ES2206407T3 - Revestimiento proteico. - Google Patents

Abstract

Un método que proporciona un recubrimiento proteináceo sobre un implante médico, que consiste en los pasos de: - sumergir el implante en una primera solución acuosa que contiene una proteína e iones magnesio, calcio y fosfato a través de la cual se hace pasar un ácido débil gaseoso; - desgasificar la solución; - permitir que el recubrimiento precipite sobre el implante; - sumergir el implante recubierto en una segunda solución para redisolver los iones magnesio, calcio y fosfato y obtener el recubrimiento proteináceo.

Description

Revestimiento protéico.

La invención se refiere al campo de implantes médicos. Más en particular, la invención se refiere a un recubrimiento que mejora la biocompatibilidad y propiedades de unión al hueso de los implantes médicos, como prótesis ortopédicas y dentales.

Recientemente, se ha desarrollado un recubrimiento biomimético para el recubrimiento de implantes médicos con materiales cerámicos, como hidroxiapatita similar a la ósea. Esta tecnología se ha descrito en la solicitud de patente europea 98203085.0 y consiste en sumergir el material del implante, por ejemplo, un soporte para la reconstrucción de tejidos óseos, en una solución supersaturada de fosfato cálcico que simula un fluido fisiológico. Se precipita uniformemente una capa de fosfato cálcico sobre la superficie del implante bajo condiciones para una nucleación y crecimiento del cristal modulados. Este método imita la forma en que se forman los cristales óseos de hidroxiapatita en el cuerpo. Teniendo en cuenta las condiciones fisiológicas en las que el recubrimiento biomimético crece desde un fluido a temperatura corporal, se pueden precipitar simultáneamente otros agentes biológicamente activos como antibióticos.

La patente EP 0 806 212 describe un dispositivo recubierto implantable que contiene una capa de fosfato cálcico en la que se puede incorporar una sustancia biológicamente activa. El recubrimiento que contiene fosfato cálcico y un factor de crecimiento puede mejorar la formación ósea. Para la preparación del recubrimiento, es necesario que la superficie del dispositivo tenga un aspecto rugoso (valor Ra) de 10-1000 nm.

En la patente WO 97/41273 se describe un proceso para recubrir un sustrato metálico o cerámico por calentamiento de una determinada solución mineral, en la que se sumerge el sustrato a una temperatura elevada hasta que el pH es al menos de 8, después de lo cual se induce el depósito de hidroxiapatita carbonatada cristalina sobre el sustrato. Tal recubrimiento se describe como osteoinductor pero no se revela la incorporación de agentes bioactivos. Es improbable que el proceso pudiera ser adecuado para tal fin, ya que la combinación de una temperatura elevada y un pH alto tendría un efecto perjudicial sobre los agentes bioactivos termosensibles.

Muchos tejidos mineralizados de los seres vivos están compuestos por cristales formados en condiciones bien controladas. Las proteínas son las participantes clave en el proceso de control. Algunas proteínas recubren los cristales individuales, mientras que otras quedan ocluidas en el interior de los cristales. Aún no se conoce claramente cómo estas proteínas quedan ocluidas en el interior de un cristal y cuál es su papel en el proceso de cristalización y en la determinación de las propiedades del cristal.

La presente invención intenta encontrar una forma de utilizar la función de control esperada de las proteínas en los procesos de mineralización. En particular, es un objetivo de la invención encontrar una forma de usar una proteína para inducir la mineralización, calcificación o la formación de tejido óseo en un implante médico.

Estos objetivos, así como los demás objetivos de la invención que serán evidentes a partir de la presente descripción, se han alcanzado en virtud de un recubrimiento proteináceo sobre el implante que se aplica en él de una forma específica.

En consecuencia, la invención se refiere específicamente a un método que proporciona un recubrimiento proteináceo sobre un implante médico, que consiste en los pasos de:

- sumergir el implante en una primera solución acuosa que contiene una proteína e iones magnesio, calcio y fosfato a través de la cual se hace pasar un ácido débil gaseoso;

- desgasificar la solución;

- permitir que el recubrimiento precipite sobre el implante;

- sumergir el implante recubierto en una segunda solución para redisolver los iones magnesio, calcio y fosfato y obtener el recubrimiento proteináceo.

