ES2210352T3

ES2210352T3 - Disolucion de criopreservacion.

Info

Publication number: ES2210352T3
Application number: ES96908717T
Authority: ES
Inventors: Milo R. Polovina
Original assignee: PROTIDE PHARMACEUTICALS Inc
Current assignee: PROTIDE PHARMACEUTICALS Inc
Priority date: 1995-03-08
Filing date: 1996-03-07
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2016-03-07
Also published as: NZ304628A; EP0813361A4; WO1996027287A1; MX9706843A; AU693339B2; ATE253818T1; NO974108L; US5580714A; AU5186996A; JPH10511402A; RU2146088C1; CA2214280A1; US5759764A; DE69630679D1; JP3165863B2; DE69630679T2; CA2214280C; NO974108D0; EP0813361A1; EP0813361B1

Abstract

UNA SOLUCION DE CRIOCONSERVACION SENCILLA, BARATA Y FISIOLOGICAMENTE COMPATIBLE QUE INCLUYE LOS COMPONENTES INOCUOS (I) GLICEROL, (II) UNA SAL DE CLORURO DE METAL ALCALINO, (III) UN MONOSACARIDO, Y (IV) ALBUMINA SERICA.

Description

Disolución de criopreservación.

Esta invención se refiere a disoluciones de criopreservación. Más específicamente, esta invención está dirigida a disoluciones de criopreservación que están sobre todo indicadas para utilizarse en la criopreservación de diversos tipos de células que circulan en la sangre o que se encuentran en la médula ósea como las células madre y las células progenitoras hematopoyéticas.

Esta invención también se refiere a métodos para criopreservar y recuperar células criopreservadas.

Sangre

Las células morfológicamente reconocibles y funcionalmente competentes que circulan en la sangre, incluyen eritrocitos, granulocitos neutrofílicos, eosinofílicos y basofílicos, linfocitos B, linfocitos T, linfocitos no B, linfocitos no T y plaquetas. Estas células maduras derivan de y son reemplazadas, según necesidad, por células en división, morfológicamente reconocibles y precursoras de sus respectivos linajes como eritroblastos para la serie de eritrocitos, mieloblastos, promielocitos y mielocitos para la serie de granulocitos y megacariocitos para las plaquetas.

Células madre y células progenitoras hematopoyéticas

Las células precursoras derivan de células más primitivas que pueden ser divididas, de una manera simplista, en dos subgrupos principales: células madre y células progenitoras. Las definiciones de células madre y células progenitoras son operacionales y dependen de criterios funcionales y no morfológicos. Las células madre tienen una gran capacidad de renovación o conservación propias. Algunas células madre se diferencian según se necesite, sin embargo algunas células madre o sus células hijas producen otras células madre que mantienen la importante reserva de estas células. Así, además de mantener su propia clase, las células madre pluripotenciales son capaces de diferenciarse en varias sublíneas de células progenitoras con una capacidad de renovación propia más limitada o sin capacidad de renovación propia. Estas células progenitoras dan lugar al final a células precursoras morfológicamente reconocibles. Las células progenitoras son capaces de proliferar y de diferenciarse a través una, o más de una, de las rutas de diferenciación mieloides.

Las células madre y las células progenitoras representan un porcentaje muy pequeño de las células nucleadas presentes en la médula ósea, el bazo y la sangre. Estas células están presentes en el bazo en una proporción cerca de diez veces menor que en la médula ósea, con una presencia todavía menor en la sangre de los adultos. Como ejemplo, aproximadamente una de cada mil células nucleadas de la médula ósea es una célula progenitora; las células madre aparecen con una frecuencia menor.

La reconstitución del sistema hematopoyético se ha conseguido mediante el transplante de médula ósea. Lorenz y sus colaboradores mostraron que los ratones podían ser protegidos frente a una irradiación letal gracias a una infusión intravenosa de médula ósea (Lorenz, 20 E., et al., 1951, J. Natl. Cancer Inst. 12:197-201). Investigaciones posteriores demostraron que la protección era el resultado de la colonización de la médula ósea del receptor por las células infundidas (Lindsley, D.L., et al., 1955, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 90:512-515; Nowell, P.C., et al., 1956, Cancer Res. 16:258-261; Mitchison, N.A., 1956, Br. J. Exp. Pathol. 37:239-247; Thomas, E.D., et al., 1957, N. Engl. J. Med. 257:491-496). De esta manera, las células madre y las células progenitoras se pueden multiplicar en la médula ósea donada y pueden reemplazar a las células de la sangre responsables de la protección inmunitaria, de la reparación de tejidos, de la coagulación y de otras funciones de la sangre. En un transplante de médula ósea exitoso, la sangre, la médula ósea, el bazo, el timo y otros órganos responsables de la inmunidad son repoblados con células derivadas del donante.

