NO312399B1 - Terapeutisk aktiv forbindelse, preparat inneholdende forbindelsen samt dens anvendelse - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse ligger i området biologisk aktive nukleosider og omfatter spesielt antivirale preparater som omfatter 2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl)-l,3-oksatiolan ("FTC") samt fysiologisk akseptable derivater eller fysiologisk akseptable salter derav.

Oppfinnelsen angår også et farmasøytisk preparat inneholdende forbindelser som nevnt ovenfor samt forbindelsenes anvendelse .

I 1981 ble ervervet immundefektsyndrom, AIDS, identifisert som en sykdom som alvorlig kompromitterte humanimmunsystemet og som så å si uten unntak førte til død. I 1983 ble den etiologiske årsak til AIDS bestemt til å være humanimmunodefektvirus, HIV. I desember 1990 anslo Verdens Helseorgani-sasjon, WHO, at mellom 8 og 10 millioner over hele verden var smittet med HIV og at ca. 1 000 000 til 1 400 000 av disse befant seg i USA.

I 1985 ble det angitt at det syntetiske nukleosid 3'-azido-3'-deoksythymidin (AZT) inhiberer replikeringen av humanimmunodefektvirus. Efter dette er et antall andre syntetiske nukleosider inkludert 2' , 3'-dideoksyinosin (CCI), 2',3'-dideoksycytidin (DDC), 3 *-fluor-3'-deoksythymidin (FLT) og 2',3'-dideoksy-2<*>,3'-dideoksy-2',3'-didehydrothymidin (D4T) påvist å være effektive mot HIV. Et antall andre 2',3'-dideoksynukleosider er vist å inhibere veksten av et antall viruser in vitro. Det synes som om, efter cellulær fos-forylering til 5'-trifosfatet ved hjelp av cellulære kinaser, disse syntetiske nukleosider innarbeides i en voksende streng av virale DNA og forårsaker kjedeterminering på grunn av fravær av 3 '-hydroksylgruppen.

Suksessen for forskjellige 2',3'-dideoksynukleosider med henblikk på inhibering av replikeringen av HIV in vivo eller in vitro har ført et antall forskere til å konstruere og å prøve nukleosider som har et heteroatom i stedet for karbonatom i 3' -posisjonen i nukleosidet. Norbeck et al. beskriver at (±)-l-[(2<p>,4<p>)-2-(hydroksymetyl)-4-dioksolanyl]-thymin (kalt (± )-dioksolan-T) viser en moderat aktivitet mot HIV (EC50på 20 um i ATH8-celler) og at forbindelsen ikke er toksisk mot ikke-infiserte kontrollceller ved en konsentrasjon på 200 jjM, det henvises til "Tetrahedron Letters", 30 (46 ), 6246, (1989). EP publ. 0 337 713 samt US-PS 5 041 449 beskriver 2-substituerte-4-substituerte-l,3-dioksolaner som viser antiviral aktivitet.

US 5 047 407 og EP 0 382 526 beskriver et antall 2-substituerte-5-substituerte-l,3-oksatiolan-nukleosider med antiviral aktivitet og angir spesifikt at den racemiske blanding (rundt C4'-posisjonen) av Cl'-p-isomeren av 2-hydroksymetyl-5-(cytosin-l-yl)-l,3-oksatiolan (herefter kalt (±)-BCH-189) har omtrent den samme aktivitet mot HIV som AZT og ingen cellulær toksisitet ved de utprøvede nivåer.

(±)-BCH-189 er også funnet å inhibere replikeringen av AZT-resistente HIV-isolater in vitro fra pasienter som har vært behandlet med AZT i mer enn 36 uker.

En annen virus som forårsaker et seriøst humanhelseproblem er hepatitt-B-virus (nedenfor kalt "HBV"). HBV er efter tobakk den største årsak til humancancer. Den mekanikk ved hvilken HBV induserer cancer er ikke kjent, selv om det er postulert at den direkte kan utløse tumorutvikling eller indirekte utløse tumorutvikling ved kronisk inflammasjon, cirrhose og celleregenerering assosiert med infeksjon.

Efter en 2 til 6 måneder lang inkuberingsperiode hvor verten ikke er klar over infeksjonen, kan HBV-infeksjon føre til akutt hepatitt og leverskade som forårsaker abdominale smerter, gulsott og forhøyede blodnivåer av visse enzymer. HBV kan forårsake fulminant hepatitt, en hurtig progressiv, ofte fatal form av sykdommen der massive deler av leveren ødelegges.

Pasienter kommer seg som regel efter akutt hepatitt. Hos enkelte pasienter forblir imidlertid høye nivåer av viralt antigen i blodet i lenge eller ubegrensede perioder og forårsaker en kronisk infeksjon. Kroniske infeksjoner kan føre til kroniske persistent hepatitt. Pasienter som er smittet med kronisk persistent HBV er vanligst i utviklings-land. I midten av 1991 var det ca. 225 millioner bærere av kronisk HBV bare i Asia, på global basis var tallet ca. 300 millioner bærere. Kronisk persistent hepatitt kan forårsake tretthet, cirrhose i leveren og heptocellulær karsinom, en primær levercancer.

I de vestlige industrialiserte land inkluderer høyrisiko-grupper for HBV-infeksjon de som er i kontakt med HBV-bærere eller deres blodprøver. Epidemiologien for HBV er meget lik den til ervervet immundefektsyndrom, noe som forklarer hvorfor HBV-infeksjon hyppig finnes blant pasienter med AIDS eller AIDS-relatert kompleks. Imidlertid er HBV mer smittsom enn HIV.

En human serum-avledet vaksine er utviklet for å immunisere pasienter mot HBV. Mens den er funnet effektiv, er produk-sjonen av vaksinen komplisert fordi ressursene av humanserum fra kroniske bærere er begrenset og fordi renseprosedyren er lang og kostbar. Videre må hver sats av vaksine som fremstilles fra forskjellig serum prøves på sjimpanser for å sikre sikkerheten. Vaksiner er også fremstilt ved genetiske teknikker. Daglige behandlinger med a-interferon, et genetisk konstruert protein, har også vist seg lovende. Til i dag er det imidlertid intet kjent farmasøytisk middel som effektivt inhiberer replikeringen av virusen.

For å markedsføre et nukleosid for farmasøytiske formål må det ikke bare være effektivt med lav toksisitet, det må også være omkostningseffektivt å fremstille. En stor innsats av forskning og utvikling er rettet mot nye, lavomkostnings-prosesser for storskala-nukleosidproduksjon. 2',3'-dideoksy nukleosider fremstilles i dag ved en av to teknikker: derivatisering av et intakt nukleosid eller kondensering av en derivatisert sukkerdel med en heterocyklisk base. Selv om det er tallrike mangler forbundet med oppnåelsen av nye nukleosidanaloger ved å modifisere intakte nukleosider, er en hovedfordel ved denne måte at den riktige absolutte stereokjemi allerede er satt naturlig. Imidlertid kan denne fremstillingsmåte ikke benyttes ved fremstilling av nukleosider som inneholder enten ikke-naturlig opptredende baser eller ikke-naturlig opptredende karbohydratdeler (og som derfor ikke fremstilles fra intakte nukleosider) som for eksempel 1,3-oksatiolan-nukleosider og 1,3-dioksolan-nukleosider.

Når man kondenserer et karbohydrat eller en karbohydratlignende del med en heterocyklisk base for å danne et syntetisk nukleosid, dannes det et nukleosid som har to chirale sentra (i Cl'- og C4'-posisjon) og som derfor foreligger som et diastereomerpar. Hver diastereomer foreligger som et sett av enantiomerer. Derfor er produktet en blanding av fire enantiomerer.

Det finnes ofte at nukleosider med ikke-natur1ig opptredende stereokjemi i enten Cl'- eller C4'-posisjon er mindre aktive enn det samme nukleosid med en naturlig gitt stereokjemi. For eksempel har Carter et al. angitt at den konsentrasjon av (-)-enantiomeren av karbovir (2',3'-didehydro-2',3'-dideoksy-guanosin) i cellekultur som er nødvendig for å redusere reverstranskriptase-aktiviteten med 50$, EC5g-verdien, er 0,8 uM, mens ED5Q-verdien for (+)-enantiomeren av karbovir er mer enn 60 jjM , se "Antimicrobial Agent and Chemotherapy", 34:6, 1297-1300 (juni 1990).

WO 91/11186 beskriver at 1,3-oksatiolan-nukleosider kan fremstilles med høy diastereo-selektivitet (høy prosentandel av nukleosid med g<->konfigurasjon av bindingen fra Cl'-karbonet til den heterocykliske base) ved omhyggelig seleksjon av den Lewis-syre som benyttes i kondensasjons-prosessen. Det ble oppdaget at kondensasjon av et 1,3-oksatiolan-nukleosid med en base inntrer med så å si fullstendig P-stereospesifisitet når tinn(IV)klorid benyttes som kondensasjonskatalysator. Andre Lewis-syrer gir lav (eller ingen) Cl'-p-selektivitet eller katalyserer ikke engang reaksjonene.

I lys av det faktum at ervervet immundef ektsyndrom, AIDS-relatert kompleks og hepatitt-B-virus har nådd epidemiske nivåer globalt sett og har tragiske innvirkninger for den infiserte pasient, er det et sterkt behov for å tilveiebringe nye, effektive farmasøytiske midler for å behandle disse sykdommer samtidig som midlene har lav toksisitet overfor verten.

Det er også et behov for å tilveiebringe en omkostnings-effektiv, kommersielt levedyktig metode for å fremstille farmasøytisk nukleosider og spesifikt å oppnå p<->stereospesifisitet i C4'-posisjonen i syntetiske nukleosider som fremstilles ved å kondensere en karbohydratlignende del med en base.

Foreliggende oppfinnelse tar sikte på å forbedre den kjente teknikk og angår i et første aspekt en terapeutisk aktiv forbindelse som karakteriseres ved at den er (-)-p-L-2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl)-l,3-oksatiolan som isolert enantiomer eller et fysiologisk akseptabelt salt derav.

I en foretrukken utførelsesform karakteriseres oppfinnelsen ved at forbindelsen er (-)-p-L-2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl )-l, 3-oksatiolan i enantiomert anriket form.

Oppfinnelsen angår som nevnt innledningsvis også et farmasøy-tisk preparat som karakteriseres ved at det omfatter en effektiv mengde for behandling av HIV-infeksjoner i mennesker av (-)-g-L-2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl)-l, 3-oksatiolan som en isolert enantiomer eller dennes fysiologisk akseptable salt, i en farmasøytisk akseptabel bærer.

I en foretrukken utførelsesform karakteriseres dette preparat ved at det omfatter en effektiv mengde for behandling av HIV-infeksjoner i mennesker av (-)-p-L-2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl )-l,3-oksatiolan i enantiomert anriket form eller dennes fysiologisk akseptable salt, i en farmasøytisk akseptabel bærer.

Til slutt angår oppfinnelsen anvendelsen av (-)-p-L-2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl)-l,3-oksatiolan som isolert enantiomer for fremstilling av et medikament for behandling av HIV.

I en foretrukken utførelsesform angår oppfinnelsen anvendelsen av (-)-P-L-2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl )-l, 3-oksatiolan i enantiomert anriket form for fremstilling av et medikament for behandling av HIV.

Behandling av HIV- og HBV-infeksjoner i mennesker og andre vertsdyr omfatter administrering av en effektiv mengde 2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl)-l,3-oksatiolan, et farmasøytisk aksepterbart derivat derav inkludert et 5'-eller N<4->alkylert eller —acylert derivat, eller et farmasøy-tisk akseptabelt salt derav, i en farmasøytisk akseptabel bærer.

