ES2350939T3

ES2350939T3 - Implantes recubiertos, su fabricación y uso de los mismos.

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Publication number: ES2350939T3
Application number: ES05715889T
Authority: ES
Inventors: Klaus Hellerbrand; Karin Wiedenmann-Schlembach; Bernd Schimkat; Michael Siedler; Andreas Schutz
Original assignee: Scil Technology GmbH
Current assignee: Bionet Pharma GmbH
Priority date: 2004-03-10
Filing date: 2005-03-09
Publication date: 2011-01-28
Anticipated expiration: 2025-03-09
Also published as: ATE478008T1; DE602005022998D1; PL1737734T3; CN1938194B; CN1938194A; JP2007527758A; WO2005089829A3; CA2558395C; PT1737734E; US8372419B2; WO2005089829A2; CA2558395A1; JP4944010B2; US20070202144A1; DK1737734T3; EP1737734A2; EP1737734B1

Abstract

Método de recubrimiento de un dispositivo con una sustancia que comprende las etapas de: (a) proporcionar un recipiente que tiene un espacio para alojar dicho dispositivo que va a recubrirse; (b) proporcionar en dicho espacio una disolución de dicha sustancia de recubrimiento; (c) insertar dicho dispositivo en dicha disolución de dicha sustancia dentro de dicho recipiente, en el que puede revertirse el orden de las etapas (b) y (c); y (d) iniciar el secado isotérmico de dicho dispositivo mientras que está ubicado en dicho recipiente en contacto con dicha disolución, y eliminando de ese modo componentes volátiles de dicha disolución de dicha sustancia.

Description

La presente invención se refiere a un método de recubrimiento de un dispositivo, preferiblemente implantes, con una sustancia que comprende las etapas de (a) proporcionar un recipiente que tiene un espacio para alojar dicho dispositivo que va a recubrirse, (b) proporcionar en dicho espacio una disolución de dicha sustancia de recubrimiento, (c) insertar dicho dispositivo en dicha disolución de dicha sustancia dentro de dicho recipiente, en el que puede revertirse el orden de las etapas (b) y (c), y (d) iniciar el secado isotérmico de dicho dispositivo mientras que está ubicado en dicho recipiente en contacto con dicha disolución, y eliminando de ese modo componentes volátiles de dicha disolución de dicha sustancia. La presente invención también se refiere a un recipiente de empaquetamiento para un dispositivo, comprendiendo dicho recipiente un receptáculo que se ubica coaxialmente dentro de la carcasa del recipiente, siendo dicho receptáculo para alojar dicho dispositivo que va a recubrirse y estando adaptado de tal manera que dicho dispositivo puede recubrirse con una sustancia directamente dentro de dicho recipiente, en el que la superficie interna de dicho receptáculo se recubre con una capa de material inerte y repelente. Además, la presente invención usa el método bien conocido de recubrimiento de las superficies internas de un recipiente de empaquetamiento para un dispositivo, preferiblemente implantes, para lograr la deposición dirigida de la sustancia sobre el implante, que comprende las etapas de (a) siliconar dichas superficies internas de dicho recipiente usando una emulsión de silicona y (b) termocurar para formar una capa de silicona secada al horno sobre dichas superficies internas de dicho recipiente. La presente invención se refiere también al uso de dicho método de recubrimiento de dispositivos para mejorar la distribución homogénea del recubrimiento sobre el dispositivo.

Además, la presente invención se refiere a un kit que comprende un recubrimiento y recipiente de empaquetamiento y a

un dispositivo recubierto obtenido mediante el método de la presente invención.

Durante las últimas décadas, se han descrito muchos métodos para mejorar la calidad de implantes con respecto a su biocompatibilidad e interacción con el tejido circundante. Las exigencias para los implantes son extremas (por ejemplo para implantes óseos, porque tales dispositivos tienen que fijarse rígidamente al hueso y ser estables a por ejemplo alta presión, dientes, articulaciones). Otra aplicación de los implantes recubiertos son las endoprótesis liberadoras de fármacos para superar la reestenosis de arterias coronarias u otras. La respuesta inicial del tejido tras la implantación depende de la presencia de factores de crecimiento específicos liberados de los tejidos circundantes que estimulan la diferenciación y el crecimiento celulares para potenciar la incorporación y modulación del crecimiento celular.

Aunque hay métodos de fijación bien establecidos para implantes dentales, todavía hay una tendencia a que se aflojen con el tiempo. Se ha descrito una variedad de enfoques con el fin de mejorar la incorporación del implante respectivo (osteointegración). Estos enfoques incluyen el recubrimiento de implantes de diferentes fuentes (por ejemplo, material cerámico, metal u otros, véase el documento EP-B1-0 657 146) con materiales biodegradables (por ejemplo, fosfato de tricalcio, hidroxilapatita, apatita carbonatada, hidroxilapatita deficiente en calcio) y diversos métodos para pretratar la superficie del dispositivo (por ejemplo, el decapado de superficies de metal; véanse los documentos EP-A-0 389 713, WO 95/13101, EP-A-1 251 889). Se supone que las irregularidades de superficie en el intervalo nanométrico y micrométrico mejoran el crecimiento celular y de colágeno hacia el interior (T. Albrektsson en: Handbook of Biomaterials (Black, J y Hastings, G (eds.), Chapman & Hall, Londres, 1998, págs. 500 -512).

El recubrimiento de implantes de metal con superficies cerámicas se describe como por ejemplo la mezcla de dos polvos, un polvo de metal y un polvo que contiene fosfato de calcio

(documento EP-A-0 467 948) procesados con el material de implante durante un proceso de sinterización.

El documento US 2003/0204239 se refiere a una endoprótesis endovascular recubierta con un recubrimiento conservante que comprende un agente bioactivo seleccionado de proteína, análogo de proteína, sacárido y derivado del mismo, una matriz polimérica y un conservante incluyendo al menos un antioxidante. El recubrimiento puede aplicarse a la endoprótesis mediante inmersión, pulverización, pintura o cualquier otro método adecuado. Después de eso, la endoprótesis se seca bajo nitrógeno de secado u otro entorno adecuado.

El documento WO 03/043673 se refiere a un dispositivo que tiene propiedades osteoinductoras y osteoconductoras así como a un método para preparar el mismo.

Se describe una variedad de otros métodos de sinterización para fabricar material cerámico compuesto (documentos DE-A-29 28 007, US-A-4 882 196, EP 1251889). Se establece como enfoque principal el recubrimiento de superficies de metal con fosfatos de calcio como fosfato de tricalcio o hidroxiapatita (Y. Tsui et al. (1998), Plasma sprayed hydroxyapatite coatings on titanium substrates, Biomaterials, 19: 2031-43, 19: 2015-29), que permiten una incorporación mejorada de los implantes (documentos US-A-6 312 472; US-A-2002/0038149). Los fosfatos de calcio descritos y una variedad de otros materiales biocompatibles inorgánicos tienen la característica de formar poros. Se dice que estos poros potencian la incorporación del implante en el hueso nativo (documentos WO 00/72776; US-A-4 051 598; EP-A-0 806 211, Jennissen, H. et al. (2001), Biomaterialien, 2: 45-53) ya que el hueso nativo crece hacia el interior de los poros al mismo tiempo que se biodegrada la capa de fosfato de calcio inorgánico del implante (documentos WO 96/10370; WO 01/97679). Además de los implantes de material compuesto se describen implantes que consisten en capas, en los que la capa inferior del implante, que comprende a menudo metales o aleaciones como titanio o aleación de titanio (documentos WO 98/43550; WO 00/72777) se recubre con una capa de los fosfatos de calcio (documento EP-A-0 478 532). Normalmente se logra el

recubrimiento con fosfatos de calcio mediante tratamiento hidrotérmico (documento EP-A-0 548 365) o mediante remojo y precipitación (documentos US-A-6 129 928; WO 97/41273) o pulverización de plasma (documentos US-A-5 697 997; US-A-6 113 993; EP-A-0 548 365, EP-A-0 739 191; Lichtinger, T.K. et al. (2001), Mat.-wiss. u. Werkstofftech, 32: 937-941).

La capa de fosfato de calcio sobre el cuerpo principal del implante puede ser parte de o bien una mezcla de materiales dentro de una capa (documentos WO 98/48862; US-A-5 934 287; USA-2002/0033548) o bien una formación de múltiples capas (documentos WO 02/09788; US-A-6 322 728).

Además de las modificaciones de la superficie, se describen varios métodos en los que se recubren proteínas o mezclas de proteínas (principalmente factores de crecimiento) sobre implantes dentales u ortopédicos. Se dice que estas proteínas aceleran significativamente la incorporación de implantes (Lichtinger, T.K. et al. (2001), Mat.-wiss. u. Werkstofftech,

32: 937-941; Shah, A. et al. (1999), Biology of the cell 91: 131-142). Se describen varios métodos para el recubrimiento directo de proteínas sobre las superficies de metal. Sin embargo, estos métodos tienen varias desventajas, especialmente la liberación rápida de proteínas a partir de la superficie de metal, lo que no permite el mantenimiento de la proteína durante el intervalo de tiempo necesario para la inducción de la formación ósea (Lichtinger, T.K. et al. (2001), Mat.-wiss. u. Werkstofftech, 32: 937-941).

Con el fin de evitar la liberación rápida inicial (arranque espontáneo) de la proteína, Endo (Endo K. et al. (1995), Dental Materials Journal 14: 185-198) y Voggenreiter (Voggenreiter G et al. (2001), Materialwiss. Werkstofftech. 32: 942-948) describen la inmovilización de las proteínas mediante unión covalente a la superficie de metal. Se mantiene la actividad de las proteínas respectivas. Sin embargo, la unión covalente puede inducir cambios estructurales, que tienen un impacto sobre la actividad e inmunogenicidad de las proteínas.

Muchos investigadores han afirmado que la implantación exitosa de los factores osteogénicos para la formación de hueso

endocondral requiere que las proteínas se asocien con una matriz

o un material portador adecuado o matriz que mantenga las proteínas en el sitio de aplicación (documento US-A-5 344 654). Con el fin de superar estas dificultades, el documento US-A-5 258 029 enseña que la proteína osteogénica de la invención se formulará normalmente en cantidades osteogénicamente eficaces con portadores fluidos o sólidos farmacéuticamente aceptables. Preferiblemente, las formulaciones incluyen una matriz que puede proporcionar una estructura para desarrollar hueso y cartílago. Las posibles matrices pueden ser biodegradables o no biodegradables, y pueden definirse química o biológicamente. La

suspensión de la proteína TGF- y el portador se seca y posteriormente se aplica a la prótesis que lleva la carga. Las desventajas de estos métodos son el uso de colágenos derivados de animales o componentes inorgánicos, que pueden erosionarse durante la implantación.

Se describe un método adicional para superar el lavado superficial rápido de la proteína por Lichtinger et al. (2001), citado anteriormente, que trata la superficie de aleación de titanio con ácido cromosulfúrico con el fin de lograr superficies bioadhesivas ultrahidrófilas. Sin embargo, debe evitarse el ácido cromosulfúrico durante la fabricación de productos farmacéuticos o dispositivos médicos ya que cantidades residuales de tal ácido que permanecen sobre la superficie pueden provocar la oxidación de la proteína con cambios estructurales y funcionales posteriores y también pueden provocar daño al paciente (Ficha de datos de seguridad del material Cr (VI)).

Se describen métodos adicionales en los documentos WO 00/72777 y WO 00/72778 que usan un depósito que está formado por una disposición de poros de una capa de óxido gruesa sobre la superficie de titanio o mediante huecos, canales o espacios internos. Sin embargo, se sabe bien que las proteínas tienden a oxidarse en presencia de metales e iones de metal (Li et al. (1997), especialmente elementos de transición con actividad catalítica en contacto con oxígeno en ausencia de cualquier

sustancia protectora, Ann. Occup. Hyg. 41, supl. 1, 379 -383). Por tanto, un inconveniente de los dispositivos mencionados anteriormente puede ser que las proteínas se oxidan sobre las superficies de los implantes. La oxidación puede dar como resultado cambios estructurales, que pueden dar como resultado la formación de reacciones inmunogénicas y la pérdida de actividad.

El documento WO 02/39946 describe un sistema de empaquetamiento y suministro para partículas de injerto óseo.

El documento US 5.335.769 se refiere a un recipiente de vidrio recubierto internamente con una silicona y que tiene un producto sólido liofilizado in situ en el mismo, y a un procedimiento para fabricar el mismo. El documento WO 00/21745 se refiere a un material de empaquetamiento de esterilización sellable y el documento EP 1 072 31 describe un método para el recubrimiento de superficies internas de dispositivos de empaquetamiento primario tal como una jeringa.