Sorprendentemente, se ha encontrado que se puede proporcionar un recubrimiento proteináceo sobre un implante médico, cuyo recubrimiento induce la nucleación y crecimiento de los cristales de fosfato cálcico tanto in vitro como in vivo. Aunque el recubrimiento por sí mismo no contendrá habitualmente ningún material de fosfato cálcico, se ha encontrado que actúa a modo de plantilla o matriz para la mineralización. Esta propiedad ventajosa permite la aplicación del implante médico para servir como un soporte para la reconstrucción de tejido óseo.

Por otro lado, dicha propiedad aumenta también la idoneidad del implante para el fin que tenía originalmente, es decir, ser implantado en un paciente que necesita un sustituto óseo. El recubrimiento proteináceo que se describe en este documento puede inducir el depósito de varios compuestos de fosfato cálcico que contienen carbonato y otros iones en la superficie de un dispositivo implantable. La composición y cristalinidad de las capas serán similares a las del mineral de los huesos y dientes y tendrán las propiedades de unión al hueso y capacidad de reabsorción biológica deseadas para mejorar la fijación biológica de los dispositivos médicos en el tejido calcificado vivo.

El recubrimiento proteináceo puede formar posteriormente una mezcla con los cristales de fosfato cálcico, por ejemplo in vivo, produciendo un recubrimiento biomimético con propiedades mecánicas superiores a las de los recubrimientos cerámicos convencionales. Se cree que la proteína puede funcionar como un refuerzo para el recubrimiento biomimético al unir entre sí los cristales de fosfato cálcico.

Además, el recubrimiento proteináceo mejora la unión entre las células y mejora la biocompatibilidad y propiedades de unión al hueso de los implantes médicos.

El implante médico sobre el que se aplica un recubrimiento de acuerdo con la invención puede ser de cualquier material inorgánico, metálico, polimérico u orgánico. El implante puede ser plano, denso o de una forma compleja y puede tener una superficie porosa, arrosariada o mallada.

Los metales como el acero inoxidable, titanio, níquel, cobalto, cromo, niobio, molibdeno, zirconio, tantalio y sus combinaciones, se pueden recubrir para aplicaciones ortopédicas y odontológicas. Por ejemplo, se pueden recubrir los dispositivos que se usan en la artroplastia total de cadera, como los cotilos acetabulares porosos o no porosos y la región proximal de los vástagos de cadera.

Asimismo, se pueden recubrir materiales cerámicos, como alúmina y zirconia, cristales como los cristales bioactivos elaborados con CaO-SiO_{2}-P_{2}O_{5}, y fosfatos cálcicos, como hidroxiapatita y trifosfato cálcico.

Dichos recubrimientos pueden aplicarse a varios polímeros y plásticos, más preferiblemente biocompatibles o biorresorbibles como Polyactive^{TM}, un copolimero de polietileno glicol y polibutilén tereftalato.

Antes de aplicar el recubrimiento, los sustratos preferentemente se limpian o se tratan para eliminar cualquier contaminante de la superficie y para promover una buena adhesión del recubrimiento. Se pueden emplear varios métodos para limpiar. Los implantes metálicos pueden aclararse con un desengrasante, como por ejemplo acetona, alcoholes alquilo, etc. y después aclararse cuidadosamente con agua pura.

Para mejorar la adhesión del recubrimiento, pueden aplicarse varios tratamientos de superficie a los implantes metálicos. Los tratamientos mecánicos de superficie como aspersión de arena, incisión, pulido y molido puede aumentar la rugosidad de la superficie de los implantes y mejorar la fuerza de unión entre los recubrimientos y el sustrato. Con fines similares, también pueden aplicarse tratamientos químicos de superficie a los sustratos metálicos antes del recubrimiento. Entre otros tratamientos químicos disponibles para los metales, se preferirá el grabado por ácido para el tratamiento de dispositivos implantables con ácidos minerales fuertes, como ácidos fluorhídrico, clorhídrico, sulfúrico, nítrico y perclórico. También puede resultar útil tratar los dispositivos metálicos con agentes oxidantes como ácido nítrico, ácidos peroxihalógenos, hidroxiperóxidos o peróxido de hidrógeno para formar una capa de óxido metálico fresca. Después del tratamiento mecánico o químico, es necesario aclarar los implantes con agua pura bajo ultrasonidos para eliminar los contaminantes de la superficie.

