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ES2204964T3 - Formulaciones de liposomas para el tratamiento de enfermedades virales. - Google Patents

Formulaciones de liposomas para el tratamiento de enfermedades virales.

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Publication number
ES2204964T3
ES2204964T3 ES95932599T ES95932599T ES2204964T3 ES 2204964 T3 ES2204964 T3 ES 2204964T3 ES 95932599 T ES95932599 T ES 95932599T ES 95932599 T ES95932599 T ES 95932599T ES 2204964 T3 ES2204964 T3 ES 2204964T3
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ES
Spain
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liposomes
liposome
hiv
formulations
treatment
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES95932599T
Other languages
English (en)
Inventor
Michel G. Bergeron
Andre Desormeaux
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Infectio Recherche Inc
Original Assignee
Infectio Recherche Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Infectio Recherche Inc filed Critical Infectio Recherche Inc
Application granted granted Critical
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Abstract

SE MUESTRA UN METODO PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES VIRALES QUE SUPONE LA ADMINISTRACION DE AGENTES ANTIVIRALES ENCAPSULADOS EN LIPOSOMAS. TAMBIEN SE PROPORCIONAN FORMULACIONES DE LIPOSOMAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES VIRALES Y MAS ESPECIALMENTE PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES CAUSADAS POR VIRUS COMO EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (HIV) Y EL CITOMEGALOVIRUS (CMV). ESTAS FORMULACIONES DE LIPOSOMAS SE COMPONEN DE CLASES ESPECIFICAS DE COMPONENTES LIPIDICOS Y CONTIENEN UN MEDICAMENTO ENTRAMPADO EFECTIVO CONTRA LA ENFERMEDAD VIRAL. ESTAS FORMULACIONES LIPOSOMIALES DE MEDICAMENTOS ANTIVIRALES PERMITEN UNA ALTA PENETRACION CELULAR EN DIFERENTES LINEAS CELULARES, BUENA EFICACIA ANTIVIRAL IN VITRO CONTRA LA REPLICACION HIV Y CMV, EFICACIA IN VIVO EN EL ENFOQUE DE LOS RESERVORIOS HIV Y MEJORAS SEÑALADAS DE LA FARMACOCINETICA DE LOS MEDICAMENTOS.

Description

Formulaciones de liposomas para el tratamiento de enfermedades virales.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a formulaciones de liposomas y a su uso en el tratamiento de enfermedades virales, y en particular, en el tratamiento de infecciones ocasionadas por virus semejantes al virus de inmunodeficiencia humana y al citomegalovirus.
Antecedentes de la invención
Muchos agentes antivirales se han desarrollado para el tratamiento de pacientes con infección del virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Sin embargo, sólo se han observado beneficios limitados y temporales en los pacientes infectados con VIH que se han tratado con algunos de los antirretrovirales actuales o combinaciones de los mismos. La capacidad limitada de estos agentes para disminuir la carga viral, el rápido desarrollo de la resistencia y los efectos secundarios tóxicos de la mayoría de los fármacos han limitado su eficiencia a largo plazo. Un problema principal asociado con la administración de agentes antivirales es su pobre capacidad de penetrar y llegar a las células infectadas. La rápida eliminación de los fármacos y la toxicidad de los compuestos o metabolitos de origen constituyen también ciertos problemas principales que pueden hacer más lento el desarrollo y uso de muchos agentes antivirales. Dada la grave toxicidad de los agentes antivirales actualmente disponibles para tratar el SIDA y otras enfermedades virales y su capacidad limitada para llegar a las células infectadas, deben explorarse las estrategias dirigidas a alcanzar niveles terapéuticos de fármacos en las células afectadas y reducir la toxicidad. El encapsular los fármacos dentro de liposomas constituye un enfoque atractivo para mejorar la administración de los agentes activos hacia las células infectadas y para reducir los efectos tóxicos asociados con su administración. Los liposomas son vesículas microscópicas en las que puede incorporarse una variedad de fármacos. Debido a la similitud que presentan los componentes primarios de los liposomas con las membranas naturales, los liposomas son en general no tóxicos y biodegradables. Se cree que una mejor comprensión del papel de los liposomas como portadores de agentes antivirales puede conducir a nuevas estrategias que pueden mejorar la eficiencia y seguridad de los fármacos utilizados para el tratamiento del SIDA y otras enfermedades virales.