Otro inconveniente de los dispositivos recubiertos conocidos hasta la fecha es que no se recubren homogéneamente con una sustancia bioactiva, lo que hace que tales dispositivos no sean suficientemente adecuados para, por ejemplo la implantación. Hay varios motivos por los que los dispositivos pueden verse afectados por tales desventajas. Por ejemplo, la sustancia recubierta que es una proteína se degrada o se oxida durante el proceso de recubrimiento y/o precipita dando agregados insolubles o está presente en cantidades insuficientes. Por consiguiente, el recubrimiento no ejerce el efecto biológico deseado, por ejemplo inducción de crecimiento óseo o atracción de posibles células que forman hueso. Además, las disoluciones de recubrimiento de la técnica anterior también contienen a menudo componentes tóxicos, por ejemplo disolventes orgánicos, que se usan para solubilizar la sustancia, que debe recubrirse sobre un implante. Por supuesto, no se desean ya sustancias tóxicas sobre implantes médicos (EMEA, ICH tema Q 3 C, Impurities: Residual solvents). Hasta la fecha, los dispositivos, por ejemplo, implantes de metal, se recubren principalmente de manera manual con una disolución de

recubrimiento, lo que es un proceso intensivo laborioso y difícilmente aplicable en condiciones de BPF. Sin embargo, la demanda de dispositivos recubiertos para su uso como implantes en diversos campos de aplicaciones médicas ha aumentado drásticamente. Por tanto, todavía hay una necesidad del recubrimiento económico de dispositivos asépticos particularmente con respecto a su producibilidad en cantidades a gran escala que tengan calidad de BPF.

Por consiguiente, el problema técnico que subyace a la presente invención es proporcionar un método mejorado para recubrir un dispositivo, preferiblemente un implante, con una sustancia, y proporcionar un recipiente para su uso en dicho método. El objetivo es garantizar un método económico para depositar la sustancia cuantitativa y homogéneamente sobre el dispositivo. Esto abarca la realización comercial, especialmente en procesamiento aséptico del estado de la técnica y farmacéuticamente aceptable. Este problema se resuelve con las características de las reivindicaciones.

Según un primer aspecto, la presente invención proporciona un método de recubrimiento de un dispositivo con una sustancia que comprende las etapas de: (a) proporcionar un recipiente que tiene un espacio para alojar dicho dispositivo que va a recubrirse, (b) proporcionar en dicho espacio una disolución de dicha sustancia de recubrimiento, (c) insertar dicho dispositivo en dicha disolución de dicha sustancia dentro de dicho recipiente, en el que puede revertirse el orden de las etapas

(b) y (c), y (d) iniciar el secado isotérmico de dicho dispositivo mientras está ubicado en dicho recipiente en contacto con dicha disolución, y eliminando de ese modo componentes volátiles de dicha disolución de dicha sustancia. Según la invención el recipiente satisface ambas propiedades como vasija de recubrimiento y recipiente de empaquetamiento primario para el dispositivo recubierto. La eliminación de componentes volátiles influye, particularmente desplaza por ejemplo el valor de pH de la disolución para controlar la solubilidad de la sustancia a un valor deseado.

Cuando se usa en el contexto de la presente invención, los términos “sustancia” y “sustrato” se usan de manera intercambiable.

La sustancia es preferiblemente una sustancia farmacéuticamente activa tal como una proteína o un péptido, un polisacárido (Schnaar et al., 1978, Adhesion of hepatocytes to polyacrylamide gels derivitized with N-acetylglucosamine, J. Biol. Chem. 253, 7940-7951), un glicolípido (Blackbourn y Schnaar, (1983) J. Biol. Chem., 258(2), 1180-1188) o un péptido

o una molécula pequeña. Los términos “proteína” o “péptido” se usan de manera intercambiable en el contexto de la presente invención.

Un ejemplo de una proteína es una proteína osteoinductora disuelta, preferiblemente un miembro de la superfamilia de TGF. Dentro del alcance de dicha sustancia farmacéuticamente activa están combinaciones de una o más proteínas, péptidos o moléculas pequeñas tal como se describe a continuación. También se prevén combinaciones de proteínas, péptidos o moléculas pequeñas.

Se ha demostrado que la familia de TGF- de factores de crecimiento y diferenciación participa en numerosos procesos biológicos que comprenden la formación ósea. Todos los miembros de dicha familia son péptidos secretados que comprenden una estructura de dominios característica. En el mismo extremo N-terminal, los miembros de la familia de TGF- comprenden un péptido de señal o líder de secreción. A esta secuencia le sigue en el extremo C-terminal el prodominio y la secuencia del péptido maduro. La secuencia del péptido maduro comprende siete cisteínas conservadas, seis de las cuales se requieren para la formación de enlaces disulfuro intramoleculares mientras que se requiere una para la dimerización de dos péptidos. El miembro de la familia de TGF- biológicamente activo es un dímero, preferiblemente compuesto por dos péptidos maduros. Habitualmente, los miembros de la familia de TGF- se secretan como proproteínas que comprenden además de la secuencia madura el prodominio. Los prodominios se eliminan por escisión

extracelularmente y no son parte de la molécula de señalización. Sin embargo, se ha notificado, que puede(n) requerirse el/los prodominio(s) para la estabilización extracelular de los péptidos maduros. En el contexto de la presente invención, la

expresión “miembro de la familia de TGF-“ o las proteínas de dicha familia a las que se hace referencia a continuación abarcan todas las variantes biológicamente activas de dichas proteínas o miembros y todas las variantes así como sus precursores inactivos. Por tanto, proteínas que comprenden meramente la secuencia madura así como proteínas que comprenden la proteína madura y el prodominio o la proteína madura, el prodominio y la secuencia líder se encuentran dentro del alcance de la invención así como fragmentos biológicamente activos de las mismas. Puede determinarse fácilmente si un fragmento de un miembro de TGF- tiene la actividad biológica mediante ensayos biológicos descritos, por ejemplo en: Katagiri et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 172: 295-299 o Nishitoh et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 21345-21352.

Preferiblemente, puede determinarse la actividad biológica según la invención mediante modelos in vivo tal como se describe en el documento WO 03/043673. Además, se abarcan mediante la

presente invención variantes de los miembros de TGF- que tienen secuencias de aminoácidos que son al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% idénticas a las secuencias de aminoácidos de los miembros de la familia de TGF.

Se proporciona una visión general de los miembros de la superfamilia de TGF- en: Wozney JM, Rosen V (1998) Clin Orthop

346: 26-37. Pueden obtenerse las secuencias de aminoácidos de los miembros de la familia de TGF- a partir de las bases de datos bien conocidos tales como Swiss-Prot a través de Internet

(http://www.expasy.ch/sprot/sprot-top.html). Más preferiblemente, dicho miembro de la familia de TGF- es un miembro de la subfamilia de BMP. Se ha demostrado que los miembros de la subfamilia de la proteína morfogenética ósea

(BMP) participan, entre otros, en la inducción y remodelación del tejido óseo. Las BMP se aislaron originalmente de la matriz ósea. Estas proteínas se caracterizan por su capacidad para inducir nueva formación ósea en sitios ectópicos. Diversos estudios in vivo demostraron la estimulación de la osteogénesis y condrogénesis de células precursoras mediante las BMP y suscitaron la posibilidad de que cada molécula de BMP tuviese papeles distintos durante el desarrollo esquelético. Se describen más detalles acerca de las propiedades moleculares y biológicas de las BMP en: Wozney JM, Rosen V (1998) citado anteriormente, Schmitt et al. (1999), J Orthop Res 17: 269-278 y Lind (1996), Acta Orthop Scand 67: 407-17. Los miembros de la familia de proteínas morfógenas incluyen la proteína osteogénica-1 de mamíferos (OP-1, también conocida como BMP-7, y el homólogo 60A de Drosophila), proteína osteogénica-2 (OP-2, también conocida como BMP-8), proteína osteogénica-3 (OP-3), BMP-2 (también conocida como BMP-2A o CBMP-2A, y el homólogo DPP de Drosophila), BMP-3, BMP-4 (también conocida como BMP-2B o CBMP-2B), BMP-5, BMP-6 y su homologo murino Vgr-1, BMP-9, BMP10, BMP-11, BMP-12, GDF-3 (también conocida como Vgr2), GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, GDF-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, GDF-5 (también conocida como CDMP-1 o MP52), GDF-6 (también conocida como CDMP-2), GDF-7 (también conocida como CDMP-3), el homologo Vgl y NODAL de Xenopus, UNIVIN, SCREW, ADMP y NEURAL. Los miembros de esta familia codifican para cadenas peptídicas secretadas que comparten características estructurales comunes, incluyendo el procesamiento a partir de un precursor “proforma” para producir una cadena peptídica madura que puede dimerizarse y que contiene un dominio activo carboxilo-terminal, de aproximadamente 97-106 aminoácidos. Todos los miembros comparten un patrón conservado de cisteínas en este dominio y la forma activa de estas proteínas puede ser o bien un homodímero unido por puentes disulfuro de un único miembro de la familia o bien un heterodímero de dos miembros diferentes (véanse, por ejemplo Massague (1990), Annu. Rev. Cell Biol. 6: 597; Sampath et al. (1990), J. Biol. Chem. 265: 13198). Véanse también la patente estadounidense n.º 5.011.691; las patentes estadounidense n.º

5.266.683, Ozkaynak et al. (1990), EMBO J. 9: 2085-2093, Wharton et al. (1991), PNAS 88:9214-9218), (Ozkaynak (1992), J. Biol. Chem. 267: 25220-25227 y la patente estadounidense n.º 5.266.683); (Celeste et al. (1991), PNAS 87:9843-9847); (Lyons et al. (1989), PNAS 86:4554-4558). Estas descripciones describen las secuencias de aminoácidos y ADN, así como las características químicas y físicas, de estas proteínas osteogénicas. Véanse también, Wozney et al. (1988), Science 242:1528-1534; BMP 9 (documento WO93/00432,); DPP (Padgett et al. (1987), Nature 325:81-84; y Vg-1 (Weeks (1987) Cell 51: 861867).

Preferiblemente, dicho miembro de la familia de BMP es BMP1, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-14 o BMP-16.

Lo más preferiblemente, dicho miembro de la familia de BMP es BMP-2 o BMP-7. La secuencia de aminoácidos de la preproforma de BMP-2 está depositada con el número de registro de Swiss-Prot P12643 (número de registro de Genebank GI: 115068). Los aminoácidos 1 a 23 corresponden a la secuencia señal, los aminoácidos 24 a 282 corresponden al propéptido y los aminoácidos 283 a 396 corresponden a la proteína madura. La secuencia de aminoácidos para la preproforma de BMP-7 está depositada con el número de registro de Swiss-Prot P18075 (número de registro de Genbank GI: 115078). Preferiblemente, BMP-2 o BMP-7 se refiere a la preproforma, a la proforma o al péptido BMP-2 o BMP-7 maduro, respectivamente. Además, también se abarcan fragmentos de dichas proteínas que tienen esencialmente la misma actividad biológica, preferiblemente propiedades osteoinductoras. A continuación se proporciona más información de secuencia de BMP-2 y BMP-7. También más

preferiblemente, dicho miembro de la familia de TGF- es un GDF. Se ha mostrado que el factor de crecimiento y diferenciación (GDF) participa, entre otros, en la inducción y remodelación del tejido óseo. El factor de crecimiento y diferenciación 5 (GDF5), también conocido como proteína morfogenética derivada de cartílago 1 (CDMP-1), es un miembro del subgrupo de la familia

de BMP, que también incluye otras proteínas relacionadas, preferiblemente, GDF-6 y GDF-7. La forma madura de la proteína es un homodímero de 27 kDa. Diversos estudios in vivo e in vitro demuestran el papel de GDP-5 durante la formación de diferentes características morfológicas en el esqueleto de mamíferos. Las mutaciones de GDF-5 son responsables de anomalías esqueléticas incluyendo la disminución de la longitud de los huesos largos de las extremidades, el desarrollo anómalo de las articulaciones en las extremidades y el esternón (Storm & Kingsley (1999), Development Biology, 209, 11-27). La secuencia de aminoácidos entre el ratón y el ser humano está sumamente conservada.

Preferiblemente, dicho miembro de la subfamilia de GDF es GDF-1, GDF-3, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10 o GDF-11.

Más preferiblemente, dicho miembro de la subfamilia de GDF es GDF-5. La secuencia de aminoácidos para la preproforma del GDF-5 está depositada con el número de registro de Swiss-Prot P 43026 (número de registro de Genbank GI: 20141384). Preferiblemente, GDF-5 se refiere a la preproforma, a la proforma o al péptido GDF-5 maduro. Además, también se abarcan fragmentos de GDF-5 que tienen esencialmente la misma actividad biológica, preferiblemente propiedades osteoinductoras.

Se describen ejemplos adicionales de miembros de la familia de TGF- que se prevé que estén recubiertos sobre un dispositivo de la presente invención, por ejemplo, en los documentos EP-B1 0 372 031, EP-A2 0 723 013, EP-A2 1 221 484, EP-B1 0 362 367, EPA2, 1 225 225, EP-B1 0 714 665, EP-A1 0 646 022, EP-B1 0 584 283, EP-B1 0 448 704, EP-B1 0 643 767, EP-B1 0 812 207, EP-A1 1 220 693, EP-A1 1 223 990, EP-A1 1 150 725, EP-B1 0 679 097, EPB1 0 601 106, EP-A2 0 601 135, EP-A1 0 972 520 o EP-B1 0 575

555.

