ES2215376T3 - Tadg-15: una proteasa de serina extracelular sobreexpresada en carcinomas de mama y ovario. - Google Patents

Abstract

Un ADN aislado que codifica una proteína TADG-15 siendo dicho ADN seleccionado del grupo que consta de: a) ADN aislado que consta de la SEC. ID nº 1, y b) ADN aislado que difiere del ADN aislado de a) en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético y que codifica una proteína TADG-15.

Description

TADG-15: una proteasa de serina extracelular sobreexpresada en carcinomas de mama y ovario.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere de forma general a los campos de la biología celular y del diagnóstico de enfermedades neoplásicas. Más concretamente, la presente invención se refiere a una serina-proteasa extracelular denominada "gen 15 derivado del antígeno tumoral" (TADG-15), que se sobreexpresa en carcinomas mamarios y ováricos

Descripción de la técnica relacionada

Las proteasas extracelulares se han asociado directamente con el crecimiento tumoral, con la diseminación de células tumorales y con la invasión de los órganos afectados. Las distintas clases de proteasas están implicadas en, pero no se limitan a, 1), la digestión del estroma que rodea el área inicial del tumor, 2) la digestión de las moléculas de adhesión celular para permitir la disociación de las células tumorales; y 3) la invasión de la membrana basal para que crezca la metástasis y se activen tanto los factores de crecimiento tumoral como los factores angiogénicos.

La técnica anterior carece de medios eficaces de detección para identificar las proteasas que se sobreexpresan en un carcinoma. La presente invención satisface esta antigua necesidad y deseo en la técnica.

Compendio de la invención

La presente invención describe un programa de detección para identificar las proteasas sobreexpresadas en un carcinoma mediante el examen de los productos de PCR amplificados, utilizando una visualización diferencial en los tumores en fases tempranas, comparando los de metástasis cancerosas con los de tejidos normales.

En una realización de la presente invención se proporciona un ADN que codifica una proteína TADG-15 seleccionada de un grupo que consta de: a) un ADN aislado que codifica una proteína TADG-15 y b) un ADN aislado que difiere del ADN aislado de a) en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético, y que codifica una proteína TADG-15.

En otra realización de la presente invención se proporciona un vector capaz de expresar el ADN de la presente invención destinado a la expresión en una célula recombinante y los elementos reguladores necesarios para expresar el ADN en la célula.

Aún en otra realización de la presente invención, se proporciona una célula hospedadora transfectada con el vector de la presente invención, vector que expresa una proteína TADG-15.

Aún todavía en otra realización de la presente invención, se proporciona un método para detectar la expresión de un ARNm de TADG-15, que comprende las etapas de: a) poner en contacto el ARNm obtenido de la célula con la sonda de hibridación marcada; y b) detectar la hibridación de la sonda con el ARNm

Otros aspectos, características y ventajas futuros de la presente invención serán evidentes con la siguiente descripción de las realizaciones de la invención preferidas actualmente que se dan con propósitos descriptivos.

Breve descripción de los dibujos

Se pueden obtener descripciones más particulares de la invención brevemente expuesta arriba mediante la referencia a algunas realizaciones de la misma que se ilustran en los dibujos adjuntos, de modo que la materia en la que las características enumeradas anteriormente, las ventajas y los objetivos de la invención se alcancen y se puedan comprender en detalle, así como para que otros se aclaren. Estos dibujos constituyen una parte de la memoria. Sin embargo, se debe tener en cuenta que los dibujos adjuntos ilustran las realizaciones preferidas de la invención y, por lo tanto, no se deben considerar limitadoras de su alcance.

La figura 1 muestra una comparación de productos de PCR derivados de un ADNc normal y de carcinoma de mama como se muestra mediante tinción en un gel de agarosa.

La figura 2 muestra una comparación del dominio catalítico serina-proteásico de TAGD-15 (SEC. ID. nº 14) con la hepsina (Heps, SEC. ID. nº 3), (Scce, SEC. ID. nº 4), la tripsina (Try, SEC. ID. nº 5), la quimotripsina (Chymb, SEC. ID. nº 6), el factor 7 (Fac 7, SEC. ID. nº 7) y un activador hístico de plasminógeno (Tpa, SEC. ID. nº 8). Los asteriscos señalan los aminoácidos conservados de la tríada catalítica.

La figura 3 muestra un análisis cuantitativo por PCR de la expresión de TADG-15.

\newpage

La figura 4 muestra el cociente de la expresión de TADG-15 respecto a la expresión de la \beta-tubulina en tejidos normales, tumores con poco potencial maligno (LMP) y carcinomas.

La figura 5 muestra la expresión de TADG-15 en líneas celulares tumorales derivadas de tejidos de carcinoma de mama y de ovario.

La figura 6 muestra la sobreexpresión de TADG-15 en otros tejidos tumorales.

La figura 7 muestra las transferencias Northern de la expresión de TADG-15 en carcinomas ováricos, en tejidos fetales y en tejidos normales de adultos.

La figura 8 muestra un diagrama del transcrito de TADG-15 y los clones con el origen de su derivación.

La figura 9 muestra la secuencia de núcleotidos del ADNc de TADG-15 (SEC. ID. nº 1) y la secuencia de aminoácidos de la proteína TADG-15 (SEC. ID. nº 2).

La figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteasa TADG-15 que incluye los sitios y los dominios funcionales.

La figura 11 muestra un diagrama estructural de la proteína TADG-15 que incluye los dominios funcionales.

La figura 12 muestra una comparación de la secuencia de núcleotidos entre la TADG-15 y la SNC-19 humana (acceso de GeneBank nº U20428).

Descripción detallada de la invención

Como se usa en la presente memoria, el término "ADNc" se referirá a la copia en ADN del ARNm transcrito de un gen.

Como se usa en la presente memoria, el término "secuencia de aminoácidos derivada" querrá decir la secuencia de aminoácidos determinada leyendo la secuencia de tripletes de bases nucleotídicas en el ADNc.

Como se usa en la presente memoria, el término "rastreo de una genoteca" se referirá al procedimiento en el que se usa una sonda marcada para comprobar si, en las condiciones adecuadas, hay una secuencia complementaria a la sonda presente en una genoteca de ADN determinada. Además, el "rastreo de una genoteca" se podría realizar por PCR.

Como se usa en la presente memoria, el término "PCR" se refiere a la reacción en cadena de polimerasa que es el objeto de las patentes de los Estados Unidos nº 4.683.195 y nº 4.683.202 de Mullis, así como otras mejoras conocidas actualmente en la técnica.

El ADNc de TADG-15 tiene una longitud de 3147 pares de bases (SEC. ID. nº 1) y codifica una proteína de 855 aminoácidos (SEC. ID. nº 2). La disponibilidad del gen TADG-15 abre la puerta para numerosos estudios que pueden conducir a varias aplicaciones. Por ejemplo, el gen TADG-15 se puede usar como un diagnóstico o diana terapéutica en el carcinoma ovárico y en otros carcinomas que incluyen el de mama, el de próstata, el de pulmón y el de colon.

De acuerdo con la presente invención, se pueden emplear técnicas convencionales de biología molecular, de microbiología y de ADN recombinante dentro del conocimiento de la técnica. Dichas técnicas se explican en detalle en la literatura. Véase, p. ej. Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach", Volúmenes I y II (D.N. Glover, ed., 1985); "Oligonucleotidde Synthesis" (M.J. Gait ed., 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D Hames & S. J. Higgins eds., (1985)]; "Transcription and Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R. I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes", [IRL Press, (1986)]; B. Perbal,"A Practical Guide To Molecular Cloning", (1984).

