ES2232880T3 - Dominio de ubiquitinacion e2f y ensayos para inhibidores de la ubiquitinacion e2f. - Google Patents

Abstract

EL FACTOR DE TRANSCRIPCION E2F CONTIENE UN CAMPO DE INTERACCION CON LA UBIQUITINA. LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A ANALISIS DESTINADOS A LA PRODUCCION DE INHIBIDORES DE DICHO DOMINIO.

Description

Dominio de ubiquitinación E2F y ensayos para inhibidores de la ubiquitinación E2F.

La presente invención se refiere a la interacción del factor de transcripción E2F con la ubiquitina, y a ensayos para moduladores de esta interacción.

Los factores de transcripción E2F controlan la expresión de al menos tres grupos de genes que están implicados en la regulación del ciclo celular. Primero, se han hallado sitios para E2F en el promotor del gen temprano inmediato c-myc (Hiebert et al., 1989; Oswald et al., 1994). Además, E2F contribuye a la regulación de varios genes cuya expresión es activada en la fase G1 del ciclo celular, incluyendo la ciclina E, el E2F-1 y la p107 (Degregori et al., 1995; Johnson et al., 1994; Neuman et al., 1994; Zhu et al., 1995). Finalmente, el E2F contribuye a la expresión regulada por el ciclo celular de un cierto número de genes que son necesarios durante la fase S, tales como la ciclina A, la reductasa de dihidrofolato, la polimerasa a del ADN, y la quinasa de timidina (revisado por Farnham et al., 1993). Los factores de transcripción E2F son heterodímeros que contienen uno de los cinco polipéptidos E2F relacionados, y uno de los dos polipéptidos DP (revisado por Beijersbergen y Bernards, 1996).

La actividad de los diversos factores de transcripción E2F está regulada a tres niveles diferentes. Primero, la abundancia de E2F está regulada al nivel de transcripción. Por ejemplo, E2F-4 es la especie de E2F más prominente en las células quiescentes, mientras que el E2F-1 está ausente en las células quiescentes y es inducido transcripcionalmente en la G1 tardía después de la estimulación con suero (Johnson et al., 1994; Sardet et al., 1995). En segundo lugar, la transactivación por parte de los E2F está regulada negativamente por la formación de complejo con uno de los tres miembros de la familia de proteínas con bolsillo (pocket protein) del retinoblastoma, pRb, p107 y p130 (revisado por Beijersbergen y Bernards, 1996). El E2F-1, 2, y 3 interaccionan preferentemente con la pRb; el E2F-4 con la p107 y p130 (Beijersbergen et al., 1994; Ginsberg et al., 1994; Vairo et al., 1995); E2F-5 with p130 only (Hijmans et al., 1995). Es probable que estos complejos de E2F-proteína con bolsillo realicen funciones diferentes durante el ciclo celular, puesto que el ritmo de su aparición difiere. La mayoría de las células quiescentes tienen un complejo E2F mayoritario que consiste en el E2F-4 en complejo con la p130 (Chittenden et al., 1993; Cobrinik et al., 1993; Vairo et al., 1995). Las células que están creciendo exponencialmente contienen cantidades significativas de E2F libre y de complejos E2F-p107 (Beijersbergen et al., 1995; Cobrinik et al., 1993; Lees et al., 1992; Shirodkar et al., 1992). Los complejos E2F-proteína con bolsillo se regulan mediante la fosforilación de las proteínas con bolsillo por parte de los complejos de ciclina/quinasa dependiente de ciclina (cdk) de la G1. La pRb puede ser fosforilada mediante los complejos ciclina D/cdk4, ciclina E/cdk2 y ciclina A/quinasa de cdk2 (Dowdy et al., 1993; Ewen et al., 1993; Hinds et al., 1992). Por contra, la p107 sólo es fosforilada eficientemente por la ciclina D/cdk4 (Beijersbergen et al., 1995). Además, varias oncoproteínas virales, incluyendo la E1A de adenovirus, pueden desbaratar los complejos E2F-proteína con bolsillo a través de la unión con elevada afinidad a las proteínas con bolsillo (Whyte et al., 1988). Un tercer nivel de regulación de la actividad del E2F concierne a la regulación de la actividad de unión al ADN. Krek et al. (1994) han mostrado que el E2F-1 puede interaccionar directamente con la ciclina A, lo que resulta en la fosforilación de la DP-1 en la fase S, causando la desregulación de la actividad unidora a ADN del E2F. La desregulación del E2F en la fase S parece ser importante en la homeostasis celular, puesto que la sobreexpresión del E2F, o los mutantes de E2F que resistan la desregulación de la ciclina A, pueden causar la apoptosis y transformación (Beijersbergen et al., 1994; Johnson et al., 1994; Krek et al., 1995; Qin et al., 1994; Singh et al., 1994; Wu y Levine, 1994).

Los sitios de unión al E2F del ADN en los promotores pueden actuar tanto como elementos reguladores positivos como negativos, dependiendo del contexto del promotor (Lam y Watson, 1993). La acción de los sitios E2F como elementos reguladores negativos se explica más fácilmente mediante el hallazgo de que las proteínas con bolsillo pueden mediar la represión transcripcional activa (Weintraub et al., 1995; Weintraub et al., 1002). Por tanto, los complejos E2F/proteína con bolsillo hallados en células quiescentes podrían contribuir a mantener la quiescencia a través de silenciamiento transcripcional activo de los genes activados por factores del crecimiento.

Muchas de las proteínas que contribuyen a la regulación del ciclo celular aparecen y desaparecen rápidamente, a menudo de una forma regulada por el ciclo celular. La degradación de las proteínas inestables frecuentemente implica la vía de la ubiquitina-proteasoma (Hilt y Wolf, 1996; Hochstrasser, 1995; Jentsch, 1992; Jentsch y Schlenker, 1995; Rubin y Finley, 1995). Este sistema actúa mediante el anclaje covalente de múltiples polipéptidos ubiquitina al sustrato. La ubiquitina es una proteína de 76 aminoácidos altamente conservada que se halla en células eucariotas. La ubiquitinación requiere la acción de tres enzimas diferentes. Una enzima que activa la ubiquitina (E1), el cual une la ubiquitina y la transfiere a una enzima que se conjuga con la ubiquitina (UBC o E2) (Haas y Rose, 1982; Pickart y Rose, 1985), el cual a su vez podría necesitar la asistencia de una ligasa de ubiquitina (E3) para anclar covalentemente el residuo ubiquitina al sustrato en un residuo lisina. Cada ubiquitina covalentemente unida a un residuo lisina de la proteína sustrato es ubiquitinada adicionalmente en un residuo lisina en la propia secuencia de la ubiquitina. La multi-ubiquitinación actúa como una señal clasificadora que apunta a sustratos para su rápida degradación por el proteasoma, un complejo de enzimas proteolíticas (Chau et al., 1989).

A partir del hallazgo de que el CDC34, un gen de levadura requerido para la transición de G1 a S, era idéntico al UBC3 de levadura, un enzima que se conjuga con la ubiquitina (Goebl et al., 1994), se originó un enlace importante entre la maquinaria del ubiquitina-proteasoma y la regulación del ciclo celular. Otros sustratos del CDC34 incluyen las ciclinas G1 de levadura y el inhibidor p40^{Sic1} de la ciclina/cdk (Deshaies et al., 1995; Schwob et al., 1994; Yaglom et al., 1995). En las células de mamíferos, recientemente se mostró que el inhibidor p27 de la ciclina/cdk era degradado, de forma dependiente del ciclo celular, por la vía ubiquitina-proteasoma (Pagano et al., 1995). En la levadura embrionaria, la ciclina Clb5 de la fase S y la ciclina mitótica Clb2 son ubiquitinadas a través de la UBC9 (Seufert et al., 1995), y también se ha observado que la ciclinas mitóticas de Xenopus son degradadas a través de la ubiquitinación (Glotzer et al., 1991).

