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ES2299434T3 - Inhibidores de kinasa utilizados como agentes terapeuticos. - Google Patents

Inhibidores de kinasa utilizados como agentes terapeuticos. Download PDF

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ES2299434T3
ES2299434T3 ES00963510T ES00963510T ES2299434T3 ES 2299434 T3 ES2299434 T3 ES 2299434T3 ES 00963510 T ES00963510 T ES 00963510T ES 00963510 T ES00963510 T ES 00963510T ES 2299434 T3 ES2299434 T3 ES 2299434T3
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kinase
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ES00963510T
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English (en)
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Gavin C. Hirst
Kurt Ritter
Paul Rafferty
Stephen St.Gallay
David Calderwood
Helen L. Twigger
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Original Assignee
Abbott GmbH and Co KG
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Abstract

Un compuesto de Fórmula (I), las mezclas racémicas diastereoméricas, isómeros ópticos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, (Ver fórmula) en donde: R1 es (Ver fórmula) Z 100 es un fenilo opcionalmente sustituido, donde Z 100 es opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes, cada uno de ellos independientemente seleccionado de entre el grupo consistente en F, Cl, CN, NO 2, -alquilo opcionalmente sustituido, -O-(alquilo opcionalmente sustituido), -C(O)H, -CONH2, -NHSO2CF3, heteroarilo opcionalmente sustituido, COOH, -Z 105 -C(O)N(R)2, -Z 105 -N(R)-C(O)-Z 200 , -Z 105 -N(R)-S(O)2-Z 200 y -Z 105 -N(R)-C(O)-N(R)-Z 200 ; Z 105 es un enlace covalente o (C 1-C 6); Z 200 es un grupo opcionalmente sustituido, seleccionado de entre el grupo consistente en (C1-C6), fenilo y -(C1- C6)-fenilo; Z 110 y Z 111 son independientemente cada uno de ellos un enlace covalente y A es O; Ra es hidrógeno; R3 es H; R2 es -Z 101 -Z 102 ; Z 101 es un enlace covalente; Z 102 es un grupo cicloalquilo sustituido o insustituido.