Por lo tanto, si aparecen en la presente memoria, los siguientes términos tendrán las definiciones expuestas a continuación.

Se prefiere que el aminoácido descrito en la presente memoria esté en la forma isomérica "L". Sin embargo, se pueden sustituir los restos en la forma isomérica "D" por cualquier resto de aminoácido L, con tal que se mantenga en el polipéptido la propiedad funcional deseada de unirse a la inmunoglobulina. NH_{2} se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxilo libre presente en el extremo carboxilo de un polipéptido. De acuerdo con la nomenclatura estándar de los polipéptidos, J. Biol. Chem.,

\hbox{243:3552-59}

(1969), las abreviaturas para los restos de aminoácidos se muestran en la siguiente tabla de correspondencia: TABLA de correspondencia

Símbolo		Aminoácido
De 1 letra	De 3 letras
Y	Tyr	tirosina
G	Gly	glicina
F	Phe	fenilalanina
M	Met	metionina
A	Ala	alanina
S	Ser	serina
I	Ile	isoleucina
L	Leu	leucina
T	Thr	treonina
V	Val	valina
P	Pro	prolina
K	Lys	lisina
H	His	histidina
Q	Gln	glutamina
E	Glu	ácido glutámico
W	Trp	triptófano
R	Arg	arginina
D	Asp	ácido aspártico
N	Asn	asparragina
C	Cys	cisteína

Hay que señalar que todas las secuencias de restos de aminoácidos se representan en la presente memoria por fórmulas cuya orientación de izquierda a derecha está en la dirección convencional de extremo amino a extremo carboxilo. Es más, hay que señalar que una raya al comienzo o al final de una secuencia de restos de aminoácidos indica un enlace peptídico con una secuencia adicional de uno o más restos de aminoácidos. La tabla anterior se presenta con el fin de correlacionar las notaciones de tres letras y de una letra que pueden aparecer alternativamente en la presente memoria.

Un "replicón" es cualquier elemento genético (p. ej. plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo, es decir, que es capaz de replicarse bajo su propio control.

Un "vector" es un replicón, como un plásmido, un fago o un cósmido, al cual se puede añadir otro segmento de ADN para ocasionar la replicación del segmento añadido.

Una "molécula de ADN" se refiere a la forma polimérica de los desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina o citosina) bien en su forma monocatenaria o bien en una hélice bicatenaria. Este término se refiere sólo a la estructura primaria y secundaria de la molécula y no lo limita a ninguna forma terciaria determinada de la molécula. Así pues, este término incluye el ADN bicatenario encontrado, entre otras cosas, en moléculas de ADN lineales (p. ej. fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. En la presente memoria se considera la estructura de acuerdo con la convención normal de dar sólo la secuencia en la dirección de 5' a 3' a lo largo de la cadena no transcrita del ADN (a saber, la cadena que tiene una secuencia homóloga al ARNm).

Un "origen de replicación" se refiere a aquellas secuencias de ADN que participan en la síntesis del ADN.

Una "secuencia codificante" de ADN es una secuencia de ADN bicatenario que se transcribe y se traduce en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante vienen determinados por un codón de iniciación en el extremo 5' (amino) y un codón de parada de la traducción en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, secuencias procarióticas, ADNc de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (p. ej. mamífero) e incluso secuencias sintéticas de ADN. Normalmente se encontrará en 3' respecto a la secuencia codificante una señal de poliadenilación y la secuencia de terminación de la transcripción.

Las secuencias de control traduccional y transcripcional son secuencias de ADN reguladoras, como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores y otras similares, que mantienen la expresión de una secuencia codificante en una célula hospedadora.

Una "secuencia promotora" es una región de ADN reguladora capaz de unir la ARN-polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante un poco más adelante (en dirección 3'). Con el propósito de definir la presente invención, la secuencia promotora se acaba en su extremo 3' por el sitio de inicio de la transcripción y se extiende hacia atrás (en dirección 5) para incluir el mínimo número de bases o de elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de iniciación de transcripción así como los dominios de unión a proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN-polimerasa. Los promotores eucarióticos a menudo, aunque no siempre, contienen cajas "TATA" y cajas "CAT". Los promotores procarióticos contienen secuencias Shine-Dalgarno además de secuencias consenso -10 y -35.

Una "secuencia de control de la expresión" es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y la traducción de otra secuencia de ADN. Una secuencia codificante se encuentra "bajo el control" de secuencias de control transcripcionales y traduccionales en una célula cuando la ARN-polimerasa transcribe la secuencia codificante a ARNm, que a continuación se traduce en la proteína codificada por la secuencia codificante.

Se puede incluir una "secuencia señal" cerca de la secuencia codificante. Esta secuencia codifica un péptido señal, en el extremo N-terminal del polipéptido, que informa a la célula hospedadora para que dirija el polipéptido hacia la superficie celular o para que secrete el polipéptido al entorno; la célula hospedadora elimina este péptido señal antes de que la proteína abandone la célula. Las secuencias señal se pueden encontrar asociadas con numerosas proteínas nativas en procariotas y eucariotas.

El término "oligonucleótido", tal como se usa en la presente memoria al hacer alusión a la sonda de la presente invención, se define como una molécula compuesta de dos o más ribonucleótidos, preferiblemente más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores que, a su vez, dependen de la función y uso finales del oligonucleótido.

El término "cebador" tal como se usa en la presente memoria se refiere a un oligonucleótido, tanto si se encuentra de manera natural como en un producto purificado de una digestión de restricción, como si se produce sintéticamente, que es capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis cuando se coloca en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto por extensión del cebador que es complementario a la cadena nucleotídica, es decir, en la presencia de nucleótidos y de un agente inductor como una ADN-polimerasa y a una temperatura y a un pH adecuados. El cebador puede ser tanto monocatenario como bicatenario y debe ser lo suficientemente largo como para cebar la síntesis del producto de extensión deseado en presencia del agente inductor. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, entre los que se incluyen la temperatura, la fuente del cebador y el uso del método. Por ejemplo, para aplicaciones diagnósticas, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el cebador oligonucleotídico normalmente contiene entre 15-20 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos.

Los cebadores en la presente memoria se seleccionan para que sean "sustancialmente" complementarios a distintas cadenas de una secuencia diana determinada de ADN. Esto quiere decir que los cebadores deben ser lo suficientemente complementarios como para hibridar con sus respectivas cadenas. Por lo tanto, la secuencia del cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, se puede añadir un fragmento nucleotídico no complementario al extremo 5' del cebador, con el resto de la secuencia del cebador complementaria a la cadena. Alternativamente, las bases no complementarias o las secuencias más largas pueden estar diseminadas por el cebador, a condición de que la secuencia del cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia o que hibride con ella y, de este modo, forme el molde para la síntesis del producto de extensión.

Como se usa en la presente memoria, los términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a enzimas, cada una de las cuales corta el ADN bicatenario en, o cerca de, una secuencia nucleotídica específica.