La médula ósea se ha utilizado con éxito creciente para el tratamiento de diversas enfermedades fatales o muy graves, incluyendo determinados tipos de anemias como anemia aplásica (Thomas, E.D., et al., Feb. 5, 1972, The Lancet, pp. 284-289), anemia de Fanconi (Gluckman, E., et al., 1980, Brit J. Haematol. 45:557-564; Gluckman, E., et al., 1983, Brit J. Haematol. 54:431-440; Gluckman, E., et al., 1984, Seminars in Hematology 21 (1):20-26), deficiencias inmunitarias (Good, R.A., et al., 1985, Cellular Immunol. 82:36-54), cánceres como linfomas o leucemias (Cahn, J.Y., et al., 1986, Brit. J. Haematol. 63:457-470; Blume, K.J. y Forman S.J., 1982, J. Cell. Physiol. Supp. 1:99-102; Cheever, M.A., et al., 1982, N. Engl. J. Med. 307(8):479-481), carcinomas (Blijham, G., et al., 1981, Eur. J. Cancer 17(4):433-441), varios tumores sólidos (Ekert, H., et al., 1982, Cancer 49:603-609; Spitzer, G., et al., 1980, Cancer 45:3075-3085), y enfermedades genéticas de la hematopoyésis.

El transplante de médula ósea ha sido también recientemente aplicado al tratamiento de enfermedades congénitas de almacenamiento (Hobbs, J.R., 1981, Lancet 2:735-739), talasemia mayor (Thomas, E.D., et al., 1982, Lancet 2:227-229), anemia de células falciformes (Johnson, F.J., et al., 1984, N. Engl. J. Med. 311:780-783), y osteopetrosis (Coccia, P.F., et al., 1980, N. Engl. J. Med. 302:701-708) (para discusiones generales, veáse Storb, R. y Thomas, E.D., 1983, Immunol. Rev. 71:77-102; O'Reilly, R., et al., 1984, Sem. Hematol. 21(3):188-221; 1969, Bone-Marrow Conservation, Culture and Transplantation, Proceedings of a Panel, Moscú, Julio 22-26, 1968, International Atomic Energy Agency, Viena; McGlave, P.B., et al., 1985, en Recent Advances in Haematology, Hoffbrand, A.V., ed., Churchill Livingstone, Londres, pp. 171-197).

La utilización actual del transplante de médula ósea está muy restringida, porque es extremadamente raro disponer de donantes perfectamente compatibles (genéticamente idénticos), excepto en los casos en los que se dispone de un gemelo idéntico o cuando las células de la médula ósea de un paciente en remisión se almacenan en un estado congelado viable. Aún en este sistema autólogo, el peligro debido a una contaminación no detectable de células malignas y la necesidad de disponer de un paciente lo suficientemente sano como para someterse a la obtención de médula, presentan serias limitaciones. Excepto en estos casos autólogos, existe una inevitable incompatibilidad genética de algún grado, que conlleva complicaciones serias y en algún caso letales. Estas complicaciones son de dos clases. En primer lugar, el paciente es generalmente incapacitado inmunológicamente mediante medicamentos con antelación, para evitar el rechazo inmune de las células de médula ósea extrañas (rechazo del injerto por el hospedante). En segundo lugar, si las células de la médula ósea donadas se establecen, pueden atacar al paciente (rechazo del hospedante por el injerto o rechazo inverso), que es reconocido como extraño. Aún con donantes compatibles de la misma familia, estas complicaciones de incompatibilidad parcial son la causa de una mortalidad y morbilidad considerables debidas directamente al transplante de médula ósea de un individuo genéticamente diferente.