Todavía otras proteínas útiles incluyen proteínas codificadas por los ADN que pueden hibridarse con un ADN que codifica para una proteína osteogénica tal como se describe en el presente documento, y análogos relacionados, homólogos, muteínas (variantes biosintéticos) y similares. Las publicaciones que dan a conocer tales secuencias de ADN, así

como sus propiedades químicas y físicas, incluyen: OP-1 y OP-2: patente estadounidense n.º 5.011.691, patente estadounidense n.º 5.266.683, Ozkaynak et al. (1990), EMBO J. 9: 2085-2093; OP-3: documento WO94/1020 (PCT US93/10520); BMP-2, BMP-3, BMP-4: documento WO88/00205, Wozney et al. (1988), Science 242:15281534); BMP-5 y BMP-6: Celeste et al. (1991), PNAS 87: 9843-9847; Vgr-1: Lyons et al. (1989), PNAS 86: 4554-4558; DPP: Padgett et al. (1987), Nature 325: 81-84; Vg-1: Weeks (1987), Cell 51: 861867; BMP-9: documento WO95/33830 (PCT/US95/07084); BMP-10: documento WO94/26893 (PCT/US94/05290); BMP-11: documento WO94/26892 (PCT/US94/05288); BMP-12: documento WO95/16035 (PCT/US94/14030); BMP-13: documento WO95/16035 (PCT/US94/14030); GDF-1: documento WO92/00382 (PCT/US91/04096) y Lee et al. (1991), PNAS 88: 4250-4254; GDF-8: documento WO94/21681 (PCT/US94/03019); GDF-9: documento WO94/15966 (PCT/US94/00685); GDF-10: documento WO95/10539 (PCT/US94/11440); GDF-11: documento WO96/01845 (PCT/US95/08543); BMP-15: documento WO96/36710 (PCT/US96/06540); MP121: documento WO96/01316 (PCT/EP95/02552); GDF-5 (CDMP-1, MP52): documento WO94/15949 (PCT/US94/00657) y WO96/14335 (PCT/US94/12814) y WO93/16099 (PCT/EP93/00350); GDF-6 (CDMP-2, BMP-13): documento WO95/01801 (PCT/US94/07762) y WO96/14335 y WO95/10635 (PCT/US94/14030); GDF-7 (CDMP-3, BMP12): documento WO95/10802 (PCT/US94/07799) y WO95/10635 (PCT/US94/14030). En otra realización, las proteínas útiles incluyen constructos biosintéticos biológicamente activos, incluyendo proteínas morfogénicas biosintéticas novedosas y proteínas quiméricas diseñadas usando secuencias de dos o más morfógenos conocidos. Véanse también los constructos biosintéticos dados a conocer en la patente estadounidense n.º

5.011.691 (por ejemplo COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7 y COP16). En el contexto de la presente invención, se prefiere un

péptido o una molécula pequeña, que tenga la actividad biológica de una proteína que es un miembro de la familia de TGF-. Más preferiblemente, el péptido o la molécula pequeña tiene propiedades osteoinductoras y/o osteogénicas. Pueden

determinarse estas propiedades mediante métodos descritos en el presente documento o en el documento WO 03/043673. El término “osteoinductora” se refiere a la capacidad de transformación de células madre mesenquimales y preosteoblastos en osteoblastos. Un requisito previo para la osteoinducción es una señal, que se distribuye por el dispositivo a los tejidos circundantes en los que los precursores de osteoblastos mencionados anteriormente y otras células mesenquimales se activan. La osteoinducción tal como se usa en el presente documento abarca la diferenciación de células mesenquimales en células precursoras óseas, los osteoblastos. Además, la osteoinducción también comprende la diferenciación de dichos osteoblastos en osteocitos, las células maduras del hueso. Por tanto, la osteoinducción requiere la diferenciación de células no diferenciadas o menos diferenciadas en osteocitos, que pueden formar el hueso. Tal como se ha descrito anteriormente, las proteínas osteoinductoras usadas según la presente invención se liberan lentamente desde el dispositivo tras su implantación y se distribuyen eficazmente en los tejidos circundantes. Además, las proteínas y los péptidos abarcados por la presente invención tienen propiedades osteoinductoras in vivo. Por ejemplo, se conoce bien en la técnica que la superfamilia de factor de crecimiento

transformante- (TGF-) abarca miembros que tienen propiedades osteoinductoras. Se enumeran anteriormente y a continuación y se describen en el presente documento miembros individuales de dicha superfamilia de TGF- que tienen propiedades osteoinductoras bien particulares. En conclusión, las proteínas osteoinductoras del dispositivo de la presente invención sobre la superficie y tras haberse liberado del portador servirán como señal osteoinductora para los precursores de osteocitos del tejido que circunda el lado de implantación del dispositivo.

El término “osteogénica” describe la síntesis de nuevo hueso mediante osteoblastos. Según la presente invención, el hueso preexistente en los alrededores del lado de implantación del dispositivo crece hacia el interior del dispositivo usando

la estructura del dispositivo como matriz sobre la que pueden adherirse los osteocitos.

Ejemplos preferidos de sustancias farmacéuticamente activas son péptidos tales como interleucinas, EGF, PDGF, IGF, FGF, TGFalfa, TGF-beta, hirudina, activador tisular del plasminógeno y variantes, parathormona. Debe entenderse que una “variante” o “derivado” de cualquiera de las sustancias farmacéuticamente activas mencionadas anteriormente tiene la misma actividad o efecto que la sustancia farmacológica no modificada.

Los ejemplos preferidos de polisacáridos, lípidos o glicolípidos o moléculas pequeñas son heparina o sustancias miméticas de heparina, taxanos por ejemplo paclitaxen, antibióticos, esteroides u hormonas o fosforilcolina.

Otro ejemplo de una sustancia con la que un dispositivo, por ejemplo una endoprótesis o lentes oculares según la presente invención pueden recubrirse son recubrimientos orgánicos tales como Biogold. Biogold es un recubrimiento de polímero comercial, que consiste en hidrocarburos de cadena corta (documento USP 4.994.498, Biogold Cooperation). Otro ejemplo de una sustancia de recubrimiento inorgánica que puede recubrirse sobre un dispositivo, por ejemplo una endoprótesis de la presente invención es carburo de silicio (SiC), óxido de iridio. (Ozbek (1997), Cathet. Cardiovasc Diagn 41: 71-78) o TENISS que puede obtenerse de Tenax, Biotronik GmbH, Berlín, Alemania (Unverdorben M. (2000), J. of interventional cardiology 16(4): 325). SiC es una cerámica y consiste en carburo de silicio hidrogenado amorfo.

Polímeros sintéticos que pueden recubrirse aún sobre un dispositivo, por ejemplo una endoprótesis según la presente invención, tales como polímeros biocompatibles o degradables, son preferiblemente poli(ácido láctico), celulosa, poliuretanopoliéster-metacriloilfosforilcolina (PC), metacrilato de laurilo

o politetrafluoroetileno (PTFE). Además, se prevé que polímeros de origen natural se recubran sobre un dispositivo de la presente invención, tales como ácido hialurónico, sulfato de condroitina, quitosano, alginato o fibrina. Como ejemplo no limitativo de una proteína que puede recubrirse sobre un

dispositivo, por ejemplo endoprótesis de la presente invención, debe mencionarse un anticuerpo frente a la glicoproteína IIb/IIIa. Adicionalmente, se prevé que fármacos tales como taxanos (por ejemplo paclitaxel) se recubran sobre un dispositivo, por ejemplo una endoprótesis de la presente invención. Para una revisión que describe diversos recubrimientos de endoprótesis, aunque no limitativos, véase Sjoerd (2001), Curr. Intervent. Cardiol. Rep. 3: 28-36.

La sustancia farmacéuticamente activa descrita en el presente documento está en una realización preferida inmovilizada en un material o una matriz biorreabsorbible orgánica o inorgánica.

Alternativamente, la sustancia comprende componentes no activos. La expresión “no activo” cuando se usa en el contexto de la presente invención es intercambiable con el término “inactivo” y significa cualquier componente de un producto farmacológico destinado a proporcionar actividad farmacológica u otro efecto directo en el diagnóstico, la cura, la mitigación, el tratamiento o la prevención de una enfermedad, o a afectar la estructura o cualquier función del organismo de seres humanos u otros animales. Se describen principios inactivos, por ejemplo, en Brown (1983), N Engl J Med., 309: 439-441 o en American Academy of Pediatrics, Commitee on Drugs “Inactive” ingredients in pharmaceutical products. Pediatrics (1985), 76: 635-643. También esta disponible una lista de principios inactivos en la FDA. Tales componentes incluyen metionina, sacarosa o ácido acético.

También se abarca por la presente invención que la sustancia comprende cualquier clase de material cerámico como fosfatos de calcio. La expresión “fosfato de calcio” abarca composiciones que comprenden iones calcio, iones fosfato y, opcionalmente, iones o átomos adicionales que son adecuados para el portador de la presente invención, por ejemplo CO32-, F-, OH-, Mg2+. Los fosfatos de calcio tal como se usan según la presente invención son cristalinos o amorfos que tienen una estructura tridimensional adecuada para el dispositivo de la presente invención tal como se expuso anteriormente. A continuación se

proporciona en el presente documento una lista de fosfatos de calcio preferidos y bien conocidos. Dicho fosfato de calcio es fosfato de beta-tricalcio, fosfato de alfa-tricalcio, hidroxiapatita, apatita carbonatada o una hidroxiapatita deficiente en calcio o cemento que contiene fosfato de calcio.

Preferiblemente, un dispositivo recubierto según los métodos de la presente invención se recubre homogéneamente en la zona de interés con una sustancia descrita en el presente documento. Dicha sustancia esta preferiblemente en forma de una disolución. Dicha disolución puede componerse por el experto en la técnica basándose en la solubilidad de, por ejemplo, la proteína osteoinductora que depende del pH, la fuerza iónica y la influencia del portador sobre dichos parámetros tras poner en contacto el portador con dicha disolución. Según la presente invención se ha encontrado que una disolución adecuada para el método de la presente invención comprende sólo componentes que no influyen en el estado de oxidación de la proteína osteoinductora.

La expresión “homogéneamente recubierto” significa que la superficie del portador está recubierta en su totalidad con dicha proteína osteoinductora, por lo cual cantidades definidas y reproducibles esenciales de proteínas están presentes sobre la zona deseada de la superficie de dicho portador. Preferiblemente, un portador homogéneamente recubierto según esta invención presenta una cobertura máxima con la proteína osteoinductora sobre su superficie. El recubrimiento homogéneo es un requisito previo para la liberación eficaz y la distribución homogénea y la actividad de la proteína osteoinductora en el tejido que circunda el sitio de implantación. Además, debe entenderse que las proteínas osteoinductoras no están agregadas ni están parcial o totalmente inactivadas debido a precipitación o microprecipitación, más bien la unión de proteínas no agregadas, biológicamente activas debe lograrse mediante recubrimiento homogéneo. Dicho recubrimiento homogéneo puede lograrse mediante el método de la presente invención y tal como se describe en los ejemplos adjuntos. Además, se describen medios y métodos para controlar

el recubrimiento homogéneo, la cuantificación y la caracterización de la proteína inmovilizada en el documento WO 03/043673.

Según la presente invención, se inmoviliza la proteína o el péptido sobre la superficie del dispositivo. Se prefiere que la unión de dicha proteína o péptido al portador sea reversible. Por tanto, se prevé que la proteína o el péptido, que tiene propiedades osteoinductoras no se acople a la superficie (por ejemplo, metálica) del dispositivo por medio de unión covalente. Preferiblemente, se produce el acoplamiento a través de interacciones electrostáticas, interacciones hidrófobas o no electrostáticas, tales como las fuerzas de Van-der-Waals. Debido a la unión reversible de la proteína osteoinductora, se permite la disolución de dicha proteína una vez que se ha llevado el dispositivo a un entorno in vivo adecuado, tal como una cavidad ósea o una arteria. Preferiblemente, se libera lentamente dicha disolución de las proteínas permitiendo la difusión de la proteína al tejido que circunda el dispositivo. Por tanto, el dispositivo permite la presencia local de proteínas nativas, que aceleran la formación de, por ejemplo, nuevo hueso y el crecimiento hacia el interior del hueso en la superficie de la matriz o endoprótesis recubiertas inhibe la reestenosis rápida.

