MXPA02004046A

MXPA02004046A - Tadg-15: una serin proteasa extracelular sobre expresada en carcinomas.

Info

Publication number: MXPA02004046A
Application number: MXPA02004046A
Authority: MX
Inventors: J O'brien Timothy
Original assignee: Univ Arkansas
Priority date: 1999-10-20
Filing date: 2000-10-20
Publication date: 2002-10-11
Also published as: JP2003512036A; AU1221501A; EP1887082A2; EP1226150A4; CA2388450C; CA2388450A1; WO2001029056A1; EP1887082A3; AU774106B2; EP1226150A1

Abstract

La presente invencion provee ADN que codifica una proteina TADG-15 asi como una proteina TADG-15; tambien se provee un vector capaz de expresar el ADN de la presente invencion adaptado para expresion en una celula recombinante y elementos reguladores necesarios para la expresion M ADN en la celula; la presente invencion ademas provee metodos para inhibir la expresion de TADG-15 y/o actividad de proteasa, metodos para detectar ARNm de TADG-15 y/o proteina y metodos para seleccionar inhibidores de TADG-15; adicionalmente, la presente invencion provee direccionamiento especifico de celula mediante TADG-15 y metodos para vacunar a un individuo en contra de TADG-15; los metodos descritos son utiles en el diagnostico, tratamiento y prevencion de cancer, particularmente cancer de mama y de ovario.

Description

TADG-15: UNA SERIN PROTEASA EXTRACELULAR SOBREEXPRESADA EN CARCINOMAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 5 REFERENCIA RECIPROCA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud es una continuación en parte de USSN 09/027,337, presentada el 20 de febrero de 1998 y por lo tanto se reclama el beneficio de 10 prioridad bajo 35 USC ?120 CAMPO DE LA INVENCIÓN • La presente invención se refiere generalmente al campo de la 15 biología celular y al diagnóstico de enfermedades neoplásicas. Más específicamente, la presente invención se refiere a una serin proteasa extracelular, denominada gen 15 derivado del antígeno tumoral (TADG-15), la * cual se sobreexpresa en carcinomas. • 20 DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA Las proteasas extracelulares se han asociado directamente con el crecimiento tumoral, dispersión de las células tumorales e invasión de órganos blanco. Las clases individuales de proteasas están implicadas en, pero no limitada a, (a) digestión del estroma que rodea el área del tumor inicial, (b) digestión de las moléculas de adhesión celular para permitir la disociación de las células tumorales; y (c) invasión de la membrana basal para 5 crecimiento metastásico y activación tanto de factores de crecimiento tumoral como de factores angiogénicos. En el proceso de la progresión del cáncer y la invasión, las proteasas median la proteólisis específica y contribuyen a la remoción de componentes de matriz extracelular que rodean las células tumorales, la 10 digestión de las moléculas de adhesión intercelular para permitir la disociación de las células malignas y la activación de muchos factores de crecimiento y factores angiogénicos. 1"3 Dependiendo de la naturaleza de sus dominios catalíticos, las proteasas se clasifican dentro de cuatro familias: serin proteasas, metaloproteasas, proteasas aspárticas y cisteín proteasas. 3 Entre 15 estas proteasas, las metaloproteasas se han estudiado bien en relación con el crecimiento tumoral y a su progresión, y se sabe que son capaces de degradar la matriz extracelular, por lo tanto mejorando el potencial invasivo de «* las células malignas. 1?5 Para serin proteasas, los estudios previos han • demostrado una producción incrementada del activador plasminógeno en las 20 células tumorales y una correlación positiva entre la actividad del activador plasminógeno y la agresividad del cáncer. 6 7 El antígeno específico de próstata (una serin proteasa) también se ha utilizado ampliamente como un indicador del crecimiento anormal de la próstata. 8 Más recientemente, varias otras serin proteasas se han reportado, por ejemplo hepsina y la enzima quimotríptica de estrato córneo (SCCE), las cuales se sobreexpresa en el cáncer de ovario y las cuales pueden contribuir a la progresión maligna al incrementar la actividad lítica extracelular de estas células tumorales.9 La técnica precedente es deficiente en la carencia de medios efectivos de seleccionar para identificar proteasas sobreexpresadas en carcinoma. La presente invención satisface estas necesidades pendientes y deseoso en la técnica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención describe un programa de selección para identificar proteasas sobreexpresadas en carcinoma al examinar los productos amplificados por PCR utilizando disposición diferencial en los tumores de etapa temprana y en los tumores metastásicos en comparación con el de los tejidos normales. El método en la presente para identificar genes candidatos sobreexpresados en células tumorales ha sido el utilizar los dominios bien conservados que rodean la tríada de aminoácidos (His-Asp-Ser) prototípica del dominio catalítico de las serin proteasas. En la presente, se presenta evidencia para una forma única de serin proteasa no previamente descrita en la literatura la cual se expresa altamente en carcinomas de ovario. A través del método de selección utilizando amplificación diferencial por PCR de tejido normal, carcinoma potencial de baja malignidad y carcinoma evidente, un i"*»!**»* <f i * * producto de PCR presente solamente en el carcinoma se subclonó y se secuenció, y se encontró que tiene un dominio catalítico el cuerpo consistente con la familia serin proteasa. En la presente se reporta la clonación completa y secuenciación de este transcrito y la evidencia de su expresión en las células tumorales de ovario. En una modalidad de la presente invención, se provee un ADN que codifica una proteína del gen derivado del antígeno tumoral (TADG-15), seleccionado a partir de los siguientes: (a) un ADN aislado el cual codifica una proteína TADG-15; (b) un ADN aislado el cual hibrida bajo condiciones de alta severidad con el ADN de (a) anteriormente mencionado y el cual codifica una proteína TADG-15; y (c) un ADN aislado que difiere a partir de los ADN aislados de (a) y (b) anteriormente mencionados en la secuencia del codón debido a la degeneración del código genético, y el cual codifica una proteína TADG-15. La modalidad adicionalmente incluye un vector que comprende el ADN de TADG-15 y elementos reguladores necesarios para la expresión del ADN en una célula. Adicionalmente considerado está un vector en el cual el ADN de TADG-15 está ubicado en una orientación reversa con relación a los elementos reguladores de manera que se produce un ARNm antisentido de TADG-15. En otra modalidad de la presente invención, se provee una proteína TADG-15 aislada y purificada codificada mediante un ADN seleccionado a partir de los siguientes:(a) un ADN aislado el cual codifica una proteína TADG-15; (b) un ADN aislado el cual hibrida bajo condiciones de alta severidad con el ADN de (a) anteriormente mencionado y el cual codifica una proteína TADG-15; y (c) un ADN aislado que difiere a partir de los ADN aislados de (a) y (b) anteriormente mencionados en la secuencia del codón debido a la degeneración del código genético, y el cual codifica una proteína TADG-15. En incluso otra modalidad de la presente invención, se provee un método para detectar ARNm de TADG-15 en una muestra, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto una muestra con una sonda la cual es específica para TADG-15; y (b) detectar la unión de la sonda al ARNm de TADG-15 en la muestra. En incluso otra modalidad de la presente invención, se provee un equipo para detectar ARNm de TADG-15, que comprende: una sonda oligonucleótida específica para TADG-15. Una marca para detección se considera adicionalmente en el equipo. La presente invención adicionalmente considera un método para detectar la proteína TADG-15 en una muestra, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto una muestra con un anticuerpo el cual es específico para TADG-15 o un fragmento del mismo; y (b) detectar la unión del anticuerpo a la proteína TADG-15 en la muestra. Similarmente, la presente invención también considera un equipo para detectar proteína TADG-15, que comprende: un anticuerpo específico para proteína TADG-15 o un fragmento de la misma. Medios para detección del anticuerpo se considera adicionalmente en el equipo.

En otra modalidad, la presente invención provee un anticuerpo específico para la proteína TADG-15 o un fragmento de la misma. En incluso otra modalidad, la presente invención provee un método para seleccionar compuestos que inhiben TADG-15, que comprende 5 los pasos de: (a) poner en contacto una muestra que comprende proteína TADG-15 con un compuesto; y (b) ensayar para la actividad proteasa de TADG-15. Típicamente, una disminución en la actividad proteasa de TADG-15 # en la presencia del compuesto en relación con la actividad proteasa de TADG- 15 en la ausencia del compuesto es indicativa de un compuesto que inhibe 10 TADG-15 En incluso otra modalidad de la presente invención, se provee un método para inhibir la expresión de TADG-15 en una célula, comprendiendo el pasos de: (a) introducir un vector dentro de una célula, en donde la expresión detector produce ARNm antisentido de TADG-15 en las células del cual 15 hibrida al ARNm endógeno de TADG-15, por lo tanto inhibiendo la expresión de TADG-15 en la célula. Además considerado por la presente invención, se provee un método para inhibir una proteína TADG-15 en una célula, que comprende el paso de: (a) introducir un anticuerpo específico para una proteína TADG-15 o 20 un fragmento de la misma dentro de una célula, en donde la unión del anticuerpo a la proteína TADG-15 inhibe la proteína TADG-15. En una modalidad de la presente invención, se provee un método para dirigir terapia a un individuo, que comprende los pasos de: (a) administraron compuesto que contiene una porción direccionadora y una porción terapéutica a un individuo, en donde la porción direccionadora es específica para TADG-15. En una modalidad de la presente invención, se provee un método para diagnosticar cáncer en un individuo, que comprende los pasos de: (a) obtener una muestra biológica a partir de un individuo; y (b) detectar TADG-15 en la muestra, en donde la presencia de TADG-15 en la muestra es indicativa de la presencia de carcinoma en el individuo y la ausencia de TADG-15 en la muestra es indicativa de la ausencia de carcinoma en el individuo. En otra modalidad de la presente invención, se provee un método para vacunar a un individuo en contra de TADG-15, que comprende los pasos de: (a) inocular un individuo, una proteína TADG-15, en donde la inoculación con la proteína TADG-15 o fragmento de la misma produce una respuesta inmune en el individuo, por lo tanto vacunando al individuo en contra de TADG-15. En una modalidad de la presente invención, se provee un método para producir células inmunes activadas dirigidas hacia TADG-15, que comprende los pasos de: exponer células dendríticas a una proteína TADG-15 o fragmento de la misma que carece de actividad proteasa TADG-15, en donde la exposición a dicha proteína TADG-15 o fragmento de la misma activa las células dendríticas, por lo tanto produciendo células inmunes activadas dirigidas hacia TADG-15.

