ES2207687T3 - Procedimiento y dispositivo para hacer vesiculas de tamaño optimo llenas de gas. - Google Patents

Abstract

UN METODO Y APARATO PARA FABRICAR AMPOLLAS ADECUADAS COMO AGENTES DE CONTRASTE EN LAS QUE SE AGITA UN RECIPIENTE QUE CONTIENE UNA FASE DE SUSPENSION ACUOSA Y UNA FASE DE GAS SEPARADA UTILIZANDO UN MOVIMIENTO ALTERNATIVO. EL MOVIMIENTO ALTERNATIVO SE PRODUCE POR MEDIO DE UN BRAZO AGITADOR QUE MUEVE EL RECIPIENTE EN DOS DIRECCIONES SUSTANCIALMENTE PERPENDICULARES, REALIZANDOSE EL MOVIMIENTO EN LA PRIMERA DIRECCION A LO LARGO DE UNA TRAYECTORIA ARQUEADA. LA TRAYECTORIA GLOBAL DEL MOVIMIENTO ADOPTA UN PATRON EN FORMA DE 8. LA FRECUENCIA DE AGITACION ES AL MENOS DE APROXIMADAMENTE 2.800 RPM, LA LONGITUD DEL BRAZO AGITADOR ES AL MENOS DE APROXIMADAMENTE 6 CM, Y EL ANGULO DE GIRO DEL BRAZO AGITADOR EN LA PRIMERA DIRECCION ES AL MENOS DE APROXIMADAMENTE 3 (GRADOS) . LA LONGITUD TOTAL RECORRIDA ALREDEDOR DEL PATRON EN FORMA DE 8 ES AL MENOS DE 0,7 CM.

Description

Procedimiento y dispositivo para hacer vesículas de tamaño óptimo llenas de gas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método y aparato para hacer vesículas llenas de gas, especialmente vesículas llenas de gas del tipo útil para formación de imágenes por ultrasonidos. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método y aparato para hacer vesículas llenas de gas por agitación en los que los parámetros de agitación son controlados para proporcionar vesículas de tamaño óptimo en una cantidad mínima de tiempo.

Antecedentes de la invención

Los ultrasonidos son una técnica de formación de imágenes de diagnóstico que proporciona varias ventajas sobre otra metodología de diagnóstico. A diferencia de técnicas como la medicina nuclear y los rayos X, los ultrasonidos no someten al paciente a exposiciones potencialmente nocivas de radiación ionizante de electrones que pueden dañar potencialmente materiales biológicos, tal como ADN, ARN y proteínas. Además, la tecnología de ultrasonidos es una modalidad relativamente barata en comparación con técnicas como la tomografía computarizada (TC) o la formación de imágenes por resonancia magnética.

El principio del ultrasonido se basa en el hecho de que las ondas sonoras serán reflejadas de forma diferencial por los tejidos dependiendo de la composición y densidad del tejido o la vasculatura que se observe. Dependiendo de la composición del tejido, las ondas ultrasónicas se disiparán por absorción, penetrarán a través del tejido o se reflejarán. La reflexión, denominada retrodispersión o reflectividad, es la base para desarrollar una imagen por ultrasonidos. Se utiliza un transductor, que es típicamente capaz de detectar ondas sonoras del orden de 1 MHz a 10 MHz en entornos clínicos, para detectar de forma sensible las ondas sonoras devueltas. Estas ondas se integran después en una imagen que puede ser cuantificada. Las ondas cuantificadas se convierten después en una imagen del tejido que se observa.

A pesar de las mejoras técnicas de la modalidad ultrasónica, las imágenes obtenidas todavía están sujetas a refinamiento adicional, en particular con respecto a la formación de imágenes de la vasculatura y tejidos irrigados con un suministro de sangre vascular. Por lo tanto, hay que formular agentes que ayuden a la visualización de la vasculatura y órganos relacionados con los vasos.

Las vesículas son deseables como agentes de contraste para ultrasonido porque la reflexión de sonido en una interface líquido-gas, tal como la superficie de una vesícula, es sumamente eficiente.

Para que sean efectivas como agentes de contraste de ultrasonido, las vesículas deberán ser lo más grandes y elásticas que sea posible, puesto que estas dos propiedades (tamaño y elasticidad de la burbuja) son importantes al maximizar la reflectividad de sonido de las vesículas. Además, las vesículas deberán ser estables a presión, es decir, retener más de 50% del gas contenido, después de la exposición a presión. También es altamente deseable que las vesículas se reexpandan después de la liberación de presión. Además, es altamente deseable tener una alta concentración de vesículas para maximizar la reflectividad y, por lo tanto, el contraste. Por lo tanto, la concentración de vesículas es un factor importante al determinar la eficacia de las vesículas. En particular, es deseable tener más de 100x10^{6} vesículas por ml y, más preferiblemente, más de 500x10^{6} vesículas por ml.

Sin embargo, el tamaño sigue siendo un factor crucial al determinar la idoneidad de las vesículas para la formación de imágenes. En el régimen de vesículas que pueden pasar con seguridad por la vasculatura capilar, la señal reflejada (dispersor Rayleigh) puede ser una función del diámetro de las vesículas elevado a la sexta potencia de modo que una vesícula de 4 \mum de diámetro tenga 64 veces la capacidad de dispersión de una vesícula de 2 \mum de diámetro.

El tamaño también es importante porque las vesículas de más de 10 \mum pueden ser peligrosas. Las vesículas grandes tienden a ocluir los microvasos después de la inyección intravenosa o intravascular. Por lo tanto, es importante que las vesículas sean lo más grandes que sea posible para reflejar eficientemente sonido, pero bastante pequeñas para pasar por los capilares.

A este respecto, es altamente deseable que el 99% de las vesículas sea de menos de 10 \mum. Además, el tamaño medio de vesícula deberá ser al menos 0,5 \mum, preferiblemente más de 1 \mum, y más preferiblemente cerca de 2 \mum para contraste más efectivo. Además, el volumen ponderado medio deberá ser en el orden de 7 \mum.

La elasticidad de las vesículas puede afectar a su tamaño máximo permisible puesto que cuanto mayor es la elasticidad de la vesícula, mayor es su capacidad de "escurrirse" por los capilares. Por desgracia, varios factores pueden evitar la formación de vesículas altamente elásticas, intensificando más por lo tanto la importancia de optimizar el tamaño de vesícula.

Aunque las vesículas no recubiertas tienen elasticidad máxima, son generalmente inestables. En consecuencia, con frecuencia se realizan esfuerzos para mejorar la estabilidad de las vesículas, por ejemplo, por recubrimiento, que tiene el efecto de reducir su elasticidad. Además, se ha sugerido el uso de gas o precursores de gas encapsulados en una envuelta proteínica, estando la proteína entrecruzada con agentes de entrecruzamiento biodegradables, así como el uso de vesículas no proteínicas entrecruzadas covalentemente con compuestos biocompatibles. Se puede suponer que tales entrecruzadores añadirán un componente de rigidez a las vesículas, reduciendo así su elasticidad.

Aunque es sabido que se puede hacer liposomas agitando una solución de surfactante en un medio líquido (véase, la patente de Estados Unidos 4.684.479 (D'Arrigo), hasta ahora no se ha desarrollado un método para hacer vesículas de tamaño óptimo en una cantidad mínima de tiempo. En consecuencia, por todas las razones anteriores, se necesita un método y aparato para hacer vesículas en los que los parámetros de agitación sean controlados para producir vesículas de tamaño óptimo en una cantidad mínima de tiempo.

Resumen de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método y aparato para hacer vesículas como los definidos en las reivindicaciones anexas en los que las variables de agitación son controladas para producir vesículas de tamaño óptimo en una cantidad mínima de tiempo. Este y otros objetos se logran con un método en el que un recipiente conteniendo una fase de suspensión acuosa y una fase gas es agitado usando movimiento alternativo. El movimiento alternativo lo produce un brazo agitador que mueve el recipiente en dos direcciones sustancialmente perpendiculares. El movimiento en la primera dirección se produce a lo largo de un recorrido arqueado que tiene un radio de curvatura de al menos 6 cm y abarca un ángulo de al menos 3º. El recorrido general del movimiento se produce en una configuración en forma del número 8. La frecuencia de agitación es al menos 2800 RPM, la amplitud de la agitación es al menos 0,3 cm y la longitud total de avance del recipiente durante cada ciclo es al menos 0,7 cm.

La presente invención también abarca un aparato para agitar un recipiente conteniendo una fase de suspensión acuosa y una fase gas usando el método antes descrito. El aparato tiene un brazo agitador con una longitud de al menos 6 cm que gira en un ángulo de al menos 3º.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una vista en alzado de la porción de recipiente del aparato de agitación de la presente invención, en el que se hacen vesículas por el método de agitación de la presente invención.

La figura 2 es una vista isométrica del aparato de agitación según la presente invención, sin el recipiente.

La figura 3 es una vista en sección transversal longitudinal del aparato de agitación mostrado en la figura 2, sin la cubierta, pero incluyendo la instalación del recipiente representado en la figura 1.

Las figuras 4 y 5 son vistas en alzado y en planta, respectivamente, del recorrido seguido por el recipiente representado en la figura 1 cuando se instala en el aparato de agitación mostrado en la figura 2, tomándose la figura 5 a lo largo de la línea V-V representada en la figura 4.

La figura 6 es una vista isométrica de los principales componentes internos del aparato de agitación mostrado en la figura 2.

Las figuras 7 y 8 son vistas en sección transversal longitudinal del aparato de agitación mostrado en la figura 2 cerca de la región donde el brazo agitador está montado sobre el eje motor, representándose en transparencia en la figura 7 la posición del brazo agitador cuando el casquillo excéntrico está en la orientación representada en la figura 8.

Las figuras 9(a) y (b) son vistas del brazo agitador tomadas a lo largo de la línea IX-IX representada en la figura 7, a excepción de que en las figuras 9(a) y (b) el casquillo excéntrico se ha girado 90º y 270º, respectivamente, de su orientación representado en la figura 7.

La figura 10 es una vista en sección transversal tomada a través de la línea X-X representada en la figura 9(b), mostrándose en transparencia la orientación del manguito cuando el casquillo excéntrico se ha girado 180º.

La figura 11 es una vista isométrica del casquillo excéntrico montado en el eje motor.

La figura 12 es una vista similar a la figura 9 mostrando la orientación del brazo agitador cuando se emplea un muelle de tensión inferior.

La figura 13 es un gráfico que muestra la relación entre la frecuencia de agitación, en RPM, por una parte, y la longitud del brazo agitador L, en cm, y el ángulo de desviación del cojinete \theta, por otra parte, usados para obtener los resultados de prueba mostrados en las figuras 14-16.

Las figuras 14(a)-(c) son gráficos que muestran el porcentaje de vesículas que tienen un tamaño inferior a 10 \mum, el número de tamaño medio ponderado, y las partículas por ml, frente a la longitud del brazo agitador L, en mm, cuando se varían la longitud del brazo agitador y las RPM según la figura 13, a un ángulo de desviación del cojinete \theta de 6º.

Las figuras 15(a)-(c) son gráficos similares a las figuras 14(a)-(c) que comparan los resultados obtenidos usando un ángulo de desviación del cojinete \theta de 9º con los representados en las figuras 14(a)-(c).

Las figuras 16(a)-(c) son gráficos que muestran el porcentaje de vesículas que tienen un tamaño inferior a 10 \mum, el número de tamaño medio ponderado, y las partículas por ml, frente a la longitud total del recorrido de agitación, en cm.

La figura 17 es un gráfico que muestra la relación entre la frecuencia de agitación, en RPM, y la longitud total del recorrido de agitación, en cm, usadas para obtener los resultados de prueba mostrados en la figura 16.

Las figuras 18(a)-(c) son gráficos que muestran el porcentaje de vesículas que tienen un tamaño inferior a 10 \mum, el número de tamaño medio ponderado, y las partículas por ml de tres tipos diferentes de dispositivos agitadores.

Descripción de la realización preferida

Según el método de la presente invención, se hacen vesículas de tamaño óptimo poniendo primero una suspensión acuosa 34, incluyendo preferiblemente lípidos, en un recipiente 9, como se representa en la figura 1.

En el sentido en que se usa aquí, el término "vesícula" se refiere a una entidad esférica que se caracteriza por la presencia de un vacío interno. Las vesículas preferidas se formulan a partir de lípidos, incluyendo los varios lípidos descritos en la presente memoria. En cualquier vesícula dada, los lípidos pueden tener forma de una monocapa o bicapa, y los lípidos de la mono- o bicapa se pueden usar para formar una o varias mono- o bicapas. En el caso de más de una mono- o bicapa, las mono- o bicapas son generalmente concéntricas. Las vesículas descritas en la presente memoria también se denominan a veces burbujas o microburbujas e incluyen entidades comúnmente denominadas liposomas y micelas, y análogos. Así, los lípidos se pueden usar para formar una vesícula unilamelar (compuesta de una monocapa o bicapa), una vesícula oligolamelar (compuesta de aproximadamente dos o aproximadamente tres monocapas o bicapas) o una vesícula multilamelar (compuesta de más de aproximadamente tres monocapas o bicapas). El vacío interno de las vesículas se puede llenar con un gas, o un precursor gaseoso.

"Liposoma" se refiere a una agrupación o agregado generalmente esférico de compuestos anfipáticos, incluyendo compuestos lípidos, típicamente en forma de una o varias capas concéntricas. Muy preferiblemente, el liposoma lleno de gas está formado por una capa única (es decir unilamelar) o una sola monocapa de lípido. Se puede usar una amplia variedad de lípidos para formar los liposomas incluyendo fosfolípidos y surfactantes iniónicos (por ejemplo, niosomas). Muy preferiblemente, los lípidos incluyendo los liposomas llenos de gas están en el estado de gel a temperatura fisiológica. Los liposomas pueden estar entrecruzados o polimerizados y pueden soportar polímeros, como polietilen glicol, en sus superficies. Los ligandos específicos dirigidos a células endoteliales se unen a la superficie de los liposomas llenos de gas. Un ligando específico es una sustancia que se une a una vesícula y dirige la vesícula a un tipo particular de célula, tal como, aunque sin limitación, tejido y/o células endoteliales. El ligando específico puede unirse a la vesícula por enlaces covalentes o no covalentes. Los liposomas también se pueden denominar aquí vesículas de lípido. Muy preferiblemente, los liposomas carecen sustancialmente de agua en su interior.

"Micela" se refiere a entidades coloidales que se forman a partir de compuestos lipídicos cuando la concentración de los compuestos lipídicos, tal como sulfato de laurilo, es superior a una concentración crítica. Puesto que muchos de los compuestos que forman micelas también tienen propiedades surfactantes (es decir, capacidad de menor tensión superficial y dominios tanto hidrófilos como lipófilos - que atraen el agua y la grasa), estos mismos materiales también se pueden usar para estabilizar burbujas. Estos materiales micelulares prefieren adoptar en general una monocapa o configuración hexagonal de fase H2, aunque también pueden adoptar una configuración bicapa. Cuando se utilice un material micelular para formar una vesícula llena de gas, los compuestos adoptarán en general una configuración radial con los radicales alifáticos (lipófilos) orientados hacia la vesícula y los dominios hidrófilos orientados en dirección contraria a la superficie de la vesícula. Para dirigirlos a células endoteliales, los ligandos específicos se pueden unir a los compuestos micelulares o a materiales anfipáticos mezclados con los compuestos micelulares. Alternativamente, los ligandos específicos pueden ser absorbidos a la superficie de los materiales micelulares estabilizando las vesículas.

