a continuación se añadió BF_{3}\cdotOEt_{2} (78
\mul, 0,63 mmoles). La reacción se controló por espectrofotometría
uv-vis. Tras 3 horas se añadió
tetracloro-1,4-benzoquinona (1,17 g,
4,7 mmoles) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 2,5
horas. La mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente,
a continuación se evaporó el disolvente al vacío. El producto en
bruto se añadió en 2,6 g de gel de sílice con 10 a 15 ml de
CH_{2}Cl_{2}. El CH_{2}Cl_{2} se evaporó y la mezcla
resultante se dividió en 3 partes iguales para tres purificaciones
cromatográficas independientes. Cada parte se cargó por separado en
seco en una columna rellena con gel de sílice (altura de gel de
sílice: 15 cm, diámetro: 5 cm, eluyente: hexanos/Et_{2}O 1:1 a
continuación CH_{2}Cl_{2}). Se obtuvieron 0,461 g de producto
combinado (30%) de 12 puro como una mezcla de isómeros
rotacionales.
\newpage
Se calentó a reflujo durante 6,5 horas una
solución de 12 (0,32 g, 0,33 mmoles) y MnCl_{2} (0,20 g, 1,56
mmoles) en DMF (32 ml). Se barboteó aire a continuación en la
solución durante 1,25 horas a medida que la mezcla de reacción se
enfriaba a temperatura ambiente. Se evaporó el DMF y la mezcla en
bruto se adsorbió en 1,5 g de gel de sílice con 10 a 15 ml de
CH_{2}Cl_{2}. Se evaporó el CH_{2}Cl_{2} y la mezcla sólida
resultante se cargó seca en una columna rellena con gel de sílice
(altura de sílice: 12,5 cm, diámetro: 5 cm, eluyente: MeOH al 5% en
CH_{2}Cl_{2}). La purificación cromatográfica proporcionó 294 mg
(84%) de 13 puro como un sólido verde-negro. (punto
de fusión >300ºC; \lambda_{max}UV-VIS 467
número (145.000); FABS calculado para
C_{56}H_{44}MnN_{4}O_{12} 1019, obtenido 1019).
Una solución agitada magnéticamente de
tetrabenzoato de manganeso 13 en una caja de Claisen de 10 ml
(KOH/
MeOH/H_{2}O) se calentó a reflujo durante 40 a 60 minutos. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y a continuación a 0ºC. La solución fría se acidificó a continuación con HCl 6 N a continuación se evaporó el MeOH a presión reducida. Los sólidos se filtraron en la solución ácida y se lavaron a fondo con agua fría. Se recogieron los sólidos y se secaron al vacío a 80ºC durante la noche para proporcionar 96 mg (87%) de 14 puro como un sólido verde oscuro (punto de fusión >300ºC; \lambda_{max}UV-VIS 467 nm (150.000); FAB-MS calculado para C_{52}H_{36}MnN_{4}O_{12} 963, obtenido 963).
MeOH/H_{2}O) se calentó a reflujo durante 40 a 60 minutos. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y a continuación a 0ºC. La solución fría se acidificó a continuación con HCl 6 N a continuación se evaporó el MeOH a presión reducida. Los sólidos se filtraron en la solución ácida y se lavaron a fondo con agua fría. Se recogieron los sólidos y se secaron al vacío a 80ºC durante la noche para proporcionar 96 mg (87%) de 14 puro como un sólido verde oscuro (punto de fusión >300ºC; \lambda_{max}UV-VIS 467 nm (150.000); FAB-MS calculado para C_{52}H_{36}MnN_{4}O_{12} 963, obtenido 963).
Se puso en suspensión MnTBAP (500 mg, 0,57
mmoles) en benceno anhidro (125 ml) en un matraz de fondo redondo
con 3 bocas equipado con un condensador de reflujo y una entrada de
N_{2}. Se añadió cloruro de tionilo (45 ml; 617 mmoles) a la
mezcla y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 22
horas. El benceno y el SOCl_{2} sin reaccionar se eliminaron por
destilación. Se lavó el residuo con benceno anhidro (50 ml) y se
evaporó en un evaporador rotatorio a sequedad. Este lavado y la
evaporación se repitieron dos veces. El residuo verde oscuro se secó
a alto vacío para dar 0,54 g (100%).
Al compuesto 15 (340 mg, 0,36 mmoles) en THF (20
ml) se añadió dimetilamina en solución de THF (10 ml, solución 2 M).
