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WO2019172112A1 - 細胞凍結保存用溶液およびその利用 - Google Patents

細胞凍結保存用溶液およびその利用 Download PDF

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WO2019172112A1
WO2019172112A1 PCT/JP2019/008063 JP2019008063W WO2019172112A1 WO 2019172112 A1 WO2019172112 A1 WO 2019172112A1 JP 2019008063 W JP2019008063 W JP 2019008063W WO 2019172112 A1 WO2019172112 A1 WO 2019172112A1
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WO
WIPO (PCT)
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cells
cell cryopreservation
cell
solution
cryopreservation solution
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2019/008063
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
博明 小玉
小川　淳
尚登 山城
孝一 佐瀬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zenogen Pharma Co Ltd
Original Assignee
Zenoaq Resource Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to JP2023061004A priority patent/JP2023076609A/ja
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a cell cryopreservation solution and use thereof.
  • cryopreservation has been performed in order to prevent cell deterioration due to passage of cultured cells or contamination by various bacteria and to use the cells for a long time.
  • a general method for cryopreserving cells a method is known in which cells are suspended in a solution containing dimethyl sulfoxide (DMSO) or serum, and cryopreserved (for example, in liquid nitrogen) in a cryotube or ampoule.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Patent Document 1 describes that cells were cryopreserved using a cell preservation aqueous solution containing DMSO, a thickener and glucose, and a good survival rate was achieved.
  • DMSO is considered to be the best anti-frost damage agent in terms of cell viability. However, it can affect the expression, differentiation and proliferation of various cell functions. In addition, in hematopoietic stem cell transplantation using a cell cryopreservation solution containing DMSO, side effects such as nausea, vomiting, headache, increased blood pressure, diarrhea, and abdominal cramps have been reported (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2). ).
  • Non-patent Document 1 Although there is an attempt to reduce the amount of DMSO used by combining other frost damage protective agents (Non-patent Document 1), securing of both performance and safety to the living body by replacement with other frost damage protective agents is still unsuccessful. It is insufficient.
  • the present invention has been made to solve such problems, and an object of the present invention is to provide a cell cryopreservation solution that can achieve both good survival rate and safety to living bodies. .
  • the cell cryopreservation solution comprises at least one saccharide selected from the group consisting of glucose, mannitol, sorbitol, trehalose, sucrose, and maltose, and propylene glycol, dimethyl sulfoxide, a thickener, and natural Contains no animal-derived ingredients.
  • a method for cryopreserving cells includes a mixing step of mixing the cell cryopreservation solution and cells, and freezing in which the cells are mixed with the cell cryopreservation solution. And a process.
  • the method for producing a frozen product of cells includes a mixing step of mixing the cell cryopreservation solution and cells, and freezing the cells in a state of being mixed with the cell cryopreservation solution. Freezing step.
  • the frozen cell product according to one embodiment of the present invention is prepared using the above-described method for preparing a frozen cell material.
  • the survival rate of the cells after thawing is good, and the thawed cells can be safely applied to a living body.
  • the cell cryopreservation solution contains at least one saccharide selected from the group consisting of glucose, mannitol, sorbitol, trehalose, sucrose, and maltose and propylene glycol, dimethyl sulfoxide (DMSO), a thickener, and natural Contains no animal-derived ingredients.
  • a saccharide selected from the group consisting of glucose, mannitol, sorbitol, trehalose, sucrose, and maltose and propylene glycol, dimethyl sulfoxide (DMSO), a thickener, and natural Contains no animal-derived ingredients.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the saccharide is at least one selected from the group consisting of glucose, mannitol, sorbitol, trehalose, sucrose, and maltose. That is, there are one, two, three, four, five or six saccharides selected from the group.
  • Glucose is a monosaccharide
  • mannitol and sorbitol are sugar alcohols
  • trehalose, sucrose, and maltose are disaccharides.
  • the saccharide may be D-form, L-form, or a mixture of D-form and L-form, but it should be D-form from the viewpoint of production cost and safety. Is preferred.
  • the saccharide is a monosaccharide.
  • the saccharide is a disaccharide.
  • the saccharide is a sugar alcohol.
  • the saccharide is a mixture of any of monosaccharides, disaccharides, and sugar alcohols.
  • the concentration of the saccharide in the cell cryopreservation solution is not particularly limited, but in one example, it is preferably 0.5 w / v% or more, more preferably 1.0 w / v% or more in terms of monosaccharide. 1.5 w / v% or more is more preferable, 2.0 w / v% or more is particularly preferable, 10.0 w / v% or less is preferable, and 6.0 w / v%. More preferably, it is more preferably 5.0 w / v% or less, still more preferably 4.5 w / v% or less, and particularly preferably 4.0 w / v% or less.
  • the concentration based on “monosaccharide conversion” refers to the concentration calculated by weight for monosaccharides and sugar alcohols, and the concentration calculated by assuming that the weight is half of that for disaccharides. That is, with the disaccharide, the actual concentration (w / v%) is twice the above concentration.
  • the concentration of propylene glycol in the cell cryopreservation solution is not particularly limited, but in one example, it is preferably 2.5 w / v% or more, more preferably 5.0 w / v% or more, and 7.5 w / W or more is more preferable, 10.0 w / v or more is particularly preferable, and from the viewpoint of safety with respect to a living body, 18.0 w / v% or less is preferable, and 16.0 w / v is preferable. It is more preferably v% or less, further preferably 15.0 w / v% or less, and particularly preferably 13.0 w / v% or less.
  • DMSO Dimethyl sulfoxide
  • the thickener examples include carboxymethyl cellulose (hereinafter referred to as CMC), sodium carboxymethyl cellulose (hereinafter referred to as CMC-Na), organic acid polymer, propylene glycol alginate, and sodium alginate.
  • CMC carboxymethyl cellulose
  • CMC-Na sodium carboxymethyl cellulose
  • organic acid polymer propylene glycol alginate
  • propylene glycol alginate propylene glycol alginate
  • sodium alginate sodium alginate.
  • Examples of natural animal-derived components include albumin, serum, plasma, and basal medium.
  • Examples of serum include adult calf serum, calf serum, newborn calf serum, and fetal calf serum.
