ES2211868T3 - Lineas celulares humanas inmortalizadas que contienen genes de citocromos p450 exogenos. - Google Patents
Lineas celulares humanas inmortalizadas que contienen genes de citocromos p450 exogenos.Info
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Abstract
SE PRESENTAN LINEAS CELULARES BRONCOEPITELIALES HUMANAS, QUE NO PRODUCEN TUMORES EN DONDE LAS LINEAS CELULARES SON CAPACES DE EXPRESAR LOS GENES DE CITOCROMO P450 QUE SE HAN INSERTADO EN LAS LINEAS CELULARES. TAMBIEN SE PRESENTAN LOS METODOS Y KITS PARA IDENTIFICAR LOS MUTAGENES, CITOTOXINAS, CARCINOGENES Y AGENTES QUIMIOTERAPEUTICOS POTENCIALES MEDIANTE LA UTILIZACION DE ESTAS LINEAS CELULARES.
Description
Líneas celulares humanas inmortalizadas que
contienen genes citocromos P450 exógenos.
La presente invención se refiere a la
construcción y aplicación de vectores recombinantes que contienen
secuencias de ADN para la codificación y la expresión eficaz de
citocromos P450 enzimáticamente activos en células de mamífero. La
invención se refiere también a células epiteliales bronquiales
humanas inmortalizadas que contienen diversos genes de citocromo
P450 y a los usos de estas células.
Los citocromos P450 son una gran familia de
enzimas hemoproteicas capaces de metabolizar xenobióticos tales como
fármacos, carcinógenos y contaminantes ambientales así como
endobióticos tales como esteroides, ácidos grasos y prostaglandinas.
Algunos miembros de la familia del citocromo P450 son inducibles
tanto en animales como en células cultivadas, mientras que otras
formas constitutivas son no inducibles. Este grupo de enzimas lleva
a cabo actividades metabólicas beneficiosas mediante la
detoxificación de xenobióticos así como la conversión
metabólicamente dañina de xenobióticos en formas tóxicas,
mutagénicas y carcinogénicas (Gelboln, Physiol. Rev., 60:
1107-1188, 1980).
En animales, se expresan simultáneamente
múltiples formas moleculares de los citocromos P450, y todas ellas
exhiben propiedades físicas y biológicas comunes. La multiplicidad y
propiedades comunes de los citocromos P450 hacen difícil separar sus
diferentes formas, especialmente las formas minoritarias. Incluso en
situaciones en que los citocromos P450 se han aislado en forma
purificada mediante procedimientos de purificación enzimática
convencionales, se han retirado de la asociación natural con la
membrana biológica y por lo tanto requieren la adición de
NADPH-citocromo P450 reductasa y otras fracciones
celulares para su actividad enzimática. Estos factores adicionales
han evitado una mayor comprensión del papel y la función de las
formas individuales de citocromo en el metabolismo, la
detoxificación y la activación tanto de sustratos xenobióticos como
endobióticos.
El ensayo toxicológico de fármacos, carcinógenos
potenciales, productos alimentarios, aditivos alimentarios y
contaminantes alimentarios se ha realizado en animales, y más
recientemente, en sistemas in vitro tales como modelos de
cultivo de bacterias (test Ames) y células animales. Estos sistemas
tienen desventajas puesto que no tienen un metabolismo específico
humano. Por lo tanto, la extrapolación para determinar el riesgo
humano es difícil y potencialmente inexacta. Los sistemas de ensayo
bacterianos y algunos de los modelos de cultivo de células animales
carecen de actividad metabólica completa y no detectarían ningún
compuesto dañino que dependa de la activación mediante rutas
metabólicas, por ejemplo por las enzimas citocromo P450. En el
pasado, esta situación se evitó añadiendo enzimas metabolizantes
aisladas de hígado de rata a las células animales cultivadas. Este
enfoque plantea dos problemas significativos. En primer lugar, el
metabolismo resultante no es necesariamente el mismo que en el
hombre. En segundo lugar, los metabolitos altamente reactivos
podrían no alcanzar su molécula diana y, en consecuencia, escapar a
la detección.
Aunque se han introducido enzimas metabolizantes
humanas en una línea celular humana, este sistema sufre de graves
deficiencias. (Crespi, Progress in Clinical and Biological
Research, vol. 340. S. Mendelsohn y Albertini (eds.)
Wiley-Lisz, Nueva York 97-106,
1990). Las células humanas son linfoblastos que no constituyen un
tejido diana importante de citotoxinas, mutágenos o carcinógenos y
no tienen actividad citocromo P450 natural en ausencia de
inductores. Además, faltan otras enzimas implicadas en el proceso de
activación, por ejemplo epóxido hidrolasa, en estas células, y deben
introducirse mediante metodología de transferencia génica. Este
sistema comprende por lo tanto un modelo artificial con una
correlación cuestionable con la situación in vivo.
Por lo tanto, resulta deseable tener un sistema
de línea celular humana in vitro que se asemeje estrechamente
a la condición humana in vivo. La presente invención
proporciona una línea celular epitelial bronquial humana no
tumorigénica en la que la línea celular es capaz de crecer sin
senescencia cuando se cultiva in vitro en medio de
crecimiento y es capaz de expresar un gen de citocromo P450 exógeno
que se ha insertado en la línea celular. El gen puede insertarse
mediante transfección o infección. Los genes de P450 expresados en
esta línea celular incluyen IA1, IA2, IIC9, IID6, IIE1 y/o IIIA4. Es
una línea celular preferida descrita en la invención
BEAS-2B-IA2, que es una línea
celular BEAS-2B transfectada con el gen IA2 de
citocromo P450.
En realizaciones de esta invención, se describen
diversos procedimientos de utilización de las líneas celulares. Por
ejemplo, se describe un procedimiento para identificar o ensayar la
mutagenicidad, citotoxicidad o carconogenicidad de un agente, que
comprende las etapas de: a) hacer reaccionar, cultivar o poner en
contacto la línea celular con un agente sospechoso de ser un
mutágeno, citotoxina o carcinógeno, y b) determinar o controlar
aquellos efectos o cambios en la línea celular que son indicativos
de mutagenicidad, citotoxicidad o carcinogenicidad.
Se describe también en esta invención un
procedimiento para identificar o ensayar la actividad
quimioterapéutica de un agente, que comprende las etapas de: a)
hacer reaccionar, cultivar o poner en contacto la línea celular con
un agente sospechoso de ser quimioterapéutico, y b) determinar o
controlar aquellos efectos o cambios en la línea celular que son
indicativos de actividad quimioterapéutica. El agente puede añadirse
antes del carcinógeno para medir los efectos preventivos del
agente.