Se describen muchos métodos para la estabilización de proteínas en productos farmacéuticos. Sin embargo, los experimentos que subyacen a esta invención demostraron que las técnicas bien conocidas de estabilización de proteínas en formulaciones de proteínas líquidas o liofilizadas no pueden adaptarse directamente a la proteína adsorbida sobre una superficie de metal. El recubrimiento de proteínas sobre superficies cerámicas o de metal, por ejemplo titanio o aleaciones de titanio según los métodos dados a conocer en el estado de la técnica a los que se hizo referencia anteriormente provocan la aparición de especies modificadas de la proteína que dan como resultado agregación u oxidación de las proteínas (para más detalles véase el ejemplo 6). Además, incluso la adición de agentes reductores no disminuye la cantidad de proteína oxidada. Gracias al método de la presente invención, es posible fabricar

dispositivos que, tras su implantación, aumentarán eficazmente la formación de hueso. Ventajosamente, pueden evitarse los efectos secundarios indeseables, tales como inflamación debida a la inmunogenicidad potenciada de proteínas oxidadas. Además, el método de la presente invención permitirá un procedimiento de fabricación más económico y que consume menos tiempo para los dispositivos médicos de la presente invención porque el recubrimiento del metal o cuerpo de aleación del implante y el empaquetamiento pueden realizarse en un procedimiento de una etapa tal como se describe en el presente documento. Además, dicho procedimiento de una etapa garantiza la conservación de la actividad de la sustancia recubierta sobre el dispositivo o implante debido al secado rápido a temperatura baja tal como se describe en el presente documento y a la ausencia de oxígeno durante el proceso de recubrimiento así como en el recipiente de empaquetamiento. Otra ventaja es que el proceso de recubrimiento y empaquetamiento permite la producción en grandes cantidades, por lo cual la producción cumple con las normas de BPF para procesamiento aséptico en lugar de otras técnicas de aplicación para la disolución de recubrimiento mediante inmersión, goteo o pulverización. Por consiguiente, implantes recubiertos según los métodos descritos en el presente documento tienen la alta calidad aséptica deseada para aplicaciones médicas, especialmente por vía parenteral.

El dispositivo recubierto según los métodos de la invención puede ser un implante, lo que significa que los términos “dispositivo” e “implante” tal como se usan en el presente documento son intercambiables. Se conoce bien que el término “implante” se refiere a todo dispositivo tal como se proporciona mediante la presente invención que esté diseñado para disponerse total o parcialmente por debajo de la superficie epitelial (Koeck, B. y Wagner, W. (Eds.) 1996). El implante puede ser plano, compacto o de una forma compleja, es decir, puede usarse cualquier dispositivo operable o usado convencionalmente. Los implantes mencionados anteriormente oscilan desde una forma cilíndrica sencilla tal como se usa por ejemplo para la sustitución de huesos largos o como una base para dientes

artificiales, hasta implantes planos tal como se usa para la sustitución de huesos planos cefálicos y articulaciones artificiales como cadera, rodilla o codo. Tipos adicionales de implantes son implantes cerámicos biodegradables de forma tridimensional estructurada (porosa) (por ejemplo bloques o cilindros) de origen natural (bovino, ser humano) o material sintético (beta-TCP).

Preferiblemente, el implante o dispositivo es una entidad, que comprende al menos dos componentes. Uno de dichos componentes es un portador. Los portadores que pueden usarse dentro del significado de la presente invención incluyen portadores sólidos, tales como portadores de aleación o de metal completo, y matrices de aleación o de metal. Además la presente invención abarca portadores sólidos, que comprenden espacios huecos y cavidades. Además, dicho portador, preferiblemente, tiene una superficie alargada debido a la formación de macro y microporos. Preferiblemente, dichos macro o microporos están limitados a la capa de superficie del portador. También están abarcados por la presente invención portadores que consisten en al menos dos componentes diferentes, en los que se usa un componente de aleación o de metal como núcleo o capa de núcleo y se usa por ejemplo un material cerámico como capa de superficie. Esto también abarca la formación de implantes o prótesis quirúrgicas completas. Preferiblemente, estas prótesis están formadas por o recubiertas con superficies metálicas tal como se describirá a continuación con más detalle. Las prótesis se fabrican de titanio o aleaciones de titanio o acero inoxidable.

Antes de poner en contacto la disolución que comprende, por ejemplo, proteína osteoinductora disuelta con un portador que contiene una superficie de metal o una aleación de metal tal como se describe en el presente documento, preferiblemente se prevé que la superficie metálica respectiva se limpie o se trate para eliminar cualquier contaminante de superficie como gases atmosféricos (por ejemplo oxígeno) u otros contaminantes hidrófobos para promover una buena fuerza de adhesión del recubrimiento. Se conocen bien en la técnica varios métodos, que son adecuados para este fin, y también se muestran a modo de

ejemplo en los ejemplos adjuntos. Por ejemplo, la superficie metálica de los dispositivos de la invención puede enjuagarse con por ejemplo acetona, alcoholes alquílicos como etanol y luego calentarse para desorber contaminantes volátiles y después de eso enjuagarse con agua desmineralizada y destilada estéril.

En otro aspecto de la presente invención se prevé que el portador de dispositivos o implantes se seleccione del grupo que consiste en materiales orgánicos sintéticos, materiales inorgánicos sintéticos, materiales orgánicos de origen natural y materiales inorgánicos de origen natural. Origen natural significa compuestos que se producen en la naturaleza.

Preferiblemente, dichos materiales orgánicos sintéticos son poliglicolida (PGA), polilactida (PLLA), poli-D/L-lactida (PDLLA), poli(ácido glicólico-co-láctico) (PLGA), poli(ácido 3hidroxibutírico) (P(3-HB), poli(ácido 3-hidroxivalérico) P(3

HV), poli(p-dioxanona) (PDS), poli(-caprolactona) (PCL), polianhídrido (PA), poliortoéster, polietileno (PE), polipropileno (PP), poli(tereftalato de etileno) (PET), poliglactina, poliamida (PA), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), poli(metacrilato de hidroximetilo) (PHEMA), poli(cloruro de vinilo) (PVC), poli(alcohol vinílico) (PVA), politetrafluoroetileno (PTFE), polieteretercetona (PEEK), polisulfona (PSU), polietilenglicol (PEG), polivinilpirrolidona, poliuretano o polisiloxano. Debe entenderse que también se prevé cualquier combinación o copolímeros de los materiales orgánicos sintéticos mencionados anteriormente.

En otra realización preferida, dichos materiales inorgánicos sintéticos son acero 316L, aleación de cromo y cobalto, titanio, aleación de titanio tal como se describe en el presente documento, oro o platino. Debe entenderse que también se prevé cualquier combinación de los materiales inorgánicos sintéticos mencionados anteriormente.

En una realización preferida adicional, dichos materiales inorgánicos son fosfato de -tricalcio, fosfato de -tricalcio, hidroxilapatita, apatita carbonatada, óxido de aluminio, óxido de circonio, carbonato de calcio, sulfato de calcio o biovidrio.

Debe entenderse que también se prevé cualquier combinación de los materiales inorgánicos mencionados anteriormente.

Todavía en otra realización preferida, dichos materiales orgánicos de origen natural son colágeno, quitina, quitosano, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, alginato, hueso autólogo, gelatina o fibrina. Debe entenderse que también se prevé cualquier combinación de los materiales orgánicos mencionados anteriormente de origen natural.

En otra realización los materiales inorgánicos de origen natural son hueso calcificado o material derivado de coral.

También pueden usarse todos los materiales orgánicos o inorgánicos mencionados en el presente documento como portador para el principio activo farmacéutico, por ejemplo como agente de encapsulación o de transmisión/incrustación para lograr la inmovilización del fármaco, protección y/o estabilización y/o liberación controlada. Puede inmovilizarse dicha sustancia farmacéuticamente activa preferible en un material biorreabsorbible orgánico o inorgánico.

El dispositivo o implante recubierto según los métodos de la presente invención, preferiblemente, tiene una superficie alargada debido a modificaciones de superficie de malla, perlada

: o porosa. Tales modificaciones pueden introducirse mediante métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo medios químicos

: o mecánicos. Además, se ha mostrado que la superficie aumentada que tiene irregularidades en el intervalo nanométrico y micrométrico es beneficiosa para la osteointegración.

El término “osteointegración” cuando se usa en el presente documento significa que el hueso tiene la capacidad de formar nuevo hueso alrededor del implante y de integrarse con el implante. Integración significa la unión de células óseas a la superficie del implante dando como resultado un anclaje firme y permanente de la reconstrucción protésica bajo carga funcional sin dolor, inflamación ni aflojamiento. Se prevé que la osteointegración acompañada por la formación de nuevo hueso se lleve a cabo para el tratamiento de defectos traumáticos, malignos o artificiales, para el tratamiento de defectos dentales o para el tratamiento de articulaciones de cadera,

codo, columna vertebral, rodilla, dedo o tobillo o como material de relleno para defectos óseos. Los síntomas de las enfermedades y trastornos a los que se hace referencia anteriormente en el presente documento se describen con detalle en libros de texto convencionales de medicina, tal como Pschyrembel y Stedman.

La “nueva formación ósea” significa la formación de hueso endocondral o la formación de hueso intramembranoso. En seres humanos, la formación ósea empieza durante las primeras 6-8 semanas de desarrollo fetal. Las células madre progenitoras de origen mesenquimal migran a sitios predeterminados, en los que o bien: (a) se condensan, proliferan y se diferencian en células que forman hueso (osteoblastos), un proceso observado en el cráneo y denominado “formación ósea intramembranosa”; o bien,

(b) se condensan, proliferan y se diferencian en células que forman cartílago (condroblastos) como productos intermedios, que se sustituyen posteriormente por células que forman hueso. Más específicamente, las células madre mesenquimales se diferencian en condrocitos. Entonces los condrocitos se calcifican, experimentan hipertrofia y se sustituyen por hueso recién formado producido por osteoblastos diferenciados, que ahora están presentes en el sitio. Posteriormente, el hueso mineralizado se remodela extensamente, después de eso pasa a estar ocupado por un huesecillo relleno de elementos de la médula ósea funcionales. Este proceso se observa en huesos largos y se denomina “formación ósea endocondral”. En la vida posfetal, el hueso tiene la capacidad de repararse a sí mismo tras una lesión imitando el proceso celular del desarrollo óseo endocondral embrionario. Es decir, pueden inducirse células madre progenitoras mesenquimales de la médula ósea, el periostio y el músculo a que migren al sitio del defecto y comiencen la cascada de acontecimientos descritos anteriormente. Allí se acumulan, proliferan y se diferencian en cartílago, que se sustituye posteriormente por hueso recién formado.

También se describe en el presente documento que puede usarse un dispositivo o implante de la presente invención en un método para tratar una o más de las enfermedades a las que se hace referencia según los usos de la presente invención, en el

que dicho método comprende al menos la etapa de administrar el dispositivo de la invención o un dispositivo que puede obtenerse mediante el método de la invención en una forma farmacéuticamente aceptable a un sujeto. Preferiblemente, dicho sujeto es un ser humano.

El dispositivo o implante recubierto según la presente invención puede, además, comprender excipientes adicionales. Estos excipientes, por ejemplo, sacáridos, aminoácidos, polioles

o detergentes sirven para la estabilización o conservación de la proteína o el mantenimiento del pH, por ejemplo sustancias tampón. Otros excipientes preferidos abarcados por esta invención incluyen almidón o almidón modificado, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, caliza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, aceites naturales (por ejemplo, aceite de ricino), polietilenglicol, polipropilenglicol, propilenglicol, agua, etanol y similares.

El término “sacáridos” abarca mono, di y polisacáridos. Se conocen bien en la técnica la estructura y composición de mono, di y polisacáridos y se describen en libros de texto convencionales, tales como Römpp, lexicon of chemistry. Más preferiblemente, dicho sacárido es un disacárido. Lo más preferiblemente, dicho disacárido es sacarosa o trehalosa.

En otra realización preferida del dispositivo recubierto según la presente invención o el método de la invención dicho dispositivo esta libre de sustancias tóxicas.

La expresión “sustancias tóxicas”, preferiblemente, abarca aquellos aditivos y disolventes orgánicos tóxicos que se usan mediante los métodos descritos en la técnica, por ejemplo acetonitrilo. Dichas sustancias pueden provocar inflamación y otras reacciones tras la implantación de dispositivos que contiene dichas sustancias. Dichos dispositivos son terapéuticamente menos aceptables debido a dichos efectos secundarios indeseables que no pueden evitarse mediante los métodos de recubrimiento descritos en la técnica. Además, las orientaciones internacionales para el desarrollo de proteínas terapéuticas requiere que en el proceso de fabricación deben

evitarse sustancias toxicas y nocivas (para más detalles véase: International Conference on Harmonization (ICH), tema Q3C; www.emea.eu.int/). Sin embargo, el dispositivo de la presente invención o un dispositivo que puede obtenerse mediante el método de la presente invención, ventajosamente, está libre de o minimizado en dichas sustancias tóxicas y, por tanto, es terapéuticamente bien aceptable y satisface los requisitos de las autoridades reguladoras.

Además, en una realización preferida adicional del implante recubierto según la presente invención o el método de la invención dicho dispositivo está libre de material infeccioso.

Además de las sustancias tóxicas, el material infeccioso comprendido por el implante puede provocar infecciones graves en un sujeto en el que se ha trasplantado el dispositivo. Sin embargo, la gelatina potencialmente infecciosa derivada de huesos bovinos o porcinos se usa como proteína protectora en muchos métodos del estado de la técnica (M. Lind (1996), Acta Orthop Scand 67: 407-17).