Una célula se ha "transformado" con ADN heterólogo o exógeno cuando dicho ADN se ha introducido dentro de la célula. El ADN transformante puede estar o no estar integrado (unido covalentemente) en el genoma de la célula. En los procariotas, las levaduras y las células de mamíferos, por ejemplo, el ADN transformante se puede mantener en un elemento episomal, como un plásmido. En cuanto a las células eucarióticas, una célula transformada establemente es aquella en la que el ADN transformante se ha integrado en un cromosoma para que las células hijas lo hereden gracias a la replicación del cromosoma. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula eucariótica para establecer líneas celulares o clones que consisten en una población de células hijas que contienen el ADN transformante. Un "clon" es una población de células derivadas por mitosis de una única célula o ancestro. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de crecer establemente in vitro durante muchas generaciones.

Dos secuencias de ADN son "sustancialmente homólogas" cuando al menos cerca del 75% (preferiblemente al menos cerca del 80% y más preferiblemente al menos cerca del 90% o del 95%) de los nucleótidos coinciden sobre la longitud definida de las secuencias de ADN. Las secuencias que son sustancialmente homólogas se pueden identificar comparando las secuencias mediante el uso de software estándar disponible en bancos de datos de secuencias o en un experimento de hibridación Southern en, por ejemplo, las condiciones estrictas que están definidas para ese sistema particular. Definir las condiciones de hibridación adecuadas se encuentra dentro del dominio de la técnica. Véase, p. ej., Maniatis et al, citado anteriormente; DNA Cloning, Vols I & II, citado anteriormente; Nucleic Acid Hybridization, citado anteriormente.

Una región "heteróloga" de la construcción de ADN es un segmento identificable de ADN dentro de una molécula de ADN mayor que no se encuentra asociada a la molécula mayor en la naturaleza. De este modo, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamíferos, el gen normalmente estará flanqueado por ADN que no flanquea el ADN genómico del mamífero en el genoma del organismo que actúa como fuente. En otro ejemplo, la secuencia codificante es una construcción en la que la propia secuencia codificante no se encuentra en la naturaleza (p. ej., un ADNc en el que la secuencia genómica codificante contiene intrones, o secuencias sintéticas que tienen codones diferentes a los del gen nativo). Las variaciones alélicas o las mutaciones que aparecen de manera natural no dan origen a una región heteróloga de ADN como se define en la presente memoria.

Los marcadores empleados más comúnmente para estos estudios son elementos radioactivos, enzimas, sustancias químicas con fluorescencia cuando se exponen a luz ultravioleta y otros. Se conocen numerosas sustancias fluorescentes que pueden utilizarse como marcadores. Entre ellas se pueden citar, por ejemplo, la fluoresceína, la rodamina, la auramina, el rojo Texas, el azul AMCA y el amarillo Lucifer. Una sustancia de detección determinada es un anticuerpo contra los anticuerpos de conejo preparado en cabras y conjugado con fluoresceína a través de un isotiocianato.

Las proteínas se pueden marcar también con un elemento radioactivo o con una enzima. El marcador radioactivo se puede detectar por cualquiera de los procedimientos de recuento disponibles corrientemente. El isótopo preferido se puede seleccionar de entre ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, ^{36}Cl, ^{51}Cr, ^{57}Co, ^{58}Co, ^{59}Fe, ^{90}Y, ^{125}I, ^{131}I y ^{186}Re.

Las marcaciones enzimáticas son igualmente útiles y se pueden detectar por cualquiera de las técnicas gasométricas, amperométricas, fluoroespectrofotométricas, espectrofotométricas o colorimétricas utilizadas actualmente. La enzima se conjuga a la partícula seleccionada haciéndola reaccionar con moléculas fijadoras como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehído y otras similares. Se conocen y se pueden utilizar muchas enzimas que pueden usarse en estos procedimientos. Las preferidas son la peroxidasa, la \beta-glucoronidasa, la \beta-D-glucosidasa, la \beta-D-galactosidasa, la ureasa, la glucosa-oxidasa más la peroxidasa y la fosfatasa alcalina. Se pueden consultar las patentes de los Estados Unidos nº 3.654.090, nº 3.850.752 y nº 4.016.043 a modo de ejemplo por su descripción de métodos y sustancias de marcación alternativos.

Un sistema de análisis particular desarrollado y utilizado en la técnica se conoce como un análisis de receptor. En un análisis de receptor, la sustancia a analizar se marca adecuadamente y a continuación se inoculan determinadas colonias celulares de prueba con una cantidad del marcador después de lo cual se realizan estudios de unión para determinar el grado al que la sustancia marcada se une a los receptores de la célula. De esta manera, se pueden descubrir diferencias en la afinidad entre las sustancias.

Un análisis útil en la técnica se conoce como análisis "cis/trans". Brevemente, este análisis emplea dos construcciones genéticas, una de las cuales normalmente es un plásmido que expresa continuamente un receptor particular de interés cuando se transfecta en una línea celular adecuada, y la segunda de ellas es un plásmido que expresa un delator, como la luciferasa, bajo el control de un complejo receptor/ligando. De este modo, por ejemplo, si se desea evaluar un compuesto como un ligando para un determinado receptor, uno de los plásmidos sería una construcción que acaba por expresar un receptor en una línea celular escogida, mientras que el segundo plásmido poseería un promotor unido al gen de la luciferasa en el que se inserta el elemento de respuesta al determinado receptor. Si el compuesto a prueba es un agonista para el receptor, el ligando se complejará con el receptor, y el complejo resultante se unirá al elemento de respuesta e iniciará la transcripción del gen de la luciferasa. La quimioluminiscencia resultante se mide a continuación fotométricamente y las curvas dosis-respuesta se obtienen y se comparan con las de ligandos conocidos. El protocolo anterior se describe detalladamente en la patente de los Estados Unidos nº 4.981.784.

Como se usa en la presente memoria, el término "hospedador" pretende incluir no sólo los procariotas sino también eucariotas como las levaduras, las plantas y las células de animales. Se puede utilizar un gen o una molécula de ADN recombinante que codifica una proteína humana TADG-15 de la presente invención para transformar un hospedador usando cualquiera de las técnicas comúnmente conocidas por los expertos en la técnica. Se prefiere especialmente el uso de un vector que contiene secuencias codificantes del gen que codifica una proteína humana TADG-15 de la presente invención con el propósito de transformar procariotas. Los hospedadores procarióticos pueden incluir E. coli, S.tymphimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. Los hospedadores eucarióticos incluyen levaduras como Pichia pastoris, células de mamíferos y células de insectos.

En general, conjuntamente con el hospedador, se utilizan vectores de expresión que contienen secuencias promotoras que facilitan la transcripción eficaz del fragmento de ADN insertado. El vector de expresión normalmente contiene un origen de replicación, promotor(es), terminador(es) así como genes específicos que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Se pueden fermentar y cultivar los hospedadores transformados de acuerdo con los medios conocidos en la técnica para lograr un crecimiento celular óptimo.

La invención incluye un ADN sustancialmente puro que codifica una proteína TADG-15, una de cuyas cadenas del ADN se hibridará en condiciones muy rigurosas a una sonda que contiene una secuencia de al menos 15 nucleótidos consecutivos de la (SEC. ID. nº 1). La proteína codificada por el ADN de la presente invención puede compartir al menos una identidad de secuencia del 80% (preferiblemente del 85% y más preferiblemente del 90% y mucho más preferiblemente del 95%) con los aminoácidos listados en la figura 10 (SEC. ID. nº 2). Más preferiblemente, el ADN incluye la secuencia codificante de los nucleótidos de la figura 9 (SEC. ID. nº 1) o una variante degenerada de dicha secuencia.

