ES2224547T3

ES2224547T3 - Actividad antiviral y resolucion del 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano.

Info

Publication number: ES2224547T3
Application number: ES99203367T
Authority: ES
Inventors: Dennis C. Liotta; Raymond F. Schinazi; Woo-Baeg Choi
Original assignee: Emory University
Current assignee: Emory University
Priority date: 1991-02-22
Filing date: 1992-02-20
Publication date: 2005-03-01
Anticipated expiration: 2012-02-20
Also published as: JP2901160B2; CZ295074B6; AU8077398A; FI114915B; EP0984013B1; CN1084745C; MX9200747A; NZ241625A; NO932980L; KR0172590B1; CN1109108C; EP1439177A1; IE920545A1; AU679649B2; ATE469147T1; RO122814B1; MY114350A; ES2345102T3; NO312399B1; CN1203232A

Abstract

Un procedimiento para obtener (-)-beta-L-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1, 3-oxatiolano, que comprende la resolución de una mezcla de (-) y (+)-cis-2-hidroximetil-5-(5-fluoro-citosin-1-il)-1, 3-oxatiolano mediante la exposición de la mezcla a citidina-desoxicitidina desaminasa.

Description

Actividad antiviral y resolución del 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano.

Esta invención se encuentra dentro del ámbito de los nucleósidos biológicamente activos e incluye, específicamente, un procedimiento para la resolución y el uso de los enantiómeros (-)-\beta-L y (+)-\beta-D del FTC.

En 1981, el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) se identificó como una enfermedad que compromete gravemente el sistema inmune humano y que lleva, prácticamente sin excepción, a la muerte. En 1983, se determinó que la etiología del SIDA era el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En diciembre de 1990, la Organización Mundial de la Salud estimó que entre 8 y 10 millones de personas, en todo el mundo, estaban infectadas por el VIH y, de esta cifra, entre 1.000.000 y 1.400.000 se encontraban en Estados Unidos.

En 1985, se observó que el nucleósido sintético 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT) inhibía la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana. Desde entonces, se ha demostrado que toda una serie de distintos nucleósidos sintéticos, que incluyen 2',3'-didesoxiinosina (DDI), 2',3'-didesoxicitidina (DDC), 3'-fluoro-3'-desoxitimidina (FLT) y 2',3'-didesoxi-2',3'-didehidrotimidina (D4T), son eficaces frente al VIH. Otra serie de 2',3'-didesoxinucleósidos han demostrado inhibir el crecimiento de varios virus in vitro. Parece que, tras su fosforilación celular a 5'-trifosfato por quinasas celulares, estos nucleósidos sintéticos se incorporan en la cadena de ADN viral en crecimiento, ocasionando la terminación de la cadena debido a la ausencia de grupo hidroxilo en 3'.

El éxito de varios 2',3'-didesoxinucleósidos en la inhibición de la replicación del VIH in vivo o in vitro ha llevado a una serie de investigadores a diseñar y probar nucleósidos que tuvieran el átomo de carbono sustituido por un heteroátomo, en la posición 3' del nucleósido. Norbeck y col. describen que la (\pm)-1-[(2\beta,4\beta)-2-(hidroximetil)-4-dioxolanil]timina (denominada en lo sucesivo (\pm)-dioxolano-T) presenta una actividad modesta frente al VIH (CE_{50} de 20 \mum en células ATH8), y no es tóxica para células control no infectadas a una concentración de 200 \mum. Tetrahedron Letters 30 (46), 6246, (1989). La Publicación de la Solicitud de Patente Europea Número 0 337 713 y la Patente de Estados Unidos 5.041.449, asignada a IAF BioChem International, Inc, describen 2-sustituidos-4-sustituidos-1,3-dioxolanos que presentan actividad antiviral.

La Patente de Estados Unidos Número 5.047.407 y la Publicación de la Solicitud de Patente Europea Número 0 382 526, asignada también a IAF BioChem International, Inc, describen una serie de nucleósidos 2-sustituidos-5-sustituidos-1,3-oxatiolano con actividad antiviral e informan específicamente de que la mezcla racémica (considerando la posición C4') del isómero \beta C1' del 2-hidroximetil-5-(citosin-1-il)-1,3-oxatiolano (denominado en lo sucesivo (\pm)-BCH-189) tiene aproximadamente la misma actividad frente al VIH que el AZT y no tiene toxicidad celular en los niveles ensayados. Se ha visto también que el (\pm)-BCH-189 inhibe la replicación in vitro de aislados de VIH resistentes a AZT, procedentes de pacientes que han sido tratados con AZT durante más de 36 semanas.

El documento WO-A-92/15308 describe el uso de 1-(2-hidroximetil)-1,3-oxatiolan-5-il)-5-fluorocitosina y derivados farmacéuticamente aceptables de la misma en el tratamiento de infecciones por el virus de la hepatitis B.

Otro virus que causa graves problemas de salud en el hombre es el virus de la hepatitis B (denominado en lo sucesivo "VHB"). El VHB es la segunda causa, tras el tabaco, de cáncer en el hombre. Se desconoce el mecanismo por el que el VHB induce cáncer, aunque se postula que el VHB podría desencadenar directamente el desarrollo del tumor o bien podría desencadenar indirectamente el desarrollo del tumor a través de la inflamación crónica, la cirrosis y la regeneración celular asociadas a la infección.

Tras un periodo de incubación de dos a seis meses, durante el que el huésped desconoce que está infectado, la infección por VHB puede dar lugar a hepatitis aguda y daño hepático, causando dolor abdominal, ictericia y el aumento en sangre de los niveles de ciertas enzimas. El VHB puede causar hepatitis fulminante, una forma de la enfermedad de progresión rápida, con frecuencia fatal, en la que se destruyen grandes porciones del hígado.

Los pacientes se recuperan, generalmente, de la hepatitis aguda. En algunos pacientes, sin embargo, persisten niveles elevados de antígeno viral en la sangre durante un periodo de tiempo prolongado, o indefinido, dando lugar a una infección crónica. Las infecciones crónicas pueden llevar a una hepatitis crónica persistente. Los pacientes con infección crónica persistente por VHB son más frecuentes en países en vías de desarrollo. A mediados de 1991, había aproximadamente 225 millones de portadores crónicos del VHB solamente en Asia y casi 300 millones de portadores en todo el mundo. La hepatitis crónica persistente puede causar fatiga, cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular, un cáncer primario del hígado.

En los países occidentales industrializados, los grupos de alto riesgo para una infección por VHB incluyen las personas que entran en contacto con portadores del VHB o las muestras de sangre de los mismos. La epidemiología del VHB es muy similar a la del síndrome de la inmunodeficiencia adquirida, lo que justifica por qué la infección por VHB es frecuente entre los pacientes con SIDA o complejo relacionado con el SIDA. Sin embargo, el VHB es más contagioso que el VIH.

Se ha desarrollado una vacuna derivada de suero humano para inmunizar a los pacientes frente al VHB. Mientras que se ha visto que es eficaz, la producción de la vacuna es difícil ya que el suministro de suero humano procedente de portadores crónicos es limitado y el proceso de purificación es largo y costoso. Además, cada lote de vacuna preparado a partir de distintos sueros ha de ser ensayado en chimpancés para asegurar su seguridad. También se han producido vacunas por ingeniería genética. El tratamiento diario con interferón-\alpha, una proteína producida por ingeniería genética, también ha mostrado ser prometedor. Sin embargo, no existe, hasta la fecha, ningún agente farmacéutico conocido que inhiba de forma eficaz la replicación del virus.

Para comercializar un nucleósido para uso farmacéutico, no solamente tiene que ser eficaz y con una toxicidad baja, sino que su fabricación también debe tener una buena relación coste-eficacia. Se ha dirigido una gran cantidad de investigación y desarrollo hacia nuevos procedimientos, de bajo coste, para la producción de nucleósidos a gran escala. En la actualidad, se preparan 2',3'-didesoxinucleósidos por una de dos vías: generando derivados de un nucleósido intacto o condensando un derivado de un radical hidrocarbonado con una base heterocíclica. Aunque existen numerosas desventajas asociadas a la obtención de nuevos análogos de nucleósidos modificando nucleósidos intactos, una ventaja principal de esta aproximación es que la estereoquímica absoluta adecuada ya ha sido establecida por la naturaleza. Sin embargo, este enfoque no se puede usar en la producción de nucleósidos que contengan bases que no existen en la naturaleza o radicales hidrocarbonados que no existen en la naturaleza (y que, por lo tanto, no se generan a partir de nucleósidos intactos), como nucleósidos 1,3-oxatiolano y nucleósidos 1,3-dioxolano.