Se emplea una fase gas encima de la fase de suspensión acuosa 34 en la porción restante o espacio superior 32 del recipiente 9. La introducción de la fase gas se puede realizar purgando el recipiente 9 con un gas, si se ha de utilizar un gas distinto de aire para la fase gas, de manera que el gas ocupe el espacio superior 32 encima de la suspensión acuosa 34. Así, antes de la agitación, el recipiente 9 contiene una fase de suspensión acuosa y una fase gaseosa. El recipiente 9 se instala después en el brazo agitador 7 del dispositivo agitador 1 de la presente invención, del que se muestra una realización preferida en las figuras 2, 3 y 6-11, y se agita durante un período de tiempo suficiente para formar las vesículas deseadas.

Aunque se puede usar filtros para refinar más la distribución de tamaño de las vesículas después de la agitación, la presente invención se centra en el control de los parámetros de agitación para producir vesículas de tamaño óptimo antes de cualquier filtración después de la agitación. Para ello, los autores de la presente invención han hallado que el tamaño de las vesículas producidas por agitación es primariamente una función de cuatro variables:

(i)

la composición de la fase de suspensión acuosa,

(ii)

la composición de la fase gas en el espacio superior,

(iii)

el volumen del recipiente y el volumen relativo del espacio superior ocupado inicialmente por la fase gaseosa, y

(iv)

la definición de los parámetros de agitación primarios, es decir, la forma del recorrido que sigue el recipiente durante la agitación, la amplitud del movimiento de agitación, y la duración y frecuencia de la agitación.

Según el método de la presente invención, cada una de estas variables se deberá ajustar en un proceso para hacer vesículas para obtener una distribución de tamaño de vesícula y concentración deseables, siendo una distribución de tamaño de vesícula preferible aquella en la que las vesículas tienen un tamaño medio de al menos aproximadamente 0,5 \mum y en la que al menos 95% de las vesículas, y más preferiblemente al menos 99% de las vesículas, tienen un diámetro inferior a 10 \mum, y la concentración de vesículas producidas es al menos 100x10^{6} vesículas por ml y, más preferiblemente, al menos 500x10^{6} vesículas por ml. En consecuencia, en las secciones I-IV siguientes se explica individualmente cada una de estas cuatro variables. En la sección V se describe un aparato preferido para llevar a la práctica el método de la presente invención. La Sección VI describe algunas aplicaciones de las vesículas hechas según la presente invención.

I. La composición de la fase de suspensión acuosa

Se puede emplear una amplia variedad de agentes de recubrimiento de burbuja en la fase de suspensión acuosa. Preferiblemente, los agentes de recubrimiento son lípidos. Los lípidos pueden estar saturados o insaturados, y pueden estar en forma lineal o ramificada, según se desee. Tales lípidos pueden incluir, por ejemplo, moléculas de ácidos grasos que contienen una amplia gama de átomos de carbono, preferiblemente entre aproximadamente 12 átomos de carbono y aproximadamente 22 átomos de carbono. También se puede emplear grupos hidrocarbono que constan de unidades isoprenoides, grupos prenilo, y/o radicales esterol (por ejemplo, colesterol, sulfato de colesterol, y sus análogos). Los lípidos también pueden llevar cadenas de polímeros, tal como los polímeros antipáticos polietilenglicol (PEG) o polivinilpirrolidona (PVP) o sus derivados (para marcación in vivo), o aminoácidos cargados, tal como polilisina o poliarginina (para la unión de un compuesto con carga negativa), o hidratos de carbono (para marcación in vivo), como se describe en la Patente de Estados Unidos número 4.310.505, o glicolípidos (para marcación in vivo), o anticuerpos y otros péptidos y proteínas (para marcación in vivo), etc, según se desee. Tales compuestos específicos o de unión se pueden añadir simplemente a la fase de suspensión acuosa del lípido o se pueden unir específicamente químicamente a los lípidos. Los lípidos también pueden ser lípidos aniónicos o catiónicos, si se desea, de manera que puedan ser capaces de unir otros compuestos, como productos farmacéuticos, material genético u otros agentes terapéuticos.

Los ejemplos de clases de lípidos adecuados y líquidos específicos adecuados incluyen: fosfatidilcolinas, como dioleoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), y distearoilfosfatidilcolina; fosfatidiletanolaminas, como dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dioleoilfosfatidiletanolamina y N-succinil-dioleoilfosfatidiletanolamina; fosfatidilserinas; fosfatidilgliceroles; esfingolípidos; glicolípidos, tal como gangliósido GM1; glucolípidos; sulfatidas; glicoesfingolípidos; ácidos fosfatídicos, tal como ácido dipalmatoilfosfatídico (DPPA); ácidos grasos palmíticos; ácidos grasos esteáricos; ácidos grasos araquidónicos, ácidos grasos láuricos; ácidos grasos mirísticos; ácidos grasos lauroleicos; ácidos grasos fisetéricos; ácidos grasos miristoleicos; ácidos grasos palmitoleicos; ácidos grasos petroselínicos; ácidos grasos oleicos; ácidos grasos isoláuricos; ácidos grasos isomirísticos; ácidos grasos isopalmíticos; ácidos grasos isoesteáricos; colesterol y derivados de colesterol, tal como hemisuccinato de colesterol, sulfato de colesterol, y colesterol-(4'-trimetilamonio)-butanoato; ésteres de ácidos grasos polioxietileno; alcoholes de ácidos grasos polioxietileno; ésteres de alcohol ácidos grasos polioxietileno; ésteres de ácidos grasos de sorbitán polioxietilado; oxiesterato de glucerol polietilen glicol; ricinooletato glucerol polietilen glicol; esteroles de semilla soja etoxilados; aceite de ricino etoxilado; polímeros de ácidos grasos polooxietileno-polioxipropileno; estearatos de ácidos grasos polioxietileno; ácido 12-(((7'-dietilaminocumarin-3-il)-carbonil)-metilamino)-octadecanoico; ácido N-[12-(((7'-dietilamino-cumarin-3-il)-carbonil)-metil-amino)octadecanoil]-2-amino-palmítico; 1,2-dioleoil-sn-glicerol; 1,2-dipalmitoil-sn-3-succinil-glicerol; 1,3-dipalmitoil-2-succinil-glicerol; y 1-hexadecil-2-palmitoil-glicerofosfoetanolamina y palmitoilhomocisteína; bromuro de lauriltrimetilamonio (lauril- = dodecil-); bromuro de cetiltrimetilamonio (cetril- = hexadecil-); bromuro de miristiltrimetilamonio (miristil- = tetradecil-); cloruros de alquildimetilbencilamonio, tal como donde el alquilo es un alquilo de C_{12}, C_{14} o C_{16}; bromuro de bencildimetildodecilamonio; cloruro de bencildimetildodecilamonio, bromuro de bencildimetilhexadecilamonio; cloruro de bencildimetilhexadecilamonio; bromuro de bencildimetiltetradecilamonio; cloruro de bencildimetiltetradecilamonio; bromuro de cetildimetiletilamonio; cloruro de cetildimetiletilamonio; bromuro de cetilpiridinio; cloruro de cetilpiridinio; cloruro de N-[1-2-dioleoiloxi)-propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA); 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilammonio) ropano (DOTAP); y 1,2-dioleoil-e-(4'-trimetilammonio)-butanoil-sn-glicerol (DOTB).

Como será evidente a los expertos en la materia, con el conocimiento de las descripciones presentes, la lista anterior de lípidos es ejemplar solamente, y se puede emplear otros lípidos útiles, ácidos grasos y derivados y sus combinaciones, y también se pretende que tales compuestos adicionales caigan dentro del alcance del término lípido, en el sentido en que se usa aquí. Como reconocerán los expertos, tales lípidos y/o sus combinaciones pueden formar, al agitar el recipiente, liposomas (es decir, esferas de lípidos con un vacío interno) que atrapan gas de la fase gaseosa en su vacío interno. Los liposomas pueden estar compuestos de una sola capa de lípido (una monocapa de lípido), dos capas de lípidos (una bicapa de lípidos) o más de dos capas de lípidos (una capa múltiple de lípidos).

En general, se prefiere que los lípidos permanezcan en el gel estado, es decir, por debajo del estado de la temperatura de transición de fase del estado de gel al estado cristalino líquido (T_{m}) del material lípido, en particular durante la agitación. Las temperaturas de transición de fase del estado de gel al estado cristalino líquido de varios lípidos son conocidas. Tales temperaturas también se pueden calcular fácilmente usando técnicas bien conocidas. La Tabla 1 siguiente, tomada de Derek Marsh, "CRC Handbook of Lipid Bilayers", página 139, CRC Press, Boca Raton,

\hbox{Florida}

(1990), muestra, por ejemplo, las temperaturas de transición de fase de cadena principal para varios lípidos de fosfocolina saturados representativos. TABLA 1 Diacil-sn-glicero-(3)-fosfocolinas saturadas: temperaturas de transición de cadena principal

Nº de carbonos en cadenas de acilo	Temperatura de transición de fase principal ºC
1,2-(12:0)	-1,0
1,2-(13:0)	13,7
1,2-(14:0)	23,5
1,2-(15:0)	34,5
1,2-(16:0)	41,4
1,2-(17:0)	48,2
1,2-(18:0)	55,1
1,2-(19:0)	61,8
1,2-(20:0)	64,5
1,2-(21:0)	71,1
1,2-(22:0)	74,0
1,2-(23:0)	79,5
1,2-(24:0)	80,1

En una realización preferida de la invención, la fase acuosa del lípido incluye además un polímero, preferiblemente un polímero antipático, y preferiblemente uno que esté directamente unido (es decir, unido químicamente) al lípido. Preferiblemente, el polímero anfipático es polietilen glicol o su derivado. La combinación más preferida es el lípido dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE) unido a polietilen glicol (PEG), especialmente PEG de un peso molecular medio de aproximadamente 5000 (DPPE-PEG5000). El PEG u otro polímero puede unirse a DPPE u otro lípido mediante un enlace covalente, tal como mediante una amida, carbamato o enlace de amina. Alternativamente, se puede usar enlaces de éster, éter, tioéster, tioamida o disulfuro (tioéster) con el PEG u otro polímero para unir el polímero, por ejemplo, a colesterol u otros fosfolípidos. Una combinación de lípidos especialmente preferida es DPPC, DPPE-PEG5000 y DPPA, especialmente en una relación de aproximadamente 82%:8%:10% (mol %), DPPC:DPPE-PEG5000:DPPA.

Otros agentes de recubrimiento que se puede emplear alternativamente, o además, en la fase de suspensión acuosa incluyen polímeros tal como proteínas, hidratos de carbono naturales y seminaturales y polímeros sintéticos. Se podría usar en la invención varias proteínas diferentes para producir las vesículas llenas de gas. Tales proteínas incluyen albúmina de origen natural (humano y animal) y recombinante, fibrina, colágeno, anticuerpos y elastina. Los polisacáridos naturales incluyen almidón, celulosa, ácido algínico, pectina, dextrano, heparina y ácido hialurónico. Los polisacáridos seminaturales incluyen metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa y almidón de hidroxietilo. Los polímeros sintéticos incluyen polivinilpirrolidona, copolímeros de etileno y propilen glicol (por ejemplo Pluronic F-68 y los otros Pluronics), polietilenglicol, alcohol polivinílico, ácido poliláctico, copolímeros de ácidos láctico y glicólico, polimetacrilato y polímeros de éster doble. También se puede usar en la invención medios inorgánicos tal como hidroxiapatita y pirofosfato de calcio. En todos estos casos los agentes de recubrimiento de burbuja se suspenden en la fase acuosa en un recipiente con una carga superior del gas preseleccionado y después se agitan. Esto da lugar a la formación de las vesículas recubiertas estabilizadas. Como reconocerán los expertos en la técnica, una vez que conocen la descripción de esta invención, se puede usar una amplia variedad de diferentes agentes estabilizantes para hacer vesículas según los principios de la invención.

En un experimento con albúmina de suero humano, BRL-Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, se agitó durante 2 minutos a 2800 RPM un vial de vidrio de 10 ml conteniendo una solución de albúmina y un espacio superior de gas perfluropropano (vol. de líquido = 6 ml, 5 mg por ml solución de albúmina) con un Wig-L-Bug^{TM} para producir vesículas de perfluoropropano recubiertas de albúmina que tienen un diámetro medio de 5 micras, con una concentración de 50 millones de partículas por ml.

Además, el uso de la invención es compatible con varios agentes de suspensión y/o viscosidad. La expresión agente de suspensión, en el sentido en que se usa aquí, denota un compuesto que asiste al proporcionar uniformidad u homogeneidad relativas al medio de contraste. Varios de tales agentes están disponibles, incluyendo goma de xantano, acacia, agar, ácido algínico, monoestearato de aluminio, basorina, caraya, goma arábiga, bentonita sin purificar, bentonita purificada, magma de bentonita, carbómero 934P, carboximetilcelulosa de calcio, carboximetilcelulosa de sodio, carboximetilcelulosa de sodio 12, carrageenina, celulosa (microcristalina), dextrano, gelatina, goma guar, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, silicato de aluminio y magnesio, metilcelulosa, pectina, caseína, gelatina, óxido de polietileno, alcohol polivinílico, povidona, propilen glicol, alginato, dióxido de silicio, dióxido de silicio coloidal, alginato de sodio y otros alginatos, y tragacanto. Como reconocerán los expertos en la materia, se puede emplear rangos amplios de agente de suspensión en el medio de contraste de la invención, cuando sea necesario o se desee.

Las concentraciones de estos agentes variarán dependiendo de los medios estabilizantes de burbujas que se seleccionen, y los parámetros de agitación también pueden variar dependiendo de los materiales empleados. Los lípidos, a causa de su biocompatibilidad, baja toxicidad, disponibilidad como materiales puros y de calidad farmacéutica son los agentes de recubrimiento de burbuja preferidos para hacer las vesículas llenas de gas de esta invención.

Para preparar la fase acuosa, se puede combinar los lípidos, u otro agente de recubrimiento, con agua (preferiblemente agua destilada), solución salina normal (fisiológica), solución salina fosfato tamponada, u otra solución de base acuosa, como será evidente a los expertos en la materia.

Como reconocerán los expertos en la técnica, una vez que se conoce lo esencial de la presente descripción, se puede emplear varios aditivos en la fase de suspensión acuosa de la invención para estabilizar dicha fase, o para estabilizar las vesículas llenas de gas al agitar. Si se desea, estos aditivos se pueden añadir a la fase de suspensión acuosa antes de la agitación, o se pueden añadir a la composición después de la agitación y preparación resultante de las vesículas llenas de gas. El uso de tales aditivos dependerá, naturalmente, de la aplicación especial de las vesículas llenas de gas resultantes, como será fácilmente evidente a los expertos en la materia.