Actualmente existen bastantes pruebas que muestran que los macrófagos juegan un papel central en la fatogénesis de VIH, actuando como depósitos para la diseminación de los virus a través de todo el sistema inmune (Gendelman y otros, 1989, AIDS 3:475-495; Meltzer y otros, 1990; Ann. Rev. Immunol. 8:169-194). Recientemente se ha informado de que en la etapa temprana de la infección y a través de la etapa clínicamente latente, el VIH se acumula y replica activamente en los órganos linfoides a pesar de una actividad viral mínima en la sangre periférica (Pantaleo y otros, 1993, Nature 362:355-358; Embretson y otros, 1993, Nature 362:359-362: Fox y otros, 1994, Nature 370:256). Se ha informado que la elevada carga viral observada en los tejidos linfoides está asociada con partículas de VIH encapsuladas en las células dendríticas foliculares de los centros germinales. Durante el curso de la infección por HIV, la red de células dendríticas foliculares se rompe gradualmente y finalmente se destruye. Al igual que el microambiente de los tejidos linfoides es crucial para la respuesta inmunoefectiva, es primordial para reducir o evitar la acumulación de VIH dentro de los tejidos linfoides con objeto de conservar la integridad de la red microambiental. El uso de liposomas como sistema de administración de fármacos es particularmente relevante para controlar la progresión de la enfermedad VIH. Dado que los liposomas se absorben naturalmente por las células del sistema fagocito mononuclear (MPS), la terapia basada en liposomas debe concentrar a los agentes antivirales dentro de las células susceptibles a la infección VIH y, al mismo tiempo, reducir la cantidad de fármacos en los sitios en donde pudiera ser potencialmente tóxico. Los fármacos encapsulados dentro de liposomas podrían, por lo tanto, representar una estrategia conveniente para reducir la diseminación de VIH hacia los tejidos linfoides y conservar el microambiente de las células dendríticas foliculares que protege, probablemente, al huésped infectado contra el desarrollo del estado inmunodeficiente característico.
El uso de liposomas como un sistema de administración de fármacos podría ofrecer beneficios importantes en comparación con el fármaco en su forma original. Por ejemplo, los liposomas podrían proteger a los fármacos contra la degradación enzimática, mejorar su farmacocinética y la distribución de los tejidos y podrían permitir una liberación controlada de agentes terapéuticos hacia las células adecuadas. Además, la distribución y disponibilidad terapéutica de los liposomas pueden modularse a través de variaciones de su tamaño, lamelaridad, composición de lípido, carga y propiedades superficiales. Por lo tanto, resulta primordial adaptar las propiedades fisicoquímicas de los liposomas con el objetivo terapéutico deseado. Volviendo a las referencias citadas en el presente caso, el solicitante proporciona la siguiente información:
La publicación de patente WO 93/19738 describe las ventajas de usar fosfolípidos de PEG-acilo en combinación con otros componentes para formar liposomas que están modificados estéricamente. Los liposomas comprenden casi sistemáticamente un esterol. Además no se muestra el perfil de distribución de tejido en esta referencia. Simplemente se dice que el pulmón captura los liposomas que comprenden gentamicina, pero el hígado y el bazo son excluidos explícitamente como tejidos objetivo. Esos liposomas no tienen la composición que hace que sean capturados por los objetivos de VIH.
La publicación de patente WO 88/07854 describe ddCTP como un agente anti-viral encapsulado en liposomas. Los liposomas comprenden DPPC, DPPG y colesterol.
Las publicaciones de patente WO 90/14074 y USA 5.252.212 también describen componentes de liposomas que comprenden un esterol.
Es un objetivo de la presente invención generar formulaciones de liposomas efectivas de fármacos para el tratamiento del SIDA y otras enfermedades virales. Estos sistemas de suministro hacia un objetivo o diana podrían eventualmente resultar en una eficiencia aumentada y toxicidad reducida de los agentes antivirales en los humanos que sufren del SIDA y de otras enfermedades virales. Además, la biodisponibilidad mejorada del fármaco por la encapsulación del mismo dentro de liposomas, podría reducir el intervalo de dosificación y, en consecuencia, mejorar la calidad de vida de los pacientes infectados con el VIH y otros virus.
Sumario de la invención
La presente invención hace referencia a un método para el tratamiento de enfermedades virales que comprende la administración de agentes antivirales encapsulados en liposomas. La invención se refiere también a formulaciones de liposomas para el tratamiento de enfermedades virales y, más particularmente, al tratamiento de infecciones provocadas por virus tales como el VIH y CMV. Las formulaciones de los liposomas están compuestas de clases específicas de componentes lípidos y contienen un fármaco encapsulado efectivo contra la enfermedad viral. La originalidad de la presente invención es que estas formulaciones liposomales de fármacos permiten una alta penetración celular en diferentes líneas celulares, buena actividad antiviral in vitro contra VIH y CMV, eficiencia en dirigirse in vivo a los depósitos de VIH y una mejora marcada en la farmacocinética de los fármacos (ver ejemplos).