Cuando se condensa un radical hidrocarbonado o de tipo hidrocarbonado con una base heterocíclica para formar un nucleósido sintético, se produce un nucleósido con dos centros quirales (en las posiciones C1' y C4'), y existe, de este modo, en forma de pareja de diastereoisómeros. Cada diastereoisómero existe en forma de conjunto de enantiómeros. Por lo tanto, el producto es una mezcla de cuatro enantiómeros.

Se observa a menudo que los nucleósidos con una estereoquímica que no está presente en la naturaleza en la posición C1' o C4', son menos activos que los mismos nucleósidos con la estereoquímica establecida por la naturaleza. Por ejemplo, Carter y col. han informado de que la concentración del enantiómero (-) del carbovir (2', 3'-didehidro-2', 3'-didesoxiguanosina) requerida en cultivos celulares para disminuir la actividad de la transcriptasa inversa en un 50% (CE_{50}) es de 0,8 \muM, mientras que la CE_{50} para el enantiómero (+) del carbovir es mayor de 60 \muM. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 34: 6, 1297-1300 (Junio de 1990).

La Publicación Internacional PCT Número WO 91/11186 describe que los nucleósidos 1,3-oxatiolano se pueden preparar con una elevada diastereoselectividad (alto porcentaje de nucleósidos con una configuración \beta en el puente entre el carbono C1' y la base heterocíclica) mediante una selección cuidadosa del ácido de Lewis usado en el proceso de condensación. Se descubrió que la condensación de un nucleósido 1,3-oxatiolano con una base se da con una estereoespecificidad \beta casi completa cuando se usa cloruro estánnico como catalizador de la condensación. Otros ácidos de Lewis proporcionan una baja selectividad \beta en C1' (o la ausencia de la misma) o simplemente fallan a la hora de catalizar las reacciones.

En vista del hecho de que el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida, el complejo relacionado con el SIDA y el virus de la hepatitis B han alcanzado niveles epidémicos en todo el mundo y tienen efectos trágicos en el paciente infectado, sigue existiendo una fuerte necesidad de proporcionar nuevos y eficaces agentes farmacéuticos para tratar estas enfermedades, que tengan una toxicidad baja para el huésped.

También existe la necesidad de proporcionar un procedimiento con una buena relación coste-eficacia y que sea comercialmente viable para producir nucleósidos farmacéuticamente importantes y conseguir, específicamente, una estereoespecificidad \beta en la posición C4' de nucleósidos sintéticos preparados por condensación de un radical de tipo hidrocarbonado con una base.

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento y una composición para el tratamiento de pacientes humanos infectados por VIH.

Otro de los objetivos de la presente invención es proporcionar un procedimiento y una composición para el tratamiento de pacientes humanos u otros huéspedes animales infectados por VHB.

Otro de los objetivos de la presente invención es proporcionar nucleósidos 1,3-oxatiolano enriquecidos enantioméricamente.

Otro de los objetivos de la presente invención es proporcionar un procedimiento para la resolución de enantiómeros C4' de nucleósidos 1,3-oxatiolano.

Resumen de la invención

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para la obtención de (-)-\beta-L-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano, que comprende la resolución de una mezcla de (-) y (+)-cis-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano exponiendo la mezcla a citidina-desoxicitidina desaminasa.

Se ha descubierto que el 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano ("FTC") presenta, de forma sorprendente, una elevada actividad frente al virus de la inmunodeficiencia humana, con una toxicidad muy baja para las células del huésped. Se ha descubierto también que el FTC presenta una actividad muy significativa frente al VHB y, por lo tanto, se puede usar para tratar pacientes que tienen distintas enfermedades asociadas a la infección por VHB.

Estudios de toxicidad y farmacocinética confirman la utilidad del FTC como agente antiviral para su administración farmacéutica. El FTC y sus enantiómeros no son tóxicos para las células periféricas de la médula ósea humana en concentraciones de hasta 50 \muM ni para otras líneas celulares en concentraciones de hasta 200 \muM. El FTC-TP es uno de los metabolitos principales en células mononucleares de sangre periférica y células HepG2. El FTC-TP inhibe competitivamente la transcriptasa inversa (RT) del VIH-1 con una K_{1} de 0,2 \muM empleando un molde cebador poli(I) oligo(dC). Mediante un análisis de secuencia, se puede demostrar que el FTC-TP es un potente terminador de la cadena de ADN cuando se usa la VIH-RT (paradas C).

El tratamiento crónico con FTC no es tóxico en roedores, incluso en dosis por vía oral de 85 mg/kg al día durante al menos dos meses. La farmacocinética del FTC en macacos de la India indica una elevada biodisponibilidad por vía oral (aproximadamente 73 \pm 6%) y una semivida plasmática terminal de aproximadamente 1,34 \pm 0,18 (media de la administración por vía oral e I.V.).

También se describe un procedimiento para la resolución de una mezcla racémica de enantiómeros de nucleósidos, incluida una mezcla racémica de FTC, que incluye una etapa de exposición de la mezcla racémica a una enzima que cataliza preferentemente una reacción en uno de los enantiómeros. El procedimiento se puede usar para la resolución de una gran variedad de nucleósidos, incluidos nucleósidos de pirimidina y purina eventualmente sustituidos en el radical hidrocarbonado o el radical básico. El procedimiento también se puede usar para la resolución de derivados de nucleósidos que contengan heteroátomos adicionales en el radical hidrocarbonado, como por ejemplo, (\pm)-FTC y (\pm)-BCH-189. La resolución de nucleósidos se puede llevar a cabo a gran escala a un coste moderado.

Usando los procedimientos descritos en el presente documento, se resolvió el FTC en sus enantiómeros (+)-\beta-D y (-)-\beta-L. El enantiómero (-)-\beta-L parece ser más potente que el enantiómero (+)-\beta-D frente a VIH, VHB y SIV. El enantiómero (+) del FTC también es activo frente a VIH, VHB y SIV.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una ilustración de la estructura química del 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano ("FTC").

La Figura 2 es una ilustración de un procedimiento para la preparación de 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano.

La Figura 3 es un diagrama de producción de la especificidad de la fosfatasa alcalina y la fosfodiesterasa del veneno de serpiente para los enantiómeros (+) y (-) del FTC.

La Figura 4 es un gráfico que indica el progreso de la hidrólisis catalizada por la lipasa, del éster butirilo-5' del FTC a lo largo del tiempo usando las enzimas Amano PS-800® (-cuadrado vacío-) y PLE (-círculo vacío con un punto-).

La Figura 5 es un gráfico del efecto de la concentración (\muM) del FTC enriquecido racémica y enantioméricamente (preparado por el procedimiento del Ejemplo 3) frente al porcentaje de inhibición de células mononucleares de sangre periférica humanas infectadas con VIH. ((-círculo relleno-, (\pm)-FTC), (-círculo vacío-, (-)-FTC), (-cuadrado relleno-, (+)-FTC)).

La Figura 6 es un gráfico del efecto de la concentración (\muM) de FTC enriquecido racémica y enantioméricamente (preparado por el procedimiento del Ejemplo 2) frente al porcentaje de inhibición de células mononucleares de sangre periférica humanas infectadas con VIH. ((-círculo relleno-, (\pm)-FTC), (-círculo vacío-, (-)-FTC), (-cuadrado relleno-, (+)-FTC)).

La Figura 7 es un gráfico de la captación de (\pm)-FTC tritiado por células mononucleares de sangre periférica humanas (media de dos determinaciones) en tiempo (horas) frente a pmol/10^{6} células.

La Figura 8 es un gráfico de la salida de (\pm)-FTC radiomarcado de células mononucleares de sangre periférica humanas, determinada en horas frente a pmol/10^{6} células.

La Figura 9 ilustra la presencia de [^{3}H]-(\pm)-FTC y sus derivados fosforilados en células HepG-2 humanas (media de dos determinaciones) incubadas en medio con [^{3}H]-(\pm)-FTC 10 \muM, determinada en pmol/10^{6} células a lo largo del tiempo.

La Figura 10 ilustra la eliminación de [^{3}H]-(\pm)-FTC y sus derivados fosforilados en células HepG2 humanas, en pmol/10^{6} células a lo largo del tiempo, tras añadir a las células pulsos de [^{3}H]-(\pm)-FTC 10 \muM (700 DPM/pmol) durante 24 horas, y evaluando la concentración del compuesto 24 horas tras su retirada.

La Figura 11 ilustra la disminución de la concentración combinada de [^{3}H]-(\pm)-FTC y sus derivados fosforilados en células HepG2 humanas tras la incubación con [^{3}H]-(\pm)-FTC 10 \muM (700 DPM/pmol) durante 24 horas, en pmol/10^{6} células, a lo largo del tiempo.