En un aspecto adicional de esta invención, se
proporciona un procedimiento para determinar los metabolitos
activados por un carcinógeno o xenobiótico, que comprende las etapas
de: a) hacer reaccionar, cultivar o poner en contacto la línea
celular con el sospechoso de carcinógeno o xenobiótico, y b)
identificar los metabolitos y/o sus efectos.
Se proporciona también un kit de diagnóstico que
comprende la línea celular para uso en uno de los
procedimientos.
En un aspecto adicional de la invención, se
proporcionan vectores recombinantes infecciosos que contienen
secuencias de ADNc completas de citocromos tales como
P1-450 y P3-450, también conocidas
como CYPIA1 y CYPIA2, respectivamente. La presente invención
proporciona también sistemas que expresan proteínas de citocromo
P450 enzimáticamente activas en células humanas.
Resultarán evidentes diversos otros objetivos y
ventajas de la presente invención a partir de la descripción
detallada de la invención.
Se comprenderán mejor estos y otros objetivos,
rasgos y muchas de las ventajas acompañantes de la invención tras la
lectura de la siguiente descripción detallada cuando se considera en
relación con los dibujos adjuntos a la misma.
La figura 1 muestra la construcción esquemática
de virus Vaccinia recombinantes para expresar los citocromos de
ratón P1-450 y P3-450. P11 y 7,5,
secuencias reguladoras transcripcionales de Vaccinia para
polipéptidos de 11 K y 7,5 K respectivamente; LacZ, gen de
\beta-galactosidasa de Escherichia coli;
TK_{L} y TK_{R}, segmentos escindidos de ADN de virus Vaccinia
en las posiciones a la izquierda y a la derecha del gen TK
respectivamente; Amp^{r} es el gen de resistencia a
ampicilina;
la Figura 2 demuestra la identificación de los
polipéptidos P1-450 y P3-450 de
citocromo. Los lisados (100 \mug) se sometieron a electroforesis y
se detectaron mediante inmunotransferencia. Los marcadores de peso
molecular proteico teñidos se muestran a la derecha. 2A. Expresión
en células WI-38 y NIH 3T3. 2B. Transcurso temporal
de la síntesis en células NIH 3T3. La banda minoritaria a M_{r}
\approx 80.000 detectada en todos los carriles celulares no se
detectó cuando se utilizó antisuero diluido;
la Figura 3 muestra los polipéptidos
P1-450 y P3-450 de citocromo en
fracciones subcelulares. En cada carril, se sometieron a
electroforesis e inmunotransferencia 100 \mug de proteína;
la Figura 4 muestra los espectros de diferencia
de CO de fracciones microsomales reducidas con ditionito. Los
microsomas se solubilizaron con emulsionante 913, y se utilizó el
sobrenadante para los espectros. - - - espectro reducido con
ditionito, - - - espectro reducido y saturado con CO;
la Figura 5 muestra la expresión de la actividad
AHH. Las células infectadas se recogieron en los intervalos de
tiempo indicados y en los lisados se ensayó la actividad AHH. Las
células NIH 3T3 se infectaron con VV-P1,
VV-P3 y WT-VV. No se encontró
ninguna actividad detectable en las células control no infectadas
(no mostradas);
la Figura 6 muestra el análisis por TLC de la
actividad acetanilida hidroxilasa. Se ensayaron los lisados
celulares (500 \mug) y se separaron los productos mediante
TLC;
la Figura 7 muestra la construcción esquemática
de los factores recombinantes para expresar genes de citocromo P450
y la transfección de los vectores a células BEAS-2B;
y
la Figura 8 muestra la citotoxicidad de la
aflatoxina A o la aflatoxina G en las líneas
BEAS-2B-pXT1 y
BEAS-2B-IA2.
El anterior y diversos otros objetivos y ventajas
de la presente invención se consiguen (a) construyendo vectores
recombinantes que contienen secuencias de ADNc para la codificación
de polipéptidos de citocromo P450 de modo que las células de
mamífero, especialmente humanas, cuando se infectan con dichos
vectores recombinantes expresan eficazmente los polipéptidos de
P450; y (b) proporcionando líneas celulares funcionalmente intactas
que contienen polipéptidos de citocromo sin necesidad de la adición
externa de NADPH citocromo P450 reductasa para su actividad
enzimática.
A menos que se defina de otro modo, todos los
términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria
tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un
experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque
puede utilizarse cualquier procedimiento y material similar o
equivalente al descrito en la práctica o el ensayo de la presente
invención, se describen ahora los procedimientos y materiales
preferidos.
Las líneas celulares epiteliales bronquiales
inmortalizadas utilizadas en esta invención se describen en la
patente de EE.UU. 4.886.238. Estas líneas celulares se preparan de
la siguiente manera.
Se cultivaron células epiteliales bronquiales
humanas normales (NHBE) de explantes de muestras de necropsia
traqueobronquial de individuos no cancerosos como se describe por
Lechner et al., J. Tissue Culture Methods, 9:
43-48, 1985. Las células NHBE se infectaron con
virus híbrido adenovirus 12-SV40. En todos los
casos, la duración de estos cultivos fue prolongada en comparación
con las NHBE; la mayoría de los cultivos experimentaron un
prolongado periodo de senescencia designado como "crisis". Con
el cultivo continuado, en algunos casos surgieron colonias de
células que habían escapado a la senescencia; con dichas colonias
supervivientes se hicieron posteriormente pasadas durante periodos
extensos de tiempo y mostraron un potencial de crecimiento
ilimitado.
Como las células NHBE, pero al contrario que las
células de carcinoma bronquial, algunas de las líneas celulares así
derivadas retuvieron la capacidad de experimentar diferenciación
escamosa en respuesta a la exposición a suero. La inyección de estas
células en ratones desnudos atímicos irradiados no dio como
resultado la formación de tumores tras periodos de hasta nueve
meses. Además, se encontró que estas líneas celulares eran
receptores adecuados para la transfección de genes adicionales y
útiles para ensayar el potencial de citotoxicidad de agentes
químicos y físicos, la capacidad de inhibición o promoción del
crecimiento de agentes biológicos, y el potencial de diferenciación
escamosa de agentes químicos y biológicos.