En una realización preferente, las formulaciones de liposomas están compuestas de diestearoilfosfatidilcolina (DSPC):diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG) en una proporción molar de 10:3, con un diámetro medio de partícula entre 0,05 y 0,5 \mum, y que contiene 2'-3'-dideoxiinosina (ddI) como un fármaco antiviral. En otra realización preferente, las formulaciones de liposomas están compuestas de DSPC:DSPG: diestearoilfosfatidil-etanolamina-polietilenglicol (DSPE-PEG) en una proporción molar de 10:3:1,45, con un diámetro medio de partícula entre aproximadamente 0,05 y 0,5 \mum, y contiene 2'-3'-dideoxiinosina (ddI) como un fármaco antiviral. En otra realización preferente, el polietilenglicol tiene un peso molecular de entre aproximadamente 500 y 5000 daltones. En todavía otra realización preferente, las formulaciones de liposomas están compuestas de DPPC:dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) en una proporción molar de 10:3, tienen un diámetro medio de partícula entre aproximadamente 0,05 y 0,5\mum y contienen foscarnet como fármaco antiviral.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1a y 1b muestran la acumulación de ddI liposomal y libre (20 \muM ddI) como una función del tiempo, en células U937 (figura 1a) y células RAW 264.7 (figura 1b). Las figuras 1c y 1d muestran la acumulación de ddC libre y liposomal (25 \muM ddC) como una fusión del tiempo, en células U937 (figura 1c) y células RAW 264.7 (figura 1d). Las figuras 1e y 1f muestran la acumulación de ddC libre y liposomal y foscarnet, respectivamente, como una función de la concentración del fármaco en las células RAW 264.7.
Las figuras 2a, 2b y 2d muestran la actividad antiviral de ddI libre y liposomal (40 \muM ddI), ddC (0,01 \muM ddC) y foscarnet (1 \muM Foscarnet), respectivamente, en células U937 infectadas con VIH-1_{IIIB}. Las figuras 2c y 2e muestran la actividad antiviral del ddC libre y liposomal (0,01 \muM ddC) y foscarnet (1 \muM Foscarnet), respectivamente, en células Molt-4 clona-8 infectadas con VIH-1_{IIIB}. La figura 2f muestra la actividad antiviral del foscarnet libre y liposomal (1 \muM) en células Supt-1 infectadas con VIH-1_{IIIB}. La figura 2g muestra la inhibición de la expresión de la proteína p72 de CMV en células de fibroblasto de pulmón humano (línea celular MRC-5) medicante foscarnet libre y liposomal (PFA y L-PFA, respectivamente).
Las figuras 3a, 3b, 3c representan la distribución de plasma y tejido del ddI libre (figura 3a), ddI liposomal (figura 3b) y lípidos liposomales (figura 3c) en ratas después de la administración del ddI libre o del ddI encapsulado en liposomas compuestos de DSPC:DSPG en una proporción molar de 10:3 y que tiene un diámetro medio de partícula de tamaño de 0,175\mum. Las figuras 3d y 3e representan la distribución de plasma y tejido del ddI liposomal (figura 3d) y lípidos liposomales (figura 3e) en ratas, después de la administración del ddI encapsulado en liposomas compuesto de DSPC:DSPG:DSPE-PEG, en una proporción molar de 10:3:1,45 y que tiene un diámetro medio de tamaño de partícula de 0,150 \mum. Las figuras 3f, 3g, 3h y 3i representan el plasma y la distribución de tejido de ddC libre y liposomal (ddC y L-ddC) en ratas, 1 hora (figuras 3f y 3h)y 3 horas (figuras 3g y 3i) después de la administración intravenosa (figuras 3f y 3g) o intraperitoneal (figuras 3h y 3i) del ddC libre o ddC encapsulado en liposomas compuestos de DPPC:DP:CHOL, en una proporción molar de 4:1:5, y que tiene un diámetro medio de partícula de tamaño de 0,300 \mum. Las figuras 3j, 3k y 3l muestran la distribución de plasma y tejido del foscarnet liposomal (figura 3j), foscarnet libre (figura 3k) y lípidos liposomales (figura 3l) en ratas, después de la administración del foscarnet libre o del foscarnet encapsulado en liposomas, compuestos de DPPC:DPPG en una proporción molar de 10:3 y que tienen un diámetro medio de partícula de tamaño de 0,165 \mum. En las figuras 3a a 3l, los valores representan las medias (\pm SEM) obtenidas de 4 a 6 animales por grupo por punto en el tiempo.