La Figura 12 es una gráfica del efecto de los enantiómeros del FTC sobre la formación de colonias de células precursoras de granulocitos-macrófagos, determinado como porcentaje de supervivencia frente a concentración en \muM ((-)-FTC, círculo vacío; (+)-FTC, círculo relleno; AZT, cuadrado relleno.)

Descripción detallada de la invención

Tal como se usan en el presente documento, los términos "nucleósido enantioméricamente enriquecido" hacen referencia a una composición de nucleósidos que incluye al menos un 95% de un único enantiómero de ese nucleósido.

Tal como se usa en el presente documento, el término FTC hace referencia al 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano (la forma racémica o los enantiómeros), también denominado 2'-desoxi-5-fluoro-3'-tiacitidina.

Tal como se usa en el presente documento, el término (\pm)-FTC hace referencia al (\pm)-\beta-D,L-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano.

Tal como se usa en el presente documento, el término (-)-FTC hace referencia al (-)-\beta-L-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano.

Tal como se usa en el presente documento, el término (+)-FTC hace referencia al (+)-\beta-D-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano.

Tal como se usan en el presente documento, los términos FTC-MP, FTC-DP y FTC-TP hacen referencia a monofosfato, difosfato y trifosfato de FTC, respectivamente.

Tal como se usa en el presente documento, el término BCH-189 hace referencia a 2-hidroximetil-5-(citosin-1-il)-1,3-oxatiolano.

Tal como se usan en el presente documento, los términos "catálisis enzimática preferente" hacen referencia a la catálisis por una enzima que favorece un sustrato en detrimento de otro.

Tal como se usa en el presente documento, un grupo saliente significa un grupo funcional que forma una carbonatación incipiente cuando se separa de la molécula a la que está unido.

Se puede usar la invención, tal como está descrita en el presente documento, en un procedimiento y una composición para el tratamiento de infecciones por VIH y VHB y otros virus que se replican de forma similar, en el hombre u otros animales huéspedes. Dichos procedimientos incluyen la administración de una cantidad eficaz de enantiómero (-)-\beta-L del 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se muestra a continuación, este compuesto posee una actividad antirretroviral, como anti-VIH-1, anti-VIH-2 y actividad frente al virus de la inmunodeficiencia simia (anti-VIS).

El (-)-\beta-L-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano y las formulaciones farmacéuticamente aceptables que contienen este compuesto son útiles para la prevención y el tratamiento de infecciones por VIH y otras dolencias relacionadas como el complejo relacionado con el SIDA (CRS), la linfadenopatía generalizada persistente (PGL), las dolencias neurológicas relacionadas con el SIDA, estados de positividad para anticuerpos anti-VIH y positividad para VIH, sarcoma de Kaposi, púrpura trombocitopénica e infecciones oportunistas. Además, estos compuestos o formulaciones se pueden usar de forma profiláctica para prevenir o retrasar la progresión de la enfermedad clínica en individuos que presentan positividad para anticuerpos anti-VIH o para antígenos del VIH o que han sido expuestos al VIH.

El (-)-\beta-L-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano y las formulaciones farmacéuticamente aceptables que contienen este compuesto también son útiles para la prevención y el tratamiento de infecciones por VHB y otras dolencias relacionadas como estados de positividad para anticuerpos anti-VHB y para el VHB, inflamación hepática crónica causa por el VHB, cirrosis, hepatitis aguda, hepatitis fulminante, hepatitis crónica persistente y fatiga. Este compuesto o estas formulaciones también se pueden usar de forma profiláctica para prevenir o retrasar la progresión de la enfermedad clínica en individuos que presentan positividad para anticuerpos anti-VHB o para antígenos del VHB o que han sido expuestos al VHB.

En resumen, la presente invención incluye los siguientes elementos:

Un procedimiento para la preparación de un enantiómero (-) o (+) del 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano que comprende el sometimiento del compuesto o un derivado del mismo (por ejemplo, éster 5') en forma de una mezcla de enantiómeros (-) y (+) a unas condiciones o reacción con reactivos que sirven para separar los enantiómeros y, si es necesario, convertir el derivado resultante en el compuesto parental.

La resolución de los enantiómeros (\pm) se puede llevar a cabo tal como se especifica detalladamente en la Sección III, a continuación.

III. Resolución de enantiómeros de nucleósidos

En el presente documento se proporciona un procedimiento para la resolución de mezclas racémicas de enantiómeros (+) y (-) de nucleósidos del FTC. El procedimiento también se puede usar para la resolución de mezclas racémicas de radicales hidrocarbonados o de tipo hidrocarbonado, como derivados del 1,3-oxatiolano y del 1,3-dioxolano. El procedimiento implica el uso de una enzima que cataliza preferentemente una reacción de un enantiómero en una mezcla racémica. El enantiómero que ha reaccionado se separa del que no ha reaccionado basándose en la nueva diferencia en cuanto a su estructura física. Dada la descripción en la presente memoria descriptiva, un experto en la materia será capaz de elegir una enzima que sea selectiva para el enantiómero del nucleósido elegido (o selectiva para el enantiómero no deseado, como un procedimiento para eliminarlo), mediante la selección de una de las enzimas mencionadas más abajo o mediante la valoración sistemática de otras enzimas conocidas. Dada esta descripción, un experto en la materia también sabrá cómo modificar el sustrato en la medida necesaria para alcanzar la resolución deseada. Se puede determinar el enriquecimiento óptico del éster recuperado mediante el uso de RMN con reactivos de desplazamientos quirales, polarimetría o HPLC quiral.

Los siguientes ejemplos ilustran además el uso de enzimas para la resolución de mezclas racémicas de enantiómeros. Se pueden usar otros procedimientos conocidos para la resolución de mezclas racémicas junto con el procedimiento de resolución descrito en el presente documento. Se considera que todas estas modificaciones se encuentran dentro del ámbito de la invención.

Resolución de enantiómeros de nucleósidos con citidina-desoxicitidina desaminasa

En la presente invención, se usa citidina-desoxicitidina desaminasa para la resolución de mezclas racémicas de 2-hidroximetil-5-(citosin-1-il)-1,3-oxatiolano y sus derivados, incluido el 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano. La enzima cataliza la desaminación del radical citosina a un uracilo. Se ha descubierto que uno de los enantiómeros de los nucleósidos 1,3-oxatiolano es un sustrato preferido por la citidina-desoxicitidina desaminasa. El enantiómero que no se convierte en un derivado uracilo (y que, por lo tanto, aún es básico) se extrae de la solución con una solución ácida. Se debe tener cuidado por evitar las soluciones muy ácidas (pH por debajo de 3,0), que pueden provocar la escisión del anillo oxatiolano.

La citidina-desoxicitidina desaminasa se puede aislar a partir de hígado de rata o hígado humano, o se puede expresar a partir de secuencias recombinantes en un sistema procariota como E. coli.

El procedimiento de resolución de enantiómeros de nucleósidos de citidina usando la citidina-desoxicitidina desaminasa se puede usar como procedimiento único de resolución o se puede usar junto con otros procedimientos, incluida la resolución por hidrólisis enzimática de ésteres de 5'-O-nucleósidos tal como se describe más abajo.

Resolución basada en la hidrólisis de ésteres de nucleósidos-C5'

En una forma de realización, el procedimiento incluye la reacción del grupo hidroxilo C5' de un racemato de nucleósidos con un compuesto acilo para formar un éster C5' en el que el nucleósido se encuentra en el extremo "carbinol" del éster. La mezcla racémica de ésteres C5' de nucleósidos se trata entonces con una enzima que preferiblemente escinde, o hidroliza, uno de los enantiómeros y no el otro, en un periodo de tiempo dado.

Una ventaja de este procedimiento es que se puede usar para la resolución de una amplia variedad de nucleósidos, incluidos nucleósidos de pirimidina y purina eventualmente sustituidos en el radical hidrocarbonado o básico. El procedimiento también se puede usar para la resolución de derivados de nucleósidos que contienen heteroátomos adicionales en el radical hidrocarbonado, como por ejemplo, FTC y BCH-189. La extensa aplicabilidad de este procedimiento reside, en parte, en el hecho de que aunque el grupo carbinol del éster desempeña un papel en la capacidad de una enzima para diferenciar enantiómeros, el sitio de reconocimiento principal de estas enzimas se encuentra en el grupo ácido carboxílico del éster. Además, uno puede extrapolar con éxito los resultados de un estudio enzima/sustrato a otro sistema, aparentemente diferente, a condición de que los grupos ácido carboxílico de los dos sustratos sean iguales o sustancialmente similares.