Es una línea celular preferida para uso en esta
invención BEAS-2B, que se preparó de la manera
siguiente. Se cultivaron células NHBE a partir de explantes de
muestras de autopsia de individuos no cancerosos como se describe
por Lechner et al., J. Tissue Culture Methods 9:
43-48, 1985. Las células se cultivaron en un medio
exento de suero, LHC-9, se recogieron mediante
tripsinación y se sembraron en 10 ml de medio de crecimiento en
discos de cultivo de 100 mm (Lux, Miles Scientific, Naperville, IL)
cuyas superficies de crecimiento se habían recubierto con una
solución de seroalbúmina bovina, fibronectina y colágeno (Lechner
et al., supra).
Se hizo crecer el virus híbrido adenovirus
12-SV40 (Ad12SV40) (Schell, et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 65: 81-88, 1968) en células
Vero como se describe por Rhim et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 78: 313-317, 1981. Las células NHBE se
expusieron al virus a 37ºC durante 4 horas y a una multiplicidad de
la infección de aproximadamente 100. Cuando los cultivos alcanzaron
la confluencia, se subcultivó cada disco en dos matraces de 75
cm^{3}. Las células se dejaron alcanzar la confluencia de nuevo y
después se volvieron a alimentar dos veces al día hasta que
aparecieron colonias transformadas y las células normales murieron.
La senescencia de las células normales se aceleró exponiendo los
cultivos a 1% de FCS en LHC-9 durante 28 días
(Lechner et al., Differentiation 25:
229-237, 1984); todo el cultivo posterior de estas
células fue en medio LHC-9 exento de suero. Se
subcultivaron colonias individuales 41 días después de la infección
viral y las cepas celulares así derivadas de este experimento se
designaron como BEAS-2.
Puesto que las células BEAS-3B
derivan de células epiteliales bronquiales humanas, que son
probablemente las células progenitoras de todos los tipos de cáncer
de pulmón, las células BEAS-2B deberían representar
la situación in vivo. Son capaces de expresar IA1 y otras
enzimas implicadas en el proceso de activación de carcinógenos y
mutágenos, tales como
glutation-S-transferasa, epóxido
hidrolasa y NADPH citocromo P450 reductasa.
Pueden aislarse clones de ADN genómico o ADNc que
codifican genes del citocromo P450 a partir de bibliotecas de clones
utilizando sondas de hibridación diseñadas basándose en las
secuencias nucleotídicas o aminoacídicas para el gen deseado. Las
sondas pueden construirse mediante síntesis química o mediante
reacciones en cadena con polimerasa utilizando cebadores basados en
los datos de secuencia para amplificar fragmentos de ADN de mezclas
combinadas o bibliotecas (patentes de EE.UU. 4.683.195 y 4.883.202).
Las sustituciones, deleciones, adiciones nucleotídicas y similares
pueden incorporarse también a los polinucleótidos, siempre que la
capacidad de hibridar del polinucleótido no se desestabilice
sustancialmente (Maniatis et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª ed., 1989 y Berger y Kimmel, Methods in
Enzimology, volumen 152, Guide to Molecular Cloning
Techniques (1987). Los clones pueden expresarse o el gen P450 de
interés puede escindirse o sintetizarse para uso en otros sistemas.
Se describen las secuencias de diversos aislamientos de ADNc para
IIC9 de citocromo P450 (Umbenhauer et al., Biochem.
25, 1094-1099, 1987 y Kimura et al., Nucl.
Acids. Res. 15: 10053-10054, 1987); IIE1 de P450
(Song et al., J. Biol. Chem. 281:
16689-16697, 1988 y Umeno et al.,
Biochem., 27: 9006-913, 1988); e IIA4 de P450
(Beaune et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:
8064-8068, 1986 y González et al., DNA
7: 79-86, 1988). El IA2 de citocromo P450 se
describe por Jaiswal et al., Nucl. Acids Res. 14:
8773-8774, 1986; el IIA3 por Yamano et al.,
Biochem. 29: 1322-1329, 1990; y el IID6 por
González et al., Genomics 2: 174-179,
1988.
Los genes del citocromo P450 pueden transferirse
a las líneas celulares mediante transfección de ADN de plásmido o
mediante infección retroviral. La transfección de células puede
ocurrir mediante aquellos procedimientos utilizados habitualmente,
tales como tratamiento con fosfato de calcio o estroncio,
microinyección, electroporación o lipofección. Por ejemplo, las
células pueden inyectarse con un promotor dirigido por la LTR de
Molony o lipofectarse con un constructo de promotor de adenovirus,
virus Vaccinia, VIH o CMV. El plásmido de ADN transfectado puede
contener un gen marcador detectable o puede cotransfectarse con un
plásmido que contiene un marcador detectable, y en algunos casos, el
vector retroviral contiene un gen marcador detectable. Cuando se
transfiere uno o más marcadores detectables a las células junto con
el gen de P450, las poblaciones celulares que contienen el gen de
P450 pueden identificarse y enriquecerse seleccionando el marcador o
marcadores. Los marcadores son típicamente resistencias a
antibióticos frente a antibióticos tales como tetraciclina,
higromicina, neomicina y similares. Otros marcadores pueden incluir
timidina quinasa y similares.
Se introdujeron ADNc complementarios de enzimas
del citocromo P450, IA2, IIA3, IID6 e IIIA4, mediante retrovirus
anfotróficos recombinantes de alta titulación en células
BEAS-2B. Estos retrovirus se generaron clonando los
correspondientes ADNc en un plásmido pXT1 (Boulter et al.,
Nucleic Acid. 15: 7194, 1987) y transfectando los plásmidos
recombinantes en líneas de empaquetado cocultivadas con cubiertas
anfotrópicas (PA317) y ecotrópicas (Psi2) utilizando precipitación
con fosfato de calcio (Bestwick et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85: 5404-5408, 1988) (véase la
figura 7).
Después de 10 días, el virus se recogió de
cultivos PA317/Psi2 confluentes en medio PC-1 exento
de suero (Ventrex Laboratories, Inc., Portland, OR). Las
titulaciones se determinaron en células NIH3T3 y se expresaron como
colonias resistentes a neomicina/ml de sobrenadante. Las células
BEAS-2B se infectaron durante 2 horas con los virus
P450 o el virus control pXT1 en medio PC-1
suplementado con polibreno 8 \mug/ml (tabla 1).