El recubrimiento del dispositivo según los métodos de la invención con, por ejemplo, una proteína osteoinductora está destinado a iniciar y estimular la transformación de células madre mesenquimales en osteoblastos y condrocitos. Por consiguiente se prevé que sólo necesitan recubrirse las partes del dispositivo de la invención que se dirigen hacia el tejido óseo respectivo. Dicha parte es preferiblemente toda la superficie o al menos las partes de la misma que se yuxtaponen con el tejido óseo. Por ejemplo, un implante dental, que se usa para sustituir un diente que falta, comprende una parte roscada que se enrosca en el hueso de la mandíbula y una parte extendida (alveolo) que se usa para anclar una corona de diente artificial. Por consiguiente, sólo es necesario recubrir la parte roscada con la proteína osteoinductora. Sin embargo, la parte que no se recubre con la proteína osteoinductora puede recubrirse con otros agentes, tales como fosfatos de calcio, colágeno o agentes similares.

La expresión “proteína osteoinductora” o tal como se expuso anteriormente, se refiere a miembros de la superfamilia de

factor de crecimiento transformante- (TGF-) que tienen propiedades osteoinductoras, tales como el factor de crecimiento y diferenciación-5 o las proteínas descritas en el presente documento o en las solicitudes de patentes europeas o las patentes europeas mencionadas anteriormente. Una condición previa importante para un proceso de adsorción de este tipo a la superficie metálica es una solubilidad suficiente de las proteínas en la disolución de recubrimiento tal como se describe en el documento WO 03/043673.

La etapa de secado usada en el método según el primer aspecto de la presente invención es el secado isotérmico que es tal como se describe a continuación.

La expresión “secado isotérmico” se refiere a un método de secado en el que el disolvente se elimina mediante evaporación del disolvente desde la fase líquida hasta la fase gaseosa y se condensa posteriormente en un condensador de hielo. Se ajusta el condensador de hielo a temperaturas muy bajas para reducir la presión de vapor saturado del disolvente para lograr un transporte de masa del disolvente fuera de la disolución al condensador de hielo y para inmovilizar el disolvente. Preferiblemente se ajusta el condensador de hielo a menos de 50ºC. Se lleva a cabo este proceso a presión reducida (es decir, por debajo de la presión atmosférica convencional) para potenciar la evaporación del disolvente, mientras que se mantiene la temperatura de la disolución a una temperatura definida preferiblemente usando estantes de temperatura regulada sobre los que se coloca el producto. La temperatura se ajusta mediante el equilibrio de evaporación y calentamiento a un nivel constante para potenciar la evaporación del disolvente y para prevenir una congelación de la disolución bajando la temperatura debido a la entalpía de evaporación del disolvente y para proteger el sustrato de la degradación inducida por la temperatura. Preferiblemente, la temperatura es constante en todo el proceso de secado. Se necesita que tanto la temperatura como la presión se ajusten cuidadosamente para garantizar que la disolución permanezca en el estado líquido en todo el secado.

Preferiblemente, se lleva a cabo el proceso de secado en un liofilizador para mantener y controlar los parámetros de secado definidos durante el proceso de secado. Preferiblemente, se lleva a cabo el proceso de secado en un entorno libre de oxígeno, por ejemplo por medio de purga de la cámara de secado con nitrógeno, argón, etc.

Recientemente, el recubrimiento de endoprótesis ha pasado a ser importante para potenciar la hemocompatibilidad y compatibilidad tisular. Se cree que ensayos en curso con nuevas endoprótesis que liberan fármacos mejoran el tratamiento de la reestenosis y especialmente reestenosis intra endoprótesis (véase, por ejemplo el informe “Recent Developments in Coated Stents), Hofma, Sjoerd H. et al. (2001), Current Interventional Cardiology Reports, 3: 28-36). La presente invención también abarca el recubrimiento de endoprótesis con el método según la presente invención. El recubrimiento de endoprótesis según la presente invención da como resultado endoprótesis que tienen un recubrimiento homogéneo sobre toda la superficie de la endoprótesis, por ejemplo endoprótesis metálicas (como endoprótesis de nitinol) tal como se describe en el presente documento.

Según la presente invención, se realiza el recubrimiento de dicho dispositivo mientras que dicho dispositivo se pone en contacto con la disolución de recubrimiento en su recipiente de empaquetamiento adaptado especial. En otras palabras, según la presente invención, la contención del dispositivo que va a recubrirse durante el proceso de recubrimiento es idéntica al recipiente usado para empaquetar y almacenar el dispositivo recubierto, es decir, se usa el mismo recipiente para el recubrimiento y empaquetamiento posterior por ejemplo usado en la producción a gran escala de productos asépticos de dosis única, en particular para el uso para productos farmacéuticos.

Preferiblemente, la disolución que contiene la sustancia es una disolución acuosa, lo más preferiblemente una disolución ácida. Por supuesto, tal como se conoce bien en la técnica, el pH de la disolución que contiene la sustancia así como los

excipientes para ajustar el pH deben seleccionarse cuidadosamente.

Por ejemplo, los dispositivos de Ti están preferiblemente recubiertos con proteína por medio de una disolución acuosa de la proteína aplicada a la superficie de metal y secado adicional. Se formula esta disolución de recubrimiento para proporcionar estabilidad suficiente para la proteína durante el procesamiento y almacenamiento. Por ejemplo, rhGDF-5 sólo es soluble en disoluciones ácidas. Por tanto, el valor de pH de la disolución de recubrimiento necesita ajustarse cuidadosamente para evitar la degradación ácida de la proteína por un lado y la precipitación a valores de pH superiores por otro lado. Los estudios han identificado un intervalo de pH de 3,0 a 3,5 como un pH ideal (documento WO 03/043673). Este pH debe ser constante durante el secado y no debe desplazarse a valores superiores o inferiores cuando se concentra la disolución durante la evaporación del disolvente. Los experimentos han mostrado que un ácido débil, por ejemplo, ácido acético es un excipiente ideal para este fin.

El término “ácido débil” se refiere a compuestos orgánicos

o inorgánicos que contienen al menos un átomo de hidrógeno unido de manera ionogénica. Los ácidos débiles se conocen bien en la técnica y se describen en libros de texto convencionales, tales como Römpp, lexicon of chemistry. Preferiblemente, dichos ácidos débiles tienen grados de disociación bajos y se describen mediante valores de pK de entre 3 y 7, preferiblemente entre 4 y

6.

Tal como se menciona en el presente documento, la disolución en la que está la sustancia que va a recubrirse sobre un dispositivo es una disolución acuosa ácida. Preferiblemente, la disolución acuosa ácida contiene HCl, ácido acético, ácido cítrico y/o ácido succínico.

En otra realización preferida de la presente invención, la disolución en la que está la sustancia que va a recubrirse sobre un dispositivo es un disolvente orgánico. Preferiblemente, el disolvente orgánico es ácido acético glacial, DSMO, anisol.

Sin embargo, la presente invención también contempla que la disolución en la que está la sustancia que va recubrirse sobre un dispositivo según los métodos de la presente invención se disuelve en alcoholes alifáticos o aromáticos, éster, éteres, hidratos de carbono, hidratos de carbono aromáticos o alifáticos halogenados y similares.

Además, se prefiere que la disolución contenga un antioxidante, como metionina o sus derivados (sulfito, ácido ascórbico, glutatión) o eliminador de radicales tal como se describe en libros de texto convencionales (Bauer, Frömming Führer, Lehrbuch der Pharmaceutischen Technologie, 6. Auflage, 1999). Ejemplos son: butilhidroxitoluol, butilhidroxianisol, EDTA, manitol, isopropanol, tocoferol, ésteres de ácido galúrico.

El dispositivo que va a recubrirse, por ejemplo, está hecho de metal o aleación de metal, preferiblemente titanio o una aleación de titanio o uno cualquiera de los materiales descritos en el presente documento. Se prefiere que los metales/las aleaciones de metales u otros materiales descritos en el presente documento de la invención sean biocompatibles. El término “biocompatible” significa la calidad de no tener efectos tóxicos o perjudiciales sobre sistemas biológicos (Williams, D.F., (1988), Consensus and definitions in biomaterials, en Advances in Biomaterials, 8, de Putter, C., de Lange K., de Groot K., Lee A.J.C. (eds.), Elsevier Science Publishers B.V., Ámsterdam). Dichas propiedades son conocidas para titanio o aleaciones de titanio. Más preferiblemente, la aleación de titanio es una aleación de titanio que contiene al menos el 50% de titanio. Además preferiblemente, dicha aleación de titanio es una aleación de Ti-Al-V, una aleación de Ti-Al-Fe, una aleación de Ti-Al-Nb o una aleación de Ti-Mo-Zr-Al, aleación de Ti-Ni, lo más preferiblemente Ti6Al4V.

El dispositivo que va a recubrirse con el método del primer aspecto es preferiblemente un implante o una endoprótesis, lo más preferiblemente un implante dental o endoprótesis coronaria.

En más detalle, el método de la presente invención comprende las subetapas de (a1) proporcionar un recipiente de

empaquetamiento para dicho dispositivo; (a2) rellenar dicho recipiente con dicha disolución de recubrimiento; y (a3) insertar dicho dispositivo en dicho recipiente rellenado previamente. Puede revertirse el orden de las etapas (a2) y (a3) de modo que primero se inserta el dispositivo en el recipiente, y posteriormente la disolución de recubrimiento. Más preferiblemente, el método comprende además la etapa de aplicar una presión reducida por debajo de la atmosférica para garantizar una humectación completa de la superficie de interés, por ejemplo para eliminar burbujas de aire, antes de la etapa de secado. Se prevé que el recipiente de empaquetamiento puede recubrirse según los métodos descritos en el presente documento. Alternativamente, el recipiente de empaquetamiento puede estar ya recubierto, por ejemplo, con un material, por ejemplo, un

material: hidrófobo tal como se describe en el presente

documento.

En: más detalle, la disolución de recubrimiento

preferiblemente se compone, se filtra de manera estéril y se dosifica en el recipiente (por ejemplo un vial de vidrio) usando una bomba de micropistón. Los dispositivos, como piezas de Ti por ejemplo, se añaden y se sumergen en la disolución de proteína. Entonces se provee a los recipientes de tapones que sólo se insertan parcialmente antes de cargar los recipientes en el liofilizador. Para eliminar burbujas de aire posiblemente atrapadas dentro de los poros de la superficie de titanio de la pieza, se aplica un vacío de, por ejemplo, 30 hPa (que esta por encima de las condiciones de ebullición de la disolución de proteína a temperatura ambiente). Posteriormente, se ajusta la presión de la cámara del liofilizador a, por ejemplo, ≤500 hPa, más preferiblemente ≤250 hPa, lo más preferible ≤100 hPa y se elimina el disolvente mediante secado isotérmico bajo nitrógeno a temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC). Se condensa el vapor del disolvente evaporado en el condensador de hielo, ajustado a temperatura muy baja (por ejemplo aproximadamente <-50ºC) tal como se describe en Murgatroyd K, The Freeze Dryer and Freeze Dryer Design, en Good Pharmaceutical Freeze-Drying Practice, 2, Cameron, P (ed.), Interpharm Press, Inc, Buffalo

Grove Ámsterdam, 1997. Tras el secado, se evacua la cámara a vacío máximo y se purga con nitrógeno estéril antes de cerrar los dispositivos dentro del liofilizador plegando los estantes del liofilizador entre sí.

Según un segundo aspecto, la presente invención proporciona un recipiente de empaquetamiento para un dispositivo, comprendiendo dicho recipiente un receptáculo que se ubica coaxialmente dentro de la carcasa del recipiente, siendo dicho receptáculo para alojar dicho dispositivo que va a recubrirse y estando adaptado de manera que dicho dispositivo puede recubrirse con una sustancia directamente dentro de dicho recipiente, en el que la superficie interna de dicho receptáculo se recubre con una capa de material inerte y repelente. Por tanto, el recipiente según la presente invención satisface ambas funciones, vasija para un procedimiento de recubrimiento in situ del dispositivo (por ejemplo, implante) y sistema de empaquetamiento primario para almacenamiento a largo plazo.

Preferiblemente, el receptáculo está adaptado en tamaño y forma al tamaño y forma de dicho dispositivo. Se prefiere que la superficie interna de dicho receptáculo esté recubierta, por ejemplo con una capa de un material inerte, repelente tal como un material hidrófilo o hidrófobo, como silicona o PTFE o un material similar a PTFE en el caso de disoluciones de

recubrimiento: acuosas. Para el recubrimiento de superficies

hidrófobas: con sustancias hidrófobas, es necesario un

recubrimiento hidrófilo sobre la vasija.

El recubrimiento de la superficie interna garantiza la deposición cuantitativa de la sustancia que va a recubrirse sobre el dispositivo o implante. Esto es altamente ventajoso en vista de la producción económica de dispositivos o implantes recubiertos.