La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 6 horas. El
análisis por TLC (eluyente: 1 metanol:3 cloroformo) demostró la
conversión completa del cloruro ácido en el producto. Tras el
enfriamiento a temperatura ambiente, se añadió agua desionizada (100
ml) a la mezcla de reacción y se filtró el sólido. Se purificó el
sólido en bruto por cromatografía en columna en gel de sílice
(eluyente cloruro de metileno:metanol = 4:1). Las fracciones
combinadas (Rf = 0,75 en CH_{2}Cl_{2}:MeOH = 4:1) se evaporaron
y se secaron a alto vacío, para proporcionar el producto como un
sólido verde 0,11 g (31%). (\lambda_{max}UV-VIS
467 nm (56.100); FAB-MS calculado para
C_{56}H_{49}MnN_{8}O_{4} 952, obtenido 952).
Siempre que se refiera a los compuestos 10402,
10602, 11001, 11002, 11003 y 11103, la síntesis puede realizarse
esencialmente, tal como se describe en el Ejemplo XIV, apartados 5 y
6; se requieren las siguientes sustituciones del material de
partida: 4-hidroxibenzaldehído por
4-formil-2-hidroxi
benzoato de metilo en el caso del 10402,
4-hidroxi-3-nitrobenzaldehído
por
4-formil-2-hidroxi-benzoato
de metilo en el caso del 10602,
indol-3-carboxaldehído por
4-formil-2-hidroxi
benzoato de metilo en el caso del 11001,
4-quinolinacarboxaldehído por
4-formil-2-hidroxi
benzoato de metilo en el caso del 11002,
3-quinolinacarboxaldehído por
4-formil-2-hidroxi
benzoato de metilo en el caso del 11003 y
3-fluoro-4-metoxibenzaldehído
por
4-formil-2-hidroxi
benzoato de metilo en el caso del 11103.
Se hace reaccionar acetonitrilo con hidroxilamina
para preparar la oxima de la amida. Se deja reaccionar un exceso de
oxima de la amida con el producto descrito en el Ejemplo XIV,
apartado 15, para proporcionar una mezcla de 10207 y 10208. La
purificación cromatográfica de la mezcla de reacción proporciona
10207 y 10208 puros.
Se transforma ácido
4-metilbenzoico disponible en el mercado en su
cloruro ácido por reacción con cloruro de oxalilo o cloruro de
tionilo. El cloruro ácido resultante se calienta en presencia de
cianuro cuproso para proporcionar el derivado de
\alpha-cetonitrilo. El
\alpha-cetonitrilo se hidroliza con metanol
anhidro saturado con gas de cloruro de hidrógeno anhidro para dar el
derivado del éster de \alpha-cetonitrilo. El grupo
metil aromático está oxidado eficazmente al estado de oxidación del
aldehído por la primera reacción con
N-bromosuccinimida y la hidrólisis posterior con
nitrato de plata. La síntesis de 10209 puede realizarse
esencialmente tal como se describió en el Ejemplo XIV, apartados 5 y
6; requiriéndose la sustitución del material de partida del
4-formil-2-hidroxi
benzoato de metilo por el aldehído descrito anteriormente.
De la lectura de esta exposición un experto en la
materia apreciará que pueden realizarse varios cambios en la forma y
en el detalle sin apartarse por ello del alcance verdadero de la
invención. Además de los compuestos descritos en la presente
memoria, los compuestos expuestos en las siguientes referencias
también pueden utilizarse como antioxidantes de oxidantes coherentes
con la invención: patente US nº 5.227.405; Nagele et al.,
Biochem. Pharmacol. (UK) 47:555-562 (1994);
Baudry et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.
192:964-968 (1993); Duran et al.,
Cancer Lett (IRE) 69 : 167-172 (1993); Itami
et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.
197:536-541 (1993); Kitajima et al.,
Inorg. Chem. 32:1879-1880 (1993); Riley et
al., Free Radical Biol. & Med. 15:514 (1993); Weiss
et al., J. Biol. Chem. (US)
268:23049-23054 (1993); Foye, Ann. Pharmacother.
26:1144-1147 (1992); Haseloff et al.,
J. Biolumin. Chemilumin. (UK) 7: 171-175
(1992); Pelletier, J., Biochem. Pharmacol.
43:1061-1066 (1992); Yaping et al., J.
Free Radic. BiolMed 13:533-541 (1992);
Schechinger et al., Biol. Met. 1:112 (1988); Linss
et al., Inorg. Chim. Acta 125:117 (1986); y Weser
et al., Adv. Exp. Med. Biol. 264:51 (1990).