Descripción detallada de la invención Componentes lípidos
En los productos con base de liposomas es necesario utilizar características de bicapa de liposoma que permiten la alta eficiencia de la encapsulación del fármaco, así como una fuga reducida de los fármacos encapsulados, para aprovechar la capacidad de los liposomas para suministrar una alta cantidad de agentes antivirales hacia la célula infectada. En el caso de los fármacos que se encuentran en el ámbito de esta invención, estos requisitos se obtienen utilizando liposomas compuestos de una mezcla de diacilfosfatidilcolina y diacilfosfatidilglicerol (en una proporción molar que varía entre 10:1 y 1:1), en donde las cadenas de acilo están ya sea saturadas o insaturadas y tienen entre 14 y 18 átomos de carbono de longitud.
Los liposomas en la presente invención incluyen liposomas estabilizados estéricamente, definidos en esta memoria como liposomas compuestos de componentes lípidos mencionados antes y que se modifican por la incorporación de polímeros, tal como poloxámeros y poloxaminas, o de lípidos anfifáticos derivatizados con un polímero como DSPE-PGE ó dioleoilfosfatidiletanolamina-PEG (DOPE-PEG). Los detalles de las síntesis de DSPE-PEG se proporcionan en el Ejemplo 1. Los liposomas de la presente invención incluyen también inmunoliposomas, definidos en esta memoria como liposomas o liposomas estabilizados estéricamente compuestos de componentes lípidos mencionados antes y que se modifican por la unión de moléculas de anticuerpos que mejoran su habilidad para llegar directamente a las células específicas.
No todas las formulaciones liposomales probadas han mostrado ser eficientes en la encapsulación de fármacos y retención de fármacos. Por ejemplo, el encapsular ddI en liposomas compuestos de fosfatidilcolina de huevo:colesterol en una proporción molar de 55:45 mostró una eficiencia de la encapsulación del fármaco que fue de aproximadamente 30 veces menor a la observada para los liposomas compuestos de DSPC:DSPG en una proporción molar de 10:3. Por otra parte, sobre un 90% del ddI se liberó a partir de vesículas multilamelares compuestas de PC de huevo:colesterol:cardiolipina en una proporción molar de 35:45:10 después de solamente 1 hora de incubación en el suero humano. En contraste, sólo el 10% del ddI se liberó de vesículas multilamelares compuestas de DSPC:DSPG en una proporción molar de 10:3 en condiciones similares, después de 5 horas de incubación en suero humano.
Aún cuando los siguientes ejemplos describen las formulaciones liposomales específicas, se considera que pueden derivarse fácilmente de los mismos una familia de formulaciones liposomales, sin afectar las propiedades valiosas de las mismas. Por lo tanto, esta familia de compuestos comprende otras cadenas acilo de formulaciones de fosfolípidos dadas que han sido probadas en la práctica.
Preparación de liposomas
Un gran número de técnicas de preparación de liposomas se han desarrollado en el pasado en respuesta al número creciente de aplicaciones específicas de los liposomas como sistemas de administración de fármacos. La preparación de los liposomas en la presente invención puede hacerse por una variedad de técnicas, tal como las descritas en la literatura (Szoka and Papahadjopoulos, 1980, Ann. Rev. Biophys, Bioeng, 9:467-508; Nässander y otros, 1990, Liposomes in Biodegradable polymers as drug delivery systems. Pág. 261-338). Entre ellas, la técnica de hidratación de película delgada de lípido constituye un procedimiento rápido y simple para generar los liposomas. Los liposomas generados por esta técnica son, en su mayor parte, vesículas multilaminales y, en general, varían en tamaño de 0,2 a 10 \mum. La técnica de hidratación de película delgada de lípido se detalla en el Ejemplo 2. Otra técnica común de preparación de los liposomas es la técnica de evaporación de fase inversa descrita por Szoka y otros. En la Patente de los Estados Unidos Nº. 4.235.871. Los liposomas generados por esta técnica son unilamelares o plurilamelares y, en general, varían en tamaño entre 0,2 y 5 \mum. La técnica de evaporación en fase inversa se detalla en el Ejemplo 3.
Agentes antivirales
Cualquier inhibidor de la síntesis de ADN y/o ARN viral y/o proteasa VIH está bajo el alcance de la invención. En esta clase se incluyen los agentes antivirales tales como 3'-azido-3'-deoxitimidina (AZT), ddI, ddC, foscarnet, ribavirin, ganciclovir y saquinavir. La incorporación de estos fármacos dentro de los liposomas puede lograrse por uno o más de los métodos de cargado activo y/o pasivo, como los que se describen en la literatura (Mayer y otros, 1986, Chem. Phys. Lipids 40:333-345).