El método para recubrir implantes médicos consiste en empapar los implantes médicos en una solución de calcificación que comprende una proteína a baja temperatura. Este método sencillo está basado en el descubrimiento de que los fosfatos cálcicos son más solubles en un medio ligeramente ácido que en pH neutro o incluso básico. Esto también se aplica a condiciones que esencialmente no afectan a la estabilidad y a la actividad de la proteína de una forma dañina. Así, las soluciones acuosas de iones calcio y fosfato y una proteína pueden estar más concentradas en un pH ligeramente ácido que en uno neutro. Dicho de otro modo, los fosfatos cálcicos precipitan en pH neutro o básico mientras que permanecen solubles en un pH ligeramente suave a partir de una solución con las mismas concentraciones de sales.

Un aumento del pH en la solución puede inducir las siguientes fases: subsaturación, sobresaturación o la formación de un estado metaestable, nucleación y crecimiento del cristal. Se pueden formar núcleos de fosfato cálcico sobre una nucleación heterogénea de sustrato cuando una solución ha alcanzado el límite de sobresaturación o el estado metaestable. En el estado de sobresaturación, los cristales pueden crecer a partir de fluidos metaestables. Con una mayor saturación, la nucleación homogénea o la precipitación en la solución es el proceso predominante. Esta invención hace uso de cambios de pH para controlar los estados mencionados más arriba y para inducir el depósito de capas de fosfato cálcico carbonato sobre la superficie de los implantes médicos.

El objetivo anterior puede conseguirse haciendo burbujear un ácido débil gaseoso, preferiblemente gas dióxido de carbono, en una solución de calcificación para reducir el pH y de esta forma aumentar la solubilidad de las sales de fosfato cálcico. Es bien conocido que el agua mineral natural con gas tiene un pH ligeramente ácido derivado del gas dióxido de carbono disuelto. También es una característica importante que el pH del agua mineral aumenta lentamente a pH neutro o ligeramente básico durante la liberación natural o el intercambio de gas dióxido de carbono disuelto con el aire.

En algunas realizaciones preferidas, se requiere el burbujeo del gas dióxido de carbono en la solución de calcificación. El gas dióxido de carbono se disolverá en la solución de calcificación y formará iones hidrógeno carbonato en agua. Dichos implantes médicos se colocan en una solución de calcificación acuosa a través de la cual se pasa un ácido débil gaseoso, como por ejemplo gas dióxido de carbono, para producir un medio débilmente ácido. El pH inicial de dicha solución de calcificación se mantiene en el intervalo 3-7; preferiblemente en torno a 5,5 a 6,5 burbujeando gas CO_{2}. El gas dióxido de carbono se introduce en la solución a una presión suficiente para generar burbujas de forma continua. La presión de gas CO_{2} estará en el intervalo 0,1-10 bar, preferiblemente de 0,5 a 1,5 bar, más preferiblemente aproximadamente 1 bar.

En un método de acuerdo a la invención, la presencia de iones magnesio, calcio y fosfato en la solución de calcificación es esencial. Particularmente, se ha observado que la presencia de magnesio es importante para controlar el crecimiento de cristales del recubrimiento durante el depósito a partir de la solución de calcificación. Un control óptimo del crecimiento de cristales conduce a un recubrimiento uniforme, fuerte y resistente al desgaste. Particularmente, la fijación del recubrimiento al sustrato se ve positivamente influida por la presencia de iones magnesio en la solución de calcificación. Un recubrimiento preparado de acuerdo con la invención, preferiblemente tiene cristales con un tamaño dentro del rango submicrométrico. En una realización preferida, se pueden incorporar en la solución de calcificación inhibidores adicionales del crecimiento de cristales, como iones carbonato. Si se requiere; también pueden estar presentes contra-iones, como sodio y cloro, para proporcionar una fuerza iónica constante.

Preferiblemente, la solución de calcificación se prepara mientras se hacen pasar las burbujas del ácido débil gaseoso, para evitar la precipitación. La introducción del gas reduce el pH de la solución y permite la disolución completa del magnesio, calcio y fosfato, y otras posibles sales. Preferiblemente, el burbujeo se inicia al menos 5 minutos antes, y durante el añadido de las sales. De esta forma, el pH se reduce a aproximadamente 3-8, más preferiblemente a 5.5-6.

Por supuesto, también es posible iniciar el burbujeo con el ácido débil gaseoso después del añadido de las cantidades deseadas de sales a la solución. Una vez que se ha iniciado el burbujeo, de acuerdo con esta realización, es importante asegurar que las sales se disuelven completamente.