La sonda a la cual se híbrida preferiblemente el ADN de la invención consta de una secuencia de al menos 20 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente 40 nucleótidos, incluso más preferiblemente 50 nucleótidos y mucho más preferiblemente 100 nucleótidos o más (hasta el 100%) de la secuencia codificante de los nucleótidos listados en la figura 9 (SEC. ID. nº 1) o el complementario de la misma. Esta sonda es útil para detectar la expresión de TADG-15 en una célula humana por un método que incluye las etapas de a) poner en contacto el ARNm obtenido de la célula con la sonda de hibridación marcada; y de b) detectar la hibridación de la sonda con el ARNm.

La invención también incluye un ADN sustancialmente puro que contiene una secuencia de al menos 15 nucleótidos consecutivos (preferiblemente 20, más preferiblemente 30, incluso más preferiblemente 50 y mucho más preferiblemente todos) de la región de los nucleótidos 1 a 3147 de los nucleótidos listados en la figura 9 (SEC. ID. nº 1).

La terminología "gran rigor" alude a las condiciones de hibridación y lavado del ADN caracterizadas por una elevada temperatura y una concentración salina baja, p. ej., condiciones de lavado de 65ºC en una concentración salina de SSC aproximadamente a 0,1X o el equivalente funcional de la misma. Por ejemplo, las condiciones de gran rigor pueden incluir la hibridación en torno a 42ºC en presencia de formamida en torno al 50%; un primer lavado en torno a 65ºC con SSC en torno a 2X que contiene un 1% de SDS; seguido de un segundo lavado en torno a 65ºC con SSC en torno a 1X.

La terminología "ADN sustancialmente puro" alude al ADN que no se encuentra en un medio en el que el ADN aparece naturalmente, en virtud de la separación (purificación total o parcial) de alguna o de todas las moléculas de ese medio, o en virtud de la alteración de las secuencias que flanquean el ADN reivindicado. Por lo tanto, el término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus de replicación autónoma, o en un ADN genómico de un procariota o un eucariota; o que existe como una molécula aislada [p. ej., un ADNc o un fragmento genómico o de ADNc producido por una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o por una digestión con una endonucleasa de restricción] independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que forma parte de un gen híbrido que codifica una secuencia polipeptídica adicional, p. ej., una proteína de fusión. También se incluye un ADN recombinante que incluye una porción de los nucleótidos listados en la figura 9 (SEC. ID. nº 1) que codifica una variante por ayuste alternativo de TADG-15.

El ADN puede tener al menos en torno al 70% de identidad de secuencia con la secuencia codificante de los nucleótidos listados en la figura 9 (SEC. ID. nº 1), preferiblemente al menos el 75% (p. ej., al menos el 80%) y mucho más preferiblemente al menos el 90%. La identidad entre las dos secuencias es una función directa del número de posiciones idénticas o coincidentes. Cuando una posición de la subunidad en cualquiera de las dos secuencias está ocupada por la misma subunidad monomérica, p.ej., si una posición dada está ocupada por una adenina en cada una de las dos moléculas de ADN, entonces son idénticas en esa posición. Por ejemplo, si 7 posiciones en una secuencia de 10 nucleótidos de longitud son idénticas a las correspondientes posiciones en una segunda secuencia decanucleotídica, entonces las dos secuencias tienen una identidad de secuencia del 70%. La longitud de comparación de las secuencias será normalmente de al menos 50 nucleótidos, preferiblemente de al menos 60 nucleótidos, más preferiblemente de al menos 75 nucleótidos y mucho más preferiblemente de 100 nucleótidos. La identidad de las secuencias normalmente se mide utilizando un programa de análisis de secuencias [p. ej. el Paquete de programas de análisis de secuencias (Sequence Análisis Software Package) del Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705].

La presente invención comprende un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína humana TADG-15 y dicho vector es capaz de replicarse en un hospedador que comprende, en una unidad operativa: a) un origen de replicación, b) un promotor, y c) una secuencia de ADN que codifica dicha proteína. Preferiblemente, el vector de la presente invención contiene una porción de la secuencia de ADN mostrada en la SEC. ID. nº 1. Se puede definir un "vector" como una construcción replicable de ácido nucleico, p. ej., un ácido nucleico vírico o plasmídico. Los vectores se pueden utilizar para amplificar y/o expresar el ácido nucleico que codifica la proteína TADG-15. Un vector de expresión es una construcción que se puede replicar en la que la secuencia del ácido nucleico que codifica un polipéptido está unida operativamente a las secuencias de control adecuadas capaces de llevar a cabo la expresión del polipéptido en una célula. La necesidad de dichas secuencias de control variará según la célula seleccionada y el método de transformación elegido. Normalmente, las secuencias de control incluyen un promotor transcripcional y/o un potenciador, sitios adecuados de unión del ARNm al ribosoma y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y de la traducción. Se pueden utilizar métodos bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contengan señales de control traduccional y transcripcional adecuadas. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed), Cold Harbor Press, N.Y. Un gen y sus secuencias de control de la transcripción se definen como "operativamente ligadas" si las secuencias de control de la transcripción controlan de manera eficaz la transcripción del gen. Los vectores de la invención incluyen, pero no se limitan a, vectores plasmídicos y vectores víricos. Los vectores víricos preferidos de la invención son los que derivan de retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, virus SV40 o virus del herpes.

La terminología "proteína sustancialmente pura" alude a una proteína que ha sido separada de al menos algunos de los componentes que la acompañan de forma natural. Normalmente, la proteína es sustancialmente pura cuando está al menos un 60%, en peso, libre de las proteínas y otras moléculas orgánicas presentes naturalmente con las que ésta se asocia de forma natural in vivo. Preferiblemente, la pureza de la preparación es al menos del 75%, más preferiblemente al menos del 90% y mucho más preferiblemente al menos del 99%, en peso. Se puede obtener una proteína TADG-15 sustancialmente pura, por ejemplo, por extracción de una fuente natural, por expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido TADG-15 o mediante síntesis química de la proteína. La pureza se puede medir por cualquier método adecuado, p. ej, cromatografía en columna como la cromatografía de inmunoafinidad que utiliza un anticuerpo específico para TAFG-15, electroforesis de gel de policrilamida o análisis por HPLC. Una proteína está sustancialmente libre de componentes asociados de forma natural cuando se la separa de al menos algunos de los contaminantes que la acompañan en su estado natural. De este modo, una proteína que se sintetiza químicamente o que se produce en un sistema celular distinto de la célula de la que se origina naturalmente estará, por definición, sustancialmente libre de sus componentes asociados de forma natural. De acuerdo con ello, las proteínas sustancialmente puras incluyen proteínas eucarióticas sintetizadas en E.coli, en otros procariotas o en cualquier otro organismo en el que no se encontraría de forma natural.