Det er oppdaget at 2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl)-1,3-oksatiolan, "FTC", viser overraskende høy aktivitet mot humanimmunodefektvirus med meget lav vertscelletoksisitet. Det er også vist at FTC viser meget signifikant aktivitet mot HBV og derfor kan benyttes for å behandle pasienter som har et antall sykdommer assosiert med HBV-infeksjon. Toksisitets- og farmakokinetiske studier bekrefter brukbar-heten av FTC som et antiviralt middel for farmasøytisk administrering. FTC og dens enantiomerer er ikke-toksiske for perifere human-benmargceller ved konsentrasjoner opptil 50 jjM og andre cellelinjer ved konsentrasjoner opptil 300 pM. FTC-TP er en intracellulær hovedmetabolitt i PBMC- og HepG2-celler. FTC-TP inhiberer kompetitivt HIV-1-revers-transkr iptase, RT, med en Kj-verdi på 0,2 jjM ved bruk av en poly(I)oligo(dC )-templatprimer. Ved bruk av sekvenserings-analyse kan FTC-TP påvises å være en potent DNA-kjede-terminator når HIV-RT benyttes (C-stopp).

Kronisk behandling med FTC er ikke-toksisk for gnagere, selv ved orale doser på 85 mg/kg pr. dag i minst 2 måneder. Farmakokinetikken for FTC i rhesus-aper indikerer høy oral biotilgjengelighet (ca. 73 ± 6$) og en plasmaterminal halveringstid på ca. 1,34 ± 0,18 (gjennomsnitt av oral og intravenøs administrering).

En fremgangsmåte for oppløsning av en racemisk blanding av nukleosid-enantiomerer inkludert den racemiske blanding av FTC, omfatter eksponering av den racemiske blanding til et enzym som preferensielt katalyserer en reaksjon i en av enantiomerene. Prosessen kan benyttes for å oppløse et vidt spektrum nukleosider inkludert pyrimidin- og purin-nukleosider som eventuelt er substituert i karbohydratdelen eller i basedelen. Prosessen kan også benyttes for å oppløse nukleosid-derivater som inneholder ytterligere heteroatomer i karbohydratdelen, for eksempel (±)-FTC og (±)-BCH-189. Oppløsningen av nukleosider kan gjennomføres i stor skala til moderate omkostninger.

Ved bruk av de her beskrevne metoder, ble FTC oppløst til sine ( + )-p-D- og (- )-p-L-enantiomerer. (-)-3-L-enantiomeren synes å være mer potent enn (+)-e-D-enantiomeren mot HIV, HBV og SIV. (+ )-enantiomeren av FTC er også aktiv mot HIV, HBV og

SIV.

Oppfinnelsen skal beskrives nærmere også under henvisning til de vedlagte tegninger, der: Figur 1 viser den kjemiske struktur for 2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl )-l,3-oksatiolan, "FTC"; Figur 2 illustrerer en fremgangsmåte for fremstilling av 2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl )-l , 3 - oksatiolan; Figur 3 er et flytskjema for spesifisiteten av alkalisk fosfatase og slangegift-fosfordiesterase for (+)- og (- )-enantiomerene av FTC; Figur 4 er et diagram som antyder utviklingen av lipasekata-lysert hydrolyse på 5'-butyrylesteren av FTC over tid ved bruk av enzymene Amano PS-800® (åpent kvadrat) og PLE (åpen sirkel med punkt); Figur 5 er et diagram over virkningen av konsentrasjonen i jjM av racemisk og enantiomer-anriket FTC (fremstilt ved metoden ifølge eksempel 4) mot den prosentuale inhibering av human PBM-celler som er infisert med HIV-1 ((formørket sirkel, (±)-FTC), (åpen sirkel, (-)-FTC), (formørket kvadrat, (+)-FTC)); Figur 6 er et diagram over virkningen av konsentrasjonen i jjM av racemisk og enantiomert anriket FTC (fremstilt ved fremgangsmåten ifølge eksempel 3) mot den prosentuale inhibering av human PBM-celler infisert med HIV-1 ((mørkgjort sirkel, (±)-FTC), (åpen sirkel, (-)-FTC), (mørkgjort kvadrat, (+)-FTC)); Figur 7 er et diagram over opptaket av tritiert (±)-FTC i human-PBM-celler (gjennomsnitt av to bestemmelser) med tiden (timer) mot pmol/10<6->celler; Figur 8 er et diagram over regressen av radiomerket (±)-FTC fra human-PBM-celler, målt i timer mot pmol/10^-celler. Figur 9 viser nærværet av [<3>H]-(±)-FTC og fosforylerte derivater derav i human-HepG2-celler (gjennomsnitt av to bestemmelser) inkubert i medium inneholdende10pM [<3>H]-(±)-FTC, målt i pmol/10<6->celler med tiden; Figur 10 viser regressen av [<3>H]-(±)-FTC og dens fosforylerte derivater i human HepG2 i pmol/10^ celler med tiden efter pulsing av celler med 10 pM [<3>H]-(±)-FTC (700 DPM/pmol) i 24 timer og bedømmelse av konsentrasjonen av forbindelsen 24 timer efter fjerning; Figur 11 illustrerer reduksjonen av de kombinerte konsentrasjoner av [<3>H]-(±)-FTC og dens fosforylerte derivater fra human-HepG2-celler efter inkubering med 10 jiM [<3>H]-(±)-FTC (700 DPM/pmol) i 24 timer, i pmol/10^ celler med tiden; og Figur 12 er et diagram over virkningen av enantiomerene av FTC på kolonidannelse av granulocytt-makrofag-forløperceller, målt i prosent overlevelse mot konsentrasjonen i pM ((-)-FTC, åpen sirkel; (+)-FTC, mørkgjort sirkel; AZT, mørkgjort kvadrat).

Som her benyttet henviser uttrykket "enantiomert anriket nukleosid" til et nukleosidpreparat som inkluderer minst 95$ av en enkelt antiomer av dette nukleosid.

Som her benyttet betyr FTC (2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl )-l , 3-oksatiolan (den racemiske form av enantiomerene), også kalt 2'-deoksy-5-fluor-3'-tiacytidin.

Som her benyttet betyr uttrykket (±)-FTC (± )-p-D,L-2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl)-l,3-oksatiolan.

Som benyttet her betyr uttrykket (-)-FTC (- )-p-L-2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl )-l,3-oksatiolan.

Som benyttet her betyr uttrykket ( + )-FTC (+ )-p-D-2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl )-l,3-oksatiolan.

Som benyttet her betyr uttrykkene FTC-MP, FTC-DP og FTC-TP det respektive monofosfat, difosfat og trifosfat av FTC.

Som benyttet her betyr uttrykket BCH-189 2-hydroksymetyl-5-(cytosin-l-yl)-l,3-oksatiolan.

Som benyttet her betyr uttrykket "preferensiel enzymkatalyse" en katalyse med et enzym som favoriserer et substrat i forhold til et annet.

Som benyttet her betyr en avspaltbar gruppe en funksjonell gruppe som danner en incipient karbonering når den skilles fra molekylet den var bundet til.

Foreliggende oppfinnelse slik den her beskrives gjelder en forbindelse og et preparat for behandling av HIV- og HBV-infeksjoner og andre viruser som replikerer på tilsvarende måte, i mennesker eller andre vertsdyr, og som inkluderer administrering av en effektiv mengde av (±)-p<->D,L-, (-)-p-L-eller ( -)-p-D-enantiomeren av 2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl )-l, 3-oksatiolan , et farmasøytisk ("fysiologisk") akseptabelt derivat, inkludert et 5'- eller N^-alkylert eller -acylert derivat, eller et farmasøytisk ("fysiologisk") akseptabelt salt derav, i en farmasøytisk akseptabel bærer. Som vist nedenfor har forbindelsene ifølge oppfinnelsen enten antiretrovial aktivitet som anti-HIV-1-, anti-HIV-2- og anti-simian-immunodefektvirus (anti-SIV)-aktivitet, i seg selv, eller som metaboliseres til en forbindelse som viser antiretroviral aktivitet.

FTC og farmasøytisk akseptable derivater eller farmasøytisk akseptable formuleringer inneholdende disse forbindelser, er brukbare ved prevensjon og terapi av HIV-infeksjoner og andre relaterte tilstander som AIDS-relatert kompleks, ARC, persistent generalisert lymfadenopati, PGL, AIDS-relaterte neurologiske tilstander, anti-HIV-antistoff positive og HIV-positive tilstander, Kaposi's sarkom, trombocytopeni purpurea og opportunistiske infeksjoner. I tillegg kan forbindelsene eller formuleringene benyttes profylaktisk for å inhibere eller retardere progresjonen av kliniske sykdommer i individer som er anti-HIV-antistoff- eller HIV-antigen-positive eller som har vært eksponert til HIV.

FTC og dens farmasøytisk akseptable derivater eller salter eller farmasøytisk akseptable formuleringer inneholdende disse forbindelser er også brukbare ved inhibering og terapi av HBV-infeksjoner og andre relaterte tilstander som anti-HBV-antistoff-positive og HBV-positive tilstander, kroniske leverinflammasjoner forårsaket av HBV, cirrhose, akutt hepatitt, fulminant hepatitt, kronisk persistent hepatitt og tretthet. Disse forbindelser eller formuleringer kan også benyttes profylaktisk for å inhibere eller retardere progresjonen av klinisk sykdom hos individer som er anti-HBV-antistoff- eller HBV-antigen-positive eller som er eksponert til HBV.

En fremgangsmåte for fremstilling av 2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl)-l,3-oksatiolan omfatter: (i) omsetning av eventuelt beskyttet 5-fluorcytosin med 1,3-oksatiolan med formel A

der Rlaer hydrogen eller en hydroksyl-beskyttende gruppe, inkludert en acylgruppe, og L er en avspaltbar gruppe; og eventuelt å fjerne en tilstedeværende hydroksyl-beskyttende gruppe, (ii) omsetning av en forbindelse med formel B

der R^aer som angitt ovenfor og R-^er en amino-beskyttende gruppe, med et fluoreringsmiddel for å innføre et fluoratom i 5-posisjon i cytosinringen;

eller

(iii) omsetning av en forbindelse med formel C

der R^aer som angitt ovenfor, med et middel for å omdanne oksogruppen i 4-posisjon i uracilringen til en aminogruppe; idet gjenværende beskyttende grupper fjernes å gi det ønskede produkt.

En fremgangsmåte for fremstilling av en (-)- eller ( + )-enantiomer av 2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl)-l,3- oksatiolan omfatter å underkaste forbindelsen eller derivatet (for eksempel 5'-esteren) derav i form av en blanding av (-)-og (+)-enantiomerer under egnede betingelser en omsetning med reagenser som tjener til å separere enantiomerene, og hvis nødvendig, omdanning av det resulterende derivat til stamforbindelsen.

Når det gjelder trinn (i) i fremgangsmåten ovenfor inkluderer den hydroksy-beskyttende gruppe beskyttende grupper som beskrevet i detalj nedenfor, inkludert acyl som acetyl, arylacyl som benzoyl eller substituert benzoyl, trityl eller monometoksytrityl, benzyl eller substituert benzyl, trisubs-tituert silyl inkludert trialkylsilyl, for eksempel dimetyl-t-butylsilyl, eller difenylmetylsilyl. 5-fluorcytosinfor-bindelsen kan eventuelt beskyttes med trisubstituerte silylgrupper. De beskyttende grupper kan fjernes på konvensjonell måte. Den avspaltbare gruppe L er . en avspaltbar gruppe som er karakteristisk for fagmannen på nukleosid-kjemien, for eksempel halogen som klor eller brom, alkoksy som metoksy eller etoksy, eller acyl som acetyl eller benzoyl.

Reaksjonen i trinn (i) kan gjennomføres i et organisk oppløsningsmiddel som 1,2-dikloretan eller acetonitril, i nærvær av en Lewis-syre, fortrinnsvis tinn(IV)klorid, eller trimetylsilyltriflat.

Forbindelser med formel A, der L betyr en acylgruppe, for eksempel en acetylgruppe, kan oppnås ved omsetning av en forbindelse med formel D

der Rlaer som angitt ovenfor, med et reduserende middel, for eksempel litiumaluminiumhydrid, fulgt av behandling med den egnede konvensjonelle reagens for det ønskede mellomprodukt, for eksempel et karboksylsyreanhydrid som eddiksyreanhydrid, for acylering, klorerings- eller bromeringsreagenser for halogenering, eller alkyleringsreagenser. Forbindelsen med formel D kan fremstilles ved omsetning av en forbindelse med formel E

med HSCH2CO2H ved forhøyet temperatur.