La solución de calcificación se prepara preferiblemente agua ultra pura y productos químicos de grado puro. La solución de calcificación se esteriliza preferiblemente con filtro a través de una membrana de filtro de 0,2 micras antes de su uso. La proporción molar calcio fósforo en la solución de calcificación se sitúa generalmente dentro del intervalo 1-3, más preferiblemente entre 1,5 y 2,5. Las concentraciones de iones en la solución de calcificación se eligen de manera que en ausencia del ácido débil gaseoso, la solución está supersaturada o sobresaturada. La molaridad de la fuente de calcio estará generalmente en el intervalo 0,5-50 mM, preferiblemente en torno a 2,5 a 25 mM. La fuente de fosfato estará generalmente aproximadamente entre 0,5 y 20 mM, más preferiblemente aproximadamente 1 a 10 mM. La concentración de magnesio en la solución de calcificación estará normalmente dentro del intervalo 0,1-20 mM, más preferiblemente aproximadamente 1,5 a 10 mM. La concentración de carbonate estará en el intervalo de 0 a 50 mM, más preferiblemente 0 a 42 mM. La fuerza iónica estará dentro del intervalo 0,10-2 M, más preferiblemente entre 0,15 y 1,5 M. La solución de calcificación se agita preferiblemente a aproximadamente 10-1000 rpm, más usualmente 50 a 200 rpm. La temperatura se mantiene a aproximadamente 5-80ºC, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 5-50ºC.

La proteína está preferiblemente presente en la solución de calcificación descrita más arriba. Puede añadirse ante, durante o después de la disolución de los diversos iones que se desean en el recubrimiento. La concentración en la que la proteína está preferiblemente presente en la solución de calcificación preferiblemente se entre 0,001 y 10 g/l, más preferiblemente entre 0,01 y 1 g/l.

En principio, el presente método puede llevarse a cabo utilizando cualquier tipo de proteína. Las proteínas preferidas y altamente adecuadas están cargadas negativamente en el pH al que se produce la precipitación. Se prefiere además que la solubilidad de la proteína sea al menos de 1 gramo por litro de agua con pH neutro. Además, se considera ventajoso si la proteína posee puentes disulfido en su estructura. Ejemplos de proteínas altamente adecuadas incluyen albúmina, caseína, gelatina, lisosima, fibronectina, fibrina y chitosan. En principio, se puede cualquier proteína basada en amino ácidos que tenga un punto isoeléctrico por debajo de 7 y que tenga carga negativa. Ejemplos de tales aminoácidos son alanina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, prolina, fosforina, serina y valina. Entre las proteínas, son particularmente preferidas las proteínas sintéticas como polilisina, polialanina, y policisteína. Las proteínas biológicamente activas, como los factores de crecimiento (por ejemplo, BMP, FGF o TGF) también se pueden usar con ciertas ventajas.

Opcionalmente, el recubrimiento proteináceo puede unirse al implante de forma covalente haciendo uso de un agente de unión o enlace. Este agente debería ser capaz de reaccionar con grupos OH sobre la superficie del implante y con grupos amino proteína. La unión covalente asegurará una buena fijación mecánica del recubrimiento proteináceo al implante. El agente de unión se elige preferiblemente dentro del grupo de isocianatos, ácido cianúrico, alcóxidos de titanio (Ti(OR)4), y ésteres de silicona, como Si(OR)2C'2, en el que R representa un grupo alquilo de 1-4 átomos de carbono. Para obtener el enlace covalente, el agente de unión se añade simplemente a la solución de calcificación en una cantidad apropiada que típicamente estará entre 1 y 20% del peso basado en el peso de la solución.