Tal como se mencionó anteriormente, el receptáculo del recipiente se ubica coaxialmente dentro de la carcasa del recipiente. La carcasa del recipiente comprende una abertura para que pase el dispositivo y la disolución/el sustrato o sustancia de recubrimiento a través del receptáculo, y una parte inferior que se ubica frente a la abertura. Además, el

receptáculo comprende una abertura para alojar el dispositivo y el sustrato o la sustancia de recubrimiento, y una parte inferior que se ubica frente a su abertura. La abertura de dicha carcasa y la abertura de dicho receptáculo están alineadas entre sí, y el receptáculo está unido en su parte inferior a la parte inferior de la carcasa. Preferiblemente, la parte de abertura del receptáculo está separada de la parte de abertura de la carcasa. Se prefiere que el recipiente de empaquetamiento esté hecho de vidrio. Alternativamente, está hecho de material plástico. Preferiblemente, las dimensiones externas de este recipiente de vidrio son idénticas a las de un vial de tipo convencional (DIN ISO 8362: Injektionsbehältnisse für Injektionspräparate und Zubehör). Las dimensiones internas están adaptadas para formar una microvasija para el recubrimiento y almacenamiento de dispositivos tales como piezas de Ti, por ejemplo.

También se describe en el presente documento un método de recubrimiento de las superficies internas de un recipiente de empaquetamiento para un dispositivo, preferiblemente implantes, que van a recubrirse mediante una sustancia, que comprende las etapas de: (A) aplicar un material hidrófobo sobre dichas superficies internas de dicho recipiente, y (B) termocurar dicho material aplicado para formar una capa secada al horno sobre dichas superficies internas de dicho recipiente, en el que dicho recubrimiento influye en el coeficiente de distribución de la sustancia que va a recubrirse sobre dicho dispositivo entre dicho recipiente y dicho dispositivo. Tal como se explicó anteriormente, el material hidrófobo es preferiblemente silicona

o PTFE o un material similar a PTFE. En más detalle, la etapa

(A) comprende siliconar dichas superficies internas del recipiente usando emulsión de silicona.

Además, se describe en el presente documento un dispositivo recubierto que puede obtenerse mediante un método según el primer aspecto de la presente invención. Preferiblemente, el dispositivo es un implante, como un implante dental o una endoprótesis coronaria. Por ejemplo, el implante es una

endoprótesis, un clavo, un tornillo, una jaula o una placa, respectivamente.

En particular, el dispositivo comprende una proteína osteoinductora que se recubre homogéneamente sobre una superficie porosa o no porosa de aleación o de metal del dispositivo, por lo cual el estado de oxidación de la proteína osteoinductora no aumenta significativamente en comparación con la proteína osteoinductora que no se ha recubierto sobre dicha superficie de aleación o de metal.

La presente invención abarca además el uso del método de recubrimiento de un dispositivo según el primer aspecto de la presente invención para mejorar la distribución homogénea del recubrimiento sobre el dispositivo.

La presente invención también abarca un kit que comprende un recipiente de empaquetamiento y recubrimiento según la presente invención y un dispositivo recubierto que se obtiene mediante el método del primer aspecto de la presente invención. Las definiciones y explicaciones de los términos realizadas anteriormente en el contexto de los métodos, dispositivos y usos de la presente invención se aplican cambiando lo que se deba cambiar para el kit descrito en el presente documento. Las partes del kit de la invención pueden empaquetarse individualmente en viales u otros medios apropiados dependiendo del componente respectivo o en combinación en recipientes o unidades de recipientes múltiples adecuados. Preferiblemente, la fabricación del kit sigue procedimientos convencionales que conoce el experto en la técnica. Preferiblemente, el dispositivo se empaqueta en un recipiente o vial en una atmósfera libre de oxígeno, tal como una atmósfera de gas inerte, que consiste preferiblemente en nitrógeno.

A continuación se describe la presente invención con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

la figura 1 muestra esquemáticamente el método de recubrimiento según el primer aspecto de la presente invención para titanio;

la figura 2 muestra una vista en sección transversal de un recipiente preferido según el segundo aspecto de la presente invención;

la figura 3 muestra un recipiente alternativo adicional según el segundo aspecto de la presente invención;

la figura 4 muestra un recipiente alternativo adicional según el segundo aspecto de la presente invención;

la figura 5 muestra esquemáticamente recipientes que contienen un dispositivo que va a recubrirse: derecho (izquierda) e invertido (derecha);

la figura 6 muestra el método de recubrimiento adaptado en un proceso aséptico según el primer aspecto de la presente invención por medio de un diagrama de flujo de fabricación;

la figura 7 muestra el efecto protector de la metionina sobre la estabilidad de la proteína;

la figura 8 muestra el efecto protector de la metionina sobre la estabilidad de rhGDF-5 mediante análisis por RP-HPLC de diferentes formulaciones de rhGDF-5 (con y sin metionina); TiU = TiUite;

la figura 9 muestra el efecto del recipiente no siliconado frente al siliconado sobre la distribución de proteína (contenido de proteína en el implante, barra negra frente a pérdida en el recipiente, barra blanca) y degradación reducida de la proteína mediante (análisis por RP-HPLC) primer aspecto de la; TiU = TiUite; ICC = cartucho de recubrimiento-inmersión;

la figura 10 muestra la distribución y degradación de rhGDF-5 recubierto sobre implantes de titanio con una carga de rhGDF-5 máxima (análisis por RP-HPLC); ICC = cartucho de recubrimiento-

inmersión;

la figura 11 muestra la distribución de rhGDF-5 secado a presión atmosférica en condiciones no optimizadas usando tinción de fluorescencia;

la figura 12 muestra la distribución homogénea de rhGDF-5 adsorbido sobre la superficie del implante mediante tinción de fluorescencia de piezas secadas tras optimizar las condiciones de secado; y

la figura 13 muestra fotografías de MEB de la superficie porosa del implante (figura A 100x, figura B 1000x).

Descripción detallada de la presente invención

La figura 1 muestra esquemáticamente el método de recubrimiento según el primer aspecto de la presente invención usado para el recubrimiento de piezas de titanio. Se muestra el recipiente de empaquetamiento usado según la presente invención para el recubrimiento del implante (en este caso: pieza de titanio) en la figura 1 en cinco etapas de procedimiento. En la primera etapa, se añade la disolución de proteína al recipiente, que en la realización preferida de la figura 1 es una vasija siliconada. Después, el dispositivo, por ejemplo un implante como un tornillo se inserta en el recipiente y se rodea completamente por tanto por el líquido. En la tercera etapa, se usa un tapón para cerrar el recipiente. Sin embargo, el tapón no se coloca en su posición de cierre final (que se muestra en el dibujo más a la derecha de la figura 1) sino en una posición intermedia. Habiendo insertado el tapón parcialmente en el recipiente, se inicia el proceso de secado que da como resultado que el dispositivo se recubre. Debido a la posición semicerrada del tapón, es posible que por ejemplo pueda escapar agua del recipiente durante el proceso de secado. Tras el procedimiento de secado/recubrimiento, puede purgarse la cámara del liofilizador con nitrógeno estéril o con cualquier otro gas inerte antes de cerrar completamente los recipientes presionando el tapón dentro del recipiente. Alternativamente, puede aplicarse un vacío antes de cerrar los recipientes. El implante completamente recubierto ya está contenido en el recipiente de empaquetamiento y está listo para su envío.

La figura 2 muestra un recipiente alternativo adicional según el segundo aspecto de la presente invención. Este recipiente de empaquetamiento comprende un vial de vidrio sólido especialmente diseñado. Las dimensiones externas de este vial de vidrio son idénticas a las de un vial 2R convencional. Las dimensiones internas están adaptadas para formar una microvasija para el recubrimiento y almacenamiento de, por ejemplo, piezas

de Ti. Este vial de vidrio se silicona usando emulsión de silicona de calidad médica cocida dentro del vidrio mediante tratamiento térmico.

La figura 3 muestra una vista en sección transversal de un recipiente preferido según el segundo aspecto de la presente invención. Este recipiente de empaquetamiento preferido consiste en un vial de vidrio de tipo 2R convencional con un tubo de vidrio interno firmemente moldeado sobre la parte inferior del vial (vial de vidrio de un componente). Por medio de este tubo de vidrio se crea una microvasija para el recubrimiento de implantes (como piezas de Ti) en posición invertida. Se silicona el vial según la presente invención usando emulsión de silicona de calidad médica que se cuece dentro del vidrio mediante tratamiento térmico.

La figura 4 muestra un recipiente alternativo adicional según el segundo aspecto de la presente invención. Este recipiente comprende un vial de vidrio 2R convencional, un tapón de liofilizador de bromobutilo convencional, un microcartucho de vidrio siliconado térmicamente dentro del vial y un soporte de plástico flexible (PE) para el cartucho. El vial se sella preferiblemente mediante engarce con una tapa de aluminio (no mostrada). Los cartuchos se siliconan usando emulsión de silicona de calidad médica, cocida dentro del vidrio mediante tratamiento térmico (véase también el capítulo 4.3 Procedimiento). Los viales se lavan y se siliconan usando emulsión de silicona. El termocurado para formar una capa de silicona secada al horno y para esterilizar el vial se realiza a una temperatura mínima de 250ºC. Los soportes de plástico se acoplan manualmente a los cartuchos, colocados dentro del vial.

La figura 5 muestra esquemáticamente diseños de recipientes alternativos de recipientes que contienen un dispositivo que va a recubrirse derecho (dibujo izquierdo) e invertido (dibujo

derecho). En ambas: alternativas, la forma del recipiente se

adapta: a la forma del implante, lo que garantiza un

recubrimiento: eficaz. Los experimentos han mostrado que el

recubrimiento: en posición invertida conduce a una capa de

proteína más homogénea sobre la superficie de las piezas. Esto

se debe a la geometría compleja del dispositivo y el hecho de que las burbujas de aire, que surgen durante el descenso de la presión, pueden conducir a defectos de recubrimiento. Esas burbujas de aire quedan atrapadas fácilmente en la cabeza de perno de la pieza cuando se encuentra en una posición derecha pero pueden escapar del cartucho cuando la pieza se coloca en posición invertida.

La figura 6 muestra el método de recubrimiento adaptado en un proceso aséptico según el primer aspecto de la presente invención por medio de un diagrama de flujo de fabricación. En la primera etapa, es decir, la etapa de composición, la disolución de proteína a granel y los excipientes se mezclan entre sí. Después, tiene lugar una filtración estéril. Esto se hace usando una unidad de filtro. En primer lugar, el vial de vidrio, es decir, el recipiente, se lava y se silicona, después de eso se esteriliza con calor y finalmente se coloca en la estación de llenado. En la estación de llenado, se rellena el recipiente con la disolución, por ejemplo usando una bomba de micropistón. En una estación de recogida y colocación posterior, las piezas esterilizadas con calor se colocan en el recipiente que contiene la disolución del material de recubrimiento. Posteriormente, los recipientes pasan a la estación de tapado y se cierran parcialmente mediante tapones de liofilizador esterilizados en autoclave. Entonces este montaje se carga en un liofilizador en el que se realizan el secado y el tapado final posterior. En una estación de engarce, los recipientes se sellan con una tapa de engarce. La última etapa comprende el etiquetado y el empaquetamiento secundario para su envío. Los componentes de caucho, es decir tapones de liofilizador, son tapones de liofilizador de tipo convencional. Preferiblemente, se sellan los viales con tapas de engarce de tipo convencional Flip-Tear up.

La figura 7 muestra la degradación de proteína cuantificada mediante RP-HPLC de implantes de titanio recubiertos con rhGDF-5 (disolución de recubrimiento usada de rhGDF-5 en ácido acético 50 mM, y rhGDF-5 en ácido acético 50 mM con metionina 10 mM). Sólo puede observarse un aumento menor de la degradación de

proteína en comparación con el material de partida. Esto muestra la viabilidad del método de recubrimiento de la presente invención.

La figura 8 muestra la estabilidad de dos disoluciones de proteína (rhGDF-5) en diferentes disoluciones de recubrimiento, HCl 10 mM (barra blanca) frente a ácido acético 50 mM (barra negra), ambas con y sin metionina mientras que están en contacto con el implante que va a recubrirse durante hasta 7 horas. Los datos muestran que es posible evitar la degradación de proteína cuando se adapta la formulación al proceso de recubrimiento (ácido acético 50 mM con metionina 10 mM). Adicionalmente, este experimento es una primera prueba de concepto para el proceso de fabricación a gran escala previsto en el que una estabilidad de la disolución de recubrimiento es un requisito previo para garantizar una calidad constante del producto. A = disolución de partida de GDF-5; B = disolución de GDF-5 tras 7 h, C = disolución de GDF-5 + pieza de TiU, D = disolución de GDF-5 + Met. Tras 7 h, E = disolución de GDF-5 + Met. + TiU tras 7 h.

La figura 9 muestra el efecto de usar un recipiente siliconado para el recubrimiento. Los datos obtenidos mostrados en la figura 9 indican claramente las ventajas, con respecto a la distribución de proteína entre el recipiente y el implante. Mientras para el recipiente no tratado más del 30% de rhGDF-5 permanece en el recipiente, esta cantidad puede reducirse masivamente hasta el 5% si se usaran recipientes siliconados. Principalmente, este efecto es independiente de la carga absoluta de rhGDF-5 y es reproducible tal como se muestra para

dos cantidades de proteína diferentes (34 g, 121,5 g por pieza)

La figura 10 muestra la distribución de rhGDF-5 secado a presión atmosférica. Para evitar la formación de burbujas, se realizó un primer experimento, secando el implante sin aplicación de vacío. Por tanto, se logró el secado mediante condensación de agua sólo sobre el condensador de hielo ultra-frío. La figura 10 muestra también que incluso con una dosificación de recubrimiento aumentada de hasta 298 g de

rhGDF-5 por implante la distribución de proteína entre el recipiente y el implante todavía está casi cuantitativamente sobre el implante. Estos hallazgos demuestran que la distribución de proteína es independiente de la dosificación de recubrimiento, lo que es una ventaja adicional del método de recubrimiento de la presente invención.