Las formulaciones de liposomas de la presente invención incluyen aquellas que tienen un diámetro medio de partícula de cualquier tamaño pero, con mayor preferencia, aquellos de entre aproximadamente 0,05 y 0,5 \mum. Estas formulaciones de liposomas de la presente invención incluyen también las preparadas con cualquier proporción molar de fármaco/lípido. Como ya se mencionó, la predisposición de los liposomas a ser absorbidos por las células del MPS debería concentrar los agentes antivirales encapsulados dentro de las células susceptibles al VIH o a otras infecciones virales, mejorando por lo tanto su eficiencia antiviral y reduciendo su toxicidad. Por lo tanto, los siguientes ejemplos pretenden demostrar la preparación de formulaciones liposomales específicas de fármacos antivirales que podrían ser muy eficientes para el tratamiento de infecciones con VIH y CMV, pero de ninguna forma pretenden limitar el alcance de la invención. Además, aún cuando el efecto de las formulaciones liposomales de los fármacos se ha verificado específicamente en dos especies virales, VIH y CMV, cualquier virus sensible al efecto de los inhibidores de síntesis de ADN y/o ARN viral y/o de proteasa VIH queda dentro del alcance de esta invención.
Ejemplo 1 Síntesis de DSPE-PEG
Se preparó diestearoilfosfatidiletanolamina-polietilenglicol (DSPE-PEG) como ya se describió anteriormente (Gabizon y Papahadjopoulos, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6949-6953; Klibanov y otros, 1990, FEBS Letters 268:235-237). En resumen, el metoxipolietilenglicol succinimidil succinato (PEG-Osu; PM 5000), el DSPE y trietilamina en una proporción molar de 3:1:3,5 conteniendo 0,01 \muCi de [^{14}C]-dioleoilfosfatidiletanolamina DOPE ([^{14}C]-DOPE) por \mumol de lípido se incubaron durante toda la noche a temperatura ambiente en CHCl_{3}. Posteriormente se evaporó el solvente bajo una corriente de nitrógeno y la mezcla seca resultante se hidrató con agua bidestilada. La solución de micelas se filtró a través de una columna (32x2cm) que contenía Bio-Gel A-1,5 M (Malla 50-100) para retirar el PEG-OSu no unido. Las fracciones pico que contenían DSPE-PEG se determinaron tanto por contaje de escintilación (para [^{14}C]-DOPE-PEG) como por lecturas de absorbancia a 225 nm (para PEG-OSu libre). Las fracciones que contenían DSPE-PEG se reunieron y se dializaron durante 24 horas contra agua utilizando una membrana de diálisis con un corte de peso molecular nominal (MWCO) de 300.000 (Spectra-Por, Spectrum Medical, Los Angeles, CA) y después se liofilizaron. El DSPE-PEG también puede obtenerse comercialmente en una variedad de pesos moleculares.
Ejemplo 2
Se encapsuló 2'-3'-dideoxiinosina (ddI) dentro de liposomas compuestos de DSPC:DSPG en una proporción molar de 10:3 y DSPC:DSPG:DSPE-PEG en una proporción molar de 10:3:1,45 utilizando hidratación de película delgada de lípido. El DSPE-PEG puede sintetizarse de acuerdo al Ejemplo 1 o también obtenerse comercialmente. En resumen, la mezcla de lípidos se disolvió en cloroformo:metanol (2:1 v/v) en presencia de una pequeña proporción de [^{14}C]-DPPC (<0,002% mol/mol) y posteriormente se evaporó el solvente en un matraz de fondo redondo para formar una película delgada de lípidos sobre la pared del matraz. La película de lípido se hidrató posteriormente con una solución reguladora de fosfatos (PBS, 145 mM, pH 7,4) de ddI en una proporción molar fármaco/lípido de 2, en la que se añadió una pequeña proporción de [^{3}H]-ddI marcada radiactivamente. Después de aproximadamente 30 minutos de reposo a temperatura ambiente, las vesículas multilamelares (MLV) se formaron con la agitación mecánica de la preparación liposomal a una temperatura superior a la de la transición de la fase de gel a la fase fluido de la mezcla del lípido. Las vesículas multilamelares se extruyeron con un dispositivo de extrusión de acero inoxidable (Lipex Biomembrane, Vancouver, BC) a través de membranas de policarbonato (Nuclepore, Cambridge, MA) de 0,2 \mum. La distribución de tamaño de las vesículas y la homogeneidad se evaluaron por dispersión de luz cuasi-elástica (QELS) con un analizador de partículas submicrónicas (modelo N4SD Coulter Electronics, Hialeah, FL). El diámetro medio de los liposomas extruidos fue de 0,175 \pm 0,035 \mum y de 0,15 \pm 0,01 \mum para las formulaciones DSPC:DSPG y DSPC:DSPG:DSPE-PEG, respectivamente. El fármaco no encapsulado se retiró por centrifugación (300 g durante 15 minutos a 4ºC) de la preparación liposomal (1 ml) a través de una columna de 10 ml de Sephadex G-50 grueso (Pharmacia LKB, Montreal, QC), por ultracentrifugación (160.000 g durante 90 minutos a 4ºC) o por diálisis contra un volumen determinado de PBS. La eficiencia del fármaco encapsulado fue determinada con el uso de un contador de escintilación líquido (modelo LS 6000TA, Beckman Instruments Canada Inc., Mississauga, ON).