Otra ventaja de este procedimiento es que es regioselectivo. Las enzimas que hidrolizan ésteres generalmente no catalizan otras reacciones en otros grupos de la molécula. Por ejemplo, la enzima lipasa cataliza la hidrólisis del éster del 2-hidroximetil-5-oxo-1,3-oxatiolano sin hidrolizar la lactona interna. Esto contrasta claramente con los enfoques "químicos" de la hidrólisis de ésteres.

Otra ventaja más de este procedimiento es que la separación del enantiómero no hidrolizado y el enantiómero hidrolizado de la mezcla de la reacción es bastante sencilla. El enantiómero no hidrolizado es más lipófilo que el enantiómero hidrolizado y se puede recuperar de forma eficaz por simple extracción con un disolvente orgánico apolar de entre una variedad de los mismos o mezclas de disolventes, incluido hexano y hexano/éter. El enantiómero hidrolizado menos lipófilo, más polar, se puede obtener entonces por extracción con un disolvente orgánico más polar, como por ejemplo, acetato de etilo, o por liofilización, seguido de la extracción con etanol o metanol. Se debería evitar el alcohol durante la hidrólisis porque puede desnaturalizar enzimas bajo determinadas condiciones.

Enzimas y sustratos

Con la creación de la pareja enzima-sustrato adecuada, se pueden establecer las condiciones para el aislamiento de cada enantiómero del nucleósido. El enantiómero deseado se puede aislar mediante el tratamiento de la mezcla racémica con una enzima que hidroliza el enantiómero deseado (seguido de la extracción del hidrolizado polar con un disolvente polar) o el tratamiento con una enzima que hidroliza el enantiómero no deseado (seguido de la eliminación del enantiómero no deseado con un disolvente apolar).

Las enzimas que catalizan la hidrólisis de ésteres incluyen esterasas, por ejemplo la esterasa de hígado de cerdo, lipasas, incluida la lipasa pancreática porcina y la lipasa Amano PS-800, subtilisina y \alpha-quimotripsina.

La Figura 3 es un diagrama de producción de la especificidad de la fosfatasa alcalina y la fosfodiesterasa del veneno de serpiente para los enantiómeros (+) y (-) del FTC. Tal como se indica, la fosfatasa alcalina hidroliza el trifosfato de ambos enantiómeros del FTC y, por lo tanto, no es eficaz como medio de separación. La fosfodiesterasa I hidroliza preferentemente el isómero (+) del FTC a su monoéster, que se puede exponer a 5'-nucleotidasa para proporcionar (+)-FTC.

El grupo acilo más eficaz que se puede usar para esterificar la posición C5' del nucleósido se puede determinar sin una experimentación indebida mediante la valoración de una serie de homólogos usando el sistema enzimático seleccionado. Por ejemplo, cuando se esterifican los nucleósidos 1,3-oxatiolano con ácido butírico, las resoluciones tanto con esterasa de hígado de cerdo como con Amano PS-800 se llevan a cabo con una elevada enantioselectividad (exceso enantiomérico del 94-100%) y una selectividad opuesta. La esterasa de hígado de cerdo hidroliza preferentemente el enantiómero (+) del FTC y la Amano PS-800® hidroliza preferentemente el enantiómero (-) del FTC. El porcentaje de exceso enantiomérico representado en la Tabla 1 es la cantidad de éster butirato purificado en la mezcla tratada con enzima (es decir, el éster butirato del (-)-FTC en el caso de la PLE y el éster butirato del (+)-FTC en el caso de la Amano PS-800®).

Ejemplos no limitantes de grupos acilo que se pueden valorar para su uso con una mezcla enantiomérica concreta de nucleósidos y una enzima concreta incluyen los ácidos alquil-carboxílicos y los ácidos alquil- carboxílicos sustituidos, incluido el ácido acético, el ácido propiónico, el ácido butírico y el ácido pentanoico. Con ciertas enzimas, se puede preferir el uso de un compuesto acilo que sea significativamente electrón-atrayente para facilitar la hidrólisis debilitando el enlace éster. Ejemplos de grupos acilo electrón-atrayentes incluyen \alpha-haloésteres como el ácido 2-cloropropiónico, el ácido 2-clorobutírico y el ácido 2-cloropentanoico. Los \alpha-haloésteres son excelentes sustratos para las lipasas.

Condiciones de resolución

Las hidrólisis enzimáticas se llevan generalmente a cabo con una cantidad catalítica de la enzima en un tampón acuoso con un pH cercano al pH óptimo para la enzima en cuestión. A medida que se desarrolla la reacción, el pH cae como consecuencia del ácido carboxílico liberado. Se debería añadir una base acuosa para mantener el pH cerca del valor óptimo para la enzima. El progreso de la reacción se puede determinar fácilmente monitorizando el cambio de pH y la cantidad de base necesaria para mantener el pH. El éster hidrófobo (el enantiómero no hidrolizado) y el alcohol más polar (el enantiómero hidrolizado) se pueden extraer secuencial y selectivamente de la solución mediante la elección sensata de disolventes orgánicos. De forma alternativa, el material a resolver se puede pasar a través de una columna que contenga la enzima inmovilizada en un soporte sólido.

Las hidrólisis enzimáticas realizadas en condiciones heterogéneas pueden presentar una escasa reproducibilidad. Se prefiere, por lo tanto, realizar la hidrólisis en condiciones homogéneas. No se prefieren los disolventes alcoholes porque pueden desnaturalizar las enzimas. La homogeneidad se puede conseguir mediante el uso de agentes tensioactivos no iónicos, como el Triton X-100. Sin embargo, la adición de estos agentes tensioactivos no sólo ayuda a disolver el material de partida sino que también incrementa la solubilidad acuosa del producto. Por lo tanto, aunque la reacción enzimática se puede llevar a cabo de forma más eficaz que en condiciones heterogéneas añadiendo un agente tensioactivo no iónico, el aislamiento tanto del material de partida recuperado como del producto puede verse dificultado. El producto se puede aislar por técnicas cromatográficas y químicas adecuadas (como por ejemplo, la formación selectiva de sales). Los nucleósidos diacilados se pueden usar pero son, con frecuencia, algo lipófilos y difíciles de disolver en el medio usado.

Ejemplo 1 Hidrólisis enantioselectiva de ésteres de FTC catalizada por lipasa

Se prepararon una serie de derivados 5'-O-acilo del FTC por O-acilación selectiva de la sal N-clorhidrato (véanse la Tabla 1 y la Figura 4) del (\pm)-FTC. Se investigó la eficacia de la hidrólisis de los derivados por lipasas. Tal como se muestra en la Tabla 1, la esterasa de hígado de cerdo (PLE) muestra un elevado nivel de selectividad hacia la hidrólisis del éster del enantiómero (+) del FTC, dejando predominantemente el butirato del (-)-FTC en la mezcla analizada por HPLC. Por el contrario, la PS-800 hidroliza preferentemente el éster del enantiómero (-) del FTC, dejando predominantemente el butirato del (+)-FTC en la mezcla analizada por HPLC. También se observó que la tasa de hidrólisis dependía de la naturaleza del grupo acilo; el derivado acetilo era significativamente más lento que el derivado butirilo. Se ha descubierto ahora que la tasa de hidrólisis del éster del ácido propiónico del FTC es incluso más rápida que la que se observa con el derivado butirato. Se determinó tanto el porcentaje de recuperación como el porcentaje de exceso enantiomérico por HPLC. Aunque la enantioselectividad es excelente cuando se emplea la PLE (generalmente e.e. del 97% o mayor), se puede llevar a cabo un enriquecimiento adicional por reacciones secuenciales de hidrólisis enzimática en las que el butirato enantioméricamente enriquecido procedente de la hidrólisis catalizada por PLE de somete a hidrólisis enzimática por PS-800.