En ésta describimos que los factores de transcripción E2F son inestables debido a su destrucción por la vía ubiquitina-proteasoma y que su degradación está altamente regulada.

En consecuencia, la presente invención proporciona un procedimiento de ensayo para un inhibidor de la degradación del factor de transcripción E2F mediada por ubiquitina, procedimiento que comprende:

a)

poner en contacto un polipéptido, que contiene un dominio que hace del E2F un sustrato para la ubiquitinación, con un candidato a inhibidor; y

b)

determinar si el candidato a inhibidor es capaz de reducir la ubiquitinación de dicho polipéptido.

El polipéptido podría ser una proteína E2F o un fragmento de la misma, el cual es capaz de unirse a una proteína con bolsillo, o el polipéptido podría comprender un polipéptido indicador tal como el LacZ.

Preferiblemente, el dominio que hace del E2F un sustrato para la ubiquitinación comprende los 63 aminoácidos de la región C-terminal del E2F-1, o los 138 aminoácidos del dominio C-terminal del E2F-4, o una porción de los mismos, tal como los 112 aminoácidos C-terminales.

El ensayo se realizará normalmente en un formato en donde el polipéptido se expresa en un célula hospedadora a partir de un vector de expresión, tal como un vector de expresión en el que el polipéptido está operativamente unido a un promotor del CMV.

En una realización, se co-expresa un polipéptido DP-1 en la célula hospedadora.

Los ensayos de la invención podrían llevarse a cabo en presencia de un inhibidor de la proteasoma.

En el ensayo de la invención, la determinación de si el candidato a inhibidor es capaz de reducir la ubiquitinación de dicho polipéptido podría realizarse proporcionando ubiquitina y determinando la cantidad de dicha ubiquitina que se ha unido a dicho polipéptido. Esto podría conseguirse realizando el ensayo en una célula hospedadora que exprese la ubiquitina de forma natural, o que contiene un vector de expresión capaz de expresar la ubiquitina. La ubiquitina podría marcarse con un epítopo capaz de unirse a un anticuerpo monoclonal, tal como un epítopo HA.

En otro aspecto, la invención también proporciona un vector que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido E2F truncado, el cual es el 1-374 del E2F-1.

En un aspecto adicional, la invención también proporciona un procedimiento de ensayo para un potenciador de la degradación del factor de transcripción E2F mediada por la ubiquitina, procedimiento que comprende:

a)

poner en contacto un polipéptido, que contiene un dominio que hace del E2F un sustrato para la ubiquitinación, con un candidato a promotor; y

b)

determinar si el candidato a promotor es capaz de reducir la ubiquitinación de dicho polipéptido.

Las diversas realizaciones preferidas del ensayo para inhibidores descritas en ésta podrían usarse también en este aspecto adicional de la invención.

Las secuencias de aminoácidos del E2F-1 y E2F-4 se muestran respectivamente como SEC. Nº ID.: 1 y SEC. Nº ID.: 2.

Descripción detallada de la invención

En la presente solicitud, la referencia al factor de transcripción E2F se refiere a la familia de factores de transcripción capaces de formar un heterodímero con un factor de transcripción DP, tal como describieron Beijerbergen y Bernards, 1996, (cuyo descubrimiento se incorpora en ésta por referencia) y capaces de formar un complejo con un miembro de la familia de proteínas con bolsillo del retinoblastoma, tal como la pRb, p107 o p130.

Las proteínas E2F se hallan en células de mamíferos. Son representativos de miembros específicos de la familia E2F aquellos miembros hallados en células humanas. Por ejemplo, el E2F-1 humano se muestra como la SEC. Nº ID.: 1. Los E2F-2 y E2F-3 humanos se describen, por ejemplo, en Lees et al., Mol. Cell. Biol. 13:7813-7825 (1993), los descubrimientos de la cual se incorporan en ésta por referencia. El E2F-4 humano se muestra como la SEC. Nº ID.: 3. El E2F-5 humano se describe, por ejemplo, en la WO/96/25494, los descubrimientos de la cual se incorporan en ésta por referencia.

También están disponibles las proteínas E2F de otras especies, tales como ratones, o se podrían clonar usando procedimientos estándares conocidos en el campo per se y por referencia a las técnicas usadas para clonar las proteínas E2F humanas mencionadas más arriba.

Podrían usarse variantes sintéticas de las proteínas E2F humanas o de otras especies. Las variantes sintéticas incluyen aquéllas que tienen al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, de homología con el E2F-1 o E2F-4 humanos. Más preferiblemente, tales variantes corresponden a una secuencia de dichos E2F-1 o E2F-4 humanos, pero tienen una o más, por ejemplo, de 1 a 20, tal como desde 2, 5 ó 10 sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos.

Tales variantes deseablemente retienen una o ambas de las siguientes propiedades funcionales:

(i)

la capacidad de causar que la proteína E2F experimente la degradación mediada por ubiquitina, tal como se describe en ésta para las varias proteínas E2F ejemplificadas; y

(ii)

la capacidad de unirse a una proteína con bolsillo.

Ambas propiedades funcionales podrían determinarse mediante experimentación de rutina, por referencia a los procedimientos ilustrados en los ejemplos que acompañan.

El procedimiento de ensayo para los moduladores de la degradación del E2F mediada por ubiquitina es útil para determinar sustancias candidatas que pueden influenciar la progresión o detención del ciclo celular. Esto se debe a que el E2F es necesario en el control del ciclo celular, y su modulación podría influenciar la progresión o detención del ciclo o podría inducir la apoptosis. Por tanto, las sustancias moduladoras que son capaces de reducir o incrementar la ubiquitinación del E2F serán útiles para detener el ciclo celular. Tales sustancias serán útiles en la investigación, por ejemplo, para proporcionar poblaciones sincronizadas de células. Las sustancias inhibidoras también podrían usarse en medicina, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades proliferantes tales como el cáncer.

El ensayo podría realizarse en cualquier formato apropiado diseñado para examinar la interacción del E2F con la ubiquitina. Por ejemplo, el ensayo podría realizarse en un sistema in vitro libre de células, en el cual el polipéptido, la sustancia inhibidora, y la ubiquitina se proporcionan juntas con otros componentes celulares implicados en el proceso de ubiquitinación. Podría usarse un lisado de reticulocito de conejo como base para un sistema libre de células, suplementado con un enzima activador de la ubiquitina (E1) y ATP.

No obstante, preferiblemente el ensayo se realiza en una célula hospedadora que contiene un vector de expresión capaz de expresar el polipéptido E2F. La célula hospedadora también podría contener un vector de expresión adicional capaz de expresar un polipéptido DP, tal como el DP-1. La célula hospedadora también podría contener un vector capaz de expresar la ubiquitina. Cualquiera o la totalidad de los polipéptidos codificados por los vectores de expresión podrían incluir un epítopo que sea capaz de ser detectado por un anticuerpo monoclonal. El epítopo es generalmente uno que no está normalmente presente en la célula hospedadora, tal como el epítopo HA del virus de la gripe.