Forbindelsen med formel E kan fremstilles ved ozonolyse av en allyleter eller —ester med formelen CH2=C, -CH2-OR eller en dieter eller diester av 2-buten-l,3-diol med formelen R0CH2-CH=CH-CH20R, der R er en beskyttende gruppe, for eksempel en alkyl-, silyl- eller acylgruppe.

Når det gjelder trinn (ii) kan 5-fluor-substituenten innføres på i og for seg kjent måte (M.J. Robins et al. i "Nucleic Acid Chemistry", del 2, utgivere L.B. Townsend og R.S. Tipson, J. Wiley and Sons, New York, 895-900 (1978) og de deri angitte referanser; R. Duschinsky i "Nucleic Acid Chemistry", del 1, utgivere L.B. Townsend og R.S. Tipson, J. Wiley and Sons, New York, 43-46 (1978) og de deri angitte referanser). Fluoreringsmidlet kan for eksempel være trimetylhypofluoritt i fluortriklormetan.

Når det gjelder trinn (iii) kan forbindelsen med formel C behandlet med 1,2,4-triazol sammen med 4-klorfenyldiklor-fosfat for derved å danne den tilsvarende 4-(1,2,4-tri-azoylyl)forbindelse som så omdannes til den ønskede 4—amino-(cytidin )forbindelse ved omsetning med for eksempel metanol. Utgangsmaterialene for formlene B og C kan fremstilles for eksempel ved omsetning av en egnet, eventuelt beskyttet, base med en forbindelse med formel A analogt det som er beskrevet i trinn (i). 5-fluoracil og 5-fluorcytosin er kommersielt tilgjengelige fra Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI 53233,

USA.

Oppløsningen av (± )-enantiomerene kan gjennomføres som angitt i detalj i del III nedenfor.

FTC kan omdannes til en farmasøytisk akseptabel ester ved omsetning med et egnet forestringsmiddel, for eksempel et syrehalogenid eller —anhydrid. FTC eller dets farmasøytisk akseptable derivat kan omdannes til et farmasøytisk akseptabelt salt derav på konvensjonell måte, for eksempel ved behandling med en egnet base. Esteren eller saltet av FTC kan omdannes til FTC, for eksempel ved hydrolyse.

I. Aktiv forbindelse og fysiologisk akseptable derivater og

salter derav.

Den antiviralt aktive forbindelse som har beskrives er 2—hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl)-l,3-oksatiolan (se figur 1) i racemisk form eller som en isolert enantiomer.

Den aktive forbindelse kan administreres som et hvilket som helst derivat som ved administrering til mottageren er i stand til direkte eller indirekte å gi den ønskede FTC-forbindelse, eller som viser aktiviteten selv. Ikke-begrensende eksempler er de farmasøytisk akseptable salter, også kalt fysiologisk akseptable salter, og 5'- og N^-acylerte eller —alkylerte derivater av den aktive forbindelse, alternativt også kalt fysiologisk eller farmasøytisk aktive derivater. I en utførelsesform er acylgruppen en karboksyl-syreester hvori ikke-karbonyldelen i estergruppen er valgt blant rett, forgrenet eller cyklisk alkyl, alkoksyalkyl inkludert metoksymetyl, aralkyl inkludert benzyl, aryloksy-alkyl som fenoksymetyl, aryl inkludert fenyl, eventuelt substituert med halogen, C^^-alkyl eller C^^-alkoksy, sulfonatestere som alkyl- eller aralkylsulfonyl inkludert metansulfonyl, mono-, di- eller trifosfatestere, trityl eller monometoksytrityl, substituert benzyl, trialkylsilyl som dimetyl-t-butylsilyl, eller difenylmetylsilyl. Arylgruppene i estrene omfatter eventuelt en fenylgruppe. Alkylgruppen kan være rett, forgrenet eller cyklisk og er optimalt en C^_^g-gruppe.

Spesifikke eksempler på farmasøytisk akseptable derivater av FTC omfatter, men er ikke begrenset til:

der Ri og Rg uavhengig er valgt blant alkyl og acyl, fortrinnsvis men ikke begrenset til metyl, etyl, propyl, butyl, pentyl, heksyl, isopropyl, isobutyl, sek-butyl, t—butyl, isopentyl, amyl, t-pentyl, 3-metylbutyryl, hydrogen-succinat, 3-klorbenzoat, cyklopentyl, cykloheksyl, benzoyl, acetyl, pivaloyl, mesylat, propionyl, butyryl, valeryl, kapron-, kapryl-, kaprin-, laurin-, myristin-, palmitin-, stearin- og oljesyre, aminosyrer inkludert, men ikke begrenset til alanyl, valinyl, leucinyl, isoleucinyl, prolinyl, fenylalaninyl, tryptofanyl, metioninyl, glycinyl, serinyl, threoninyl, cysteinyl, tyrosinyl, asparaginyl,

glutaminyl, aspartoyl, glutaoyl, lysinyl, argininyl og histidinyl , og der en av R-l og R2kan være H.

FTC og dens derivater kan tilveiebringes i form av farmasøy-tisk akseptable salter. Som her brukt henviser uttrykket farmasøytisk akseptable salter eller komplekser til salter eller komplekser av FTC som beholder den ønskede biologiske aktivitet for opphavsforbindelsen og som viser minimal, hvis overhodet, uønsket toksikologisk virkning. Ikke-begrensende eksempler på slike salter er

(a) syreaddisjonssalter som dannes med uorganiske syrer som salt-, hydrobrom-, svovel-, fosfor- og salpetersyre og lignende, og salter som dannes med organiske syrer som eddik-, oksal-, vin-, rav-, malein-, askorbin-, benzo-, tannin-, pamoin-, alginin- og polyglutaminsyre, naftalen-sulfon- og naftalendisulfonsyrer og polygalakturonsyre; (b) baseaddisjonssalter dannet med polyvalente metallkationer som sink, kalsium, vismut, barium, magnesium, aluminium, kobber, kobolt, nikkel, kadmium, natrium, kalium og lignende eller med et organisk kation dannet av N,N-dibenzyletylendiamin, ammonium eller etylendiamin; eller (c) kombinasjoner av (a) og (b), for eksempel et sinktannat-salt eller lignende.

Modifikasjoner av den aktive forbindelse, spesielt i en N<4_>og 5'-O-posisjoner, kan påvirke biotilgjengeligheten og metabolismegraden for de aktive spesier og derved gi kontroll over avleveringen av de aktive spesier. Videre kan modifikasjoner påvirke den antivirale aktivitet for forbindelsen, i enkelte tilfeller kan aktiviteten økes utover den til opphavsforbindelsen. Dette kan lett påvises ved å fremstille derivatet og prøve dets antivirale aktivitet i henhold til de her beskrevne metoder, eller andre for fagmannen kjente metoder.

II. Fremstilling av de aktive forbindelser.

Den racemiske blanding av FTC kan fremstilles ifølge metoder som beskrevet i WO 91/11186, eller ved den metode som er beskrevet i eksempel 1. Generelt omfatter metoden å ozonisere enten en allyleter eller -ester med formelen CH2=CH-CH2-0R eller en dieter eller diester av 2-buten-l,3-diol med formelen ROCHg-CH^H-CHgOR, der R er en beskyttende gruppe, for eksempel en alkyl-, silyl- eller acylgruppe, for derved å danne et glykoaldehyd med formelen OHC-CHg-OR; tilsetning av tioglykolsyre til glykoaldehydet for å danne et lakton med formelen 2-(R-oksy)-metyl-5-okso-l,3-oksatiolan; å redusere laktonet til forskjellige forbindelser inneholdende en avspaltbar gruppe i 5-posisjon i oksatiolanringen; kobling av disse forbindelser med silylert 5-fluorcytosin i nærvær av SnCl4for å danne p<->isomeren av FTC og eventuelt å fjerne de beskyttende grupper.

Eksempel 1 Fremstilling av ( ± )- p- D, L- 2- hydroksymetyl- 5-( 5-fluorcytosin- l- yl)- l. 3- oksatiolan

En fremgangsmåte for fremstilling av den racemiske blanding av FTC er vist i figur 2 og beskrevet i detalj nedenfor.

Beskyttelse av 2- buten- l. 4- diol

I en tørr, 2-liters 3-halskoble ble, under inert atmosfære, 100 g (93,5 ml = 1,135 mol = 1,00 ekv.) 2-buten-l,4-diol og15g (ca. 0,2 ekv.) DMAP (4-dimetylaminopyridin) oppløst i 800 ml tørr pyridin og omrørt under avkjøling til 0°C. Butyrylklorid (260 ml = 2,2 ekv.) ble så tilsatt langsomt for å forhindre oppvarming og tillatt omrøring i en time. Reaksjonen ble stanset med en liten mengde isvann. Væsken ble dekantert av fra saltet og fordampet under vakuum. Det gjenværende salt ble oppløst i vann og den vandige oppløsning ble ekstrahert to ganger med etyleter. De kombinerte ytre sjikt ble vasket en gang med mettet CUSO4, to ganger med mettet NaHC03inneholdende Norit® og vakuumfi 1trert gjennom en Celite®-plugg.

Den konsentrerte reaksjonsblanding ble oppløst 1 eter og vasket ved å følge den samme prosedyre som ovenfor for saltoppløsningen. De kombinerte, organiske sjikt ble konsentrert ved rotasjonsfordamping og så anbragt under vakuum. Denne reaksjon er karakteristisk meget nær kvanti-tativ. Skalaen kan lett økes efter behov. Produktet, 1,4-dibutyryl-2-buten-l,4-diol, er en farveløs til lett gul, klar væske.

Ozonolyse av den beskyttede diol

1,4-dibutyryl-2-buten-l,4-diol (1,365 mol) ble oppløst i 4 1 tørr CHgClg i en tørr 5-liters 3-halskolbe utstyrt med et stort tørkerør og et åpent rør for innføring av gass. Røret er fortrinnsvis ikke et frittet gassboblingsrør som vil tilstoppes under eksponering til den konsentrerte oppløsning. Oppløsningen ble omrørt og avkjølt til —78°C mens inertgass ble boblet gjennom oppløsningen. Gassinnløpet ble tettet med en gang oppløsningen var tilstrekkelig avkjølt og kolben og røreapparaturen ble bragt til ozongeneratoren. Oksygen ble boblet gjennom den omrørte oppløsning i minst 30 minutter mens man opprettholdt isbadet. En Cryocool er ideell for å opprettholde den lave temperatur for denne heller lange reaksjon. Ozonet ble så innført under et trykk på 8 til 8,5 psi. Efter ferdig tilførsel ble ozonstrømmen stanset og oksygen boblet gjennom oppløsningen i ca. Vi time før 3 ekvivalenter MegS ble tilsatt. Kolben ble fjernet fra avkjølingsbadet og bragt til en hette der den ble omrørt i 2 dager for å bevirke fullstendig reduksjon. Oppløsningen ble fordampet og anbragt under vakuum i flere timer.

Denne reaksjon gir karakteristisk utbytter på 95$ beskyttet aldehyd (2-butyryloksyacetaldehyd), en farveløs til gul, klar væske.

Ringslutning av aldehydet med merkaptoeddiksyre

1,0 ekv. aldehyd ble oppløst i toluen for å gi en 0,80 til 0,85M oppløsning i en kolbe utstyrt med en felle av Dean Stark-typen. 1,1 ekv. tioglykolsyre ble tilsatt og blandingen oppvarmet til tilbakeløp. Vannet ble fjernet azeotropt via fellen. Reaksjonen ble fullført i løpet av 3 timer og ble tillatt avkjøling til romtemperatur. Den organiske oppløsning ble vasket to ganger med like volumer av NaHC03mettet vann og en gang med vann, tørket over MgS04og Norit®, og vakuumfiltrert gjennom Celite® før fordamping under vakuum. Den første NaHC03-vasking ble ekstrahert tilbake en gang med eter; eteren ble vasket en gang med vann, tørket over MgS04og Norit®, vakuumfiltrert gjennom Celite® og fordampet sammen med annet organisk materiale fra toluenoppløsningen. Det kombinerte materialet ble anbragt under vakuum over natten.