También se ha investigado la sangre periférica como fuente de células madre para la reconstitución hematopoyética (Nothdurtt, W., et al., 1977, Scand. J. Haematol. 19:470-471; Sarpel, S.C., et al., 1979, Exp. Hematol. 7:113-120; Ragharachar, A., et al., 1983, J. Cell. Biochem. Supp. 7A:78; Juttner, C.A., et al., 1985, Brit. J. Haematol. 61:739-745; Abrams, R.A., et al., 1983, J. Cell. Biochem. Supp. 7A:53; Prummer, O., et al., 1985, Exp. Hematol. 13:891-898). En algunos estudios, se han obtenido resultados prometedores en pacientes con diferentes leucemias (Reiffers, J., et al., 1986, Exp. Hematol. 14:312-315 (utilizando células criopreservadas); Goldman, J.M., et al., 1980, Br. J. Haematol. 45:223-231; Tilly, H., et al., Jul. 19, 1986, The Lancet, pp. 154-155; veáse también To, L.B. y Juttner, C.A., 1987, Brit. J. Haematol. 66:285-288, y las referencias citadas en ese trabajo); y con linfoma (Korbling, M., et al., 1986, Blood 67:529-532). Se ha dado a entender que la capacidad para reconstituir el sistema hematopoyético de la sangre periférica autóloga de adulto, observada en algunos pacientes, está asociada al mayor número de células progenitoras circulantes en la sangre periférica producidas después de la citorreducción debido a una quimioterapia intensiva y/o irradiación (el fenómeno de rebote) (TO, L.B. y Juttner, C.A., 1987, Annot., Brit. J. Haematol. 66:285-288; veáse también 1987, Brit. J. Haematol. 67:252-253, y las referencias citadas en ese trabajo). Otros estudios utilizando sangre periférica no han logrado llevar a cabo la reconstitución (Hersko, C., et al., 1979, The Lancet 1:945-947; Ochs, H.D., et al., 1981, Pediatr. Res. 15(4 Parte 2):601).

Otros estudios también han investigado la utilización del transplante de células de hígado fetales (Cain, G.R., et al., 1986, Transplantation 41(1):32-25; Ochs, H.D., et al., 1981, Pediatr. Res. 15(4 parte 2):601; Paige, C.J., et al., 1981, J. Exp. Med. 153:154-165; Touraine, J.L., 1980, Excerpta Med. 514:277; Touraine, J.L., 1983, Birth Defects 19:139; veáse también Good, R.A., et al., 1983, Cellular Immunol. 82:44-45 y las referencias citadas en ese trabajo) o transplante de células de bazo neonatales (Yunis, E.J., et al., 1974, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:4100) como fuente de células madre para la reconstitución hematopoyética. También se han transplantado células de timo neonatal en experimentos de reconstitución inmune (Vickery, A.C., et al., 1983, J. Parasitol. 69(3):478-485; Hirokawa, K., et al., 1982, Clin. Immunol. Immunopathol. 22:297-304).

Disoluciones y técnicas de criopreservación

La congelación ha sido muy utilizada para preservar células vivas, como las células de la sangre, después de haber sido extraídas o separadas de un organismo donante. Sin embargo, la criopreservación y la recuperación de células vivas han demostrado ser bastante problemáticas. Las células se someten a unas condiciones relativamente severas durante los ciclos de congelación y descongelación implicados en la criopreservación de las células, lo que da como resultado una tasa de supervivencia baja.

La congelación es destructiva para la mayoría de las células vivas. Al congelarse el medio externo, las células intentan mantener el equilibrio y pierden agua, incrementando así la concentración intracelular de solutos, hasta que se produce la congelación intracelular a aproximadamente menos 10-15ºC. Se cree que tanto la congelación intracelular como los efectos de la disolución son responsables del daño celular. Se ha propuesto, por ejemplo, que la destrucción por congelación por hielo extracelular es esencialmente un daño en la membrana plasmática que resulta de una deshidratación osmótica de la célula.

Se han invertido un tiempo y esfuerzo considerables para maximizar la viabilidad de las células descongeladas. Estos esfuerzos se han centrado generalmente en el desarrollo de agentes crioprotectores y en establecer velocidades de enfriamiento óptimas.

Se piensa que la crioprotección por adición de soluto ocurre por dos mecanismos potenciales: (i) intracelular; por reducción de la cantidad de hielo formada dentro de la célula; y/o (ii) extracelular; por reducción del flujo de agua hacia el exterior de la célula en respuesta a un descenso de la presión de vapor producido por la formación de hielo en el soluto que rodea a las células.

Se han descrito diferentes velocidades de enfriamiento óptimas para distintas células. Varios grupos han estudiado el efecto de la velocidad de enfriamiento o de criopreservantes en la supervivencia o en la eficacia del transplante de células de médula ósea y células rojas de la sangre congeladas (Lovelock, J.E. y Bishop, M.W.H., 1959, Nature 183:1394-1395; Ashwood-Smith, M.J., 1961, Nature 190:1204-1205; Rowe, A.W. y Rinfret, A.P., 1962, Blood 20:636; Rowe, A.W. y Fellig, J., 1962, Fed. Proc. 21:157; Rowe, A.W., 1966, Cryobiology 3(1):12-18; Lewis, J.P., et al., 1967, Transfusion 7(1):17-32; Rapatz, G., et al., 1968, Cryobiology 5(1):18-25; MaZur, P., 1970, Science 168:939-949; Mazur, P., 1977, Cryobiology 14:251-272; Rowe, A.W. y Lenny, L.L., 1983, Cryobiology 20:717; Stiff, P.J., et al., 1983, Cryobiology 20:17-24; Gorin, N.C., 1986, Clinics in Haematology 15(1):19-48). Generalmente, se pueden conseguir resultados óptimos en la congelación de células madre y células progenitoras hematopoyéticas con una velocidad de enfriamiento de aproximadamente 1-2ºC por minuto con una temperatura final de almacenamiento de aproximadamente -70 a aproximadamente -196ºC, siendo generalmente válidos estos rangos para otras células de la sangre.