El dióxido de carbono tiene una solubilidad limitada en soluciones acuosas. En contacto con el aire, una solución acuosa carbonada está libre de CO_{2} o se desgasifica completamente al cabo de unas pocas horas dependiendo de la superficie de la solución en contacto con el aire. El intercambio completo de gas CO_{2} disuelto en la atmósfera pude realizarse en aproximadamente 8 a 48 horas, más preferiblemente entre 12 y 24 horas. La liberación natural de gas CO_{2} hace que el pH de la solución remanente aumente. Dicho de otro modo, la saturación en la solución de calcificación puede aumentar hasta que se produce la precipitación de las capas bioactivas, incluyendo fosfato cálcico y proteína, sobre la superficie. Opcionalmente, se pueden hacer pasar burbujas de aire a través de la solución para desgasificar o airear la solución y acelerar el escape, liberación o intercambio del ácido débil gaseoso. Los valores pH inicial y final así como los cambios en el pH con el tiempo dependen de la cantidad de carbonato y sales de fosfato añadidas a la solución de calcificación. La capacidad tamponadora puede ajustarse a un valor pH deseado añadiendo más o menos sales de fosfato y carbonato. El pH se puede mantener dentro del rango deseado introduciendo gas dióxido de carbono. Esencialmente, el flujo de dióxido de carbono pude ajustarse usando una electroválvula o una válvula solenoide pilotada por el controlador. Durante la liberación natural de gas CO_{2} fuera de la solución de calcificación, el pH aumentará hasta aproximadamente 6-10, más preferiblemente aproximadamente 7,5 a 8,5 después de estar empapada durante 24 horas. La capa de fosfato cálcico carbonato que comprende la proteína se precipitará sobre la superficie del dispositivo implantable con un valor de pH en el intervalo de aproximadamente 5-7.5. Dicha precipitación sobre la superficie de los implantes médicos está relacionada con un paso de nucleación heterogénea. Los cristales de fosfato cálcico carbonato pueden posteriormente precipitarse en la solución de calcificación mediante un proceso de crecimiento de cristales. De acuerdo con la invención, la nucleación heterogénea se ve favorecida por la estabilización energética del núcleo sobre el sustrato. La alta densidad de nucleación asegura un depósito uniforme de los cristales de fosfato cálcico carbonato sobre la superficie de los implantes médicos.

En un método de acuerdo con la invención, puede ser deseable control el pH y de esta forma la fase de nucleación introduciendo burbujas de gas CO_{2} gas en diversos tiempos. El tiempo de burbujeo es normalmente de entre unos pocos segundos y unos minutos, preferiblemente aproximadamente de 1 a 600 segundos. La introducción de dióxido de carbono provoca una disminución del pH, mientras que el pH de la solución de calcificación tiende a aumentar naturalmente sin burbujeo de gas CO_{2} gas. El aumento del pH pude deberse al intercambio natural del gas CO_{2} gas con la atmósfera y a la capacidad de amortiguación de la solución de calcificación. Ajustando el tiempo y el flujo del gas CO_{2} gas introducido en la solución de calcificación, el pH puede oscilar en torno a un valor situado en el rango de 6 a 9, más preferiblemente el pH de la solución de calcificación se puede mantener entre 6,5 y 7,5. Esta oscilación del pH está relacionada con la fase de nucleación de los cristales de fosfato cálcico carbonato sobre la superficie de los implantes médicos. Por lo tanto, se proporciona una alta densidad de nucleación y los cristales de fosfato cálcico carbonato pueden nuclear y crecer sobre la superficie de los implantes médicos. Capas homogéneas que comprenden material cerámico y proteína pueden depositarse uniformemente sobre el sustrato del implante. El espesor total de las capas estará preferiblemente dentro del intervalo de 0,5-100 micras, más probablemente entre 0,5 y 50 micras. Mientras las capas son finas, normalmente por debajo de 5 micras, los recubrimientos pueden difractar la luz natural formando franjas de colores que van del azul al rojo. Esta difracción de la luz es similar al fenómeno que puede observarse cuando una gota de aceite está presente en el agua. Cuando el espesor es mayor, las capas adquieren una coloración gris brillante o blanca.

El recubrimiento así obtenido contiene tanto el material cerámico como la proteína. De acuerdo con la invención, el material cerámico se elimina mediante disolución en una segunda solución para proporcionar el recubrimiento proteináceo objetivo. Las condiciones en las que se lleva a cabo la disolución se eligen de manera que el material cerámico se disuelve sustancialmente de forma completa y la proteína permanece sustancialmente de forma completa recubierta sobre la superficie del implante médico. Dicho de otro modo, deberá tenerse cuidado de evitar, en la medida de lo posible, la hidrolización de la proteína. Aunque cabría esperar que se produjera una desnaturalización (parcial) de la proteína durante esta fase, no se considera que esto perjudique las propiedades inductivas del recubrimiento y puede de hecho ser positivo.

La disolución puede conseguirse utilizando una solución ácida, como una solución acuosa de la que el pH se elige preferiblemente entre 2 y 5, más preferiblemente ente 3 y 4. El ácido utilizado para obtener el pH objetivo puede en principio ser cualquier ácido adecuado para alcanzar el grado deseado de acidez. Los ácidos adecuados no afectan de forma negativa a la proteína. Ejemplos son el ftalato hidrógeno y el ácido hidroclórico que se usan preferiblemente en una solución acuosa de 30-70 mM.