Se empleó una relación igual de células a
unidades formadoras de colonias del virus. 48 horas después de la
infección, se seleccionaron las células BEAS-2B por
resistencia a neomicina G418 con 125 \mug/ml de neomicina durante
8 días. Posteriormente, las células se seleccionaron por la
presencia de los genes introducidos mediante análisis de
transferencia Western. Ejemplificado para P450IA2, la población y 3
clones (clon 8 > clon 3 > clon 6) expresaron la proteína
correspondiente al retrovirus P450 respectivo. Según ello, el clon 8
(cl 8) mostró la más alta sensibilidad, siendo hasta 150 veces más
sensible al efecto citotóxico y hasta 250 veces al efecto genotóxico
de un compuesto modelo, AFB_{1}, que el control.
La Figura 8 muestra también el análisis de la
citotoxicidad por aflatoxina B o aflatoxina G sobre los clones
BEAS-2B-pXT_{1} y
BEAS-2B-IA2. Las células se
expusieron a diversas concentraciones de los mutágenos durante 28
horas. Cada cultivo contenía 250 célula por disco de 60 mm. Después
de 7-10 días, se determinó la citotoxicidad midiendo
el número de colonias de cada placa. El número de colonias de los
cultivos tratados con mutágeno se dividió entre el número de
colonias de los cultivos no tratados para proporcionar la
supervivencia relativa. Cada punto temporal refleja al menos 3
experimentos independientes.
La Tabla 2 proporciona la formación de aducto de
ADN con AFB_{1}. La formación se elevó por un factor de 1000 en el
clon 8.
- (1)
- Identificación de fármacos quimioterapéuticos potenciales: estas células son útiles para evaluar compuestos químicos adecuados para el tratamiento del cáncer y enfermedades relacionadas al hacerlas crecer in vitro en medio que contiene el compuesto químico a ensayar y después, tras un periodo de exposición adecuado, determinar si y en qué extensión ha ocurrido citotoxicidad, por ejemplo mediante ensayo de exclusión con azul de triptano o ensayos relacionados (Paterson, Methods Enzymol. 58: 141, 1979) o mediante ensayos de crecimiento tales como la eficacia de formación de colonias (MacDonald et al., Exp. Cell. Res. 50: 417, 1968), todos los cuales son técnicas estándar bien conocidas en la técnica. Una vez se identifica un agente quimioterapéutico potencial, puede utilizarse con las células en numerosos estudios adicionales, tales como de diseño de fármacos. Estas células son también útiles en la identificación de carcinógenos potenciales.
- (2)
- Estudios del control de la diferenciación escamosa, e identificación de los agentes químicos y biológicos que inducen la diferenciación escamosa: Esto se consigue mediante ensayos descritos anteriormente para células epiteliales bronquiales humanas normales (Masul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2438, 1986). Algunas células retienen la capacidad de experimentar diferenciación escamosa en respuesta al suero. La inducción de la diferenciación terminal puede ser un modo eficaz de controlar el crecimiento del cáncer. Se evalúa la capacidad de las sustancias químicas y biológicas de inducir la diferenciación añadiéndolas al medio de crecimiento de estas células y, después de un intervalo de tiempo adecuado, determinando si ha ocurrido una serie de cambios, incluyendo terminación de la síntesis de ADN y aparición de morfología escamosa. Las células son también útiles para estudios de los mecanismos biológicos de diferenciación escamosa, y la existencia de ambas líneas celulares resistente a suero y sensible a suero posibilita comparaciones y la identificación de los genes implicados en el proceso de diferenciación.
- (3)
- Estudios de metabolismo de carcinógenos y otros xenobióticos: Pueden añadirse carcinógenos y otros xenobióticos al medio de crecimiento de estas células y después la apariencia de los productos metabólicos de estos compuestos puede controlarse mediante técnicas tales como cromatografía en capa fina o cromatografía líquida de alta resolución y similares. Se determina después la interacción de los compuestos y/o sus metabolitos con el ADN.
- (4)
- Estudios de mutagénesis de ADN: Pueden añadirse sustancias conocidas por o sospechosas de ser mutágenos al medio de crecimiento de las células y ensayarse después las mutaciones, por ejemplo mediante la detección de la aparición de colonias celulares mutantes resistentes a fármacos (Thompson, Methods Enzymol. 58: 308, 1979). Y de forma similar, mutagénesis de ADN mediada por célula mediante cocultivo de las células con tipos celulares conocidos por o sospechosos de ser capaces de secretar compuestos mutagénicos (Hsu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 2003, 1978).
- La enzima P450 puede ligarse también a un ensayo de detección de mutágeno tal como el sistema Ames Salmonella/microsoma para detectar o ensayar la frecuencia mutagénica inducida por contaminantes ambientales, carcinógenos y similares (Ames et al., Mut. Res., 31: 347, 1975). Pueden utilizarse también, por supuesto, otros procedimientos estándar bien conocidos en la técnica tales como la aberración cromosómica y la inducción del intercambio de cromátidas hermanas en células de ovario de hámster chino (Galloway et al., Environ Mutagen, 7: 1, 1985) o ensayos de mutagénesis de células de linfoma de ratón (Myhr, et al., Prog. in Mut. Res., 5: 556-568, 1985) para ensayar la mutagenicidad.
- (5)
- Estudios de agentes nocivos para cromosomas: Pueden añadirse sustancias conocidas por o sospechosas de causar daños cromosómicos al medio de cultivo de estas líneas celulares, y después puede medirse la extensión del daño cromosómico mediante técnicas tales como la medida de la frecuencia de intercambio de cromátidas hermanas (Latt, et al., en: Tice, R.R. y Hollaender, A. Sister Chromatid Exchanges, Nueva York; Plenum Press, pág. 11 y siguientes, 1984).
- (6)
- Estudios de transformación maligna mediante agentes químicos, físicos y virales y genes transferidos, incluyendo oncogenes, genes supresores de tumores mutantes y ADN genómico de alto peso molecular de tumores, utilizando ensayos estándar tales como crecimiento independiente del anclaje o formación de tumores en ratones desnudos atímicos.
- (7)
- Uso de células alteradas mediante la transferencia de oncogenes como en el apartado 6 anterior para evaluar agentes quimioterapéuticos potenciales (mediante las técnicas descritas en el apartado 1 anterior), especialmente aquellos que pueden ser específicos de células transformadas mediante la activación de oncogenes particulares, la combinación de oncogenes o de genes supresores de tumores mutantes.