  • Examples of the basal medium include RPMI medium, MEM medium, HamF-12 medium, DM-160 medium and the like. Since the cell cryopreservation solution of the present invention does not contain natural animal-derived components, there is no problem of quality differences among lots of natural animal-derived components, and various cytokines and growth contained in serum. It is possible to avoid the risk of changes in cell properties due to factors and hormones that are essentially unnecessary for cell preservation, and it is also possible to avoid the effects of components that are unknown in the basal medium.
  • the cell cryopreservation solution of the present invention is very useful from the viewpoint that it can be safely applied to a living body particularly in clinical use. Moreover, as shown in the examples described later, cells can be cryopreserved with a good survival rate even if natural animal-derived components are not contained.
  • the cell cryopreservation solution may further contain other components.
  • other components include a pH adjuster.
  • the pH adjuster include phosphate buffer and carbonate buffer.
  • BSS Basic Stock Solution
  • a solution containing physiological saline can also be used.
  • BSS Basic Stock Solution
  • the pH adjuster is preferably used as appropriate in order to adjust the pH in the cell cryopreservation solution to about 6.5 to 9.0, preferably 7.0 to 8.5.
  • the phosphate buffer in the present invention is sodium chloride, monosodium phosphate (anhydrous), monopotassium phosphate (anhydrous), disodium phosphate (anhydrous), trisodium phosphate (anhydrous), potassium chloride, And potassium dihydrogen phosphate (anhydrous), and sodium chloride, monosodium phosphate (anhydrous), potassium chloride, or potassium dihydrogen phosphate (anhydrous) is particularly preferable.
  • a combination of potassium dihydrogen phosphate, sodium chloride, potassium chloride, and disodium hydrogen phosphate is also preferable.
  • the pH adjuster is preferably contained in the cell cryopreservation solution in an amount of 0.01 to 1.0 w / v%, more preferably 0.05 to 0.5 w / v%.
  • the composition of the inorganic salt solution used in the examples is also suitable.
  • the cell cryopreservation solution is preferably an aqueous solution.
  • the osmotic pressure of the cell cryopreservation solution is preferably 1000 mOsm or more, more preferably 1000 to 2700 mOsm, in order to maintain performance as a preservation solution.
  • composition of the cell cryopreservation solution may be any combination of components among the specific examples of each component listed above as long as the composition can sufficiently preserve the cells.
  • concentrations can be selected and combined.
  • components and / or concentrations in Examples described later can be selected and combined. That is, the individual components and / or concentrations disclosed herein can be selected and combined, respectively.
  • the cell cryopreservation solution is an aqueous solution containing saccharides and propylene glycol and not containing DMSO, thickener and natural animal-derived components.
  • the cell cryopreservation solution is an aqueous solution containing saccharides, propylene glycol and a pH adjuster, and free of DMSO, thickeners and natural animal-derived components.
  • the cell cryopreservation solution is an aqueous solution containing only saccharides, propylene glycol and a pH adjuster and not containing DMSO, thickener and natural animal-derived components (ie, saccharides, propylene glycol, It consists only of pH adjuster and water).
  • the cell cryopreservation solution is preferably sterilized. This is because the risk of infection of bacteria and the like is reduced, so that it can be applied to a living body more safely. Moreover, in research use, the risk of contamination by bacteria or the like is reduced.
  • Glucose, mannitol, sorbitol, trehalose, sucrose, and maltose have been used as components of intravenous injection solutions.
  • 5% glucose injection is usually intravenously injected at 500 to 1000 mL per adult due to water supply, drug / toxic poisoning, and liver disease.
  • the six saccharides are very safe for living bodies.
  • propylene glycol is sometimes used as a solubilizing agent in an injection when the active ingredient is hardly soluble in a solvent.
  • the maximum amount used in the human body is 3.2 g by intravenous injection.
  • propylene glycol is very safe for living organisms.
  • the cells to be cryopreserved are not particularly limited.
  • cell lines of various organisms lymphoid cells, spleen cells, thymocytes, fertilized eggs, hematopoietic stem cells, adult stem cells, mesenchymal stem cells, embryos Sex stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • Examples of the living organism include humans and non-human animals, and more specifically, insects, fish, amphibians, reptiles, birds, mammals, and the like. Mammals include laboratory animals such as primates excluding mice, rats, rabbits, guinea pigs and humans; pets such as dogs and cats (pets); domestic animals such as pigs, cows, goats, sheep and horses; Can be mentioned.
  • the cell cryopreservation solution of the present invention varies depending on the cells to be stored, but can achieve a good survival rate after, for example, one week of storage or more (for example, after 10 years). .
  • the survival rate after thawing may be 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, and particularly preferably 90% or more.
  • the cell cryopreservation solution of the present invention has an advantage that a good survival rate can be achieved, it can be used as an excellent cell cryopreservation solution even when it is not applied to a living body (for example, for research use). it can.
  • the cell cryopreservation solution of the present invention may be combined with, for example, a cold-resistant container, a temperature-controllable freezer or a slow-freezing container, or an instruction manual.
  • the instructions for use of the kit include, for example, the contents of the cryopreservation method according to the present invention described in the section of [Method for cryopreserving cells] described below, and / or [Method for preparing a frozen product of cells] described below. At least a part of the content of the manufacturing method according to the present invention described in the column is recorded.
  • the method of cryopreserving cells according to the present invention includes a mixing step of mixing the above-described cell cryopreservation solution and cells, and a freezing step of freezing the cells in a state of being mixed with the cell cryopreservation solution; ,including.
  • the number of cells per 1 mL of the cell cryopreservation solution is not particularly limited, but it is preferably 10 3 to 10 9 cells / mL, more preferably 10 4 to 10 8 cells / mL. Is preferred.
  • the cells Before the mixing step, the cells may be washed with a washing solution such as PBS (phosphate buffered saline). Thereby, for example, mixing of components such as a culture medium can be further reduced.
  • a washing solution such as PBS (phosphate buffered saline).
  • the mixture may be transferred to a cold resistant container such as an ampoule or cryotube.
  • the cold-resistant container is preferably sterilized inside.
  • the cooling rate is not particularly limited, but from the viewpoint of further increasing the survival rate, it is preferably cooled at a slow rate, more preferably at a cooling rate of about -1 ° C / min. Therefore, the freezing step is preferably performed using a temperature-controllable freezer or slow freezing container.