^{1}Los números del carbono de la porfina se
refieren a los carbonos (5, 10, 15, 20) del puente de metina a los
que está unido cada grupo R o a los carbonos (2, 4, 7, 8, 12, 13, 17
ó 18) del pirrol, al que está unido P. P es hidrógeno a menos que se
defina de otro modo.
^{2}Actividad de SOD determinada tal como es
descrita por McCord y Fridovich, J.Biol. Chem. 244:6049
(1969).
^{3}Actividad de la catalasa determinada tal
como es descrita por Del Rio et al., Anal. Biochem.
80:409 (1977). Se analizaron las metaloporfirinas a varias
concentraciones en presencia de peróxido de hidrógeno 1 mM para la
actividad de tipo catalasa. Se utilizó un electrodo de Clark para
medir la formación de oxígeno en la descomposición del peróxido de
hidrógeno durante un periodo de 2 minutos.
^{4}Las tasas de crecimiento de los cultivos de
E. coli de SOD nulo (cepa JI132) fueron seguidos por
turbidimetría a 700 nm para minimizar las interferencias de la
absorbancia de los compuestos del ensayo. El medio de cultivo
contenía glucosa al 0,2%, casaminoácidos al 0,2%, 30 mg/l de
tiamina, 30 mg/l de ácido pantoténico y sales M9 en agua, el pH se
ajustó a 7,0. Los compuestos del ensayo se sometieron a
ultrafiltración antes de añadirlos al medio (Faulkner et al.,
J. Biol. Chem. 269: 23471 (1994)).
^{5}Células endoteliales humanas de la vena del
cordón umbilical (HUVEC) (ATCC nº CRL-1730) (Moldow
et al., Methods in Enzymology
105:378-385 (1984)) se cultivaron en medio
F-12K de Ham enriquecido con suero bovino fetal al
10%, 0,1 mg de heparina y 0,03 mg/ml de factor de crecimiento de
células endoteliales en matraces de cultivo T-75 en
una atmósfera humectada que contenía dióxido de carbono al 5% y aire
al 95%. Las células se colocaron en placas a razón de \sim3,5
\times 10^{4} células/pocillo en placas de 24 pocillos. Los
experimentos se realizaron 48 horas después. Se cambió el medio por
EMEM sin enriquecimiento con suero pero incluyendo al principio de
cada estudio heparina y factor de crecimiento de células
endoteliales. Las soluciones madre de D-aminoácido
oxidasa y de metaloporfirinas se diluyeron en (EMEM) y se pasaron a
través de un filtro de 0,2 cc antes de su utilización. Las células
HUVEC se marcaron con Cr^{51} incubándolas con EMEM que contenía
cromato de sodio radiomarcado durante 4 h a una concentración de
isótopo de 20 \muCi/10^{6} células. Se eliminó el Cr^{51} no
incorporado mediante lavados repetidos en EMEM. Se inició el
traumatismo por incubación de las células endoteliales durante 5
horas con un de sistema de generación de peróxido de hidrógeno
constituido por D-alanina (1 mM) y 40 mU/ml de
D-aminoácido oxidasa en EMEM. La
D-aminoácido oxidasa se encuentra en los PMN
(leucocitos polimorfonucleares) y se cree que forma parte del
despliegue oxidativo que es una parte clave de la respuesta
inflamatoria mediada por PMN (Robinson et al., J. Cell
Biology, 77:59 (1978); Cline et al., Microbiology
62:756 (1969); De Chatelet J. Reticul. Soc. 24:73
(1978)). Se recogió el sobrenadante de cada pocillo y el final del
periodo de incubación, se lavaron las células con PBS y a
continuación se lisaron con hidróxido de sodio 0,4 N. La
radioactividad en ambos sobrenadantes y en los lisados celulares se
midió por separado con un contador gamma. Se utilizó una serie de
pocillos en cada placa para medir la liberación basal de Cr^{51}
procedente de HUVEC incubado en EMEM solo. La liberación de
Cr^{51} se expresó como porcentaje de radioactividad en el
sobrenadante con respecto a la radioactividad total [(Cr^{51} en
el sobrenadante + Cr^{51} en el lisado) \times 100].