Description

Inhibidores de kinasa utilizados como agentes terapéuticos.
Existen al menos 400 enzimas identificadas como proteínas quinasas. Estas enzimas catalizan la fosforilación de sustratos proteicos diana. La fosforilación usualmente se trata de una reacción de transferencia de un grupo fosfato de ATP al sustrato proteico. La estructura específica en el sustrato diana al cual es transferido el fosfato es un residuo de tirosina, serina o treonina. Debido a que estos residuos aminoacídicos son las estructuras diana para la transferencia de fosforilación, estas enzimas proteínas quinasas son denominadas usualmente tirosinas quinasas o serinas/treoninas quinasas.
Las reacciones de fosforilación y las reacciones fosfatasas inversas, en los residuos de tirosina, serina y treonina, están involucradas en incontables procesos celulares que subyacen en las respuestas a diversas señales intracelulares (usualmente mediadas a través de receptores celulares), en la regulación de funciones celulares y en la activación o desactivación de procesos celulares. A menudo, una cascada de proteínas quinasas participa en la transducción de la señal intracelular y son necesarias para la realización de estos procesos celulares. Debido a su ubicuidad en estos procesos, las proteínas quinasas pueden ser encontradas como una parte integral de la membrana plasmática o como enzimas citoplasmáticas, o pueden estar localizadas en el núcleo, a menudo como componentes de complejos enzimáticos. En muchos casos, estas proteínas quinasas constituyen un elemento esencial de complejos enzimáticos y proteínicos estructurales que determinan dónde y cuándo tiene lugar un proceso celular dentro de una célula.
Proteínas Tirosinas Quinasas. Las proteínas tirosinas quinasas (PTKs) son enzimas que catalizan la fosforilación de residuos específicos de tirosina en las proteínas celulares. Esta modificación postraslacional de estas proteínas sustrato -a menudo ellas mismas enzimas- actúa como un interruptor molecular, regulando la proliferación celular, la activación o diferenciación (para revisión, véase Schlessinger y Ulrich, 1992, Neuron 9:383-391). Ha sido observada una actividad aberrante o excesiva de la PTK en muchos estados de enfermedad, incluyendo desórdenes proliferativos benignos o malignos, así como enfermedades resultantes de la activación inapropiada del sistema inmune (e.g., desórdenes autoinmunes), rechazo a aloinjertos y enfermedad de injerto contra huésped. Además, los receptores de las PTKs específicos para las células endoteliales, como el KDR y el Tie-2, median en el proceso angiogénico y, de esta forma, se encuentran involucrados en el soporte para la progresión de cánceres y otras enfermedades que implican una vascularización inapropiada (e.g., retinopatía diabética, neovascularización coroidal debida a degeneración macular asociada a la edad, psoriasis, artritis, retinopatía del prematuro, hemangiomas infantiles).
Las tirosinas quinasas pueden ser del tipo receptor (poseyendo dominios extracelulares, transmembranosos e intracelulares) o del tipo no receptor (siendo totalmente intracelulares).
Receptores Tirosina Quinasa (RTKs). Los RTKs comprenden una gran familia de receptores transmembranosos con diversas actividades biológicas. En la actualidad, han sido identificadas al menos diecinueve (19) subfamilias distintas de RTKs. La familia del receptor tirosina quinasa (RTK) incluye receptores que son cruciales para el crecimiento y diferenciación de una variedad de tipos celulares (Yarden y Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57:433-478, 1988; Ullrich y Schlessinger, Cell 61:243-254, 1990). La función intrínseca de los RTKs es activada al unirse a ligando, lo cual da como resultado la fosforilación del receptor y de múltiples sustratos celulares y, posteriormente, una variedad de respuestas celulares (Ullrich y Schlessinger, 1990, Cell 61:203-212). De esta manera, la transducción de señal mediada por el receptor tirosina quinasa es iniciada a través de la interacción extracelular con un factor de crecimiento específico (ligando), usualmente seguido de la dimerización del receptor, estimulación de la actividad intrínseca de la proteína tirosina quinasa y transfosforilación del receptor. De esta forma, son creados sitios de unión para las moléculas intracelulares transductoras de señal y se lleva a la formación de complejos con un espectro de moléculas señalizadoras citoplasmáticas que facilitan la respuesta celular apropiada (e.g., división celular, diferenciación, efectos metabólicos, cambios en el microambiente extracelular) véase Schlessinger y Ullrich, 1992, Neuron 9:1-20.
Proteínas con dominios SH2 (src-homología 2), o de unión a fosfotirosina (PTB), se unen a receptores activados de tirosina quinasa y sus sustratos con alta afinidad, con el fin de propagar señales dentro de la célula. Ambos dominios reconocen a la fosfotirosina (Fantl et al., 1992, Cell 69:413-423; Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777-2785; Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778; y Koch et al., 1991, Science 252: 668-678; Shoelson, Curr. Opin. Chem. Biol. (1997), 1(2), 227-234; Cowburn, Curr. Opin. Struct. Biol. (1997), 7(6), 835-838). Han sido identificadas varias proteínas del sustrato intracelular que se asocian a los receptores tirosina quinasa (RTKs). Pueden ser divididas en dos grupos principales: (1) sustratos que poseen un dominio catalítico; y (2) sustratos a los que les falta dicho dominio pero que sirven como adaptadores y se asocian a moléculas catalíticamente activas (Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778). La especificidad de las interacciones entre receptores o proteínas y los dominios SH2 o PTB de sus sustratos, es determinada por los residuos aminoacídicos que se encuentran en los alrededores