  • slow freezing containers include Corning's CoolCell (registered trademark), Nalgene's Mr. Frosty, and Nihon Freezer Corporation's Bicell.
  • the final freezing temperature is not particularly limited, but is preferably ⁇ 80 ° C. or lower, more preferably ⁇ 150 ° C. or lower, and further preferably ⁇ 196.5 ° C. or lower. Further, after storing at around ⁇ 80 ° C., it may be transferred to ⁇ 180 ° C. to ⁇ 200 ° C. (for example, in liquid nitrogen) for storage.
  • cells cryopreserved using the cryopreservation method according to the present invention can exhibit a good survival rate after thawing (see also examples described later).
  • Thawing is preferably performed quickly, for example, by immersing in a water bath at 37 ° C. ⁇ 1 ° C.
  • the cell cryopreservation solution may or may not be removed.
  • the thawed mixture can be applied to a living body without removing the cell cryopreservation solution. Since the cell cryopreservation solution of the present invention can be composed of components with extremely high safety to living organisms, it can be directly applied to living organisms. Therefore, it can be possible to perform cell transplantation easily and quickly at the site of cell transplantation (operating room).
  • the thawed mixture may be added to a culture medium or the like, and used after the cell cryopreservation solution is removed by centrifugation or washing. The liquid used for washing may be appropriately selected according to the content of subsequent treatment and the intended use of the cells. For example, culture medium, physiological saline, PBS, or the like may be used.
  • the cell cryopreservation solution in a research scene where it is desired to strictly control the components during cell culture.
  • the thawed mixture can be used for experiments such as cell culture without removing the cell cryopreservation solution. Since the cell cryopreservation solution of the present invention can be composed of components with extremely high safety against cells, cell culture can be suitably performed by diluting with a medium or the like without washing.
  • the method for producing a frozen product of cells according to the present invention includes a mixing step of mixing the above-described cell cryopreservation solution and cells, and freezing in which the cells are frozen in a state mixed with the cell cryopreservation solution. And a process.
  • a frozen product of cells produced using the production method according to the present invention can exhibit a good survival rate after thawing (see also examples described later).
  • the survival rate after thawing may be 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, and particularly preferably 90% or more.
  • the frozen material can be, for example, a cell preparation, a normal tissue or a cancer tissue having a size within several cm.
  • the cells contained in the cell preparation for example, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, lymphocyte cells, dendritic cells, nervous system cells, keratinocytes, and fibroblasts are preferable.
  • the cell cryopreservation solution comprises at least one saccharide selected from the group consisting of glucose, mannitol, sorbitol, trehalose, sucrose, and maltose, and propylene glycol, dimethyl sulfoxide, a thickener, and natural Contains no animal-derived ingredients.
  • the propylene glycol concentration is preferably 5.0 w / v% or more.
  • the propylene glycol concentration is more preferably 10.0 w / v% or more and 15.0 w / v% or less.
  • the concentration of the saccharide is preferably 1.0 w / v% or more and 5.0 w / v% or less in terms of monosaccharide.
  • the concentration of the saccharide is preferably 2.0 w / v% or more and 4.0 w / v% or less in terms of monosaccharide.
  • the cell cryopreservation solution preferably further contains a pH adjuster.
  • a method for cryopreserving cells includes a mixing step of mixing the cell cryopreservation solution and cells, and freezing in which the cells are mixed with the cell cryopreservation solution. And a process.
  • the method for producing a frozen product of cells includes a mixing step of mixing the cell cryopreservation solution and cells, and freezing the cells in a state of being mixed with the cell cryopreservation solution. Freezing step.
  • the freezing step is preferably performed using a temperature-controllable freezer or a slow freezing container.
  • the frozen cell product according to one embodiment of the present invention is prepared using the above-described method for preparing a frozen cell material.
  • ⁇ Used cells> Jurkat: Human T cell line leukemia cell line P3U1: Mouse myeloma cell line Mesenchymal stem cells: MSenchymal stem cells (MSC) (Source: National Institute of Biomedical Innovation, Health and Nutrition JCRB Cell Bank) iPS cells (induced pluripotent stem cells): 201B7 strain (source: iPS Academia Japan)
  • ⁇ Test method> [Freeze storage] 1. Various cells were collected from the culture flask, and viable cells were counted by trypan blue staining. 2. A required amount of cell suspension was dispensed into a 15 mL falcon tube, centrifuged at 1,200 rpm ⁇ 5 minutes (4 ° C.), and the supernatant was removed. 3. 3 mL (iPS cells: 0.6 mL) of each cell cryopreservation solution was added to suspend the pellet. 4). 1 mL (iPS cells: 0.2 mL) of cell suspension was dispensed into 1.5 mL cryotubes.
  • the number of cells was 3 ⁇ 10 6 cells / tube (Jurkat), 1 ⁇ 10 6 cells / tube (MSC and P3U1), or 2 ⁇ 10 5 cells / tube (iPS). 5.
  • Cryotubes were placed in Mr. Frosty (Nalgene), which had been ice-cooled in advance, and stored frozen in a ⁇ 80 ° C. freezer overnight. 6). The next day, the cryotube was transferred to a -152 ° C freezer and stored frozen for over 1 week.