Jt^,J:; fe*?ta»,.^^J..^.^.t.|llfr f|lffi t l & mA~>?i?**l*L?> .» *i L?tÉ?at*?iMlAfrL Jaj En otra modalidad de la presente invención, se provee una composición inmunogénica, que comprende un fragmento inmunogénico o de una proteína TADG-15 y un adyuvante apropiado. Otros aspectos y aspectos, características, y ventajas 5 adicionales de la presente invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción de las modalidades actualmente preferidas de la invención dadas para el propósito de descripción. » BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS 10 Para que el tema en el cual las características anteriormente mencionadas, ventajas y objetivos de la invención, así como otros se aclaren, # se espera que se entiendan en detalle, las descripciones más particulares de la invención brevemente resumidas anteriormente y puedan tener como 15 referencia a ciertas modalidades de las mismas las cuales se ilustran en los dibujos anexos. Estos dibujos forman parte de la especificación. Se debe evidenciar, sin embargo, que los dibujos anexos ilustran modalidades preferidas de la invención y que por lo tanto no deben considerarse como • limitantes de su alcance. 20 La figura 1 muestra una comparación del dominio catalítico de serin proteasa de TADG-15 con Hepsina (Heps, SEQ ID NO. 3), SCCE (SEQ ID NO. 4), Tripsina (Try, SEQ ID NO. 5), Quimotripsina (Chymb, SEQ ID NO. 6), Factor 7 (Fac7, SEQ ID NO. 7) y activador de tejido del plasminógeno (Tpa, SEQ ID NO. 8). Los * indican aminoácidos conservados de tríadas catalíticas. La figura 2 muestra la secuencia nucleotídica del ADNc de TADG-15 y la secuencia derivada de aminoácidos de la proteína TADG-15. El codón de inicio putativo se localiza en los nucleótidos 23-25. La secuencia transmembranal potencial está subrayada. Los sitios de glucosilación adaptados a N están indicados por una línea segmentada. Los asteriscos indican residuos de cisteina conservados del dominio CUB. Los motivos SDE del dominio similar al repetido reunión del ligando al receptor de LDL están marcados en cajas. Las flechas muestran el enlace arginina-valina escindido después de la activación. Los aminoácidos conservados de la tríada catalítica; histidina, ácido aspártico y residuos de serina están en círculos. La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteasa TADG-15, incluyendo los sitios y dominios funcionales. La figura 4 muestra un diagrama de la proteína TADG-15. Uno; dominio citoplásmico, (aa #1-54), 2; dominio transmembranal (aa # 55-57), 3; dominio extracelular (aa # 78-213), 4-5; repetido CUB (aa #214-447), 6-9; motivo similar al repetido de unión al ligando del receptor LDL (motivo clase A) (aa # 453-602), 10; serin proteasa (aa # 615-855). La figura 5 muestra análisis de Northern blot de la expresión del ARNm de TADG-15 en ovario normal, carcinomas de ovario, líneas celulares de carcinoma, tejidos fetales normales y tejidos normales de adulto. Un único transcrito intenso de la TADG-15 se observó en cada sub-tipo de carcinoma y en las dos líneas celulares de carcinoma, SW626 y CAOV3, mientras que ninguna banda visible se detectó en el ovario normal cuenta las dos líneas celulares de cáncer de mama. En los tejidos normales fetales, el riñon fetal mostró un transcrito incrementado y una expresión débil se detectó en el pulmón fetal. En los tejidos normales de adulto, la TADG-15 se detectó en el colon con una baja expresión en el intestino delgado y en la próstata. La figura 6A muestra el análisis de PCR cuantitativo de la expresión de TADG-15. Los niveles de expresión de TADG-15 con relación a la ß-tubulina son significativamente elevados en todos los tumores LMP y en los carcinomas en comparación con el de los ovarios normales, m; mucinoso, s; seroso. La figura 6B muestra la relación de la expresión de TADG-15 a la expresión de ß-tubulina en el ovario normal, tumor LPM y carcinoma de ovario. Los niveles de expresión del ARNm de TADG-15 por la significativamente elevados tanto en el tumor LPM (*; p<0.001 ) y carcinoma (**; p<0.0001 ) en comparación con el del ovario normal. Todas las 10 muestras de ovario normal mostraron un nivel bajo de expresión de TADG-15. La figura 7 muestra la expresión de TADG-15 en las líneas de células tumorales derivadas tanto a partir de tejido de carcinoma de ovario como de mama. La figura 8 muestra la sobreexpresión de TADG-15 en otros tejidos tumorales. La figura 9 muestra los lisados de células SW626 y CAOV3 que se separaron mediante SDS-PAGE y se sometieron a inmunoblot. Las líneas 1 y 2 se probaron con suero de conejo pre-inmune como control negativo. Las líneas 3 y 4 se probaron con anticuerpo poligonal de conejo generado para un péptido carboxi terminal a partir de la secuencia de la proteína TADG-15. La figura 10 muestra la tinción inmunohistoquímica del epitelio de ovario normal (figura 10A) con anticuerpo poligonal a un péptido de proteasa de TADG-15 que no muestra tinción del estroma o del epitelio. Sin embargo, la tinción del anticuerpo de los carcinomas confirma la presencia del expresión de TADG-15 en el citoplasma de un tumor potencial seroso de baja malignidad (figura 10B); un tumor potencial mucinoso de baja malignidad (figura 10C); un carcinoma seroso (figura 10D); y su presencia tanto en el citoplasma como en la superficie celular de un carcinoma de endometrio (figura 10E). La figura 11 muestra una alineación de la secuencia de la proteína TADG-15 de un humano con la de epitina de ratón lo cual demuestra que las proteínas son 84% similares y 81% idénticas a lo largo de 843 aminoácidos. Los residuos que son idénticos entre las dos proteínas se indican por un "-", mientras que el símbolo "*" representa la terminación de la traducción de TADG-15. La diferencia más significativa entre estas dos proteínas yace en el carboxi terminal, el cual para la epitina, incluye 47 aminoácidos que no están presentes en TADG-15. La figura 12 muestra una comparación de secuencia de nucleótidos entre TADG-15 y SNC-19 de humano (número de acceso GeneBank #U20428). stt ' - - - - - DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las proteasas han estado implicadas en la modulación extracelular requerida para el crecimiento tumoral y la invasión. En un esfuerzo por categorizar aquellas proteasas que contribuyen a la progresión del carcinoma de ovario, los iniciadores redundantes dirigidos hacia los dominios conservados de aminoácidos que rodean la tríada catalítica de His, Asp, y Ser se utilizaron para amplificar las serin proteasas expresada diferencialmente en carcinomas. Utilizando este método, una serin proteasa denominada TADG-15 (gen 15 derivado del antígeno tumoral) se ha identificado que se sobreexpresa en tumores de ovario. La TADG-15 parece ser una serin proteasa con multidominios transmembranales. La TADG-15 se sobreexpresa altamente en los tumores de ovario basándose en PCR, Northern blot e inmunolocalización. El ADNc de TADG-15 es de 3147 pares de bases de longitud (SEQ ID NO. 1 ) que codifica para una proteína de 855 aminoácidos (SEQ ID NO. 2). La disponibilidad del gen de TADG-15 provee numerosas utilidades. Por ejemplo, el gen de TADG-15 puede ser utilizado como un blanco diagnóstico o terapéutico en el ovario y en otros carcinomas, incluyendo mama, próstata, pulmón y colon. La presente invención se dirige al ADN que codifica una proteína del gen derivado del antígeno tumoral (TADG-15), seleccionada a partir de lo siguiente: (a) un ADN aislado el cual codifica una proteína TADG-15; (b) un í?^U^J^M-^?^n^?M1MM?^ AD N. aislado el cual hibrida bajo elevadas condiciones de severidad al ADN aislado de (a) anteriormente mencionado y el cual codifica una proteína TADG-15; y (c) un ADN aislado y difiere de los ADN aislados de (a) y (b) anteriormente mencionados en el codón de secuencia debido a la degeneración del código genético, y el cual codifica una proteína TADG-15. Se prefiere que el ADN tenga la secuencia que se muestra en SEQ ID NO. 1 y que la proteína TADG-15 tenga la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO. 2. La presente invención se dirige hacia un vector que comprende el ADN de TADG-15 y los elementos reguladores necesarios para la expresión del ADN en una célula, o un vector en el cual el ADN de TADG-15 está ubicado en orientación reversa con relación a los elementos reguladores de manera que un ARNm antisentido de TADG-15 se produce. Generalmente, el ADN codifica una proteína TADG-15 que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO. 2. La invención también se dirige hacia células hospederas transfectadas con cualquier vector(es) anteriormente descrito. Las células hospederas representativas son células bacterianas, células de mamífero, células vegetales y células de insecto. Preferiblemente, la célula bacteriana es E. coli. La presente invención se dirige hacia una proteína TADG-15 aislada y purificada codificada por un ADN seleccionada partir de los siguientes: (a) un ADN aislado el cual codifica una proteína TADG-15; (b) un ADN aislado el cual hibrida bajo condiciones de alta severidad con el ADN de fe s (a) anteriormente mencionado y el cual codifica una proteína TADG-15; y (c) un ADN aislado que difiere a partir de los ADN aislados de (a) y (b) anteriormente mencionados en la secuencia del codón debido a la degeneración del código genético, y el cual codifica una proteína TADG-15. 5 Preferiblemente, la proteína tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO. 2. La presente invención se dirige hacia un método para detectar ARNm de TADG-15 en una muestra, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto una muestra con una sonda la cual es específica para TADG-15; ío y (b) detectar la unión de la sonda al ARNm de TADG-15 en la muestra. La presente invención también se dirige hacia un método para detectar la proteína TADG-15 en una muestra, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto una muestra con un anticuerpo el cual es específico para TADG-15 o un fragmento del mismo; y (b) detectar la unión del anticuerpo a la proteína 15 TADG-15 en la muestra. Generalmente, la muestra es una muestra biológica; preferiblemente, la muestra biológica es a partir de un individuo; y típicamente, el individuo se sospecha que tiene cáncer. # La presente invención se dirige hacia un equipo para detectar el ^ ARNm de TADG-15, que comprende: una sonda oligonucleótida, en donde la 20 sonda es específica para TADG-15. El equipo puede comprender adicionalmente: una marca con la cual se marca la sonda; y medios para detectar la marca. La presente invención adicionalmente se dirige hacia un equipo para detectar proteína TADG-15, que comprende: un anticuerpo el cual es específico para la proteína TADG-15 o un fragmento de la misma. El equipo puede comprender adicionalmente: medios para detectar el anticuerpo. La presente ¡nvención se dirige hacia un anticuerpo el cual es específico para la proteína TADG-15 o un fragmento de la misma. La presente invención se dirige hacia un método para seleccionar compuestos que inhiben a TADG-15, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto una muestra que contiene la proteína TADG-15 con un compuesto; y (b) ensayar para actividad proteasa de TADG-15. Típicamente, una disminución en la actividad proteasa de TADG-15 en la presencia del compuesto en relación con la actividad proteasa de TADG-15 en la ausencia del compuesto es indicativa de un compuesto que inhibe TADG- 15. La presente invención se dirige hacia un método para inhibir la expresión de TADG-15 en una célula, que comprende el paso de: (a) introducir un vector que expresa ARNm antisentido de TADG-15 dentro de una célula, el cual hibrida al ARNm endógeno de TADG-15, por lo tanto inhibiendo la expresión de TADG-15 en la célula. Generalmente, la inhibición de la expresión de TADG-15 es para tratar cáncer. La presente invención se dirige hacia un método para inhibir una proteína TADG-15 en una célula, que comprende los pasos de: (a) introducir un anticuerpo específico para la proteína TADG-15 o un fragmento de la misma dentro de una célula, el cual inhibe a la proteína TADG-15. Generalmente, la inhibición de la proteína TADG-15 es para tratar cáncer.

La presente invención se dirige hacia un método de terapia dirigida a un individuo, que comprende el paso de: (a) administraron compuesto que tiene una porción direccionadora y una porción terapéutica a un individuo, en donde la porción direccionadora es específica para TADG-15. Las porciones direccionadoras representativas son un anticuerpo específico para TADG-15 y un ligando o dominio de unión a ligando (por ejemplo, CUB, LDLR, proteasa y extra celular) que se une a TADG-15. Similarmente, una porción terapéutica representativa es un radioisótopo, una toxina, un agente quimoterapéutico y estimulantes inmunes. Típicamente, el método anteriormente descrito es útil cuando el individuo padece de cáncer de ovario, cáncer de mama o cáncer de la próstata, pulmón, color y cérvix. La presente invención se dirige hacia un método de diagnóstico de cáncer en un individuo, que comprende los pasos de: (a) obtener una muestra biológica a partir de un individuo; y (b) detectar TADG-15 en la muestra. Generalmente, la presencia de TADG-15 en la muestra es indicativa de la presencia de carcinoma en el individuo, y la ausencia de TADG-15 en la muestra es indicativa de la ausencia de carcinoma en el individuo. Generalmente, la muestra biológica es sangre, fluidos de ascitis, orina, lágrimas, salida o fluido intestinal. Los modos típicos para detectar TADG-15 son mediante Northern blot, Western blot, PCR, dot blot, ELISA, radioinmunoensayo, fragmentos de ADN o marcado de célula tumoral. Este método puede ser útil para diagnosticar cánceres tales como cáncer de ¡.1^ ?- ?Skí2 a. J. i. ,... ? y, ¿-.r ovario, mama y otros cánceres en los que TADG-15 está sobreexpresada, tal como en cánceres de pulmón, próstata y colon. La presente invención también se dirige a un oligonucleótido antisentido que tiene la secuencia nucleotídica complementaria a una secuencia de ARNm de TADG-15. La presente invención también se dirige a una composición que comprende dicho oligonucleótido antisentido de conformidad y un vehículo fisiológicamente aceptable del mismo. La presente invención también se dirige a un método para tratar un estado neoplásico en un síndrome individual en un individuo que necesita de dicho tratamiento, que comprende el paso de administrar ha dicho individuo una dosis efectiva de un oligonucleótido sentido. Preferiblemente, el estado neoplásico se selecciona a partir del grupo que consiste de cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de colon y otros cánceres en los que TADG-15 está sobreexpresada. Para dicha terapia, los oligonucleótidos solos o en combinación con otros agentes anti-neoplásicos pueden formular separa una variedad de modos de administración, incluyendo administración sistémica, tópica o localizada. Las técnicas y formulaciones generalmente pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. El ingrediente activo oligonucleótido generalmente se combina con un vehículo farmacéutica mente aceptable tal como un diluyente o excipiente del cual puede incluir llenadores, extensores, aglutinantes, agentes humectantes, desintegrantes, agentes activos de superficie o lubricantes, dependiendo de la naturaleza del *^t. l&y ^^?SÍ? ?M modo de administración y de la forma de dosis. Las formas típicas de dosis incluyen tabletas, polvos, preparaciones líquidas incluyendo suspensiones, emulsiones, y soluciones, granulos, cápsulas y supositorios, así como preparaciones líquidas para inyecciones, incluyendo preparaciones de liposomas. Para la administración sistémica, se prefiere la inyección, incluyendo intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para inyección, los oligonucleótidos de la invención se formulan en soluciones líquidas, preferiblemente en amortiguadores fisiológicamente compatibles. Además, los oligonucleótidos pueden formularse en forma sólida y redisolverse o suspenderse inmediatamente antes del uso. Las formas liofilizadas también se incluyen. Las dosis que pueden utilizarse para administración sistémica preferiblemente tienen un intervalo de aproximadamente 0.01 mg/kg a 50 mg/kg administradas una vez por dos veces al día. Sin embargo, horarios de dosis diferentes pueden utilizarse dependiendo de (1) la potencia de un oligonucleótido individual que inhiben la actividad de su ADN blanco, (2) la severidad o grado del estado patológico de enfermedad, o (3) la conducta farmacocinética de un oligonucleótido dado. La presente invención se dirige hacia un método de vacunar a un individuo en contra de la sobreexpresión de TADG-15, que comprende los pasos de: (a) inocular a un individuo con una proteína TADG-15 un fragmento de la misma el cual carece de actividad proteasa de TADG-15. La inoculación con la proteína TADG-15 o con un fragmento de la misma produce una s. . I respuesta inmune en el individuo, por lo tanto vacunando al individuo en contra de TADG-15. La vacunación con TADG-15 descrita en la presente se pretende para un individuo que tiene cáncer, se sospecha que tiene cáncer o está en riesgo de contraer cáncer. Generalmente, el fragmento de TADG-15 útil para vacunar a un individuo son fragmentos de 9 residuos hasta fragmentos de 20 residuos, con los fragmentos de 9 residuos preferidos que se muestran en SEQ ID Nos. 2, 19, 20, 21 , 29, 39, 49, 50, 59, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 89 y 90. La presente invención se dirige hacia un método para producir células inmunes activadas dirigidas contra TADG-15, que comprende los pasos de: exponer células dendríticas a una proteína TADG-15 o fragmento de la misma que carece de actividad proteasa de TADG-15, en donde la exposición a la proteína TADG-15 o fragmento de la misma activa la células dendríticas, por lo tanto produciendo células inmunes activadas dirigidas contra TADG-15. Las células inmunes activadas representativas son células B, células T y dendritas. Generalmente, el fragmento TADG-15 es un fragmento de 9 residuos hasta un fragmento de 20 residuos, con los fragmentos de 9 residuos preferidos que se muestran en SEQ ID Nos. 2, 19, 20, 21 , 29, 39, 49, 50, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 89 y 90. Preferiblemente las células dendríticas se aislan a partir de un individuo antes del exposición, y las células dendríticas activadas se reintroducen dentro del individuo subsecuentemente a la exposición. Típicamente, el individuo para el cual este método puede aplicarse tiene cáncer, se sospecha que tiene cáncer o está en riesgo de contraer cáncer. La presente invención se dirige hacia una composición inmunogénica, que comprende un fragmento inmunogénico de una proteína TADG-15 y un adyuvante apropiado. Generalmente, el fragmento es un fragmento de 9 residuos hasta un fragmento de 20 residuos, con los fragmentos de 9 residuos preferidos que se muestran en SEQ ID Nos. 2, 19, 20, 21 , 29, 39, 49, 50, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 89 y 90. De conformidad con la presente invención se pueden emplear técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, y técnicas de ADN recombinante dentro de la habilidad de la técnica. Dichas técnicas explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982); DNA Cloning: A Practical Approach", volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Translation" (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. 1985); "Transcription and Translation" (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed. 1986); "Immobilized Cells And Enzymes" (IRL Press, 1986); B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984). Por lo tanto, como aparece en la presente, los siguientes términos deben tener las definiciones establecidas a continuación. Como se utiliza en la presente, el término "ADNc" debe hacer referencia a la copia de ADN del transcrito de ARNm de un gen.