Se ha descrito la recuperación fructífera de células humanas de la médula ósea después de un largo período de almacenamiento en nitrógeno líquido (1983, American Type Culture Collection, Quaterly Newsletter 3(4):1). Además, se ha demostrado que las células madre de la médula ósea son capaces de soportar la criopreservación y la descongelación (Fabian, I., et al., 1982, Exp. Hematol, 10(1):119-122).

El crioprotector estándar aceptado ampliamente a nivel industrial para ser utilizado en la criopreservación de la mayoría de las células, incluyendo sangre total, sangre del cordón umbilical, médula ósea, granulocitos, neutrófilos, plaquetas y células madre y células progenitoras hematopoyéticas, es el dimetil sulfóxido (DMSO). Este hecho se puede atribuir de manera general a la extendida experiencia y conocimiento de las disoluciones de criopreservación basadas en DMSO y a una percepción general de que el DMSO proporciona una protección superior y una viabilidad celular máxima. Aunque el DMSO se muestra generalmente eficaz para estos propósitos, se sabe también que es fisiológicamente dañino, sobre todo a altas concentraciones, y, que por tanto, tiende a irritar tanto a los implicados en el proceso de criopreservación como al paciente en quien se introducen las células criopreservadas produciéndole hipertensión, vómitos y nauseas. También se piensa que la naturaleza perniciosa del DMSO da como resultado una baja viabilidad in vitro de las células criopreservadas.

El documento WO 91/03935, describe una disolución de vitrificación para la criopreservación de embriones que comprende 25% glicerol + 25% de propilenglicol en un medio de rehidratación que comprende 1% de Cl^{-}, 0,1% de glucosa, 0,3% de albúmina sérica, 0,125% de PO^{3-}_{4} y antibióticos.

Valeri, Transfusion, Vol. 15, 195-218 (1975), revela la utilización de varias concentraciones de glicerol (20-40%) para la criopreservación de globulos rojos de la sangre. Después de la criopreservación, los globulos rojos de la sangre se descongelan y se lavan con 12% de NaCl tamponado con fosfato.

La patente de EEUU 4.059.967 (Rowe) describe una solución salina acuosa para la criopreservación de plaquetas de la sangre que comprende 4-7% glicerol, 2-6% glucosa y 0,9% NaCl.

Por consiguiente, existe la necesidad sustancial de una solución alternativa de criopreservación sencilla, fisiológicamente compatible y capaz de proporcionar un nivel comparable de viabilidad celular tanto in vivo como in vitro.

Ahora se ha desarrollado una disolución de criopreservación sencilla, barata y compatible fisiológicamente, que incluye los componentes inocuos (i) glicerol, (ii) una sal cloruro de un metal alcalino, (iii) un monosacárido, y (iv) albúmina sérica.

El constituyente principal de la disolución de criopreservación es el agente de criopreservación glicerol (también citado como glicerina). El cloruro del metal alcalino favorece la viabilidad celular en el ciclo de congelación-descongelación. El monosacárido actúa como una fuente nutricional de carbono para las células. La albúmina sérica actúa como una fuente de proteína que proporciona una cubierta alrededor de la membrana de la célula diana que protege a la membrana durante el ciclo de congelación-descongelación y en el almacenamiento de las células congeladas. Se piensa que la albúmina sérica actúa como captadora de radicales libres de oxígeno que se sabe afectan de manera adversa a la viabilidad de diversas células diana como los eritrocitos, granulocitos neutrofílicos, eosinofílicos, y basofílicos, linfocitos B, linfocitos T, linfocitos no B, linfocitos no T, y plaquetas, como se ha mencionado anteriormente. La fuente de albúmina sérica debe ser preferentemente compatible con la especie del sujeto en el que se quieren introducir las células diana protegidas.

La disolución de criopreservación puede ser suministrada en forma concentrada o diluida. La forma concentrada puede ser diluida para obtener la concentración adecuada de uso por la adición de un diluyente como agua, que haya sido tratada de manera adecuada para inyección, en la disolución. Preferentemente el diluyente es una disolución de sal fisiológicamente equilibrada como solución salina.