  • Solution 1-A 3.0 w / v% glucose
  • Solution 1-B 3.0 w / v% glucose + 10.0 w / v% DMSO (MW 78.13)
  • Solution 1-C 3.0 w / v% glucose + 10.0 w / v% glycerol (MW 92.09)
  • Solution 1-D 3.0 w / v% glucose + 10.0 w / v% propylene glycol (MW 76.09)
  • Solution 2-A 2.5 w / v% propylene glycol + 3 w / v% glucose
  • 2-B 5.0 w / v% propylene glycol + 3 w / v% glucose
  • 2-C 7.5 w / v% propylene glycol + 3 w / V% glucose solution
  • 2-D 10.0 w / v% propylene glycol + 3 w / v% glucose solution
  • 2-E 12.5 w / v% propylene glycol + 3 w / v% glucose solution
  • 2-F 15.0 w / v % Propylene glycol + 3 w / v% glucose
  • Solution 3-A 10.0 w / v% propylene glycol Solution 3-B: 3.0 w / v% glucose (MW 180.2) + 10.0 w / v% propylene glycol Solution 3-C: 3.0 w / v% mannitol ( MW 182.2) +10.0 w / v% propylene glycol solution 3-D: 3.0 w / v% sorbitol (MW 182.2) +10.0 w / v% propylene glycol solution 3-E: 6.0 w / v% trehalose (MW 342.3 ) + 10.0 w / v% propylene glycol solution 3-F: 6.0 w / v% sucrose (MW 342.3) + 10.0 w / v% propylene glycol solution 3-G: 6.0 w / v% maltose (MW342.3) + 10.0w / v% propylene glycol solution 3-G: 6.0 w / v% maltose
  • Solution 4-A 10.0 w / v% propylene glycol Solution 4-B: 1.0 w / v% glucose + 10.0 w / v% propylene glycol Solution 4-C: 2.0 w / v% glucose + 10.0 w / v % Propylene glycol solution 4-D: 3.0 w / v% glucose + 10.0 w / v% propylene glycol solution 4-E: 4.0 w / v% glucose + 10.0 w / v% propylene glycol solution 4-F: 5. 0 w / v% glucose + 10.0 w / v% propylene glycol solution 4-G: 6.0 w / v% glucose + 10.0 w / v% propylene glycol
  • Solution 5-A 10.0 w / v% propylene glycol + 3.0 w / v% glucose (MW 180.2)
  • Solution 5-B 3.0 w / v% glucose (MW 180.2)
  • Solution 5-C 3.0 w / v% mannitol (MW 182.2)
  • Solution 5-D 3.0 w / v% sorbitol (MW 182.2)
  • Solution 5-E 6.0 w / v% trehalose (MW 342.3)
  • Solution 5-F 6.0 w / v% sucrose (MW 342.3)
  • Solution 5-G 6.0 w / v% maltose (MW 342.3)
  • the present invention can be used for cryopreservation of cells in medicine and research.

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Abstract

良好な生存率と生体への安全性とを両立し得る細胞凍結保存用溶液を提供する。本発明に係る細胞凍結保存用溶液は、グルコース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、スクロースおよびマルトースからなる群より選択される少なくとも１つの糖類ならびにプロピレングリコールを含み、ジメチルスルホキシド、増粘剤および天然の動物由来成分を含まない。

Description

細胞凍結保存用溶液およびその利用
　本発明は、細胞凍結保存用溶液およびその利用に関する。
　従来、培養細胞の継代による細胞の変質または雑菌による汚染等を防止し、細胞を長期的に利用するために凍結保存が行われている。細胞の凍結保存の一般的な方法として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）または血清等を含む溶液に細胞を懸濁し、クライオチューブまたはアンプル等に入れて凍結保存する（例えば液体窒素中）方法が知られている。例えば、特許文献１には、ＤＭＳＯ、増粘剤およびグルコースを含む細胞保存水溶液を用いて細胞を凍結保存し、良好な生存率が達成されたことが記載されている。
　近年の細胞移植による治療の発展により、患者に細胞製剤を投与する機会が増えつつある。細胞移植の現場（手術室）では、凍結保存されている細胞製剤を解凍後、患者に投与する前に、凍結保存溶液を除去する操作を行うことは困難である。そのため、患者に安全に投与可能でかつ十分な細胞の生存率が得られる細胞凍結保存用溶液の必要性が高まっている。
日本国特許第５８３５８５３号公報
Shu Z, Heimfeld S, Gao D.: Hematopoietic SCT with cryopreserved grafts: adverse reactions after transplantation and cryoprotectant removal before infusion. Bone Marrow Transplant. 2014 Apr;49(4):469-76 Alessandrino P, Bernasconi P, Caldera D, Colombo A, Bonfichi M, Malcovati L, Klersy C, Martinelli G, Maiocchi M, Pagnucco G, Varettoni M, Perotti C, Bernasconi C.: Adverse events occurring during bone marrow or peripheral blood progenitor cell infusion: analysis of 126 cases. Bone Marrow Transplant. 1999 Mar;23(6):533-7