Varios agentes estabilizantes que se puede emplear en la presente invención están disponibles, incluyendo goma de xantano, acacia, agar, agarosa, ácido algínico, alginato, alginato de sodio, carrageenina, dextrano, dextrina, gelatina, goma guar, tragacanto, semilla de algarroba, basorina, caraya, goma arábiga, pectina, caseína, bentonita, bentonita sin purificar, bentonita purificada, magma de bentonita, coloidal, celulosa, celulosa (microcristalina), metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa de calcio, carboximetilcelulosa de sodio, carboximetilcelulosa sodio 12, así como otras celulosas naturales o naturales modificadas, polisorbato, carbómero 934P, silicato de aluminio y magnesio, monoestearato de aluminio, óxido de polietileno, alcohol polivinílico, povidona, polietilen glicol, propilen glicol, polivinilpirrolidona, dióxido de silicio, dióxido de silicio coloidal.

Además, se puede utilizar compuestos tal como perfluorooctilbromuro (PFOB), perfluorooctilyoduro, perfluorotripropilamina, y perfluorotributilamina en la fase lípido como agentes estabilizantes. Los perfluorocarbonos con más de cinco átomos de carbono serán en general líquidos a temperatura corporal, y tales perfluorocarbonos también son altamente preferidos como agentes estabilizantes. Los perfluorcarbonos adecuados incluyen perfluorohexano, perfluoroheptano, perfluorooctano, perfluorodecalina, y perfluorododecalina. Además, también se puede usar líquidos perfluorados o lípidos parcialmente fluorados para contribuir a la estabilización. Como será evidente a los expertos en la materia, se puede usar una amplia variedad de análogos perfluorados y parcialmente fluorados de los lípidos descritos en la presente invención. A causa de su naturaleza hidrófoba relativa con respecto a los lípidos de hidrocarbono, tales lípidos perfluorados o parcialmente fluorados pueden proporcionar incluso ventajas en términos de estabilidad. Ejemplos de lípidos perfluorados o parcialmente fluorados son fosfatidicolina (PC) F_{6}C_{11} y F_{8}C_{5}PC. Tales análogos se describen, por ejemplo, en Santaella y otros, Federation of European Biochemical Societies (FEBS), Vol. 336, Nº 3, págs. 418-484 (1993).

También se puede usar una amplia variedad de aceites biocompatibles al objeto de facilitar la estabilización, tal como aceite de cacahuete, aceite de canola, aceite de oliva, aceite de cártamo, aceite de maíz, aceite de almendra, aceite de semilla de algodón, aceite pérsico, aceite de sésamo, aceite de soja, aceite mineral, aceite mineral ligero, oleato de etilo, alcohol miristílico, miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, octildodecanol, propilen glicol, glucerol, escualeno, o cualquier otro aceite comúnmente conocido como ingestible. Estos también pueden incluir lecitina, esfingomielina, colesterol, sulfato de colesterol, y triglicéridos.

La estabilización también se puede efectuar mediante la adición de una amplia variedad de modificadores de viscosidad (es decir, agentes modificadores de viscosidad), que pueden servir como agentes estabilizantes según la presente invención. Esta clase de compuestos incluyen, aunque sin limitación: 1) hidratos de carbono y sus derivados fosforilados y sulfonados; 2) poliéteres con rangos de peso molecular entre 400 y 8000; 3) di- y trihidroxi alcanos y sus polímeros en el rango de peso molecular entre 800 y 8000. También se puede usar liposomas en unión con agentes emulsionantes y/o solubilizantes que pueden constar de, aunque sin limitación, acacia, colesterol, dietanolamina, monoestearato de glicerilo, alcoholes de lanolina, lecitina, mono- y diglicéridos, monoetanolamina, ácido oleico, alcohol oleico, poloxámero, estearato de polioxietileno 50, aceite de ricino polioxil 35, éter oleico polioxil 10, éter cetostearílico de polioxil 200, estearato de polioxil 40, polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 80, propilen glicol diacetato, propilen glicol monostearato, sulfato de sodio y laurilo, estearato de sodio, monolaurato de sorbitán, monooleato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán, monoestearato de sorbitán, ácido esteárico, trolamina, cera emulsionante, Pluronic F61, Pluronic F64 y Pluronic F68.

Otros agentes que se puede añadir incluyen agentes de tonicidad tal como polialcoholes tal como glucerol, propilen glicol, alcohol polivinílico, polietilenglicol, glucosa, manitol, sorbitol, cloruro de sodio y análogos.

Si se desea, se puede incluir en la formulación agentes antibactericidas y/o conservantes. Tales agentes incluyen benzoato de sodio, todas las sales de amonio cuaternario, azida sódica, metilparabén, propilparabén, ácido sórbico, sorbato potásico, sorbato sódico, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, clorobutanol, ácido dehidroacético, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), monotioglicerol, benzoato potásico, metabisulfito potásico, sorbato potásico, bisulfito sódico, dióxido de azufre, y sales mercúricas orgánicas.

Si se desea, se puede utilizar un agente de osmolaridad para controlar la osmolaridad. Los materiales osmóticamente activos adecuados incluyen compuestos fisiológicamente compatibles como azúcares monosacáridos, azúcares disacáridos, alcoholes de azúcar, aminoácidos, y varios compuestos sintéticos. Los azúcares monosacáridos o alcoholes de azúcar adecuados incluyen, por ejemplo, eritrosa, treosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, glucosa, manosa, idosa, galactosa, talosa, trehalosa, ribulosa, fructosa, sorbitol, manitol, y sedoheptulosa, siendo los monosacáridos preferibles fructosa, manosa, xilosa, arabinosa, manitol y sorbitol. Los azúcares disacáridos adecuados incluyen, por ejemplo, lactosa, sacarosa, maltosa y celobiosa. Los aminoácidos adecuados incluyen, por ejemplo, glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina y histidina. Los compuestos sintéticos incluyen, por ejemplo, glucerol, propilen glicol, polipropilen glicol, etilen glicol, polietilen glicol y polivinilpirrolidona. Otros varios materiales osmóticamente activos adecuados son conocidos por los expertos en la materia, y se pretende que caigan dentro del alcance del término agente osmóticamente activo en el sentido en que se usa aquí.

También se puede añadir varios polímeros, tal como los explicados anteriormente, para varios efectos y usos diferentes. Como reconocerán los expertos en la materia, se puede emplear una amplia gama de cantidades de aditivo, tal como los agentes de suspensión descritos anteriormente, en la fase de suspensión acuosa de la invención, cuando sea necesario o se desee, dependiendo del uso final concreto. Tales aditivos pueden incluir en general de 0,01% por volumen a aproximadamente 95% por volumen de la formulación de agente de contraste resultante, aunque se puede emplear cantidades mayores o menores. A modo de guía general, un agente de suspensión está presente típicamente en una cantidad de al menos aproximadamente 0,5% por volumen, más preferiblemente al menos aproximadamente 1% por volumen, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 10% por volumen. En general, el agente de suspensión está presente típicamente en una cantidad de menos de aproximadamente 50% por volumen, más preferiblemente inferior a aproximadamente 40% por volumen, incluso más preferiblemente menos de aproximadamente 30% por volumen. Una cantidad típica de agente de suspensión podría ser aproximadamente 20% por volumen, por ejemplo. Además, típicamente, para lograr generalmente los rangos de osmolaridad preferidos, se emplea menos de aproximadamente 25 g/l, más preferiblemente menos de aproximadamente 20 g/l, incluso más preferiblemente menos de aproximadamente 15 g/l, y todavía más preferiblemente menos de aproximadamente 10 g/l de los materiales osmóticamente activos, y en algunos casos no se emplean materiales osmóticamente activos. Un rango más preferido de materiales osmóticamente activos es generalmente entre aproximadamente 0,002 g/l y aproximadamente 10 g/l. Estos y otros rangos adecuados de aditivos serán fácilmente evidentes a los expertos en la materia, una vez conocida la presente invención.

También se puede incorporar una amplia variedad de agentes terapéuticos y/o de diagnóstico en la fase de suspensión acuosa añadiendo simplemente a dicha fase los agentes terapéuticos o de diagnóstico deseados. Los agentes terapéuticos y de diagnóstico adecuados, y sus cantidades adecuadas, serán fácilmente evidentes a los expertos en la materia, una vez conocida la presente descripción. Estos agentes se pueden incorporar a o sobre membranas de lípido o encapsular en los liposomas resultantes.

Para mejorar más el efecto magnético de las vesículas llenas de gas resultantes para formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), por ejemplo, se puede añadir uno o varios agentes mejoradores de contraste MRI, tal como agentes mejoradores de contraste paramagnéticos o superparamagnéticos. Los agentes mejoradores de contraste MRI útiles incluyen iones paramagnéticos tal como metales de transición, incluyendo hierro (Fe^{+3}), cobre (Cu^{+2}), y manganeso (Mn^{+2}) y los lantánidos tal como gadolinio (Gd^{+3}) y disprosio (Dy^{+3}), nitróxidos, óxidos de hierro (Fe_{3}O_{4}), sulfuros de hierro y partículas paramagnéticas tal como hidroxiapatitas manganeso (Mn^{+2}) sustituidas. Además, agentes como cromo (Cr^{+3}), níquel (Ni^{+2}), cobalto (Co^{+2}) y europio (Eu^{+2}) son otros ejemplos de iones paramagnéticos que se puede usar. Se puede usar otros agentes mejoradores de contraste tal como radicales nitróxido o cualquier otro átomo que mantenga un espín de electrón no pareado con propiedades paramagnéticas. Idealmente, el agente mejorador de contraste se añade a la fase de suspensión acuosa antes de la agitación, y se diseña de tal manera que después de la agitación, el agente mejorador de contraste se incorpore en o sobre la superficie de las vesículas llenas de gas resultantes, aunque también es posible la adición después de la preparación de vesículas. Las vesículas llenas de gas resultantes pueden tener relajabilidad mejorada en gran medida, proporcionando un agente de contraste especialmente efectivo para formación de imágenes por resonancia magnética. A modo de ejemplo, se incorporará manganeso (Mn^{+2}) sobre los grupos de cabeza del lípido cuando se utilice fosfatidicolina o fosfatidilserina en la fase acuosa del lípido. Si se desea, los metales pueden ser quelados usando compuestos liposolubles como se muestra, por ejemplo, en Unger y otros, Patente de Estados Unidos número 5.312.617, cuya descripción se incorpora aquí a la presente memoria por referencia en su totalidad. Tales compuestos liposolubles son bastante útiles, porque se incorporarán fácilmente a la membrana de liposoma. Los óxidos de hierro y otras partículas deberán ser en general pequeños, preferiblemente de menos de aproximadamente 1 \mu, más preferiblemente de menos de aproximadamente 200 \mum, y muy preferiblemente de menos de 100 \mum, para lograr óptima incorporación a o sobre la superficie del liposoma. Para mejor incorporación, se puede usar óxidos de hierro recubiertos con compuestos alifáticos o lipófilos puesto que estos tenderán a incorporarse al recubrimiento del lípido de la superficie de la burbuja.

También está dentro del alcance de la presente invención que la fase de suspensión acuosa pueda contener un ingrediente para producir gelación, tal como un ingrediente que producirá gelación con polímeros lípidos y metales que no forman espontáneamente gel, o que mejorará la gelación. Se puede emplear agentes gelificantes tal como cationes metálicos polivalentes, azúcares y polialcoholes. Los cationes metálicos polivalentes ejemplares útiles como agentes gelificantes incluyen calcio, zinc, manganeso, hierro y magnesio. Los azúcares útiles incluyen monosacáridos tal como glucosa, galactosa, fructosa, arabinosa, alosa y altrosa, disacáridos tal como maltosa, sacarosa, celobiosa y lactosa, y polisacáridos como almidón. Preferiblemente, el azúcar es un azúcar simple, es decir, un monosacárido o un disacárido. Los agentes gelificantes de polialcohol útiles en la presente invención incluyen, por ejemplo, glicidol, inositol, manitol, sorbitol, pentaeritritol, galacitol y alcohol polivinílico. Muy preferiblemente, el agente gelificante empleado en la presente invención es sacarosa y/o calcio. Los agentes gelificantes concretos que se puede emplear en las varias formulaciones de la presente invención serán fácilmente evidentes a los expertos en la materia, una vez conocida la presente descripción.

Para estabilizar los lípidos se puede usar combinaciones de lípidos, por ejemplo ácido fosfatídico con sales de calcio o magnesio y polímeros como ácido algínico, ácido hialurónico o carboximetil celulosa. Se supone que los cationes divalentes forman puentes metálicos entre los lípidos y polímeros para estabilizar los liposomas llenos de gas dentro de los sistemas lípidos/poliméricos. Igualmente, se puede preparar suspensiones conteniendo mezclas de quitosán (o materiales a base de quitina), polilisina, polietilenimina y ácido algínico (o sus derivados) o ácido hialurónico.

Se ha descubierto que los materiales diferentes dentro de la fase acuosa pueden ser importantes al controlar el tamaño de las vesículas llenas de gas resultantes. La Tabla 2 muestra los tamaños de liposomas producidos agitando recipientes estériles llenos de una fase acuosa y un espacio superior de nitrógeno. En todos los casos, el tamaño del liposoma se midió con un determinador del tamaño de partícula por oscurecimiento de luz Particle Sizing System Model 770 (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA). Como revelan los datos, la relación de lípidos en la fase acuosa afecta a la distribución de tamaño de los liposomas llenos de gas resultantes. Específicamente, la Tabla 2 siguiente muestra el efecto de la composición de lípido en el tamaño medio del liposoma.

TABLA 2 Efecto de la composición de lípidos en el tamaño medio del liposoma

Composición del lípido*	Tamaño medio del liposoma
77,5:15:7,5	5,26 \mum
77,5:20:2,5	7,33 \mum
82:10:8	6,02 \mum
* Relaciones de dipalmitoilfosfatidilcolina:ácido dipalmitoilfosfatídico:
dipalmitoilfosfatidiletanolamina-PEG5000, en mol %.

La Tabla 3 demuestra la dependencia de la concentración de una mezcla de composición de lípidos definida en el tamaño medio del liposoma. Como se expone en la Tabla 3, las variaciones de las concentraciones totales de lípido también son importantes para que el tamaño del liposoma después de la agitación quede afectado. En estos experimentos se mantuvo constante la relación de los tres componentes lípidos diferentes y se varió la concentración de lípido entre 0,5 y 5,0 mg ml^{-1} en la fase acuosa. El gas usado era nitrógeno. Las vesículas de tamaño óptimo para diagnóstico por ultrasonidos con un espacio superior de perfluorobutano se produjeron cuando la concentración de lípido en la fase acuosa era 1,0 mg ml^{-1}.