Cuando al ensayo de la invención se le proporciona un vector que codifica la ubiquitina, la ubiquitina codificada por el vector podría ser cualquier ubiquitina compatible con la célula hospedadora o sistema de ensayo in vitro que se esté usando. Por ejemplo, se han caracterizado varias ubiquitinas de mamíferos, y sus secuencias podrían obtenerse por referencia a la literatura publicada o a las bases de datos. Tal como se ha indicado más arriba, la ubiquitina podría marcarse con un epítopo detectable por un anticuerpo, y este epítopo podría fusionarse al extremo N- o C-terminal de la ubiquitina.

Generalmente se usarán las secuencias de la ubiquitina que ocurren de forma natural, por ejemplo de mamíferos, preferiblemente humana, aunque podrían hacerse pequeñas modificaciones a las secuencias, por ejemplo, podrían alterarse o suprimirse algunos residuos durante la introducción del ácido nucleico que codifica la ubiquitina en un vector de expresión apropiado, o durante la fusión de tal ácido nucleico a una secuencia que codifica el epítopo.

La célula hospedadora podría ser cualquier célula hospedadora apropiada en la cual pueda ocurrir la ubiquitinación del E2F. La conveniencia de las células hospedadora podría determinarse repitiendo procedimientos análogos a aquéllos descritos en los Ejemplos adjuntos en una célula hospedadora potencial, y determinando si ocurre o no la ubiquitinación del E2F. Los células hospedadoras apropiadas incluyen las células hospedadoras de mamíferos, tales como las células hospedadoras humanas o de ratón. Otras células hospedadoras incluyen las células de insectos o células hospedadoras de levaduras.

Aunque podría usarse una proteína E2F que ocurra de forma natural, o una variante sintética de la misma, el ensayo podría realizarse con otros polipéptidos, tales como proteínas de fusión que retienen el dominio de E2F que hace del E2F un sustrato para la ubiquitinación. Hemos hallado que este dominio está presente en la región C-terminal del E2F. Los experimentos descritos en los Ejemplos adjuntos demuestran que esta región está contenida dentro de los 63 aminoácidos C-terminales del E2F-1, aunque también podrían usarse porciones más pequeñas de esta región a condición de que retuvieran su función como sustrato. De este modo, por ejemplo, podría usarse un fragmento de esta región de 63 aminoácidos que comprendiera 10, 20, 30, 40 ó 50 aminoácidos con tal que un fragmento tal retenga la capacidad de hacer del E2F un sustrato para la ubiquitinación. La capacidad de tales fragmentos para funcionar como un sustrato de la ubiquitinación podría ensayarse mediante procedimientos de rutina basados en los Ejemplos adjuntos, o mediante el anclaje del fragmento a una proteína indicadora, tal como se describe más abajo.

De forma similar, hemos hallado que podría usarse como el dominio de ubiquitinación la región 138 C-terminal del E2F-4, y fragmentos de ésta, también de, por ejemplo, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 112 ó 120 aminoácidos. De nuevo, tales fragmentos podrían ser internos o C-terminales.

Los polipéptidos usados en los procedimientos de ensayo de la invención podrían contener más de un dominio de ubiquitinación, por ejemplo, de 1 a 10, tal como 2, 3, 4 ó 5 dominios. Estos dominios podrían estar presentes en repeticiones en tándem o en ambas, las regiones N- y C-terminales del polipéptido.

Alternativamente, el dominio de ubiquitinación se podría anclar a una proteína indicadora, tal como una proteína que puede proporcionar un cambio de color cuando se añaden los sustratos necesarios a la célula. Usualmente, tal anclaje se obtiene preparando una proteína de fusión codificada por un ácido nucleico que une la secuencia que codifica el dominio con una secuencia que codifica la proteína indicadora, estando la unión en pauta. Esto podría conseguirse mediante técnicas de clonación rutinarias. El dominio podría ser N- o C-terminal respecto la proteína indicadora. Tales proteínas indicadoras incluyen la lacZ o la peroxidasa de rábano silvestre. En esta realización del ensayo, el efecto del candidato a inhibidor podría medirse, añadiendo los sustratos necesarios para el cambio de color en presencia o ausencia del candidato, y midiendo la cantidad de cambio de color producida.

Alternativamente, el polipéptido indicador puede ser un activador de la transcripción específico de secuencia y el ensayo puede incluir una construcción informadora, la cual se expresa en presencia del activador de la transcripción específico de secuencia. Tales activadores incluyen, por ejemplo, el activador VP16 del herpesvirus o el activador GAL4 de levadura.

Cuando el ensayo de la invención se lleva a cabo en una célula hospedadora, y los diversos componentes del ensayo se proporcionan en vectores de expresión, los vectores podrían usar cualquier promotor apropiado capaz de funcionar en la célula hospedadora. Nosotros hemos usado promotores del CMV, aunque podrían usarse otros promotores virales o celulares. No obstante, es deseable que el promotor no esté regulado por el E2F y que se exprese independientemente del ciclo celular.

Cuando el polipéptido usado en el ensayo de la invención es una proteína E2F capaz de unirse a una proteína con bolsillo, la proteína deseablemente es la pRb, p107 ó p130.

El ensayo podría realizarse en presencia de un inhibidor del proteasoma, tal como el Cbz-LLL. Cuando se añade tal inhibidor, sucederá la poli-ubiquitinación del polipéptido, y puede detectarse en grandes cantidades puesto que los conjugados polipéptido-ubiquitina se acumularán en la célula y no estarán sometidos a degradación en el proteasoma.

Aunque es preferible que el ensayo de la invenciónse use para examinar inhibidores de la degradación del E2F mediada por la ubiquitina, el ensayo es también apropiado para examinar promotores de tal degradación. Las diversas realizaciones preferidas del ensayo descrito más arriba también podrían usarse en el ensayo de sustancias candidatas a promotor.

La naturaleza y cantidad de sustancias candidatas a inhibidor o promotor que se usará en el ensayo dependerá del formato de ensayo que se esté usando y de la naturaleza de la sustancia. Estos pueden ser determinados mediante ensayo y error de rutina por parte de los especialistas en la técnica. Las sustancias candidatas incluyen los péptidos basados en la región C-terminal del E2F, los cuales podrían competir con el E2F nativo por la ubiquitina en una célula. Cuando el ensayo de la invención se lleva a cabo en una célula hospedadora, la cantidad de sustancia candidata usada podría depender de su capacidad para entrar dentro de la célula. Los procedimientos y adyuvantes para potenciar la permeabilidad de las células son conocidos en la técnica y podrían usarse en ensayos de la presente invención. Podría usarse cualquiera entre las concentraciones sub-nanomolar y micromolar, por ejemplo, de 1 nM a 100 \muM.

Por tanto, los ensayos de la invención podrían usarse como la base para el diseño racional de fármacos basado en péptidos, o imitaciones de los mismos, diseñados en torno a la secuencia del dominio de ubiquitinación, o fragmentos del mismo, tales como aquéllos descritos más arriba.

Los anticuerpos dirigidos contra el dominio de ubiquitinación, o fragmentos de tales anticuerpos que retienen la capacidad de unirse a este dominio (incluyendo los anticuerpos humanizados) podrían usarse en el diagnóstico, prognosis, o tratamiento de condiciones en las que ocurre un control aberrante del ciclo celular, o que se sospecha ocurre a través de mutaciones u otra pérdida de función en el dominio de ubiquitinación del E2F. Tales condiciones generalmente serán aquéllas que implican la proliferación celular incontrolada, tales como el cáncer.

Los anticuerpos o fragmentos de los mismos dirigidos contra este dominio, los anticuerpos o fragmentos de los mismos dirigidos contra la ubiquitina, y los compuestos que unen un heterodímero E2F/proteína DP, podrían usarse en solos o en combinación en ensayos para, o procedimientos para tratar la proliferación celular incontrolada.