　ＤＭＳＯは、細胞の生存率という観点においては最も優れた凍害防御剤であると考えられている。しかしながら、種々の細胞の機能の発現、分化および増殖に影響を与え得る。また、ＤＭＳＯを含む細胞凍結保存用溶液を用いた造血幹細胞移植において、吐き気、嘔吐、頭痛、血圧上昇、下痢、および腹部痙攣などの副作用が報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。
　他の凍害防御剤を組み合わせることによってＤＭＳＯの使用量を軽減する試みはある（非特許文献１）が、他の凍害防御剤への置き換えによる性能と生体への安全性との両方の確保は未だ不十分である。
　本発明は、このような課題を解決するためになされたものであって、良好な生存率と生体への安全性とを両立し得る細胞凍結保存用溶液を提供することを目的の１つとする。
　本発明の一態様に係る細胞凍結保存用溶液は、グルコース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、スクロースおよびマルトースからなる群より選択される少なくとも１つの糖類ならびにプロピレングリコールを含み、ジメチルスルホキシド、増粘剤および天然の動物由来成分を含まない。
　本発明の一態様に係る細胞を凍結保存する方法は、上記細胞凍結保存用溶液と細胞とを混合する混合工程と、当該細胞を、上記細胞凍結保存用溶液と混合された状態で凍結する凍結工程と、を含む。
　本発明の一態様に係る細胞の凍結物を作製する方法は、上記細胞凍結保存用溶液と細胞とを混合する混合工程と、当該細胞を、上記細胞凍結保存用溶液と混合された状態で凍結する凍結工程と、を含む。
　本発明の一態様に係る細胞の凍結物は、上記細胞の凍結物を作製する方法を用いて作製される。
　本発明の一態様に係る細胞凍結保存用溶液を用いれば、解凍後の細胞の生存率が良好であり、且つ、解凍した細胞を生体に対して安全に適用することができる。
　〔細胞凍結保存用溶液〕
　本発明に係る細胞凍結保存用溶液は、グルコース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、スクロースおよびマルトースからなる群より選択される少なくとも１つの糖類ならびにプロピレングリコールを含み、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、増粘剤および天然の動物由来成分を含まない。
　糖類は、グルコース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、スクロースおよびマルトースからなる群より選択される少なくとも１つである。すなわち、糖類は、当該群より選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つである。グルコースは単糖であり、マンニトールおよびソルビトールは糖アルコールであり、トレハロース、スクロースおよびマルトースは二糖である。糖類は、Ｄ体であってもよいし、Ｌ体であってもよいし、Ｄ体とＬ体との混合物であってもよいが、製造コストおよび安全性の観点から、Ｄ体であることが好ましい。一例において、糖類は単糖である。別の一例において、糖類は二糖である。別の一例において、糖類は糖アルコールである。別の一例において、糖類は単糖と二糖と糖アルコールとのうちの任意のものの混合物である。
　細胞凍結保存用溶液における糖類の濃度は、特に限定されないが、一例において、単糖換算で、０．５ｗ／ｖ％以上であることが好ましく、１．０ｗ／ｖ％以上であることがより好ましく、１．５ｗ／ｖ％以上であることがさらに好ましく、２．０ｗ／ｖ％以上であることが特に好ましく、また、１０．０ｗ／ｖ％以下であることが好ましく、６．０ｗ／ｖ％以下であることがより好ましく、５．０ｗ／ｖ％以下であることがさらに好ましく、４．５ｗ／ｖ％以下であることがさらに好ましく、４．０ｗ／ｖ％以下であることが特に好ましい。本明細書において「単糖換算」による濃度とは、単糖および糖アルコールではその重量で算出した濃度、二糖では半分の重量であると仮定して算出した濃度を指す。すなわち、上記二糖では、実際の濃度（ｗ／ｖ％）が上記の２倍の濃度になる。
　細胞凍結保存用溶液におけるプロピレングリコールの濃度は、特に限定されないが、一例において、２．５ｗ／ｖ％以上であることが好ましく、５．０ｗ／ｖ％以上であることがより好ましく、７．５ｗ／ｖ以上であることがさらに好ましく、１０．０ｗ／ｖ以上であることが特に好ましく、また、生体に対する安全性の観点から、１８．０ｗ／ｖ％以下であることが好ましく、１６．０ｗ／ｖ％以下であることがより好ましく、１５．０ｗ／ｖ％以下であることがさらに好ましく、１３．０ｗ／ｖ％以下であることが特に好ましい。
　ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、細胞の生存率という観点においては最も優れた凍害防御剤であると考えられている。しかしながら、上述の問題点が報告されている。本発明では、ＤＭＳＯを含んでいないため、それらＤＭＳＯがもたらす問題点が生じることがない。そのため、本発明の細胞凍結保存用溶液は、特に臨床使用において生体へ安全に適用することができるという観点で、非常に有用である。しかも、後述の実施例で示されるとおり、プロピレングリコールを含むことで、ＤＭＳＯと同等の細胞の生存率を達成し得る。
　増粘剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース（以下ＣＭＣとする）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（以下ＣＭＣ－Ｎａとする）、有機酸ポリマー、アルギン酸プロピレングリコール、およびアルギン酸ナトリウム等が挙げられる。本発明の細胞凍結保存用溶液では、増粘剤を含んでいないことにより、増粘剤がもたらし得る副作用の発生を回避することができる。そのため、本発明の細胞凍結保存用溶液は、特に臨床使用において生体へ安全に適用することができるという観点で、非常に有用である。しかも、後述の実施例で示されるとおり、増粘剤が含まれていなくとも細胞を良好な生存率で凍結保存することができる。