TABLA 1 Comparación del efecto del éster sobre la hidrólisis enzimática

1

Ejemplo 2 Procedimiento para la preparación de (+)- y (-)-FTC mediante la hidrólisis enantioselectiva de butirato de FTC catalizada por lipasa

Se disolvió 5'-O-butirato de (\pm)-FTC (0,47 mmol, 149 mg) en 10 ml de una solución tampón: CH_{3}CN 4:1 pH 8. La solución transparente se agitó y trató con 26 mg de esterasa de hígado de cerdo (PLE-A). El progreso de la reacción se monitorizó por HPLC (Figura 4). Tras 20 horas (conversión del 52%), la mezcla de la reacción se extrajo con 2 x 80 ml de CHCL_{3} y 80 ml de acetato de etilo. Los extractos de la fase orgánica se combinaron, se secaron sobre MgSO_{4} anhidro, se filtraron y se concentraron por evaporación rotatoria. El residuo resultante se eluyó en 2 x placas pTLC 1000m usando acetato de etilo como eluyente (doble elución) para dar, tras su aislamiento, 53 mg (36% basándose en el material de partida) de butirato de FTC que se determinó tenía un exceso enantiomérico (e.e.) del 98% mediante el análisis por HPLC. El butirato enantioméricamente enriquecido se trató entonces con 1,6 ml de metanol seguido de 0,38 mmol (20 mg) de metóxido de sodio. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente y el progreso de la reacción se controló por HPLC. La reacción se había completado al cabo de 30 minutos. El disolvente se eliminó por evaporación rotatoria para dar un sólido blanco bruto (76 mg) que se eluyó en una pTLC 1000m usando acetato de etilo: etanol 5:1. El (-)-FTC se aisló en forma de sólido blanco (33 mg; rendimiento 82%). En el análisis por HPLC del FTC, en forma de su derivado O-acetato-5', mostró un e.e. del 97%; [\alpha] (^{20}, _{D}) -120,5º (c = 0,88; etanol abs.).

Se pueden evitar las emulsiones en la etapa de procesamiento añadiendo HCCl_{3} a la mezcla de la reacción tras la finalización de la misma (lo que también sirve para desnaturalizar la enzima), los disolventes se eliminan al vacío y se realiza la extracción con HCCl_{3}.

De forma similar, se disolvieron 1,2 mmol (375 mg) de O-butirato-5' de (\pm)-FTC en 40 ml de tampón: CH_{3}CN 4:1 pH 8. La solución transparente se agitó y se trató con 58 mg de esterasa de hígado de cerdo (PLE-A). El progreso de la reacción se monitorizó por HPLC. Tras 90 minutos (conversión del 38%), la mezcla de la reacción se añadió a 150 ml de CHCl_{3}. Las fases se separaron y la fase acuosa se liofilizó para eliminar el disolvente. El residuo blanco de la liofilización se extrajo con 3 x 10 ml de etanol absoluto. Los extractos se filtraron, se combinaron y se concentraron al vacío para producir 179 mg de aceite bruto. El material bruto se eluyó en una columna 45 x 30 mm de gel de sílice usando 3 x 75 ml de acetato de etilo seguido de acetato de etilo: etanol 5:1. El (+)-FTC se aisló en forma de sólido blanco (109 mg; 37% basándose en el butirato de partida). El análisis por HPLC del (+)-FTC, en forma de su derivado 5'-O-acetato, mostró un e.e. del 97,4%; [a] O (^{20}, _{D}) +113,4º (c = 2,53; etanol absoluto).

Se llevó a cabo una reacción similar usando 0,12 mmol (37 mg) de 5'-O-butirato de FTC y 7 mg de PS-800 en 4,0 ml de tampón: CH_{3}CN 4:1 pH 8. La reacción fue considerablemente más lenta que la que se llevó a cabo con PLE-A y requirió 74 horas para una conversión del 59%. Se vio que el butirato recuperado (11,4 mg; 31% de la cantidad inicial) presentaba un e.e. del 94% por HPLC.

Combinación de la resolución enzimática con procedimientos clásicos de resolución

El procedimiento descrito más arriba para la resolución de mezclas racémicas de enantiómeros de nucleósidos se puede combinar con otros procedimientos clásicos de resolución enantiomérica para incrementar la pureza óptica del producto final.

Los procedimientos clásicos de resolución incluyen varias técnicas físicas y químicas. Con frecuencia la técnica más simple y eficaz es la recristalización, basada en el principio de que el racemato es con frecuencia más soluble que los enantiómeros individuales correspondientes. La recristalización se puede llevar a cabo en cualquier etapa, incluido sobre los compuestos acilados o el producto enantiomérico final. Si tiene éxito, este sencillo enfoque representa un procedimiento de elección.

Cuando la recristalización no consigue proporcionar un material con una pureza óptica aceptable, se pueden valorar otros procedimientos. Si el nucleósido es básico (por ejemplo, una citidina) se pueden usar ácidos quirales que formen mezclas de diastereoisómeros que pueden poseer propiedades de solubilidad significativamente diferentes. Ejemplos no limitativos de ácidos quirales incluyen el ácido málico, el ácido mandélico, el ácido dibenzoil tartárico, el ácido 3-bromocanfo-8-sulfónico, el ácido 10-canfosulfónico y el ácido di-p-toluiltartárico. De forma similar, la acilación del grupo hidroxilo libre con el derivado de un ácido quiral también da como resultado la formación de mezclas de diastereoisómeros cuyas propiedades físicas pueden ser suficientemente diferentes como para permitir su separación.

Se pueden obtener o purificar pequeñas cantidades de nucleósidos enantioméricamente enriquecidos pasando la mezcla racémica a través de una columna de HPLC diseñada para separaciones quirales, incluidas las columnas unidas a ciclodextrina comercializadas por Rainin Corporation.

Ejemplo 3 Separación de mezclas racémicas de nucleósidos por HPLC

La resolución de los enantiómeros C4' del (\pm)-FTC se llevó a cabo usando una columna quiral unida a ciclodextrina (cyclobond AC-I) procedente de la Rainin Corporation (Woburn, MA). Las condiciones fueron las siguientes: sistema isocrático; metanol 0,5% en agua; flujo 1 ml/min, detección UV a 262 nm. El metanol con calidad HPLC se adquirió en J.T. Baker (Phillipsburg, NJ). Las mezclas racémicas se inyectaron y las fracciones se recogieron. Las fracciones que contenían cada uno de los enantiómeros se juntaron, se congelaron y se liofilizaron. Los compuestos se caracterizaron por espectroscopia UV y por sus tiempos de retención en la HPLC. En general, los enantiómeros (-) tienen tiempos de retención menores que los enantiómeros (+) (véase J. Liquid Chromatography 7: 353-376, 1984). Las concentraciones de los compuestos se determinaron por espectroscopia UV, usando una solución estándar de concentración conocida (15 \muM) preparada en agua para valoración biológica. Los tiempos de retención para los enantiómeros separados se proporcionan en la Tabla 2.

TABLA 2 Tiempos de retención de los enantiómeros del FTC

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Compuesto \+  \hskip3.5cm  \+ R _{t}  (min)\cr 
(-)  -  FTC \+ \+ 8,3\cr (+)  -  FTC \+ \+
8,7\cr}

Ejemplo 4 Procedimientos alternativos para separar enantiómeros del FTC usando una columna quiral

Usando una columna Cyclobond I-Ac (5 \mum, 25 cm x 4,6 mm, Rainin Corporation, Woburn, MA, número de catálogo AST-41049), con un flujo de 0,6 ml/min de metanol 0,5%, sistema isocrático (Fisher Scientific, Inc. calidad HPLC, número de catálogo A-452-4 en agua) y detección UV a 262 nm, los enantiómeros del FTC presentaron tiempos de retención de 12,68 minutos ((-)-FTC) y 13,20 minutos ((+)-FTC).

Usando una columna Chiralpak AS (10 \mum, 25 cm x 4,6 mm, J.T. Baker Inc., Phillisburg, NJ, número de catálogo 7406-00, número de serie 09-29-10320) con un flujo de 0,8 ml/min de alcohol isopropílico (calidad HPLC, Fisher Scientific, Inc., número de catálogo A-451-4) y detección UV a 262 nm, los enantiómeros del FTC presentaron tiempos de retención de 5,9 minutos ((-)-FTC) y 9,8 minutos ((+)-FTC).

IV. Capacidad del 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano ("FTC") para inhibir la replicación del VIH

Es conveniente, con frecuencia, cribar una serie de mezclas racémicas de nucleósidos como una etapa preliminar para determinar cuáles merecen una posterior resolución en forma de componentes enantioméricamente enriquecidos y la evaluación posterior de su actividad antiviral. La capacidad de los nucleósidos para inhibir el VIH se puede medir mediante varias técnicas experimentales. La técnica usada en el presente documento y descrita con detalle más abajo, mide la inhibición de la replicación viral en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humana infectadas por VIH-1 (cepa LAV) y estimuladas con fitohemaglutinina (PHA). La cantidad de virus producido se determina midiendo la enzima transcriptasa inversa codificada por el virus. La cantidad de enzima producida es proporcional a la cantidad de virus producido. La Tabla 3 proporciona los valores de CE_{50} (concentración de nucleósido que inhibe la replicación del virus en un 50% en células mononucleares de sangre periférica, con un factor de error estimado del 10%) y los valores de CI_{50} (concentración de nucleósido que inhibe al 50% el crecimiento de células mononucleares de sangre periférica humana no infectadas y estimuladas con un mitógeno) de una serie de (\pm)-1,3-oxatiolanos y nucleósidos.