Ejemplo 3 (con propósitos ilustrativos, no es parte de la invención)
Se encapsuló 2'-3'-dideoxicitidina (ddC) dentro de los liposomas compuestos de DPPC:DP:CHOL en una proporción molar de 4:1:5 utilizando el método de evaporación en fase inversa (Szoka y Papahadjopoulos, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198). En resumen, la mezcla del lípido se disolvió en cloroformo:metanol (2:1 v/v) en presencia de una pequeña proporción de colesteril [1-^{14}C] oleato y posteriormente se evaporó el solvente en un matraz de fondo redondo para formar una película delgada de lípido sobre la pared del matraz. La película del lípido después se redisolvió en isopropiléter:metanol (3:0,8 v/v). A esta fase orgánica se añadió una solución reguladora de fosfatos (PBS, 145 mM, pH 7,4) de ddC en una proporción molar de fármaco/lípido de 3:6, que contenía una pequeña proporción de [^{3}H]-ddC etiquetado radiactivamente. La mezcla de las dos fases se sometió posteriormente a sonificación durante 5 minutos en un baño ultrasónico a temperatura ambiente para dar una solución homogénea. El solvente orgánico se eliminó en vacío en condiciones controladas mediante retroevaporación a 50ºC. Las suspensiones de liposomas se extruyeron entonces a través de las membranas de policarbonato de 0,4 \mum. La homogeneidad y distribución del tamaño de las vesículas se evaluó por QELS. El diámetro medio de los liposomas extruidos fue de 0,300 \pm 0,08 \mum. El fármaco no encapsulado se retiró como ya se describió y la eficiencia de encapsulación del ddC se estimó por conteos de radioactividad.
Ejemplo 4
El foscarnet se encapsuló dentro de los liposomas utilizando el método de evaporación en fase inversa como se ha descrito para la preparación liposomal de ddC (Ejemplo 3), excepto que los componentes lípidos fueron DPPC:DPPG en una proporción molar de 10:3. En este caso, la proporción molar de fármaco/lípido fue de 5, y [^{3}H]-DPPC y [^{14}C]-foscarnet se utilizaron como marcadores de lípidos y fármacos, respectivamente. Las suspensiones de liposoma se extruyeron a través de membranas de policarbonato de 0,2 \mum, generando liposomas con un diámetro medio de 0,165 \pm 0,030 \mum. El fármaco no encapsulado se retiró como se describió antes y la eficiencia de encapsulación de foscarnet se calculó por conteos de radioactividad.
Ejemplos que comparan los fármacos liposomales con la administración celular de fármacos libres Absorción celular
Hemos efectuado experimentos in vitro para evaluar la acumulación de agentes anti-VIH encapsulados en liposomas y libres, en células RAW 264.7 de monocito-macrófago de murina y en células U937 de premonocitoide humano. En resumen, los experimentos se efectuaron incubando células confluentes en un medio de cultivo en presencia de diferentes concentraciones de los agentes anti-VIH encapsulados en liposomas y libres, en los que se añadió una pequeña proporción de los lípidos y los fármacos marcados radiactivamente. A diferentes tiempos de incubación, el medio se retiró y las células se lavaron y trataron con una solución de Triton X-100. La absorción de fármacos y lípidos se determinó midiendo el nivel de radioactividad con un contador de escintilación en líquidos. La concentración de proteína para cada muestra se determinó con un ensayo de proteína de ácido bicinconínico Pierce (Rockford, IL) en placas de microtitulación. Los resultados mostraron que la incorporación del ddC en liposomas mejora en gran medida la absorción del fármaco tanto en células RAW 264.7 como en células U937 (figuras 1c, 1d y 1e). De manera similar, el foscarnet liposomal se acumuló mucho mejor que el fármaco libre en las células RAW 264.7 (figura 1f). En contraste, aunque el nivel de absorción del ddI liposomal en estas células fue similar al de las formulaciones liposomales del ddC o foscarnet, se observó una acumulación mayor del ddI libre en las dos líneas celulares (figuras 1a y 1b) sugiriendo una mayor permeabilidad de la membrana de estas líneas celulares hacia el ddI en comparación con otros agentes anti-VIH.