Como se utiliza en la presente, el término "secuencia derivada de aminoácidos" desde hace referencia a la secuencia de aminoácidos determinada mediante la lectura de la secuencia de tripletes de las bases nucleotídicas del ADNc. Como se utiliza en la presente, el término "seleccionar una genoteca" desde hace referencia al procedimiento de utilizar una sonda marcada para monitorear si, bajo las condiciones apropiadas, hay una secuencia complementaria a la sonda presente en una genoteca de ADN particular. Además, "seleccionar una genoteca " puede llevarse a cabo mediante PCR. Como se utilizan la presente, el término "PCR" se refiere a la reacción en cadena de la polimerasa que es el tema de las patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195 y 4,683,202 a Mullis, así como otras mejorías actualmente conocidas en la técnica. El aminoácido descrito en la presente se prefiere que sea una forma "L" isomérica. Sin embargo, los residuos en la forma "D" isomérica pueden ser sustituidos por cualquier residuo de aminoácido L, siempre y cuando la propiedad funcional deseada de la unión a inmunoglobulina se retenga por el polipéptido. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el amino terminal de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en el carboxi terminal de un polipéptido. Para mantener la nomenclatura estándar de polipéptidos, J Biol. Chem., 243:3552-59 (1969), las abreviaturas para los residuos de aminoácidos son como se utilizan habitualmente en la técnica. Debe evidenciarse que todas las secuencias de residuos aminoácidos están representadas en la presente como fórmulas cuya orientación izquierda y derecha está en la dirección convencional de amino terminal a carboxi terminal. Además, debe evidenciarse que un guión al inicio o al término de la secuencia del residuo del aminoácido indica un enlace de peptídico a una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácidos. Un "replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación del ADN in vivo; es decir, capaz de replicarse bajo su propio control. Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al cual otro segmento de ADN puede unirse de manera que se lleve a cabo la replicación del segmento unido. Un "vector" puede adicionalmente definirse como una construcción de ácido nucleico replicable, por ejemplo, un plásmido o ácido nucleico viral. Una "molécula de ADN" se refiere a la forma polimérica de desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina, o citosina) ya sea en forma de una sola hebra o como una hélice en doble hebra. Este término se refiere solamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no se limita a ninguna forma terciaría particular. Por lo tanto, este término incluye ADN de doble hebra encontrado, entre otros, en moléculas de ADN lineal (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos, y cromosomas. La estructura se discuten en la presente de conformidad con la convención normal de dar solamente la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra no transcrita del ADN (es decir, la hebra que tiene una secuencia homologa al ARNm). Un vector de expresión es una construcción replicable en la cual una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido está operativamente unida a secuencias control adecuadas capaces de afectar la expresión del polipéptido en una célula. La necesidad de dicha secuencias control vanará dependiendo de la célula seleccionada y del método de transformación elegido. Generalmente, la secuencias control incluyen un promotor transcripcional y/o potenciadores, sitios de unión adecuados para ARNm ribosomal, y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y de la traducción. Los métodos que se conocen bien por los expertos en la técnica pueden ser utilizados para construir vectores de expresión que contienen señales control de la transcripción y de la traducción apropiadas. Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Ed), Cold Spring Harbor Press, N.Y. un gen y sus secuencias de control de transcripción se definen como estando "operativamente unidos" si las secuencias de control transcripcional controlan efectivamente la transcripción del gen. Los vectores de la invención incluyen, pero no se limitan a, vectores plasmídicos y vectores virales. Los vectores virales preferidos de la invención son aquellos derivados a partir de retrovirus, adenovirus, virus adeno asociados, virus SV40, o virus de herpes. En general, los vectores de expresión contienen secuencias promotoras que facilitan la transcripción eficiente del fragmento de ADN insertado y se utilizan en conexión con el hospedero. El vector de expresión típicamente contiene un origen de replicación, promotor(es), terminador(es), así como genes específicos los cuales son capaces de promover la selección fenotípica en células transformadas. Los hospederos transformados pueden fermentarse y cultivarse de conformidad con los modos conocidos en la técnica para lograr un crecimiento celular óptimo. Un "origen de replicación" se refiere a aquellas secuencias de ADN que participan en la síntesis de ADN. Una "secuencia codificante" de ADN es una secuencia de ADN de doble hebra la cual se transcribe y se traduce hacia un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de paro de la traducción en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia codificante que incluye, pero no se limita a, secuencias procariontes, ADNc a partir de ARNm de eucariontes, secuencias de ADN genómico a partir de ADN de eucarionte (por ejemplo, mamífero), e incluso secuencias de ADN sintéticas. Una señal de poliadenilación y secuencias de terminación de la transcripción usualmente estarán localizadas hacia el extremo 3' de la secuencia codificante. i*Á~ *"*— i ? -jÉJH jt1rT Las secuencias control de la transcripción y de la traducción son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores, y similares, que se proveen para la expresión de una secuencia codificante en una célula hospedera. Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante hacia el extremo 3' (dirección 3'). Para propósitos de definir la presente invención, la secuencia promotora se une a su extremo 3' mediante el sitio de inicio de la transcripción y se extiende hacia el extremo 5' (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción, así como dominios de unión a proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucariontes frecuentemente, pero no siempre, contienen cajas 'TATA" y cajas "CAT'. Los promotores procariontes típicamente contienen secuencias Shine-Dalgarno de unión al ribosoma además de las secuencias consenso -10 y -35. Una "secuencia control de la expresión" es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y traducción de otra secuencia de ADN. Una secuencia codificante está "bajo el control" de secuencias de control de transcripción y traducción en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia codificante hacia ARNm, la cual se traduce entonces hacia la proteína codificada por la secuencia codificante.

Una "secuencia señal" puede incluirse cerca de la secuencia codificante. Esta secuencia codifica un péptido señal, N-terminal polipéptido, que comunica con la célula hospedera para dirigir el polipéptido a la superficie celular o secretar el polipéptido hacia el medio, y este péptido señal se separa de la célula hospedera antes de que la proteína deje la célula. Las secuencias señal pueden encontrarse asociadas con una variedad de proteínas nativas a procariontes y eucariontes. Como se utilizan la presente, los términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a las enzimas, cada una de las cuales cortan el ADN de doble hebra en una secuencia nucleotídica específica o cercana a una secuencia nucleotídica específica. Una célula ha sido "transformada" por ADN exógeno o heterólogo cuando dicho ADN ha sido introducido dentro de la célula. El ADN transformante puede o no ser integrado (acoplado covalentemente) dentro del genoma de la célula. En células procariontes, de levadura, y de mamífero por ejemplo, el ADN transformante puede mantenerse en un elemento episomal tal como un plásmido. Con respecto a las células procariontes, una célula establemente transformada es una en la que el ADN transformante se ha integrado dentro del cromosoma de manera de hereda a las células hijas a través de la replicación cromosomal. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula eucarionte para establecer líneas celulares o clonas comprendidas de una población de células hijas que contienen el ADN transformante. Una "clona" es una población de células derivadas a partir de una sola célula o ancestro mediante mitosis. Una "línea celular" es una clona de una célula primaria que es capaz de crecer establemente in vitro por muchas generaciones. Dos secuencias de ADN son "substancialmente homologas" cuando al menos aproximadamente 75% (preferiblemente al menos aproximadamente 80%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 90% o 95%) de los nucleótidos coinciden sobre la longitud definida de las secuencias de ADN. Las secuencias que son substancialmente homologas pueden ser identificadas al comparar las secuencias utilizando software estándar disponible en bancos de datos de secuencias, o en un experimento de hibridación de Southern bajo, por ejemplo, condiciones severas como se definió para ese sistema particular. Las condiciones de hibridación apropiadas definidas están dentro de las habilidades de la técnica. Véase, por ejemplo, Maniatis et al., anteriormente mencionado; DNA Cloning, volúmenes I & II, anteriormente mencionado; Nucleic Acid Hybridization, anteriormente mencionado. Una región "heteróloga" de la construcción del ADN es un segmento identificable de ADN dentro de una molécula mayor de ADN que nos encuentra en asociación con la molécula mayor en la naturaleza. Por lo tanto, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen usualmente estará flanqueado por ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo fuente. En otro ejemplo, la secuencia codificante es una construcción en donde la secuencia codificante misma no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un ADNc en donde la secuencia codificante genómica contiene intrones, o secuencias sintéticas que tienen diferentes codones a los del gen nativo). Las variaciones alélicas o los eventos mutacionales que ocurren de manera natural no dan lugar a regiones heterólogolas de ADN como se definió anteriormente. 5 Las marcas más comúnmente empleadas para estos estudios son elementos radiactivos, enzimas, químicos con fluorescencia cuando se exponen a luz ultravioleta, y otros. Varios materiales fluorescentes se conocen y pueden utilizarse como marcas. Estas incluyen, por ejemplo, fluoresceína, rodamina, auramina, rojo Tejas, azul AMCA y amarillo lucifer. Un material de 10 detección particular es un anticuerpo anti-conejo preparado en cabras y conjugado con fluoresceína a través de un isotiocianato. Las proteínas también pueden marcarse con elementos radiactivos o con una enzima. La • marca radiactiva puede detectarse mediante cualesquiera de los procedimientos del conteo actualmente disponibles. Los isótopos preferidos 15 pueden seleccionarse a partir de 3H, 14C, 8P, 36S, CI, 51Cr, 57Co, 8Co, "Fe, 9?? i25| 131| y 18ßRe. Las marcas enzimáticas son similarmente útiles, y pueden detectarse mediante cualesquiera de las técnicas colorimétricas, espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas, amperométricas o ?r gasométricas actualmente utilizadas. Las enzimas se conjuga a la partícula 20 seleccionada mediante la reacción con moléculas de enlace tales como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehído y similares. Muchos enzimas que pueden utilizarse en estos procedimientos se conocen y pueden ser utilizadas. Las preferidas son peroxidasa, ß-glucuronidasa, ß-D-glucosidasa, ß-D- a Aii tLi^iJiiL.i .J^^^ * galactosidasa, ureasas, glucosa oxidasa más peroxidasa y fosfatasa alcalina. Las patentes de E.U.A. Nos. 3,654,090, 3,850,752, y 4,016,043 se refieren a manera de ejemplo para su descripción de materiales y métodos de marcado alternativos. 5 Un sistema de ensayo particular desarrollado y utilizado en la técnica se conoce como un ensayo de receptor. En un ensayo de receptor, el material a ser ensayado se marca apropiadamente y luego ciertas colonias celulares prueba se inoculan con una cantidad de ambas marcas después de la cual los estudios de unión se conducen para determinar el grado al cual los o materiales marcados se unen a los receptores celulares. Esta manera, las diferencias en la afinidad entre los materiales puede evaluarse. Un ensayo útil en la técnica se conoce como un ensayo "cis/trans". Brevemente, este ensayo emplea dos construcciones genéticas, una de las cuales es típicamente un plásmido que expresa continuamente un 15 receptor particular interés cuando se transfecta dentro de una línea celular apropiada, y la segunda de las cuales es un plásmido que expresa un reportero tal como luciferasa, bajo el control de un complejo receptor/ligando. Por lo tanto, por ejemplo, si se desea evaluar un compuesto como un ligando (tk, para un receptor particular, uno de los plásmido podría ser una construcción 20 que resulta en la expresión del receptor en la línea celular elegida, mientras que el segundo plásmido podría poseer un promotor unido al gen de luciferasa en el cuartel elemento de respuesta al receptor particular está insertado. Si compuesto bajo prueba es un agonista para el receptor, el ligando formará un complejo con el receptor, y el complejo resultante unirá el elemento de respuesta e inicia la transcripción del gen de luciferasa. La quimioluminiscencia resultante se mide entonces fotométricamente, y las curvas dosis respuesta se obtienen y se comparan con aquellas de los ligandos conocidos. El protocolo precedente se describe en detalle en la patente de E.U.A. No. 4,981 ,784.

Como se utiliza en la presente, el término "hospedero" se pretende que incluya no solamente procariontes sino que también eucariontes tales como células de levadura, de planta y de animal. Una molécula de ADN recombinante o gen del cual codifica una proteína TADG-15 de humano de la presente invención puede utilizarse para transformar un hospedero utilizando cualesquiera de las técnicas comúnmente conocidas por los expertos en la técnica. Especialmente preferido es el uso de un vector que contiene secuencias codificantes para el gen las cuales codifica una proteína TADG-15 de humano de la presente invención para propósitos de transformación del procarionte. Los hospederos procariontes pueden incluir E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. Los hospederos eucariontes incluyen levaduras tales como Pichia pastorís, células de mamífero y células de insecto.

La invención incluye un ADN substancialmente puro que codifica una proteína TADG-15, una hebra de ADN la cual hibridará a severidad elevada con una sonda que contiene una secuencia de al menos 15 nucleótidos consecutivos de (SEQ ID NO. 1). La proteína codificada por el JÜJ to^. ? ??.^^^?^.

* DN de esta invención puede compartir al menos 80% de identidad de secuencia (preferiblemente 85%, más preferiblemente 90%, y más preferiblemente 95%) con los aminoácidos listados en las figuras 3 y 4 (SEQ ID NO. 4). Más preferiblemente, el ADN incluye la secuencia codificante de los nucleótidos de la figura 2 (SEQ ID NO. 1), o una variante de generada de dicha secuencia. Esta invención también incluye un ADN substancialmente puro que contiene una secuencia de al menos 15 nucleótidos consecutivos (preferiblemente 20, más preferiblemente 30, incluso más preferiblemente 50, y más preferiblemente todos) de la región a partir de los nucleótidos 1 a 3147 de los nucleótidos mostrados en la figura 2 (SEQ ID NO. 1 ). Por "ADN substancialmente puro" se entiende ADN que no es parte de un medio en el cual el ADN ocurre de manera natural, en virtud de la separación (purificación parcial o total) de algunas o todas las moléculas de ese medio, o en virtud de la alteración de las secuencias que flanquean el ADN reclamado. El término por lo tanto incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que cual se incorpora dentro de un vector, dentro de un plásmido o virus replicante de manera autónoma, o dentro del ADN genómico de un procarionte o eucarionte; o del cual existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un ADN genómico o un fragmento de ADNc producido mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o digestión con endonucleasas de restricción) independiente de otras secuencias. También se incluye un ADN recombinante del cual es parte de un gen híbrido que codifica secuencias peptídicas adicionales, por ejemplo, una proteína de fusión. También incluido está un ADN recombinante del cual incluye una porción de los nucleótidos listados en la figura 2 (SEQ ID NO. 1) y los cuales codifican una variante de procesamiento alternativo de TADG-15. Por una "proteína substancialmente pura" se entiende una proteína que ha sido separada a partir de al menos algunos de aquellos componentes que la acompañan de manera natural. Típicamente, la proteína es substancialmente pura cuando ésta es al menos 60% (en peso) y pretende las proteínas y otras moléculas orgánicas que ocurren de manera natural con las cuales está asociada de manera natural in vivo. Preferiblemente, la pureza de la preparación (en peso) es de al menos 75%, más preferiblemente al menos 90%, y más preferiblemente al menos 99%. Una proteína TADG-15 substancialmente pura puede obtenerse, por ejemplo, mediante la extracción a partir de una fuente natural; mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido TADG-15; o mediante la síntesis química de la proteína. La pureza se puede medir mediante cualquier método apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna, tal como cromatografía de inmunoafinidad utilizando un anticuerpo específico para TADG-15, electroforesis en gel de poliacrilamida, o análisis HPLC. Una proteína esta substancialmente libre de componentes naturalmente asociados cuando se separa a partir de al menos algunos de aquellos contaminantes que la acompañan en su estado natural. Por lo tanto, una proteína que se sintetiza químicamente o que se produce en un sistema celular diferente a partir de las células de la cual se origina de manera natural estará, por definición, substancialmente libre a partir de sus componentes naturalmente asociados. Por consiguiente, las proteínas substancialmente puras incluyen proteínas eucariontes sintetizadas en E. coli, otros procariontes, o cualquier otro organismo en el cual éstas no ocurran de manera natural. 5 El término "oligonucleótido", como se utiliza en la presente, se define como una molécula que comprende dos o más ribonucleótidos, preferiblemente más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos • factores, los cuales, a su vez, dependen de la función final y del uso del oligonucleótido. El término "iniciador", como se utiliza en la presente, se 10 refiere a un oligonucleótido, ya sea que ocurre de manera natural (como en una digestión de restricción purificada) o producida sintéticamente, y la cual es capaz de iniciar la síntesis de una hebra complementaria a un ácido nucleico cuando se coloca bajo condiciones apropiadas, es decir, en la presencia de nucleótidos y un agente inductor, tal como ADN polimerasa, y a una 15 temperatura y pH adecuados. El iniciador puede ser o bien de hebra sencilla o de doble hebra y debe ser lo suficientemente largo para cebar la síntesis del producto de extensión deseado en la presencia del agente inductor. La longitud exacta del iniciador dependerá de muchos factores, incluyendo ? temperatura, secuencia y/u homología del iniciador y el método a ser utilizado. 20 Por ejemplo, en aplicaciones diagnósticas, el iniciador oligonucleótido típicamente contiene 15-25 o más nucleótidos, dependiendo de la complejidad de la secuencia blanco, aunque ésta puede contener menos nucleótidos.