- (8)
- Estudios de bioquímica celular, incluyendo cambios en el pH intracelular y los niveles de calcio, como se correlaciona con el crecimiento celular y la acción de agentes exógenos incluyendo, pero sin limitación, los descritos en los apartados 1 a 7 anteriores. Para estudiar el pH intracelular y los niveles de calcio, se exponen las células en recipientes de cultivo adecuados a tintes indicadores fluorescentes, y después se detectan las emisiones de fluorescencia con un espectrofotómetro de fluorescencia (Grynkiewicz, et al., J. Biol. Chem. 250: 3440-3450, 1985).
- (9)
- Estudios de respuestas celulares ante factores de crecimiento y producción de factores de crecimiento: Identificación y purificación de factores de crecimiento importantes para el crecimiento y la diferenciación de células epiteliales bronquiales humanas. Estas células son particularmente útiles para dicha aplicación puesto que crecen en medio exento de suero. Por lo tanto, pueden estudiarse las respuestas a los factores de crecimiento en medios de crecimiento definidos precisamente, y cualquier factor producido por las células puede identificarse y purificarse sin la complicación de la presencia de suero.
- (10)
- Uso de vectores de expresión de ADN recombinante para producir proteínas de interés. Por ejemplo, el gen que codifica una proteína de valor terapéutico puede recombinarse con segmentos de ADN controladores (concretamente que contienen un promotor con o sin una secuencia potenciadora), transferirse a una célula (por ejemplo mediante transfección con fosfato de estroncio) y, después, la proteína producida puede recogerse del sobrenadante de cultivo o un extracto celular mediante procedimientos de rutina bien conocidos en la técnica.
- (11)
- Estudios de comunicación intracelular, por ejemplo, mediante ensayos de carga de tinte por rascado. Para determinar si las células que crecen in vitro tienen la capacidad de comunicarse mediante conexiones de hueco, los cultivos pueden rascarse, por ejemplo con un escalpelo, en presencia de un tinte fluorescente en el medio de crecimiento. Las células en el borde de la herida se desestabilizan mecánicamente y por lo tanto incorporan tinte; puede evaluarse si ha ocurrido comunicación intercelular determinando si células distantes de la herida contienen también tinte.
- (12)
- Caracterización de los antígenos de superficie celular: las células se incuban con un anticuerpo contra el antígeno de superficie celular de interés, y después se hacen reaccionar con un segundo anticuerpo que está conjugado con un tinte fluorescente. Las células se evalúan después utilizando un clasificador de células activadas por fluorescencia para determinar si son fluorescentes y por tanto poseen el antígeno de superficie celular.
- (13)
- Estudios híbridos para la identificación de la actividad supresora de tumores (Stanbridge et al., Science 215: 252-259, 1982). Para determinar si estas líneas celulares contienen genes supresores de tumores, se condensan con células tumorales malignas. La presencia de genes supresores de tumores se indica por la pérdida de la malignidad, por ejemplo como se detecta por la pérdida de la capacidad de formar tumores en ratones desnudos atímicos en las células híbridas.
- (14)
- Identificación de nuevos genes, incluyendo genes transformantes en cánceres de origen natural descritos en el apartado 6 anterior, genes de factor de crecimiento como se describen en el apartado 9 anterior y genes supresores de tumores como se describen en el apartado 13 anterior utilizando técnicas biológicas moleculares estándar (Davis et al., Methods in Molecular Biology Nueva York, Elsevier, 1988) y técnicas tales como clonación por sustracción de ADNc y similares. Estos genes o sus derivados pueden utilizarse en terapia génica.
Por supuesto, se ensambla fácilmente un kit para
evaluar agentes carcinogénicos o antineoplásicos y para cualquier
otro uso como se describe en la presente memoria, que comprende un
envase o envases que contienen la línea o líneas celulares de la
presente invención. Pueden incluirse también otros componentes
encontrados rutinariamente en dichos kits con instrucciones para
realizar el ensayo.
Se adquirieron las endonucleasas de restricción,
la ADN polimerasa 1 y su fragmento de Klenow y la ADN ligasa T4 de
fuentes comerciales y se utilizaron según las especificaciones del
fabricante. Se adquirió la
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosidasa
(X-gal) de Boehringer Mannheim (Smith et al.,
Biotechniques, nov/dic: 306-312, 1984). La
C-acetanilida (31,7 mCi/mmol) se compró en
California Bionuclear.
Se obtuvieron los virus Vaccinia (cepa WR),
células HeLA, células CV-1, células
BSC-1 y células TK^{+}143 humanas de NIH,
Bethesda, MD. El virus se hizo crecer en células HeLa y se purificó
a partir de extractos citoplasmáticos mediante centrifugación en
gradiente de densidad de sacarosa siguiendo el procedimiento
descrito por Joklik, Virology, 16: 9-18,
1962. Todas las células se hicieron crecer en medio esencial mínimo
de Eagle modificado por Dulbecco que contenía 10% de suero bovino
fetal, y las células TK^{+} tenían además 25 \mug de BrdUrd por
ml.
Se emplearon el vector de inserción de
coexpresión pSC-11 (Chakrabarti et al.,
Mol. Cell. Biol., 5: 3403-3409, 1985) y
clones de ADN complementario de P1-450 y
P3-450 de citocomo (Kimura et al., J.
Biol. Chem., 259: 10705-10713, 1984) en la
construcción de los recombinantes. Los plásmidos se hicieron crecer
en bacterias y su ADN se purificó mediante dos centrifugaciones
secuenciales en gradientes de densidad en equilibrio de
CsCl-EtBr. Los fragmentos de ADN se separaron en
geles de agarosa y se purificaron mediante electroelución. Se
llevaron a cabo otros procedimientos de ADN recombinante mediante
procedimientos estándar (Maniatis et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York,
1982). El ADN de virus Vaccinia se extrajo de los viriones
purificados como se describe por Garon et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 75: 4835-4867, 1978.
Los procedimientos se llevaron a cabo
esencialmente como se describe por B. Moss y colegas (Mackett et
al., J. Virol., 49: 857-864, 1984; Smith,
supra; Mackett, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 78: 7415-7419, 1982). Se transfectaron
células de riñón de mono CV-1 subconfluentes
infectadas con virus Vaccinia de tipo salvaje
(WT-VV) con 10 \mug de vector recombinante y 1
\mug de ADN de virus Vaccinia de tipo salvaje. Dos días después de
la incubación, los virus TK^{+} recombinantes formados en las
células se distinguieron del tipo salvaje mediante un ensayo en
placa de células TK^{+} en presencia de BrdUrd (Chakrabarti et
al., 1985, supra). Las células TK^{-} con las placas
TK^{-} se recubrieron con agar que contenía 400 \mug de
X-gal por ml para comprobar la expresión
concomitante de \beta-galactosidasa, y también
para distinguir los recombinantes TK^{+} de los mutantes TK^{-}.