La figura 11 muestra el análisis de fluorescencia correspondiente de las piezas así secadas. Puede observarse a partir de las imágenes que la proteína se segrega mucho más entre la cabeza de pieza en la que obviamente se concentra el rhGDF-5 y la parte inferior. De manera interesante, el recubrimiento parece ser relativamente homogéneo a lo largo del radio correspondiente.

La figura 12 muestra la distribución homogénea del rhGDF-5 adsorbido sobre la superficie del implante mediante tinción de fluorescencia de piezas secadas tras optimizar las condiciones

de: secado. En un intento de optimizar las condiciones
de

recubrimiento, se variaron algunos parámetros: que tienen un

efecto sobre la distribución de proteína:

•: la presión; para permitir una humectación completa también dentro de cavidades de la superficie de la pieza microestructurada. Se cambió de una presión constante a un vacío pulsado;

•: la posición de la pieza en el recipiente derecha frente a invertida porque la forma cónica de la pieza permite que las burbujas de aire escapen del recipiente más fácilmente; y

•: la forma del recipiente.

Las fotografías demuestran que las piezas secadas en posición invertida tienen un recubrimiento simétrico radial ventajoso con algo de concentración de proteína en la parte ahusada de la pieza.

La figura 13 muestra fotografías de MEB de la superficie porosa del implante de titanio (figura A 100x, figura B 1000x) que se usaron para el recubrimiento descrito con rhGDF-5.

Ejemplo 1: Cuantificación de GDF-5 en disolución mediante RPHPLC

Se determinó el contenido en GDF-5 mediante análisis por HPLC en fase inversa (RP). Se analizaron alícuotas de la muestra usando una columna Poros C8-18 (R2/10, 2,1* 30 mm, Applied Biosystems), se usaron ácido fórmico al 0,1% en un 21% de acetonitrilo (disolvente A) y ácido fórmico al 0,1% en un 84% de acetonitrilo (disolvente B) como disolventes a una velocidad de flujo de 0,4 ml/min. Se registró el perfil de elución midiendo la absorbancia a 220 nm. Se calcularon las cantidades de GDF-5 a partir del área del pico a 220 nm usando una curva patrón.

Ejemplo 2: Extracción y cuantificación de la proteína inmovilizada

Se extrajo la proteína mediante incubación del dispositivo recubierto en primer lugar en HCl 10 mmol/l durante 3 h a temperatura ambiente. Tras ajustar la muestra de PBS a pH 2. Se analizaron las disoluciones de HCl que contenían el factor de crecimiento óseo extraído mediante RP-HPLC tal como se describió en el ejemplo 1.

Ejemplo 3: Determinación de modificaciones químicas de la proteína extraída

Se determinó la cantidad de modificaciones químicas, es decir, oxidación del factor de crecimiento óseo en disoluciones que contenían la proteína extraída mediante RP-HPLC. Se aplica la muestra a una columna Vydak C8-18 (2 x 250 mm) que se ha equilibrado con TFA al 0,15%, acetonitrilo al 20%. Tras el lavado de la columna, tiene lugar la elución del factor de crecimiento óseo con una mezcla de TFA al 0,1%, y un gradiente escalonado del 20% -84% de acetonitrilo (flujo: 0,3 ml/min). Se observa la elución midiendo la absorción a 220 nm. La cuantificación tiene lugar a través de la razón del área del pico de especies modificadas en relación con el área del pico total.

Ejemplo 4: Determinación de la homogeneidad del recubrimiento de factor de crecimiento óseo sobre superficies de titanio mediante microscopía de fluorescencia

Se investigó la homogeneidad del recubrimiento de rhGDF-5 sobre el implante de titanio usando un marcador de fluorescencia para proteínas. Se realizó la determinación mediante microscopía de fluorescencia.

Coloración de fluorescencia de la proteína inmovilizada:

Se prepararon los dispositivos recubiertos tal como se describe en el ejemplo 5. Para la coloración se añadieron 2,3 l de una disolución 10 mmol/l de Alexa Fluor™ 488 a 1 ml de una disolución de NaHCO3 0,15 M. Se incubaron los implantes en 1 ml de la mezcla de colorante de fluorescencia en la oscuridad durante 4 h a temperatura ambiente. La razón de proteína:fluoróforo es de 1:10. Se incubó el implante usado como blanco sólo durante 20 min. Tras el período de incubación, se lavaron extensamente los implantes con agua desmineralizada y se secaron durante 15 min. a vacío en la oscuridad.

Se detectó la señal de fluorescencia mediante microscopía de fluorescencia y se documentó mediante un software de toma de imágenes.

En las figuras 11 y 12 puede determinarse claramente la distribución de rhGDF-5 mediante microscopía de fluorescencia. Lo que significa que el marcador de fluorescencia se unió a la proteína. Para excluir cualquier efecto del disolvente, se preparó también un implante que no se recubrió con rhGDF-5 sino que se incubó también en marcador de fluorescencia Alexa Fluor™ 488 (datos no mostrados).

Ejemplo 5: Recubrimiento de implantes de titanio con rhGDF-5

El objetivo de este ejemplo era demostrar la viabilidad de este método de recubrimiento. En más detalle, se sometió a prueba si la metionina como excipiente conservante antioxidación tiene un efecto beneficioso sobre la tasa de degradación de rhGDF-5. Se realizó el recubrimiento de prueba mediante dos sistemas experimentales diferentes y con dos piezas por sistema. Se llevó a cabo el primer sistema sometido a prueba con el rhGDF-5 recién reformulado en ácido acético 50 mM. En el segundo

sistema, se sometió a prueba una disolución de recubrimiento de rhGDF-5 en ácido acético 50 mM, que adicionalmente contiene metionina para evaluar la posibilidad de minimizar la tasa de oxidación. La tabla 1 proporciona una visión general de los 5 sistemas de recubrimiento sometidos a prueba. Se secaron todas las muestras en el liofilizador durante cuatro horas a aproximadamente 66 mbar con el condensador de hielo ajustado a aproximadamente -80ºC. Se mantuvieron los estantes de liofilización de manera constante a temperatura ambiente de

10 aproximadamente 20ºC, por tanto no tuvo lugar la congelación ni la liofilización. Se logró un secado eficaz mediante evaporación del disolvente y condensación del vapor del disolvente en el condensador de hielo ultra-frío.

15 Tabla 1. Esquema de las muestras sometidas a prueba

N.o de muestra

Descripción

1.1 Vial siliconado

1.2 Vial siliconado Vial siliconado +

2.1

metionina Vial siliconado +

2.2 metionina

Resultados

Los hallazgos con respecto a la degradación de rhGDF-5 de los dos experimentos se resumen en la figura 7. Se midió el 20 aumento de la degradación según el método descrito en el ejemplo

2.

La comparación entre disoluciones de recubrimiento con o sin adición de metionina no muestra sorprendentemente diferencias significativas con respecto a rhGDF-5 y la formación

25 de productos de degradación. En ambos casos se observa sólo un ligero aumento de la degradación de proteína (< 2%). Esto puede explicarse por un efecto de estabilización del ácido acético, que puede actuar como eliminador de radicales y por tanto afecta como un agente protector a corto plazo. Sin embargo, esta no

30 influencia de la metionina es sólo el caso en condiciones ideales en la fabricación a pequeña escala. Según el ejemplo 7 en el que se ha establecido fabricación a gran escala y son

inevitables tiempos de retención más prolongados, por ejemplo 7 horas, dentro del proceso de fabricación, esta degradación aumentada de la proteína puede evitarse usando metionina. En resumen, estos resultados demuestran el recubrimiento satisfactorio de rhGDF-5 sobre la superficie de un implante metálico. Además, se ha demostrado la prueba de concepto de un método de secado isotérmico.

Ejemplo 6: Método para recubrir titanio o aleación de titanio con factor de crecimiento óseo de manera manual a escala de laboratorio

Se realiza el proceso de recubrimiento bajo una atmósfera de gas inerte para excluir el oxígeno. Para mantener estas condiciones se usa una cámara. La cámara consiste en un cuarto herméticamente cerrado con una corriente continua de gas inerte, por ejemplo gas de N2. Dentro de la cámara se mantiene un ligero exceso de presión. Los materiales necesarios para el proceso de recubrimiento se transportan al interior de la cámara a través de una esclusa. La cámara permite un proceso de recubrimiento de manera manual. Para la definición y normalización del proceso de recubrimiento se monitoriza y se ajusta la humedad relativa en la cámara.

Recubrimiento:

Se limpiaron láminas de titanio, se lavaron con agua desmineralizada y se secaron. Se recubrieron las láminas de titanio con 60 g del rhGDF-5. Se dispuso cada lámina de forma plana en una cubeta y se recubrió con disolución del rhGDF-5 sobre un lado de la lámina de metal. Se realizó el recubrimiento bajo atmósfera de gas de N2 en una cámara tal como se describió anteriormente y a una temperatura de 0ºC a 4ºC. Tras el secado se secó la lámina en las condiciones respectivas durante 30 min. a vacío.

Extracción:

Se incubó rhGDF-5 en primer lugar en PBS para imitar condiciones casi fisiológicas. Para mantener las muestras casi libres de oxígeno, se saturó la disolución de PBS con gas de N2 para las muestras respectivas. Tras la incubación con PBS, se

5 incubaron las láminas en HCl 10 mmol/l durante 3 h a la temperatura respectiva. Se cuantificó el rhGDF-5 en las disoluciones de extracción mediante RP-HPLC (véase el ejemplo 1). También se determinó la cantidad de rh-GDF-5 oxidado mediante RP-HPLC (véase el ejemplo 2). Para poder comparar

10 muestras recubiertas y extraídas tal como se describió anteriormente, se realizó el mismo procedimiento a temperatura ambiente y bajo atmósfera de oxígeno.

Tabla 2:

Muestra: Atmósfera Temperatura % de proteína oxidada tras la extracción (media) DE

Implante: aire TA 10,0 1,6

Implante: N2 4ºC 5,6 0,6

A granel: aire TA 4,7 0,0

15 Los parámetros sometidos a prueba en este caso en los experimentos tienen una influencia sobre la cantidad de rhGDF-5 oxidado tras la extracción a partir de las láminas de titanio: Las muestras recubiertas en presencia de oxígeno del aire a

20 temperatura ambiente revelan una cantidad de rhGDF-5 oxidado del 10,0%  1,6% tal como se muestra en la tabla 2. Las muestras procesadas a 4ºC y bajo gas de N2 muestran un 5,6%  0,6% de rhGDF-5 oxidado tras la extracción. En comparación con la disolución a granel de rhGDF-5, las muestras procesadas a 4ºC y

25 gas de N2 no revelan diferencias significativas en la cantidad de rhGDF-5 oxidado (4,7%  0%).

Ejemplo 7: Evaluación del proceso a escala industrial

Los siguientes experimentos demostraron la idoneidad del 30 método de recubrimiento desarrollado para la fabricación a

escala industrial de implantes recubiertos usando los recipientes siliconados. En una primera etapa se reformuló la disolución a granel de rhGDF-5 en dos formulaciones ácidas diferentes con y sin adición

5 de metionina. Se sometieron a prueba las formulaciones en cuanto a su viabilidad y estabilidad en el recipiente siliconado durante la fabricación. Para identificar y cuantificar la degradación provocada por la pieza de titanio, se sometieron a prueba todas las formulaciones con y sin adición de una pieza al

10 recipiente siliconado relleno con la disolución. A continuación se proporciona una visión general del sistema experimental en la tabla 3.

Para simular la fabricación a escala industrial, se incubaron las disoluciones durante siete horas a 23ºC bajo

15 atmósfera de aire normal (el peor de los casos). Después de eso, se cuantificó el grado de degradación de proteína que resultó mediante análisis por RP-HPLC.

Tabla 3. Esquema de las diferentes formulaciones de rhGDF-5 20 sometidas a prueba

imagen1

Resultados

Los datos de RP-HPLC obtenidos se muestran en la figura 8. Los datos para la formulación de rhGDF-5 en HCl 10 mM (columnas rojas) muestran que un almacenamiento a lo largo de 7 horas afecta ya a un aumento de la cantidad de productos de degradación de rhGDF-5 desde un porcentaje inicial del 4,8% hasta el 7,8%. En presencia de una pieza de titanio, el valor aumentó adicionalmente hasta el 9,3%.

Se obtiene un resultado completamente diferente para las disoluciones que contienen metionina. El análisis muestra un efecto beneficioso claro de este excipiente sobre la tasa de degradación de rhGDF-5. Ni la disolución sola ni la disolución con pieza de titanio muestra un aumento significativo de la oxidación/desamidación.