Los iniciadores en la presente se seleccionan para que sean "substancialmente" complementarios a secuencias de ADN blanco particulares. Esto significa que los iniciadores deben de ser lo suficientemente complementarios para hibridar con sus hebras respectivas. Por lo tanto, la secuencia iniciadora no necesita reflejar ia secuencia exacta del molde. Por ejemplo, un fragmento nucleótidos no complementario (es decir, que contiene un sitio de restricción) puede unirse al extremo 5' del iniciador, con el resto de la secuencia iniciadora siendo complementaria a la hebra. Alternativamente, ias bases no complementarias o secuencias más largas pueden estar dispersas dentro del iniciador, con la condición de que la secuencia iniciadora sea lo suficientemente complementaria con la secuencia para hibridar con ésta y formar el molde para la síntesis del producto de extensión. La sonda a la cual el ADN de la invención hibrida preferiblemente consiste de una secuencia de al menos 20 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente 40 nucleótidos, incluso más preferiblemente 50 nucleótidos, y más preferiblemente 100 nucleótidos o más (hasta el 100%) de la secuencia codificante de los nucleótidos listados en las figura 2 (SEQ ID No. 1) o el complemento a la misma. Dicha sonda es útil para detectar la expresión de TADG-15 en una célula mediante un método que incluye los pasos de (a) poner en contacto ARNm obtenido a partir de las células con una sonda de hibridación de TADG-15 marcada; y (b) detectar la hibridación de la sonda con el ARNm.

.^..MMÉ^ .. ,1^,^ Por "alta severidad" se entiende la hibridación del ADN y las condiciones de lavado caracterizadas por una elevada temperatura y bajas concentraciones de sal, por ejemplo, condiciones de lavado de 65°C a una concentración de sal de aproximadamente SSC 0.1X, o el equivalente funcional de las mismas. Por ejemplo, condiciones de alta severidad pueden incluir hibridación a aproximadamente 42°C en la presencia de formamida al 50%; un primer lavado a aproximadamente 65°C con aproximadamente SSC 2X que contiene SDS al 1%; seguido por un segundo lavado a aproximadamente 65°C con aproximadamente SSC 0.1X. El ADN puede tener al menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia a la secuencia codificante de los nucleótidos listados en la figura 2 (SEQ ID No. 1), preferiblemente al menos 75% (por ejemplo, al menos 80%); y más preferiblemente al menos 90%. La identidad entre dos secuencias es una función directa del número de coincidencias o posiciones idénticas. Cuando una posición en ambas de las dos secuencias está ocupada por la misma subunidad monomérica, por ejemplo, si una posición dada está ocupada por una adenina en cada una de las dos moléculas de ADN, entonces éstas son idénticas en esa posición. Por ejemplo, si 7 posiciones en una secuencia de 10 nucleótidos en longitud son idénticas a las posiciones correspondientes en una segunda secuencia de 10 nucleótidos, entonces las dos secuencias tienen 70% de identidad de secuencia. La longitud de la secuencia de comparación generalmente será de al menos 50 nucleótidos, preferiblemente de al menos 60 nucleótidos, más preferiblemente al menos 75 nucleótidos, y más preferiblemente 100 nucleótidos. La identidad de secuencia típicamente se mide utilizando software de análisis de secuencia (por ejemplo, paquete de software de análisis de secuencia del Genetics Computer Group (GCG), University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705). La presente invención comprende un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína TADG-15 de humano, en donde dicho vector es capaz de llevar a cabo replicación en un hospedero, y comprende, de manera operativamente unida: a) un origen de replicación; b) un promotor; y c) una secuencia de ADN que codifica para dicha proteína TADG-15. Preferiblemente, el vector de la presente invención contiene una porción de la secuencia de ADN mostrada en SEQ ID No. 1. Los vectores pueden ser utilizados para amplificar y/o expresar ácido nucleico que codifica una proteína TADG-15 o un fragmento de la misma. Además de las proteínas substancialmente de longitud total, la invención también incluye fragmentos (por ejemplo, fragmentos antigénicos) de la proteína TADG-15 (SEQ ID No. 2). Como se utilizó en la presente, "fragmento", como se aplica a un polipéptido, originariamente será de al menos 6 residuos, más típicamente de al menos 9-12 residuos, y preferiblemente al menos 13-20 residuos en longitud, pero menos que la secuencia entera, intacta. Alternativamente, un fragmento puede ser un dominio individual de 20-120 residuos a partir de SEQ ID No. 2. Los fragmentos de la proteína TADG-15 pueden generarse mediante métodos j¡Hm ^¡| !|g conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante digestión enzimática de proteína TADG-15 que ocurre de manera natural o es recombinante, mediante técnicas de ADN recombinante utilizando un vector de expresión de codifica un fragmento definido de TADG-15, o mediante 5 síntesis química. La capacidad de un fragmento candidato para exhibir una característica de TADG-15 (por ejemplo, unión a un anticuerpo específico para TADG-15) puede evaluarse mediante métodos descritos en la presente. TADG-15 purificada o fragmentos antigénicos de TADG-15 pueden ser utilizados para generar nuevos anticuerpos o para evaluar anticuerpos 10 existentes (por ejemplo, como controles positivos en un ensayo diagnóstico) al emplear protocolos estándares conocidos por los expertos en la técnica. Incluidos en esta invención están los antisueros policlonales generados al • utilizar TADG-15 o un fragmento de TADG-15 como el inmunógeno en, por ejemplo, conejos. Se emplean los protocolos estándares para producción de 15 anticuerpos monoclonales y policlonales conocidos por los expertos en esta técnica. Los anticuerpos monoclonales generados mediante este procedimiento pueden seleccionarse por la capacidad para identifica clonas de ADNc de TADG-15 recombinante, y para distinguirlas de otras clonas de ADNc. • 20 Además incluidas en esta invención están las proteínas TADG- 15 las cuales se codifican, al menos en parte, por porciones de SEQ ID No. 2, por ejemplo, productos de los eventos de procesamiento alternativo del ARNm o eventos de procesamiento alternativos de las proteínas, o en los cuales una sección de la secuencia de TADG-15 ha sido deletada. El fragmento, o el polipéptido TADG-15 intacto, puede unirse covalentemente a otro polípéptido, por ejemplo, uno que actúa sobre una marca, un ligando o un medio para incrementar la antigenicidad. La invención también incluye un anticuerpo policlonal o monoclonal el cual se une específicamente a TADG-15. La invención abarca no solamente un anticuerpo monoclonal intacto, sino que también un fragmento de anticuerpo inmunológicamente activo, por ejemplo, un fragmento Fab o (Fab)2; una molécula Fv diseñada de una sola cadena; o una molécula quimérica, por ejemplo, un anticuerpo que contiene la especificidad de unión de un anticuerpo, por ejemplo, de origen murino, y las porciones remanentes de otro anticuerpo, por ejemplo, de origen humano. En una modalidad, el anticuerpo, un fragmento del mismo, puede estar unido a una toxina o a una marca detectable, por ejemplo, una marca radiactiva, una marca de isótopo no radioactivo, una marca fluorescente, una marca quimioluminiscente, una marca paramagnética, una marca enzimática, o una marca colorimétrica. Los ejemplo de toxinas adecuadas incluyen toxina de difteria, exotoxina A de Pseudomonas, ricina, y toxina de cólera. Los ejemplos de marcas enzimáticas adecuadas incluyen malato hidrogenasa, nucleasa estafilococal, delta-5-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa, alfa-glicerol fosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, i..fcjtBifa«i»j-l ? " jfJ'f--* ^ glucoamilasa, acetilcolinesterasa, etc. los ejemplos de marcas de radioisótopos adecuados incluyen 3H, 125l, 131l, 8P, ^S, 14C, etc. Los isótopos paramagnéticos para propósitos de diagnóstico in vivo también pueden ser utilizados de conformidad con los métodos de esta invención. Hay numerosos ejemplos de elementos que son útiles en imagen de resonancia magnética. Para discusiones sobre imágenes de resonancia magnética nuclear in vivo, véase, por ejemplo, Schaefer et al., (1989) JACC 14, 472-480; Shreve et al., (1986) Magn. Reson. Med. 3, 336-340; Wolf, G. L, (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 93-95; Wesbey et al., (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 145-155; Runge et al., (1984) Invest. Radiol. 19, 408-415. Los ejemplos de marcas fluorescentes adecuadas incluyen una marca de fluoresceína, una marca de isotiocialato, una marca de rodamina, una marca de ficoeritrina, una marca de ficocianina, una marca de aloficocianina, una marca de oftaldehído, una marca de fluorescamina, etc. Los ejemplos de marcas quimioluminiscentes incluyen una marca luminal, una marca isolumínal, una marca de éster aromático de acridinio, una marca de imidazol, una marca de sal de acridinio, una marca de éster de oxalato, una marca de luciferina, una marca de aequorina, etc. Los expertos en la técnica conocerán otras marcas adecuadas las cuales pueden emplearse de conformidad con la presente invención. La unión de estas marcas a anticuerpos o fragmentos de los mismos puede lograrse utilizando técnicas estándares comúnmente conocidas y utilizadas por los expertos en la técnica. La técnica típicas se describen por Kennedy et al., (1976) Clin. Chim. Acta 70, 1-31; y Schurs et al., (1977) Clin. Chim. Acta 81, 1-40. Las técnicas de acoplamiento mencionadas en la parte final son el método de glutaraldehído, el método de periodato, el método de dimaleimida, el método de éster de m-maleimidobencil-N-hidroxi-succinimida. Todos estos métodos se incorporan como referencia en la presente. También dentro de la invención ésta un método para detectar la proteína TADG-15 en una muestra biológica, la cual incluye los pasos de poner en contacto la muestra con el anticuerpo marcado, por ejemplo, anticuerpo marcado radiactivamente específico para TADG-15, y determinación de si el anticuerpo se une un componente de la muestra. Los anticuerpos para la proteína TADG-15 pueden ser utilizados en un inmundo ensayo para detectar niveles incrementados de expresión de la proteína TADG-15 en tejidos que se sospecha de transformación neoplásica. Estos mismos usos pueden lograrse con ensayos Northern blot y análisis. Como se describe en la presente, la invención provee varias ventajas diagnósticas y usos. Por ejemplo, la proteína TADG-15 es útil para diagnosticar cáncer en diferentes tejidos puesto que esta proteína se sobreexpresa altamente en células tumorales. Los anticuerpos (o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) los cuales se unen a un epítope específico para TADG-15, son útiles en un método para detectar la proteína TADG-15 en una muestra biológica para diagnóstico de cáncer o de transformación neoplásica. Este método incluye los pasos de obtener una muestra biológica (por ejemplo, células, sangre, plasma, tejido, etc.) a partir de un paciente que se sospecha que tiene cáncer, poner en contacto la muestra con un anticuerpo marcado (por ejemplo, anticuerpo marcado con radiactividad) específico para TADG-15, y detectar la proteína TADG-15 utilizando técnicas de inmunoensayo estándares tales como ELISA. La unión del anticuerpo a la muestra biológica indica que la muestra contiene un componente el cual se une específicamente a un epítope dentro de TADG-15. Similarmente, un ensayo estándar de Northern blot puede ser utilizado para evaluar las cantidades relativas de ARNm de TADG-15 en una célula o tejido obtenido a partir de un paciente que se sospecha que tiene cáncer, de conformidad con las técnicas de hibridación convencionales de Northern conocidas por los expertos en la técnica. Este ensayo Northern utiliza una sonda de hibridación, por ejemplo, ADNc de TADG-15 marcado con radiactividad, que o bien contiene el ADN de longitud total, o el ADN de una sola hebra que tiene una secuencia complementaria a la SEQ ID No. 1 (figura 2), o un fragmento de ésa secuencia de ADN de al menos 20 (preferiblemente al menos 30, más preferiblemente al menos 50, y más preferiblemente al menos 100 nucleótidos consecutivos en longitud). La sonda de hibridación de ADN puede marcarse mediante cualesquiera de los diferentes métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los siguientes ejemplos serán para el propósito de ilustrar varias modalidades de la invención y no se dan para limitar la presente invención de ninguna manera. ^¿ ^t*^»*»»**^.* »****.^ *-"tÜilhil^- M^t^?^^ ?^^?á?MJ EJEMPLO 1 Recolección de tejido y almacenamiento Después de la histerectomía, salpingo-ooforectomía bilateral, o 5 remoción quirúrgica de tejido neoplásico a un paciente, el espécimen se recupera y se coloca sobre hielo. El espécimen se lleva al patólogo residente para aislamiento e identificación de las muestras de tejido específicas. >f Finalmente, la muestra se congela en nitrógeno líquido, se archiva dentro del registro de laboratorio y se almacena a -80°C. ío Los especímenes adicionales se obtuvieron frecuentemente a partir de Cooperative Human Tissue Network (CHTN). Estas muestra se prepararon por el CHTN y se enviaron sobre hielo seco. Después de la llegada, estos especímenes (por ejemplo, sangre (suero), orina, saliva, lágrimas y fluido intersticial) se registraron en el registro de laboratorio y se 15 almacenaron a -80°C. La participación de la siguientes divisiones del Cooperative Human Tissue Network (CHTN) para proveer tejidos tumorales se reconoce: Western División, Case Western Reserve University, (Cleveland, OH); Midwestem División, Ohio state University, (Columbus, OH), Eastern División, NDRI, (Philadelphia, PA); Pediatric's División, Children's Hospital, • 20 (Columbus, OH); Southern División, University of Alabama en Birmingham, (Birmingham, AL).

EJEMPLO 2 Aislamiento del ARNm y síntesis de ADNc Cuarenta y un tumores de ovario (10 tumores con potencial maligno bajo y 31 carcinomas) y 10 ovarios normales se obtuvieron a partir de especímenes de cirugía y se congelaron en nitrógeno líquido. Las líneas celulares de carcinoma de ovario de humano SW626 y CAOV3, y las líneas de células de carcinoma de mama de humano MDA-MB-231 y MDA-MB-435S, se obtuvieron a partir de American Type Culture Collection (Rockville, MD). Las células se cultivaron a subconfluencia en medio Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero bovino fetal al 10% (v/v) y antibióticos. El aislamiento del ARN mensajero (ARNm) se llevó a cabo de conformidad con las instrucciones del fabricante utilizando el equipo de aislamiento de ARNm Mini RiboSep™ Ultra obtenido a partir de Becton Dickinson. En este procedimiento, el ARNm poliA+ se aisló directamente a partir del lisado de tejido utilizando cromatografía por afinidad con medio oligo(dT) celulosa. La cantidad de ARNm recuperada fue cuantificada mediante espectrometría de UV. Se sintetizó una primera hebra complementaria al ADN (ADNc) utilizando 5.0 µg de ARNm y o bien hexámeros al azar o iniciadores oligo(dT) de conformidad con el protocolo del fabricante utilizando un equipo para la síntesis de la primera hebra obtenido a partir de CLONTECH (Palo Alto, CA). La pureza del ADNc se evaluó mediante PCR utilizando iniciadores específicos para el gen p53. Éstos iniciadores abarcan un intrón de tal manera . ^fclMfc» que el ADNc puro puede distinguirse a partir del ADNc que está contaminado con ADN genómico.