　天然の動物由来成分としては、例えば、アルブミン、血清、血漿および基礎培地等が挙げられる。血清としては成牛血清、仔牛血清、新生仔牛血清、および牛胎児血清等が挙げられる。基礎培地としては、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＨａｍＦ－１２培地、およびＤＭ－１６０培地等が挙げられる。本発明の細胞凍結保存用溶液は、天然の動物由来成分を含まないため、天然の動物由来成分のロット間での品質の違いの問題を生じることがない上、血清に含まれる各種サイトカイン、増殖因子およびホルモン等の本来細胞保存に不必要な成分による細胞の性質の変化の虞を回避でき、さらに、基礎培地に含まれる由来が不明な成分による影響も回避できる。そのため、本発明の細胞凍結保存用溶液は、特に臨床使用において生体に安全に適用することができるという観点で、非常に有用である。しかも、後述の実施例で示されるとおり、天然の動物由来成分が含まれていなくとも細胞を良好な生存率で凍結保存することができる。
　細胞凍結保存用溶液は、さらに、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、ｐＨ調製剤等が挙げられる。ｐＨ調整剤としては、例えば、リン酸緩衝液および炭酸緩衝液等が挙げられる。また、Basic Stock Solution（ＢＳＳ）にリン酸緩衝液を添加しない場合には、生理食塩水を添加したものも用いることができる。このうちリン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。ｐＨ調整剤は細胞凍結保存用溶液中のｐＨをおよそ６．５～９．０、好ましくは７．０～８．５に調整するために適宜用いることが好ましい。なお、本発明におけるリン酸緩衝液とは、塩化ナトリウム、リン酸一ナトリウム（無水）、リン酸一カリウム（無水）、リン酸二ナトリウム（無水）、リン酸三ナトリウム（無水）、塩化カリウム、およびリン酸二水素カリウム（無水）などのことをいい、特に塩化ナトリウム、リン酸一ナトリウム（無水）、塩化カリウム、またはリン酸二水素カリウム（無水）を用いることが好ましい。また、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、およびリン酸水素二ナトリウムの組み合わせも好ましい。ｐＨ調整剤は細胞凍結保存用溶液中に０．０１～１．０ｗ／ｖ％含まれることが好ましく、０．０５～０．５ｗ／ｖ％含まれることがより好ましい。また、実施例で用いた無機塩類溶液の組成も好適である。
　細胞凍結保存用溶液は、水溶液であることが好ましい。細胞凍結保存用溶液の浸透圧は、保存液としての性能を保持するために、１０００ｍＯｓｍ以上であることが好ましく、１０００～２７００ｍＯｓｍであることがより好ましい。
　なお、細胞凍結保存用溶液の組成は、細胞を十分に保存できる組成であれば上記で列挙した各成分の具体例のうちいずれの成分の組み合わせも用いることができる。また、濃度についてもそれぞれ選択して組み合わせることができる。さらに、後述の実施例における成分および／または濃度についてもそれぞれ選択して組み合わせることができる。すなわち、本明細書に開示されている個々の成分および／または濃度をそれぞれ選択して組み合わせることができる。
　細胞凍結保存用溶液は、好ましい一例において、糖類およびプロピレングリコールを含み、かつＤＭＳＯ、増粘剤および天然の動物由来成分を含まない水溶液である。細胞凍結保存用溶液は、より好ましい一例において、糖類、プロピレングリコールおよびｐＨ調整剤を含み、かつＤＭＳＯ、増粘剤および天然の動物由来成分を含まない水溶液である。細胞凍結保存用溶液は、さらに好ましい一例において、糖類、プロピレングリコールおよびｐＨ調整剤のみを含み、かつＤＭＳＯ、増粘剤および天然の動物由来成分を含まない水溶液である（すなわち、糖類、プロピレングリコール、ｐＨ調整剤および水のみからなる）。
　細胞凍結保存用溶液は、滅菌されていることが好ましい。細菌等の感染のリスクが低減されるため、より安全に生体へ適用することができるからである。また、研究用途においては、細菌等による汚染のリスクが低減されるからである。
　グルコース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、スクロースおよびマルトースは、静脈内注射液の成分として使用された実績がある。特にグルコースは、５％ブドウ糖注射液が、水補給、薬物・毒物中毒、肝疾患のために、通常成人１回あたり５００～１０００ｍＬが静脈内注射されている。このように上記６つの糖類は、生体に対する安全性が非常に高い。
　また、プロピレングリコールは、注射剤において、有効成分が溶媒に難溶な場合に溶解補助剤として用いられることもある。日本医薬品添加剤協会の安全性データによれば、人体への最大使用量は静脈内注射で３．２ｇである。このようにプロピレングリコールは、生体に対する安全性が非常に高い。
　凍結保存の対象となる細胞は、特に限定されず、例えば、様々な生物の株化細胞、リンパ球系細胞、脾臓細胞、胸腺細胞、受精卵、造血幹細胞、成体幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等を挙げることができる。由来となる生物としては、ヒトおよび非ヒト動物などが挙げられ、より具体的には、昆虫、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物などが挙げられる。哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌおよびネコ等の愛玩動物（ペット）；ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジおよびウマ等の家畜；ならびにヒトが挙げられる。
　本発明の細胞凍結保存用溶液は、保存の対象となる細胞によって異なるが、例えば、保存１週間経過後またはそれ以上経過後（例えば１０年以上経過後）において、良好な生存率を達成し得る。一例において、解凍後の生存率は、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上であり得る。
　本発明の細胞凍結保存用溶液は、良好な生存率を達成し得るという利点があるため、生体に適用する場合以外（例えば、研究用途）でも、優れた細胞凍結保存用溶液として利用することができる。
　本発明の細胞凍結保存用溶液は、例えば、後述する耐寒性容器、温度制御可能なフリーザーもしくは緩慢凍結容器、または使用説明書等と組み合わせて、キットとしてもよい。キットの使用説明書には、例えば、後述する〔細胞を凍結保存する方法〕の欄で説明する本発明に係る凍結保存方法の内容、および／または後述する〔細胞の凍結物を作製する方法〕の欄で説明する本発明に係る作製方法の内容の少なくとも一部が記録されている。
　〔細胞を凍結保存する方法〕
　本発明に係る細胞を凍結保存する方法は、上述の細胞凍結保存用溶液と細胞とを混合する混合工程と、当該細胞を、当該細胞凍結保存用溶液と混合された状態で凍結する凍結工程と、を含む。
　混合工程において、細胞凍結保存用溶液１ｍＬあたりの細胞数は、特に限定されないが、好ましくは１０３～１０９個／ｍＬ、より好ましくは１０４～１０８個／ｍＬになるように調製することが好ましい。
　混合工程の前に、細胞をＰＢＳ（phosphate buffered saline）等の洗浄液を用いて洗浄してもよい。これによって、例えば、培養培地等の成分の混入をより低減することができる。