En un aspecto distinto, la presente invención proporciona vectores que codifican un E2F truncado (tal comoel E2F-1, E2F-2, E2F-3, E2F-4, o E2F-5) que no contiene un dominio C-terminal capaz de ubiquitinación. Tales polipéptidos incluyen el E2F-1 o E2F-4 que comprenden los residuos 1a aproximadamente 400, por ejemplo, aproximadamente 300, 320, 350, 375, 390, 410 ó 420. El extremo N-terminal también podría truncarse en unos pocos aminoácidos, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15 ó 20 aminoácidos. Un polipéptido tal es el E2F-1 1-374. Otros es el E2F-4 1-301. Otros polipéptidos de E2F truncado, tales como aquéllos mencionados más arriba, podrían prepararse y ensayarse de acuerdo con los procedimientos descritos en los Ejemplos adjuntos. Alternativamente, el E2F podría contener una región C-terminal, pero que esta región estuviera modificada para impedir la ubiquitinación del polipéptido en una célula hospedadora, por ejemplo, mediante supresión interna del dominio de ubiquitinación. La invención también proporciona vectores que codifican una proteína de fusión de un polipéptido indicador y uno o más dominios de ubiquitinación del E2F, siendo tales polipéptidos como se describe más arriba.

Estos polipéptidos truncados o modificados serían útiles para suministrar el factor de transcripción E2F a una célula que es resistente a la ubiquitinación. Así pues, tales polipéptidos podrían reducir la proliferación celular, puesto que se acumularán en la célula y mediarán la represión transcripcional a través de su interacción con proteínas con bolsillo.

Los vectores que codifican los diversos polipéptidos E2F truncados y modificados, así como otros polipéptidos descritos más arriba, podrían prepararse usando técnicas de clonación estándares, las cuales son bien conocidas en el campo. Los Ejemplos adjuntos describen un cierto número de vectores apropiados, y pueden prepararse vectores adicionales a partir de éstos mediante procedimientos de rutina. Por ejemplo, los polipéptidos truncados o modificados podrían prepararse mediante mutagénesis dirigida a un sitio del ácido nucleico que codifica las proteínas no modificadas. Podrían usarse las técnicas de clonación mediante la PCR para obtener ácido nucleico que codifica otros factores de transcripción no específicamente citados en los Ejemplos, y estas técnicas pueden usarse también para introducir cambios en la secuencia de ADN que ocurre de forma natural, con objeto de producir polipéptidos truncados o modificados.

Generalmente, los vectores para uso en la invención serán vectores de ADN, aunque también podrían usarse vectores de ARN.

La invención se ilustra mediante los Ejemplos adjuntos.

Ejemplos La p107 y la E1 de adenovirus incrementan los niveles de E2F-4 y proteína DP-1

Para investigar el efecto de la expresión de la p107 sobre la estabilidad del E2F-4 y la proteína DP-1, transfectamos transitoriamente células de carcinoma cervical C33A con los vectores de expresión del E2F-4 y la DP-1 marcados con el epítopo HA, tanto en presencia como en ausencia de la p107. Las células C33A se transfectaron con 0,5 \mug de pRc-HA-E2F-4, 0,5 \mug de pCMV-HA-DP-1 y 0,5 \mug de pRc-HA-cat en combinación con 5 \mug de pCMV-HA-p107 ó 5 \mug de p5Xhocc4, según se indica. 36 después de la transfección, se lisaron las células y los extractos de las células se sometieron a SDS-PAGE al 7,5%. Las proteínas separadas se transfirieron a nitrocelulosa y las proteínas marcadas con el HA se detectaron mediante análisis Western con el mAb 12CA5. Se halló que la transfección de los vectores de expresión del E2F-4 y de la DP-1 bajo control del promotor del CMV sólo rinde niveles bajos de proteína propios del estado estacionario. Sin embargo, la co-expresión de la p107 causó un dramático incremento en la abundancia tanto del E2F-4 como de la proteína DP-1. De forma similar, la expresión de la región 1 temprana del adenovirus 5 (Ad5 E1, que dirige la expresión de ambas, las proteínas E1A y E1B), causó un incremento significativo en los niveles del E2F-4 y de la proteína DP-1. Como control interno, monitorizamos el efecto de la p107 y de la Ad5 E1 sobre la abundancia de la subunidad catalítica de 36 kDa, marcada con HA y co-transfectada, de la proteína fosfatasa 2A (PP2A), cuya expresión está bajo control del mismo promotor del CMV que el E2F-4 y la DP-1. Esta proteína sólo fue afectada de forma marginal por la expresión de la p107 y Ad5 E1. Cuando se omitió el control interno de PP2A de la transfección se observaron los mismos efectos sobre la abundancia del E2F. De forma importante, los niveles de ARNm del E2F-4 medidos 36 horas después de la transfección mediante análisis Northern, no estaban significativamente afectados por la co-transfección con la p107 o la Ad5 E1. Tomado en conjunto, esto sugiere que la p107 y la Ad5 E1 influyen, bien sobre la traducción del ARNm del E2F-4 y DP-1, bien sobre la estabilidad de la proteína.

La p107 y la E1 de adenovirus estabilizan las proteínas E2F-4 y DP-1

Para investigar el efecto de la p107 sobre la estabilidad del E2F-4 y de la proteína DP-1, realizamos un experimento de pulso y caza. Se transfectaron transitoriamente células C33A con vectores de expresión del E2F-4 y la DP-1 marcados con HA en presencia o ausencia de p107 marcada con HA. Las células C33A se transfectaron con 3,0 \mug de pRc-HA-E2F-4 y 1,0 \mug de pCMV-HA-DP-1 en combinación con 10 \mug de pCMV-HA-p107 o con 10 \mug de p5Xhocc4. Treinta y seis horas después de la transfección, las células se marcaron con un pulso durante 2 horas con una mezcla de [^{35}S]-metionina-cisteína, y se cazaron con un exceso de 10 veces de metionina y cisteína no radiactivas durante 0, 2, 4 y 108 horas. Se lisaron las células, y se realizaron las inmunoprecipitaciones con el mAb 12CA5. Las proteínas inmunoprecipitadas se separaron mediante SDS-PAGE al 10%. Se halló que la proteína E2F-4 tenía una vida media corta en ausencia de la p107 cotransfectada, mientras que la expresión de la p107 incrementaba significativamente la vida media de ambos, la E2F-4 y la DP-1. La expresión ed la Ad5 E1 también causaba un incremento en la vida media del E2F-4 y la DP-1. Cuantificamos las intensidades de las bandas en el gel usando un fosforimager. Las intensidades de las proteínas marcadas con [^{35}S] se midieron después de exponer las placas del fosforimager y se calcularon en comparación con proteínas presentes en el instante cero. Los resultados de este análisis indican que la E2F-4 libre tiene una vida media de aproximadamente 2-3 horas, mientras que la p107 y la Ad5 E1 incrementan la vida media respectivamente hasta aproximadamente 8 y 10-12 horas. Estos datos indican que las proteínas codificadas por la p107 y la Ad5 E1 interfieren con la proteolisis de las proteínas E2F-4 y la
DP-1.