EJEMPLO 3 PCR con iniciadores redundantes, clonación de ADNc de TADG-15, ligación del vector T y transformaciones y secuenciación de ADN Iniciadores redundantes, hacia adelante 5'- TGGGTIGTIACIGCIGCIGCICA (C/T)TG-3' (SEQ ID No. 11 ) y reverso 5'-A (A/G)IGGICCICCI (C/G) (T/A) (A/G)TCICC-3' (SEQ ID No. 12), que corresponde a los aminoácidos que rodean la tríada catalítica para serin proteasas, se utilizaron para comparar los productos de PCR a partir de ADNc de tejido normal y de carcinoma. Los productos de PCR purificados se ligaron dentro del plásmido vector T Promega y los productos de ligación se utilizaron para transformar células competentes JM109 de conformidad con las instrucciones del fabricante (Promega). Las colonias positivas se cultivaron para amplificación, el ADN del plásmido se aisló utilizando el sistema de purificación de ADN Wizard TM Minipreps (Promega) y los plásmido se digirieron con enzimas de restricción Apal y Sacl para determinar el tamaño del inserto. Los plásmidos con insertos del tamaño(s) visualizado por la electroforesis en gel del producto de PCR descrito previamente fueron secuenciados.

Las colonias individuales se cultivaron y el ADN del plásmido se aisló utilizando el sistema de purificación de ADN Wizard™ Minipreps (Promega). Se utilizó el sistema de secuenciación de ADN de Applied Biosystems Modelo 373A para dirigir la determinación de la secuencia de ADNc. Utilizando un iniciador específicos del plásmido cerca del sitio de clonación, las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo utilizando terminadores PRISM TM Ready Reaction Dye Deoxy™ (Applied Biosystems) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Los terminadores de colorante residual se removieron a partir de la reacción de secuenciación terminada utilizando una columna para centrifugación Centri-sep™ (Princeton Separation). Basándose en la secuencia determinada, los iniciadores que amplificaron específicamente el gen de interés se diseñaron y se sintetizaron. La subclona original TADG-15 (436 pb) se marcó al azar y se utilizó como una sonda para seleccionar una genoteca de ADNc de tumor de ovario mediante técnicas de hibridación estándares. 13 La genoteca se construyó en 8ZAP utilizando ARNm aislado a partir de las células tumorales de un paciente con adenocarcinoma de ovario etapa lll/grado lll. Tres clonas que se sobreponían se obtuvieron las cuales abarcaban 3147 nucleótidos. ha^ÉM!!*.^ .,.,..,*^^ EJEMPLO 4 Análisis de Northern blot 10 µg de ARNm se separaron por tamaño mediante electroforesis a través de un gel de agarosa formaldehído al 1 % en MOPS 0.02 M, acetato de sodio 0.05 M (pH 7.0), y EDTA 0.001 M. Los ARNm se sometieron a blot con una membrana de nylon Hybond-N+ (Amersham) mediante acción capilar en SSPE 20x. Los ARNm se fijaron a la membrana mediante horneado por 2 horas a 80°C. Las sondas de ADNc marcadas con 32P se elaboraron mediante el sistema de marcado Prime-a-Gene (Promega). Los productos de PCR amplificados mediante los mismos iniciadores descritos anteriormente se utilizaron para sondas. Los blots se prehibridaron por 30 minutos y se hibridaron por 60 minutos a 68°C con sonda de ADNc marcada con 32P en una solución de hibridación ExpressHyb (CLONTECH). La hibridación control para determinar la carga relativa del gel se llevó a cabo con una sonda de ß-tubulina. Los tejidos normales de humano; bazo, timo, próstata, testículo, ovario, intestino delgado, colon y leucocitos de sangre periférica, y los tejidos fetales normales de humano; cerebro, pulmón, hígado y riñon (Human Múltiple Tissue Northem Blot; CLONTECH) también se examinaron mediante el mismo procedimiento de hibridación. Los Northern blots de tejidos múltiples adicionales (MTN) a partir de CLONTECH incluyen el blot Human MTN, el blot Human MTN II, el blot Human Fetal MTN II, y el blot Human Brain MTN lll. t a»hJ ma??l*uí*^*~ .^.á .^^^«^a^ ^^^ateAa ^J^m^faa^^ EJEMPLO 5 Análisis de Western blot El anticuerpo policlonal de conejo se generó mediante 5 inmunización, repetido Ag de unión múltiple a poli-lisina derivaba partir de la secuencia "LFRDWIKENTGV" de la proteína TADG-15 (SEQ ID No. 13).

Aproximadamente 20 µg de los lisados celulares se separaron sobre un gel de f SDS-PAGE al 15% y se sometieron a electroblot a PVDF a 100 V por 40 minutos a 4°C. Las proteínas se fijaron a la membrana mediante incubación ío en MeOH al 50% por 10 minutos. La membrana de bloqueó durante toda la noche en TBS (pH 7.8) que contenía leche sin grasa al 0.2%. El anticuerpo primario se añadió a la membrana a una dilución de 1 :100 en leche al 0.2%/TBS y se incubó por dos horas a temperatura ambiente. El blot se lavó y se incubó con una dilución 1 :3000 de IgG de cabra anti-conejo conjugada a 15 fosfatasa alcalina (BioRad) por una hora a temperatura ambiente. El blot se lavó y se incubó con sustrato quimioluminiscente antes de una exposición de 10 segundos a la película de rayos X para visualización.

EJEMPLO 6 • 20 PCR cuantitativo La sobreexpresión del ARNm de TADG-15 se determinó utilizando un PCR cuantitativo. El PCR cuantitativo se llevó a cabo. 11 ,12 Los iniciadores oligonucleótidos que se utilizaron para TADG-15: hacia adelante 5'-ATGACAGAGGATTCAGGTAC-3' (SEQ ID No. 14) y reverso 5'-GAAGGTGAAGTCATTGCCGA-3' (SEQ ID No. 15); y para ß-tubulina: hacia adelante 5*-CGCATCAACGTGTACTACAA-3' (SEQ ID No. 16) y reverso 5'-TACGAGCTGGTGGACTGAGA-3' (SEQ ID No. 17). La ß-tubulina se utilizó como un control interno. La mezcla de reacción de PCR que consiste de ADNc derivado a partir de 50 ng de ARNm, 5 pmoles de iniciadores sentido y antisentido para ambos genes de TADG-15 y de ß-tubulina, 200 µmoles de dNTP, 5 µCi de a32PdCTP y 0.25 unidades de ADN polimerasa Taq con amortiguador de reacción (Promega) en un volumen final de 25 µl. Las secuencias blanco se amplificaron en paralelo con el gen de ß-tubulina. Treinta ciclos de PCR se llevaron a cabo en un termociclador (Perkin Elmer Gene Amp 2400; Perkin Elmer Cetus). Cada sitio de PCR incluyó 30 segundos de desnaturalización a 94°C, 30 segundos de fijación a 60°C y 30 segundos de extensión a 72°C. La temperatura de fijación varía de conformidad con los iniciadores que se utilizaron en la reacción de PCR. Para las reacciones que implican iniciadores degenerados, una temperatura de fijación de 48°C se utilizó. La temperatura de fijación apropiada para los iniciadores específicos para TADG-15 y ß-tubulina es de 62°C. Una porción de los productos de PCR se separó sobre geles de agarosa al 2% y la radiactividad de cada producto de PCR se determinó al utilizar un Phospholmager (Molecular Dynamics). En el presente estudio, la relación de expresión (TADG-15/ß-tubulina) se utilizó para evaluar la jÍh«BÍMlÉiÍÍÉ|ffÍl?irftfr' -r fijjgiÉÉtf .?«^wa^ expresión génica y define el valor en la media ± 2 DE del ovario normal como el valor límite para determinar la sobreexpresión. La prueba t de student se utilizó para comparación de los valores medios de ovarios normales y tumores del ovario.

EJEMPLO 7 Inmunohistoquímica La tinción inmunohistoquímica se llevó a cabo utilizando un equipo Vectastain Élite ABC (Vector). Los especímenes fijados en formalina y embebidos en parafina se desparafinizaron rutinariamente y se procesaron utilizando tratamiento de calentamiento con microondas en amortiguador de citrato de sodio 0.01 M (pH 6.0). Los especímenes se incubaron con suero normal de cabra en una cámara húmeda por 30 minutos. Después de la incubación con IgG anti-conejo biotinilado por 30 minutos, las secciones se incubaron entonces con reactivo ABC (Vector) por 30 minutos. Los productos finales se visualizaron utilizando el sistema de sustrato AEC (DAKO) y las secciones se contratiñeron con hematoxilina antes de montarlas. Los controles negativos se llevaron a cabo utilizando suero normal en lugar del anticuerpo primario. ^,.^.. », 1^^^^^^^»>**^"'>^ EJEMPLO 8 TADG-15 antisentido TADG-15 se clonó y se expresó en la orientación opuesta de tal " manera que una molécula de ARN antisentido (SEQ ID No. 18) se produjo. Por ejemplo, el ARN antisentido se utilizó para hibridar al ARN complementario en las células y por lo tanto inhibir la traducción del ARN de TADG-15 hacia proteína.

EJEMPLO 9 Ciasificación del péptido Para la vacuna por estimulación inmune, elementos de 9 unidades a 11 unidades individuales se examinaron para categorizar la unión de los péptidos individuales a los 8 haplotipos superiores en la población general (Parker et al., (1994)). El programa de computadora utilizado para este análisis puede encontrarse en <http:/ www- bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/>. El cuadro 1 muestra el rango de los péptidos basándose en la vida media pronosticada para cada unión peptídica a un alelo particular HLA. Una vida media más larga indica una asociación más fuerte con ese péptido y la molécula HLA particular. Los péptidos TADG- 15 que se unen fuertemente a un alelo HLA son inmunógenos putativos, y se utilizan para inocular a un individuo en contra de TADG-15.

CUADRO 1 .nqo del péptido TADG-15 10 • 15 • 20 . ^J¿ hÉM»A*JliMiillAJ*llfaMIJ EJEMPLO 10 ADNc de TADG-15 Una estrategia de selección para identificar proteasas las cuales se sobreexpresan en el cáncer de humano ha sido desarrollada en la cual los productos de RT-PCR amplificados especialmente en tumores, en comparación con el tejido normal, se examinan. 9 Durante este esfuerzo, los genes candidatos se identificaron utilizando iniciadores sentido redundantes al dominio conservado del aminoácido de histidina en el extremo NH3 del dominio catalítico y los iniciadores antisentido al dominio conservado del aminoácido de serina hacia el extremo 3'. La subclonación y secuenciación de la banda(s) apropiada de 480 pares de bases amplificada en dicha reacción de PCR provee la base para identificar al gen(es) que codifica proteasa(s). Entre estos dominios catalíticos amplificados, un nuevo gen de serin proteasa denominado TADG-15 (gen 15 derivados de antígeno tumoral) se identificó. El dominio catalítico de la proteína TADG-15 recientemente identificada es similar a otras serin proteasas y específicamente contiene aminoácidos conservados apropiados para el dominio catalítico de la familia de serin proteasa similar a tripsina. Una búsqueda computarizada de las bases de datos GenEMBL utilizando el programa FASTA (Wisconsin Package Versión 9.1 , GCG, Madison, Wisconsin) para secuencias de aminoácidos homologas al dominio de proteasa TADG-15 revelaron que las homología con otras proteasas de humano conocidas nunca excedía el 55%. La figura 1 muestra el alineamiento del dominio de proteasa de TADG-15 en comparación con otras serin proteasas de humano. Utilizando el programa BESTFIT disponible a través de GCG, las similitudes entre TADG-15 y tripsina, quimotripsina, y activador de plasminógeno tipo tejido son del 51%, 46% y 52%, respectivamente. A partir de las secuencias derivadas del dominio catalítico TADG-15, los iniciadores específicos se sintetizaron para amplificar una sonda específica para TADG-15 para selección de la genoteca. Después de la selección de una genoteca de carcinoma de ovario, una clona de 1785 pb se obtuvo la cual incluyó el extremo 3' del transcrito TADG-15. Después de la selección adicional utilizando el extremo 5' de la clona recientemente detectada, dos clonas adicionales se identificaron las cuales proveyeron otros 1362 pb del ADNc, incluyendo el extremo 5' del transcrito TADG-15. La longitud total del ADNc secuenciado puede aproximadamente 3.15 kb. La secuencia nucleotídica total obtenida incluye una secuencia consenso Kozak que precede a un marco abierto de lectura único que codifica una proteína pronosticada de 855 aminoácidos (figura 2). El marco abierto de lectura deducido codificado por la secuencia nucleotídica TADG-15 (figuras 2, 3 y 4) contiene varios dominios distintos como sigue: una cola citoplásmica amino terminal (aminoácidos (aa) #1-54), un dominio potencial transmembranal (aa #55-77), un dominio de membrana extracelular (aa #78-213), dos subcomponentes complementarios Clr/CIs, Uegf, y repetidos de la proteína morfogenética de hueso 1 (CUB) (aa #214- ! 447), cuatro repetidos de unión al ligandos del dominio similar al receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL) (aa #453-602) y dominio de serin proteasa (aa #615-855). La proteína TADG-15 también contiene dos sitios de glucosilación unidos a N (aa #109 y 302) y un sitio de rompimiento proteolítico potencial hacia el extremo 5' a partir del dominio de proteasa (aa #614) el cual podría liberar y/o activar la proteasa en el extremo carboxi de esta proteína. Además, TADG-15 contiene un motivo RGD (aa #249-251 ) el cual se encuentra comúnmente en las proteínas implicadas en la adhesión célula-célula. EJEMPL0 11 Expresión de TADG-15 Para examinar el tamaño del transcrito para TADG-15 y su patrón de expresión en varios tejidos, se llevaron a cabo hibridaciones Northern blot para tipos histológicos representativos de carcinoma y en una serie de líneas celulares, tejidos fetales y tejidos de adulto normal (figura 5). El tamaño del transcrito para el mensajero de TADG-15 se determinó como de aproximadamente 3.2 kb y un solo transcrito intenso pareció estar presente en todas los carcinomas examinados, mientras que no se detectó banda posible en el ovario normal (figura 5). Este tamaño del transcrito también está de acuerdo con los datos de secuencia que predicen el tamaño del transcrito de 3.15 kb. Las líneas de células tumorales de ovario, SW626 y CAOV3, también mostraron una abundancia de transcrito, aunque es transcrito fue poco o no se detectó en las líneas celulares de carcinoma de mama MDA-MB-231 y ,&Lfci^.j^...*aa&i^ ^ MÍ3A-MB-4355. Entre los tejidos fetales normales de humano, el riñon fetal mostró una abundancia del transcrito TADG-15 y una baja expresión también se detectó el pulmón fetal. En los tejidos de adulto normal, TADG-15 se detectó en el colon con bajos niveles expresión en el intestino delgado y 5 próstata (figura 5). Para evaluar la expresión del transcrito de ARNm de TADG-15 en tumores de ovario y el ovario normal, el PCR semi-cuantitativo se llevó a cabo (figura 6). En un estudio preliminar, la linealidad de este ensayo11,12 se confirmó y su eficiencia se correlacionan tanto con Northern blot como con ío inmunohistoquímica. Los datos se cuantifican utilizando un phosphoimager y se compararon como una relación de la expresión (TADG-15/ß-tubulina). Los resultados en la presente indican que la expresión de los transcritos TADG-15 • esta elevada por arriba del valor límite (media de ovario normal ± 2 DE) en todos los casos de tumor examinados y no se detectan o que se detectan a 15 niveles extremadamente bajos en ovarios normales (figuras 6A y 6B). El análisis de los subtipos de carcinoma de ovario, incluyendo enfermedad en etapa temprana y en etapa tardía, confirman la sobreexpresión de TADG-15 en todos los carcinomas examinados (cuadro 2). Todos los carcinomas • estudiados, los cuales incluyeron 5 carcinomas en etapa I y 3 en etapa II, 20 mostraron la sobreexpresión del gen TADG-15. Estos datos también pueden examinarse con respecto a la etapa del tumor y el subtipo histológico, y los resultados indican que cada carcinoma y cada etapa y subtipo histológico sobreexpresaron el gen TADG-15. La MJMJM ttA^ i^ ? ^fc^^? relación de expresión (valor medio ± DE) para el grupo de ovario normal se determinó como 0.182 ± 0.024, para el grupo del tumor LMP como 0.847 ± 0.419 y para el grupo de carcinoma como 0.771 ± 0.380 (cuadro 2). Una comparación entre el grupo normal y el grupo tumor mostró que la 5 sobreexpresión del gen TADG-15 es estadísticamente significativa tanto en el grupo del tumor LMP, en el grupo de carcinoma (tumor LMP:p<0.001, carcinoma:p<0.0001 ). Como se muestra en la figura 6, los transcritos de TADG-15 se evidenciaron en todos los carcinomas de ovario, pero no estuvieron presentes ío a niveles detectable en ninguno de los siguientes tejidos: a) ovario normal, b) hígado y cerebro fetal, c) bazo, timo, testículos, ovario y linfocitos de sangre <f periférica de adulto, d) músculo esquelético, hígado, cerebro o corazón. Esta evaluación se extendió al panel estándar de aproximadamente 40 tumores. Utilizando iniciadores específicos para TADG-15, la expresión también se 15 examinó en líneas celulares tumorales derivadas a partir tanto de tejidos de carcinoma de ovario como de mama como se muestra en la figura 7 y en otros tejidos tumorales como se muestra en la figura 8. La expresión de TADG- 15 también se observó en carcinomas de mama, colon, próstata y pulmón. • Los anticuerpos policlonales desarrollados para un péptido 20 sintético (de 12 elementos) en el carboxi terminal del dominio de proteasa se utilizan para examinar la expresión de TADG- 15 en líneas celulares mediante Western blot y mediante inmunolocalización en ovarios normales y tumores de ovario. Los Western blot de extractos de células a partir de células SW626 y CAOV3 se ensayaron tanto con anticuerpos como con suero preinmune (figura 9). Varias bandas se detectaron con el anticuerpo, incluyendo bandas de aproximadamente 100,000 daltones, aproximadamente 60,000 daltones y 32,000 daltones. El tamaño molecular anticipado de la molécula completa de TADG-15 se estima que es de aproximadamente 100,000 daltones, y el dominio de proteasa y cuál puede ser liberado mediante escisión proteolítica en aa #614 se estima que es de aproximadamente 32,000 daltones. Algunos productos proteolíticos intermediarios pueden estar representados por la banda de 60,000 daltones. La tinción con anticuerpos de las células tumorales confirman la presencia de la proteasa TADG-15 el citoplasma de un tumor LMP seroso, tumor LMP mucinoso y carcinoma seroso (figura 10B, C y D, respectivamente). Este patrón de tinción difuso puede deberse a la detección de TADG-15 dentro de las células conforme ésta empieza a ser empaquetada y transportada a la superficie celular. En el carcinoma de endometrio, el antígeno es claramente detectable sobre la superficie de las células tumorales (figura 10E). No se detectó tinción en el epitelio de ovario normal o en las células estromales (figura 10A). La tinción inmunohistoquímica de una serie de 27 tumores indicó la presencia de la proteína TADG-15 en todos los subtipos de carcinomas examinados, incluyendo el grupo potencial de baja malignidad. Una tinción fuerte se evidenció en 7 de 9 tumores potenciales de baja malignidad y 13 de 18 carcinomas (cuadro 3).