Claims (13)
1. Antioxidante del oxidante de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, o un complejo metálico del mismo en la que
dicho metal se selecciona de entre el grupo constituido por
manganeso, cobre y hierro, en la
que:
cada R_{1} es independientemente
en la que Y'' es un grupo alquilo,
y en la
que
indica que se une a R_{2}' en
cualquier posición
y
indica que se une a R_{2}' y al
sustituyente R_{1}' fenilo en cualquier
posición;
cada R_{2}' es independientemente un enlace o
-(CH_{2})_{n-}
en la que n es de 1 a 4,
cada R_{3}' es independientemente -Y'', -Y''',
-H, -OH, -OY'', -NO_{2}, -CN, -NH_{2}, -COOH, -COY'',
-COO^{-} o un grupo heterocíclico, en el que Y'' es tal como se
definió anteriormente e Y''' es una amina primaria, secundaria,
terciaria o cuaternaria,
en la que cuando R_{1}' es
R_{3}' no es COOH, COY'' o COO^{-},
en la que cuando R_{1}' es
R_{3}' no es -NO_{2}, y
en la que
-R_{1}'-R_{2}-R_{3}',
conjuntamente, no son
2. Antioxidante según la reivindicación 1, en el
que Y''' es una amina secundaria, terciaria o cuaternaria y cada
grupo de sustitución de hidrógeno en el nitrógeno amínico es un
grupo alquilo C_{1}-C_{4}.
3. Antioxidante según la reivindicación 1, en el
que dicho antioxidante presenta la estructura siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
4. Antioxidante según la reivindicación 1, en el
que dicho antioxidante presenta la estructura siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
5. Antioxidante según la reivindicación 1, en el
que dicho antioxidante presenta la estructura siguiente:
6. Método de protección en células vegetales de
la toxicidad producida por el oxidante al poner en contacto dichas
células con una cantidad no tóxica de un antioxidante de
fórmula,
o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, o un complejo metálico del mismo en la que
dicho metal se selecciona de entre el grupo constituido por
manganeso, cobre o hierro, en la
que:
cada R_{1}' es independientemente un enlace
en las que Y'' es un grupo alquilo,
y en las
que
indica que se une a R_{2}' en
cualquier posición
y
indica que se une a R_{2}' y al
sustituyente R_{1}' fenilo en cualquier
posición;
cada R_{2}' es independientemente un enlace o
-(CH_{2})_{n}- en la que n es de 1 a 4,
cada R_{3}' es independientemente -Y'', -Y''',
-H, -OH, -OY'', -NO_{2}, -CN, -NH_{2}, -COOH, -COY'',
-COO^{-} o un grupo heterocíclico, en el que Y'' es tal como se
definió anteriormente e Y''' es una amina primaria, secundaria,
terciaria o cuaternaria,
en la que cuando R_{1}' es
R_{3}' no es COOH, COY'' o COO^{-}, y
en la que cuando R_{1}' es
R_{3}' no es -NO_{2}, y
en la que
-R_{1}'-R_{2}-R_{3}',
conjuntamente, no son -H,
suficiente para efectuar dicha protección.
7. Utilización de un antioxidante según la
reivindicación 6, para la preparación de un medicamento destinado a
la protección en las células de mamíferos de la toxicidad provocada
por el oxidante al poner en contacto dichas células con una cantidad
no tóxica de antioxidante suficiente para efectuar dicha
protección.
8. Utilización de un antioxidante de la fórmula
siguiente:
o de una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, o de un complejo metálico del mismo en la que
dicho metal se selecciona de entre el grupo constituido por
manganeso, cobre o hierro, en la
que:
cada R_{1}' es independientemente un enlace
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en las que Y'' es un grupo alquilo,
y en la
que
indica que se une a R_{2}' en
cualquier posición
y
indica que se une a R_{2}' y al
sustituyente R_{1}' fenilo en cualquier
posición;
cada R_{2}' es independientemente un enlace o
-(CH_{2})_{n}- en la que n es de 1 a 4,
cada R_{3}' es independientemente -Y'', -Y''',
-H, -OH, -OY'', -NO_{2}, -CN, -NH_{2}, -COOH, -COY'',
-COO^{-} o un grupo heterocíclico, en el que Y'' es tal como se
definió anteriormente e Y''' es una amina primaria, secundaria,
terciaria o cuaternaria,
en la que cuando R_{1}' es
R_{3}' no es COOH, COY'' o COO^{-}, y
en la que cuando R_{1}' es
R_{3}' no es -NO_{2}, y en la que
-R_{1}'-R_{2}'-R_{3}',
conjuntamente, no son -H,
para la preparación de un medicamento destinado a
la inhibición de la actividad de la xantina oxidasa de una célula o
tejido, al poner en contacto dicha célula o tejido con una cantidad
de dicho antioxidante suficiente para efectuar dicha inhibición.