La formulación de rhGDF-5 en ácido acético 50 mM también investigada proporciona resultados bastante similares. Aunque el valor inicial es un 5,2% ligeramente superior en comparación con la disolución de rhGDF-5 del fármaco a granel en HCl 10 mM (4,8%), todos los otros valores determinados estaban notablemente por debajo.

Conclusión

Los datos demuestran el aumento de estabilidad de la formulación de rhGDF-5 en ácido acético para la aplicación en el recipiente siliconado en comparación con la formulación en HCl. Para todos los parámetros de procedimiento investigados, la tasa de degradación de la formulación en ácido acético es significativamente inferior que el valor correspondiente de la formulación convencional en HCl. Además, este experimento demuestra claramente un efecto ventajoso de la metionina para prevenir la degradación de rhGDF-5 en la formulación diseñada para el uso en el recipiente siliconado.

Como resultado de este experimento, se identificó la formulación de rhGDF-5 optimizada con respecto al procesamiento y la estabilidad con la formulación de rhGDF-5 en ácido acético 50 mM/metionina 10 mM. Adicionalmente, este experimento es una primera prueba de concepto para el proceso de fabricación a gran escala previsto.

Ejemplo 8: Conformidad de la dosificación de implantes recubiertos con rhGDF-5 usando recipientes siliconados

El objetivo principal era conseguir información detallada acerca de la distribución de rhGDF-5 entre la superficie del implante y el recipiente siliconado, especialmente en cuanto a la reproducibilidad y conformidad de la dosificación. Además, debe someterse a prueba la viabilidad de las diferentes densidades de recubrimiento, es decir, dosis de proteína por piezas.

Se analizó la deposición controlada de rhGDF-5 entre el recipiente siliconado y el implante de titanio cuantificando la cantidad de proteína sobre el implante así como la cantidad residual de proteína en el recipiente siliconado. Para ilustrar la cuestión se realizaron experimentos de deposición controlada con concentraciones de rhGDF-5 diferentes en la disolución de

recubrimiento (34 g, 122 g y 298 g por implante). Para permitir una evaluación estadística de la conformidad de la dosificación de implantes recubiertos usando este método, se recubrieron seis piezas por dosificación. Después de eso se analizaron el implante y el recipiente correspondiente por separado en cuanto a la cantidad de rhGDF-5 y productos de degradación de proteínas. Para evaluar la importancia de la siliconación del recipiente se sometió a prueba adicionalmente la influencia con respecto a la distribución de rhGDF-5 en un experimento por separado en el que no se usaron recipientes siliconados.

Resultados

Con respecto a la necesidad de usar recipientes siliconados para el recubrimiento, los datos obtenidos mostrados en la figura 8 y la figura 9 indican claramente las ventajas, con respecto a la distribución de la proteína entre el recipiente y el implante. Mientras que para recipientes no tratados más del 30% de rhGDF-5 permanece en el vial, esta cantidad puede reducirse masivamente hasta el 5% si se usaran recipientes

siliconados. Este efecto es en su mayor parte independiente de

la carga absoluta de rhGDF-5 y es reproducible para todas las dosificaciones investigadas (34 g, 121,5 g y 298 g por pieza).

5 La tabla 4 resume unos análisis estadísticos de la conformidad de la dosificación. A pesar del hecho que los recipientes usados están hechos a mano y difieren en sus dimensiones, la conformidad de la dosificación parece ser fiable.

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Tabla 4. Análisis estadístico de la conformidad de la dosificación de implantes recubiertos

imagen2

121,5 85,8 8,9 10,4 (siliconados) 298 94,9 10,3 10,9 (siliconados)

De manera interesante puede observarse un efecto

5 beneficioso adicional de los recipientes siliconados sobre la degradación de rhGDF-5. La degradación de rhGDF-5 determinada durante los cuatro sistemas de recubrimiento se resume en la tabla 5. La comparación entre recipientes no tratados y recipientes siliconados (con la misma dosificación de

10 recubrimiento) muestra una degradación de rhGDF-5 aproximadamente un 1% superior para los recipientes siliconados.

Tabla. 5 Análisis estadístico de la degradación de rhGDF-5 de piezas recubiertas de recipientes

imagen3

imagen4

recubrimiento para 34 g de rhGDF5/implante Implantes recubiertos con 34 g de rhGDF5/implante (recipiente no tratado) Implantes recubiertos con 34 g de rhGDF5/implante (recipiente siliconado)

Disolución de recubrimiento para 121,5 g de rhGDF5/implante Implantes recubiertos con 34 g de rhGDF5/implante (recipiente siliconado)

5,1 -

7,7 2,6 0,9

6,6 1,5 0,5

5,3 -

5,8 0,5 0,6

Disolución de recubrimiento

para 298 g de rhGDF5/implante Implantes recubiertos con 298 g de rhGDF5/implante (recipiente siliconado)

4,6 -

4,8 0,2 0,6

Adicionalmente, los datos muestran que con una dosificación de recubrimiento creciente se suprimió el porcentaje de degradación de rhGDF-5 desde el 6,6 % para una dosificación de

5 34 g por implante hasta el 4,8% para una dosificación de 298 g por implante. Con el conocimiento de la cantidad inicial de la degradación de la disolución de recubrimiento, la cantidad absoluta de la degradación de rhGDF-5 provocada por el procedimiento de recubrimiento se calculó con aproximadamente

10 0,5 g por implante para recipientes siliconados, independientemente de la dosificación de recubrimiento. Para recipientes no tratados este valor es con aproximadamente 0,9 g dos veces más alto.

15 Conclusión Los datos presentados muestran que puede lograrse un recubrimiento reproducible con rhGDF-5 con respecto a la distribución de proteína entre el implante y el recipiente y una conformidad de la dosificación usando recipientes siliconados.

20 Ejemplo 9: Determinación de la distribución homogénea de implantes recubiertos con rhGDF-5 analizada mediante microscopía de fluorescencia

Debido a que los datos de RP-HPLC no permiten monitorizar 25 información referente a la homogeneidad del recubrimiento sobre la superficie del implante, se usó microscopía de fluorescencia

para lograr información detallada de la distribución de proteína sobre la superficie del implante.

Se analizó la homogeneidad del recubrimiento con rhGDF-5 usando un microscopio de fluorescencia tal como se describe en el ejemplo 4. Las primeras muestras analizadas eran implantes producidos a partir del experimento 8 descrito anteriormente y

se recubrieron con 298 g de rhGDF-5 por implante.

Para identificar los parámetros que son responsables de la posible falta de homogeneidad del recubrimiento de proteína, se hicieron exámenes visuales detallados del proceso de secado. Para este fin se grabó el proceso completo con una cámara digital. Basándose en estos resultados se encontró que podrían surgir burbujas de aire de la superficie porosa del implante (véase la figura 13) durante el descenso de la presión en el liofilizador.

En un intento adicional de optimizar las condiciones de recubrimiento, se variaron algunos parámetros que tienen un efecto sobre la distribución de proteína:

•: La presión; para permitir una humectación completa en particular también dentro de los poros en la superficie del implante. Se cambió el vacío desde un nivel de presión constante hasta un perfil de presión pulsado diseñado.

•: La posición del implante en el recipiente derecho frente a invertido, debido a que la forma cónica del implante permite que escapen las burbujas de aire del recipiente más fácilmente.

•: La forma del recipiente.

Los resultados de las pruebas con ambas posiciones del implante en el recipiente y los parámetros de secado optimizados se muestran en la figura 11. Las fotografías demuestran que los implantes secados en posición invertida tienen un recubrimiento simétrico radial ventajoso con algo de concentración de proteína en la parte ahusada del implante.

53

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método de recubrimiento de un dispositivo con una sustancia que comprende las etapas de:

(a)

proporcionar un recipiente que tiene un espacio para alojar dicho dispositivo que va a recubrirse;

(b)

proporcionar en dicho espacio una disolución de dicha sustancia de recubrimiento;

(c)

insertar dicho dispositivo en dicha disolución de dicha sustancia dentro de dicho recipiente, en el que puede revertirse el orden de las etapas (b) y (c); y

(d)

iniciar el secado isotérmico de dicho dispositivo mientras que está ubicado en dicho recipiente en contacto con dicha disolución, y eliminando de ese modo componentes volátiles de dicha disolución de dicha sustancia.
2.

Método según la reivindicación 1, en el que dicha sustancia es una sustancia farmacéuticamente activa.
3.

Método según la reivindicación 2, en el que dicha sustancia farmacéuticamente activa es una proteína, un péptido, un polisacárido o un glicolípido o una molécula pequeña.
4.

Método según la reivindicación 3, en el que dicha sustancia farmacéuticamente activa se inmoviliza en un material biorreabsorbible orgánico o inorgánico.
5.

Método según la reivindicación 4, en el que dicha sustancia farmacéuticamente activa es una proteína osteoinductora disuelta.
6.

Método según la reivindicación 5, en el que dicha proteína osteoinductora es un miembro de la familia de TGF-.
7.

Método según la reivindicación 6, en el que dicho miembro de la familia de TGF- es un miembro de la subfamilia de BMP, preferiblemente BMP2 o BMP 7.
8.

Método según la reivindicación 6, en el que dicho miembro de la familia de TGF- es una proteína del grupo que consiste en GDF-5, GDF-6 y GDF-7.
9.

Método según la reivindicación 1, en el que dicha sustancia comprende principios no activos.
10.

Método según la reivindicación 1, en el que dicha sustancia comprende fosfatos de calcio.
11.

Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho recipiente del dispositivo es su recipiente de empaquetamiento.
12.

Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha disolución es una disolución acuosa o un disolvente orgánico.
13.

Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha disolución es una disolución acuosa ácida.
14.

Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha disolución contiene un antioxidante.
15.

Método según la reivindicación 14, en el que dicho antioxidante es metionina o sus derivados.
16.

Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho dispositivo está hecho de metal

o aleación de metal, preferiblemente titanio o una aleación

de titanio, o fosfato de calcio, preferiblemente fosfato de -tricalcio.
17.

Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho dispositivo es un implante dental, o una endoprótesis coronaria.
18.

Método según la reivindicación 17, en el que la superficie interna de dicho recipiente se recubre con una capa secada al horno de un material hidrófobo, en el que dicho recubrimiento influye en el coeficiente de distribución de la sustancia que va a recubrirse sobre dicho dispositivo entre dicho recipiente y dicho dispositivo.
19.

Método según la reivindicación 18, en el que dicho material hidrófobo es silicona o PTFE.
20.

Método según la reivindicación 18, comprendiendo dicho recipiente de empaquetamiento un receptáculo para alojar dicho dispositivo que va a recubrirse, estando adaptado

dicho receptáculo en tamaño y forma al tamaño y forma de dicho dispositivo.
21.

Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa de aplicar un vacío para eliminar burbujas de aire, antes de la etapa (d).
22.

Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (d) se realiza a aproximadamente 100 hPa a temperatura ambiente.
23.

Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (d) se realiza usando un condensador de hielo.
24.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, que comprende además la etapa de evacuar dicho recipiente, purgándolo con nitrógeno, y cerrando dicho recipiente bajo nitrógeno.
25.

Recubrimiento y recipiente de empaquetamiento para un dispositivo, comprendiendo dicho recipiente un receptáculo que se ubica coaxialmente dentro de la carcasa del recipiente, siendo dicho receptáculo para alojar dicho dispositivo que va a recubrirse y estando adaptado de tal manera que dicho dispositivo puede recubrirse con una sustancia directamente dentro de dicho recipiente, en el que la superficie interna de dicho receptáculo se recubre con una capa de material inerte y repelente.
26.

Recipiente según la reivindicación 25, estando adaptado dicho receptáculo en tamaño y forma al tamaño y forma de dicho dispositivo.
27.

Recipiente según la reivindicación 25, en el que dicho recubrimiento inerte y repelente es de un material hidrófobo o hidrófilo.
28.

Recipiente según la reivindicación 27, en el que el material hidrófobo es una silicona o PTFE.
29.

Recipiente según la reivindicación 25, en el que dicha carcasa del recipiente comprende una abertura para alojar dicho dispositivo y dicha sustancia de recubrimiento, y una parte inferior que está ubicada opuesta a dicha abertura,

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en el que dicho receptáculo comprende una abertura para alojar dicho dispositivo y dicha sustancia de recubrimiento, y una parte inferior que está ubicada opuesta a dicha abertura, estando alineadas entre sí dicha

5 abertura de dicha carcasa y dicha abertura de dicho receptáculo, y en el que dicho receptáculo está unido en su parte inferior a la parte inferior de dicha carcasa.
30. Recipiente según la reivindicación 29, en el que la parte

de abertura de dicho receptáculo está separada de la parte 10 de abertura de dicha carcasa.
31. Uso de dicho método de recubrimiento de un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 para mejorar la distribución homogénea del recubrimiento sobre el dispositivo.

15 32. Kit que comprende un recubrimiento y recipiente de empaquetamiento según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30 y dispositivo recubierto obtenido mediante el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.