Además de las proteínas sustancialmente completas, la invención también incluye fragmentos (p.ej., fragmentos antigénicos) de la proteína TADG-15 (SEC. ID. nº 2). Como se usa en la presente memoria, el término "fragmento" cuando se aplica a un polipéptido, comúnmente será de al menos 10 restos, más normalmente de al menos 20 restos y preferiblemente de al menos 30 (p. ej., 50) restos de longitud, pero menos que la secuencia intacta entera. Los fragmentos de la proteína TADG-15 se pueden generar por métodos conocidos por los expertos en la técnica, p.ej., por digestión enzimática de la proteína TADG-15 recombinante o producida por medios naturales, por técnicas de ADN recombinante que usan un vector de expresión que codifica un fragmento definido de TADG-15, o por síntesis química. La capacidad de un fragmento candidato para exhibir una característica de TADG-15 (p. ej., unión a un anticuerpo específico para TADG-15) se puede evaluar por métodos descritos en la presente memoria. La TADG-15 purificada o los fragmentos antigénicos de TADG-15 se pueden utilizar para generar nuevos anticuerpos o para probar los anticuerpos existentes (p. ej., como controles positivos en un análisis de diagnóstico) empleando protocolos estándares conocidos por los expertos en la técnica. En la presente invención se incluyen antisueros policlonales generados mediante el uso de TADG-15 o un fragmento de TADG-15 como el inmunógeno en, p. ej., conejos. Se emplean protocolos estándares para la producción de anticuerpos monoclonales y policlonales conocidos por los expertos en esta técnica. Los anticuerpos monoclonales generados por este procedimiento se pueden rastrear por la capacidad de identificar clones recombinantes con ADNc de TADG-15 y distinguirlos de clones de ADNc conocidos.

Además en la presente invención se incluyen proteínas TADG-15 que se codifican al menos en parte por porciones de la SEC. ID. nº 2; p. ej., los productos de ayuste alternativo del ARNm o procesamientos alternativos de la proteína o en los que se ha borrado una sección de la secuencia de TADG-15. El fragmento, o el polipéptido intacto de TADG-15, puede unirse covalentemente a otro polipéptido, p. ej., que actúe como una marca, un ligando o un medio para aumentar la antigenicidad.

La invención también incluye un anticuerpo monoclonal o policlonal que se une específicamente a TADG-15. La invención comprende no sólo un anticuerpo monoclonal intacto sino también un fragmento de anticuerpo inmunológicamente activo, p. ej., un fragmento Fab o (Fab)_{2}, una molécula de Fv monocatenaria generada en el laboratorio, o una molécula quimérica, p. ej., un anticuerpo que contiene la especificidad de unión de un anticuerpo, p. ej., de origen murino, y las porciones restantes de otro anticuerpo, p. ej., de origen humano.

En una realización, el anticuerpo, o un fragmento del mismo, puede unirse a una toxina o a un marcador detectable, p. ej., un marcador radioactivo, un marcador isotópico no radioactivo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador paramagnético, un marcador enzimático o un marcador colorimétrico. Ejemplos de toxinas adecuadas incluyen la toxina de la difteria, la exotoxina A de Pseudomonas, la ricina y la toxina del cólera. Ejemplos de marcadores enzimáticos adecuados incluyen la malato-hidrogenasa, la nucleasa estafilocócica, la delta-5-esteroide isomerasa, la alcohol deshidrogenasa, la alfa-glicerol-fosfato deshidrogenasa, la triosa-fosfato isomerasa, la peroxidasa, la fosfatasa alcalina, la asparraginasa, la glucosa oxidasa, la beta-galactosidasa, la ribonucleasa, la ureasa, la catalasa, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, la glucoamilasa, la acetilcolinesterasa, etc. Ejemplos de marcadores radioisotópicos adecuados incluyen ^{3}H, ^{125}I, ^{131}I, ^{32}P, ^{35}S, ^{14}C, etc.

También se pueden utilizar isótopos paramagnéticos con el propósito de un diagnóstico in vivo de acuerdo con los métodos de esta invención. Hay numerosos ejemplos de elementos que resultan útiles en la resonancia magnética nuclear. Sobre discusiones a cerca de las imágenes de resonancia magnética nuclear in vivo, véase, por ejemplo, Schaefer et al, (1989), JACC 14, 472-480; Shreve et al, (1986), Magn. Reson. Med., 3, 336-340; Wolf, G. L., (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 93-95; Wesbey et al., (1984) Physiol. Chem. Med. NMR 16, 145-155; Runge et al., (1984) Invest. Radiol. 19, 408-415. Ejemplos de marcadores fluorescentes adecuados incluyen la fluoresceína, el isotiocianato, la rodamina, la ficoeritrina, la ficocianina, la aloficocianina, el oftaldehído, la fluorescamina, etc. Ejemplos de marcadores quimioluminiscentes incluyen el luminal, el isoluminal, el éster acridínico aromático, el imidazol, la sal acridínica, el éster de oxalato, la luciferina, la luciferasa, la ecuorina, etc.

Los expertos en la técnica conocerán otros marcadores adecuados que pueden emplearse de acuerdo con la presente invención. La unión de estos marcadores a anticuerpos o a fragmentos de los mismos se puede lograr utilizando técnicas estándares comúnmente conocidas por aquellos que dominan la técnica común. En Kennedy et al., (1976), Clin. Chim. Acta 70, 1-31 y Schurs et al., (1977) Clin. Chim. Acta 81, 1-40 se describen las técnicas características. Las técnicas fijadoras mencionadas en el último son el método del glutaraldehído, el método del peryodato, el método de la dimaleimida, el método del éster de m-maleimidobencil-N-hidroxi-sucinimida. Todos estos métodos se han incorporado mediante referencia en la presente memoria.

También dentro de la invención se encuentra un método para detectar la proteína TADG-15 en una muestra biológica que incluye las etapas de poner en contacto la muestra con el anticuerpo marcado, p. ej., un anticuerpo específico etiquetado radioactivamente que es específico de TADG-15, y determinar si el anticuerpo se une a un componente de la muestra.

Como se describe en la presente memoria, la invención proporciona numerosas ventajas y usos diagnósticos. Por ejemplo, la proteína TADG-15 resulta útil en el diagnóstico de cáncer en diferentes tejidos ya que esta proteína se sobreexpresa mucho en las células tumorales. Resultan útiles los anticuerpos (o fragmentos de los mismos que se unen al antígeno) que se unen a un epítopo específico de TADG-15 en un método para detectar la proteína TADG-15 en una muestra biológica para el diagnóstico de transformación neoplásica o cancerosa. Este método incluye las etapas de obtención de una muestra biológica (p. ej., células, sangre, plasma, tejido, etc.) de un paciente sospechoso de tener cáncer, poner en contacto la muestra con un anticuerpo marcado (p. ej., un anticuerpo marcado radioactivamente) específico para TADG-15 y la detección de la proteína TADG-15 utilizando técnicas estándares de inmunoanálisis como un ELISA. La unión del anticuerpo a una muestra biológica indica que la muestra contiene un componente que se une específicamente a un epítopo en TADG-15.

Igualmente, se puede utilizar un análisis de transferencia Northern estándar para averiguar las cantidades relativas del ARNm de TADG-15 en una célula o en un tejido obtenido de un paciente sospechoso de tener cáncer, de acuerdo con las técnicas de hibridación Northern convencionales conocidas por aquellos que dominan la técnica. El análisis Northern utiliza una sonda de hibridación, p. ej., un ADNc de TADG-15 radiomarcado, tanto si contiene el ADN monocatenario completo que posee una secuencia complementaria a la SEC. ID. nº 1 (figura 9) o un fragmento de esa secuencia de ADN de una longitud de al menos 20 (preferiblemente de al menos 30, más preferiblemente de al menos 50 y mucho más preferiblemente de al menos 100) nucleótidos consecutivos. La sonda de hibridación de ADN se puede marcar por cualquiera de los muchos y diferentes métodos conocidos por aquellos que dominan esta técnica.

Se pueden utilizar anticuerpos contra la proteína TADG-15 en un inmunoanálisis para detectar niveles incrementados de expresión de la proteína TADG-15 en los tejidos en los que se sospecha la transformación neoplásica. Estos mismos usos se pueden lograr con ensayos y análisis de transferencia Northern.