Los recombinantes TK^{+} \beta-gal^{+} se
purificaron mediante dos ciclos de selección. En los recombinantes
se evaluó después la presencia de los insertos de ADNc
P1-450 y P3-450 mediante hibridación
de transferencia de punto (Macket et al., 1982,
supra), y las soluciones madre de virus se prepararon en
células HeLa.
Se recogieron las células mediante rascado y los
lisados se prepararon mediante tres ciclos de
congelación-descongelación y una breve sonicación en
un tampón que contenía Tris-HCl 0,02 M, pH 7,5 +
sacarosa 0,25 M. La concentración de proteína se determinó mediante
el procedimiento de Lowry (Lowry et al., J. Bio.
Chem., 193: 265-275, 1951). Se realizó la
electroforesis en geles de poliacrilamida al 7,5% en presencia de
NaDodSO_{4} como se describe por Laemmli (Nature, 227:
680-685, 1970). Se utilizaron patrones de peso
molecular proteico preteñidos (Bethesda Research Laboratories) para
estimar el tamaño de los polipéptidos. Las proteínas sometidas a
electroforesis se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y las
proteínas transferidas se detectaron mediante transferencia Western
(Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:
4350-4354, 1979) utilizando una mezcla de antisuero
de conejo contra P-450c y P-450d.
Las formas P-450c y P-450d son los
homólogos en rata de P1-450 y P3-450
de ratón, respectivamente. Estas proteínas comparten un alto grado
de homología y sus antisueros reaccionan cruzadamente entre sí. Las
inmunotransferencias se detectaron incubando con inmunoglobulina G
de cabra anti-conejo conjugada con fosfatasa
alcalina (KPL Labs, Gaithersburg, MD) junto con el sustrato
cromogénico
5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato/cloruro
de p-nitroazultetrazolio.
Se prepararon fracciones microsomales de los
lisados celulares. Los lisados se centrifugaron aproximadamente a
700 g durante 10 minutos, y el sobrenadante se volvió a centrifugar
aproximadamente a 8.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante
resultante a 8.000 g se centrifugó de nuevo aproximadamente a
100.000 g durante 60 minutos para sedimentar los microsomas. La
fracción microsomal se suspendió en tampón fosfato de potasio 0,11
M, pH 7,6, que contenía 20% de glicerol. Para los espectros de
diferencia, la fracción microsomal se solubilizó con 0,14% de
emulsionante 913 (15 minutos), se centrifugó a 100.000 g durante 60
minutos y se utilizó el sobrenadante. Los espectros se midieron en
un espectrofotómetro modelo DW-2a de Aminco
Instruments Company como se describe por Omura et al., J.
Biol. Chem. 239: 2370-2378, 1964.
Se determinó la actividad arilhidrocarburo
hidroxilasa (AHH) mediante la medida de la fluorescencia de los
metabolitos fenólicos formados a partir de
benzo(a)pireno, Nebert et al., J. Biol.
Chem., 243: 6242-6249, 1968. La mezcla de
reacción contenía en 1,0 ml: 50 \mumol de
Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 \mumol de MgCl_{2}, 0,6
\mumol de NADPH, 100 nmol de benzo(a)pireno y 400
\mug de homogeneizado celular. La actividad AHH se expresa como
pmoles de producto equivalente a
3-OH-benzo(a)pireno
formado por mg de proteína por minuto. La actividad acetanilida
hidroxilasa se determinó midiendo la conversión de
^{14}C-acetanilida en sus derivados hidroxilados.
El sustrato y sus metabolitos se separaron mediante cromatografía en
capa fina de gel de sílice (TLC) siguiendo procedimientos estándar.
El ensayo se llevó a cabo en un volumen final de 1,0 ml que
contenía: 50 \mumol de Tris-HCl, pH 7,5, 0,3
\mumol de MgCl_{2} 0,6 \mumol de NADPH, 2 \mumol de
^{14}C-acetanilida a una actividad específica de
1,0 mCi/mmol y 500 \mug de homogeneizado celular total. La
actividad enzimática se expresa como pmoles de producto formado por
mg de proteína/minuto. Se punteó una alícuota del producto de
reacción en metanol en una placa de gel de sílice de capa fina de
250 \mul (Whatman) y se eluyó con 95% de cloroformo + 5% de
metanol. Los valores de R_{f} para acetanilida y
4-hidroxiacetanilida en estas condiciones son de
aproximadamente 0,74 y 0,2, respectivamente. La placa de gel se
autorradiografió, y el producto se cuantificó contando la
radiactividad después de rascado de la placa.
La construcción de genes quiméricos que contienen
las señales reguladoras transcripcionales y el sitio de inicio de
ARN de genes de virus Vaccinia, el sitio de inicio de la traducción
de las secuencias de codificación de P1-450 y
P3-450 de ratón y la incorporación de estas
secuencias al virus Vaccina de tipo salvaje para formar
recombinantes se presentan en forma de diagrama en la Figura 1. El
plásmido de partida en la secuencia de construcción de generación
del virus recombinante es el vector de inserción
pSC-11. Este vector de inserción de coexpresión
contiene: el gen de \beta-galactosidasa de
Escherichia coli bajo el control del promotor de Vaccinia
para la proteína de 11 K, un segundo promotor para la proteína de
7,5 K para la transcripción de las secuencias de codificación, un
único sitio Sma 1 cadena abajo del promotor de 7,5 K para la
inserción de secuencias de codificación de proteínas extrañas, y
secuencias flanqueantes de TK del virus Vaccinia para recombinación
homóloga dentro de las células infectadas (Mackett et al.,
1984, supra). Se modificaron un ADNc completo de 2,8 Kb de
P1-450 de citocromo y un ADNc completo de 1,9 kb de
P3-450 de citocromo (Kimura et al., 1984,
supra) y se insertaron en el único sitio Sma 1 del plásmido
de inserción para formar los vectores de recombinación que contienen
los P1-450 y P3-450 individuales. La
selección de los plásmidos de recombinación que contienen los
insertos de P1-450 y P3-450 en la
orientación correcta se realizó mediante cartografía de enzimas de
restricción. Los dos plásmidos de recombinación se utilizaron
después individualmente para transfectar células
CV-1 previamente infectadas con
WT-VV. La recombinación homóloga entre las
secuencias TK de Vaccinia en el plásmido de recombinación y el
genoma viral da como resultado la inserción de las secuencias de
P450 y \beta-galactosidasa en el virus Vaccinia.