La utilización de la disolución de criopreservación para la preservación y subsecuente utilización terapéutica de las células diana, como sangre total, sangre del cordón umbilical, médula ósea, granulocitos, neutrófilos, plaquetas y células madre y células progenitoras hematopoyéticas incluyendo las identificadas como células CD 34+, incluyen los pasos de (i) diluir la disolución concentrada de criopreservación según sea necesario, (ii) introducir las células diana en la disolución diluida, (iii) congelar las células diana protegidas, (iv) descongelar en condiciones ambientales la disolución congelada, e (v) introducir las células diana descongeladas en el sujeto necesitado de tales células diana. Las células diana descongeladas y la disolución de criopreservación adjunta se calientan preferentemente hasta alcanzar la temperatura del cuerpo (es decir, aproximadamente 37ºC) antes de ser introducidas en el sujeto. La compatibilidad fisiológica de la disolución de criopreservación permite introducir las células diana descongeladas en el sujeto sin necesidad separar las células diana y la disolución de criopreservación.

Ahora se ha descubierto una disolución concentrada de criopreservación sencilla, de bajo coste, fisiológicamente compatible que consta esencialmente de (i) aproximadamente 60 a aproximadamente 80% en peso de glicerol, (ii) aproximadamente 5 a aproximadamente 10% en peso de sal cloruro de un metal alcalino, (iii) aproximadamente 0,2 a aproximadamente 1% en peso de un monosacárido metabolizable biológicamente y (iv) aproximadamente 20 a aproximadamente 30% en peso de albúmina sérica.

Como se utiliza en la presente memoria, excluyendo las reivindicaciones, % en peso, cuando se use a propósito de los constituyentes de la disolución de criopreservación, se basa en el peso total de la disolución concentrada de criopreservación, a no ser que se indique otra cosa.

El glicerol (C_{3}H_{8}O_{3}) es un poliol disponible comercialmente en calidad U.S.P y alimentaria de diversos proveedores incluyendo J.T.Baker.

La disolución concentrada de criopreservación incluye de aproximadamente 60 a aproximadamente 80% en peso de glicerol. Concentraciones menores de aproximadamente 60% en peso de glicerol dan como resultado una viabilidad celular reducida mientras que las disoluciones que contienen más de aproximadamente 80% en peso de glicerol dan como resultado una disolución con una osmolaridad inaceptablemente alta (es decir, mayor de aproximadamente 2.000 mOsm/kg).

Las sales cloruro de metales alcalinos apropiadas para ser utilizadas en esta invención incluyen cloruro sódico y cloruro potásico. Se cree que la sal cloruro de metal alcalino favorece la viabilidad celular en el ciclo de congelación-descongelación al ajustar la osmolaridad de la disolución de criopreservación entre aproximadamente 500 y 2.000 mOsm/kg medida con un osmómetro de presión de vapor modelo Wescor 5500, de acuerdo con el protocolo proporcionado en el manual de instrucción/servicio del instrumento. A modo de referencia, la osmolaridad fisiológica de la sangre está generalmente comprendida en el intervalo de 260 y 320 mOsm/kg aproximadamente. La osmolaridad óptima dentro de este intervalo general depende de varios factores incluyendo las células diana, la constitución específica de la disolución de criopreservación y la velocidad de congelación-descongelación. A modo de ejemplo, una osmolaridad de aproximadamente 700 a aproximadamente 1.700 es la deseada generalmente para la criopreservación de células madre y células progenitoras hematopoyéticas.

La disolución concentrada de criopreservación incluye de aproximadamente 5 a aproximadamente 10% en peso de sal cloruro de metal alcalino. Concentraciones menores que aproximadamente 5% en peso y mayores que aproximadamente 10% en peso de la sal cloruro de metal alcalino dan como resultado una viabilidad celular reducida en el ciclo de congelación-descongelación pudiendo las concentraciones mayores de 10% en peso dañar la cristalización.

El monosacárido, como la glucosa, actúa como una fuente nutricional de carbono para las células. La disponibilidad del monosacárido favorece la preservación celular en el ciclo de congelación-descongelación y en el almacenamiento de las células congeladas al asegurar la presencia de nutrientes suficientes dentro de la célula.

La albúmina sérica actúa como fuente de proteína que proporciona una cubierta alrededor de la membrana de la célula diana que protege a la membrana durante el ciclo de congelación-descongelación y en el almacenamiento de las células congeladas. Se piensa que la albúmina sérica actúa además como captadora de radicales libres de oxígeno que se sabe afectan de manera adversa la viabilidad de varias células diana como los eritrocitos, granulocitos neutrofílicos, eosinofílicos, y basofílicos, linfocitos B, linfocitos T, linfocitos no B, linfocitos no T, y plaquetas, como se ha mencionado anteriormente. La fuente de albúmina sérica es preferentemente compatible con la especie del sujeto en el que se quieren introducir las células diana protegidas.