En otra realización la disolución del material cerámico se consigue en una solución que comprende un agente acomplejante o secuestrante para redisolver los iones magnesio, calcio y fosfato y obtener el recubrimiento proteináceo. La solución que comprende el agente secuestrante es preferiblemente una solución acuosa en la que el pH puede ser alcalino; neutro o ácido. El pH está preferiblemente en el intervalo de 2-9, más preferiblemente en el intervalo de 2-7. De forma todavía más preferiblemente, el pH está en el intervalo de 4-6, debido a la mejor solubilidad del calcio libre y del magnesio con un pH ácido, en combinación con un grado relativamente alto de complejación.

En principio puede usarse cualquier agente secuestrante para calcio y magnesio para disolver la parte mineral del recubrimiento. Un agente secuestrante adecuado no afecta negativamente a la proteína. El agente secuestrante pude usarse por sí sólo o junto con un agente secuestrante más o más agentes secuestrantes, por ejemplo, para optimizar la complejación de los diferentes cationes en los materiales cerámicos.

Se han conseguido muy Buenos resultados con acetato tetra diamina etileno (EDTA, por ejemplo, la sal sódica) como agente secuestrante. Un pH altamente preferido para esta realización en particular es el intervalo de 4-6.

Se ha observado que el material cerámico pude disolverse del recubrimiento utilizando el agente secuestrante en un rango amplio de concentración. El agente secuestrante puede utilizarse en cualquier concentración, hasta llegar a concentración saturada. Preferiblemente la concentración es entre 0,1 y 20% en peso, más preferiblemente entre 1 y 10%.

La disolución del material cerámico utilizando un agente secuestrante o acomplejante puede llevarse a cabo de manera que la proteína no se desnaturalice significativamente, lo que puede ser ventajoso para aplicaciones particulares.

Una vez que el material cerámico se ha eliminado esencialmente de forma completa, el implante médico con el recubrimiento proteináceo puede sacarse de la solución en la que se ha disuelto el material cerámico y aclararse opcionalmente con agua o con agua desmineralizada para eliminar trazas de ácido o de material cerámico. Se ha observado que el implante médico así obtenido induce la mineralización, la calcificación o la formación de tejido óseo en vitro y en vivo. Por lo tanto, el implante tiene un rendimiento mejorado como sustituto del hueso en comparación con el implante sin el recubrimiento proteináceo.

También se ha observado que al exponerlo a una solución de calcificación, puede producirse una recalcificación de la capa proteinácea de manera que la morfología de la capa después de la remineralización se parece mucho a la del recubrimiento intermedio, incluyendo proteína y fosfato cálcico, antes de la descalcificación. Se espera que este proceso de recalcificación se produzca en vivo, dependiendo del lugar la implantación. Como la capa puede reabsorber totalmente los minerales, se minimiza el riesgo de crear zonas quebradizas que pudieran causar fractura en los recubrimientos.

Además, la propiedad inductora del recubrimiento hace que el implante recubierto sea altamente adecuado para su uso como soporte para hueso para la reconstrucción de tejidos. En esta aplicación, se pueden plantar células en el implante y hacer cultivos para formar o empezar a formar tejido óseo.

La invención se ilustrará ahora mediante los siguientes ejemplo no limitativos.

Ejemplo

Materiales y Métodos Materiales

Se usaron placas de aleación de titanio de alto grado (Ti6AI4V) de 20 x 20 x 1 mm. Las soluciones de calcificación se prepararon con reactivos químicos puros (Merck) y agua desmineralizada. La proteína usada en este estudio fue la albúmina sérica bovina (BSA) en forma de polvo (fracción V, >98%, Sigma). La BSA es una cadena polipeptídica sencilla que contiene aproximadamente 583 residuos de aminoácidos (PM 66,4303). En un pH de 5-7 contiene 17 puentes disulfuro intracatenáricos y 1 grupo sulfhidrilo (Sigma A-8806).