CUADRO 2 Número de casos con sobreexpresión de TADG -15 en ovarios normales y tumores de ovario 10 La relación del nivel de expresión de TADG-15 a ß-tubulina (media ± DE). • 15 20 UfcttiAi -*« ** *.*r^*.».~*?*~*~ EJEMPLO 12 Homología de TADG-15 Recientemente, una proteína de ratón denominada epitina (número de acceso GenBank No. AF042822) ha sido descrita.14 La epitina es una proteína de 902 aminoácidos la cual contiene una estructura similar a TADG-15 en tanto que tiene un dominio citoplásmico, dominio transmembranal, dos dominios CUB, cuatro dominios similares a LDLR y un dominio serin proteasa carboxi terminal. TADG-15 y epitina son 84% similares en 843 aminoácidos, sugiriendo que las proteínas pueden ser ortólogas (figura 11 ). El papel preciso de la epitina permanece desconocido. Una búsqueda en GeneBank para secuencias similares previamente identificadas produjo una secuencia con homología relativamente alta a una porción del gen TADG-15. La similitud entre la porción de TADG-15 para los nucleótidos #182 a 3139 y SNC-19 número de acceso GeneBank No. #U20428 es de aproximadamente 97% (figura 12). Hay diferencias significativas entre SNC-19 y TADG-15. Por ejemplo, TADG-15 y en un marco abierto de lectura de 855 aminoácidos mientras que es marco de lectura abierto más grande de SNC-19 es de 173 aminoácidos. Adicionalmente, SNC-19 no incluye un sitio de inicio adecuado para el inicio de la traducción, ni incluye la porción amino terminal de la proteína codificada por TADG-15. Además, SNC-19 no incluye un marco abierto de lectura para una serin proteasa funcional debido a que los residuos His, Asp y Ser de la tríada *,« ^asi^^A.j.^. ^.^ catalítica que son necesarios para la función están codificados en diferentes marcos de lectura.

Implicaciones La estructura general de la proteína TADG-15 relativamente similar a los miembros de la familia toloide/BMP-1 y los subcomponentes del complemento, Clr/CIs. Estas proteínas contienen ambos dominios CUB y proteasa, y una formación compleja a través del dominio de unión al ligando es esencial para su función. La acción de los dominios serin proteasa de Clr y Cls requiere escisión proteolítica de los enlaces Arg-Gly y Arg-lle, respectivamente. 15 Similarmente, se puede esperar que la proteína TADG-15 se sintetice como zimógeno, el cual se activa mediante escisión entre Arg614 y Val615 y análogos al mecanismo de activación de otros zimógenos de serin proteasa. Los análisis Western blot de lisados de células cultivadas confirmaron tanto un péptido de 100 kDa como de 32 kDa, el cual corresponde al zimógeno putativo (molécula completa) y un producto escindido de proteasa de TADg-15 (figura 9). Estos datos apoyan un modelo para liberación proteolítica y/o activación de TADG-15 como ocurre para serin proteasas similares del tipo II. Los dominios CUB se encontraron inicialmente en subcomponentes del complemento C1 r/Cls16-18 y se sabe que son un módulo ampliamente extendido en las proteínas que regulan el desarrollo, tales como la proteína morfogenética de hueso-1 (BMP-1 ) y el producto del 61 CUADRO 3 Tinción inmunohistoquímica utilizando TADG-15 - Negativo; + Positivo; ++ Positivo fuerte (más de 50% de la función celular) gen toloide. 18-20 El papel de estas secuencias repetidas permanece desconocido. Sin embargo, algunos modelos sugieren que el dominio CUB puede estar implicado en las interacciones proteína-proteína. El dominio CUB puede de Clr y Cls participa en el ensamblaje del complejo tetramérico Cls- Clr-CIr-CIs en la activación de la ruta clásica del complemento al proveer dominios de interacción proteína-proteína.15 La proteína decapentaplégica de Drosophila (DPP) es esencial para la especificación dorsal-ventral del embrión, y taloide de Drosophila (TLD), un complejo con DPP para regular su actividad. 19,20 Las mutaciones sin sentido en el dominio CUB de la proteína toloide resulta en un fenotipo que no permite una interacción de la proteína con el complejo DPP. 19 La proteína TADG-15 contiene dos secuencias repetidas en tándem de dominios similares a CUB entre los residuos de aminoácidos 214 y 447. Cada uno de éstos es de aproximadamente 110 aminoácidos de largo y cada uno tiene cuatro residuos conservados de cisteína característicos de otros CUB (aminoácidos 214, 244, 268, 294, 340, 366, 397, 400 días). Por analogía, dos repetidos CUB de la proteína TADG- 15 pueden formar un dominio de interacción capaz de promover la formación de complejos multiméricos y regular la actividad de la proteína blanco o la TADG- 15 misma. La proteína TADG- 15 también contiene el dominio similar al repetidos de unión al ligando del receptor LDL (motivo clase A), el cual consiste de cuatro repetidos contiguos ricos cisteína (residuos de aminoácidos 453 a 602). Cada repetido rico en cisteína es de aproximadamente 40 aminoácidos de largo y contiene una secuencia conservada, negativamente cargada (Ser-Asp-Glu) con seis residuos de cisteína. En la proteína receptor de LDL, se cree que este repetido es un dominio de unión a proteína el cual interactúa con los residuos de lisina y arginina presentes en lipoproteínas. 21 ,22 Además, el primer repetido del receptor a LDL parece unirse a Ca2+ y no a las lipoproteínas. 23 Por analogía, es posible que el repetido similar al receptor LDL en TADG-15 pueda actuar de manera similar, interactuando con regiones positivamente cargadas de otras proteínas y diagonal, como un sitio de unión de Ca2+. Como resultado de la unión al ligando y la formación del complejo receptor-ligando, el receptor LDL se internaliza mediante depresiones cubiertas con clatrina. 24 TADG-15 no contiene el motivo en su región citosólica, y además, no se encontraron similitudes con otras secuencias de proteínas conocidas en el dominio citoplásmico de la TADG-15. Este hallazgo sugiere que TADG-15 funciona de manera similar a partir de los receptores endocíticos (tales como el receptor LDL), aunque TADG-15 posee repetidos de unión al ligando similares en la matriz extracelular. Aunque el papel preciso de TADG-15 se desconoce, el gen está claramente sobreexpresado en los tumores de ovario. Una variedad de proteasas, tales como la colagenasa tipo IV y el activador de plasminógeno, parecen estar implicadas en el proceso de invasión tumoral y son constituyentes de una cascada de proteasa en la progresión de la malignidad. TADG-15 puede constituir dicha actividad y digerir directamente los componentes de matriz extracelular que rodean al tumor, o activar otras proteasas mediante la escisión de precursores inactivos, indirectamente mejorando el crecimiento del tumor y la invasión. También es posible que TADG-15 pueda funcionar similarmente a un miembro de la familia taloide/BMP-1 al formar complejos con otros factores de crecimiento o proteínas de transducción de la señal para modular sus actividades. Estos datos tienen la posibilidad de que el gen TADG-15 y su proteína traducida sean un marcador útil para la detección temprana de carcinoma de ovario a través de la liberación del dominio proteasa hacia la matriz extracelular y finalmente a la circulación. Éstos datos también sugieren la posibilidad de utilizar TADG-15 como un blanco para intervención terapéutica a través de sistemas de administración dirigidos a los dominios de unión al ligando CUB/LDLR. Las siguientes referencias se citan en la presente: 1. Liotta, L , et al. Cell, 64: 327-336, 1991. 2. Duffy, M.J. Clin. Exp. Metástasis, 10: 145-155, 1992. 3. Tryggvason, K., et al. Biochem. Biophys. Acta., 907: 191 217, 1987. 4. Levy, A.T., et al. Cáncer Res., 51: 439-444, 1991. 5. Monsky, W.L. et al. 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Un experto en la técnica apreciará fácilmente que la presente invención se adapta bien para llevar a cabo los objetivos y obtener los 5 resultados y ventajas mencionadas, así como aquellos inherentes a la presente. Los presentes ejemplos junto con los métodos, procedimientos, tratamientos, moléculas y compuestos específicos descritos en la presente son actualmente representativos de las modalidades preferidas, y son ejemplares, y no se pretende que limiten el alcance de la invención. Los 10 cambios en la presente y en otros usos serán evidentes a los expertos en la técnica los cuales se abarcan dentro del espíritu de la invención como se define por el alcance de las reivindicaciones.