Se pueden lograr concentraciones eficaces mediante la incorporación de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 1% en peso de monosacárido a la disolución concentrada de criopreservación. La incorporación de menos de 0,2% en peso proporciona una concentración insuficiente y reduce la viabilidad celular en el ciclo de congelación-descongelación mientras que las concentraciones mayores que aproximadamente 1% en peso no aportan un aumento proporcional de la viabilidad celular y afectan de manera adversa las concentraciones de los otros constituyentes.

La albúmina sérica actúa como fuente de proteína que proporciona una cubierta alrededor de la membrana de la célula diana que protege a la membrana durante el ciclo de congelación-descongelación y en el almacenamiento de las células congeladas.

Se pueden lograr concentraciones eficaces mediante la incorporación de aproximadamente 20 a aproximadamente 30% en peso de albúmina sérica. Una concentración menor que 20% en peso de albúmina sérica proporciona una concentración insuficiente y da como resultado una reducción la viabilidad celular mientras que concentraciones mayores que aproximadamente 30% en peso no aportan un aumento proporcional de la viabilidad celular y tienden a aumentar la osmolaridad de la disolución por encima del valor máximo deseado de aproximadamente 2.000 mOsm/kg.

La disolución concentrada de criopreservación puede ser diluida para obtener la concentración adecuada de uso por la adición de un diluyente apropiado (por ejemplo, 0,9% en peso de solución salina preparada con agua ultrafiltrada, agua para inyección, y plasma autólogo) en una relación de aproximadamente 1 a 10 partes, normalmente 1 a 2 partes, de diluyente para 1 parte de disolución concentrada de criopreservación. Generalmente, la disolución diluida de criopreservación consta esencialmente de (i) aproximadamente 20 a aproximadamente 40% en peso de glicerol, (ii) aproximadamente 1,5 a aproximadamente 5% en peso de sal cloruro de un metal alcalino, (iii) aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5% en peso de monosacárido, y (iv) aproximadamente 6 a 15% en peso de albúmina sérica, basado en la disolución de criopreservación diluida. El equilibrio es el diluyente.

La disolución de criopreservación debe ser formulada para proporcionar un pH entre aproximadamente 7 y 7,5.

Las células diana pueden ser criopreservadas utilizando la disolución de criopreservación diluida simplemente (i) introduciendo las células diana en la disolución de criopreservación diluida, y (ii) congelando o criopreservando las células diana protegidas. El volumen de la disolución de criopreservación diluida que debe ser añadido a las células diana depende tanto de la relación volumétrica de la disolución en la que se encuentra la célula diana respecto a la disolución de criopreservación como de la relación de la célula diana respecto a la disolución de criopreservación. La relación volumétrica de la disolución en la que se encuentra la célula diana respecto a la disolución de criopreservación debe encontrarse generalmente entre aproximadamente 1:1 a 1:10, con una relación de la célula diana respecto a la disolución de criopreservación entre aproximadamente 1x10^{5} células/ml y 1:1x10^{9} células/ml siendo preferida generalmente la proporción entre 2x10^{8} células/ml y 3x10^{8} células/ml. Las relaciones mayores que las mencionadas arriba dan como resultado una disminución de la concentración de células viables debido a una cantidad insuficiente de disolución de criopreservación, mientras que relaciones menores que las mencionadas arriba dan como resultado una utilización poco eficiente de la disolución de criopreservación y la necesidad de introducir una cantidad excesiva de disolución de criopreservación en un sujeto con el fin de introducir una cantidad eficaz de células diana. Las células diana se encuentran normalmente disponibles para preservación sólo en forma diluida como constituyentes de un líquido biológico (por ejemplo, las células madre concentradas de la sangre periférica contienen normalmente células madre en una concentración de aproximadamente 1x10^{6} células/ml a aproximadamente 3x10^{8} células/ml con un equilibrio que comprende otros componentes de la sangre como plasma y plaquetas). Estas muestras diluidas biológicamente deben ser generalmente combinadas con la disolución de criopreservación en una relación volumétrica de aproximadamente 2:1 a 1:4 (dependiendo, por supuesto, de un número de factores que incluyen la formulación específica de la disolución de criopreservación diluida, la concentración de las células diana en la muestra diluida biológicamente, el tipo de células diana, etc.) para obtener la proporción óptima de células diana respecto a la disolución de criopreservación. La disolución final que contiene las células diana debe contener por lo general, aproximadamente 4 a 12% en peso de glicerol y aproximadamente 2 a 10% en peso de albúmina, aunque se contemplan variaciones fuera de este intervalo general en ciertas aplicaciones.