A continuación nos preguntamos si la E2F-1 estaba afectada de forma similar por la expresión de su proteína con bolsillo pareja, la pRb y por la Ad5 E1. Transfectamos vectores de expresión de la E2F-1 y la DP-1 marcadas con HA tanto en presencia como en ausencia de vectores de expresión de la pRb y Ad5 E1. Se transfectaron células C33A con 0,5 \mug de pCMV-HA-E2F-1, 0,5 \mug de pCMV-HA-DP-1 y 0,5 \mug de pRc-HA-cat en combinación con 5 \mug de pCMV-pRb o 5 \mug de p5Xhocc4. 36 después de la transfección, se lisaron las células y los extractos de las células se sometieron a SDS-PAGE al 7%. Las proteínas separadas se transfirieron a nitrocelulosa y las proteínas marcadas con HA se detectaron mediante análisis Western con mAb 12CA5. De nuevo, la expresión de la pRb y Ad5 E1 incrementaba enormemente la E2F-1, y en menor grado los niveles de proteína DP-1, aunque con la E2F-1 también se observó un efecto de ambas, la pRB y la Ad5 E1, sobre la unidad catalítica de la PP2A de control. Lo más probable es que éste se deba al hecho de que la expresión de la E2F-1, pero no la de la E2F-4, causa apoptosis, la cual es inhibida por la pRb y por la proteína E1B de 19 kDa de adenovirus (White et al., 1992). Sin embargo, parece que la E2F-4 y la E2F-1 son afectadas de forma similar por la expresión de la proteína con bolsillo Ad5 E1.

El E2F es degradado por la vía del ubiquitina-proteasoma

Muchas proteínas celular de vida corta están destinadas a ser degradadas mediante la vía ubiquitina-proteasoma. Un paso clave en este proceso implica la unión covalente de múltiples cadenas polipeptídicas de ubiquitina al sustrato, lo que hace al sustrato blanco de una degradación rápida por parte del proteasoma. Estos conjugados ubiquitina-sustrato son altamente inestables y a menudo pueden visualizarse solamente mediante el tratamiento de las células con inhibidores del proteasoma.

Para comprobar si el proteasoma está implicado en la degradación de la E2F in vivo, transfectamos células con los vectores de expresión de la E2F-1 y de la DP-1. Se transfectaron células U2-OS con 5,0 \mug de pMT123 (que expresa la proteína ubiquitina marcada con HA), 5,0 \mug de pRc-E2F-1 y 3,0 \mug de pRc-DP-1 en diferentes combinaciones. Transcurridas veinticuatro horas, se incubaron las células transfectadas durante la noche con carboxibenzil-leucil-leucil-leucinal (Cbz-LLL) 10 \muM, un inhibidor potente y específico de los proteasomas (Rock et al., 1994; Wiertz et al., 1996). Los niveles de proteína E2F se midieron mediante transferencia Western con el mAb KH95 para detectar la proteína E2F-1. La incubación de células transfectadas con la E2F-1 con el Cbz-LLL causó un incremento dramático en los niveles de proteína E2F-1 en comparación con los controles no tratados. Además, en las células tratadas con inhibidor eran visibles varias bandas de peso molecular más elevado, las cuales, lo más probablemente, representan formas de la E2F-1 conjugada con ubiquitina. Para verificarlo, transfectamos células como más arriba con el vector de expresión de la E2F-1 (sin marcar) y un vector de expresión de la ubiquitina marcada con HA. Transcurridos dos días, se inmunoprecipitaron los lisados de las células con el anticuerpo monoclonal KH9 S anti-E2F-1, y se realizó la transferencia Western con anticuerpo 12CA5 para detectar los conjugados de ubiquitina. Cuando se cotransfectaron la E2F-1 y la ubiquitina marcada con HA con el inhibidor del proteasoma, se observó una mancha de conjugados de E2F-ubiquitina que oscilaban desde los 70 kDa hasta varios cientos de kDa. No se observaron conjugados E2F-ubiquitina cuando se omitió el inhibidor del proteasoma, o cuando se transfectaron por separado los vectores de la E2F-1 y de la ubiquitina marcada con HA. En conjunto, estos datos sugieren que la E2F libre puede ser poli-ubiquitinada in vivo y que la E2F-1 es degradada por el proteasoma.

Se llevaron a cabo experimentos adicionales en los que el plásmidos pRc-E2F-1 se remplazaba con la misma cantidad de pRc-E2F-4. Estos también mostraron que las células transfectadas tratadas con Cbz-LLL causaban un incremento en los niveles de proteína E2F-4.

Un epítopo carboxi-terminal hace la E2F inestable

Para comprobar si secuencias específicas en E2F-1 son las responsables de su inestabilidad, usamos dos mutantes por supresión del extremo carboxi-terminal. Se ensayaron los niveles de expresión de proteína de estos mutantes en ensayos de transfección transitoria. Se transfectaron células C33A con 0,5 \mug de pRc-E2F-1, 0,5 \mug de pCMV-E2F-1 (aa. 1-284), o 0,5 \mug de pCMV-E2F-1 (aa. 1-374) en combination con 0,5 \mug de pRc-HA-cat. 36 horas después de la transfección, se prepararon extractos de células y se separaron mediante SDS-PAGE al 7,5%. Las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a análisis de transferencia Western, bien usando el mAb KH20, dirigido contra el extremo amino-terminal de la E2F-1, bien usando el 12CA5 que reconoce la subunidad catalítica de la PP2A marcada con HA. Tanto la E2F-1 (1-284) como la E2F-1 (1-374) se expresaron con niveles significativamente incrementados en comparación con la E2F-1 del tipo salvaje (1-437) expresada en el mismo vector, mientras que la expresión de la subunidad catalítica de la PP2A marcada con HA cotransfectada no estaba afectada por ninguna de las construcciones de la E2F-1. En este experimento, los niveles del ARNm del tipo salvaje y de los mutantes de la E2F-1 también eran equivalentes. Por tanto, concluimos que un epítopo en los 63 aminoácidos carboxi-terminales de la E2F-1 hace a la proteína susceptible de degradación rápida.

Puesto que el sitio de unión de la pRb sobre la E2F-1 se solapa con la señal de degradación en el extremo carboxi-terminal de la E2F-1, ensayamos si los mutantes por supresión carboxi-terminal de la E2F-1 podían ser estabilizados por la pRb. Se transfectaron células C33A con 2,0 \mug de pRc-E2F-1 (aa. 1-284), 2,0 \mug de pCMV-E2F-1 (aa. 1-374) y 2,0 \mug de pRc-DP-1 en combinación con 10 \mug de pCMV-pRb. 36 después de la transfección, se prepararon extractos de las células y se separaron las proteínas mediante SDS-PAGE al 10%, se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a análisis de transferencia Western usando el mAb KH20 dirigido contra un epítopo en el extremo amino-terminal de la E2F-1. Hallamos que la abundancia de las proteínas E2F-1 (1-284) y E2F-1 (1-374) no se veía afectada por la co-expresión de la pRb.

36 horas después de su transfección, se rasparon en PBS células transfectadas de idéntica forma, y se aisló el ARN total, se separó en un gel de agarosa, y se transfirió a nitrocelulosa. Se realizó el análisis de transferencia Northern usando una sonda de cADN de E2F-1 de longitud completa. Esto mostró que los ARNm para esto mutantes de la E2F-1 tampoco estaban afectados por la expresión de la pRB (FIGURA 6B). En conjunto, estos datos sugieren que la pRB estabiliza la E2F apantallando el epítopo sobre la E2F que es reconocido por la maquinaria proteolítica.