Denne reaksjon ga karakteristisk et 90 %-ig utbytte av 2—(butyryloksy )-metyl-5-okso-l,3-oksatiolan.

Reduksjon av lakton og omdanning til acetat

1,00 ekv. 2-butyryloksy-metyl-5-okso-l,3-oksatiolan ble oppløst i tørr THF for derved å oppnå en 0,23M oppløsning i en tørr 3-halskolbe utstyrt med mekanisk røreverk og holdt under en inert atmosfære. Oppløsningen ble omrørt og avkjølt til 0°C før 1,1 ekv. 1,0M Li(t-BuO)3A1H i THF ble tilsatt via en kanyle. Reduksjonen var ferdig i løpet av ca. 3 timer som antydet ved TLC ved bruk av et 2:1 eter:heksan-oppløsnings-middelsystem og anisaldehydflekk.

Ca. 10 ekvivalenter nydestillert AcgO ble så tilsatt og det hele ble omrørt i 2 dager for å gi det acetylerte produkt. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av mettet NaHC03, og så omrørt over natten. Oppløsningen ble så fordampet og omrørt med mer NaHC03~oppløsning over natten. Denne ble ekstrahert med eter som ble omhyggelig vasket to ganger med mettet NaHC03og en gang med vann, tørket over MgS04og Norit®, vakuumfiltrert gjennom Celite® og fordampet. Produktet er en mørkgul, klar væske. Gasskromatografi (initial T - 80°C; initialtid = 5 minutter; progresjonshastighet - 10 min./min.; slutt T = 240°C) indikerer karakteristisk en renhet på ca. 7056.

Silvlering av 5- fluorcytosin

5-fluorcytosin (1,05 ekv., beregnet på mengden acetylert laktol som ble oppnådd i det foregående trinn ved bruk av GC-indikasjonen på renhet) ble silylert ved tilbakeløp i minst 10 ekvivalenter heksametyldisilazan inneholdende en katalytisk mengde ren ammoniumsulfat (0,05 til 0,10 ekv.) i 2 timer efter at oppløsningen ble klar. Kolben ble så forseglet og oppløsningsmidlet fjernet ved bruk av en vakuumpumpe med hjelpefelle. Produktet, et hvitt faststoff, ble efterlatt under vakuum over natten inntil det var klart for bruk i de efterfølgende koblingsreaksjoner.

Kobling av silylert 5- fluorcytosin med acetylert laktol

Til silylert 5-fluorcytosin (33,86 g, 0,124 mol) i 350 ml tørr diklormetan ble det satt 135,6 ml SnC^-oppløsning i form av en 1-molar oppløsning i CHgClg, alt under en nitrogenatmosfære. Oppløsningen ble omrørt i 15 minutter ved romtemperatur. Denne oppløsning ble kanylert til oppløsningen av laktolacetat (38 g, 0,113 mol) i 400 ml diklormetan under nitrogenatmosfære i løpet av 30 minutter.

Reaksjonsoppløsningsmidlet ble omrørt i 2 timer ved hvilket punkt fullføringen av reaksjonen ble antydet ved hjelp av TLC. Reaksjonsoppløsningen ble så fortynnet med 500 ml diklormetan og avkjølt med ammoniumhydroksydoppløsning. 100 ml ammoniumhydroksydoppløsning ble langsomt tilsatt mens reaksjonstemperaturen ble holdt under 30°C, noe som resulterte i dannelsen av et hvitt precipitat.

Blandingen ble omrørt i ytterligere 30 minutter og så ført gjennom en silikagelpluggkolonne (17,5 cm diameter, 12,5 cm høyde). Det ble eluert sekvensielt med 2 1 diklormetan, 2 1 etylacetat og 4 1 etylacetat: etanol 9:1. Etylacetat- og etylacetat:etanol-eluentene inneholdt det ønskede produkt. Disse oppløsninger ble kombinert og fordampet under redusert trykk. Det gjenværende klebrige faststoff ble så vasket med 200 ml tørr eter og man oppnådde et hvitt faststoff, 25,35 g, 71*, efter FTC-5'-butyrat.

FTC-5'-butyrat (8,74 g, 0,026 mol) ble oppløst i 250 ml metanol. Natriummetoksyd (2,85 g, 0,052 mol) ble tilsatt ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 time da ferdig reaksjon ble bekreftet ved TLC. 10 ml Nl^Cl-oppløsning ble tilsatt for å stanse reaksjonen og derefter ble oppløs-ningsmidlet fjernet under redusert trykk. Resten ble absorbert på 5 g silikagel og ført gjennom en liten kolonne ved bruk av etylacetat:etanol 9:1 som elueringsmiddel. De produktholdige fraksjoner ble kombinert og fordampet og man oppnådde et klebrig faststoff som ble vasket med tørr eter hvorved man oppnådde et hvitt fast FTC (6,00 g, 88*).

<i>H-NMR: (DMSO-d<6>) 8,18 (1H, d, H6, J=8,4Hz), 7,81 & 7,57

(2H, bred, NH2), 6,12 (1H, dd, E1 > , J=5,7 & 4,2 Hz), 5,40 (1H, t, OH, J=5,7 Hz), 5,17 (1H, t, 1H4>, J = 3-6 Hz), 3,74 (2H, m, 2H5. ), 3,41 (1H, dd, 1H2., J=5,7 & 11,7 Hz), 3,11 (1H, dd, 1H2•, J=4,2 & 11,7 Hz);

<13>C-NMR: (DMSO-d<6>) 157,85 (d, J=13,4Hz), 153,28, 136,12

(d, J=241Hz), 126,01 (d, J=32,6Hz), 86,90, 86,84, 62,48, 37,07;

Smeltepunkt: 195-196°C

III. Oppløsning av nukleoside enantiomerer.

Det tilveiebringes en fremgangsmåte for oppløsning av racemiske blandinger av nukleoside enantiomerer, inkludert, men ikke begrenset til ( + )- og (- )-enantiomerene av FTC. Fremgangsmåten kan også benyttes for å oppløse racemiske blandinger av karbohydrater eller karbohydrat1ignende geler som derivater av 1,3-oksatiolan og 1,3-dioksolan. Fremgangsmåten omfatter bruken av et enzym som preferensielt katalyserer en reaksjon av en enantiomer i en racemisk blanding. Den omsatte enantiomer separeres fra den ikke-omsatte enantiomer på basis av de nye forskjeller i fysisk struktur. Basert på den her gitte beskrivelse vil fagmannen kunne velge et enzym som er selektivt for den angjeldende nukleosid-enantiomere (eller selektiv for den ikke-ønskede enantiomer som en metode for å eliminere denne), ved å selektere et av de nedenfor beskrevne enzymer eller ved systematisk bedøm-melse av andre kjente enzymer. Basert på denne beskrivelse vil fagmannen også vite hvordan han skal modifisere sub-stratet efter behov for å nå den ønskede oppløsning. Ved bruk av enten chiral-NMR-skiftreagenser, polarimetri eller chiral HPLC, kan den optiske anrikning av den gjenvunne ester, bestemmes.

De følgende eksempler skal videre illustrere bruken av enzymer for å oppløse racemiske blandinger av enantiomerer. Andre kjente metoder for oppløsning av racemiske blandinger kan benyttes i kombinasjon med den her beskrevne oppløsnings-metode. Alle disse modifikasjoner ansees å ligge innenfor oppfinnelsens ramme.

Oppløsning basert på hydrolyse av C5'-nukleosidestere.

I en utførelsesform omfatter metoden omsetning av C5'-hydroksylgruppen i en blanding av nukleoside racemater med en acylforbindelse for derved å oppnå C5'-estrene hvori nukleosidet ligger i "karbinol"-enden av esteren. Den racemiske blanding av nukleosid C5'-estere behandles så med et enzym som preferensielt spalter ellerhydrolyserer, en av enantiomerene og ikke den andre, i et gitt tidsrom.

En fordel ved denne metode er at den kan benyttes for å oppløse et vidt spektrum av nukleosider inkludert pyrimidin-og purinnukleosider som eventuelt er substituert i karbohydratdelen eller basedelen. Fremgangsmåten kan også benyttes for å oppløse nukleosidderivatet som inneholder ytterligere heteroatomer i karbohydratdelen, for eksempel FTC og BCH-189. Den brede anvendelighet av denne metode ligger delvis i det faktum at selv om karbinoldelen av esteren spiller en rolle for enzymets evne til å differensiere enantiomerer, ligger hovederkjennelsessetet for disse enzymer i karboksylsyredelen av esteren. Videre kan man være i stand til med hell å ekstrapolere resultatene av et enzym/substrat-studium til et annet, tilsynelatende forskjellig system, forutsatt at karboksylsyredelen av de to substrater er den samme eller i det vesentlige tilsvarende.

En annen fordel ved denne metode er at den er regioselektiv. Enzymer som hydrolyserer estere katalyserer karakteristisk ikke andre reaksjoner i andre deler av molekylet. For eksempel katalyserer enzymet lipase hydrolyse av esteren av 2—hydroksymetyl-5-okso-l,3-oksatiolan uten samtidig å hydro-lysere det indre lakton. Dette står i sterk kontrast til "kjemiske" tilnærmelser til esterhydrolyse.

Ytterligere en fordel ved denne metode er at separeringen av den ikke-hydrolyserte enantiomer og den hydrolyserte enantiomer fra reaksjonsblandingen er heller enkel. Den ikke-hydrolyserte enantiomer er mer lipofil enn den hydrolyserte enantiomer og kan effektivt gjenvinnes ved enkel ekstrahering med en av et antall ikke-polare, organiske oppløsningsmidler eller blandinger derav inkludert heksan og heksan/eter. Jo mindre lipofilitet, jo mere polar hydrolysert enantiomer kan oppnås ved ekstrahering med et mer polart, organisk oppløs- ningsmiddel, for eksempel etylacetat, eller ved lyoflll-sering, fulgt av ekstrahering med etanol eller metanol. Alkohol bør unngås under hydrolysen fordi alkohol under visse betingelser kan denaturere enzymer.

Enzymer og substrater

Med egnet tilpasning av enzym og substrat kan man opprette betingelser for isolering av hver nukleosid enantiomer. Den ønskede enantiomer kan isoleres ved behandling av den racemiske blanding med et enzym som hydrolyserer den ønskede enantiomer (fulgt av ekstrahering av det polare hydrolysat med et polart oppløsningsmiddel) eller ved behandling med et enzym som hydrolyserer den uønskede enantiomer (fulgt av fjerning av den uønskede enantiomer med et ikke-polart oppløsningsmiddel).

Enzymer som katalyserer hydrolysen av estere omfatter esteraser som griselever-esterase, lipaser inkludert porcin pankreatisk lipase og Amano PS-800®-lipase, substillisin og a-chymotrypsin.

Figur 3 er et flytdiagram over spesifisiteten for alkalisk fosfatase og slangegift-fosfodiesterase for (+)- og (-)-enantiomerene av FTC. Som antydet hydrolyserer alkalisk fosfatase trifosfatet i begge enantiomerer til FTC og er derfor ikke brukbar som separeringsmiddel. Fosfodiesterase 1 hydrolyserer preferensielt (+)-isomeren av FTC til dens monoester som så kan utsettes for 5'-nukleotidase for derved å oppnå (+)-FTC.