　混合物は、例えば、アンプルまたはクライオチューブ等の耐寒性容器に移してもよい。耐寒性容器は、内部が滅菌されていることが好ましい。
　凍結工程において、冷却速度は特に限定されないが、生存率をより高める観点から、緩速で冷却することが好ましく、－１℃／分程度の冷却速度で冷却することがより好ましい。そのため、凍結工程は、温度制御可能なフリーザーまたは緩慢凍結容器を用いて行われることが好ましい。緩慢凍結容器としては、Corning社のCoolCell（登録商標）、Nalgene社のMr. Frosty、および日本フリーザー株式会社のバイセル等が挙げられる。最終的な凍結温度は特に限定されないが、好ましくは－８０℃以下、より好ましくは－１５０℃以下、さらに好ましくは－１９６．５℃以下である。また、－８０℃付近で保存した後、－１８０℃～－２００℃（例えば、液体窒素中）に移して保存してもよい。
　本発明に係る凍結保存方法を用いて凍結保存された細胞は、上述のとおり、解凍後に良好な生存率を示し得る（後述の実施例も参照）。解凍は、素早く行うことが好ましく、例えば、３７℃±１℃のウォーターバスに浸漬して行うことが好ましい。解凍後の細胞の使用において、細胞凍結保存用溶液は除去されてもよいし、除去されなくてもよい。
　一例において、解凍した混合物は、細胞凍結保存用溶液が除去されることなく生体に適用され得る。本発明の細胞凍結保存用溶液は、生体に対する安全性が非常に高い成分で構成され得るため、生体に直接適用することができる。したがって、細胞移植の現場（手術室）において簡便且つ迅速に細胞移植を行うことを可能にし得る。別の一例では、解凍した混合物は培養培地等に添加され、遠心分離または洗浄等によって細胞凍結保存用溶液が除去されてから使用され得る。洗浄で用いる液体はその後の処理内容および細胞の使用用途に応じて適宜選択すればよく、例えば、培養培地、生理食塩水、またはＰＢＳ等を用いればよい。例えば、細胞培養時の成分等を厳密に管理したい研究場面では、細胞凍結保存用溶液を除去することが好ましい場合がある。また別の一例では、解凍した混合物は、細胞凍結保存用溶液が除去されることなく、細胞培養等の実験に用いられ得る。本発明の細胞凍結保存用溶液は、細胞に対する安全性が非常に高い成分で構成され得るため、洗浄せずとも、培地等で希釈することで、好適に細胞培養を行うことができる。
　〔細胞の凍結物を作製する方法および細胞の凍結物〕
　本発明に係る細胞の凍結物を作製する方法は、上述の細胞凍結保存用溶液と細胞とを混合する混合工程と、当該細胞を、当該細胞凍結保存用溶液と混合された状態で凍結する凍結工程と、を含む。
　細胞の凍結物を作製する方法の具体的な説明は、上記〔細胞を凍結保存する方法〕と同様である。
　本発明に係る作製方法を用いて作製された細胞の凍結物は、上述のとおり、解凍後に良好な生存率を示し得る（後述の実施例も参照）。一例において、解凍後の生存率は、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上であり得る。
　凍結物は、例えば、細胞製剤、または数ｃｍ以内のサイズの正常組織もしくは癌組織等であり得る。細胞製剤に含まれる細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、リンパ球系細胞、樹状細胞、神経系細胞、ケラチノサイト、および線維芽細胞が好ましい。
　以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
　〔まとめ〕
　本発明の一態様に係る細胞凍結保存用溶液は、グルコース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、スクロースおよびマルトースからなる群より選択される少なくとも１つの糖類ならびにプロピレングリコールを含み、ジメチルスルホキシド、増粘剤および天然の動物由来成分を含まない。
　上記細胞凍結保存用溶液において、上記プロピレングリコールの濃度が５．０ｗ／ｖ％以上であることが好ましい。
　上記細胞凍結保存用溶液において、上記プロピレングリコールの濃度が１０．０ｗ／ｖ％以上１５．０ｗ／ｖ％以下であることがより好ましい。
　上記細胞凍結保存用溶液において、上記糖類の濃度が単糖換算で１．０ｗ／ｖ％以上５．０ｗ／ｖ％以下であることが好ましい。
　上記細胞凍結保存用溶液において、上記糖類の濃度が単糖換算で２．０ｗ／ｖ％以上４．０ｗ／ｖ％以下であることが好ましい。
　上記細胞凍結保存用溶液において、さらにｐＨ調整剤を含むことが好ましい。
　本発明の一態様に係る細胞を凍結保存する方法は、上記細胞凍結保存用溶液と細胞とを混合する混合工程と、当該細胞を、上記細胞凍結保存用溶液と混合された状態で凍結する凍結工程と、を含む。
　本発明の一態様に係る細胞の凍結物を作製する方法は、上記細胞凍結保存用溶液と細胞とを混合する混合工程と、当該細胞を、上記細胞凍結保存用溶液と混合された状態で凍結する凍結工程と、を含む。
　上記方法において、上記凍結工程は、温度制御可能なフリーザーまたは緩慢凍結容器を用いて行われることが好ましい。
　本発明の一態様に係る細胞の凍結物は、上記細胞の凍結物を作製する方法を用いて作製される。
　＜使用した細胞＞
　Jurkat：ヒトＴ細胞系白血病細胞株
　P3U1：マウスミエローマ細胞株
　間葉系幹細胞：mesenchymal stem cells（MSC）（入手元：国立研究開発法人　医薬基盤・健康・栄養研究所　ＪＣＲＢ細胞バンク）
　iPS細胞（induced pluripotent stem cells）：201B7株（入手元：ｉＰＳアカデミアジャパン株式会社）
　＜試験方法＞
　〔凍結保存〕
１．　各種細胞を培養フラスコから回収し、トリパンブルー染色により生存細胞を計数した。
２．　１５ｍＬファルコンチューブに必要量の細胞懸濁液を分注し、１，２００ｒｐｍ×５分（４℃）で遠心分離後、上清を除去した。
３．各細胞凍結保存用溶液を３ｍＬ（ｉＰＳ細胞：０．６ｍＬ）加え、ペレットを懸濁した。
４．　１．５ｍＬクライオチューブに細胞懸濁液を１ｍＬ（ｉＰＳ細胞：０．２ｍＬ）ずつ分注した。細胞数は、３×１０６cells/tube（Jurkat）、１×１０６cells/tube（MSCおよびP3U1）、または２×1０５cells/tube（iPS）とした。
５．　予め氷冷しておいたMr. Frosty（Nalgene社）にクライオチューブを入れ、－８０℃冷凍庫で一晩凍結保存した。
６．　翌日、－１５２℃冷凍庫にクライオチューブを移し、１週間以上凍結保存した。
　〔解凍〕
１．　－１５２℃冷凍庫からクライオチューブを取り出し、３７℃のウォーターバスで素早く解凍した。
２．　１５ｍＬファルコンチューブに、室温に戻しておいた培地を９ｍＬ入れ、そこに解凍した細胞懸濁液を移した。
３．　１，２００ｒｐｍ×５分（４℃）で遠心分離した後、上清を除去した。
４．　３ｍＬ（Jurkat）、１ｍＬ（MSCおよびP3U1）、または０．２ｍＬ（iPS細胞）の培地を加えた。