La estabilización de la E2F-4 se correlaciona con la unión a proteína con bolsillo

Para comprobar si la estabilización de la E2F-4 se correlacionaba con la unión a proteína con bolsillo, transfectamos la E2F-4 con vectores de expresión de la p107 del tipo salvaje o mutante. Los niveles de proteína E2F-4 se monitorizaron mediante análisis de transferencia Western. Las células C33A se transfectaron con vectores de expresión de la E2F-4 y DP-1 en presencia o ausencia de vectores de expresión de la p107 del tipo salvaje o mutante marcada con HA. Los extractos de proteínas procedentes de células transfectadas, normalizados según los niveles de ARNm, se separaron en un gel de poliacrilamida al 7,5%, y la proteína E2F-4 y el nivel de expresión de las proteínas p107 del tipo salvaje y mutante se detectaron con el anticuerpo 12CA5. Se halló que la cotransfección de la E2F-4 con la p107 del tipo salvaje, la p107-N385, o la p107-\Delta27, todas las cuales pueden unirse a la E2F-4 (Zhu et al., 1995a), causaba que la E2F-4 se acumulara con niveles superiores. Por contra, la p107-\Delta28, que no se une a la E2F-4 (Zhu et al., 1995a), no consiguió incrementar la abundancia de la proteína E2F-4, incluso aunque este mutante se expresaba al mismo nivel que los otros mutantes de la p107.

El complejo entre la E2F-4 y p107 es interrumpido mediante fosforilación de la p107 por la ciclina D1/cdk4, pero no por la ciclina A/cdk2 o la ciclina E/cdk2 (Beijersbergen et al., 1995). Por tanto, nos preguntamos si la expresión de estas ciclinas/cdk afectaría la capacidad de la p107 para estabilizar la E2F-4. Se transfectaron células C33A cells con HA-E2F-4/HA-DP-1 en presencia de HA-p107, junto con varias combinaciones de ciclina/cdk. Las proteínas E2F-4, DP-1, y p107 transfectadas se detectaron en una transferencia Western con anticuerpo 12CA5. Se halló que la expresión de la ciclina D1/cdk4 impide el incremento en abundancia de la E2F-4 mediado por la p107. Por contra, la expresión de ambas, la ciclina E/cdk2 y la ciclina A/cdk2 no consiguió interferir con la estabilización de la E2F-4 por parte de la p107.

En las células quiescentes, el complejo de E2F-4 con proteína con bolsillo mayoritario es el E2F-4-p130 (Cobrinik et al., 1993; Vairo et al., 1995). Por tanto, nos preguntamos si la p130 compartía con la p107 la capacidad de estabilizar la proteína E2F-4. Se transfectaron células C33A con HA-E2F-4/DP-1, en presencia de p107 ó 130, junto con ciclina D1/cdk4 o cdk4-dominante negativa. La E2F-4 se detectó en una transferencia Western con el anticuerpo 12CA5.

La expresión de la p130 causó un incremento similar en los niveles de proteína E2F-4 al de la p107. Más aún, la fosforilación de ambas proteína con bolsillo por parte de la ciclina D1/cdk4 abolió la estabilización de la E2F-4 mediada por proteína de bolsillo, mientras que la expresión de la cdk4 dominante-negativa no tuvo ningún efecto. Tomados en conjunto, estos datos apoyan fuertemente la noción de la que E2F-4 es estabilizada a resultas de la unión directa de una proteína con bolsillo pareja.

Un epítopo carboxilo terminal hace la E2F inestable

Los datos anteriores indican que la E2F-4 es inestable y que la unión de proteínas con bolsillo al extremo carboxi-terminal de la E2F-4 causa un incremento en la vida media de la E2F-4. Por tanto, nos preguntamos si un mutante de la E2F-4 por supresión carboxi-terminal, \DeltaE2F-4 que codifica los aminoácidos 1-301 de la E2F-4 y que carece de la superficie de interacción con la p107, difería de la E2F-4 del tipo salvaje en estabilidad. Se transfectaron células C33A con vectores de expresión de la E2F-4/DP-1 o \DeltaE2F-4/DP-1 (expresando los aminoácidos 1-301 de la E2F-4) en presencia o ausencia de la p107. Los extractos de proteínas de las células transfectadas se normalizaron según el contenido en ARNm. La proteína E2F-4 se detectó en una transferencia Western con el anticuerpo C-108. La transferencia Northern del ARN procedente de células transfectadas transitoriamente se sondeó con cADN de E2F-4, después de la normalización para cantidades iguales de ARNm de E2F-4 y \DeltaE2F-4 (ver Materiales y Procedimientos). La E2F-4 y la \DeltaE2F-4 se inmunoprecipitaron con anticuerpo 12CA5. Después de la normalización según los niveles de ARNm en las células transfectadas, la \DeltaE2F-4 se expresaba a un nivel sustancialmente superior en comparación con la E2F-4 del tipo salvaje. También se llevaron a cabo experimentos de pulso-y-caza usando ambas, la E2F-4 del tipo salvaje y la \DeltaE2F-4 were also conducted. Las células se marcaron con un pulso de una mezcla de [^{35} S] metionina-cisteína, y se cazaron con un exceso de aminoácidos fríos. Los experimentos revelaron que la diferencia en acumulación de proteína estaba causada por una vida media significativamente prolongada de la proteína \DeltaE2F-4 en comparación con la proteína E2F-4 del tipo salvaje (2 horas respecto 18 horas). Por tanto, los 112 aminoácidos carboxi-terminales de la E2F-4 albergan un epítopo que hace a la proteína inestable. De forma significativa, la expresión de la p107 causó un incremento en la abundancia de la E2F-4 del tipo salvaje, pero no afectó los niveles de proteína de la \DeltaE2F-4. Como un control adicional de la especificidad, mostramos que abundancia de p27, una proteína nuclear lábil que no interacciona con la p107 (Polyak et al., 1994; Toyoshima y Hunter 1994), también era afectada por la p107. Tomados conjuntamente, estos datos apoyan la noción de que la unión de la E2F-4 a la p107 causa que la proteína sea estable, y que la p107 no influencia la estabilidad de la proteína de forma no específica.

El extremo carboxilo-terminal de la E2F-4 hace inestable un factor de transcripción de levadura

Se transfectaron células U2-OS de osteosarcoma humano con vectores de expresión que dirigen la síntesis del dominio de unión al ADN de la GAL4 de levadura (aminoácidos 1-147) fusionado con el extremo carboxi-terminal de la E2F-4 (aminoácidos 276-413), o la GAL4 de levadura (1-147), o se cotransfectaron con el vector quimérico GAL4-E2F-4 y el vector de expresión de la p107. Dos días después de la transfección, se prepararon lisado a partir de células transfectadas, y se detectó la abundancia de las proteínas GAL4 en una transferencia Western usando un anticuerpo monoclonal contra el dominio unidor de ADN de la GAL4. En ausencia de la p107, la cantidad de proteína de fusión GAL4-E2F-4 (276-413) observada era inferior a la de GAL4 sola. La cotransfección de los vectores de la GAL4-E2F-4 vector y de la p107 restauró los niveles de la fusión GAL4-E2F a aquéllos de la GAL4 sola. Puesto que en las tres transfecciones se detectaron cantidades iguales de ARNm de GAL4, concluimos que la abundancia reducida de la proteína de fusión GAL4-E2F-4 en comparación con la proteína progenitora GAL4 (1-147) es el resultado de la reducida estabilidad proteica de la proteína GAL4-E2F-4.

La E2F-4 es inestable en levadura

Hemos hallado que la levadura (S. cerevisiae) tiene la capacidad de degradar la E2F a través de la ubiquitinación. Nuestros datos recientes indican que la E2F del tipo salvaje es inestable en levaduras, mientras que una E2F-4 truncada de forma C-terminal es más estable. Se transformó la cepa Y190 de levadura con vectores de expresión en levadura (pPC97) que dirigían la síntesis, bien de la E2F-4 del tipo salvaje, bien de la E2F-4 truncada de forma C-terminal que codifica los aminoácidos 1-301 de la E2F-4. Se prepararon lisados de proteínas a partir de dos cultivos duplicados de levaduras creciendo exponencialmente, y se analizaron los niveles de proteína E2F mediante análisis Western usando anticuerpo monoclonal anti-E2F-4. Los cultivos de levaduras expresaron cantidades iguales del ARNm de la E2F-4 del tipo salvaje o mutante, pero a nivel de proteína, las cantidades de la \DeltaE2F-4 fueron varias veces superiores, indicando que la truncación hace la proteína más estable.