Métodos Preparación de los recubrimientos biomiméticos de fosfato cálcico

Las placas de Ti6AI4V se limpiaron por ultrasonidos durante 15 min en acetona y después etanol (70%) y, por último, en agua desmineralizada. Todas las muestras se grabaron con una mezcla de ácido fluorhídrico (HF, 40% del peso), ácido nítrico (HNO_{3}, 65% del peso) y agua desmineralizada durante 10 min bajo ultrasonidos. Después del grabado, se aclararon abundantemente con agua desmineralizada.

Se aplicaron posteriormente dos capas de fosfato cálcico sobre las muestras de Ti6AI4V utilizando un método biomimético. La primera capa se preparó con unas condiciones altas de nucleación en presencia de inhibidores de crecimiento de cristales en un líquido corporal simulado concentrado (SBF x 5) (Tabla 1). Se elaboró una solución de calcificación disolviendo sales NaCl: CaCl_{2}, 2 H_{2}O, MgCl_{2}, 6 H_{2}O, NaHCO_{3} y Na_{2}HPO_{4}, 2 H_{2}O en 1000 ml de agua desmineralizada y haciendo pasar gas dióxido de carbono a su través. Después de la inmersión durante 24 horas a 37ºC, el pH de esta solución había aumentado desde 5-6 a 8. Las placas se aclararon cuidadosamente con agua desmineralizada durante 10 minutos y por último se secaron a temperatura ambiente toda la noche. Sobre la superficie de aleación de titanio se depositó uniformemente una capa fina, densa y amorfa de fosfato cálcico. Esta fina capa producía la difracción de la luz natural formando ondas coloreadas, por lo que se denominó recubrimiento en arco iris. Las placas de Ti6AI4V con recubrimiento en arco iris se usaron a continuación como superficie de siembra para el crecimiento de una capa de apatita cristalina posterior.

TABLA 1

1

HBP = Un preparado habitual de plasma sanguíneo humano

La segunda capa se preparó en condiciones conductivas para el crecimiento del cristal, es decir, por inmersión de los implantes de Ti6AI4V en una solución supersaturada de fosfato cálcico (CPS, Tabla 1) durante 48 horas a temperatura ambiente. Estas soluciones también contenían albúmina sérica bovina [(BSA) en forma de polvo, fracción V, >98%, de Sigma] en concentraciones de 0, 0,01, 0,1 y 1 mg/ml de BSA.

Las muestras se lavaron a continuación en agua desmineralizada y se secaron al aire a temperatura ambiente. El microscópico electrónico de barrido (SEM, Philips, Modelo 525, 15 kV, muestras de carbono potenciado) reveló que las películas de proteína tenían estructura foliácea, repitiendo los cristales lamelares originales de hidroxiapatita (Figura 1a). Durante este proceso de recubrimiento, se depositó uniformemente una película gruesa (30 - 50 \mum) y densa de apatita cristalizada sobre la superficie del sustrato. La capa arco iris actúa como una estructura de base y se reabsorbe durante este paso.

El tratamiento de estos implantes recubiertos con soluciones ácidas (SPS, Tabla 1) a 37ºC produjo la disolución completa de los componentes del mineral cristalizado (calcio y fosfato) (13), dejando atrás una matriz de proteínas fina (7 - 10 \mum), blanda y porosa (Figura 1b).

La microscopia electrónica por escáner reveló que el proceso de remineralización había convertido al capa de proteína a la morfología de película laminar original. También se observó sobre las películas cierto sobrecrecimiento de agrupamientos cristalinos de tipo rosa (Figura 1c). Los implantes desprovistos de la película de proteína film no se recubrieron con una capa mineralizada.

La espectometría Fourier Transform InfraRed (FT-IR, Perkin-Elmer, Spectrum 1000) utilizando bolas transparente KBr ) de la película original mineralizada muestra claramente la característica de doblete de fosfato 563 y 602 cm^{-1} (figura 2a). Este doblete está ausente después de la desmineralización (figura 2b). El doblete fosfato reaparece después de la remineralización (figura 2c). El BSA muestra un gran pico debido a OH, >NH y agua absorbida en torno a 3500 cm^{-1} y bandas características de >C=O y -COO- a 1640 cm^{-1} y 1550 cm^{-1}.

Las películas de proteína eran insolubles en la solución tanto de pH ácido como neutro. Tras la liberación del recubrimiento, el espesor de la película BSA se midió utilizando una sonta de inducción magnética (Electrophysik Minitest 2100). El rango de medición de este aparato es entre 0 y 100 micras. Estas mediciones se repitieron 10 veces y se obtuvieron medias en cada muestra. Su espesor aumentaba a medida que la concentración de BSA en el baño de solución SCP aumentaba (Tabla 2).