Ejemplo 5 Actividad anti-VIH de los nucleósidos (\pm)-1,3-oxatiolano

A. Células mononucleares de sangre periférica de tres días estimuladas con fitohemaglutinina (10^{6} células/ml), procedentes de donantes sanos seronegativos para la hepatitis B y el VIH-1, se infectaron con VIH-1 (cepa LAV) a una concentración aproximadamente 100 veces mayor que la dosis infecciosa en cultivo de tejidos 50% (DITC 50) por ml y se cultivaron en presencia y ausencia de varias concentraciones de compuestos antivirales.

B. Aproximadamente una hora tras la infección, el medio con el compuesto a ensayar (2 veces la concentración final en el medio) o sin él se añadió a los frascos (5 ml; volumen final 10 ml). Se usó AZT como control positivo.

C. Las células se expusieron al virus (aproximadamente 2 x 10^{5} dpm/ml, tal como se determinó por el ensayo de la transcriptasa inversa) y se pusieron en un incubador de CO_{2}. El VIH-1 (cepa LAV) se adquirió en el Center for Disease Control, Atlanta, Georgia. Los procedimientos usados para cultivar las células mononucleares de sangre periférica, recoger los virus y determinar la actividad transcriptasa inversa son los que describieron McDougak y col. (J. Immun. Meth. 76, 171-183, 1985) y Spira y col. (J. Clin. Meth. 25, 97-99, 1987) salvo que no se añadió fungizona al medio (véase Schinazi y col., Antimicrob. Agents Chemother. 32, 1784-1787 (1988); Id., 34: 1061-1067 (1990)).

D. El día 6, las células y el sobrenadante se transfirieron a un tubo de 15 ml y se centrifugaron aproximadamente a 900 g durante 10 minutos. Se recogieron cinco ml de sobrenadante y el virus se concentró por centrifugación a 40.000 rpm durante 30 minutos (Beckman 70.1 Ti rotor). El sedimento de virus solubilizado se procesó para la determinación de los niveles de transcriptasa inversa. Los resultados están expresados en dpm/ml de sobrenadante de muestra. También se pueden concentrar virus procedentes de volúmenes menores de sobrenadante (1 ml) por centrifugación previa a la solubilización y determinación de los niveles de transcriptasa inversa.

La mediana de la concentración eficaz (CE_{50}) se determinó por el método de la mediana (Antimicrob. Agents Chemother. 30, 491-498 (1986). Resumiendo, el porcentaje de inhibición del virus, determinado a partir de mediciones de transcriptasa inversa, se representa en un gráfico frente a la concentración micromolar de compuesto. La CE_{50} es la concentración de compuesto a la que hay una inhibición del crecimiento viral del 50%.

E. Se cultivaron células mononucleares de sangre periférica humanas no infectadas y estimuladas con un mitógeno (3,8 x 10^{5} células/ml) en presencia y ausencia de medicamento en condiciones similares a las que se usaron para el ensayo antiviral descrito más arriba. Las células se contaron tras 6 días usando un hemacitómetro y el procedimiento de exclusión con azul tripán, como describieron Schinazi y col., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 22(3), 499 (1982). La CI_{50} es la concentración de compuesto que inhibe el crecimiento de células normales en un 50%.

TABLA 3 CE_{50} e CI_{50} de varios análogos de nucleósidos 1,3-oxatiolano en células mononucleares de sangre periférica humana

2

3

Tal como se indica en la Tabla 3, en general, los nucleósidos 1,3-oxatiolano citosina sustituidos son más activos que los nucleósidos uracilo correspondientes. El error en las mediciones de CE_{50} e CI_{50} se estima en \pm 10%.

Uno de los compuestos, (\pm)-FTC, (denominado en lo sucesivo "DLS-022", compuesto 8) no sólo presenta una excepcional actividad (aproximadamente 10 nM en células mononucleares de sangre periférica) sino que también presenta una toxicidad bastante baja (>100 \muM en células mononucleares de sangre periférica, Vero y CEM).

La CI_{50} del (\pm)-FTC estaba por encima de 100 \muM, indicando que el compuesto no era tóxico en células mononucleares de sangre periférica no infectadas, evaluada hasta 100 \muM.

Ejemplo 6 Actividad antiviral de los enantiómeros del FTC resueltos por HPLC

Los enantiómeros del FTC se aislaron por el procedimiento del Ejemplo 3, y la actividad antiviral se evaluó mediante el procedimiento del Ejemplo 5. Los resultados se proporcionan en la Tabla 4 y se ilustran en la Figura 5.

TABLA 4 Actividad antiviral de los enantiómeros (+) y (-) del FTC

4

Tal como se indica en la Tabla 4, en este experimento el enantiómero (-) del FTC parece ser aproximadamente una orden de magnitud más potente que el enantiómero (+) del FTC y tiene aproximadamente la misma actividad anti-VIH que la mezcla racémica. Ni los enantiómeros ni la mezcla racémica son tóxicos hasta 100 \muM, tal como se ha determinado mediante el procedimiento de exclusión con azul de tripano en células mononucleares de sangre periférica humana.

Ejemplo 7 Actividad antiviral de los enantiómeros del FTC resueltos por el procedimiento del Ejemplo 2

Los enantiómeros del (\pm)-FTC se resolvieron también por el procedimiento del Ejemplo 2 y la actividad antiviral se evaluó mediante el procedimiento del Ejemplo 5. Los resultados están ilustrados en la Figura 6. Tal como se indica en la Figura 6, la CE_{50} de la mezcla racémica del FTC fue de 0,017 \muM, la CE_{50} del (-)-FTC fue de 0,0077 \muM y la CE_{50} del (+)-FTC fue de 0,84 \muM.

Ejemplo 8 Captación de (\pm)-FTC por células mononucleares de sangre periférica humana

Los estudios se emprendieron usando FTC radiomarcado para hacer un seguimiento de los perfiles intracelulares del medicamento parental y los metabolitos detectados en el interior de la célula. Todos los estudios se llevaron a cabo por duplicado. Se resuspendieron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humana en medio RPMI 1640 que contenía un 10% de suero de ternera fetal y antibióticos (2 x 10^{6} células/ml), 10 ml por punto de tiempo) y se incubaron tras añadir FTC 10 \muM (actividad específica aproximadamente 700 dpm/pmol). Las células se expusieron al medicamento durante 2, 6, 12 y 24 horas. A estos tiempos, el medio se retiró y las células se lavaron dos veces con solución salina equilibrada de Hank fría. La extracción se llevó a cabo añadiendo 0,2 ml de metanol frío al 60%/agua y almacenando la mezcla toda la noche a -70ºC. A la mañana siguiente, las suspensiones se centrifugaron y las extracciones se repitieron dos veces durante 0,5 horas a -70ºC. Los sobrenadantes totales (0,6 ml) se liofilizaron. Los residuos se resuspendieron en 250 \mul de agua y se analizaron alícuotas de entre 50 y 100 \mul por HPLC. Se llevaron a cabo cuantificaciones del medicamento parental y sus derivados metabólicos intracelulares por HPLC. Debido a la potencial labilidad ácida de algunos compuestos, se usó un sistema tampón con un pH cercano al fisiológico para la separación de los metabolitos.

La Figura 7 es un gráfico de la presencia (captación) de (\pm)-FTC tritiado en células mononucleares de sangre periférica humana (media de dos determinaciones) en tiempo (horas) frente a pmol/10^{6} células. Los estudios de captación indican que el FTC radiomarcado es fácilmente recogido por los linfocitos humanos, que producen cantidades muy grandes del derivado 5'-trifosfato del FTC.

Ejemplo 9 Actividad antirretroviral del FTC en varias líneas celulares

Se midió la actividad antirretroviral del FTC en una serie de líneas celulares usando procedimientos similares, pero no idénticos, a los que se han expuesto en el Ejemplo 5. Las líneas celulares se obtuvieron tanto de donantes humanos, como del AIDS Research and Reference Reagent Program, NIH, Rockville, Maryland, la ATCC o la Red Cross. Las células CEM deficientes en timidina quinasa se prepararon pasando las células CEM de forma secuencial en presencia de 5-bromo-2'-desoxiuridina. Los resultados se proporcionan en la Tabla 5.