Den mest effektive acylgruppe for bruk ved forestring av C5'-posisjonen i nukleosidet kan bestemmes uten for mye ekspe-rimentering ved å bedømme et antall homologer og ved bruk av det selekterte enzymsystem. Når for eksempel 1,3-oksatiolan-nukleosider forestres med smørsyre, skjer oppløsninger mer både griselever-esterase og Amano PS-800® med høy enantio-selektivitet (94-100* enantiomeroverskudd) og motsatt selektivitet. Griselever-esterase hydrolyserer preferensielt (+)-enantiomeren av FTC og Amano PS-800® hydrolyserer preferensialt (- )-enantiomeren av FTC. Prosentandelen enantiomeroverskudd som angis i tabell 1 er den mengde renset butyratester som er tilbake i den enzymbehandlede blanding (det vil si butyratesteren av (-)-FTC når det gjelder PLE og butyratesteren av (+)-FTC når det gjelder Amano PS-800®).

Ikke-begrensende eksempler på acylgrupper som kan bedømmes for anvendelse med en spesiell nukleosid-enantiomerblanding og spesielt enzym er alkylkarboksylsyrer og substituerte alkylkarboksylsyrer inkludert eddik-, propion-, smør- og pentansyre. Med visse enzymer kan det være foretrukket å benytte en acylforbindelse som er sterkt elektrontiltrekkende for å lette hydrolyse ved svekking av esterbindingen. Eksempler på slike elektrontiltrekkende grupper er a—halogen-estere som 2-klorpropion-, 2-klorsmør- og 2—klorpentansyre. a-halogenestere er utmerkede substrater for lipaser.

OppløsningsbetingeIser

De enzymatiske hydrolyser gjennomføres karakteristisk med en katalytisk mengde av enzymet i en vandig buffer som har en pH-verdi som er nær den optimale pH-verdi for det angjeldende enzym. Efter hvert som reaksjonen skrider frem, synker pH-verdien som et resultat av frigjort karboksylsyre. Vandig base bør tilsettes for å holde pH-verdien nær den optimale verdi for enzymet. Forløpet av reaksjonen kan lett bestemmes ved å overvåke pH-endringen og mengden base som er nødvendig for å opprettholde pH-verdien. Den hydrofobe ester (den ikke-hydrolyserte enantiomer) og den mer polare alkohol (den hydrolyserte enantiomer) kan sekvensielt og selektivt ekstraheres fra oppløsningen ved valget av organiske oppløsningsmidler. Alternativt kan materialet som skal oppløses, separeres gjennom en kolonne som inneholder enzymet, immobilisert på en fast bærer.

Enzymatiske hydrolyser som gjennomføres under heterogene tilstander kan lide under dårlig reproduserbarhet. Det er derfor foretrukket at hydrolysen gjennomføres under homogene betingelser. Alkoholoppløsningsmidler er ikke foretrukket fordi disse kan denaturere enzymene. Homogeniteten kan oppnås ved bruk av ikke-ioniske overflateaktive midler som Triton X-100. Imidlertid understøtter tilsetning av disse overflateaktive midler ikke bare oppløsningen av utgangs-.materialet, de øker også produktets vandige oppløselighet. Selv om derfor den enzymatiske reaksjon kan forløpe mer effektivt ved tilsetning av et ikke-ionisk overflateaktivt middel enn under heterogene betingelser, kan isoleringen av både gjenvunnet utgangsmateriale og produkt være vanske-ligere. Produktet kan isoleres ved egnede kromatografiske og kjemiske (for eksempel selektiv saltdannelse) teknikker. Diacylerte nukleosider kan benyttes, men er ofte svært lipofile og vanskelig å oppløse i det benyttede medium.

Eksempel 2 Enantioselektiv 1ipase- katalysert hydrolyse av

FTC- estere

Et antall 5'-O-acylderivater av FTC ble fremstilt ved selektiv O-acylering av N-hydrokloridsaltet (se tabell 1 og figur 4) av (±)-FTC. Effektiviteten for hydrolysen av derivatene med lipaser ble undersøkt. Som vist i tabell 1, viste griselever-esterase, PLE, et høyt selektivitetsnivå for hydrolyse av esteren av (+)-enantiomeren av FTC og efterlot hovedsakelig butyratet av (-)-FTC i den HPLC-analyserte blanding. I motsetning til dette hydrolyserer PS-800 esteren av (-)-enantiomeren av FTC på preferensiell måte og efterlater hovedsakelig butyratet av (+)-FTC i den HPLC-analyserte blanding. Graden av hydrolyse ble også funnet å avhenge av arten av acylgruppen; acetylderivatet var signifikant langsommere enn butyrylderivatet. Det er nu oppdaget at hydrolysehastigheten for propionsyreesteren av FTC er ennå hurtigere enn den som ble observert for butyratderivatet. Prosentual gjenvinning og prosentandelen enantiomert overskudd ble begge deler bestemt ved bruk av HPLC. Selv om enantioselektiviteten er utmerket når man benytter PLE (karakteristisk 97* eller høyere), kan ytterligere anrikning oppnås ved sekvensielle, enzymatiske hydrolysereaksjoner hvori det enantiomert, anrikede butyrat fra en PLE-katalysert hydrolyse underkastes enzymatisk hydrolyse med PS-800.

Eksempel 3 Prosedyre for fremstilling av (+)- og (-)- FTC

via enantioselektiv, lipase- katalysert hydrolyse

av FTC- butyrat

5'-O-butyratet av (±)-FTC (0,47 mmol, 149 mg) ble oppløst i 16 ml av en oppløsning av 4:1 pH 8 buffer: CH3CN. Den klare oppløsning ble omrørt og behandlet med 26 mg griselever-esterase (PLE-A). Forløpet av reaksjonen ble overvåket ved hPLC (figur 4). Efter 20 timer (52* omdanning) ble reaksjonsblandingen ekstrahert med 2 x 80 ml CHCI3og 80 ml etylacetat. De organiske ekstrakter ble kombinert, tørket over vannfri MgS04, filtrert og konsentrert ved rotasjonsfordamping. Den dannede rest ble eluert på 2 x 1000 m pTLC-plater ved bruk av etylacetat som elueringsmiddel (dobbelt-eluering), noe som, efter isolering, ga 53 mg (36* beregnet

på utgangsmaterialet) FTC-butyrat som ble fastslått å ha 98* enantiomert overskudd (EO) ved HPLC-analyse. Det enantiomer-anrikede butyrat ble så behandlet med 1,6 ml metanol fulgt av 0,38 mmol (20 mg) natriummetoksyd. Den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur og reaksjonsforløpet ble overvåket ved HPLC. Reaksjonen var ferdig i løpet av 30 minutter. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved rotasjonsfordamping og man oppnådde 76 mg av et urent, hvitt faststoff som ble eluert på en 1000 m pTLC ved bruk av 5:1 etylacetat: etanol. (-)-FTC ble isolert som et hvitt faststoff (33 mg, 82* utbytte). HPLC-analyse av FTC som 5'-O-acetatderivat viste 97* EO.

[a]<2>£ -120,5° (c = 0,88; absolutt etanol).

Emulsjoner i opparbeidingstrinnet kan unngås ved tilsetning av HCCI3til reaksjonsblandingen når den ferdig (som også tjener til å denaturere enzymet), stripping av oppløsnings-midlene under vakuum og efterfølgende ekstrahering med HCCI3.

På samme måte ble 1,2 mmol (375 mg) 5 \-0-butyrat av (±)-FTC oppløst i 40 ml 4:1 pH 8 buffer: CH3CN. Den klare oppløsning ble omrørt og behandlet med 58 mg griselever-esterase (PLE—A). Forløpet av reaksjonen ble overvåket ved HPLC. Efter 90 minutter (38* omdanning) ble reaksjonsblandingen tilsatt til 150 ml CHCI3. Sjiktene ble separert og det vandige sjikt lyofilisert for å fjerne oppløsningsmiddel. Den hvite rest fra lyofiliseringen ble ekstrahert med 3 x 10 ml absolutt etanol. Ekstraktene ble filtrert, kombinert og konsentrert under vakuum og man oppnådde 179 mg uren olje. Det urene materialet ble eluert på en 45 x 30 mm si 1 ikagelkolonne ved bruk av 3 x 75 ml etylacetat, fulgt av 5:1 etylacetat:etanol.

( + )-FTC ble isolert som et hvitt faststoff (109 mg; 37*, beregnet på utgangsbutyratet). HPLC-analyse av ( + )-FTC og 5'-O-acetatderivatet viste 97,4* EO.

[a]<g>° +113,4° (c = 2,53; absolutt etanol).

En tilsvarende reaksjon ble gjennomført ved bruk av 0,12 mmol eller 37 mg 5'-0-butyratet av FTC og 7 mg PS-800® i 4,0 ml 4:1 pH 8 buffer:CH3CN. Reaksjonen var betydelig langsommere enn med PLE-A og krevet 74 timer for 59* omdanning. Det gjenvunne butyrat (11,4 mg, 31* av den opprinnelige mengde) ble funnet å gi 94* enantiomert overskudd, ved HPLC.

Oppløsning av nukleoside enantiomerer med cytidin-deoksycytidin deaminase.

I en alternativ utførelsesform benyttes cytidin-deoksycytidin aminase for å oppløse racemiske blandinger av 2-hydroksymetyl-5-(cytosin-l-yl)-l,3-oksatiolan og dens derivater inkludert 2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl )-l,3-oksatiolan. Enzymet katalyserer deamineringen av cytosindelen til et uracil. Det er oppdaget at en av enantiomerene av 1,3-oksatiolan-nukleosidene er et foretrukket substrat for cytidin-deoksycytidin-deaminase. Enantiomeren som ikke omdannes til et uracilderivat (og som derfor fremdeles er basisk), ekstraheres fra oppløsningen med en sur oppløsning. Man må passe å unngå sterkt sure oppløsninger (pH under 3,0) som kan spalte oksatiolanringen.

Cytidin-deoksycytidin-deaminase kan isoleres fra rottelever eller humanlever, eller uttrykkes fra rekombinante sekvenser i et prokaryotisk system som i E. coli.

Fremgangsmåten for oppløsning av cytidin-nukleosid enantiomerer ved bruk av cytidin-deoksycytidin-deaminase kan benyttes som den eneste metode for oppløsning eller kan benyttes i kombinasjon med andre oppløsningsmetoder inkludert oppløsning ved enzymatisk hydrolyse av 5'-O-nukleosidestere som beskrevet ovenfor.

Kombinasjon av enzymatisk oppløsning med klassiske oppløs-ningsmetoder.

Den ovenfor beskrevne fremgangsmåte for oppløsning av racemiske blandinger av nukleosidenantiomerer kan kombineres med andre klassiske metoder for enantiomeroppløsning for å øke den optiske renhet i sluttproduktet.

Klassiske metoder for oppløsning inkluderer et antall fysikalske og kjemiske teknikker. Ofte er den enkleste og mest effektive teknikk en vanlig omkrystallisering, basert på det prinsipp at racemater ofte er mer oppløselige enn de tilsvarende individuelle enantiomerer. Omkrystallisering kan gjennomføres i et hvilket som helst trinn inkludert på de acylerte forbindelser eller de endelige enantiomere produkter. Hvis vellykket representerer en enkel utførelses-form den foretrukne metode.

Når omkrystalliseringen ikke gir det ønskede materialet med aksepterbar optisk renhet, kan man ta andre metoder i betraktning. Hvis nukleosidet er basisk (for eksempel et cytidin), kan man benytte chiralsyrer som danner diastereo-mere blandinger som kan ha signifikant forskjellige oppløse-1ighetsegenskaper. Ikke-begrensende eksempler på chirale syrer er malin-, mandel-, dibenzoylvin-, 3-bromkamfer-8-sulfon-, 10-kamfersulfon- og di-p-toluoylvinsyre. På tilsvarende måte resulterer acylering av den frie hydroksyl-gruppe med et chiralsyrederivat også i dannelsen av dia-stereomere blandinger hvis fysikalske egenskaper kan være tilstrekkelig forskjellige til å tillate separering.

Små mengder enantiomer-anrikede nukleosider kan oppnås eller renses ved å føre den racemiske blanding gjennom en HPLC-kolonne som er konstruert for chiral separering inkludert cyklodekstrin-bundne kolonner som markedsført av Rainin Corporation.