TABLA 3 Efecto de la concentración de lípido en el tamaño medio del liposoma

Concentración de lípido*	Tamaño medio del liposoma
1 mg ml^{-1}	1,8 \mum
3 mg m1^{-1}	4,0 \mum
5 mg ml^{-1}	7,2 \mum
* La concentración de lípido para todas las muestras se basó en una relación molar de di-
palmitoilfosfatidilcolina: ácido dipalmitoilfosfatídico: dipalmitoilfosfatidiletanolamina-
PEG500D de 82:10:8. El gas usado era nitrógeno.

El tamaño de vesículas también puede depender de la concentración de medios estabilizantes, por ejemplo lípidos. Por ejemplo se ha descubierto que una concentración de lípido de 1,0 mg ml^{-1} produce liposomas llenos de gas de aproximadamente el mismo diámetro cuando se utiliza nitrógeno que la concentración de lípidos de 5,0 mg ml^{-1} con perfluorobutano. Sin embargo, se ha hallado que la concentración más alta puede dar lugar a una distribución un poco más sesgada hacia los liposomas llenos de gas más grandes. Este fenómeno tiende a reflejar la estabilidad incrementada de los liposomas llenos de gas a una concentración de lípido más alta. Se considera, por lo tanto, que la concentración más alta de lípido contribuye a la estabilidad actuando como un agente estabilizante en la fase acuosa o la concentración de lípido más alta proporciona más lamelas alrededor del gas, haciéndolas más estables, y permitiendo así que persista un mayor proporción de los liposomas más grandes.

También se cree que la tensión superficial en la interface de vesículas llenas de gas y el medio acuoso es un factor determinante adicional del tamaño último de la vesícula llena de gas, cuando se toma cuenta junto con las otras variables.

II. La composición de la fase gaseosa

Se puede emplear una amplia variedad de gases diferentes en la fase gaseosa de la presente invención. Preferiblemente, los gases son sustancialmente insolubles en la fase de suspensión acuosa. Por sustancialmente insoluble se entiende que el gas mantiene una solubilidad en agua a 20ºC y 1 atmósfera de presión igual o inferior a aproximadamente 18 ml de gas por kg de agua. Como tales, los gases sustancialmente insolubles tienen una solubilidad inferior a la solubilidad del gas nitrógeno. Preferiblemente, la solubilidad es igual o inferior a aproximadamente 15 ml de gas por kg de agua, más preferiblemente igual o inferior a aproximadamente 10 ml de gas por kg de agua, a 20ºC y 1 atmósfera de presión. En una clase preferible de gases, la solubilidad es entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 18 ml de gas por kg de agua, o entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 15 ml de gas por kg de agua, o entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 ml de gas por kg de agua, o entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8 ml de gas por kg de agua, o entre aproximadamente 2 y 6 ml por kg de agua, a dicha temperatura y presión. Los gases de perfluorocarbonos y el gas hexafluoruro de azufre fluorado son, por ejemplo, menos solubles que 10 ml de gas por kg de agua, a 20ºC y 1 atmósfera de presión, y por ello se prefieren. Los gases que no son sustancialmente insolubles, definidos en la presente memoria, se denominan gases solubles.

Otros gases sustancialmente insolubles o solubles adecuados incluyen, aunque sin limitación, hexafluoroacetona, isopropilacetileno, aleno, tetrafluoroaleno, trifluoruro de boro, 1,2-butadieno, 1,3-butadieno, 1,2,3-triclorobutadieno, 2-fluoro-1,3-butadieno, 2-metil-1,3-butadieno, hexafluoro-1,3-butadieno, butadiíno, 1-fluorobutano, 2-metilbutano, decafluorobutano (perfluorobutano), decafluoroisobutano (perfluoroisobutano), 1-buteno, 2-buteno, 2-metil-buteno, 3-metil-1-buteno, perfluoro-1-buteno, perfluoro-1-buteno, perfluoro-2-buteno, 4-fenil-3-buteno-2-ona, 2-metil-1-buteno-3-ino, nitrato de butilo, 1-butino, 2-butino, 2-cloro-1,1,1,4,4-hexafluoro-butino, 3-metil-1-butino, perfluoro-2-butino, 2-bromo-butiraldehído, carbonil sulfuro, crotononitrilo, ciclobutano, metilciclobutano, octafluorociclobutano (perfluorociclobutano), perfluoroisobutano, 3-clorociclopenteno, ciclopropano, 1,2-dimetilciclopropano, 1,1-dimetilciclopropano, etil ciclopropano, metilciclopropano, diacetileno, 3-etil-3-metildiaziridina, 1,1,1-trifluorodiazoetano, dimetilamina, hexafluorodimetilamina, dimetiletilamina, bis-(dimetil fosfina)amina, 2,3-dimetil-2-norbornano, perfluoro-dimetilamina, cloruro de dimetiloxonio, 1,3-dioxolano-2-on, 1,1,1,1,2-tetrafluoroetano, 1,1,1-trifluoroetano, 1,1,2,2-tetrafluoroetano, 1,1,2-tricloro-1,2,2-trifluoroetano, 1,1-dicloroetano, 1,1-dicloro-1,2,2,2-tetrafluoroetano, 1,2-difluoroetano, 1-cloro-1,1,2,2,2-pentafluoroetano, 2-cloro-1,1-difluoroetano, 1-cloro-1,1,2,2-tetrafluoro-etano, 2-cloro-1,1-difluoroetano, cloroetano, cloropentafluoroetano, diclorotrifluoroetano, fluoroetano, nitropentafluoroetano, nitrosopentafluoro-etano, perfluoroetano, perfluoroetilamina, etil vinil éter, 1,1-dicloroetileno, 1,1-dicloro-1,2-difluoro-etileno, 1,2-difluoroetileno, metano, metano-sulfonil-cloruro-trifluoro, metano-sulfonil-fluoruro-trifluoro, metano-(pentafluorotio)trifluoro, metano-bromo-difluoro-nitroso, metano-bromo-fluoro, metano-bromo-cloro-fluoro, metano-bromo-trifluoro, metano-cloro-difluoro-nitro, metano-cloro-dinitro, metano-cloro-fluoro, metano-cloro-trifluoro, metano-cloro-difluoro, metano-dibromo-difluoro, metano-dicloro-difluoro, metano-dicloro-fluoro, metano-difluoro, metano-difluoro-yodo, metano-disilano, metano-fluoro, metano-yodometano-yodo-trifluoro, metano-nitrotrifluoro, metano-nitroso-trifluoro, metano-tetrafluoro, metano-tricloro-fluoro, metano-trifluoro, metanosulfenilcloruro-trifluoro, 2-metil butano, metilo éter, metil isopropil éter, lactato de metilo, nitrito de metilo, sulfuro de metilo, metil vinil éter, neopentano, nitrógeno (N_{2}), óxido nitroso, ácido 1,2,3-nonadecanotricarboxílico-2-hidroxitrimetiléster, 1-noneno-3-ino, oxígeno (O_{2}), oxígeno 17 (^{17}O_{2}), 1,4-pentadieno, n-pentano, dodecafluoropentano (perfluoropentano), tetradecafluorohexano (perfluorohexano), perfluoroisopentano, perfluoroneopentano, 2-pentanona-4-amino-4-metil, 1-penteno, 2-penteno {cis}, 2-penteno {trans}, 1-penteno-3-bromo, 1-penteno-perfluoro, ácido ftálico-tetracloro, piperidino-2,3,6-trimetil, propano, propano-1,1,1,2,2,3-hexafluoro, propano-1,2-epoxi, propano-2,2 difluoro, propano-2-amino, propano-2-cloro, propano-heptafluoro-1-nitro, propano-heptafluoro-1-nitroso, perfluoropropano, propeno, propil-1,1,1,2,3,3-hexafluoro-2,3-dicloro, propileno-1-cloro, propileno-cloro-{trans}, propileno-2-cloro, propileno-3-fluoro, propileno-perfluoro, propino, propino-3,3,3-trifluoro, estireno-3-fluoro, hexafluoruro de azufre, azufre (di)-decafluoro (S_{2}F_{10}), tolueno-2,4-diamino, trifluoroacetonitrilo, trifluorometil peróxido, trifluorometil sulfuro, tungsteno hexafluoruro, vinil acetileno, vinil éter, neón, helio, criptón, xenón (especialmente gas xenón hiperpolarizado enriquecido con rubidio), dióxido de carbono, helio y aire. Se prefieren los gases fluorados (es decir, un gas conteniendo una o varias moléculas de flúor, tal como hexafluoruro de azufre), gases de fluorocarbono (es decir, un gas fluorado que es un carbono o gas fluorado), y gases de perfluorocarbono (es decir, un gas de fluorocarbono completamente fluorado, tal como perfluoropropano y perfluorbutano).

Aunque se puede emplear teóricamente virtualmente cualquier gas en la fase gaseosa de la presente invención, se puede elegir un gas particular para optimizar las propiedades deseadas del medio de contraste resultante y adaptarlo a la aplicación de diagnóstico particular. Se ha hallado, por ejemplo, que algunos gases hacen vesículas llenas de gas más estables en agitación que otros gases, y tales gases se prefieren. También se ha hallado que algunos gases proporcionan mejores resultados de formación de imágenes en formación de imágenes de diagnóstico tal como ultrasonidos o MRI.

Como ejemplo de incrementar la estabilidad de las vesículas llenas de gas, se ha hallado que dióxido de carbono < oxígeno < aire < nitrógeno < neón = helio < gases de perfluorocarbono. Por estas y otras razones se prefieren los gases fluorados, en particular los gases de perfluorocarbono.

Además, aunque en algunos casos los gases solubles funcionarán adecuadamente como la fase gaseosa en la presente invención, los gases sustancialmente insolubles tienden a dar lugar a una mayor estabilidad que los gases con solubilidad más alta, en particular después de crear el agente de contraste a la agitación. Además, con tales gases insolubles será más fácil mantener una fase gaseosa sustancialmente separada de la fase de suspensión acuosa antes de la agitación, según la presente invención. Así, se prefieren los gases sustancialmente insolubles, como se ha definido antes.

La calidad de las imágenes por ultrasonido y la duración de tales imágenes también están correlacionadas con la solubilidad del gas en el medio acuoso. La disminución de solubilidad del gas, en general, ofrece una imagen de mejor resolución y duración más larga en ultrasonido.

Además, se ha observado en general que el tamaño de unas vesículas llenas de gas producidas por agitación está correlacionado con la solubilidad del gas en el medio acuoso, dando lugar los gases de mayor solubilidad a vesículas llenas de gas más grandes.

También se cree que el tamaño de las vesículas puede estar influenciado por la interacción del gas con la pared interior de las vesículas. Específicamente, se estima que la interacción en la interface afecta a la tensión y, en consecuencia, la fuerza hacia fuera del gas interior en la pared interior de la vesícula. Una disminución de la tensión permite vesículas más pequeñas disminuyendo la fuerza ejercida por el gas interior, permitiendo así que la fuerza ejercida en el exterior de la vesícula por el medio acuoso contraiga la vesícula llena de gas.

La solubilidad de los gases en solventes acuosos se puede estimar utilizando la Ley de Henry, puesto que es aplicable en general a presiones de hasta aproximadamente 1 atmósfera y para gases que son ligeramente solubles (Daniels, F. y Alberty, R. A., Physical Chemistry, 3ª edición, Wiley & Sons, Inc., New York, 1966). Por ejemplo, el oxígeno tiene una solubilidad de 31,6 ml por kg de agua a 25ºC, el aire atmosférico posee una solubilidad de 21,36 ml en 1 kg de agua a 25ºC, el nitrógeno mantiene una solubilidad de aproximadamente 18,8 ml kg-1 a 25ºC. Por otra parte, el hexafluoruro de azufre tiene una solubilidad de aproximadamente 5,4 ml kg^{-1} a 25ºC.

En resumen, los gases fluorados, gases de fluorocarbono, y gases de perfluorocarbono se prefieren por razones de estabilidad, insolubilidad, y tamaño de vesícula resultante. Especialmente preferidos son el gas hexafluoruro de azufre fluorado, y los gases de perfluorocarbono perfluoropropano, perfluorobutano, perfluorociclobutano, perfluorometano, perfluoroetano, y perfluoropentano, especialmente perfluoropropano y perfluorobutano.

Se deberá observar que los perfluorocarbonos que tienen menos de cinco átomos de carbono son gases a temperatura ambiente. El perfluoropentano, por ejemplo, es un líquido hasta aproximadamente 27ºC. Por encima de esta temperatura ocupará el espacio superior del recipiente. Se ha demostrado, sin embargo, que el perfluoropentano también se puede usar para llenar el espacio superior (es decir, el espacio del vial situado encima de la fase de suspensión de lípido) incluso a temperatura ambiente. Seleccionando un valor definido de perfluoropentano líquido calculado para llenar el espacio superior y añadiendo el líquido al recipiente a baja temperatura, por ejemplo, -20ºC, y rarificando después el recipiente (quitando efectivamente el espacio superior de aire) y sellando después el recipiente, el perfluoropentano experimentará una transición de la fase líquido a la fase vapor a una temperatura menor que su punto de ebullición a 1 atmósfera. Así, a temperatura ambiente ocupará parte o todo el espacio superior con gas. Como reconocerán los expertos en la materia, se puede estimar la disminución de la temperatura de transición de fase líquido a fase vapor utilizando una estimación empírica común. Específicamente, por cada disminución de la presión a la mitad, la temperatura de ebullición disminuirá aproximadamente 10ºC. Alternativamente, se puede calcular la disminución de temperatura en función de la disminución de la presión utilizando relaciones en base a la ley de los gases ideales en base a ley de Boyle. Otro método para llenar el espacio superior con perfluoropentano es rarificar primero el espacio superior y llenar después el espacio superior con gas perfluoropentano a más de 27ºC. Naturalmente, este método no se limita a perfluoropentano solo, sino que se aplica a todos gases de perfluorocarbono, así como gases en general, a condición de que se conozca el punto de ebullición del gas.

Si se desea, se puede usar dos o más gases diferentes juntos para llenar el espacio superior. Una mezcla de gases puede tener varias ventajas en una amplia variedad de aplicaciones de las vesículas llenas de gas resultantes (tal como aplicaciones en formación de imágenes por ultrasonido, formación de imágenes MR, etc). Se ha hallado que se puede mezclar una cantidad pequeña de un gas sustancialmente insoluble con un gas soluble para proporcionar mayor estabilidad de la que cabría esperar por la combinación. Por ejemplo, una cantidad pequeña de gas perfluorocarbono (en general al menos aproximadamente 1 mol %, por ejemplo) se puede mezclar con aire, nitrógeno, oxígeno, dióxido de carbono u otros gases más solubles. El agente de contraste de vesícula llena de gas resultante producido después de la agitación puede ser entonces más estable que el aire, nitrógeno, oxígeno, dióxido de carbono u otros gases más solubles solos.