Eficiencia antiviral in vitro
La eficiencia antiviral de las formulaciones liposomales de los fármacos antivirales también se evaluó en diferentes líneas celulares. En resumen, las células se infectaron con diferentes cepas de VIH con una multiplicidad de infecciones de 1 (virus/célula objetivo) y se trataron con diferentes concentraciones de fármacos encapsulados en liposomas y libres. La replicación del virus se inspeccionó a diferentes intervalos de tiempo midiendo la actividad de transcriptasa inversa en los sobrenadantes de células libres o la proteína viral p24 utilizando una prueba enzimática. La trascripción del virus también se inspeccionó por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) con análisis de 24 horas después del tratamiento utilizando un par cebador VIH (M661/M667). La evaluación PCR se normalizó en relación a la cantidad del gen de \beta-globina humana en células. La viabilidad de las células se determinó utilizando un ensayo colorimétrico con base en tetrazolio (MTT). Los resultados mostraron que la incorporación del ddC en liposomas fue comparable o incluso mejor que la eficiencia anti-VIH que el agente libre contra la replicación VIH-1_{IIIB} en las células U937 y Molt-4 clona-8 (figuras 2b y 2c). Similarmente, el foscarnet liposomal mostró una eficiencia comparable o incluso mejor en el aspecto antiviral que el fármaco no encapsulado contra la replicación de VIH-1_{IIIB} en las células U937 y Molt-4 clona-8 y Supt-1 (figuras 2d, 2e, y 2f). Aunque la eficiencia antiviral de las formulaciones liposomales de ddI fue menor a la del agente libre contra la replicación VIH-1_{IIIB} en células U937 (figura 2a), se observó una mayor eficiencia anti-VIH para ddI liposomal contra la replicación VIH-1_{Ada-M} en macrófagos derivados de monocitos (tabla 1). Se aprecia que como los liposomas se absorben preferentemente por las células de MPS, es mucho más probable observar una eficiencia superior anti-VIH de los fármacos liposomales respecto a los fármacos libres en situaciones in vivo.
(Tabla pasa a página siguiete)
TABLA 1
1
^{a} Las células mononucleares de sangre periférica se suspendieron en un medio de sembrado en una placa de 48 pocillos a una densidad de 3x10^{6} células/ml. Cinco días después de la iniciación de los cultivos, se retiraron las células no adherentes por el enjuagado de los cultivos cuatro veces con PBS. Las células adherentes se preincubaron primero en presencia o ausencia de medio que contenía fármaco durante 2 horas antes de la inoculación de 10.000 cpm/pocillo de la cepa de monocitotrópica Ada-M del VIH-1. Posteriormente, el medio se cambió una vez cada 4 a 5 días y se reemplazó con medio suplementado o no suplementado con ddI. La replicación del virus se supervisó midiendo los niveles p24 utilizando un ensayo enzimático.
La actividad anti-CMV del foscarnet encapsulado en liposomas y del foscarnet libre también se evaluó en células de fibroblasto de pulmón embriónico (línea celular MRC-5). En resumen, las células se infectaron con la cepa AD169 del CMV humano y se trataron con una serie de diluciones del foscarnet liposomal y foscarnet libre. Después de una incubación de 96 horas, las células se fijaron y se efectuó un teñido de inmunoperoxidasa utilizando un anticuerpo monoclonal dirigido contra una proteína CMV inmediata temprana de 72 kDa. Las placas marcadas se contaron y los resultados se expresaron como porcentaje de células de control infectadas y no tratadas contra concentración de foscarnet. Los resultados mostraron que el foscarnet libre y el foscarnet liposomal tienen una actividad inhibitoria comparable contra la expresión de la proteína p72 CMV en la línea celular MRC-5 (figura 2g).
Estudios in vivo
Las propiedades farmacocinéticas y la distribución de tejido de los agentes anti-VIH encapsulados en liposoma y libres se investigó en ratas. En resumen, los fármacos encapsulados en liposomas y los fármacos libres se inyectaron en ratas hembra Sprague-Dawley como una sola dosis de bolo intravenoso, mediante un catéter insertado a través de la vena yugular de los animales. En puntos específicos en el tiempo, los animales se sacrificaron y la sangre se recogió en tubos heparinizados y se separó por centrifugación. Al mismo tiempo, los tejidos seleccionados se retiraron, se lavaron, se pesaron y homogeneizaron. Los tejidos y el plasma se trataron después de acuerdo a un procedimiento de solubilizante comercial de tejido. La determinación de los niveles de fármaco y lípido en todas las muestras se inspeccionó con trazadores radioactivos.
Los resultados mostraron evidentemente que la encapsulación de los agentes antivirales dentro de los liposomas da por resultado una acumulación mucho mayor del fármaco en los tejidos ricos en macrófagos, respecto a la observada para los fármacos no encapsulados (figuras 3a a 31). La administración de una cantidad mayor de agentes antivirales en estos tejidos susceptibles a la infección con VIH y la administración reducida de los fármacos en los sitios en donde pudieran ser potencialmente tóxicos, debería dar por resultado una eficiencia mayor y toxicidad reducida de los agentes anti-VIH. Con particular interés mostramos que la acumulación del foscarnet liposomal en los nodos linfáticos fue 8 veces mayor que aquélla del agente libre (tabla 2; misma formulación que en las figuras 3j, 3k y 3l:10 mg de foscarnet/kg).