Discusión

En ésta mostramos que ambos, los componentes E2F y DP de los factores de transcripción E2F son inestables. Dos líneas de evidencia indican que la E2F es un sustrato del sistema ubiquitina-proteasoma de proteolisis dirigida. Primero, la incubación de las células con un inhibidor específico del proteasoma conduce a una acumulación significativa de la proteína E2F. Más aún, mostramos que en células tratadas con inhibidor del proteasoma se acumulan cantidades significativas de conjugados E2F-poli-ubiquitina. Se sabe que la poli-ubiquitinación actúa como una señal clasificadora que destina dirige las proteínas hacia una degradación rápida por parte del proteasoma (Chau et al., 1989). Hemos ubicado el dominio que hace la E2F-1 inestable en los 63 residuos carboxi-terminales, lo que está en estrecha proximidad con el sitio de unión de la E2F-1 para la pRb (Helin et al., 1992; Kaelin et al., 1992). Nuestros datos indican que la unión de la pRb o la p107 a los heterodímeros de E2F/DP protege ambos polipéptidos de la degradación. Nuestros datos sugieren un modelo en el cual las proteínas con bolsillo inhiben la degradación de la E2F apantallando el epítopo carboxi-terminal en la E2F que es reconocido por la maquinaria de ubiquitinación. De forma consistente con esto, hemos hallado que los mutantes de la E2F por supresión carboxi-terminal ya no podían ser estabilizados mediante la expresión de la proteína con bolsillo. Sorprendentemente, hallamos que las proteínas E1 de adenovirus también causan la estabilización de las proteínas E2F y DP. Esto fue inesperado porque se sabe que E1A destruye los complejos E2F-proteína con bolsillo, y, por tanto, debería generar E2F libre, pero inestable. Nosotros proponemos que la estabilización de la E2F por parte de la Ad5 E1 sirve para potenciar la entrada en la fase S de las células infectadas por adenovirus: impidiendo la degradación de la E2F liberada de los complejos con proteína con bolsillo, la E1A causa un incremento adicional en factores de transcripción E2F libres, los cuales, a su vez, facilitan la entrada en la fase S de las células infectadas por adenovirus.

Actualmente no está claro cómo la E1A media en la estabilización de la E2F libre. Recientemente hemos mostrado que la E1A puede interaccionar con un miembro de la familia de enzimas conjugadores de la ubiquitina, denominado mUBC9, proporcionando de ese modo un posible enlace entre las proteínas transformadoras del adenovirus y la vía de la ubiquitina-proteasoma (Hateboer et al., 1996). Esta proteína está altamente relacionada con una proteína UBC9 de S. cerevisiae, cuya desactivación causa una detención en las fases S y G2 del ciclo celular (Seufert et al., 1995). De forma importante, la mUBC9 que interacciona con la E1A complementa el defecto en el ciclo celular, indicando que la mUBC9 puede contribuir a la regulación del ciclo celular (Hateboer et al., 1996). Si la UBC9 juega un papel en la proteolisis dirigida de la E2F permanece pendiente de investigación.

Se cree que los complejos E2F-proteína con bolsillo juegan un rol activo en el mantenimiento de la quiescencia actuando como represores dominantes de la transcripción (Weintraub et al., 1995; Weintraub et al., 1992). Como tales, los complejos de E2F-proteína con bolsillo podrían impedir la expresión de genes que se activan mediante señales mitogénicas. En la mayoría de los tipos de células en reposo, la principal E2F que se expresa es la E2F-4, la cual está unida a la p130 durante la quiescencia (Cobrinik et al., 1993; Sardet et al., 1995; Vairo et al., 1995). La observada estabilidad de los complejos E2F-4-proteína con bolsillo podría ser necesaria para mantener activa la represión transcripcional en células quiescentes que tiene una baja síntesis de novo de polipéptidos de E2F. La entrada en el ciclo celular está acompañada por un incremento en la transcripción de la E2F, y por un incremento en el factor de transcripción E2F libre (Sardet et al., 1995). El rápido recambio de la E2F libre podría impedir la acumulación de un exceso de E2F libre, el cual se sabe induce la apoptosis (Qin et al., 1994; Wu y Levine, 1994). Recientemente Krek et al. mostraron que la célula ha diseñado otros mecanismos para limitar la actividad de la E2F. La ciclina A puede interaccionar directamente con la E2F-1, que media en la desregulación de la actividad de unión al ADN de la E2F durante la fase S (Krek, 1994). Los mutantes de la E2F-1 que son resistentes a la desregulación por parte de la ciclina A inducen apoptosis, probablemente mediante la hiperestimulación de los genes que responden a la E2F-1 (Krek et al., 1995). Nuestros datos actuales descubren otro nivel de regulación de los factores de transcripción E2F. Mediante la degradación activa de la E2F libre, pero no de la E2F unida a proteínas con bolsillo, la célula inhibe la degradación de los complejos de E2F y proteínas con bolsillo en las células quiescentes, y previene la acumulación de niveles elevados de E2F en células en proliferación.

Procedimientos experimentales Plásmidos

pCMV-HA-E2F-1, pRc-E2F-1, pCMV-HA-DP-1, pCMV-E2F-1 (1-284) y pCMV-E2F-1 (1-374) fueron donaciones generosas de K. Helin. Los vectores de expresión de la p107 mutante fueron proporcionados por L. Zhu (Massachusetts General Hospital Cancer Center, Charlestown). pRc-HA-E2F-4 y p5Xhocc4, que expresan entera la región temprana 1 (E1) del adenovirus del tipo 5 han sido ambos descritos previamente (Beijersbergen et al., 1995) (Bernards et al., 1982). P\DeltaE2F-4, que expresa los aminoácidos 1-310 de la E2F-4, se construyó mediante PCR y se clonó en pRc-CMV, cadena abajo respecto un epítopo HA. pMT123, que expresa una proteína ubiquitina marcada con HA fue amablemente proporcionado por D. Bohmann (Treier et al., 1994). pRc-DP-1 y pRc-HA-cat fueron obsequio de M. Voorhoeve. pCMV-HA-p107 y pCMV-pRb han sido descrito previamente (Beijersbergen et al., 1995; Beijersbergen et al., 1994)

Cultivos celulares, transfecciones, experimentos de marcado y de pulso-y-caza

Las células U2-OS de osteosarcoma humano y las células C33A de carcinoma cervical humano se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FCS). Las transfecciones se realizaron durante la noche usando el procedimiento del fosfato cálcico. Después de esto, las células se alimentaron de nuevo con medio normal y, transcurridas 36 horas desde la transfección, las células, o se lisaron directamente en tampón de muestra que contenía SDS para obtener lisados de células completas, o se lisaron en RIPA^{+} (tampón RIPA suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas, Complete, Boehringer Mannheim), y se sometieron a inmunoprecipitaciones. Para los experimentos de pulso-y-caza en presencia o ausencia de proteína con bolsillo o E1 de adenovirus, se hizo ayunar las células en medio carente de metionina/cisteína durante 1 hora, y subsiguientemente se incubaron con 100 \muCi de [^{35}S] metionina/cisteína por placa de 100 mm durante 2 horas. A continuación, las células se lisaron con RIPA^{+}, sobre hielo, durante 30 minutos, o se incubaron con medio normal suplementado con un exceso de 10 veces de metionina y cisteína no radiactivas durante los períodos de tiempo indicados, y a continuación se lisaron con RIPA^{+}. Se incubaron cantidades iguales de lisados radiactivos a 4ºC, durante 30 minutos, con 5 \mul de suero no inmune para pre-eliminar. De forma subsiguiente, se incubaron los lisados durante 2 horas a temperatura ambiente con anticuerpos específicos, pre-complejados sobre cuentas de Sepharose con proteína-A. Los inmunoprecipitados se lavaron cuatro veces con RIPA^{+}, se calentaron en tampón de muestra que contenía SDS, y se cargaron sobre un gel de poliacrilamida con SDS al 7.5%.