Además, se puede usar una mezcla de gases para compensar el aumento de tamaño de vesículas llenas de gas que de otro modo se podría producir in vivo si se inyectasen in vivo vesículas de perfluorocarbono conteniendo gas. Se ha hallado que algunos gases de perfluorocarbono pueden tender a absorber o embeber otros gases tal como oxígeno. Así, si el gas perfluorocarbono se inyecta por vía intravenosa, puede tomar el oxígeno u otros gases solubles disueltos en la sangre circulante. Las vesículas resultantes pueden crecer entonces in vivo como resultado de esta toma. Conociendo este fenómeno, se puede premezclar entonces el gas perfluorocarbono con un gas soluble, tal como aire, nitrógeno, oxígeno, dióxido de carbono, saturando por lo tanto las propiedades de absorción o imbibición del perfluorocarbono. En consecuencia, esto retardaría o incluso eliminaría la posibilidad de expansión de las vesículas llenas de gas en la corriente sanguínea. Esto es significativo a la luz del hecho de que si una vesícula crece a un tamaño superior a 10 \mum, se pueden producir eventos embólicos potencialmente peligrosos si se administra en la corriente sanguínea. Rellenando el espacio superior con gases más solubles que el gas perfluorocarbono, junto con el gas perfluorocarbono, las vesículas llenas de gas no experimentarán en general este aumento de tamaño después de la inyección in vivo. Así, como resultado de la presente invención, el problema de eventos embólicos como resultado de la expansión de vesícula se puede resolver produciendo vesículas donde tal expansión se elimina o retarda suficientemente.

Así, según la presente invención, si se desea, se puede combinar un gas sustancialmente insoluble con un gas soluble para producir eficientemente vesículas llenas de gas altamente efectivas y estables.

Se pusieron múltiples muestras de soluciones de lípido (relaciones en % molar de 1 mg por ml; 82:10:8 de DPPC:DPPA:DPPE-PEG-5000) en relaciones de peso de 8:1:1 de salina normal: glicerol: propilen glicol en viales de 2 ml (tamaño real 3,7 ml)de Wheaton Industries (Millville, NJ) en un liofilizador Edwards Modelo S04 modificado con cuatro pies cúbicos de capacidad, y sometieron a presión reducida. Después se instiló a los espacios superiores de los viales, que formaban 60% del volumen total, 80% PFP con 20% aire, 60% PFP con 40% aire, 50% PFP con 50% aire, 20% PFP con 80% aire, o 100% aire. Los porcentajes de gas en los espacios superiores de las diferentes muestras se confirmaron por cromatografía de gases con un cromatógrafo de gas Hewlett Packard Modelo 1050L en interface con software Hewlett Packard Chem^{TM}. El modo de detección era detección por ionización de llama. Las muestras se agitaron después a 3.300 RPM durante 60 segundos usando un Wig-L-Bug^{TM} estándar modelo 3110B y los tamaños y recuentos de vesículas se determinaron por determinación óptica de partículas. Se utilizó un determinador óptico del tamaño de partículas (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA) para analizar el tamaño de vesículas llenas de gas y los recuentos totales. Se utilizó un volumen de muestra de 5 microlitros para cada análisis, usándose cuatro muestras para cada determinación. Los resultados se exponen en la Tabla 4.

Como se expone en la Tabla 4, incluso cuando solamente 20% del gas era PFP (un gas sustancialmente insoluble) y 80% del gas era aire (una mezcla de gases solubles), se produjeron 100 veces más vesículas que cuando se utilizó aire solo (0% PFP). Además, cuando se utilizó aire solo (0% PFP), las vesículas eran mucho menos estables y una fracción más grande era de más de 10 micras. Sin embargo, las vesículas de 20% PFP y 80% aire parecían tan estables como las vesículas de 80% PFP y 20% aire, así como las otras muestras de concentración PFP intermedias, y el 20% PFP con 80% aire produjo aproximadamente tantas vesículas llenas de gas como 80% PFP con 20% aire.

TABLA 4 Efecto del porcentaje de perfluoropropano en el tamaño y número de vesículas

1

En la Tabla 4, D. E. = Desviación estándar, y CV = Coeficiente de varianza. También en la Tabla 4, E+ denota un exponente a una cierta potencia, por ejemplo, 5,45E+05 = 5,45 x 10^{5}.

En resumen, se ha hallado que solamente se necesita una cantidad pequeña de un gas relativamente insoluble (tal como PFP) para estabilizar las vesículas, siendo la amplia mayoría del gas un gas soluble. Aunque la solubilidad efectiva de la combinación de dos o más gases, calculada por la fórmula siguiente:

(solubilidad gas A) x (mol por ciento gas A) + (solubilidad gas B) x (mol por ciento gas B)/100,

sólo puede ser ligeramente diferente de la solubilidad del gas soluble, todavía hay un alto recuento de vesículas llenas de gas y estabilidad de las vesículas llenas de gas añadiendo solamente una cantidad pequeña de gas insoluble.

Aun sin querer quedar vinculado por ninguna teoría operativa, se estima que el gas sustancialmente insoluble es importante para un efecto estabilizante de la membrana. En efecto, se estima que el gas sustancialmente insoluble (tal como PFP) hace de barrera contra la membrana de lípido, formando posiblemente efectivamente una capa en la superficie interior de la membrana, que retarda la salida del gas soluble (tal como aire, nitrógeno, etc). Este descubrimiento es sorprendente y útil, puesto que esto permite utilizar solamente una cantidad pequeña del gas sustancialmente insoluble (por ejemplo, un perfluorocarbono u otro gas fluorado) y primariamente un gas más biocompatible (menos potencialmente tóxico), tal como aire o nitrógeno, para formar la mayor parte del volumen de la vesícula.

La cantidad de gases sustancialmente insolubles y gases solubles en cualquier mezcla puede variar ampliamente, como reconocerán los expertos en la técnica. Típicamente, sin embargo, al menos aproximadamente 0,01% de la cantidad total del gas es un gas sustancialmente insoluble, más preferiblemente al menos aproximadamente 0,1%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 1%, y muy preferiblemente al menos aproximadamente 10%. Los rangos adecuados de gas sustancialmente insoluble varían dependiendo de varios factores, como el gas soluble a emplear adicionalmente, el tipo de lípido, la aplicación especial, etc. Los rangos ejemplares incluyen entre aproximadamente 0,01% y aproximadamente 99% de gas sustancialmente insoluble, preferiblemente entre aproximadamente 1% y aproximadamente 95%, más preferiblemente entre aproximadamente 10% y aproximadamente 90%, y muy preferiblemente entre aproximadamente 30% y aproximadamente 85%.

Para otros usos distintos de la formación de imágenes de diagnóstico por ultrasonido, tal como los usos en formación de imágenes de diagnóstico por resonancia magnética (MRI), se utilizan preferiblemente gases paramagnético, como el gas oxígeno 17 fuertemente paramagnético (^{17}O_{2}), neón, xenón, helio, argón (especialmente gas xenón hiperpolarizado enriquecido con rubidio), u oxígeno (que todavía es paramagnético, aunque menos fuertemente), por ejemplo, para llenar el espacio superior, aunque también se puede usar otros gases. Muy preferiblemente, gas ^{17}O_{2}, neón, gas xenón hiperpolarizado enriquecido con rubidio, o gas oxígeno se combina con un gas sustancialmente insoluble tal como, por ejemplo, un gas perfluorocarbono. Los gases paramagnéticos son conocidos en la técnica y los gases paramagnéticos adecuados serán fácilmente evidentes a los expertos en la materia. El gas más preferido para aplicaciones MRI, tanto si se usa solo como en combinación con otro gas, es ^{17}O_{2}.

Utilizando una combinación de gases, el gas ^{17}O_{2} u otro gas paramagnético proporciona el contraste óptimo y el perfluorocarbono estabiliza el gas ^{17}O_{2} dentro del gas atrapado después de la agitación. Sin la adición del gas perfluorocarbono, los gases, tal como ^{17}O_{2}, son generalmente mucho menos efectivos, puesto que a causa de su solubilidad se difunden del atrapamiento de lípido después de la inyección intravenosa. Además, el gas ^{17}O_{2} es bastante caro. Combinar el gas perfluorocarbono con gas ^{17}O_{2} aumenta en gran medida la eficacia del producto y disminuye el costo mediante un uso más eficiente del gas ^{17}O_{2} costoso. Igualmente, se puede mezclar otros gases con propiedades paramagnéticas deseables, como neón, con los gases de perfluorocarbono.

Como expone la Tabla 5 siguiente, se puede usar una amplia variedad de diferentes gases en una aplicación de formación de imágenes MR. En la Tabla 5 se muestran R2 (1/T2/mmol/l.seg^{-1}) para diferentes gases en vesículas llenas de gas. Como expone la Tabla 5, hay diferencias drásticas de la relajabilidad de las diferentes vesículas llenas de gas, indicando que cuanto más altos son los valores de relajación R2, más eficaces son las vesículas como agentes de formación de imágenes MR. De los gases mostrados, el aire tiene el valor R2 más alto. Se estima que el aire es el más alto a causa del efecto paramagnético del oxígeno en el aire. Sin embargo, el oxígeno puro es algo menos efectivo, debido probablemente a la solubilidad más alta del oxígeno y el equilibrio de oxígeno en el medio acuoso que rodea las vesículas. Con aire, el nitrógeno (el aire es aproximadamente 80% nitrógeno) contribuye a estabilizar el oxígeno dentro de las vesículas. El nitrógeno tiene mucha menos solubilidad en agua que el aire. Como se ha indicado anteriormente, se puede mezclar PFP u otros gases de perfluorocarbono con un gas más magnéticamente activo, como aire, oxígeno, ^{17}O_{2} o xenón hiperpolarizado enriquecido con rubidio. Al hacerlo, se puede preparar vesículas de gas magnéticamente activas altamente estables.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5 Distribución de tamaño y relajabilidad

2

El espacio superior del recipiente se puede llenar con el gas a presión ambiente, disminuida o incrementada, según se desee.

En el recipiente de la invención, la fase gaseosa está sustancialmente separada de la fase de suspensión acuosa. Por sustancialmente separada se entiende que menos de aproximadamente 50% del gas se combina con la fase de suspensión acuosa, antes de la agitación. Preferiblemente, menos de aproximadamente 40%, más preferiblemente menos de aproximadamente 30%, incluso más preferiblemente menos de aproximadamente 20%, y muy preferiblemente menos de aproximadamente 10% del gas se combina con la fase de suspensión acuosa. La fase gaseosa se mantiene sustancialmente separada de la fase de suspensión acuosa, hasta aproximadamente el tiempo de uso, tiempo en el que se agita el recipiente y se combinan la fase gaseosa y fase de suspensión acuosa para formar una suspensión acuosa de vesículas llenas de gas. De esta forma se produce un agente de contraste excelente para formación de imágenes por ultrasonido o resonancia magnética. Además, puesto que el agente de contraste se prepara inmediatamente antes del uso, se minimizan los problemas de estabilidad en almacenamiento.

III. Volumen y espacio superior del recipiente

Se ha descubierto que el tamaño del espacio superior de gas también se puede usar para afectar al tamaño de las vesículas llenas de gas. Puesto que un espacio superior más grande contiene proporcionalmente más gas con relación al tamaño de la fase acuosa, los espacios superiores grandes producirán en general vesículas más grandes que los espacios superiores de menores dimensiones. Por lo tanto, el espacio superior, expresado como porcentaje del volumen total del recipiente, no deberá exceder de un valor máximo. Además, un espacio superior demasiado pequeño no dejará espacio suficiente para que el fluido se mueva durante la agitación para formar vesículas eficientemente.

Por ejemplo, un descubrimiento de esta invención es que, al utilizar viales de 3,7 ml de volumen real (vidrio de borosilicato Wheaton 300, Wheaton Industries, Millville, NJ, denominado tamaño nominal de 2 ml, diámetro x altura = 15 mm x 32 mm), el volumen del espacio superior que contiene gas es preferiblemente de entre aproximadamente 10% y aproximadamente 60% del volumen total del vial. En general, el espacio superior que contiene gas en un vial es de entre aproximadamente 10% y aproximadamente 80% del volumen total de dicho vial, aunque, dependiendo de las circunstancias particulares y la aplicación deseada, puede ser apropiado más o menos gas. Más preferiblemente, el espacio superior incluye entre aproximadamente 30% y aproximadamente 70% del volumen total. En general, se ha hallado que el volumen más preferido del espacio superior conteniendo gas es de aproximadamente 60% del volumen total del recipiente.

IV. Valores óptimos de los parámetros de agitación A. Forma del recorrido de avance y amplitud de la agitación

Como se ha explicado anteriormente, además de las composiciones de las fases de suspensión acuosa y gaseosa, la forma específica en que se agite el recipiente que contiene dichas fases, afectará a la distribución del tamaño de vesícula. Las condiciones óptimas de agitación se pueden definir por referencia a cuatro parámetros: la forma del recorrido que sigue el recipiente durante la agitación, la amplitud del movimiento de agitación, la frecuencia de la agitación, y la duración de la agitación.

Se ha hallado que el recorrido seguido por el recipiente durante la agitación es especialmente significativo en la formación de vesículas del tamaño apropiado. En particular, se ha hallado que se puede producir vesículas pequeñas en una cantidad mínima de tiempo cuando la agitación toma la forma de movimiento alternativo. Otros tipos de agitación, tal como formación de torbellino, pueden producir también vesículas pequeñas. Sin embargo, la agitación alternativa reduce en gran medida la duración de la agitación necesaria para lograr una alta concentración de vesículas pequeñas.

Los inventores han hallado que se obtienen vesículas de pequeño tamaño en un período relativamente corto de tiempo, es decir, 2 minutos o menos, cuando la amplitud de la agitación, específicamente la longitud C del recorrido alternativo seguido por el recipiente durante la agitación, es al menos 0,3 cm. En general, cuanto mayor es la amplitud de la agitación, más pequeñas son las vesículas. Sin embargo, como se explica a continuación, la frecuencia de la agitación también es un parámetro importante. Puesto que las consideraciones prácticas asociadas con el equipo de agitación darán lugar típicamente a una caída de la frecuencia de agitación a niveles indeseablemente bajos cuando la amplitud de la agitación se incremente más allá una cierta cantidad máxima, la amplitud se mantendrá suficientemente baja para garantizar que la frecuencia de agitación siga siendo adecuada. Para el dispositivo agitador Wig-L-Bug^{TM} modelo 3110B, esta amplitud máxima es aproximadamente 2,5 cm.

Los autores de la invención también han hallado que es preferible que el movimiento alternativo se produzca a lo largo de un recorrido arqueado 20, como se representa en la figura 4, donde la amplitud del movimiento de agitación se designa C, puesto que de esta forma se realiza más fácilmente un movimiento de agitación de alta frecuencia. En la realización preferida de la invención, el recorrido arqueado 20 se define por un radio de curvatura L, formado por un brazo agitador de longitud L. Según la presente invención, el brazo agitador 7 tiene una longitud L de al menos 6 cm y gira un ángulo \theta de al menos 3º. Como se explica mejor a continuación, según la realización preferida de la invención, el ángulo de rotación del brazo agitador \theta se logra empleando un cojinete que tiene un ángulo de desviación igual a \theta. Además, la longitud L del brazo agitador se define como la distancia desde la línea central de un casquillo excéntrico 40 en el que está montado el cojinete 50 del brazo agitador 7, como se explica mejor a continuación, a la línea central del recipiente 9, como se representa en la figura 3.