TABLA 2
2
^{a} Valores expresados en nmol de foscarnet/g de tejido/hora, se calcularon a partir de los valores medios del perfil de distribución de tejido utilizando la regla trapezoidal.
Una acumulación aumentada del fármaco también se observó en el cerebro de los animales cuando se inyectó a los animales el foscarnet liposomal en lugar del agente libre. Esta característica es de importancia primordial, ya que están involucradas enfermedades del sistema nervioso central graves en la patología del VIH. Además, como los datos de los presentes inventores demostraron una acumulación mejorada del fármaco en los ojos después de la inyección del foscarnet liposomal en lugar del fármaco libre, la administración del foscarnet encapsulado en liposomas debe mejorar la eficiencia del fármaco contra el CMV en pacientes infectados con VIH y tratados para la retinitis de CMV. También se observó una farmacocinética mejorada durante el encapsulado de los agentes antivirales dentro de los liposomas (tablas 3 y 4; mismas formulaciones que en las figuras 3a a 3e y 3j a 3l). La eliminación sistémica de los fármacos encapsulados fue mucho menor que la de los agentes libres, dando como resultado un aumento mayor de la vida media de los fármacos liposomales. La farmacología mejorada de los agentes antivirales con la encapsulación en liposomas puede reducir de manera esperada la dosis de agentes antivirales utilizada en la terapia convencional, así como la frecuencia de la administración de los agentes anti-VIH, mejorando, por lo tanto, la calidad de vida de los pacientes con SIDA y otras enfermedades virales.
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 3
3
^{a} Los parámetros se calcularon a partir de las curvas de concentración de plasma-tiempo utilizando un modelo no compartimental.
^{\dagger} Abreviaturas: t_{1/2}, vida media de eliminación; AUC_{0-\infty}, área bajo la curva de concentración de plasma-tiempo desde cero hasta el infinito; K_{el}, constante de velocidad de eliminación; vd_{ss}, volumen de distribución en estado estable; Cl, eliminación sistémica; MRT, tiempo de residencia medio.
TABLA 4
4
^{a} Los valores se expresan como medias \pm desviación estándar obtenidas de 6 animales por grupo por punto en el tiempo.
^{\dagger} Abreviaturas: t_{1/2}, vida media de eliminación; AUC_{0->\infty}, área bajo la curva de concentración de plasma-tiempo desde cero hasta el infinito; K_{el}, constante de velocidad de eliminación; vd_{ss}, volumen de distribución en estado estable; Cl, eliminación sistémica; MRT, tiempo de residencia medio.

Claims (8)

1. Liposoma para el tratamiento de una enfermedad viral, que comprende: i) un componente lípido que esencialmente consiste en una mezcla de diacilfosfatidilcolina y diacilfosfatidilglicerol en una proporción molar que varía entre 10:1 y 1:1, en el que las cadenas de acilo son palmitoilo o estearoilo, y ii) una cantidad terapéutica de un fármaco encapsulado efectivo contra dicha enfermedad viral.
2. Liposoma, como se definió en la reivindicación 1, en el que dicha relación molar es 10:3.
3. Liposoma para el tratamiento de una enfermedad viral, que esencialmente consiste en: i) un componente lípido que esencialmente comprende una mezcla de diacilfosfatidilcolina, diacilfosfatidilglicerol y un polietilenglicol conjugado a una diacilfosfatidiletanol-amina y ii) una cantidad terapéutica de un fármaco encapsulado efectivo contra dicha enfermedad viral.
4. Liposoma, según la reivindicación 3, en el que el polietilenglicol tiene un peso molecular entre aproximadamente 500 y aproximadamente 5000 daltons.
5. Liposoma, según la reivindicación 3, en el que el diacilfosfatidilcolina, diacilfosfatidilglicerol, y diacilfosfatidiletanolamina-polietilenglicol están presentes en una proporción molar de 10:3:1,45.
6. Liposoma, según la reivindicación 1 ó 2, en el que el componente lípido comprende una mezcla de dipalmitoilfosfatidilcolina y de dipalmitoil-fosfatidilglicerol, o una mezcla de diestearoilfosfatidilcolina y de diestearoilfosfatidilglicerol.
7. Liposoma, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el fármaco encapsulado se selecciona del grupo que consiste en 3'-azido-3'deoxitimidina (AZT), ddI, ddC, foscarnet, ribavirina, ganciclovir y saquinavir.
8. Liposoma, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene un diámetro medio de partícula comprendido entre aproximadamente 0,05 y 0,5 \mum.
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