TABLA 5 Actividad antirretroviral del FTC en distintos sistemas celulares

5

Ejemplo 10 Salida de (\pm)-FTC de células mononucleares de sangre periférica humana

Los estudios se llevaron a cabo usando FTC radiomarcado para hacer el seguimiento de los perfiles intracelulares del medicamento parental y los metabolitos detectados en el interior de la célula tras la incubación en medio con el medicamento durante 24 horas y la posterior retirada del medicamento. Este estudio mide el tiempo necesario para que declinen los niveles intracelulares de trifosfatos. Los estudios se llevaron a cabo por duplicado. Las células no infectadas (2 x 10^{6} ml) se resuspendieron en el medio adecuado suplementado con suero (10 ml por punto de tiempo) y se incubaron a 37ºC en un incubador con un 5% de CO_{2}. La concentración de FTC radiomarcado era 10 \muM. Tras añadir el compuesto en pulsos a las células durante 24 horas, las células se lavaron minuciosamente y se resuspendieron en medio nuevo sin el medicamento antiviral (0 h). A las 0, 2, 4, 6, 12, 24 y 48 horas (segundo tiempo de incubación), las células se recogieron y se extrajeron inmediatamente con metanol frío al 60%/agua. El extracto se obtuvo por centrifugación y eliminación del sedimento de células. Los extractos se liofilizaron y se almacenaron a continuación a -70ºC. Antes del análisis, el material se resuspendió en 250 microlitros de tampón HPLC y se analizó inmediatamente. La cuantificación del medicamento parental y los derivados metabólicos intracelulares se llevó a cabo por HPLC, usando un sistema de HPLC de Micromeritics o de Hewlett-Packard modelo 1090 con una columna Partisil 10 SAX de intercambio aniónico (Whatman, Inc.), con un flujo de 1 ml/min, una presión de 1 kpsi, y detección UV a 262 nm. La fase móvil consistía en agua desionizada (A), NaH_{2}PO_{4} 2 mM/NaOAc 16 mM (pH = 6,6) (B), NaH_{2}PO_{4} 15 mM/NaOAc 120,2 mM (pH = 6,6) (C) y NaH_{2}PO_{4} 100 mM/NaOAc 800 mM (pH = 6,6) (D).

Procedimiento de separación: sistema isocrático durante 5 minutos con A, seguido de un gradiente lineal de 15 minutos hasta un 100% de B, seguido de un gradiente lineal de 20 minutos hasta un 100% de C, seguido de un gradiente lineal de 10 minutos hasta un 100% de D, seguido de un sistema isocrático durante 30 minutos con 100% de D.

Tiempos de retención (minutos) en células humanas

Compuesto	Intacto	Monofosfato	Difosfato	Trifosfato
(\pm)-FTC	5,0	39,0	55,0	68,0

La Figura 8 es un gráfico de la salida de (\pm)-FTC radiomarcado de células mononucleares de sangre periférica humana, medida en horas tras la retirada del medicamento frente a la concentración (pmol/10^{6} células). Tal como se indica en la Figura, el FTC-trifosfato tiene una semivida intracelular de aproximadamente 12 horas y se puede detectar fácilmente a nivel intracelular en concentraciones de 1-5 \muM, 48 horas tras la retirada del medicamento extracelular, lo que está muy por encima de la CE_{50} del compuesto. Además, la afinidad (K^{1}) por el trifosfato de (\pm)-FTC cuando se usa la RT del VIH es de 0,2 \muM, lo que está por debajo del nivel de concentración a las 48 horas.

Ejemplo 11 Actividad anti-VIH de los derivados farmacéuticamente aceptables del (\pm)-FTC

a. Se evaluaron una serie de derivados farmacéuticamente aceptables del (\pm)-FTC, preparados derivando las posiciones 5' y N^{4}, para su actividad anti-VIH en células mononucleares de sangre periférica usando un procedimiento similar al que se ha descrito en el Ejemplo 5. Los resultados son los siguientes. El éster O-butirato-5' del (\pm)-FTC presentó una CE_{50} de 0,0017. El derivado N^{4}-acetilo del (\pm)-FTC presentó una CE_{50} de 0,0028. El O-butirato-5', N^{4}-éster del (\pm)-FTC presentó una CE_{50} = 0,0058.

b. La actividad anti-VIH del éster O-butirato-5' del (\pm)-FTC en el sistema MT4 (CE_{50}) fue 0,04 \muM. En el mismo ensayo, el (\pm)-FTC no acilado presentó una CI_{50} de 0,52 \muM. La CI_{50} del AZT en este sistema fue de 0,09 \muM.

V. Capacidad del FTC para inhibir la replicación del VHB Ejemplo 12 Evaluación de la actividad de los enantiómeros (+) y (-) del FTC en cultivos celulares 2.2.15

La capacidad de los enantiómeros del FTC para inhibir el crecimiento de virus en cultivos celulares 2.2.15 (células HepG2 transformadas con un virión de la hepatitis) se describe con detalle a continuación.

Se ha elaborado un resumen y una descripción del ensayo de los efectos antivirales en este sistema de cultivo y del análisis de ADN del VHB (Korba and Milman, 1991, Antiviral Res., 15: 217). Las evaluaciones antivirales se realizaron en dos pases distintos de células. Todos los pocillos, de todas las placas, se sembraron a la misma densidad y al mismo tiempo.

Parámetros del ensayo

Debido a las variaciones inherentes en los niveles tanto intracelulares como extracelulares de ADN del VHB, solamente se consideraron estadísticamente significativos (P<0,05) disminuciones 3,5 veces (para el ADN del virión del VHB) o 3,0 veces (para productos intermedios de la replicación de ADN del VHB) mayores que los niveles medios de estas formas de ADN del VHB en células no tratadas. Los niveles de ADN del VHB integrado en cada preparación de ADN celular (que se mantienen constantes por célula en estos experimentos) se usaron para calcular los niveles de formas intracelulares de ADN del VHB, asegurando de este modo que se comparaban cantidades iguales de ADN celular entre distintas muestras.

Los valores típicos de ADN extracelular del virión del VHB en células no tratadas varían entre 50 y 150 pg/ml de medio de cultivo (media de aproximadamente 76 pg/ml). Los productos intermedios intracelulares de replicación del ADN del VHB en células no tratadas varían entre 50 y 100 pg/\mug de ADN celular (media de aproximadamente 74 pg/\mug de ADN celular). En general, las disminuciones de los niveles de ADN intracelular del VHB debidas al tratamiento con compuestos antivirales son menos pronunciadas y ocurren más despacio que las disminuciones de los niveles de ADN del virión del VHB (Korba and Milman, 1991, Antiviral Res., 15: 217).

La forma en que se realizaron los análisis de hibridación para estos experimentos dio como resultado una equivalencia de aproximadamente 1,0 pg de ADN intracelular del VHB para 2-3 copias genómicas por célula y 1,0 pg/ml de ADN extracelular del VHB para 3 x 10^{5} partículas virales/ml.

Análisis de toxicidad

Los análisis de toxicidad se realizaron para evaluar si cualquier efecto antiviral observado se debía a un efecto general sobre la viabilidad celular. El procedimiento usado en el presente documento fue la medición de la captación de colorante rojo neutro, un ensayo estándar y de uso extendido para la viabilidad celular en una variedad de sistemas virus-huésped, incluidos VSH y VIH. Los análisis de toxicidad se realizaron en placas de 96 pocillos con fondo plano para cultivos tisulares. Las células para los análisis de toxicidad se cultivaron y trataron con los compuestos ensayados siguiendo el mismo esquema que se describe para las evaluaciones antivirales más abajo. Cada compuesto se ensayó a 4 concentraciones, cada uno en cultivos por triplicado (pocillos "A", "B" y "C"). El captación de colorante rojo neutro se usó para determinar el nivel de toxicidad relativo. La absorbancia del colorante internalizado a 510 nm (A_{sin}) se usó para el análisis cuantitativo. Los valores se presentan como porcentaje de los valores A_{sin} medios en 9 cultivos separados de células no tratadas mantenidos en la misma placa de 96 pocillos que los compuestos a ensayar. El captación de colorante en los 9 cultivos control en la placa 5 varió entre 91,6% y 110,4%, en la placa 6 entre 96,6% y 109%. Los resultados se proporcionan en la Tabla 6.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 6 Análisis de toxicidad de los compuestos ensayados en células 2.2.15

6

Evaluación de la toxicidad

Tal como se indica en la Tabla 6, no se observó una toxicidad significativa (disminución mayor del 50% con respecto a los niveles de captación de colorante observado en células no tratadas) con los compuestos ensayados a las concentraciones usadas para las evaluaciones antivirales. Ambos compuestos ensayados, (-)-FTC y (+)-FTC, parecieron ser tóxicos a las concentraciones más elevadas usadas en los análisis de toxicidad (330 \muM).