El uso de mayores longitudes del brazo agitador L y mayores ángulos de rotación \theta incrementará la amplitud de la agitación y, por lo tanto, reducirá generalmente el tamaño de vesícula. Sin embargo, como se ha explicado anteriormente, los valores máximos para la longitud del brazo agitador L y el ángulo de rotación \theta empleados se deberán limitar para garantizar que la amplitud de agitación C no sea tan grande que dé lugar a una frecuencia de agitación inadecuada. Además, las consideraciones mecánicas también limitarán el tamaño del ángulo de rotación del brazo agitador 7. Para el Wig-L-Bug^{TM} modelo 3110B, la longitud máxima del brazo agitador y el ángulo de rotación que se deberán emplear son aproximadamente 15 cm y aproximadamente 9º, respectivamente.

Además, el dispositivo agitador superpone un movimiento alternativo en una segunda dirección perpendicular sobre el movimiento alternativo en la primera dirección. Preferiblemente, la amplitud de agitación en la segunda dirección C' es al menos aproximadamente una décima parte de la amplitud de agitación en la primera dirección C. A efectos de la descripción, la primera dirección de movimiento alternativo se denominará la dirección longitudinal y la segunda dirección de movimiento alternativo se denominará la dirección transversal.

Según la presente invención, la temporización de los movimientos en las direcciones longitudinal y transversal se ajusta de manera que la suma de los movimientos en las dos direcciones dé lugar a que el recipiente 9 se agite en una configuración en forma del número 8.

En base a lo anterior, el recorrido de agitación preferido 20 descrito por el recipiente 9 cuando está unido al extremo del brazo agitador 7 del dispositivo agitador 1 de la presente invención, se representa en las figuras 4 y 5. Como se representa en la figura 5, según la presente invención, el brazo agitador 7 imparte al recipiente 9 movimiento en la dirección transversal cuando se mueve hacia atrás y hacia adelante en la dirección longitudinal de tal forma que un punto en el recipiente 9 avance en una configuración 20 en forma del número 8. La longitud del 8 es la amplitud en la dirección longitudinal C y la anchura del 8 es la amplitud de la agitación en la dirección transversal C'. Según se ve desde el lado, como se representa en la figura 4, el recorrido es arqueado en la dirección longitudinal, específicamente, un arco que tiene un radio de curvatura igual a la longitud L del brazo agitador 7. La longitud del arco C es el producto de la longitud del brazo agitador L y el ángulo \theta abarcado por la rotación del brazo agitador en el plano longitudinal, expresado en radianes, es decir, C = L\theta.

Preferiblemente, la configuración en forma del número 8 consta de aproximadamente dos secciones rectas 21 que intersectan en un ángulo \Phi y dos secciones aproximadamente semicirculares 22. Como se explica mejor a continuación, en la realización preferida de la invención, el ángulo \Phi formado por la configuración en forma del número 8 es aproximadamente igual al ángulo de rotación del brazo agitador 7 en la dirección longitudinal \theta. Como se explica a continuación, esto se lleva a cabo aplicando al brazo agitador 7 desde un muelle 46 una fuerza suficiente para mantener el brazo agitador esencialmente en una orientación vertical en el plano transversal durante la agitación, como se representa en las figuras 9 y 10. Si la tensión del muelle se regula para permitir que el brazo agitador 7 gire un ángulo en el plano transversal \omega, como se representa en la figura 12, el ángulo \Phi de la configuración de agitación en forma de 8 experimentado por el recipiente 9 será mayor que \theta.

Si \Phi es igual a \theta, la distancia total D recorrida en un circuito alrededor del recorrido 20 será una función de dos variables: la longitud del brazo agitador L y el ángulo \theta descrito por el brazo agitador cuando avanza en el plano longitudinal. Esta distancia D se puede expresar de forma aproximada por la ecuación:

D = 2L [(2 \ sen \ \theta/2 \ + \ \Pi \ tan^{2} \ \theta/2)/(1 \ + \ tan \ \theta/2)]

Puesto que la longitud L es al menos 6 cm y el ángulo \theta es al menos 3º, la distancia D deberá ser al menos aproximadamente 0,6 cm.

Además, dado que \Phi = \theta, la amplitud de agitación en la dirección transversal C' será una función de la amplitud en la dirección longitudinal C y el ángulo \theta, y se puede aproximar por la ecuación:

C' = (2C \ tan \ \theta/2)/(1 \ + \ tan \ \theta/2)

Dado que, preferiblemente, la amplitud de la agitación en la dirección longitudinal C es al menos aproximadamente 0,3 cm y el ángulo \theta es al menos aproximadamente 3º, la amplitud en la dirección transversal C' deberá ser preferiblemente al menos aproximadamente 0,02 cm.

Los valores óptimos para la amplitud y forma del movimiento de agitación explicados anteriormente se alcanzan en base a una serie de pruebas, explicadas a continuación en la subsección C.

B. Frecuencia y duración de la agitación

Además de la forma y amplitud del movimiento de agitación, la frecuencia de la agitación también es un parámetro importante al formar vesículas del tamaño apropiado. La frecuencia de agitación se cuantifica en términos de las revoluciones por minuto ("RPM") que experimenta el brazo agitador 7 y se define como el número de veces que el brazo agitador y, por lo tanto, el recipiente 9 unido a él, atraviesa la totalidad del recorrido de agitación en un minuto. Así, en la realización preferida de la invención, agitar a una frecuencia de 3600 RPM significa que el recipiente 99 experimenta un movimiento de agitación alrededor del recorrido 20 en forma del número 8 tres mil seiscientas veces en un minuto, o sesenta veces en un segundo.

Se ha hallado que se puede hacer vesículas usando frecuencias de agitación del orden de 100 RPM a 10.000 RPM. Sin embargo, se ha hallado que hay una frecuencia de agitación mínima que dará lugar a la producción de vesículas de dimensiones óptimas dentro de un período relativamente corto de tiempo. Como se explica en la sección C siguiente, se ha hallado que esta frecuencia mínima es aproximadamente 2800 RPM. Aunque, en general, el aumento de la frecuencia de agitación reducirá el tamaño de vesícula, las limitaciones del dispositivo agitador impondrán típicamente la frecuencia máxima obtenible. Para el Wig-L-Bug^{TM}, la frecuencia máxima obtenible es aproximadamente 3300 RPM. Según la presente invención, la frecuencia está incluida entre 2800 y 10.000 RPM.

A frecuencias del orden de 2800 a 3300 RPM, la duración óptima de la agitación es al menos aproximadamente 60 segundos. Sin embargo, la duración óptima de la agitación se refiere a la frecuencia y puede ser más baja a frecuencias más altas. Así, por ejemplo, a 4500 RPM la duración óptima de la agitación es solamente 50 segundos.

C. Resultados de las pruebas

El valor óptimo para la frecuencia de agitación, así como la forma y amplitud del movimiento de agitación, se desarrollaron mediante una serie de pruebas, como se explica a continuación.

Se realizó una primera serie de pruebas para determinar el efecto de la frecuencia de agitación en el tamaño de vesícula. Se añadieron muestras de lípido de un mg ml^{-1} que constaban de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Ala), ácido dipalmitoilfosfatídico (DPPA) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Ala), y dipalmitoilfosfatidiletanolamina unida covalentemente a éter monometílico de polietilenglicol de peso molecular = 5000, (DPPE PEG-5000) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Ala), en una relación molar de 82 mol % : 10 mol % : 8 mol %, respectivamente, a un diluyente que constaba de salina normal, glucerol (Spectrum Chemical Co., Gardena, Calif.) y propilen glicol (Spectrum Chemical Co., Garden, Calif.), (8:1:1, v:v:v). Las muestras se calentaron después a 45ºC durante 10 minutos dejando después que se equilibrasen a temperatura ambiente (25ºC).

Después se añadieron las muestras a viales de borosilicato de 2,0 ml nominales (VWR Scientific, Boston, Mass.) del tipo representado en la figura 1 (volumen real 3,7 ml). Después se sellaron los viales con un tapón de caucho de butilo y cerraron con un adaptador estanco a los gases con un reborde de aluminio. El espacio superior de los viales era aproximadamente 60% de su volumen total. Después se purgaron las muestras con perfluoropropano (Flura Corporation, Nashville, Tenn.) y pusieron en el dispositivo agitador mostrado en la figura 3, que se explica mejor en la sección V.

Se agitaron los recipientes durante 2 minutos usando el movimiento del tipo de 8 representado en las figuras 4 y 5. La longitud del brazo agitador L era 7,7 cm y el ángulo de desviación del cojinete \theta y, por lo tanto, el ángulo de rotación del brazo agitador en el plano longitudinal, era 6º. Usando las relaciones explicadas anteriormente, se determinó que la amplitud de agitación en las direcciones longitudinal y transversal C y C' eran aproximadamente 0,8 cm y 0,1 cm, respectivamente. Se utilizaron frecuencias de agitación de 1500, 2800 y 3300 RPM, medidas con un tacómetro Pistol Grip Code-Palmer Modelo 08210 (Code-Palmer, Nile, Ill). El tamaño se determinó por clasificación óptica de partículas pequeñas en un determinador del tamaño de partícula por oscurecimiento de luz Particle Sizing System (Santa Barbara, Calif.).

La Tabla 6 muestra los resultados de estas pruebas y demuestra el efecto que la frecuencia de agitación tiene en el tamaño medio de vesícula resultante.

TABLA 6 Efecto de la frecuencia de agitación en el tamaño medio de vesícula

Frecuencia (RPM)	Tamaño medio de vesícula
1500	3,4 \mum
2800	3,3 \mum
3300	2,9 \mum

Como se puede ver, la agitación a una frecuencia superior a 2800 RPM reduce en gran medida el tamaño medio de vesícula obtenido después de 2 minutos de agitación.

Se realizó un segundo conjunto de pruebas para determinar el efecto del incremento de la longitud del brazo agitador L en el tamaño de vesícula, y, por lo tanto, la amplitud de la agitación en las direcciones longitudinal y transversal C y C', así como la distancia de agitación por ciclo D. Se realizaron las mismas pruebas que las explicadas anteriormente a excepción de que los recipientes se agitaron durante 60 segundos usando longitudes del brazo agitador L del rango de 6,7 a 14,8 cm.

Las variaciones de la longitud del brazo agitador dieron lugar a variaciones de la frecuencia de agitación en el rango de 2250 a 3260 RPM, disminuyendo la frecuencia de agitación a medida que aumentaba la longitud del brazo agitador. La variación de la frecuencia de agitación con la longitud del brazo agitador L y el ángulo de rotación del brazo agitador \theta se representa en la figura 13. Así, por ejemplo, cuando se utilizó una longitud del brazo agitador L de 6,7 cm y un ángulo de rotación \theta de 6º, la frecuencia de agitación era aproximadamente 3200 RPM, mientras que cuando la longitud del brazo agitador se incrementó a 13,8 cm, a la vez que se mantuvo el mismo ángulo de rotación, la frecuencia disminuyó a aproximadamente 2700 RPM.

Los resultados de esta serie de pruebas se representan en las figuras 14(a)-(c). Como se representa en la figura

\hbox{14(a),}

con un ángulo de rotación en el plano longitudinal \theta de 6º, al menos 98% de las vesículas son de menos de 10 micras siempre que la longitud del brazo agitador L sea 7,7 cm o mayor, es decir, cuando las amplitudes de agitación en la dirección longitudinal C son superiores a 0,8 cm. Además, el porcentaje de vesículas de menos de 10 \mum llega a una meseta de aproximadamente 99 a 99,5% a longitudes del brazo agitador L de 9,8 cm y más, es decir, cuando las amplitudes de agitación en la dirección longitudinal son 1,0 cm y más. El número de tamaño medio ponderado de las vesículas llega a una meseta de aproximadamente 2 \mum en estas mismas condiciones, como se representa en la

\hbox{figura 14(b).}

Aunque el efecto general de incrementar la frecuencia de agitación es reducir el tamaño de vesícula cuando todas las demás variables se mantienen constantes, como se ha explicado previamente y se expone en la Tabla 6, estos datos muestran que aumentar la amplitud de la agitación incrementando la longitud del brazo agitador reduce el tamaño de las vesículas incluso cuando tales aumentos se combinan con reducciones de la frecuencia de agitación, como se representa en la figura 13.

Como se representa en la figura 14(c), se obtuvieron más de 400x10^{6} vesículas por ml a todas las longitudes del brazo agitador y, de hecho, el uso de longitudes del brazo agitador del orden de aproximadamente 10 a 12 cm dio lugar a la producción de más de 1000x10^{6} vesículas por ml. Sin embargo, a medida que la longitud del brazo agitador se incrementa por encima de aproximadamente 12 cm, las partículas por ml comienzan a caer y llegan a 800x10^{6} vesículas por ml a 14,8 cm. Aunque no se muestra en la figura 13, con una longitud del brazo agitador de 14,8 cm y un ángulo de rotación del brazo agitador de 6º, se determinó que la frecuencia era solamente 2550 RPM. Así, se considera que la disminución de la concentración de vesículas producidas con una longitud del brazo de 14,8 cm se debe a la disminución de la frecuencia de agitación que acompaña a los aumentos de la amplitud de agitación, como se ha explicado previamente. Por lo tanto, estos datos indican que, al utilizar un dispositivo agitador Wig-L-Bug^{TM}, la longitud del brazo agitador deberá ser preferiblemente inferior a aproximadamente 15 cm para maximizar la concentración de vesículas.

Se realizó una tercera serie de pruebas usando los mismos materiales y procedimiento explicados anteriormente a excepción de que el ángulo de desviación del cojinete y, por lo tanto, el ángulo de la rotación del brazo agitador en la dirección longitudinal \theta, se incrementó de 6º a 9º, incrementando por ello la amplitud de agitación en la dirección longitudinal. Además, no se usaron longitudes del brazo agitador superiores a 11,8 cm. Los resultados de estas pruebas se representan en las figuras 15(a)-(c), junto con los resultados de las series de pruebas explicadas anteriormente para comparación.

Como se puede ver en la figura 15(a), el aumento del ángulo de rotación del brazo agitador \theta de 6º a 9º reduce el tamaño de vesícula, aunque también tiene el efecto de reducir la frecuencia de agitación, como se representa en la figura 13. Así, con un ángulo de rotación del brazo agitador de 9º, incluso una longitud del brazo agitador de solamente 6,7 cm da lugar a que más del 99,5% de las vesículas sean de menos de 10 \mum y un tamaño medio de aproximadamente 2 \mum. Además, se obtuvieron más de 1000x10^{6} vesículas por ml a todas las longitudes del brazo agitador, como se representa en la figura 15(c).