Las células diana protegidas criopreservadas deben ser descongeladas antes de ser introducidas en un sujeto. Debido a la compatibilidad fisiológica de la disolución de criopreservación, las células diana descongeladas pueden ser introducidas en el sujeto sin necesidad de separar las células diana y la disolución de criopreservación. Las células diana descongeladas pueden ser mantenidas durante varias horas a temperatura ambiente sin pérdida apreciable de viabilidad celular. La disolución descongelada puede ser diluida lentamente con solución salina u otra disolución iónica apropiada con el fin de reducir la osmolaridad de la disolución desde el intervalo de 500 a 2.000 mOsm/kg deseado para la criopreservación, hasta el intervalo fisiológico de 260 a 320 mOsm/kg con el fin de reducir el impacto sobre las paredes celulares producido por cambios bruscos de la osmolaridad.

Una velocidad controlada de enfriamiento lento resulta generalmente eficaz para obtener una viabilidad celular óptima. Se piensa que diferentes tipos celulares poseen diferentes velocidades óptimas de enfriamiento (Veáse, por ejemplo, Rowe, A.W. y Rinfret, A.P., 1962, Blood 20:636; Rowe, A.W., 1966, Cryo Biology 3(1):12-18; Lewis, J.P., et al., 1967, Transfusion 7(1):17-32; y Mazur, P., 1970, Science 168:939-949 para efectos de la velocidad de enfriamiento en la supervivencia de células madre de médula y en su potencial de transplante).

La disolución de criopreservación puede ser mantenida a temperatura ambiente antes de su utilización y las células diana mezcladas a temperatura ambiente hasta 30 minutos antes de que comience la congelación sin una pérdida apreciable de viabilidad celular. Esto contrasta con el crioprotector tóxico DMSO que debe ser enfriado a 4ºC antes de su adición a las células diana con el fin de acelerar el proceso de congelación y que además requiere que el proceso de congelación comience inmediatamente después de que el DMSO sea añadido a las células para minimizar la muerte celular producida en presencia de DMSO.

La congelación controlada puede ser llevada a cabo mediante la utilización de un dispositivo de congelación programable. Los aparatos de congelación programables permiten la determinación de las velocidades óptimas de enfriamiento y facilitan un enfriamiento estándar reproducible.

El contenedor donde se encuentran las células debe ser estable a las temperaturas criogénicas y debe permitir una transferencia rápida de calor para un control eficaz de la congelación y la descongelación. Se pueden utilizar viales sellados de plástico (por ejemplo los criotubos de Nunc y Wheaton) o ampollas de cristal para múltiples cantidades pequeñas (1 a 2 ml), mientras que los volúmenes mayores de 100 a 200 ml pueden ser congelados en bolsas de poliolefina, como las disponibles de Fenwal, sujetas entre láminas de metal.

Las células congeladas pueden ser transferidas entonces a un tanque criogénico de almacenamiento para largos períodos de tiempo. En una realización preferida, las muestras pueden ser almacenadas criogénicamente en nitrógeno líquido (-196ºC) o en vapor de nitrógeno líquido (-105ºC). Este almacenamiento se ve facilitado por la disponibilidad de refrigeradores de nitrógeno líquido muy eficaces.

Cuando se necesiten, las células congeladas son preferentemente descongeladas de una manera rápida y mantenidas a aproximadamente 37ºC hasta su utilización. Al ser la disolución de criopreservación fisiológicamente compatible no se necesita separarla antes de su introducción en el sujeto.

Para la reconstitución del sistema hematopoyético de un paciente adecuado se pueden utilizar terapéuticamente células del cordón umbilical, plaquetas y células madre y células progenitoras hematopoyéticas que han sido criopreservadas y descongeladas. Las células pueden ser introducidas por cualquier método conocido en este campo, siendo la infusión sistémica la que se prefiere generalmente.

La reconstitución del sistema hematopoyético (o sistema inmune) puede ser muy valiosa desde un punto de vista terapéutico para numerosas enfermedades y trastornos. La infusión de células madre y células progenitoras hematopoyéticas criopreservadas para la reconstitución hematopoyética pueden ser utilizadas de manera beneficiosa en el tratamiento de estas enfermedades que hoy se sabe pueden curarse por transplante autogénico de médula ósea.