Transferencia Northern

El ARN total se aisló a partir de células transfectadas 36 horas después de la transfección usando el procedimiento de lisis NP-40. Se separaron cantidades iguales de ARN sobre un gel de formaldehído al 1%-agarosa. Después de la electroforesis, se transfirió el ARN a un filtro de nitrocelulosa y se hibridó con sondas de cADN de E2F-1 y E2F-4 de longitud completa. Se comprobó que la carga del gel fuera igual mediante tinción con bromuro de etidio.

Inmunotransferencia

Para la abundancia de las proteínas E2F del tipo salvaje y E2F mutante en presencia o ausencia de proteínas con bolsillo y E1 de adenovirus, se separaron lisados de células completas (10% de una placa de 100 mm transfectadas transitoriamente) en geles de poliacrilamida con SDS al 10% o SDS al 7,5% según se indica. Los inmunoprecipitados de E2F no radiactivos, recogidos mediante cuentas de proteína-A-Sepharose, se separaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 10%. Las proteínas se transfirieron de los geles a filtros de nitrocelulosa mediante electroforesis. Los filtros se bloquearon en PBS suplementado con un 0,1% de Tween-20 y un 5% de leche descremada (Protifar, Nutricia) (TPBS, 5%) durante 2 horas, a temperatura ambiente. De forma subsiguiente, los filtros se incubaron, o con sobrenadante de hibridoma de 12CA5 (dirigido contra la marca HA) en una dilución de 1:20, o con sobrenadante de hibridoma de KH95 (dirigido contra el extremo carboxi-terminal de la E2F-1) en una dilución de 1:10.000, o con anticuerpo monoclonal KH20 (dirigido contra el extremo amino-terminal de la E2F-1) en una dilución 1:500, durante 3 horas en TPBS al 2%, a temperatura ambiente, y se incubaron con el anticuerpo secundario durante 30 minutos, a temperatura ambiente, en TPBS, y la visualización se llevó a cabo mediante quimioluminiscencia potenciada (Amersham).

Ubiquitinación de la E2F-1

Las células U2-OS se transfectaron transitoriamente con 5 \mug de pMT123 (ubiquitina marcada con HA), 5 \mug de pRc-E2F-1 y 5 \mug de pRc-DP-1 en diferentes combinaciones. La cantidad total de ADN transfectado por placa se ajustó hasta 17 \mug con vector vacío (pRc/CMV). 24 horas después de la transfección, se incubaron las células durante la noche con el inhibidor de proteasoma Cbz-LLL en una concentración final de 10 \mug en DMEM/10% FCS, o se alimentaron de nuevo en medio normal. A continuación, se lisaron las células en RIPA^{+} durante 30 minutos sobre hielo. Las inmunoprecipitaciones se realizaron con 2 \mul de anticuerpo monoclonal KH95 (Santa Cruz) previamente complejado sobre 20 \mul de cuentas de proteína-A-Sepharose, durante 2 horas, a 4ºC. Se lavaron las cuentas cuatro veces en RIPA, se calentaron en tampón de muestra que contenía SDS, y se separaron sobre un gel de poliacrilamida con SDS al 10%. La transferencia a nitrocelulosa se realizó durante la noche, y el filtro se incubó con sobrenadante de hibridoma de 12CA5 dirigido contra la ubiquitina marcada con HA. Para detectar los conjugados E2F-ubiquitina, se transfectaron transitoriamente células U2-OS con 5 \mug de pRc-E2F-1 y 5 \mug de pRc-DP-1, se ajustaron a 17 \mug con pRc/CMV o con 17 \mug de vector vacío. 24 horas después de la transfección, las células se incubaron durante la noche con medio que contenía Cbz-LLL 10 \muM, o se alimentaron de nuevo con medio normal. A continuación, se lisaron las células directamente en tampón de muestra que contenía SDS, y los lisados se separaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 10%, y se inmunotransfirieron con KH95 contra la proteína E2F-1.

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SECUENCIA CODIFICADA DE E2F1 (HUMANA) (Transcripción de ADN)

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1

2

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SEC.ID. Nº. 3 & 4

SECUENCIA CODIFICADA DE E2F4 (HUMANA) (Transcripción del ADN)

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3

4

Claims (14)

1. Procedimiento de ensayo para un inhibidor de la degradación mediada por ubiquitina del factor de transcripción E2F, procedimiento que comprende:

a)

poner un polipéptido que contiene un dominio que hace de la E2F un sustrato para la ubiquitinación en contacto con un candidato a inhibidor; y

b)

determinar si el candidato a inhibidor es capaz o no de reducir la ubiquitinación de dicho polipéptido.

2. Ensayo según la reivindicación 1, en donde el polipéptido es una proteína de fusión que comprende un polipéptido indicador.

3. Ensayo según la reivindicación 2, en donde el polipéptido indicador es la LacZ.

4. Ensayo según la reivindicación 1, en donde el polipéptido es una proteína E2F o fragmento de la misma que es capaz de unirse a una proteína con bolsillo.

5. Ensayo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el dominio que hace de la E2F un sustrato para la ubiquitinación comprende la región C-terminal de 63 aminoácidos de la E2F-1 de la SEC. Nº ID.: 1.

6. Ensayo según cualquiera de las reivindicaciones precedente, en donde el polipéptido se expresa en una célula hospedadora a partir de un vector de expresión recombinante.

7. Ensayo según la reivindicación 6, en donde el vector de expresión comprende un promotor de CMV operativamente unido a una secuencia que codifica el polipéptido.

8. Ensayo según la reivindicación 6 ó 7, en donde un polipéptido de DP-1 se co-expresa en la célula hospedadora.

9. Ensayo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el ensayo se lleva a cabo en presencia de un inhibidor del proteasoma.

10. Ensayo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la determinación de si el candidato a inhibidor es capaz o no de reducir la ubiquitinación de dicho polipéptido se realiza proporcionando ubiquitina, y determinando la cantidad de dicha ubiquitina que se ha unido a dicho polipéptido.

11. Ensayo según la reivindicación 10, en donde el ensayo se realiza en una célula hospedadora que contiene un vector de expresión capaz de expresar la ubiquitina.

12. Ensayo según la reivindicación 11, en donde la ubiquitina se marca con un epítopo HA capaz de unirse a un anticuerpo monoclonal.

13. Procedimiento de ensayo para un potenciador de la degradación mediada por ubiquitina del factor de transcripción E2F, procedimiento que comprende:

a)

poner un polipéptido que contiene un dominio que hace de la E2F un sustrato para la ubiquitinación en contacto con un candidato a potenciador; y

b)

determinar si el candidato a potenciador es capaz o no de reducir la ubiquitinación de dicho polipéptido.

14. Ensayo según la reivindicación 13, en donde el polipéptido es una proteína E2F o fragmento de la misma que es capaz de unirse a una proteína con bolsillo.