５．　トリパンブルー染色により生存細胞を計数して、細胞の生存率を計算した。
　＜細胞凍結保存用溶液の調製＞
　〔無機塩類溶液〕
　下記物質を下記濃度で蒸留水に溶解している水溶液を、無機塩類溶液として調製した。なお、この無機塩類溶液は、ｐＨ調整機能を奏する。
　　・リン酸二水素カリウム　0.0328 g/L
　　・塩化ナトリウム　1.315 g/L
　　・塩化カリウム　0.0328 g/L
　　・リン酸水素二ナトリウム12水和物　0.189 g/L
　〔細胞凍結保存用溶液〕
　各実験において、後述の組成となるよう各成分を無機塩類溶液に添加し、混合した。これをフィルターで濾過して無菌的な細胞凍結保存用溶液を調製した。
　＜実験１＞
　グルコースとの組み合わせにおけるＤＭＳＯ、グリセロールおよびプロピレングリコールについて、凍結保存効果を調べた。
　溶液１－Ａ：３．０ｗ／ｖ％グルコース
　溶液１－Ｂ：３．０ｗ／ｖ％グルコース＋１０．０ｗ／ｖ％ＤＭＳＯ(MW 78.13)
　溶液１－Ｃ：３．０ｗ／ｖ％グルコース＋１０．０ｗ／ｖ％グリセロール(MW 92.09)
　溶液１－Ｄ：３．０ｗ／ｖ％グルコース＋１０．０ｗ／ｖ％プロピレングリコール(MW 76.09)
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　グリセロールと比較して、プロピレングリコールでは、ＤＭＳＯと同等の生存率を達成できることが示された。
　＜実験２＞
　プロピレングリコールについて、凍結保存効果における濃度依存性を調べた。
　溶液２－Ａ：２．５ｗ／ｖ％プロピレングリコール＋３ｗ／ｖ％グルコース
　溶液２－Ｂ：５．０ｗ／ｖ％プロピレングリコール＋３ｗ／ｖ％グルコース
　溶液２－Ｃ：７．５ｗ／ｖ％プロピレングリコール＋３ｗ／ｖ％グルコース
　溶液２－Ｄ：１０．０ｗ／ｖ％プロピレングリコール＋３ｗ／ｖ％グルコース
　溶液２－Ｅ：１２．５ｗ／ｖ％プロピレングリコール＋３ｗ／ｖ％グルコース
　溶液２－Ｆ：１５．０ｗ／ｖ％プロピレングリコール＋３ｗ／ｖ％グルコース
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　＜実験３＞
　プロピレングリコールとの組み合わせにおける種々の糖類について、凍結保存効果を調べた。
　溶液３－Ａ：１０．０ｗ／ｖ％プロピレングリコール
　溶液３－Ｂ：３．０ｗ／ｖ％グルコース(MW 180.2)＋１０．０ｗ／ｖ％プロピレングリコール
　溶液３－Ｃ：３．０ｗ／ｖ％マンニトール(MW 182.2)＋１０．０ｗ／ｖ％プロピレングリコール
　溶液３－Ｄ：３．０ｗ／ｖ％ソルビトール(MW 182.2)＋１０．０ｗ／ｖ％プロピレングリコール
　溶液３－Ｅ：６．０ｗ／ｖ％トレハロース(MW 342.3)＋１０．０ｗ／ｖ％プロピレングリコール
　溶液３－Ｆ：６．０ｗ／ｖ％スクロース(MW 342.3)＋１０．０ｗ／ｖ％プロピレングリコール
　溶液３－Ｇ：６．０ｗ／ｖ％マルトース(MW342.3)＋１０．０ｗ／ｖ％プロピレングリコール
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　グルコース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、スクロースおよびマルトースの何れにおいても高い生存率を達成できることが示された。
　＜実験４＞
　糖類（グルコース）について、凍結保存効果における濃度依存性を調べた。
　溶液４－Ａ：１０．０ｗ／ｖ％プロピレングリコール
　溶液４－Ｂ：１．０ｗ／ｖ％グルコース＋１０．０ｗ／ｖ％プロピレングリコール
　溶液４－Ｃ：２．０ｗ／ｖ％グルコース＋１０．０ｗ／ｖ％プロピレングリコール
　溶液４－Ｄ：３．０ｗ／ｖ％グルコース＋１０．０ｗ／ｖ％プロピレングリコール
　溶液４－Ｅ：４．０ｗ／ｖ％グルコース＋１０．０ｗ／ｖ％プロピレングリコール
　溶液４－Ｆ：５．０ｗ／ｖ％グルコース＋１０．０ｗ／ｖ％プロピレングリコール
　溶液４－Ｇ：６．０ｗ／ｖ％グルコース＋１０．０ｗ／ｖ％プロピレングリコール
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　＜実験５＞
　プロピレングリコール非存在下における種々の糖類について、凍結保存効果を調べた。
　溶液５－Ａ：１０．０ｗ／ｖ％プロピレングリコール＋３．０ｗ／ｖ％グルコース(MW 180.2)
　溶液５－Ｂ：３．０ｗ／ｖ％グルコース(MW 180.2)
　溶液５－Ｃ：３．０ｗ／ｖ％マンニトール(MW 182.2)
　溶液５－Ｄ：３．０ｗ／ｖ％ソルビトール(MW 182.2)
　溶液５－Ｅ：６．０ｗ／ｖ％トレハロース(MW 342.3)
　溶液５－Ｆ：６．０ｗ／ｖ％スクロース(MW 342.3)
　溶液５－Ｇ：６．０ｗ／ｖ％マルトース(MW 342.3)
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　プロピレングリコール非存在下では、何れの糖類についても、生存率が非常に低いことが示された。
　本発明は、医療および研究等における細胞の凍結保存に利用することができる。

Claims (10)

  1. 　グルコース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、スクロースおよびマルトースからなる群より選択される少なくとも１つの糖類ならびにプロピレングリコールを含み、ジメチルスルホキシド、増粘剤および天然の動物由来成分を含まない、細胞凍結保存用溶液。
  2. 　上記プロピレングリコールの濃度が５．０ｗ／ｖ％以上である、請求項１に記載の細胞凍結保存用溶液。
  3. 　上記プロピレングリコールの濃度が１０．０ｗ／ｖ％以上１５．０ｗ／ｖ％以下である、請求項２に記載の細胞凍結保存用溶液。
  4. 　上記糖類の濃度が単糖換算で１．０ｗ／ｖ％以上５．０ｗ／ｖ％以下である、請求項１～３の何れか１項に記載の細胞凍結保存用溶液。
  5. 　上記糖類の濃度が単糖換算で２．０ｗ／ｖ％以上４．０ｗ／ｖ％以下である、請求項４に記載の細胞凍結保存用溶液。
  6. 　さらにｐＨ調整剤を含む、請求項１～５の何れか１項に記載の細胞凍結保存用溶液。
  7. 　細胞を凍結保存する方法であって、
    　請求項１～６の何れか１項に記載の細胞凍結保存用溶液と細胞とを混合する混合工程と、
    　上記細胞を、上記細胞凍結保存用溶液と混合された状態で凍結する凍結工程と、を含む、方法。
  8. 　細胞の凍結物を作製する方法であって、
    　請求項１～６の何れか１項に記載の細胞凍結保存用溶液と細胞とを混合する混合工程と、
    　上記細胞を、上記細胞凍結保存用溶液と混合された状態で凍結する凍結工程と、を含む、方法。
  9. 　上記凍結工程は、温度制御可能なフリーザーまたは緩慢凍結容器を用いて行われる、請求項７または８に記載の方法。
  10. 　請求項８に記載の方法を用いて作製された、細胞の凍結物。
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