Los virus progenie se ensayaron después en placa en células TK^{+}
en presencia de BrdUrd para seleccionar los virus TK^{-} y se
recubrieron con agar que contenía X-gal (sustrato
cromogénico para la \beta-galactosidasa) para
seleccionar los virus \beta-gal^{+}. Se confirmó
la presencia de los insertos P1-450 y
P3-450 en los recombinantes TK^{+} y
\beta-gal^{+} mediante hibridación de
transferencia de punto (Macklett et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 79: 7415-7419, 1982). Después de
dos purificaciones en placa secuenciales, las soluciones madre de
virus recombinante se designaron VV-P1 y
VV-P3, respectivamente.
Se ha realizado un depósito de los virus Vaccinia
recombinantes que contienen la secuencia de codificación completa
para P1-450 y P3-450 en la American
Type Culture Collection (ATTC), Rockville, Maryland, con los números
de acceso VR-2168 y VR-2169,
respectivamente. La línea celular BEAS-2B se
depositó también como CRL 9609. Los depósitos se mantendrán viables,
reemplazándolos si se vuelven no viables, durante un periodo de 30
años desde la fecha del depósito, o durante 5 años desde la última
fecha de solicitud de una muestra del depósito, lo que sea mayor, y
se pondrán a disposición del público sin restricciones de acuerdo
con las provisiones legales. El comisario de patentes y marcas, a
petición, tendrá acceso al depósito.
Se sometieron a electroforesis lisados de células
humanas y de ratón infectadas con cada uno de los virus
recombinantes en geles de
NaDodSO_{4}-poliacrilamida, y se analizaron
mediante inmunotransferencia (Figura 2A). Tanto las células
WI-38 humanas como las células NIH 3T3 de ratón
infectadas con el virus VV-P1 recombinante mostraron
una banda peptídica que se cocromatografiaba con
P1-450 de microsomas hepáticos de ratón a M_{r}=
55.000. Estas mismas células infectadas con el virus recombinante
VV-P3 mostraron una banda de proteína de migración
ligeramente más rápida que la cocromatografiada con
P3-450 de microsomas hepáticos de ratón a M_{r}=
54.000. En lisados de células control no infectadas o células
infectadas con WT-VV, no se detectaron ni las bandas
P1-450 ni P3-450. El transcurso
temporal de la síntesis de P1-450 y
P3-450 en células 3T3 infectadas con virus se
muestra en las inmunotransferencias de la Figura 2B. Las
P1-450 y P3-450 de citocromo se
detectaron tan temprano como 2 horas después de la infección, y la
cantidad del producto de expresión aumentó durante el intervalo de
tiempo posterior de 15 horas. Basándose en las intensidades
relativas de las bandas de proteína P1-450 y
P3-450 encontradas en células humanas y de ratón
infectadas y en los contenidos de P450 de los microsomas hepáticos
de ratón, se estima que el contenido específico está en el intervalo
de aproximadamente 15-90 pmoles por mg de lisados de
células infectadas. Estos resultados muestran claramente que los
recombinantes de virus Vaccinia infeccioso dirigían la síntesis de
P1-450 y P3-450 de citocromo. Los
productos polipeptídicos formados fueron indistinguibles de las
P1-450 y P3-450 de microsomas de
ratón. La síntesis de los polipéptidos P1-450 y
P3-450 de tamaño correcto indica que no se formaron
polipéptidos de fusión ni se expresó ningún marco de lectura
incorrecto. La detección de los productos de expresión de P450 en
cualquier punto temporal después de la infección es consistente con
el uso de un promotor temprano de Vaccinia.
Las apoproteínas de P450 celulares nativas
normalmente complejan con el hemo para formar hemoproteínas que se
transportan posteriormente a las membranas microsomales. Por lo
tanto, debía determinarse si las P1-450 y
P3-450 recién expresadas se transportan a los
microsomas en la célula. Por tanto, se determinó la distribución de
los polipéptidos P1-450 y P3-450 en
diferentes fracciones subcelulares de células infectadas con
VV-P1 y VV-P3mediante
inmunotransferencia. Los resultados presentados en la Figura 3
muestran que las P450 de citocromo recién expresadas se concentraban
en la fracción microsomal (sedimento de 100.000 g). No se detectó
ninguna cantidad, o cantidades despreciables, en el sobrenadante de
100.000 g. Estos resultados indican que las P450 de citocromo
sintetizadas mediante los virus Vaccinia recombinantes
VV-P1 y VV-P3 se translocan a las
membranas microsomales. La comparación de las intensidades de banda
relativas de los lisados y los microsomas de las células infectadas
indicó un enriquecimiento de 10 veces de las P450 expresadas en la
fracción microsomal.
Un rasgo característico de las hemoproteínas P450
de citocromo microsomal es que la forma nativa catalíticamente
activa exhibe máximos de absorción del complejo reducido con CO a
450 nm y las formas inactivas catalíticamente desnaturalizadas
exhiben máximos de absorción aproximadamente a 420 nm. El examen de
la fracción microsomal de las células NIH 3T3 infectadas con
VV-P1 mostró un máximo de absorción del complejo
reducido con CO a 450 nm, indicando que la P1-450
recién expresada en los microsomas está en configuración nativa
(Figura 4). De forma similar, la fracción microsomal de las células
infectadas con VV-P3 mostró un pico a 450 nm
característico de la P450 nativa. El contenido específico de
P1-450 de citocromo fue de 0,028 ng por mg y el de
P3-450 fue de 0,083 ng por mg de fracción microsomal
solubilizada con detergente. Estos resultados indican que las
proteínas P1-450 y P3-450 de
citocromo sintetizadas en células infectadas con virus incorporan un
resto hemo y se transportan y secuestran en la fracción microsomal
de manera indistinguible de las P450 celulares procesadas in
vivo nativas.