Evaluaciones antivirales Controles

Dentro de las variaciones normales, los niveles de ADN del virión de VHB y los productos intermedios intracelulares de replicación del VHB (VHB RI) permanecieron constantes en las células no tratadas a lo largo del periodo de estudio. El DMSO, a una concentración del 1%, no afectó a los niveles de replicación del VHB en cultivos celulares 2.2.15.

Compuestos ensayados

Tal como se indica en la Tabla 7, tanto el (-)-FTC como el (+)-FTC inhibían significativamente la replicación del VHB en los niveles ensayados. Tal como se indica en la Tabla 8, el (-)-FTC aún inhibe de forma significativa la síntesis de ADN del virión del VHB y el ADN intracelular del VHB a concentraciones de 4, 1 y 0,25 \muM.

TABLA 7 Efecto de los compuestos ensayados sobre la producción de VHB en cultivos celulares 2.2.15

7

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ * \+ El punto de corte de sensibilidad para el ADN de virión del
VHB fue 0,1 pg/ml.\cr  \+ @ \+  \begin{minipage}[t]{140mm} El
ADN intracelular de VHB se analizó 24 horas tras el 9º día de
tratamiento. Los niveles de ADN del VHB integrado en cada
preparación de ADN celular se usaron para calcular los niveles de
ADN del VHB de 3,2 Kb en estado episomal (MONO.) y los productos
intermedios de replicación del ADN del VHB
(RI.).\end{minipage} \cr}

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TABLA 8 Efectos de los compuestos ensayados sobre la producción de VHB en cultivos celulares 2.2.15

8

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ * \+ El punto de corte de sensibilidad para el ADN del virión
del V HB fue 0,1 pg/ml.\cr  \+ + \+  \begin{minipage}[t]{140mm}
El análisis del ADN intracelular del VHB se hizo durante 24 horas
tras el 9º día de tratamiento. Los niveles de ADN del VHB integrado
en cada preparación de ADN celular se usaron para calcular los
niveles de ADN del VHB de 3,2 Kb en estado episomal (MONO.) y los
productos intermedios de replicación del ADN del VHB
(RI.).\end{minipage} \cr}

Ejemplo 13 Captación de (\pm)-FTC en células hepáticas humanas; Actividad del FTC frente al VHB

Se repitió el procedimiento del Ejemplo 8 con células hepáticas humanas (células HepG2, disponibles en la ATCC) para determinar el captación y el metabolismo del FTC en estas células. Tal como se muestra en la Figura 9, las células HepG2 recogen (\pm)-FTC en grandes cantidades. Estas células hepáticas humanas metabolizan un alto porcentaje del (\pm)-FTC a trifostato de (\pm)-FTC.

Estos datos, junto con los demás datos proporcionados en el presente documento, indican que el (\pm)-FTC, así como sus enantiómeros (-) y (+), son fosforilados en células hepáticas. Estas células se pueden transformar con el virus de la hepatitis B.

Ejemplo 14 Salida de FTC de células HepG2 humanas

La Figura 10 ilustra la salida de [^{3}H]-(\pm)-FTC y sus derivados fosforilados de células HepG2 en pmol/10^{6} células a lo largo del tiempo tras añadir a las células pulsos de [^{3}H]-(\pm)-FTC 10 \muM (700 DPM/pmol) durante 24 horas, y evaluar la concentración de compuesto 24 horas tras su retirada.

Tal como se ilustra, incluso a las 48 horas, aún está presente en las células más de 1 \muM de compuesto activo (lo que es significativamente mayor a la CE_{50} para el compuesto).

V. Toxicidad en células precursoras de granulocitos-macrófagos Ejemplo 15 Efecto del FTC sobre la formación de colonias de células precursoras de granulocitos-macrófagos

La Figura 12 es un gráfico del efecto de los enantiómeros (-) y (+) del FTC sobre la formación de colonias de células precursoras de granulocitos- macrófagos, medido en porcentaje de supervivencia frente a concentración en \muM ((-)-FTC, círculo vacío; (+)-FTC, círculo relleno; AZT, cuadrado relleno. Tal como se indica, el enantiómero (-) del FTC parece ser menos tóxico, es decir, tiene una mayor CI_{50}, que tanto el enantiómero (+) como el AZT en esta línea celular.

VI. Farmacocinética del FTC Ejemplo 16 Metabolismo del FTC tras su administración en ratas

Se administró (\pm)-FTC por vía intravenosa en dosis de 10, 50 y 100 mg/kg en ratas y se evaluó el área bajo la concentración plasmática del medicamento frente a tiempo (AUC), el aclaramiento total (CL_{T}), el volumen de distribución en el estado de equilibrio estacionario (V_{SS}), el tiempo medio de residencia (MRT) y la semivida (t_{1/2}). Los resultados se proporcionan en la Tabla 9.

TABLA 9 Parámetros farmacocinéticos del FTC tras la administración intravenosa de 10, 50 100 mg/kg en ratas*

9

Ejemplo 17 Parámetros farmacocinéticos del FTC tras la administración vía intravenosa y oral de FTC

Se obtuvieron los parámetros farmacocinéticos modelo-independientes para el (\pm)-FTC mediante la administración (intravenosa (I.V.) y oral (P.O.)) de 33,3 mg/kg en macacos de la India. Los resultados se proporcionan en la Tabla 10. Cabe destacar que la biodisponibilidad media del compuesto en los monos fue del 73% (\pm 6%).

TABLA 10 Parámetros farmacocinéticos modelo-independientes obtenidos para el (\pm)-FTC mediante la administración intravenosa (I.V.) y oral (P.O.) de 33,3 mg/kg en macacos de la India*

10

TABLA 11 Relación LCR/suero de FTC y su metabolito desaminado, 1 hora tras el tratamiento

11

Ejemplo 18 Relación LCR/suero de FTC y sus metabolitos en macacos de la India

La capacidad del (\pm)-FTC para atravesar la barrera hematoencefálica se evaluó administrando 33,3 mg/kg del compuesto activo en macacos de la India y midiendo la cantidad de (\pm)-FTC en el líquido cefalorraquídeo y el suero de la sangre una hora tras la administración Los resultados se proporcionan en la Tabla 11. Los datos indican que una cantidad significativa de compuesto activo atraviesa la barrera hematoencefálica en estos mamíferos.

Claims

1. Un procedimiento para obtener (-)-\beta-L-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano, que comprende la resolución de una mezcla de (-) y (+)-cis-2-hidroximetil-5-(5-fluoro-citosin-1-il)-1,3-oxatiolano mediante la exposición de la mezcla a citidina-desoxicitidina desaminasa.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además la exposición de la mezcla enantioméricamente enriquecida a una segunda enzima para la posterior resolución de (-)-\beta-L-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el cis-2-hidroximetil-5-(5-fluoro-citosin-1-il)-1,3-oxatiolano se acila en la posición hidroxilo C5' previamente a la etapa de resolución.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el cis-2-hidroximetil-5-(5-fluoro-citosin-1-il)-1,3-oxatiolano se acila con un compuesto seleccionado del grupo formado por ácidos alquil-carboxílicos y ácidos alquil-carboxílicos sustituidos.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el ácido alquil-carboxílico se selecciona del grupo formado por ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido pentanoico, ácido 2-cloropropiónico, ácido 2-clorobutírico y ácido 2-cloropentanoico.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que la segunda enzima se selecciona del grupo formado por una esterasa, una lipasa, subtilisina o \alpha-quimotripsina, que catalizan preferentemente una reacción en uno de los enantiómeros.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la esterasa es esterasa de hígado de cerdo.

8. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la lipasa se selecciona del grupo formado por lipasa pancreática porcina y lipasa Amano PS-800.

9. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la mezcla se mezcla con la enzima en una solución.

10. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la mezcla se pasa a través de una columna que incluye la enzima inmovilizada en un soporte.

11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la reacción enzimática tiene lugar en presencia de un agente tensioactivo no iónico.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el agente tensioactivo no iónico es Triton X-100.

13. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende además la recristalización de la mezcla enantioméricamente enriquecida.

14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende además el tratamiento de la mezcla enantioméricamente enriquecida con un ácido quiral seleccionado del grupo formado por ácido málico, ácido mandélico, ácido 10-canfosulfónico, ácido 3-bromocanfo-8-sulfónico, ácido di-benzoil tartárico y ácido di-p-toluiltartárico.

15. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende además la resolución de la mezcla enantioméricamente enriquecida usando una columna quiral.