9. Utilización de un antioxidante de la fórmula
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o de una sal farmacéuticamente
aceptable de la
misma,
en la que:
\newpage
R_{1} es un enlace
en la que X es un halógeno e Y es
un grupo alquilo y en la
que
indica que se une a R_{2} en
cualquier posición
y
indica que se une a R_{2} y al
sustituyente en cualquier posición;
y
R_{2} es un enlace -(CY'_{2})_{n}-,
-(CY'_{2}-CY'=CY')_{n},
-(CY'_{2}-CY'_{2}-CH=CH)_{n}-,
-(CY'=CY')_{n}- o
-(CY'_{2}-CO)_{n}-
en las que Y' es hidrógeno o un grupo alquilo y
en las que n es de 1 a 8;
R_{3} es -Y'', -OH, -NH_{2}-,
-N^{+}(Y'')_{3}, -COOH, -COO^{-}, -SO_{3}H,
-SO_{3}^{-}, CH_{2}-PO_{3}H_{2} o
-CH_{2}-PO_{3}H^{-}, en las que Y'' es un
grupo alquilo.
opcionalmente acomplejado con un metal
seleccionado de entre el grupo constituido por manganeso, cobre y
hierro, para la preparación de un medicamento destinado a la
modulación de la función de NO\cdot como neurotransmisor en un
mamífero al poner en contacto dicho mamífero con una cantidad de
antioxidante del oxidante suficiente para efectuar dicha
modulación.
10. Utilización de un antioxidante de la fórmula
siguiente:
o de una sal farmacéuticamente
aceptable de la misma, o de un complejo metálico de la misma en la
que dicho metal se selecciona de entre el grupo constituido por
manganeso, cobre o hierro, en la
que:
cada R_{1}' es independientemente un enlace
en las que Y'' es un grupo alquilo,
y en las
que
\vskip1.000000\baselineskip
indica que se une a R_{2}' en
cualquier posición
y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
indica que se une a R_{2}' y al
sustituyente R_{1}' fenilo en cualquier
posición;
cada R_{2}' es independientemente un enlace o
-(CH_{2})_{n}- en la que n es de 1 a 4,
cada R_{3}' es independientemente -Y'', -Y''',
-H, -OH, -OY'', -NO_{2}, -CN, -NH_{2}, -COOH, -COY'',
-COO^{-} o un grupo heterocíclico, en el que Y'' es tal como se
definió anteriormente e Y''' es una amina primaria, secundaria,
terciaria o cuaternaria,
en la que cuando R_{1}' es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R_{3}' no es COOH, COY'' o COO^{-}, y
en la que cuando R_{1}' es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R_{3}' no es -NO_{2}, y en la que
-R_{1}'-R_{2}'-R_{3}',
conjuntamente, no son -H,
para la preparación de un medicamento destinado a
modular la función del NO\cdot como neurotransmisor en un mamífero
al poner en contacto dicho mamífero con una cantidad del
antioxidante del oxidante suficiente para efectuar dicha
modulación.
11. Kit que comprende un antioxidante según la
reivindicación 1, colocado en el interior de un recipiente.
12. Antioxidante del oxidante de la fórmula
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o una sal farmacéuticamente
aceptable de la misma, o un complejo metálico de la misma en la que
dicho metal se selecciona de entre el grupo constituido por
manganeso, cobre o hierro, en la
que:
cada R_{1}' es independientemente un enlace
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Y'' es un grupo alquilo,
y en la
que
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
indica que se une a R_{2}' en
cualquier posición
y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
indica que se une a R_{2}' y al
sustituyente R_{1}' fenilo en cualquier
posición;
cada R_{2}' es independientemente un enlace o
-(CH_{2})_{n}- en la que n es de 1 a 4,
cada R_{3}' es independientemente -Y'', -COY''
o un grupo heterocíclico, en el que Y'' es tal como se definió
anteriormente e Y''' es una amina primaria, secundaria, terciaria o
cuaternaria,
en la que cuando R_{1}' es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R_{3}' no es COY'' y
en la que
-R_{1}'-R_{2}'-R_{3}',
conjuntamente, no son
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
13. Antioxidante según la reivindicación 12, en
la que dicho antioxidante presenta la estructura siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
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