Se realizó otra serie de pruebas usando los mismos materiales y procedimiento explicados anteriormente a excepción de que se utilizaron ángulos de desviación de cojinete y, por lo tanto, los ángulos de la rotación del brazo agitador en la dirección longitudinal \theta, de 3º, 5,2º, 6º, 7,8º, y 9º junto con longitudes del brazo agitador L entre 6,7 cm y 13,8 cm (aumentando en incrementos de 1 cm aproximadamente). La longitud total D del recorrido de agitación 20 se estimó en cada punto. La frecuencia en función de la longitud total del recorrido se representa en la figura 17. Los resultados se representan en las figuras 16(a)-(c) en función de la longitud total del recorrido D. Como se puede ver, en todas las condiciones comprobadas, es decir, a longitudes totales de recorrido D de 0,7 cm y mayores, más del 95% de las vesículas eran de menos de 10 \mum y la concentración de vesículas producidas era más de 100x10^{6} por ml. Además, en todas las condiciones en las que la longitud total de recorrido D era 2,19 cm o mayor, más de 98% de las vesículas eran de menos de 10 \mum. Esto sugiere que la longitud total del recorrido del movimiento de agitación deberá ser al menos 0,7 cm y, más preferiblemente, al menos 2,2 cm.

Así, lo anterior muestra que se puede obtener vesículas de pequeño tamaño en aproximadamente dos minutos o menos cuando se realiza agitación alternativa de tal manera que la frecuencia de agitación sea al menos aproximadamente 2800 RPM. Además, el movimiento de agitación se deberá realizar en dos direcciones sustancialmente perpendiculares, y, más preferiblemente, en una configuración en forma del número 8. Además, la amplitud de agitación en la dirección principal deberá ser al menos 0,3 cm y, más preferiblemente al menos 0,8 cm, o la longitud total del recorrido de agitación deberá ser al menos 0,7 cm y, más preferiblemente, al menos 2,2 cm.

V. El aparato de la invención A. El dispositivo agitador preferido

El dispositivo agitador preferido 1 de la presente invención se representa en las figuras 2 y 3. El aparato consta de una base 2 y una cubierta de seguridad articulada 3. Un botón de puesta en marcha-parada 6 y un dial de control de velocidad 5 están montados en una carcasa 4 que encierra la base 2. Un brazo 7 sobresale hacia arriba a través de un agujero 12 en la porción superior de la carcasa 4. Girando el dial 5 hacia la derecha se aumenta la agitación velocidad, mientras que girando el dial hacia la izquierda se disminuye la agitación velocidad.

Según la presente invención, al extremo distal del brazo 7 está unido un soporte de montaje 8 que permite fijar el recipiente 9, explicado además a continuación, al brazo. El soporte 8 está provisto con varios clips elásticos 11 y 12 que sujetan con seguridad el recipiente 9 en posición. También se podría usar alternativamente un soporte del tipo de tornillo de mariposa para proporcionar una unión aún más segura del recipiente 9. Como se representa en la figura 3, el soporte puede estar orientado a un ángulo \delta a la horizontal de manera que, cuando se instale en el dispositivo 1, el eje del recipiente 9 también esté orientado a un ángulo \delta a la horizontal. Preferiblemente, el ángulo \delta es del rango de -5º a +5º, y muy preferiblemente es aproximadamente 0º. En la práctica, el recipiente 9 está fijado al soporte 8 y el dispositivo agitador 1 se pone en funcionamiento para agitar vigorosamente el recipiente a lo largo del recorrido de avance representado en las figuras 4 y 5.

Las figuras 6-12 muestran los principales componentes internos del dispositivo agitador 1 según la presente invención. Como se puede ver, el brazo agitador 7 está montado rotativamente sobre el eje 42 de un motor eléctrico 44. Como se representa bien en las figuras 6 y 9, se ha formado un manguito cilíndrico 41 en el extremo próximo del brazo agitador 7. El manguito 41 aloja un cojinete 50 que soporta un casquillo cilíndrico excéntrico 40. El casquillo 40, bien representado en la figura 11, está unido fijamente al eje 42, por ejemplo, encajándose a presión o formándose integralmente con el eje, y gira dentro del cojinete 50.

Como se representa bien en la figura 11, un extremo 43 del casquillo 40 es excéntrico con respecto al eje 42, mientras que el otro extremo 45 del casquillo es concéntrico con el eje. En consecuencia, como se representa bien en la figura 7, la línea central del casquillo 40 forma un ángulo agudo \theta/2 con la línea central del eje 42. El ángulo \theta se denomina el ángulo de desviación del cojinete. Como se ha explicado previamente, el ángulo de desviación del cojinete \theta es preferiblemente de al menos aproximadamente 3º. Como se representa en las figuras 7 y 8, cuando el eje 42 y casquillo 40 giran 360º, el brazo agitador 7 gira hacia atrás y hacia adelante en el plano longitudinal un ángulo igual a \theta (cuando el casquillo 40 está en la orientación representada en la figura 8, la posición del brazo agitador 7 es la representada en transparencia en la figura 7). Así, el movimiento rotativo del eje 42 gira el manguito 41 en el plano longitudinal e imparte movimiento rectilíneo a lo largo de un recorrido arqueado al extremo distal del brazo agitador 7 al que está fijado el recipiente 9, como se representa en la figura 4.

Debido a la naturaleza excéntrica del casquillo 40, la rotación del eje 42 también tiende a girar el manguito 41 del brazo agitador 7 el ángulo de desviación del cojinete \theta también en la dirección transversal, como se representa en la figura 10 (la posición del brazo agitador cuando el casquillo ha girado 180º se representa en transparencia en la figura 10). Así, si la rotación del eje 42 era hacia la derecha según se ve de izquierda a derecha en la figura 7, la orientación del brazo agitador 7 cuando el casquillo excéntrico 40 está a 0º la representan las líneas continuas en la figura 7, la orientación cuando el casquillo está a 90º se representa en transparencia en la figura 10, la orientación cuando el casquillo está a 180º se representa en la figura 8, y la orientación cuando el casquillo está a 270º se representa con las líneas continuas en la figura 10. Así, cuando el casquillo excéntrico 40 gira 360º dentro del cojinete 50, el brazo agitador 7 imparte un movimiento de agitación al recipiente 9 en ambas direcciones longitudinal y transversal para lograr la configuración en forma del número 8 explicada anteriormente.

Un muelle 46 se extiende desde el punto muerto inferior del manguito 41 a la chapa base 5 de la carcasa del agitador, como se representa en la figura 6. La tensión en el muelle 46 sirve para mantener el brazo agitador 7 en la posición vertical cuando gira el casquillo 40. Preferiblemente, el muelle 46 tiene tensión suficiente para que el brazo agitador 7 permanezca esencialmente orientado verticalmente en el plano transversal, como se representa en las figuras 9(a) y (b), aunque se aparte de la vertical \theta/2 en el plano longitudinal, como se representa en la figura 7. Utilizar un muelle 46 con una constante elástica más baja permitirá al brazo agitador 7 girar en el plano transversal un ángulo \omega, como se representa en la figura 12. Esto tiene el efecto de incrementar la amplitud en la dirección transversal C'.

Preferiblemente, el dispositivo agitador 1 se construye modificando un dispositivo agitador comercializado fabricado por Crescent Dental Manufacturing, Inc., 7750 West 47th Street, Lyons, IL 60534 bajo el nombre agitador Wig-L-Bug^{TM} 3110B. Tales dispositivos Wig-L-Bug^{TM} emplean una configuración de agitación en forma de 8 y se venden con un brazo agitador con una longitud L de 4 cm, un ángulo de desviación del cojinete y, por lo tanto, un ángulo de rotación del brazo agitador en la dirección longitudinal \theta de 6º, y operan a una velocidad fija de 3200 RPM. Además, el brazo agitador del Wig-L-Bug incluye un par de cucharas para mantener las muestras.

Así, el aparato de agitación de la presente invención se puede crear modificando un agitador Wig-L-Bug^{TM} 3110B para incorporar el recipiente 9, al que se añaden las fases de suspensión acuosa y gaseosa, como se ha explicado previamente, sobre el extremo distal del brazo 7 de al menos 6 cm de largo. Preferiblemente, el agitador Wig-L-Bug^{TM} también se modifica para incorporar la ménsula de montaje 8 para fijar el recipiente 9 sobre el brazo agitador 7, como se representa en las figuras 3 y 6. Además, dependiendo de la composición de las fases acuosa y gaseosa, el tamaño del recipiente, etc, se puede obtener resultados óptimos modificando más el Wig-L-Bug^{TM} para (i) realizar agitación a una frecuencia distinta de 3200 RPM o para permitir la operación en un rango de frecuencias de agitación, o (ii) emplear un ángulo de desviación del cojinete \theta distinto de 6º modificando el casquillo de desviación 40.

También se puede utilizar en la práctica de la presente invención otros tipos de dispositivos agitadores alternativos, muy preferiblemente, dispositivos que imparten un movimiento de agitación en forma de 8. Además del Wig-L-Bug^{TM}, tales dispositivos incluyen (i) el Mixomat, comercializado por Degussa AG, Frankfurt, Alemania, (ii) el Capmix, comercializado por Espe Fabrik Pharmazeutischer Praeparate GMBH & Co., Seefeld, Oberay, Alemania, (iii) el Silamat Plus, comercializado por Vivadent, Lichtenstein, y (iv) el Vibros, comercializado por Quayle Dental, Sussex, Inglaterra.

Las figuras 18(a)-(c) muestran los resultados de pruebas realizadas en el Mixomat y Capmix en comparación con los resultados de pruebas obtenidos en un Wig-L-Bug^{TM} 3110B usando los mismos materiales y procedimientos explicados anteriormente con respecto a los resultados de prueba mostrados en las figuras 13-17, y una duración de agitación de 60 segundos, operando el Wig-L-Big^{TM} a una frecuencia de 3200 RPM, operando el Mixomat a una frecuencia de 4100 RPM, y operando el Capmix a una frecuencia de 4500 RPM. Como se puede ver, en cada caso, más de 98% de las vesículas eran de menos de 10 \mum y se produjeron más de 800x10^{6} vesículas por ml.

B. El recipiente preferido

Según la presente invención, el recipiente que se fija al dispositivo agitador 1 puede tomar varias formas diferentes. Un recipiente preferido 9 se representa en la figura 1 e incluye un cuerpo 30 y un tapón estanco a los gases 10. Cuando está lleno, el recipiente 9 forma un espacio superior de gas 32 y una fase de suspensión acuosa 34 sustancialmente separados uno de otro. Alternativamente, el recipiente puede tomar la forma de una jeringa prellenada, que, si se desea, puede estar provista de uno o varios filtros. Por consiguiente, el término recipiente, en el sentido en que se usa aquí, incluye una jeringa. Las jeringas, llenas de una fase acuosa y un espacio superior de un gas preseleccionado, se montan preferiblemente en el dispositivo agitador 1 con sus ejes largos orientados en la dirección transversal, es decir, perpendiculares a la longitud del arco C. Después de la agitación, se producen en la jeringa vesículas llenas de gas, listas para ser utilizadas. Independientemente del tipo de recipiente usado, éste es preferiblemente estéril, junto con su contenido.

Aunque, en general, la invención se pone en práctica con recipientes estériles donde la fase acuosa ya está presente dentro del recipiente, para aplicaciones seleccionadas, los medios estabilizantes se pueden almacenar dentro del recipiente en un estado secado o liofilizado. En este caso, la solución acuosa, por ejemplo salina fosfato tamponada estéril, se añade al recipiente estéril inmediatamente antes de la agitación. Al hacerlo, los medios estabilizantes rehidratados dentro de la fase acuosa interactuarán de nuevo con el espacio superior de gas durante la agitación para producir vesículas llenas de gas, como antes. La rehidratación de un medio de suspensión secado o liofilizado complica además necesariamente el producto y no se desea en general, pero para algunos preparados puede ser útil para prolongar más la duración del producto en almacén. Por ejemplo, algunos agentes terapéuticos, como ciclofosfamida, péptidos, y materiales genéticos (como ADN), se podrían hidrolizar en almacenamiento acuoso a largo plazo. La rehidratación de una muestra previamente liofilizada para formar la fase acuosa y el espacio superior antes de la agitación puede ser práctica para producir vesículas llenas de gas conteniendo compuestos que de otro modo no podrían tener suficiente duración en almacén.

Se puede usar varios materiales diferentes para producir el recipiente, tal como vidrio, vidrio de borosilicato, vidrio de silicato, polietileno, polipropileno, politetrafluoroetileno, poliacrilatos, poliestireno, u otros plásticos. Los recipientes preferidos son impermeables a los gases o se envuelven dentro de una barrera exterior impermeable a los gases, antes del llenado con gas. Es deseable, naturalmente, mantener la integridad del gas preseleccionado dentro del recipiente. Los ejemplos de materiales de jeringa que tienen capacidades de estanqueidad a los gases pueden incluir, aunque sin limitación, silicatos o borosilicatos de vidrio, provistos de jeringas de sílice fundida o jeringas del tipo de bloqueo luer, y émbolos de punta de teflón o recubiertos de teflón.

El tamaño del recipiente, más específicamente, su peso, afectará al tamaño de las vesículas llenas de gas. Los dispositivos agitadores agitarán en general más lentamente a medida que el peso del recipiente aumente más allá de un cierto nivel, por ejemplo, un Wig-L-Bug^{TM} 3110B agita más rápidamente con un vial de 2 ml (volumen real 3,7 ml) que con un vial de 10 ml. Por lo tanto, el volumen del recipiente no deberá exceder de una cierta cantidad dependiendo del dispositivo agitador particular utilizado.

Se realizaron pruebas en un Wig-L-Bug utilizando un vial claro de 10 ml (Wheaton Industries, Millville, New Jersey) y un vial ámbar de 2 ml (volumen real 3,7 ml) (Wheaton Industries, Millville, New Jersey). De nuevo, la velocidad de agitación se midió usando un tacómetro Code-Palmer Pistol Grip (Code-Palmer, Nile, Ill). La Tabla 7 expone los resultados, que demuestran que aumentando la capacidad del vial se disminuirá la frecuencia de
agitación.

TABLA 7 Efecto del tamaño del vial en la frecuencia de agitación del Wig-L-Bug^{TM}

Tamaño del vial	Frecuencia medida (RPM)
vial de 2 ml	3250
vial de 10 ml	2950

Como se puede ver, 2 ml nominales permiten el uso de una frecuencia de agitación alta en el Wig-L-Bug. Con referencia a las dimensiones mostradas en la figura 1, un recipiente 9 de 2 ml nominales, 3,7 ml reales, tiene preferiblemente un diámetro D de aproximadamente 1,8 cm (0,7 pulgada), y una altura general H_{o} de aproximadamente 3,6 cm (1,4 pulgada) y una altura de cuerpo H_{B} de aproximadamente 2,5 cm (1 pulgada).