• LISTADO DE SECUENCIA <110> O'Brien, Timothy J. Tanimoto, Hirotoshi <120> TADG-15: Una Serin Proteasa Extracelular Sobreexpresada en Carcinomas <130> D6064CIPPCT <141> 10-20-2000 <150> US 09/421,213 <151> 10-20-1999 <160> 98 <210> 1 <211> 3147 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> TADG-15 <400> 1 tcaagagcgg cctcggggta ccatggggag cgatcgggcc cgcaagggcg 50 gagggggccc gaaggacttc ggcgcgggac tcaagtacaa ctcccggcac 100 gagaaagtga atggcttgga ggaaggcgtg gagttcctgc cagtcaacaa 150 cgtcaagaag gtggaaaagc atggcccggg gcgctgggtg gtgctggcag 200 ccgtgctgat cggcctcctc ttggtcttgc tggggatcgg cttcctggtg 250 tggcarttgc agtaccggga cgtgcgtgtc cagaaggtct tcaatggcta 300 catgaggatc acaaatgaga attttgtgga tgcctacgag aactccaact 350 ccactgagtt tgtaagcctg gccagcaagg tgaaggacgc gctgaagctg 400 ctgtacagcg gagtcccatt cctgggcccc taccacaagg agtcggctgt 4JU tjrf ? <. ??.tcí"t" c agcgagggca gcgtcatcgc ctactactgg tctgagttca 500 gcatcccgca gcacctggtg gaggaggccg agcgcgtcat ggccgaggag 550 cgcgtagtca tgctgccccc gcgggcgcgc tccctgaagt cctttgtggt 600 cacctcagtg gtggctttcc 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<400> 7 Arg He Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp 5 10 15 Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr 20 25 30 Leu He Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 35 40 45 Lys He Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu Gly Glu His 50 55 60 Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala 65 70 75 Gln Val He He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His 80 85 90 Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 95 100 105 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg 110 115 120 Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln 125 130 135 Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn 140 145 150 Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys 155 160 165 *"*» » * ? iúÁi ÁA??M y *Au»*^b>«¿Í **~ *t*« Aim*>.*b *W.*M*H**i*^á Val Gly Asp Ser Pro Asn He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly 170 175 180 Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly 185 190 195 Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He 200 205 210 Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val 215 220 225 Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr He Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met 230 235 240 Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 245 250 255 <210> 8 <211> 253 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Activador de Pía:sminógenos de Tejido <400> 8 Arg He Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp He Ala Ser His Pro Trp 5 10 15 Gln Ala Ala He Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg 20 25 30 Phe Leu Cys Gly Gly He Leu He Ser Ser Cys Trp He Leu Ser 35 40 45 Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr 50 55 60 Val He Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu 65 70 75 Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr He Val His Lys Glu Phe Asp 80 85 90 Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp He Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser 95 100 105 Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val 110 115 120 Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys 125 130 135 Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr 140 145 150 Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser 155 160 165 Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn 170 175 180 Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn 185 190 195 Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys 200 205 210 1 | ? t ¡¡¡¡tu f tifí irmmiimiP'^^ Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly He He Ser Trp Gly 215 220 225 Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val 230 235 240 Thr Asn Tyr Leu Asp Trp He Arg Asp Asn Met Arg Pro 245 250 <210> 9 <211> 2900 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> SNC-19; No. de acceso GeneBank #U20428 <400> 9 cgctgggtgg tgctggcagc cgtgctgatc ggcctcctct tggtcttgct 50 ggggatcggc ttcctggtgt ggcatttgca gtaccgggac gtgcgtgtcc 100 agaaggtctt caatggctac atgaggatca caaatgagaa ttttgtggat 150 gcctacgaga actccaactc cactgagttt gtaagcctgg ccagcaaggt 200 gaaggacgcg ctgaagctgc tgtacagcgg agtcccattc ctgggcccct 250 accacaagga gtcggctgtg acggccttca gcgagggcag cgtcatcgcc 300 tactactggt ctgagttcag catcccgcag cacctggttg aggaggccga 350 gcgcgtcatg gccaggagcg cgtagtcatg ctgcccccgc gggcgcgctc 400 cctgaagtcc tttgtggtca cctcagtggt ggctttcccc acggactcca 450 aaacagtaca gaggacccag gacaacagct gcagctttgg cctgcacgcc 500 gcggtgtgga gctgatgcgc ttcaccacgc cggcttccct gacagcccct 550 accccgctca tgcccgctgc cagtgggctg cggggacgcg acgcagtgct 600 gagctactcg agctgactcg cagcttgact gcgcctcgac gagcgcggca 650 gcgacctggt gacgtgtaca acaccctgag ccccatggag ccccacgcct 700 ggtgagtgtg tggcacctac cctccctcct acaacctgac cttccactcc 750 ctcccacgaa cgtcctgctc atcacactga taaccaacac tgacgcggca 800 tcccggcttt gaggccacct tcttccagct gcctaggatg agcagctgtg 850 gaggccgctt acgtaaagcc caggggacat tcaacagccc ctactaccca 900 ggccactacc cacccaacat tgactgcaca tggaaaattg aggtgcccaa 950 caaccagcat gtgaaggtgc gcttcaaatt cttctacctg ctggagcccg 1000 gcgtgcctgc gggcacctgc cccaaggact acgtggagat caatggggag 1050 aaatactgcg gagagaggtc ccagttcgtc gtcaccagca acagcaacaa 1100 gatcacagtt cgcttccact cagatcagtc ctacaccgac accggcttct 1150 tagctgaata cctctcctac gactccagtg acccatgccc ggggcagttc 1200 acgtgccgca cggggcggtg tatccggaag gagctgcgct gtgatggctg 1250 ggcgactgca ccgaccacag cgatgagctc aactgcagtt gcgacgccgg 1300 ccaccagttc acgtgcaaga gcaagttctg caagctcttc tgggtctgcg 1350 acagtgtgaa cgagtgcgga gacaacagcg acgagcaggg ttgcatttgt 1400 ccggacccag accttcaggt gttccaatgg gaagtgcctc tcgaaaagcc 1450 agcagtgcaa tgggaaggac gactgtgggg acgggtccga cgaggcctcc 1500 tgccccaagg tgaacgtcgt cacttgtacc aaacacacct accgctgcct 1550 caatgggctc tgcttgagca agggcaaccc tgagtgtgac gggaaggagg 1600 actgtagcga cggctcagat gagaaggact gcgactgtgg gctgcggtca 1650 ttcacgagac aggctcgtgt tgttgggggc acggatgcgg atgagggcga 1700 gtggccctgg caggtaagcc tgcatgctct gggccagggc cacatctgcg 1750 ****.** **.A Li gtgcttccct catctctccc aactggctgg tctctgccgc acactgctac 1800 atcgatgaca gaggattcag gtactcagac cccacgcagg acggccttcc 1850 tgggcttgca cgaccagagc cagcgcaggc cctggggtgc aggagcgcag 1900 gctcaagcgc 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gctgtggtcc 2750 ttggccacgc ttcttgagga agcccaggct cggaggaccc tggaaaacag 2800 acgggtctga gactgaaaat ggtttaccag ctcccaggtg acttcagtgt 2850 gtgtattgtg taaatgagta aaacatttta tttcttttta aaaaaaaaaa 2900 <210> 10 <211> 902 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Epitina <400> 10 Met Gly Ser : Asn Arg Gly Arg Lys Ala Gly Gly Gly Ser Glni Asp 5 10 15 Phe Gly Alai Gly Leu Lys Tyr Asp Ser Arg Leu Glu Asn Met . Asn 20 25 30 Gly Phe Glui Glu Gly Val Glu Phe Leu Pro Ala Asn Asn Ala . Lys 35 40 45 Lys Val Glui Lys Arg Gly Pro Arg Arg Trp Val Val Leu Val Ala 50 55 60 Val Leu Phe ! Ser Phe Leu Leu Leu Ser Leu Met Ala Gly Leu . Leu 65 70 75 Val Trp Hisi Phe His Tyr Arg Asn Val Arg Val Gln Lys Val Phe 80 85 90 Asn Gly Hisi Leu Arg H ,e Thr Asn Glu He Phe Leu Asp Ala Tyr 95 100 105 Glu Asn Ser • Thr Ser Thr Glu Phe He Ser Leu Ala Ser Gln Val 110 115 120 Mái.^ fc . ,.afe& a.. jan*. .«-&*. ««*a Lys Glu Ala Leu Lys Leu Leu Tyr Asn Glu Val Pro Val Leu Gly 125 130 135 Pro Tyr His Lys Lys Ser Ala Val Thr Ala Phe Ser Glu Gly Ser 140 145 150 Val He Ala Tyr Tyr Trp Ser Glu Phe Ser He Pro Pro His Leu 155 160 165 Ala Glu Glu Val Asp Arg Ala Met Ala Val Glu Arg Val Val Thr 170 175 180 Leu Pro Pro Arg Ala Arg Ala Leu Lys Ser Phe Val Leu Thr Ser 185 190 195 Val Val Ala Phe Pro He Asp Pro Arg Met Leu Gln Arg Thr Gln 200 205 210 Asp Asn Ser Cys Ser Phe Ala Leu His Ala His Gly Ala Ala Val 215 220 225 Thr Arg Phe Thr Thr Pro Gly Phe Pro Asn Ser Pro Tyr Pro Ala 230 235 240 His Ala Arg Cys Gln Trp Val Leu Arg Gly Asp Ala Asp Ser Val 245 250 255 Leu Ser Leu Thr Phe Arg Ser Phe Asp Val Ala Pro Cys Asp Glu 260 265 270 His Gly Ser Asp Leu Val Thr Val Tyr Asp Ser Leu Ser Pro Met 275 280 285 Glu Pro His Ala Val Val Arg Leu Cys Gly Thr Phe Ser Pro Ser 290 295 300 Tyr Asn Leu Thr Phe Leu Ser Ser Gln Asn Val Phe Leu Val Thr 305 310 315 Leu He Thr Asn Thr Gly Arg Arg His Leu Gly Phe Glu Ala Thr 320 325 330 Phe Phe Gln Leu Pro Lys Met Ser Ser Cys Gly Gly Val Leu Ser 335 340 345 Asp Thr Gln Gly Thr Phe Ser Ser Pro Tyr Tyr Pro Gly His Tyr 350 355 360 Pro Pro Asn He Asn Cys Thr Trp Asn He Lys Val Pro Asn Asn 365 370 375 Arg Asn Val Lys Val Arg Phe Lys Leu Phe Tyr Leu Val Asp Pro 380 385 390 Asn Val Pro Val Gly Ser Cys Thr Lys Asp Tyr Val Glu He Asn 395 400 405 Gly Glu Lys Gly Ser Gly Glu Arg Ser Gln Phe Val Val Ser Ser 410 415 420 Asn Ser Ser Lys He Thr Val His Phe His Ser Asp His Ser Tyr 425 430 435 Thr Asp Thr Gly Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Ser Tyr Asp Ser Asn 440 445 450 Asp Pro Cys Pro Gly Met Phe Met Cys Lys Thr Gly Arg Cys He 455 460 465 Arg Lys Glu Leu Arg Cys Asp Gly Trp Ala Asp Cys Pro Asp Tyr 470 475 480 Ser Asp Glu Arg Tyr Cys Arg Cys Asn Ala Thr His Gln Phe Thr 485 490 495 \¿?*?±L?Í*¿??* m»..«*.*q¿~l?.**.^ M*.