La presente invención se dirige al ADN que codifica una proteína TADG-15 seleccionado de un grupo que consta de: a) ADN aislado que codifica una proteína TADG-15 y b) ADN aislado que es distinto del ADN aislado de a) en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético y que codifica una proteína TADG-15. Preferiblemente, el ADN tiene la secuencia mostrada en la SEC. ID. nº 1. Más preferiblemente, el ADN codifica una proteína TADG-15 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº 2.

La presente invención también se dirige a un vector capaz de expresar el ADN de la presente invención destinado a la expresión en una célula recombinante y a los elementos reguladores necesarios para expresar el ADN en la célula. Preferiblemente, el vector contiene el ADN que codifica una proteína TADG-15 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº 2.

La presente invención también se dirige a una célula hospedadora transfectada con el vector descrito en la presente memoria, en la que dicho vector expresa una proteína TADG-15. Las células hospedadores representativas incluyen células bacterianas, células de mamíferos y células de insectos.

La presente invención también se dirige a una proteína TADG-15 aislada y purificada, codificada por el ADN seleccionado del grupo que consta de: a) ADN aislado que codifica una proteína TADG-15 y b) ADN aislado que es distinto del ADN aislado de a) en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético y que codifica una proteína TADG-15. Preferiblemente, la proteína TADG- 15 aislada y purificada de la reivindicación 9 contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº 2.

La presente invención también se dirige a un método para detectar la expresión de la proteína de la reivindicación 1, que comprende las etapas de: a) poner en contacto el ARNm obtenido de la célula con la sonda de hibridación marcada; y b) detectar la hibridación de la sonda con el ARNm.

Se proporcionan los siguientes ejemplos con el propósito de ilustrar varias realizaciones de la invención y que no pretenden limitar de ninguna manera la presente invención.

Ejemplo 1 Recogida de tejidos y almacenamiento

Con una histerectomía, una ovariosalpingectomía bilateral o una retirada quirúrgica del tejido neoplásico en el paciente, se recupera el espécimen y se coloca en hielo. A continuación, el espécimen se llevó al histopatólogo residente para aislar e identificar las muestras específicas del tejido. Finalmente, la muestra se congeló en nitrógeno líquido, se registró en el historial del laboratorio y se almacenó a -80ºC. Se obtuvieron frecuentemente especímenes adicionales de la Red Cooperativa de Tejidos Humanos (Cooperative Human Tissue Network, CHTN). La CHTN nos preparó y envió estas muestras en nieve carbónica. A su llegada, estos especímenes se registraron en el historial del laboratorio y se almacenaron a -80ºC.

Ejemplo 2 Aislamiento del ARNm y síntesis del ADNc

Se obtuvieron 41 tumores de ovario (10 tumores con poco potencial maligno y 31 carcinomas) y 10 ovarios normales de especímenes quirúrgicos y se congelaron en nitrógeno líquido. Las líneas celulares SW 626 y Caov 3 de carcinoma de ovario humano, las líneas celulares MDA-MB-231 y MDA-MB-435S de carcinoma de mama humano y la línea celular Hela del carcinoma cervical uterino humano se adquirieron a la American Type Culture Collection (Rockville, MD). Las células se cultivaron a subconfluencia en el medio de Eagle modificado del de Dulbecco, y se suspendieron con suero bovino fetal al 10% (v/v) y antibióticos.

El aislamiento del ARN mensajero (ARNm) se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el kit de aislamiento de ARNm Mini RiboSep™ Ultra adquirido a Becton Dickinson (referencia del catálogo 30034). Se trataba de un sistema de aislamiento de ARNm basado en una cromatografía con oligo(dT). La cantidad de ARNm recuperada se cuantificó por espectrofotometría de rayos ultravioleta.

La primera cadena del ADN complementario (ADNc) se sintetizó utilizando 5,0 mg de ARNm y tanto hexámeros al azar como cebadores oligo(dT) de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando un kit de síntesis de la primera cadena de Clontech (referencia del catálogo K1402-1). La pureza del ADNc se evaluó por PCR utilizando cebadores específicos del gen de p53. Estos cebadores amplifican un intrón de manera que se puede distinguir el ADNc puro del ADNc contaminado con ADN genómico.

Ejemplo 3 Reacciones de PCR

La sobreexpresión del ARNm de TADG-15 se determinó utilizando una PCR cuantitativa. Los cebadores oligonucleotídicos se utilizaron para: TADG-15, el directo 5'-ATGACAGAGGATTCAGGTAC-3' (SEC. ID. nº 10) y el inverso 5'-GAAGGTGAAGTCATTGAAGA-3' (SEC. ID. nº 11); y la \beta-tubulina, el directo 5'-TGCATTGACAAC
GAGGC-3'(SEC. ID. nº 12) y el inverso 5'-CTGTCTTGACATTGTTG-3' (SEC. ID. nº 13). La \beta-tubulina se utilizó como control interno. Las reacciones se realizaron de la siguiente manera: la primera cadena del ADNc generado a partir de 50 ng de ARNm se utilizará como molde en presencia de MgCl_{2} 1,0 mM, dNTP 0,2 mM , 0,025 U de Taq polimerasa por mililitro de reacción y el tampón suministrado con enzima a 1X. Además, deben añadirse los cebadores a la reacción de PCR. Los cebadores degenerados que pueden amplificar varios tipos de ADNc se utilizan a una concentración final de 2,0 mM cada uno, mientras que los cebadores que amplifican los ADNc específicos se añaden a una concentración final de 0,2 mM cada uno.

Después de una desnaturalización inicial a 95ºC durante 3 minutos, se realizan treinta ciclos de PCR en un termociclador Gene Amp 2400 de Perkin Elmer. Cada ciclo consta de 30 segundos de desnaturalización a 95ºC, 30 segundos de hibridación del cebador a la temperatura de hibridación adecuada y 30 segundos de extensión a 72ºC. El último ciclo se extenderá a 72ºC durante 7 minutos. Para asegurarse de que la reacción tuvo éxito, se migrará una fracción
de la mezcla de reacción en una electroforesis en un gel de agarosa/TAE al 2% teñido con bromuro de etidio (con-
centración final de 1 mg/ml). La temperatura de hibridación varía de acuerdo con los cebadores que se usan en la reacción de PCR. Para las reacciones que implican cebadores degenerados se utilizó una temperatura de hibridación de 48ºC. La temperatura de hibridación adecuada para los cebadores específicos de la TADG-15 y la \beta-tubulina es de 62ºC.

Ejemplo 4 Ligación al vector-T y transformaciones

Los productos purificados de la PCR se ligan con el plásmido vector-T de Promega y los productos de la ligación se utilizan para transformar las células competentes JM109 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega, referencia en el catálogo A3610). Las colonias positivas se cultivaron para amplificarlas, el ADN plasmídico se aisló por medio del sistema de purificación de ADN Wizard™ Minipreps (Promega, referencia en el catálogo A7500) y los plásmidos se digirieron con las enzimas de restricción ApaI y SacI para determinar el tamaño del inserto. Se secuenciaron los plásmidos cuyos insertos eran del tamaño (o tamaños) visualizado(s) mediante la electroforesis en gel del producto de la PCR descrita anteriormente.