Los trastornos que pueden tratarse por infusión de células madre, incluyen, pero no están limitados a, cinco grandes categorías. Primero están los trastornos que resultan de un fallo o una disfunción de la producción y maduración normales de las células de la sangre (es decir, anemia aplásica y trastornos hipoproliferativos de células madre). El segundo grupo incluye enfermedades neoplásicas malignas en los órganos hematopoyéticos (por ejemplo, leucemia y linfomas). El tercer grupo de trastornos comprende pacientes con un amplio espectro de tumores sólidos malignos de origen no hematopoyético. La infusión de células madre en estos pacientes sirve como procedimiento de rescate de médula ósea y se proporciona a un paciente que de otra manera seguiría una quimioterapia letal o una irradiación del tumor maligno. El cuarto grupo de enfermedades consiste en trastornos autoinmunes, donde las células madre sirven como fuente para reemplazar un sistema inmune anormal. El quinto grupo de enfermedades comprende un número de trastornos genéticos que pueden ser corregidos por infusión de células madre hematopoyéticas, preferiblemente singénicas, que se han sometido a terapia génica antes del transplante.

Claims

1. Una disolución de criopreservación concentrada que consta esencialmente de:

(a) 60 a 80% en peso de glicerol;

(b) 5 a 10% en peso de sal cloruro de un metal alcalino;

(c) 0,2 a 1% en peso de un monosacárido metabolizable biológicamente; y

(d) 20 a 30% en peso de albúmina sérica.

2. La disolución de criopreservación de la reivindicación 1, que incluye además un diluyente.

3. La disolución de criopreservación de la reivindicación 1 ó 2, en la que el pH de la disolución tiene un valor entre aproximadamente 7 y 7,5.

4. La disolución de criopreservación de la reivindicación 2, en la que la disolución consta esencialmente de: (a) aproximadamente 20 a aproximadamente 40% en peso de glicerol, (b) aproximadamente 1,5 a aproximadamente 5% en peso de sal cloruro de un metal alcalino, (c) aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5% en peso de monosacárido, y (d) aproximadamente 6 a aproximadamente 15% en peso de albúmina sérica y (e) el resto hasta el 100% diluyente.

5. La disolución de criopreservación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la sal cloruro de metal alcalino es cloruro sódico.

6. La disolución de criopreservación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el monosacárido es la glucosa.

7. La disolución de criopreservación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la albúmina sérica es albúmina sérica humana.

8. Un método para criopreservar células, que comprende (i) introducir células diana en la disolución de criopreservación de la reivindicación 2, y (ii) criopreservar las células diana protegidas.

9. El método de la reivindicación 8 en el que las células diana son células madre o células progenitoras hematopoyéticas, plaquetas de la sangre, células identificadas como células CD 34+ o células diana obtenidas de la sangre del cordón umbilical.

10. Un método para criopreservar células, que comprende (i) introducir las células diana en la disolución de criopreservación de la reivindicación 4, siendo el monosacárido glucosa y (ii) criopreservar las células diana protegidas.

11. El método de la reivindicación 10 en el que las células diana protegidas se enfrían a una velocidad de 1-2ºC por minuto hasta una temperatura entre aproximadamente -70 y aproximadamente -196ºC.

12. Un método para criopreservar y recuperar células viables, que comprende (i) introducir las células diana en la disolución de criopreservación de la reivindicación 2, (ii) criopreservar las células diana protegidas, y (iii) descongelar las células diana protegidas.

13. El método de la reivindicación 12, en el que las células diana son células madre o células progenitoras hematopoyéticas.

14. El método de la reivindicación 8, 10 ó 12, en el que la relación volumétrica de la disolución que contiene a las células diana respecto a la disolución de criopreservación está entre aproximadamente 1:1 y 1:10 y la relación de las células diana respecto a la disolución de criopreservación está entre aproximadamente 1x10^{5} células/ml y aproximadamente 1x10^{9} células/ml.

15. Utilización de células diana protegidas descongeladas obtenidas según se define en la reivindicación 12 sin separación de las células diana y la disolución de criopreservación para la preparación de una composición farmacéutica para la reconstitución del sistema hematopoyético o sistema inmune.

16. Utilización de la reivindicación 15 en la que la relación volumétrica de la disolución que contiene a las células diana respecto a la disolución de criopreservación está entre aproximadamente 1:1 y 1:10 y la relación de las células diana respecto a la disolución de criopreservación está entre aproximadamente 1x10^{5} células/ml y aproximadamente 1x10^{9} células/ml.

17. Utilización de la reivindicación 15 ó 16, en la que las células diana son células madre o células progenitoras hematopoyéticas, plaquetas de la sangre, células identificadas como células CD 34+ o células diana obtenidas de la sangre del cordón umbilical.

18. Utilización de las reivindicaciones 15 a 17, en las que la composición farmacéutica es para la reconstitución del sistema hematopoyético de un ser humano.