Eksempel 4 Separering av racemiske blandinger av nukleosider ved HPLC

Oppløsningene av C4'-enantiomerene av (±)-FTC ble gjennomført ved bruk av en chiral cyklodekstrin-bundet (cyclobond AC-I) kolonne fra Rainin Corporation (Woburn, MA). Betingelsene var som følger: Isokratisk 0,5* metanol i vann; strømnings-hastighet 1 ml/min., UV-detektering ved 262 nm. Metanol av HPLC-kvalitet ble oppnådd fra J.T. Baker (Phillipsburg, NJ). De racemiske blandinger ble injisert og fraksjoner ble samlet. Fraksjoner inneholdende hver av enantiomerene ble slått sammen, dypfryst og så lyofilisert. Forbindelsene blekarakterisert vedUV-spektroskopi og ved deres HPLC-retensjonstider. Generelt har (- )-enantiomerene lavere retensjonstider enn (+)-enantiomerene, sel "J. Liquid Chromatography", 7:353-376, 1984. Konsentrasjonene av forbindelsene ble bestemt ved UV-spektroskopi ved bruk av en forrådsoppløsning med en kjent konsentrasjon på 15 pM, fremstilt i vann for biologisk bedømmelse. Retensjonstidene for de separerte enantiomerer er angitt i tabell 2.

Eksempel 5 Alternative metoder for separering av FTC-enantiomerer ved bruk av en chiral kolonne

Ved bruk av en Cyclobond I-AC-kolonne (5 pm, 25 cm x 4,6 mm, Rainin Corporation, Woburn, MA, katalog nr. AST-41049), med en strømningshastighet på 0,6 ml/min. av 0,5* isokratisk metanol (Fisher Scientific, Inc., HPLC-kvalitet, katalog nr. A-452-4 i vann), og UV-detektering ved 262 nm, viste FTC-enantiomerenes retensjonstider på 12,68 minutter ((-)-FTC) hennoldsvis 13,20 minutter (+)-FTC).

Ved bruk av Chiralpak AS-kolonne (10 pm, 25 cm x 4,6 mm, J.T. Baker Inc., Phillisburg, NJ, katalog nr. 7406-00, serienr. 09-29-10320) med en strømningshastighet på 0,8 ml/min. isopropylalkohol (HPLC-kvalitet, Fisher Scientific, Inc., katalog nr. A-451-4) og UV-detektering ved 262 nm, viste FTC-enantiomernes retensjonstider på 5,9 minutter ((-)-FTC) henholdsvis 9,8 minutter ((+)-FTC). IV. Evnen til 2-hydroksymetyl-5-( 5-f luorcytosin-l-yl )-l ,3-oksatlolan ("FTC") til å inhibere replikering av HIV.

Det er ofte ønskelig å bedømme et antall racemiske blandinger av nukleosider som et preliminært trinn for å bestemme hvilken som gir ytterligere oppløsning til enantiomert anrikede komponenter og ytterligere evaluering av antiviral aktivitet. Nukleosidenes evne til å inhibere HIV kan måles ved forskjellige eksperimentelle teknikker. Den her benyttede teknikk, beskrevet i detalj nedenfor, måler inhiberingen av viralreplikering i fytohemagglutinin (PHA) stimulert human perifere blodmononukleære (PBM) celler som er infisert med HIV-1 (stamme LAV). Mengden virus som produseres bestemmes ved å måle det viruskodede reverstranskriptase-enzym. Mengden enzym som produseres er proporsjonal med mengden virus som produseres. Tabell 3 gir EC5Q-verdiene (den konsentrasjon av nukleosid som inhiberer replikeringen av viruset med 50* i PBM-celler med en 10* anslått feilfaktor) og ICsg-verdiene (konsentrasjonen av nukleosider som inhiberer 50* av veksten av mitogenstimulerte, ikke-infiserte human-PBM-celler ) for et antall (±)-l,3-oksatiolan og nukleosider.

Eksempel 6 Anti- HIV- aktivitet for ( ± )- l. 3- oksatiolan-nukleosider

A. 3 dager gamle fytohemagglutininstimulerte PBM-celler (IO<6>

celler/ml) fra hepatitt B- og HIV-l-seronegative sunne donorer ble infisert med HIV-1 (stamme LAV) ved en konsentrasjon på ca. 100 ganger den 50 *-ige vevkultur-infektiøse dose (TICD 50) pr. ml og dyrket i nærvær og

fravær av forskjellige konsentrasjoner av antivirale forbindelser.

B. Ca. en time efter infeksjon, ble mediet med forbindelsen som skal prøves (2 ganger den endelige konsentrasjon i mediet) og uten forbindelse, tilsatt til kolbene (5 ml;

sluttvolum 10 ml). AZT ble benyttet som positiv kontroll.

C. Cellene ble eksponert til viruset (ca. 2 x IO<5>dpm/ml, bestemt ved revers transkriptaseanalyse) og så anbragt i

en COg-inkubator. HIV-1 (stamme LAV) ble oppnådd fra "Center for Disease Control", Atlanta, Georgia. Metodene som ble benyttet for å dyrke PBM-cellene, høste virusene og bestemmelse av revers transkriptase-aktiviteten var som beskrevet av McDougal et al. i "J. Immun. Meth.", 76, 171-183, 1985 og av Spira et al. i "J. Clin. Meth.", 25, 97-99, 1987, bortsett fra at fungizoner ikke var inkludert i mediet, se Schinazi et al. i "Antimicrob. Agents Chemother." 32, 1784-1787 (1988); id., 34:1061-1067 (1990). D. På dag 6 ble cellene og supernatant overført til et 15 ml rør og sentrifugert ved ca. 900 x g i 10 minutter. 5 ml supernatant ble fjernet og virusene ble konsentrert ved sentrifugering ved 40 000 omdr./min. i 30 minutter (Beckman 70,1 Ti-rotor). Den oppløseliggjorte virus-pellett ble behandlet for bestemmelse av nivåene av revers transkriptase. Resultatene er uttrykt i dpm/ml prøvet supernatant. Virus fra mindre volumer supernatant, for eksempel 1 ml, kan også konsentreres ved sentrifugering før oppløseliggjøring og bestemmelse av revers transkriptase-nivåene.

Den midlere effektive (EC50) konsentrasjon ble bestemt ved medianeffektmetoden ("Antimicrob. Agents Chemother.", 30, 491-498 (1986)). Kort sagt blir den prosentuale inhibering av virus, bestemt fra målinger av revers transkriptase, plottet mot forbindelsens mikromolare konsentrasjon. EC5Q-verdien er konsentrasjonen av forbindelsen ved hvilken det er en 50 #-ig inhibering av viral vekst.

E. Mitogenstimulerte, ikke-infiserte human-PBM-celler (3,8 x IO<5>celler/ml) ble dyrket i nærvær og ved fravær av medikament under tilsvarende betingelser som de som ble benyttet for den antivirale analyse som beskrevet ovenfor. Cellene ble tellet efter 6 dager ved bruk av et hemacytometer og trypanblå ekskluderingsmetoden slik den beskrives av Schinazi et al i "Antimicrobial Agents and Chemotherapy", 22(3), 499 (1982). IC50er den konsentrasjon av forbindelsen som inhiberer 50 % av den normale cellevekst.

Som antydet generelt i tabell 3 er de substituerte cytosin-1,3-oksatiolan-nukleosider mer aktive enn de tilsvarende uracilnukleosider. Feilen i EC50- og IC^Q-målingene er anslått til ± 10%.

En av forbindelsene, (±)-FTC (kalt "DLS-022", forbindelse 8) viser ikke bare eksepsjonell aktivitet (ca. 10 nM i PBM-celler), men også en heller lav toksisitet (>100 pM i PBM-, Vero- og CEM-celler).

IC5ø-verdien for (±)-FTC var over 100 pM, noe som antydet at forbindelsen ikke var toksisk i ikke-infiserte PBM-celler bedømt opp til 100 jjM.

Eksempel 7 Antiviral- aktivitet av enantiomerer av HPLC-oppløst FTC.

Enantiomerene av FTC ble isolert ved fremgangsmåten ifølge eksempel 4 og den antivirale aktivitet bedømt ved metoden ifølge eksempel 6. Resultatene er gitt i tabell 4 og illustrert i figur 5.

Som antydet i tabell 4 synes (- )-enantiomeren av FTC i dette forsøk å være omtrent en størrelsesorden mer potent enn (+)-FTC-enantiomeren og har omtrent den samme anti-HIV-aktivitet som den racemiske blanding. Hverken enantiomerene eller den racemiske blanding er toksisk opp til 100 pM, målt ved trypanblå-ekskluderingsmetoden i human PBM-celler.

Eksempel 8 Antiviral aktivitet av FTC- enantiomerer. oppløst

ved fremgangsmåten ifølge eksempel 3

Enantiomerene av (±)-FTC ble også oppløst ved metoden ifølge eksempel 3 og den antivirale aktivitet bedømt ved metoden ifølge eksempel 6. Resultatene er vist i figur 6. Som antydet i figur 6 var E,Cg0-verdien for den racemiske blanding av FTC 0,017 pM, ED50-verdien for (-)-FTC var 0,0077 pM og EC50<->verdien for (+)-FTC var 0,84 pM.

Eksempel 9 Opptak av ( ±)- FTC i human PBM- celler

Det ble gjennomført studier ved bruk av radiomerket FTC for å følge de intracellulære profiler av stammedikamentet og metabolitter detektert i cellen. Alle studier ble gjennomført i duplikat. Humanperifere blodmononukleære celler, PBM-celler, ble suspendert i RPMI 1640-medium inneholdende 10* fetalt kalveserum og antibiotika (2 x IO<6>celler/ml, 10 ml pr. tidspunkt) og inkubert under tilsetning av 10 pM FTC (spesifikk aktivitet ca. 700 dpm/pmol). Cellene ble eksponert til medikamentet i 2, 6, 12 og 24 timer. På disse tidspunkter ble mediet fjernet og cellene vasket to ganger med kold Hanks balanserte saltoppløsning. Ekstraher ingen ble gjennomført under tilsetning av 0,2 ml 60* kold metanol/vann og lagret over natten ved -70°C. Den følgende morgen ble suspensjonene sentrifugert og ekstraher ingen ble gjentatt to ganger i en Vi time ved —70°C. De totale supernatanter, 0,6 ml, ble lyofilisert til tørr tilstand. Restene ble resuspendert i 250 pl vann og like mengder mellom 50 og 100 pl ble analysert ved HPLC. Kvantitering av intracellulært stammedikament og metabolitiske derivater ble gjennomført ved HPLC. På grunn av den potensielt sure labilitet for visse forbindelser, ble det benyttet et buffersystem nær fysiologisk pH-verdi for separering av metabolittene.

Figur 7 er et diagram over nærværet (opptak) av tritiert FTC i human-PBM-celler (gjennomsnitt av to bestemmelser) over tid (timer) mot pmol/10<6>celler. Opptaksstudiene antyder at radiomerket FTC lett tas opp i humanlymfocytter som produ-serer meget store mengder av 5'-trifosfatderivatet av FTC.

Eksempel 10 Antiretroviral aktivitet av FTC i forskjellige

cel lei in. i er

Den antiretrovirale aktivitet av FTC ble målt i et antall cellelinjer ved bruk av prosedyrer som tilsvarer, men som ikke er identiske med de som er angitt i eksempel 6. Cellelinjene ble oppnådd fra enten humandonorer, "AIDS Research and Reference Reagent Program", NIH, Rockville, Maryland, ATCC, eller Røde Kors. De CEM-thymidinkinase-defekte celler ble preparert ved sekvensiell føring av CEM-celler i nærvær av 5-brom-2'-deoksyuridin. Resultatene er gitt i tabell 5.