Ejemplo 5 Secuenciación de ADN

Se realizaron las reacciones de secuenciación utilizando los terminadores PRISM™ Ready Reaction Dye Deoxy™ (Applied Biosystems, referencia en el catálogo 401384) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y usando un cebador específico del plásmido cercano al sitio de la clonación. Los terminadores colorantes residuales se retiraron de la reacción de secuenciación completada utilizando una columna centrifugable Centrisep™ (Princenton Separation, referencia en el catálogo CS-901). Se dispuso de un sistema de secuenciación de ADN Applied Biosystems Model 373A y se utilizó para el análisis de secuencias. Basándose en la secuencia determinada, se diseñaron y se sintetizaron cebadores que amplifican específicamente el gen de interés.

Ejemplo 6 Análisis por transferencia Northern

Se separaron según el tamaño 10 \mug de ARNm por electroforesis en un gel formaldehído-agarosa al 1% en MOPS 0,02 M, acetato sódico 0,05 M (pH 7,0) y EDTA 0,001 M. A continuación, los ARNm se transfirieron a una membrana Hybond-N (Amersham) por capilaridad en SSPE a 20X. Los ARN se fijaron a la membrana en un horno durante 2 horas a 80ºC. Se adquirieron a CLONTECH Laboratories, Inc más membranas para Northern con muestras de múltiples tejidos (MTN). Estas membranas incluyen la membrana Human MTN (referencia en el catálogo7760-1), la membrana Human MTN II (referencia en el catálogo 7759-1), la membrana Human Fetal MTN II (referencia en el catálogo 7756-1) y la membrana Human Brain MTN III (referencia en el catálogo 7750-1). Las sondas adecuadas se marcaron radiactivamente utilizando el sistema de marcación Prime-a-Gene disponible de Promega (referencia en el catálogo U1100). Las transferencias se hibridaron y deshibridaron de acuerdo con el protocolo ExpressHyb Hybridization Solution disponible de CLONTECH (referencia en el catálogo 8015-1 ó 8015-2).

Ejemplo 7 PCR cuantitativa

La PCR cuantitativa se realizó en una mezcla de reacción que consta del ADNc derivado de 50 ng de ARNm, 5 pmol de los cebadores sentido y antisentido de TADG-15 y del control interno de la \beta-tubulina, 0,2 mmol de los dNTP, 0,5 mCi de [\alpha-^{32}P]dCTP y 0,625 U de Taq polimerasa en tampón a 1X en un volumen final de 25 \mul. La mezcla se sometió a 1 minuto de desnaturalización a 95ºC seguida de 30 ciclos de desnaturalización durante 30 segundos a 95ºC, 30 segundos de hibridación a 62ºC y 1 minuto de extensión a 72ºC con 7 minutos adicionales de extensión en el último ciclo. El producto se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 2% para la separación, el gel se secó al vacío y se autorradiografió. Se determinó la radioactividad relativa de cada banda con el PhosphoImager de Molecular Dynamics.

Ejemplo 8

La presente invención describe el uso de cebadores dirigidos a áreas conservadas de la familia de serín-proteasas para identificar los miembros de esa familia que se sobreexpresan en carcinomas. Se han identificado y clonado varios genes en otros tejidos, pero no se habían asociado anteriormente con el carcinoma de ovario. La presente invención describe una proteasa identificada en carcinoma de ovario. Este gen se identificó utilizando cebadores para el área conservada que rodea el aminoácido conservado histidina en el dominio catalítico y la del aminoácido conservado serina más abajo que se localiza en torno a 150 aminoácidos hacia el extremo carboxilo de la proteasa.

El gen que codifica la nueva serina-proteasa extracelular de la presente invención se identificó de un grupo de proteasas sobreexpresadas en carcinomas por subclonación y secuenciación de los productos adecuados de la PCR. En la figura 1 se proporciona un ejemplo de semejante reacción de PCR. La subclonación y la secuenciación de las bandas de tal amplificación proporcionaron una base para identificar la proteasa de la presente invención.

Ejemplo 9

La secuencia determinada para el dominio catalítico de TADG-15 se muestra en la figura 2 y es coherente con otras serina-proteasas y contiene específicamente aminoácidos conservados adecuados para el dominio catalítico de la familia de las serina-proteasas del tipo de la tripsina. Se utilizaron cebadores específicos (20-meros) derivados de esta secuencia.

Se examinaron una serie de ADNc tumorales y normales para determinar la expresión del gen de la TADG-15 en carcinoma de ovario. En una serie de ADNc derivados de células normales comparados con los ADNc derivados de carcinoma utilizando la \beta-tubulina como control interno para la amplificación por PCR, la TADG-15 estaba significativamente sobreexpresada en todos los carcinomas examinados y en el tejido epitelial normal, o bien no se detectó, o se detectó en un nivel muy bajo (figura 3). Esta evaluación se amplió a una lista estándar de unos 40 tumores. Utilizando estos cebadores específicos, también se examinó la expresión de este gen en líneas celulares tumorales derivadas tanto de tejidos de carcinoma de ovario como de mama, como se muestra en la figura 5, y en otros tejidos tumorales como se muestran en la figura 6. La expresión de TADG-15 también se observó en carcinomas de mama, de colon, de próstata y de pulmón.

Utilizando la secuencia específica para TADG-15 que cubre todo el dominio del sitio catalítico como sonda en los análisis de transferencia Northern, se examinaron tres transferencias Northern: una derivada de tejidos de ovario, tanto normales como de carcinomas, otra de tejidos fetales y otra de tejidos normales de adultos. Como se muestra en la figura 7, se detectaron los transcritos de TADG-15 en todos los carcinomas de ovario, pero no estaban presentes en cantidades detectables en ninguno de los siguientes tejidos: a) ovario normal, b) hígado y cerebro fetales, c) bazo, timo, testículos, ovario y linfocitos de sangre periférica de adultos, d) músculo esquelético, hígado, cerebro o corazón. El tamaño del transcrito resultó ser de unas 3,2 kb aproximadamente. La hibridación para las transferencias de adultos y de fetos fue adecuada y se realizó con la misma sonda que en el tejido de ovario. Posteriormente a este examen, se confirmó que estas transferencias contenían otros ARNm transcritos detectables de ARNm.

Utilizando inicialmente un dominio catalítico de la proteasa para rastrear las genotecas de ADNc de tumores de ovario y de ADNc de Hela, se obtuvo un clon que cubría todo el extremo 3' del gen de la TADG-15 en la genoteca de tumor de ovario. En un examen posterior usando el extremo 5' de los clones recientemente detectados, se identificaron dos clones más que cubrían el extremo 5' del gen de la TADG-15 en la genoteca de Hela (figura 8). La secuencia nucleotídica completa (SEC. ID. nº 1) se proporciona en la figura 9 junto con la traducción del marco de lectura abierto (SEC. ID. nº 2).

En la secuencia de nucleótidos hay una secuencia Kozak típica de las secuencias hacia 5' del sitio de inicio de traducción. También se encuentra una secuencia de señal de poliadenilación y una cola de poliadenilatos. El marco de lectura abierto consta de una secuencia de 855 aminoácidos (SEC. ID. nº 2) que incluye una cola citoplasmática amino-terminal desde los aminoácidos 1 a 50, un domino transmembranario de 22 aminoácidos aproximadamente seguido por una secuencia extracelular que precede a dos repeticiones CUB identificadas de los subcomponentes complementarios Clr y Cls. Estas dos repeticiones están seguidas por cuatro dominios con repeticiones de un motivo de clase A del receptor LDL y estas cuatro repeticiones están seguidas por la enzima proteásica de la familia de la tripsina que forma el extremo carboxilo de la proteína TADG-15 (figura 11). También se sitúan claramente (figura 10) la serie de histidina, ácido aspártico y serina conservadas en el dominio catalítico junto con una serie de aminoácidos conservados en la familia de las serina-proteasas.