La actividad AHH en lisados de células 3T3
infectadas con VV-P1 muestra (figura 5) actividad
enzimática detectable tan temprano como 1 hora después de la
infección y un aumento de la actividad enzimática durante 12 horas
después de ella. Sin embargo, los lisados de células infectadas con
VV-P3 mostraron sólo una pequeña fracción de
actividad en comparación con la de VV-P1 incluso a
las 12 horas después de la infección. No se encontró actividad
detectable en células control no infectadas o en células infectadas
con WT-VV. La actividad AHH se inhibió completamente
con los antisueros contra P-450c y
P-450d (datos no mostrados). La actividad AHH
específica en diferentes preparaciones varió en el intervalo de
aproximadamente 10-70 pmoles por mg de lisados
celulares. La actividad AHH fue al menos 30 veces mayor con
P1-450 que con P3-450.
En los lisados de células 3T3 infectadas con
VV-P1 y VV-P3 durante diferentes
intervalos temporales se ensayó la actividad acetanilida hidroxilasa
y los autorradiograma del análisis por TLC de los productos formados
se presentan en la Figura 6. Los lisados de células infectadas con
VV-P3, además de la banda intensa de sustrato (valor
de Rf= 0,74), mostraron una banda de movimiento lento (valor de Rf=
0,2) que identificaba la posición de migración en TLC de los
productos hidroxilados de la acetanilida. La formación de
metabolitos hidroxilados aumentó con el tiempo. En células
infectadas con VV-P1, sin embargo, no hubo ninguna
banda detectable a un valor de Rf de 0,2. No hubo actividad
detectable en células control no infectadas o en células infectadas
con WT-VV. Se detectó una banda minoritaria a un
valor de Rf de 0,2 en células Hepa 1 infectadas con
VV-P1 después de una exposición prolongada
(resultado no mostrado). La actividad acetanilida hidroxilada
específica fue de aproximadamente 45 pmoles por mg de lisado
celular. La actividad acetanilida hidroxilasa fue al menos 20 veces
mayor con P3-450 que con P1-450.
El ensamblaje de la holoenzima y la expresión de
la actividad enzimática sin necesidad de la adición externa de
ninguna coenzima ni cofactor y similares muestra claramente que las
proteínas P1-450 y P3-450
codificadas por células infectadas con virus recombinantes se
sintetizan en forma de una molécula completa catalíticamente activa.
En contraposición, debería observarse que los citocromos P450
preparados por medios convencionales no exhiben actividad enzimática
a menos que se añada externamente NADPH citocromo P450 reductasa y
otras fracciones celulares (Goldstein et al., J. Biol.
Chem. 257: 2702, 1982: Guengerlch et al., Biochem.
21: 6019-6030, 1982; Negishi et al., J.
Biol. Chem., 254: 11015-11023, 1979). Además, la
P1-450 de citocromo de la presente invención tiene
30-40 veces más actividad AHH que la
P3-450, y la P3-450 de citocromo
mostró una actividad acetanilida hidroxilasa 20 veces mayor que la
P1-450, un rasgo característico y distintivo de
estas dos enzimas. Las células infectadas con virus recombinantes
expresaron 10^{7}-10^{8} moléculas de los
citocromos recién sintetizados por célula, y esto representa
0,1-1,0% de las proteínas celulares totales.
La disponibilidad de enzimas
P1-450 y P3-450 puras funcionalmente
intactas según la presente invención hace ahora posible por primera
vez ensayar in vitro el metabolismo, detoxificación,
mutagénesis o activación de sustancias xenobióticas y endobióticas.
La disponibilidad de dicho sistema enzimático puro facilita
significativamente el ensayo y desarrollo de nuevos fármacos, el
ensayo del metabolismo de carcinógenos, mutágenos químicos
ambientales y similares sin recurrir a caros sistemas in vivo
que consumen mucho tiempo. Además, el sistema de expresión de virus
Vaccinia recombinante de la presente invención proporciona un
procedimiento fácil, eficaz y económico de producción de grandes
cantidades de enzimas de citocromo P450 puras catalíticamente
activas que no era posible hasta el momento. Para obtener enzimas
P1-450 o P3-450 puras, se infectan
simplemente células de mamífero u otras adecuadas con virus Vaccinia
recombinante de la presente invención, y las células infectadas se
utilizan directamente como fuente de enzimas P1-450
y P3-450, que se sintetizan como resultado de la
infección. Como alternativa, la fracción microsomal o de retículo
endoplasmático de las células transfectadas puede separarse y
utilizarse como fuente de enzima pura.
Claims (10)
1. Una línea celular epitelial bronquial humana
no tumorigénica que contiene un gen de citocromo P450 exógeno que
puede expresarse en la línea celular.
2. La línea celular de la reivindicación 1, en la
que el gen del citocromo P450 es IA1, IA2, IIC9, IID6, IIE1 y/o
IIIA4.
3. La línea celular de la reivindicación 2, que
es BEAS-2B (ATCC CRL 9690) que contiene un gen IA2
del citocromo P450 exógeno.
4. La línea celular de la reivindicación 1, en la
que la línea celular antes de la inserción del gen de citocromo es
BEAS-2B depositada como ATCC CRL 9609.
5. Un procedimiento de identificación para ensayo
de la mutagenicidad, citotoxicidad o carcinogenicidad de un agente,
que comprende las etapas de:
a) hacer reaccionar, cultivar o poner en contacto
la línea celular de la reivindicación 1 con un agente sospechoso de
ser un mutágeno, citotoxina o carcinógeno, y
b) determinar o controlar aquellos efectos o
cambios sobre la línea celular que son indicativos de mutagenicidad,
citotoxicidad o carcinogenicidad.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el
que la línea celular es BEAS-2B (ATCC CRL 9609) que
contiene un gen IA2 de citocromo P450 exógeno.
7. El procedimiento para identificar o ensayar
la actividad quimioterapéutica de un agente, que comprende las
etapas de:
a) hacer reaccionar, cultivar o poner en contacto
la línea celular de la reivindicación 1 con un agente sospechoso de
ser quimioterapéutico en presencia de un carcinógeno, y
b) determinar o controlar aquellos efectos o
cambios sobre la línea celular que son indicativos de actividad
quimioterapéutica.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el
que el agente se hace reaccionar, se cultiva o se pone en contacto
con la línea celular antes de la adición del carcinógeno.
9. Un procedimiento para determinar los
metabolitos activados por un carcinógeno o xenobiótico, que
comprende las etapas de:
a) hacer reaccionar, cultivar o poner en contacto
la línea celular de la reivindicación 1 con el sospechoso de
carcinógeno o xenobiótico; y
b) identificar los metabolitos y/o sus
efectos.
10. Un kit de diagnóstico que comprende la línea
celular de la reivindicación 1.
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