Eksempel 11 Egress av ( ±)- FTC fra human- PBM- celler

Studier ble gjennomført ved bruk av radiomerket FTC for å følge de intracellulære profiler av stammedikamentet og metabolittene som detekteres i cellen efter inkubering i media med medikament i 24 timer og så fjerning av medikamentet. Dette studiet måler den tid som trenges for at intracellulære nivåer av trifosfater skal synke. Studiene ble gjennomført i duplikat. Ikke-infiserte celler (2 x IO<6>ml) ble suspendert i det egnede medium, supplert med serum (10 ml pr. tidspunkt) og inkubert ved 37 °C i en 5* COg-inkubator. Den radiomerkede FTC-konsentrasjon var 100 pM. Efter pulsing av cellene med den merkede forbindelse i 24 timer,'ble cellene grundig vasket og så supplert med fritt medium uten de antivirale medikamenter (tid 0). Ved 0, 2, 4, 6, 12, 24 og 48 timer (andre inkuberingstid) ble cellene fjernet og umiddelbart ekstrahert med 60* kold metanol:vann. Ekstrakten ble oppnådd ved sentrifugering og fjerning av cellepelletten. Ekstraktene ble lyofilisert og så lagret ved —70°C. Før analyse ble materialet resuspendert i 250 ul HPLC-buffer og analysert umiddelbart. Kvantitering av intracellulært stammedikament og metabolske derivater ble gjennomført ved HPLC ved bruk av enten et Micromeritics- eller Hewlett-Packard modell 1090 PHLC-system med en anionbytte Partisil 10 SAX-kolonne (Whatman, Inc.) ved en strømningshastighet på 1 ml/min., 1 kpsi trykk og med UV-detektering ved 262 nm. Den mobile fase bestod av deionisert vann (A), 2 mM NaH2P04/16 nM NaOAc (pH = 6,6) (B), 15 mM NaH2P04/120,2 mM NaOAc (pH=6,6) (C), og 100 mM NaH2P04/800 mM NaOAc (pH = 6,6) (D). Separeringsmetode: Isokratisk for 5 minutter med A, fulgt av en 15 minutters lineær gradient til 100* B, fulgt av en 20 minutters lineær gradient til 100* C, fulgt av 10 minutter lineær gradient til 100* D, fulgt av 30 minutter isokratisk med 100* D.

Figur 8 er et diagram over egressen av radiomerket (±)-FTC fra human-PBM-celler, målt i timer efter medikamentfjerning mot konsentrasjonen (pmol/10<6>celler). Som antydet i figuren har FTC-trifosfat en intracellulær halveringstid på ca. 12 timer og kan lett detekteres intracellulært ved konsentrasjoner på 1-5 jjM, 48 timer efter fjerning av det ekstracellulære medikament, noe som er godt over ECgg-verdien for forbindelsen. Videre er affiniteten, K1 , for (±)-FTC- trifosfat ved bruk av HIV RT 0, 2 uM, noe som er under 48 timers konsentrasjonsnivået.

Eksempel 12 Anti- HIV- aktivitet for farmasøytisk akseptable

derivater av ( ±)- FTC

a. Et antall farmasøytisk akseptable derivater av (±)-FTC,

fremstilt ved derivatisering av 5'- og N<4->posisjonen, ble bedømt på anti-HIV-aktivitet i PBM-celler ved bruk av en prosedyre tilsvarende den som er beskrevet i eksempel 6. Resultatene er som følger. 5'-O-butyratesteren av (±)-FTC viste en ECgø-verdi på 0,0017. N<4->acetylderivatet av (±)-FTC viste en EC50-verdi på 0,0028. 5'-0-butyrat, N<4->esteren av (±)-FTC viste en EC50-verdi på 0,0058.

b. Anti-HIV-aktiviteten for 5'-O-butyratesteren av (+)-FTC i MT4-systemet (EC50) var 0,04 jjM . I den samme analyse viste det ikke-acylerte (±)-FTC en IC^Q-verdi på 0,52 jjM.

•IC50"verdien f°r ÅZT 1 dette system var 0,09 jjM.

V. Evnen for FTC til å inhibere replikering av HBV.

Eksempel 13 Evaluering av aktiviteten av ( + )- og (-)-enantiomerene i FTC i 2. 2. 15- cellekulturer Evnen for enantiomerene av FTC til å inhibere veksten av virus i 2 .2 .15-cellekulturer (HepG2-celler, transformert med hepatittvirion) er beskrevet i detalj nedenfor.

En oppsummering og en beskrivelse av analysen for antivirale effekter i dette kultursystem og analyse av HBV DNA er beskrevet av Korba og Milman i "Antiviral Res.", 15:217, 1991). De antivirale evalueringer ble gjennomført på to separate cellepassasjer. Alle brønner i alle plater ble podet til samme densitet og samtidig.

ANALYSEPÅEÅMETRE

På grunn av de inherente variasjoner i nivåene av både intracellulære og ekstracellulære HBV DNA, ansees kun depresjon større enn 3,5 ganger (for HBV virion DNA) eller 3,0 ganger (for HBV DNA-replikeringsmellomprodukter) i forhold til de midlere nivåer for disse HBV DNA-former i ikke-behandlede celler, å være statistisk signifikante (P>0,05). Nivåene av integrert HBV DNA i hvert cellulære DNA-preparat (som forblir konstant på en pr. cellebasis i disse forsøk) ble benyttet for å beregne nivåene av intracellulære HBV DNA-former for derved å sikre at like mengder cellulær-DNA ble sammenlignet mellom separate prøver.

Typiske verdier for ekstracellulær HBV virion DNA i ikke-behandlede celler ligger fra 50 til 150 pg/ml kulturmedium (gjennomsnitt på ca. 76 pg/ml). Intracellulære HBV DNA-replikeringsmellomprodukter i ikke-behandlede celler lå fra 50 til 100 pg/pg celle DNA (gjennomsnitt ca. 75 pg/pg celle DNA). Generelt er depresjoner i nivåene av intracellulær HBV DNA på grunn av behandling med antivirale forbindelser mindre utpreget, og inntrer langsommere, enn depresjoner i nivåene av HBV virion DNA, se Korba og Milman i "Antiviral Res.", 1991, 15:217.

Den måte på hvilken hybridiseringsanalysene ble gjennomført for disse forsøk resulterte i en ekvivalens på ca. 1,0 pg intracellulært HBV DNA pr. 2-3 genomkopier pr. celle og 1,0 pg/ml av ekstracellulært HBV DNA pr. 3 x IO<5>viralpartikler pr. ml.

TOKSISITETSANALYSER

Toksisitetsanalyser ble gjennomført for å bedømme hvorvidt observerte antiviraleffekter skyldes en generell virkning på celle-levedyktigheten. Den her benyttede metode var målingen av opptaket av nøytralrødt farvestoff, en standard- og utbredt analyse for svellelevedyktighet i et antall virus-vertssystemer inkludert HSV og HIV. Toksisitetsanalysene ble gjennomført i 96-brønners flatbunnede vevkulturplater. Celler for toksisitetsanalysene ble dyrket og behandlet med prøveforbindelsene med den samme plan som beskrevet for antiviralbedømmelsene nedenfor. Hver forbindelse ble prøvet ved fire konsentrasjoner, hver i triplikatkulturer (brønnene "A", "B" og "C"). Opptaket av nøytralrødt farvestoff ble benyttet for å bestemme det relative toksisitetsnivå. Absorbansen av internalisert farvestoff ved 510 nm (As^n) ble benyttet for den kvantitative analyse. Verdiene presenteres som en prosentandel av de gjennomsnittlige Ag^n-verdiene i ni separate kulturer av ikke-behandlede celler som holdes i den samme 96-brønners plate som prøveforbindelsene. Farveopptaket i de ni kontrollkulturer på plate 5 lå fra 91,6* til 110,4* og på plate 6 fra 96,6* til 109*. Resultatene er gitt i tabell 6.

TOKSISITETSEVALUERING

Som antydet i tabell 6 ble ingen signifikant toksisitet (større enn 50* depresjon av farveopptaksnivåene som observeres i ikke-behandlede celler) observert for prøve-forbindelsene ved de konsentrasjoner som benyttes for antiviralevalueringene. Begge prøveforbindelser, (-)-FTC og (+)-FTC, syntes å være toksiske ved den høyeste konsentrasjon som ble benyttet for toksisitetsprøvene, 330 pM.

ANTIVIRALEVALUERINGER

KONTROLLER

Innen normale variasjoner forble nivåene av HBV virion DNA og intracellulære HBV-replikeringsmellomprodukter (HBV RI) konstant i de ikke-behandlede celler over utfordrings-perioden. DMSO påvirket ved en konsentrasjon på 1* ikke nivåene av HBV-replikering i 2.2.15-cellekulturer.

PRØVEFORBINDELSER

Som antydet i tabell 7 inhiberte både (-)-FTC og (+)-FTC signifikant replikeringen av HBV ved de prøvede nivåer. Som antydet i tabell 8 inhiberte (-)-FTC fremdeles signifikant syntesen av HBV virion DNA og intracellulære HBV DNA ved konsentrasjoner på 4, 1 og 0,25 uM.

Eksempel 14 Opptak av ( ±)- FTC i human- leverceller: EBV-aktiviteten for FTC

Prosedyren i eksempel 9 ble gjentatt med human-leverceller (HepG2-celler, tilgjengelige fra ATCC) for å bestemme opptaket og metabolismen av FTV i disse celler. Som vist i figur 9 blir (±)-FTC tatt opp av HepG2-celler i store mengder. Disse human-leverceller metaboliserer en stor prosentandel av (±)-FTC til (±)-FTC-tri fosfat. Disse data indikerer i forbindelse med andre her tilveiebragte data at (±)-FTC så vel som dens (-)- og (+ )-enantiomerer, fos- foryleres i leverceller. Disse celler kan transformeres med hepatitt B-virus.

Eksempel 15 Egress av FTC i human- HepG2- celler

Figur 2 viser egressen av [<3>H]-(±)-FTC og dens fosforylerte derivater i human-HepG2 i pmol/10<6>celler over tidsceller efter pulsing av celler med 10jjM [<3>H]-(±)-FTC (700 DPM/pmol) i 24 timer, og evaluering av konsentrasjonen av forbindelsen 24 timer efter fjerning. Figur 11 viser reduksjonen av den kombinerte konsentrasjon av [<3>H]-(±)-FTC og dens fosforylerte derivater fra human HepG2-celler efter inkubering med 10 pM [<3>H]-(±)-TFC (700 DPM/pmol) i 24 timer, i pmol/10<6>celler over tid.

Som vist er, selv efter 48 timer, over 1 jjM aktiv forbindelse (noe som er signifikant høyere enn ECg0-verdien for forbindelsen) fremdeles til stede i cellene. V. Toksisitet i granulocytt-makrofag-forløperceller.

Eksempel 16 Virkning av FTC på kolonidannelse av granulocytt- makrof ag- f or løper celler

Figur 12 er et diagram av virkningen av (-)- og ( + )-enantiomerene av FTC på kolonidannelse av granulocytt-makrof ag-forløperceller, målt i prosent overlevelse mot konsentrasjonen i pM ((-)-FTC, åpen sirkel; (+)-FTC, mørkgjort sirkel; AZT, mørkgjort kvadrat). Som antydet synes (-)-enantiomeren av FTC å være mindre toksisk, det vil si ha høyere IC50-verdi, enn både (+ )-enantiomeren og AZT i denne cellelinje.

VI. Farmakokinetika for TFC.

Eksempel 17 Metabolisme av FTC ved administrering til rotter (±)-FTC ble administrert intravenøst ved doseringer på 10, 50 og 100 mg/kg til rotter, og arealer under plasmamedikament-konsentrasjonen mot tid, AUC, den totale klaring, CL-p, stabil-tilstandsvolumet for fordeling, Vss, midlere oppholds-tid, MRT, og halveringstiden, Ty2, ble bedømt. Resultatene er gitt i tabell 9.

Eksempel 18 Farmakokineti ske parametre for FTC efter

intravenøst og oral administrering av FTC

Model1-uavhengige farmakokinetiske parametre ble avledet for (±)-FTC ved administrering intravenøst, IV, og oralt, PO, av 33,3 mg/kg til rhesusaper. Resultatene er oppført i tabell 10. Viktig er at den midlere bi ot ilgjengelighet for forbindelsen i aper var 73* (± 6*).