TABLA 2

2

Los poros entre los cristales se mantienen como poros en la película de proteína desmineralizada (Tabla 2). El tamaño de cristal -y por lo tanto el tamaño de poro- disminuyó a medida que la concentración de BSA en la solución SCP se aumentaba. El espesor de la película de proteína desmineralizada aumentó en aproximadamente un 20% a 27% de película de precursor mineralizado con una concentración mayor de BSA. No se observaron cristales de apatita residuales en estas películas de proteína.

Análisis por rayos X de dispersión de energía (EDS, Voyager) mostraron evidencia de que el calcio residual y el fosfato en las películas de proteína estaban por debajo de 1,14% (Tabla 3).

TABLA 3

3

Cuando implantes que estaban cubiertos con estas películas de proteína se sumergen de nuevo en soluciones SCP (sin BSA) en las mismas condiciones, se recubrieron con una capa espesa (30\mum), densa de apatita (deducido de los resultados que se muestran en la Figura 3).

Otras realización de la invención se definen en las reivindicaciones.

Claims (21)

1. Un método que proporciona un recubrimiento proteináceo sobre un implante médico, que consiste en los pasos de:

- sumergir el implante en una primera solución acuosa que contiene una proteína e iones magnesio, calcio y fosfato a través de la cual se hace pasar un ácido débil gaseoso;

- desgasificar la solución;

- permitir que el recubrimiento precipite sobre el implante;

- sumergir el implante recubierto en una segunda solución para redisolver los iones magnesio, calcio y fosfato y obtener el recubrimiento proteináceo.

2. Un método de acuerdo a la reivindicación 1, en el que el ácido débil gaseoso es dióxido de carbono.

3. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en el que el implante es un implante metálico, orgánico, polimérico o cerámico.

4. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los iones calcio y fosfato se encuentran en la primera solución en una relación molar entre 1 y 3, preferiblemente entre 1,5 y 2,5.

5. Un método de acuerdo a la reivindicación 4, en el que la primera solución contiene iones calcio en una concentración de 0,5-50 mM, preferiblemente 2,5-25 mM, e iones fosfato en una concentración de 0,5-20 mM, preferiblemente 1-10 mM.

6. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la primera solución contiene iones magnesio en una concentración de 0,1-20 mM, preferiblemente 1,5-10 mM.

7. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la primera solución contiene además iones carbonato en una concentración de 0-50 mM, preferiblemente 0-42 mM.

8. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la fuerza iónica de la primera solución se encuentra en el intervalo de 0,1-2 M, preferiblemente de 0,15-1,5 M.

9. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la presión del ácido débil gaseoso se encuentra en el intervalo de 0,1-10 bar, preferiblemente de 0,5-1,5 bar.

10. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la temperatura de la primera y segunda soluciones se elige independientemente en el intervalo de 5 a 80ºC, preferiblemente de 5 a 50ºC.

11. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína se elige entre el grupo de albúmina, caseína, gelatina: lisozima, fibronectina, fibrina, chitosan, polilisina, polialanina, policisteína, factores de crecimiento, y sus combinaciones.

12. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína se encuentra en la primera solución en una concentración de entre 0,001 y 10 g/l.

13. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la segunda solución es una solución acuosa ácida.

14. Un método de acuerdo a la reivindicación 13, en el que la segunda solución tiene un pH de entre 2 y 5.

15. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la segunda solución contiene un agente secuestrante o acomplejante.

16. Un método de acuerdo a la reivindicación 15, en el que el agente secuestrante o acomplejante es etilendiaminotetraacetato.

17. Un método de acuerdo a la reivindicación 15 ó 16, en el que el agente secuestrante se encuentra en una concentración entre un 0,1 y un 20% del peso.

18. Un implante médico que consiste en un recubrimiento proteináceo que se puede obtener con un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

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19. Un implante médico de acuerdo a la reivindicación 18, en el que el recubrimiento proteináceo tiene un grosor en el intervalo de 0,5 a 100 micras.

20. El uso de un recubrimiento proteináceo que se puede obtener con un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-17 para la fabricación de un implante médico útil como un soporte para la reconstrucción de tejidos óseos.

21. El uso de un recubrimiento proteináceo que se puede obtener con un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-17 para la fabricación de un implante médico para inducir la mineralización o formación de tejido óseo.