Cys Lys Asn Gln Phe Cys Lys Pro Leu Phe Trp Val Cys Asp Ser 500 505 510 Val Asn Asp Cys Gly Asp Gly Ser Asp Glu Glu Gly Cys Ser Cys 515 520 525 Pro Ala Gly Ser Phe Lys Cys Ser Asn Gly Lys Cys Leu Pro Gln 530 535 540 Ser Gln Lys Cys Asn Gly Lys Asp Asn Cys Gly Asp Gly Ser Asp 545 550 555 Glu Ala Ser Cys Asp Ser Val Asn Val Val Ser Cys Thr Lys Tyr 560 565 570 Thr Tyr Arg Cys Gln Asn Gly Leu Cys Leu Ser Lys Gly Asn Pro 575 580 585 Glu Cys Asp Gly Lys Thr Asp Cys Ser Asp Gly Ser Asp Glu Lys 590 595 600 Asn Cys Asp Cys Gly Leu Arg Ser Phe Thr Lys Gln Ala Arg Val 605 610 615 Val Gly Gly Thr Asn Ala Asp Glu Gly Glu Trp Pro Trp Gln Val 620 625 630 Ser Leu His Ala Leu Gly Gln Gly His Leu Cys Gly Ala Ser Leu 635 640 645 He Ser Pro Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Asp 650 655 660 Asp Lys Asn Phe Lys Tyr Ser Asp Tyr Thr Met Trp Thr Ala Phe 665 670 675 Leu Gly Leu Leu Asp Gln Ser Lys Arg Ser Ala Ser Gly Val Gln 680 685 690 Glu Leu Lys Leu Lys Arg He He Thr His Pro Ser Phe Asn Asp 695 700 705 Phe Thr Phe Asp Tyr Asp He Ala Leu Leu Glu Leu Glu Lys Ser 710 715 720 Val Glu Tyr Ser Thr Val Val Arg Pro He Cys Leu Pro Asp Ala 725 730 735 Thr His Val Phe Pro Ala Gly Lys Ala He Trp Val Thr Gly Trp 740 745 750 Gly His Thr Lys Glu Gly Gly Thr Gly Ala Leu He Leu Gln Lys 755 760 765 Gly Glu He Arg Val He Asn Gln Thr Thr Cys Glu Asp Leu Met 770 775 780 Pro Gln Gln He Thr Pro Arg Met Met Cys Val Gly Phe Leu Ser 785 790 795 Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser 800 805 810 Ser Ala Glu Lys Asp Gly Arg Met Phe Gln Ala Gly Val Val Ser 815 820 825 Trp Gly Glu Gly Cys Ala Gln Arg Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr 830 835 840 Arg Leu Pro Cys Ser Ser Gly Leu Asp Gln Arg Ala His Trp Gly 845 850 855 He Ala Ala Trp Thr Asp Ser Arg Pro Gln Thr Pro Thr Gly Met 860 865 870 Pro Asp Met His Thr Trp He Gln Glu Arg Asn Thr Asp Asp He 875 880 885 i iiijbiilM^.at^^ Tyr Ala Val Ala Ser Pro Pro Gln His Asn Pro Asp Cys Glu Leu 890 895 900 His Pro <210> 11 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <221> n=Inosma <222> 6, 9, 12 , 15 , 18 <223> Iniciador oligonucleótido degenerado <400> 11 tgggtngtna cngcngcnca ytg 23 <210> 12 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <221> n=Inosina <222> 3, 6, 9, 12, 18 <223> Iniciador oligonucleótido degenerado <400> 12 arnggnccnc cnswrtcncc 20 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Fragmento de TADG-15 <400> 13 Leu Phe Arg Asp Trp He Lys Glu Asn Thr Gly Val 5 10 <210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador hacia delante de oligonucleótidos para TADG-15 <400> 14 atgacagagg attcaggtac 20 <210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador reverso de oligonucleótidos para TADG-15 <400> 15 gaaggtgaag tcattgaaga 20 <210> 16 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador hacia adelante de oligonucleótidos para ß-tubulina <400> 16 cgcatcaacg tgtactacaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador reverso de oligonucleótidos para ß-tubulina <400> 17 tacgagctgg tggactgaga 20 <210> 18 <211> 3147 <212> RNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Antisentido de TADG-15 <400> 18 uuuuuuuuuu uuuuuuuuua aaaagaaaua aauuguuuua cccauuuaca 50 caaauacaca cacugaaguc cacccuggga gcugguaaaa caauuucagu 100 cucagacccg ucuguuuucc aggguccucc gagccugggc uuccucaaga 150 gcguggccca agggccccac agcccagauc cggcagcccc accaccuuca 200 cugaggaggc uccgaagcuc cguucccgcu gcuccuuaca gacaggggag 250 gcagauauac acaaacgcgc cucggcccag cuuggggcug gcgggggagg 300 cugugucuuc aaaccuuugc ccccaguugg gucaguagaa ccaccagugu 350 ccuccccuuc uaccucccag cuccacuuug gaggcugagg aagcgagagg 400 uuuucuaggc agauuuggag cccuggagau ugaguucaca guguauguuc 450 ugggggcgcu ggugcaguca gcgguccagu cuccagccug caggcgugca 500 l i I • i i- ' , .- cacuggggug gacgaugggu ggccccgcag guguacacau uuggguggcc 550 ccggccccua uaccccagug uucucuuuga uccagucccg aaacagaggg 600 agccuugugu acacgccugg cuuguuccuc ugagcgcagc cgucucccca 650 gcucaccaca ccggccugga agauccgccc auccgccucc acgcuggaca 700 gggguccccc ggaaucaccc uggcaggagu ccacgccgcc gcugaggaag 750 cccacgcaca ucaugcgcgg cgugaucugc ugcggcagga gguucucgca 800 gguggucugg uugaugacgc ggaucucacc cuuuugcagg aucagcgcgc 850 cagugccucc auacugggug uguccccagc ccgugaccca gauggccuug 900 ccggcaggga agacauggga ggcguccggc aggcagaugg gccgcaccau 950 ggagcuguac ucugccgguu ucuccagcuc cagcagcgcg augucauagu 1000 cgaaggugaa gucauugaag aagggguggg agaugaugcg cuugagccug 1050 cgcuccugca ccccaggggc gcugcgcugg cucuggucgu gcaagcccag 1100 gaaggccguc cacugcgugg ggucugagua ccugaauccu cugucaucga 1150 uguagcagug ugcggcagag accagccagu ugggagagau gagggaagca 1200 ccgcagaugu ggcccuggcc cagagcaugc aggcuuaccu gccagggcca 1250 cucgcccuca uccgcauccg ugcccccaac aacacgagcc ugucucguga 1300 augaccgcag cccacagucg caguccuucu caucugagcc gucgcuacag 1350 uccuccuucc cgucacacuc aggguugccc uugcucaagc agagcccauu 1400 gaggcagcgg uagguguguu ugguacaagu gacgacguuc accuuggggc 1450 aggaggccuc gucggacccg uccccacagu cguccuuccc auugcacugc 1500 uggcuuuucg agaggcacuu cccauuggaa caccugaagg ucugggccgg 1550 acaacugcac cccugcucgu cgcuguuguc uccgcagucg uucacacugu 1600 cgcagaccca gaagaggggc uugcagaacu uguucuugca cgugaacugg 1650 uggccggcgu cgcaacugca guugagcuca ucgcuguggu cggugcaguc 1700 ggcccagcca ucacagcgca gcuccuuccg gauacaccgc cccgugcggc 1750 acgugaacug ccccgggcau gggucacugg agucguagga gagguauuca 1800 gcuaagaagc cggugucggu guaggacuga ucugagugga agcgaacugu 1850 gaucuuguug cuguugcugg ugacgacgaa cugggaccuc ucuccgcagu 1900 auuucucccc auugaucucc acguaguccu uggggcaggu gcccgcaggc 1950 acgccgggcu ccagcaggua gaagaauuug aagcucaccu ucacaugcug 2000 guuguugggc accucaaugu uccaugugca gucaauguug gguggguagu 2050 ggccugggua guaggggcug uugaaugucc ccugggcuuu acguaagcgg 2100 ccuccacagc ugcucauccu aggcagcugg aagaaggugg ccucaaagcc 2150 gggaugccgc cgcucagugu ugguuaucag ugugaugagc aggacguucu 2200 gggaggagug gaaggucagg uuguaggagg gaggguaggu gccacacaac 2250 ugcaccaggg cguggggcuc cauggggcuc aggguguugu acaccgucac 2300 caggucgcug ccgcgcucgu cgcaggacgc aaggucaaag cugcggaagg 2350 ugaggcucag cacugagucg gcgucccccc gcagggccca cuggcagcgg 2400 gcaugagcgg gguaggggcu gucagggaag ccgggcgugg ugaagcgcau 2450 cagcuccaca ccgcgggcgu gcaggccaaa gcugcagcug uuguccuggg 2500 uccucuguac uguuuuggag uccgugggga aagccaccac ugaggugacc 2550 acaaaggacu ucagggagcg cgcccgcggg ggcagcauga cuacgcgcuc 2600 cucggccaug acgcgcucgg ccuccuccac caggugcugc gggaugcuga 2650 acucagacca guaguaggcg augacgcugc ccucgcugaa ggccgucaca 2700 gccgacuccu ugugguaggg gcccaggaau gggacuccgc uguacagcag 2750 cuucagcgcg uccuucaccu ugcuggccag gcuuacaaac ucaguggagu 2800 uggaguucuc guaggcaucc acaaaauucu cauuugugau ccucauguag 2850 ccauugaaga ccuucuggac acgcacgucc cgguacugca aaugccacac 2900 caggaagccg auccccagca agaccaagag gaggccgauc agcacggcug 2950 r tn ?ñ??Ímt ?*?* ?*' ccagcaccac ccagcgcccc gggccaugcu uuuccaccuu cuugacguug 3000 uugacuggca ggaacuccac gccuuccucc aagccauuca cuuucucgug 3050 ccgggaguug uacuugaguc ccgcgccgaa guccuucggg cccccuccgc 3100 ccuugcgggc ccgaucgcuc cccaugguac cccgaggccg cucuuga 3147 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 68-76 de la proteína TADG-15 <400> 19 Val Leu Leu Gly He Gly Phe Leu Val 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 126-134 de la proteína TADG-15 <400> 20 Leu Leu Tyr Ser Gly Val Pro Phe Leu 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 644-652 de la proteína TADG-15 <400> 21 Ser Leu He Ser Pro Asn Trp Leu Val 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 379-387 de la proteína TADG-15 <400> 22 Lys Val Ser Phe Lys Phe Phe Tyr Leu 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 386-394 de la proteína TADG-15 <400> 23 Tyr Leu Leu Glu Pro Gly Val Pro Ala 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 257-265 de la proteína TADG-15 <400> 24 Ser Leu Thr Phe Arg Ser Phe Asp Leu 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 762-770 de la proteína TADG-15 <400> 25 He Leu Gln Lys Gly Glu He Arg Val 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 841-849 de la proteína TADG-15 <400> 26 Arg Leu Pro Leu Phe Arg Asp Trp He 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 64-72 de la proteína TADG-15 <400> 27 Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Gly He 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 57-65 de la proteína TADG-15 <400> 28 Val Leu Ala Ala Val Leu He Gly Leu 5 10 <210> 29 <211> 9 <2 2> PRT <213> Homo sapiens • <220> <223> Residuos 67-75 de la proteína TADG-15 <400> 29 Leu Val Leu Leu Gly He Gly Phe Leu 5 15 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 379-387 de la proteína TADG-15 <400> 30 # Lys Val Ser Phe Lys Phe Phe Tyr Leu 5 20 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 126-134 de la proteína TADG-15 <400> 31 Leu Leu Tyr Ser Gly Val Pro Phe Leu 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 88-96 de la proteína TADG-15 <400> 32 Lys Val Phe Asn Gly Tyr Met Arg He 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 670-678 de la proteína TADG-15 <400> 33 Thr Gln Trp Thr Ala Phe Leu Gly Leu 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Ho o sapiens <220> <223> Residuos 119-127 de la proteína TADG-15 <400> 34 Lys Val Lys Asp Ala Leu Lys Leu Leu 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 60-68 de la proteína TADG-15 <400> 35 Ala Val Leu He Gly Leu Leu Leu Val 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 62-70 de la proteína TADG-15 <400> 36 Leu He Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 57-65 de la proteína TADG-15 <400> 37 Val Leu Ala Ala Val Leu He Gly Leu 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 61-69 de la proteína TADG-15 <400> 38 Val Leu He Gly Leu Leu Leu Val Leu 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 146-154 de la proteína TADG-15 <400> 39 Phe Ser Glu Gly Ser Val He Ala Tyr 5 i í <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 658-666 de la proteína TADG-15 <400> 40 Tyr He Asp Asp Arg Gly Phe Arg Tyr 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 449-457 de la proteína TADG-15 <400> 41 Ser Ser Asp Pro Cys Pro Gly Gln Phe 10 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT • <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 401-409 de la proteína TADG-15 <400> 42 Tyr Val Glu He Asn Gly Glu Lys Tyr 15 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 387-395 de la proteína TADG-15 • <400> 43 Leu Leu Glu Pro Gly Val Pro Ala Gly 20 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens y. L ? - . ii¿.:^^*y ,ái i *^Éméí¿ <220> <223> Residuos 553-561 de la proteína TADG-15 <400> 44 Gly Ser Asp Glu Ala Ser Cys Pro Lys 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 97-105 de la proteína TADG-15 <400> 45 Thr Asn Glu Asn Phe Val Asp Ala Tyr 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 110-118 de la proteína TADG-15 <400> 46 Ser Thr Glu Phe Val Ser Leu Ala Ser 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 811-819 de la proteína TADG-15 <400> 47 Ser Val Glu Ala Asp Gly Arg He Phe 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 666-674 de la proteína TADG-15 <400> 48 Tyr Ser Asp Pro Thr Gln Trp Thr Ala 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 709-717 de la proteína TADG-15 <400> 49 Asp Tyr Asp He Ala Leu Leu Glu Leu 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 408- 416 de la proteína TADG-15 <400> 50 Lys Tyr Cys Gly Glu Arg Ser Gln Phe 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 754- 762 de la proteína TADG-15 <400> 51 Gln Tyr Gly Gly Thr Gly Ala Leu He 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 153- 161 de la proteína TADG-15 <400> 52 Ala Tyr Tyr Trp Ser Glu Phe Ser He 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 722-730 de la proteína TADG-15 <400> 53 Glu Tyr Ser Ser Met Val Arg Pro He 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 326-334 de la proteína TADG-15 <400> 54 Gly Phe Glu Ala Thr Phe Phe Gln Leu 10 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT • <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 304-312 de la proteína TADG-15 <400> 55 15 Thr Phe His Ser Ser Gln Asn Val Leu 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 707-715 de la proteína TADG-15 • <400> 56 20 Thr Phe Asp Tyr Asp He Ala Leu Leu 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 21-29 de la proteína TADG-15 <400> 57 Lys Tyr Asn Ser Arg His Glu Lys Val 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 665-673 de la proteína TADG-15 <400> 58 Arg Tyr Ser Asp Pro Thr Gln Trp Thr 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 686-694 de la proteína TADG-15 <400> 59 Ala Pro Gly Val Gln Glu Arg Arg Leu 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 12-20 de la proteína TADG-15 <400> 60 Gly Pro Lys Asp Phe Gly Ala Gly Leu 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens MMa<tjtoA<wrttt^ t, , <220> <223> Residuos 668-676 de la proteína TADG-15 <400> 61 Asp Pro Thr Gln Trp Thr Ala Phe Leu 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 461-469 de la proteína TADG-15 <400> 62 Thr Gly Arg Cys He Arg Lys Glu Leu 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 59-67 de la proteína TADG-15 <400> 63 Ala Ala Val Leu He Gly Leu Leu Leu 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 379-387 de la proteína TADG-15 <400> 64 Lys Val Ser Phe Lys Phe Phe Tyr Leu <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 119-127 de la proteína TADG-15 <400> 65 Lys Val Lys Asp Ala Leu Lys Leu Leu 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 780-788 de la proteína TADG-15 <400> 66 Leu Pro Gln Gln He Thr Pro Arg Met 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 67-75 de la proteína TADG-15 <400> 67 Leu Val Leu Leu Gly He Gly Phe Leu 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 283-291 de la proteína TADG-15 <400> 68 Ser Pro Met Glu Pro His Ala Leu Val 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT < 13> Homo sapiens <220> <223> Residuos 12-20 de la proteína TADG- 15 <400> 69 Gly Pro Lys Asp Phe Gly Ala Gly Leu 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 257-265 de la proteína TADG-15 <400> 70 Ser Leu Thr Phe Arg Ser Phe Asp Leu 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 180-188 de la proteína TADG-15 <400> 71 Met Leu Pro Pro Arg Ala Arg Ser Leu 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 217-225 de la proteína TADG-15 <400> 72 Gly Leu His Ala Arg Gly Val Glu Leu 5 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 173-181 de la proteína TADG-15 <400> 73 Met Ala Glu Glu Arg Val Val Met Leu 5 <210> 74 <211> 9 Í*.*, ^*** ?±~?Á , <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 267-275 de la proteína TADG-15 <400> 74 Ser Cys Asp Glu Arg Gly Ser Asp Leu 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 567-575 de la proteína TADG-15 <400> 75 Cys Thr Lys His Thr Tyr Arg Cys Leu 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 724-732 de la proteína TADG-15 <400> 76 Ser Ser Met Val Arg Pro He Cys Leu 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 409-417 de la proteína TADG-15 <400> 77 Tyr Cys Gly Glu Arg Ser Gln Phe Val 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 495- 503 de la proteína TADG-15 <400> 78 Thr Cys Lys Asn Lys Phe Cys Lys Pro 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 427- 435 de la proteína TADG-15 <400> 79 Val Arg Phe His Ser Asp Gln Ser Tyr 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 695- 703 de la proteína TADG- 15 <400> 80 Lys Arg He He Ser His Pro Phe Phe 5 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 664- 672 de la proteína TADG-15 <400> 81 Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Thr Gln Trp 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 220- 228 de la proteína TADG-15 <400> 82 láÁ íá^ ..,^..^., Ala Arg Gly Val Glu Leu Met Arg Phe 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 492-500 de la proteína TADG-15 <400> 83 His Gln Phe Thr Cys Lys Asn Lys Phe 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 53-61 de la proteína TADG-15 <400> 84 Gly Arg Trp Val Val Leu Ala Ala Val 5 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 248-256 de la proteína TADG-15 <400> 85 Leu Arg Gly Asp Ala Asp Ser Val Leu 5 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 572-580 de la proteína TADG-15 <400> 86 Tyr Arg Cys Leu Asn Gly Leu Cys Leu 5 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 692-700 de la proteína TADG-15 <400> 87 Arg Arg Leu Lys Arg He He Ser His 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 24-32 de la proteína TADG-15 <400> 88 Ser Arg His Glu Lys Val Asn Gly Leu 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 147-155 de la proteína TADG-15 <400> 89 Ser Glu Gly Ser Val He Ala Tyr Tyr 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 715-723 de la proteína TADG-15 <400> 90 Leu Glu Leu Glu Lys Pro Ala Glu Tyr 5 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 105-113 de la proteína TADG-15 <400> 91 Tyr Glu Asn Ser Asn Ser Thr Glu Phe 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 14-22 de la proteína TADG- 15 <400> 92 Lys Asp Phe Gly Ala Gly Leu Lys Tyr 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 129-137 de la proteína TADG-15 <400> 93 Ser Gly Val Pro Phe Leu Gly Pro Tyr 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 436-444 de la proteína TADG-15 <400> 94 Thr Asp Thr Gly Phe Leu Ala Glu Tyr 5 <210> 95 <211> 9 <212> PRT ^^^g| m^ <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 766-774 de la proteína TADG-15 <400> 95 Gly Glu He Arg Val He Asn Gln Thr 5 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 402-410 de la proteína TADG-15 <400> 96 Val Glu He Asn Gly Glu Lys Tyr Cys 5 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 482-490 de la proteína TADG-15 <400> 97 Asp Glu Leu Asn Cys Ser Cys Asp Ala 5 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Residuos 82-90 de la proteína TADG-15 <400> 98 Arg Asp Val Arg Val Gln Lys Val Phe 5 í ^ A,. ^ ?. ^.*-*s^****^>->*

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un ADN aislado que codifica una proteína del gen 15 derivada del antígeno tumoral (TADG-15), caracterizado porque se selecciona a partir del grupo que consiste de: (a) ADN aislado que codifica una proteína TADG-15; y (b) ADN aislado que tienen a partir de los ADN aislados de (a) anteriormente mencionados en las secuencias de codón debido a la degeneración del código genético, el cual codifica una proteína TADG-15. 2.- El ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho ADN tiene la secuencia que se muestra en SEQ ID No. 1. 3.- El ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha proteína TADG- 15 tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID No. 2. 4.- Un vector caracterizado porque comprende el ADN como se reclama en la reivindicación 1 y elementos reguladores necesarios para la expresión dicho ADN en una célula. 5.- El vector de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho ADN codifica una proteína TADG-15 que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID No. 2. 6.- El vector de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho ADN está ubicado en orientación reversa con relación a dichos elementos reguladores tales como ARNm antisentido de TADG-15 se producen. 7 - Una célula hospedera caracterizada porque está transfectada con el vector como el que se reclama en la reivindicación 4, dicho vector expresando una proteína TADG-15. 8.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque dicha célula se selecciona a partir del grupo que consiste de células bacterianas, células de mamífero, células de planta y células de insecto. 9.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque dicha célula bacteriana es E. coli. 10.- Una proteína TADG-15 aislada y purificada codificada por ADN caracterizada porque se selecciona a partir del grupo que consiste de: (a) ADN aislado el cual codifica una proteína TADG- 15; y (b) ADN aislado que difiere a partir de los ADN aislados de (a) anteriormente mencionados en la secuencia de codón debido a la degeneración del código genético, y el cual codifica una proteína TADG-15. 11.- La proteína TADG-15 de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque dicha proteína tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2. ¿A*á+á¿á? . *+—. .-. .— .. -.. 12.- Un método para detectar ARNm de TADG-15 en una muestra, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) poner en contacto una muestra con una sonda, en donde dicha sonda es específica para TADG- 15; y (b) detectar la unión de dicha sonda a ARNm de TADG-15 en dicha 5 muestra.