Eksempel 19 CSF:serumforhold for FTC og dens metabolitt i

rhesusaper

Tilgjengeligheten av (±)-FTC til å krysse blod-hjerne-barrieren ble bedømt ved administrering av 33,3 mg/kg av den aktive forbindelse til rhesusaper og å måle mengden (±)-FTC i cerebral spinalfluidet, CSF, og i blodserum, en time efter administrering. Resultatene er gitt i tabell 11. Disse data antyder at en signifikant mengde aktiv forbindelse passerer gjennom blod-hjerne-barrieren i dette pattedyr.

III. Fremstilling av farmasøytiske preparater.

Mennesker som lider av sykdommer forårsaket av HIV- eller HBV-infeksjon kan behandles ved administrering av en effektiv mengde av (-)FTC som isolert enantiomer eller et farmasøy-tisk akseptabelt salt derav, eller i enantiomert anriket form eller som et farmasøytisk akseptabelt derivat eller salt derav i nærvær av en farmasøytisk akseptabel bærer eller et fortynningsmiddel. De aktive stoffer kan administreres på en hvilken som helst egnet måte, for eksempel oralt, paren-teralt, intravenøst, intradermalt, subkutant eller topisk, i flytende eller fast form.

Den aktive forbindelse innarbeides i den farmasøytisk akseptable bærer eller fortynningsmiddel i en mengde tilstrekkelig til til pasienten å avgi en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse til å inhibere viral replikering in vivo, særlig HIV- og HBV-replikering, uten å forårsake alvorlige toksiske virkninger hos den behandlede pasient. Med "inhiberende mengde" menes en mengde aktiv bestanddel som er tilstrekkelig til å utøve en inhiberende virkning som målt for eksempel ved en analyse som de som her beskrives.

En foretrukket dose av (-)FTC som isolert enantiomer eller I enaniomert anriket form eller et fysiologisk akseptabelt salt derav, for alle de ovenfor angitte tilstander vil ligge i området fra 1 til 50 mg/kg, fortrinnsvis 1 til 20 mg/kg kroppsvekt pr. dag, rent generelt fra 0,1 til 100 mg/kg kroppsvekt hos mottageren, pr. dag. Det effektive doserings-området for de farmasøytisk akseptable derivater kan beregnes basert på vekten av stamnukleosidet som skal avgis. Hvis derivatet viser aktivitet per se, kan den effektive dose estimeres som ovenfor ved bruk av vekten av derivatet, eller ved andre i og for seg kjente metoder.

Forbindelsen administreres hensiktsmessig i enhetsdoser i en hvilken som helst egnet form, inkludert, men ikke begrenset til en som inneholder 7 til 3000 mg og fortrinnsvis 70 til 1400 mg aktiv bestanddel pr. enhetsdose. En oral dosering på 50 til 1000 mg er vanligvis hensiktsmessig.

Ideelt bør den aktive bestanddel administreres for å oppnå topp-plasmakonsentrasjoner for den aktive bestanddel fra 0,2 til 70 jjM, og fortrinnsvis 1,0 til 10 pM.. Dette kan for eksempel oppnås ved intravenøs injeksjon av en 0,1 til 5 #-ig oppløsning av den aktive bestanddel , eventuelt i saltoppløs-ning, eller administrert som en bolus av den aktive bestanddel .

Konsentrasjonen av aktiv forbindelse i medikamentblandingen avhenger av absorpsjons-, inaktiverings- og utskillings-hastighetene for medikamentet så vel som andre faktorer som er velkjente for fagmannen. Det skal påpekes at doserings-verdier også vil variere med alvorligheten av den tilstand som skal lindres. Det skal videre være klart at for et hvilket som helst spesielt subjekt, må spesifikke doserings-planer justeres med tiden i henhold til de individuelle behov og fagmannens profesjonelle bedømmelse i forbindelse med overvåking av administreringen av blandingene, og de her gitte konsentrasjonsområder er kun eksempler og ikke ment å begrense hverken rammen eller gjennomføringen av den krevede blanding. Den aktive bestanddel kan administreres på en gang eller kan deles i et antall mindre doser for administrering i varierende tidsrom.

En foretrukken administreringsmetode for den aktive bestanddel er oral administrering. Orale preparater vil generelt omfatte et inert fortynningsmiddel eller en spiselig bærer. De kan innelukkes i gelatinkapsler eller presses til tabletter. For oral terapeutisk administrering kan den aktive forbindelse innarbeides med drøyemidler og benyttes i form av tabletter, dragéer eller lignende, eller kapsler. Farmasøy-tisk godtagbare bindemidler og/eller hjelpemidler kan innarbeides som en del av blandingen. Tabletter, piller, kapsler, dragéer og lignende kan inneholde en hvilken som helst av de følgende bestanddeler eller forbindelser av tilsvarende art: et bindemiddel som mikro-krystallinsk cellulose, tragakantgummi eller gelatin; et drøyemiddel som stivelse eller laktose; et disintegrerings-middel som alginsyre, Primogel eller maisstivelse; et smøremiddel som magnesiumstearat eller Sterotes; et glide-middel som kolloid silisiumdioksyd; et søtningsmiddel som sukrose eller sakkarin; et smaksmiddel som peppermynte, metylsalicylat eller appelsinsmak. Når enhetsdoseformen er en kapsel, kan den i tillegg til materialer av den ovenfor angitte type også inneholde en flytende bærer som en fettolje. I tillegg kan enhetsdoseformer inneholde forskjellige andre materialer som modifiserer den fysikalske form av enhetsdosen, for eksempel belegg av sukker, skjellakk eller andre enteriske midler. (-)FTC eller farmasøytisk akseptable derivater eller salter derav, kan administreres som en komponent av en eliksir, suspensjon, sirup, tyggegummi eller lignende. En sirup kan i tillegg til de aktive forbindelser inneholde sukrose som et søtningsmiddel og visse preserveringsmidler, farvestoffer og smaksstoffer. (-)FTC eller farmasøytisk akseptable derivater eller salter derav kan også blandes med andre aktive stoffer som ikke forstyrrer den ønskede virkning, eller med stoffer som supplerer den ønskede virkning som antibiotika, antifungale midler eller antiinflammatori ske midler, eller andre antivirale midler inkludert andre nukleosid-anti-HIV-forbindelser.

Oppløsninger eller suspensjoner som benyttes for parenteral, intradermal, subkutan eller topisk applikering kan inkludere de følgende bestanddeler: et sterilt fortynningsmiddel som vann for injeksjon, saltoppløsning, fikserte oljer, poly-etylenglykoler, glyserol, propylenglykol eller andre syntetiske oppløsningsmidler; antibakterielle midler som benzylalkohol eller metylparabener; antioksydanter som askorbinsyre eller natriumbisulfitt; gelateringsmidler som etylendiamintetraeddiksyre; buffere som acetater, citrater eller fosfater og midler for justering av tonisiteten som natriumklorid eller dekstrose. Det parenterale preparat kan inneholdes i ampuller, engangssprøyter eller flerdoseampuller av glass eller plast.

Ved intravenøs administrering er foretrukne bærere fysiolo-giske saltoppløsninger eller fosfatbufret saltoppløsning,

PBS.

I en foretrukken utførelsesform fremstilles de aktive forbindelser med bærere som beskytter forbindelsen mot hurtig eliminering fra legemet, for eksempel kontrollert avgivelses-formuleringer inkludert implantater og mikroinnkapslede avgivningssystemer. Bionedbrytbare og biokompatible polymerer kan benyttes, eksempler er etylenvinylacetat, polyanhydrider, polyglykolsyre, kollagen, polyortoestere og polymelkesyre. Metoder for fremstilling av slike formuleringer vil være åpenbare for fagmannen. Materialene kan også oppnås kommersielt for eksempel fra Alza Corporation eller Nova Pharmaceu-ticals, Inc.

Liposomale suspensjoner (inkludert liposomer som er rettet mot infiserte celler med monoklonale antistoffer til virale antigener) er også foretrukket som farmasøytisk akseptable bærere. Disse kan fremstilles i henhold til i og for seg kjente metoder, for eksempel som beskrevet i US-PS 4 522 811. For eksempel kan 1iposomformuler inger fremstilles ved å oppløse ett eller flere egnede lipider som stearoyl-fosfatidyletanolamin, stearoylfosfatidylkolin, arachadoyl-fosfatidylkolin og kolesterol, i et uorganisk oppløsnings-middel som så fordampes og efterlater en tynn film av tørket lipid på overflaten av beholderen. En vandig oppløsning av den aktive forbindelse eller dens mono-, di- og/eller trifosfatderivat innføres så til beholderen. Beholderen blir så slynget for hånd for å frigjøre 1ipidmaterialet fra beholdersidene og å dispergere 1ipidaggregatene for derved å danne den liposomale suspensjon.

IV. Fremstilling av fosfatderivater av FTC.

Mono-, di- og trifosfatderivater av FTC kan fremstilles som beskrevet nedenfor.

Monofosfatet kan fremstilles ifølge den prosedyre som beskrives av Imai et al. i "J. Org. Chem.", 34(6), 1547-1550 (juni 1969). For eksempel omsettes ca. 100 mg FTC og ca. 280 pl fosforylklorid under omrøring i ca. 8 ml tørr etylacetat ved ca. 0°C i rundt 4 timer. Reaksjonen stanses med is. Den vandige fase renses på en aktivert trekullkolonne og det hele elueres med 5% ammoniumhydroksyd i en 1:1 etanol:vann. Fordamping av elueringsmidlet gir ammonium-FTC-5'-monofosfat. Difosfatet kan fremstilles i henhold til Davison et al. i "J. Org. Chem.", 52(9), 1794-1801 (1987). FTC-difosfat kan fremstilles fra det tilsvarende tosylat som i sin tur for eksempel kan fremstilles ved omsetning av nukleosidet med tosylklorid i pyridin ved romtemperatur i ca. 24 timer med efterfølgende opparbeiding av produktet på vanlig måte som vasking, tørking og krystal1 isering.

Trifosfatet kan fremstilles ifølge Hoard et al. i "J. Am. Chem. Soc", 87(8), 1785-1788 (1965 ). For FTC gjennomføres aktivering (ved fremstilling av et imidazolid i henhold til i og for seg kjente metoder) og behandling med tributyl-ammoniumpyrofosfat i DMF. Reaksjonen gir primært trifosfatet av nukleosidet med noe ikke-omsatt monofosfat og noe difosfat. Rensing ved anionbyttekromatografi på en DEAE-kolonne følges ved isolering av trifosfatet, for eksempel som tetranatriumsalt.

Oppfinnelsen er beskrevet under henvisning til foretrukne utførelsesformer, men variasjoner og modifikasjoner kan selvfølgelig gjennomføres av fagmannen uten å gå utenfor rammen av oppfinnelsen.

Claims (6)

1. Terapeutisk aktiv forbindelse,karakterisertved at den er (- )-p-L-2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl )-l,3-oksatiolan som isolert enantiomer eller et fysiologisk akseptabelt salt derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisertved at den er (-)-p<->L-2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl )-l,3-oksatiolan i enantiomert anriket form.

3. Farmasøytisk preparat,karakterisert vedat det omfatter en effektiv mengde for behandling av HIV-infeksjoner i mennesker av (-)-p-L-2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl)-l,3-oksatiolan som en isolert enantiomer eller dennes fysiologisk akseptable salt, i en farmasøytisk akseptabel bærer.

4 . Farmasøytisk preparat ifølge krav 3,karakterisert vedat det omfatter en effektiv mengde for behandling av HIV-infeksjoner i mennesker av (-)-p-L-2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl)-l,3-oksatiolan i enantiomert anriket form eller dennes fysiologisk akseptable salt, i en farmasøytisk akseptabel bærer.

5 . Anvendelsen av (- )-p-L-2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl )-l,3-oksatiolan som isolert enantiomer for fremstilling av et medikament for behandling av HIV.

6 • Anvendelse ifølge krav 5 av (-)-p-L-2-hydroksymetyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl)-l,3-oksatiolan i enantiomert anriket form for fremstilling av et medikament for behandling av HIV.