Una búsqueda en GeneBank de secuencias similares identificadas previamente produjo una secuencia semejante con una homología relativamente elevada con una porción del gen de la TADG-15. La similitud entre la porción de la TADG-15 entre los nucleótidos 182 al 3139 y SNC-19 (SEC. ID. nº 9; acceso al GeneBank nº U20428) es en torno al 97% (figura 12). No obstante, existen diferencias importantes entre SNC-19 y TADG-15, a saber, TADG-15 tiene un marco de lectura abierto (ORF) de 855 aminoácidos mientras que el ORF más largo de SNC-19 sólo tiene 173 aminoácidos. SNC-19 no incluye un sitio de iniciación adecuado para comenzar de traducción ni incluye la porción amino-terminal de la proteína codificada por TADG-15. Es más, SNC-19 no incluye un ORF para una serín-proteasa funcional porque los restos His, Asp y Ser necesarios para la función están codificados en marcos de lectura diferentes.

TADG-15 es un gen que se sobreexpresa considerablemente en los tumores. Se expresa en un número limitado de tejidos normales, principalmente tejidos que están implicados tanto en la toma como en la secreción de moléculas, p. ej., colon y páncreas. TADG-15 además es novedosa en la estructura constituyente de sus dominios en cuanto tiene un dominio catalítico proteásico que se puede liberar y utilizar como un diagnóstico y que sería posible utilizar como diana de una intervención terapéutica. TADG-15 también tiene dominios que se unen a ligandos que normalmente se asocian con moléculas que internalizan o toman ligandos de la superficie exterior de la célula como hace el receptor LDL con el complejo de colesterol y LDL. Cabe la posibilidad de que estos dominios puedan estar implicados en la toma de ligandos específicos y de que pudieran utilizarse para llevar moléculas tóxicas o genes a las células tumorales que expresan esta molécula en su superficie. Tiene características similares a la molécula de la serín-proteasa hepsina en cuanto que ésta también contiene un dominio transmembranario amino-terminal con el dominio catalítico proteolítico proyectado hacia la matriz extracelular. La diferencia aquí radica en que TADG-15 presenta estos dominios con la repetición de unión a ligandos que el gen de la hepsina no contiene. Además del uso de este gen para diagnóstico o diana terapéutica del carcinoma de ovario y otros carcinomas que incluyen el carcinoma de mama, de próstata, de pulmón y de colon, sus dominios de unión a ligando pueden ser valiosos para introducir moléculas específicas en las células tumorales.

Cualquiera de las patentes o publicaciones mencionadas en esta especificación son indicativas del nivel de conocimiento de los expertos en la técnica a la que concierne la invención. El experto en la técnica fácilmente se dará cuenta de que la presente invención se adapta bien para llevar a cabo los objetos y alcanzar los fines y las ventajas mencionados, así como aquellos inherentes en ésta. Los ejemplos actuales junto con los métodos, los procedimientos, los tratamientos, las moléculas y los compuestos específicos descritos en la presente memoria son actualmente representativos de las realizaciones preferidas, son ejemplares y no se destinan a limitar el alcance de la invención. Los expertos en la técnica encontrarán otros usos y realizarán cambios en ella que están incluidos dentro del espíritu de la invención tal como define el alcance de las reivindicaciones

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<110> O'Brien, Timothy J.

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Taninomoto, Hirotoshi.

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<120> TADG-15: una serina-proteasa extracelular sobreexpresada en carcinomas de mama y de ovario.

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<130> D6064PCT

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<140> PCT/US99/03436

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<141> 18/02/1999

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<150> US 09/027, 337

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<151> 20/02/1998

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<160> 14

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<210> 1

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<211> 3147

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<223> Secuencia de ADNc de TADG-15

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<400> 1

1

2

3

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 855

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos de TADG-15 codificada por el ADNc

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 2

4

5

6

7

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 256

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Dominio catalítico serina-proteásico de la hepsina (Heps) homólogo al dominio similar en TADG-15.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 3

8

80

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 225

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Dominio catalítico serina-proteásico de la Scce homólogo al dominio similar en TADG-15.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 4

9

10

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 225

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Dominio catalítico serina-proteásico de la tripsina (Try) homólogo al dominio similar en TADG-15.

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 5

11

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 231

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Dominio catalítico serina-proteásico de la quimotripsina (Chymb) homólogo al dominio similar en TADG-15.

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 6

12

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 255

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Dominio catalítico serina-proteásico del factor 7 (Fac 7) homólogo al dominio similar en TADG-15.

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 7

13

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 253

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Dominio catalítico serina-proteásico del activador del plasminógeno tisular (Tpa) homólogo al dominio similar en TADG-15.

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 8

14

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 2900

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Secuencia de ARNm de SNC19 (U20428)

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 9

15

16

160

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

SEC 14/17

\vskip0.333000\baselineskip

<221> Cebador

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Cebador directo para el análisis de la sobreexpresión del ARNm de TADG-15 por PCR cuantitativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgacagagg attcaggtac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> Cebador

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Cebador reverso para el análisis de la sobreexpresión del ARNm de TADG-15 por PCR cuantitativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaggtgaag tcattgaaga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> Cebador

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Cebador directo para el análisis de la expresión del ARNm de la \beta-tubulina por PCR cuantitativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcattgaca acgaggc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> Cebador

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Cebador reverso para el análisis de expresión del ARNm de la \beta-tubulina por PCR cuantitativa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgtcttgac attgttg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

SEC 15/17

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 242

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Dominio catalítico serina-proteásico de TADG-15.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 14

17

170

Claims (10)

1. Un ADN aislado que codifica una proteína TADG-15 siendo dicho ADN seleccionado del grupo que consta de:

a) ADN aislado que consta de la SEC. ID nº 1, y

b) ADN aislado que difiere del ADN aislado de a) en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético y que codifica una proteína TADG-15.

2. El ADN de la reivindicación 1, en el que dicha proteína TADG-15 consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº 2.

3. Un vector que comprende el ADN de la reivindicación 1 y los elementos reguladores necesarios para la expresión del ADN en la célula.

4. El vector de la reivindicación 3, en el que dicho ADN codifica una proteína TADG-15 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº 2.

5. Una célula hospedadora transfectada con el vector de la reivindicación 3, en la que dicho vector expresa una proteína TADG-15.

6. La célula hospedadora de la reivindicación 5, en la que dicha célula se selecciona del grupo que consta de células bacterianas, células de mamíferos, células de plantas y células de insectos.

7. La célula hospedadora de la reivindicación 6, en la que dicha célula bacteriana es E. coli.

8. La proteína TADG-15 purificada y aislada, codificada por un ADN seleccionado del grupo que consta de:

a) ADN aislado que consta de la SEC. ID. nº 1; y

b) ADN aislado que difiere del ADN aislado de a) en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético y que codifica una proteína TADG-15.

9. La proteína TADG-15 aislada y purificada de la reivindicación 8, dicha proteína consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº 2.

10. Un método de detección de la expresión de la proteína de la reivindicación 8, que comprende las etapas:

a) poner en contacto el ARNm obtenido de la célula con la sonda de hibridación marcada derivada del ADN de la reivindicación 1; y

b) detectar la hibridación de la sonda con el ARNm.