VI. Aplicaciones de las vesículas producidas según la presente invención

Lo anterior expone varios parámetros al determinar el tamaño de vesículas llenas de gas. El tamaño de vesícula es importante en términos de maximizar la eficacia del producto y minimizar la toxicidad. Además, las vesículas deberán ser tan flexibles como sea posible para maximizar la eficacia y minimizar las interacciones adversas con el tejido, tal como el alojamiento en los pulmones. La presente invención crea vesículas del tamaño deseado con membranas flexibles muy finas. Dado que las membranas de vesícula son tan finas y flexibles, por ejemplo, solamente se necesita 1 mg ml-1 de lípido para estabilizar las membranas, se ha hallado que se puede usar vesículas llenas de gas de mayor diámetro sin producir hipertensión pulmonar. Por ejemplo, se han administrado a cerdos dosis de hasta cinco veces las necesarias para la formación de imágenes de diagnóstico sin ninguna evidencia de hipertensión pulmonar. Por comparación, dosis mucho menores de burbujas de aire recubiertas de albúmina de menor diámetro producen hipertensión pulmonar severa en estos animales. Dado que las vesículas de la presente invención son tan flexibles y deformables, deslizan fácilmente por los capilares pulmonares. Además, las tecnologías de recubrimiento empleadas con los lípidos presentes (por ejemplo, lípidos que soportan polietilenglicol) disminuyen las interacciones pulmonares adversas, al mismo tiempo que mejoran la estabilidad y eficacia del producto in vitro e in vivo.

El tamaño de las vesículas llenas de gas para uso como medio general de contraste por ultrasonido deberá ser lo más grande que sea posible (sin producir efectos embólicos) porque la retrodispersión o el efecto ultrasonido es proporcional al radio a la sexta potencia cuando las frecuencias son tales que las vesículas llenas de gas estén en el régimen de dispersión Rayleigh. Para MRI, también se prefieren vesículas más grandes de la invención. La capacidad de la presente invención de preparar y emplear un tamaño de vesícula más grande con menos posibilidad de efectos tóxicos aumenta su eficacia con relación a otros productos.

Un parámetro adicional que influye en el contraste por ultrasonido es la elasticidad de la membrana de la vesícula. Cuanto mayor es la elasticidad, mayor es el efecto de contraste. Dado que las vesículas presentes se recubren con membranas de lípido ultrafinas, la elasticidad es bastante parecida a la del gas sin aditivos y se maximizan la reflectividad y el efecto de contraste.

El procedimiento de agitación de la presente invención produce fácilmente vesículas a partir de una fase acuosa y un espacio superior de gas dentro de un recipiente estéril. La invención es suficiente para producir vesículas con propiedades altamente deseables para aplicaciones de formación de imágenes por ultrasónico o resonancia magnética. Sin embargo, para aplicaciones seleccionadas se puede emplear un filtro para producir vesículas con distribuciones de tamaño aún más homogéneas y de diámetros deseados. Por ejemplo para medir in vivo presiones en ultrasonido usando los fenómenos armónicos de las vesículas llenas de gas, puede ser útil tener diámetros de vesícula definidos muy estrictamente dentro de un rango estrecho de tamaños. Esto se logra fácilmente inyectando las vesículas (producidas agitando el recipiente con fase acuosa y espacio superior de gas) a través de un filtro de tamaño definido. Las vesículas resultantes no serán más grandes que un tamaño muy próximo al de los poros del filtro en la membrana filtro. Como se ha indicado anteriormente, para muchas aplicaciones de ultrasonidos o MRI, es deseable que las vesículas llenas de gas sean los más grandes que sea posible. Sin embargo, para algunas aplicaciones pueden ser deseables vesículas llenas de gas mucho más pequeñas. Al dirigirlas, por ejemplo, a tumores u otros tejidos enfermos, puede ser necesario que las vesículas llenas de gas salgan del espacio vascular y entren en el intersticio del tejido. Las vesículas llenas de gas mucho más pequeñas pueden ser útiles para estas aplicaciones. Estas vesículas llenas de gas más pequeñas (por ejemplo, apreciablemente de menos de una micra de diámetro) se pueden producir en gran medida mediante modificaciones de los compuestos en la fase acuosa (composición y concentración), así como el espacio superior (composición de gas y volumen de espacio superior), pero también por inyección a través de un filtro. Se puede producir vesículas muy pequeñas llenas de gas de tamaño sustancialmente homogéneo inyectando, por ejemplo, a través de un filtro de 0,22 micra. Las vesículas llenas de gas resultantes de tamaño micrométrico pueden tener entonces propiedades deseables para marcación.

Los ejemplos anteriores de suspensiones de lípidos también se pueden esterilizar mediante autoclave sin cambio apreciable del tamaño de las suspensiones. La esterilización del medio de contraste se puede llevar a cabo por autoclave y/o filtración estéril realizada antes o después del paso de agitación, o por otros medios conocidos por los expertos en la materia.

Después de llenar los recipientes con la fase acuosa y el espacio superior del gas preseleccionado, las botellas selladas se pueden almacenar indefinidamente. No es necesario que haya partículas que precipiten, vesículas llenas de gas que exploten u otras interacciones indeseables entre vesículas llenas de gas, partículas, coloides o emulsiones. La duración en almacén del recipiente lleno de la fase acuosa y espacio superior de gas depende solamente de la estabilidad de los compuestos dentro de la fase acuosa. Estas propiedades de larga duración en almacenamiento y esterilizabilidad confieren ventajas sustanciales a la presente invención con respecto a la técnica anterior. Aquí se resuelve el problema de la estabilidad, por ejemplo, con la agregación y precipitación de partículas, que era tan común en el campo de los medios de contraste por ultrasonido.

Se ha hallado que las vesículas llenas de gas que se producen por agitación del recipiente multifase de la invención tienen excelente utilidad como agentes de contraste para la formación de imágenes de diagnóstico, tal como formación de imágenes por ultrasonido o resonancia magnética. Las vesículas son útiles para formar imágenes de un paciente en general, y/o al diagnosticar específicamente la presencia de tejido enfermo en un paciente. El proceso de formación de imagen se puede llevar a cabo administrando una vesícula llena de gas de la invención a un paciente, y explorando después el paciente usando formación de imágenes por ultrasonido o resonancia magnética para obtener imágenes visibles de una región interior de un paciente y/o del tejido enfermo en dicha región. Por región de un paciente se entiende todo el paciente o una zona concreta o porción del paciente. El agente de contraste liposómico se puede emplear para proporcionar imágenes de la vasculatura, corazón, hígado y bazo, y al formar imágenes de la región gastrointestinal u otras cavidades corporales, o de otras formas, como será fácilmente evidente a los expertos en la materia, tal como en caracterización de tejido, formación de imágenes de sangre acumulada, etc. Se puede emplear cualquiera de los varios tipos de dispositivos de formación de imágenes por ultrasonido o resonancia magnética en la práctica de la invención, no siendo crítico el tipo o modelo concreto del dispositivo para el método de la invención.

Las vesículas llenas de gas de la invención también se pueden emplear para administrar una amplia variedad de agentes terapéuticos a un paciente para el tratamiento de varias enfermedades, estados o afecciones, como reconocerán los expertos en la técnica.

Además, se puede usar vesículas magnéticamente activas para estimar presión por MRI. Las vesículas aumentan la susceptibilidad volumétrica y, por consiguiente, aumentan la relajación T2 pero aún más la relajación T2*. Dado que los efectos de los gradientes de campo estático se compensan principalmente en experimentos de eco de espín (en virtud del pulso de reenfoque de radiofrecuencia a 180º) el efecto de las vesículas es menos marcado en secuencias de pulso ponderado T2 que T2* donde no se compensan los efectos de campo estático. El aumento de presión da lugar a pérdida de vesículas o disrupción de vesículas (para gases más solubles) así como a una disminución del diámetro de vesícula. Por consiguiente, 1/T_{2} disminuye con el aumento de presión. Después de liberar la presión, algunas vesículas restantes se reexpenden y 1/T_{2} aumenta de nuevo ligeramente. Las vesículas compuestas de aproximadamente 80% PFP con 20% aire muestran mejor estabilidad y una ligera caída de 1/T_{2} con la presión que vuelve a línea base después de la liberación de presión (es decir, las vesículas son estables pero muestran un ligero efecto de presión 1/T_{2}). Cuando se obtienen imágenes de eco-gradiente y se mide la intensidad de señal, estos efectos son mucho más marcados. La intensidad de señal aumenta con el aumento de presión (1/T_{2}* disminuye con una presión incrementada). Dado que el experimento se lleva a cabo de forma relativamente rápida (para efectuar las imágenes de eco-gradiente se tarda menos de una décima del tiempo que se tarda en medir T_{2}). La duración de la exposición a presión es mucho menor y las vesículas llenas de nitrógeno vuelven casi a línea base después de liberar la presión (es decir, hay muy poca pérdida de vesículas). Por consiguiente, la intensidad de señal en eco-gradiente vuelve casi a línea base al retorno a presión ambiente. Para la medición de la presión por MRI, las vesículas se pueden diseñar de manera que se deshagan con el aumento de presión o sean estables, pero disminuyan el diámetro de vesícula con la disminución de presión. Dado que en MRI el radio de vesícula afecta a 1/T_{2}*, esta relación se puede usar para estimar la presión por MRI.

Como reconocerán los expertos en la técnica, la administración de las vesículas llenas de gas al paciente se puede llevar a cabo de varias formas, tal como por vía intravenosa o intraarterial por inyección, por vía oral o rectal. La dosis útil a administrar y el modo particular de administración variará dependiendo de la edad, el peso y el mamífero concreto y su región a explorar o tratar, y el medio concreto de contraste o terapéutico a emplear. Típicamente, la dosis se inicia a niveles más bajos e incrementa hasta que se logra la mejora deseada del contraste o efecto terapéutico. El paciente puede ser cualquier tipo de mamífero, pero muy preferiblemente es un humano.

Varias modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente memoria, serán evidentes a los expertos en la materia por la descripción anterior. Se pretende también que tales modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (34)

1. Un aparato para hacer vesículas de tamaño óptimo, incluyendo dicho aparato:

a) un recipiente conteniendo una fase de suspensión acuosa y una fase gaseosa sustancialmente separada de dicha fase de suspensión acuosa; y

b) un dispositivo para agitar dicho recipiente impartiéndole un movimiento alternativo para formar vesículas, incluyendo dicho dispositivo de agitación

(i)

un brazo,

(ii)

medios para acoplar dicho recipiente a dicho brazo, y

(iii)

medios para agitar dicho brazo hacia atrás y hacia adelante en direcciones primera y segunda perpendiculares entre sí;

caracterizado porque dicho brazo tiene una longitud de al menos 6 cm;

dichos medios para agitar dicho brazo incluyen medios para girar dicho brazo en la primera dirección a lo largo de un recorrido arqueado que tiene un radio de curvatura de al menos 6 cm y abarcando un ángulo de al menos 3º, y

el recorrido general de dicho movimiento alternativo se produce en una configuración en forma del número 8.

2. El aparato según la reivindicación 1, donde dichos medios para agitar incluyen medios para agitar a una amplitud de al menos aproximadamente 0,3 cm.

3. El aparato según la reivindicación 2, donde dichos medios de agitación incluyen además medios para agitar a una amplitud no superior a aproximadamente 2,5 cm.

4. El aparato según la reivindicación 2, donde dichos medios para agitar dicho brazo incluyen medios para girar dicho brazo a una amplitud de al menos aproximadamente 0,02 cm en dicha segunda dirección.

5. El aparato según la reivindicación 1, donde dichos medios de agitación incluyen medios para agitar dicho recipiente a lo largo de un recorrido en forma del número 8 que tiene una longitud total de al menos aproximadamente 0,7 cm.

6. El aparato según la reivindicación 1, donde el ángulo abarcado por dicho recorrido arqueado no es superior a aproximadamente 9º.

7. El aparato según la reivindicación 1, donde el radio de curvatura de dicho recorrido arqueado no es superior a aproximadamente 15 cm.

8. El aparato según la reivindicación 1, donde dichos medios de agitación incluyen medios para agitar a una frecuencia de al menos aproximadamente 2800 RPM.

9. El aparato según la reivindicación 1, donde dicha fase de suspensión acuosa incluye lípidos.

10. El aparato según la reivindicación 9, donde dicha fase de suspensión acuosa incluye dipalmitoilfosfatidilcolina, ácido dipalmitoilfosfatídico, y dipalmitoilfosfatidiletanolamina.

11. El aparato según la reivindicación 9, donde dicho lípido tiene forma de una monocapa.

12. El aparato según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dichas vesículas incluyen liposomas.

13. El aparato según la reivindicación 12, donde dichos liposomas incluyen un fosfolípido.

14. El aparato según la reivindicación 1, donde dicha fase gaseosa ocupa inicialmente al menos 10% del volumen de dicho recipiente.

15. El aparato según la reivindicación 1, donde dicha fase gaseosa incluye un gas perfluorocarbono.

16. El aparato según la reivindicación 1, donde dicha fase gaseosa incluye un gas seleccionado a partir del grupo que consta de perfluoropropano, perfluorobutano, perfluoropentano, perfluorohexano y hexafluoruro de azufre.

17. El aparato según la reivindicación 16, donde dicha fase gaseosa incluye perfluoropentano.

18. El aparato según la reivindicación 16, donde la fase gaseosa incluye hexafluoruro de azufre.

19. El aparato según la reivindicación 16, donde dicha fase gaseosa incluye perfluoropropano.

20. El aparato según la reivindicación 16, donde dicha fase gaseosa incluye perfluorohexano.

21. El aparato según la reivindicación 1, donde dicha fase de suspensión acuosa incluye un polímero.

22. El aparato según la reivindicación 21, donde dicho polímero incluye un polimetacrilato.

23. El aparato según la reivindicación 21 o 22, donde dicha fase gaseosa incluye aire.

24. El aparato según la reivindicación 1, donde dicha fase de suspensión acuosa incluye un polisacárido.

25. El aparato según la reivindicación 1, donde dicha fase de suspensión acuosa incluye galactosa.

26. El aparato según la reivindicación 25, donde dicha fase gaseosa incluye nitrógeno.

27. El aparato según la reivindicación 12, donde dichos liposomas incluyen liposomas entrecruzados o liposomas polimerizados.

28. El aparato según la reivindicación 9, donde dicha fase de suspensión acuosa incluye además polietilen glicol.

29. Un método de hacer vesículas de tamaño óptimo, incluyendo dicho método facilitar un aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, y agitar dicho recipiente a una frecuencia superior a aproximadamente 2.800 RPM y no superior a aproximadamente 10.000 RPM durante un tiempo suficiente para generar vesículas en dicho recipiente.

30. El método según la reivindicación 29, donde dicha agitación produce vesículas de las 95% son de menos de 10 \mum.

31. El método según la reivindicación 30, donde dicha agitación produce vesículas que tienen un tamaño medio de menos de 2,5 \mum.

32. El método según la reivindicación 29, donde dicha fase gaseosa ocupa inicialmente al menos 10% del volumen de dicho recipiente.

33. El método según la reivindicación 30, donde la duración de dicha agitación no es superior a aproximadamente 2 minutos.

34. El método según la reivindicación 33, donde dicho recipiente es una jeringa.