rodeando el residuo de tirosina fosforilada. Por ejemplo, las diferencias en las afinidades de unión entre los dominios SH2 y las secuencias aminoacídicas que rodean los residuos de fosfotirosina en determinados receptores se correlacionan con las diferencias observadas en sus perfiles de fosforilación del sustrato (Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778). Las observaciones sugieren que la función de cada receptor tirosina quinasa es determinada no solo por su perfil de expresión y disponibilidad de ligando, sino también por el grupo de rutas de transducción de señales aguas abajo que son activadas por un determinado receptor, así como por el momento y duración de esos estímulos. De esta manera, la fosforilación proporciona una importante fase de regulación que determina la selectividad de las rutas de señalización escogidas por receptores específicos de factores de crecimiento, así como por receptores de factores de diferenciación.
Se ha sugerido que algunos receptores tirosina quinasa, tales como el FG-FR-1, el PDGFR, el TIE-2 y el c-Met, y factores de crecimiento que se unen a los mismos, juegan un papel en la angiogénesis, aunque algunos pueden promover la angiogénesis de forma indirecta (Mustonen y Alitalo, J. Cell Biol. 129:895-898, 1995). Uno de tales receptores tirosina quinasa, conocido como "quinasa de hígado fetal 1" (FLK-1), es un miembro de la subclase de tipo III de los RTKs. Una denominación alternativa para el FLK-1 humano es "receptor con dominio inserto-quinasa" (KDR) (Terman et al., Oncogene 6:1677-83, 1991). Otra denominación alternativa para el FLK-1/KDR es "receptor 2 del factor de crecimiento celular endotelial vascular" (VEGFR-2) ya que éste se une a VEGF con una alta afinidad. La versión murina del FLK-1/VEGFR-2 ha sido denominada también NYK (Oelrichs et al., Oncongene 8(1):11-15, 1993). Han sido aislados ADNs codificando para FLK-1 de ratón, rata y humano, y se ha informado sobre el nucleótido y las secuencias aminoacídicas codificadas (Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9026-30, 1991; Terman et al., 1991, supra; Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187:1579-86, 1992; Sarzani et al., supra; y Millauer et al., Cell 72:835-846, 1993). Numerosos estudios, tales como los presentados por Milloauer et al., supra, sugieren que el VEGF y el FLK-1/KDR/VEGFR-2 son un par de ligando-receptor que juega un papel importante en la proliferación de células endoteliales vasculares, y en la formación y aparición de vasos sanguíneos, denominadas vasculogénesis y angiogénesis, respectivamente.
Otra subclase de RTK de tipo III denominada "tirosina quinasa de tipo fms-1" (Flt-1) está relacionada con el FLK-1/KDR (DeVries et al., Science 255:989-991, 1992; Shibuya et al., Oncogene 5:519-524, 1990). Una denominación alternativa para el Flt-1 es "receptor 1 del factor de crecimiento celular endotelial vascular" (VEGFR-1). Hasta el momento, ha sido descubierto que los miembros de las subfamilias FLK-1/KDR/VEGFR-2 y Flt-1/VEGFR-1 son expresados principalmente en las células endoteliales. Estos miembros de la subclase son especialmente estimulados por los miembros de la familia de ligandos del factor de crecimiento celular endotelial vascular (VEGF) (Klagsburn y D'Amore, Cytokine & Growth Factor Reviews 7:259-270, 1996). El factor de crecimiento celular endotelial vascular (VEGF) se une al Flt-1 con una mayor afinidad que al FLK-1/KDR y es mitogénico para las células endoteliales vasculares (Terman et al., 1992, supra; Mustonen et al., supra; DeVries et al., supra). Se cree que el Flt-1 es esencial para la organización endotelial durante el desarrollo vascular. La expresión del Flt-1 se asocia con el desarrollo vascular temprano en embriones de ratón, y con la neovascularización durante la sanación de heridas (Mustonen y Alitalo, supra). La expresión del Flt-1 en monocitos, osteoclastos y osteoblastos, así como en tejidos adultos -tales como el glomérulo de riñón-, sugiere una función adicional para este receptor que no está relacionada con el crecimiento celular (Mustonen y Alitalo, supra).
Conforme es mencionado previamente, la evidencia reciente sugiere que el VEGF juega un papel en la estimulación tanto de la angiogénesis normal como de la patológica (Jakeman et al., Endocrinology 133:848-859, 1993; Kolch et al., Breast Cancer Research and Treatment 36:139-155, 1995; Ferrara et al., Endocrine Reviews 18(1); 4-25, 1997; Ferrara et al., Regulation of Angiogenesis (ed. L. D. Goldberg y E. M. Rosen), 209-232, 1997). Además, el VEGF se ha visto implicado en el control y mejora de la permeabilidad vascular (Connolly, et al., J. Biol. Chem. 264:20017-20024, 1989; Brown et al., Regulation of Angiogenesis (ed. L. D. Goldberg y E. M. Rosen), 233-269, 1997). Se ha informado sobre diferentes formas de VEGF resultantes del empalme alternativo del ARNm, incluyendo las cuatro especies descritas por Ferrara et al. (J. Cell. Biochem. 47:211-218, 1991). Han sido identificadas por Ferrara et al. supra tanto las especies de VEGF secretadas como las predominantemente asociadas a células, y se sabe que la proteína existe en forma de dímeros ligados por puentes disulfuro.
Han sido identificados recientemente algunos homólogos relacionados de VEGF. Sin embargo, sus papeles en procesos fisiológicos normales y en los de enfermedad no han sido dilucidados aún. Además, los miembros de la familia del VEGF son a menudo expresados conjuntamente con VEGF en un número de tejidos y, por lo general, son capaces de formar heterodímeros con VEGF. Esta propiedad altera probablemente la especificidad receptora y los efectos biológicos de los heterodímeros y complica adicionalmente la dilucidación de sus funciones específicas, conforme es ilustrado más abajo (Korpelainen y Alitalo, Curr. Opin. Cell Biol., 159-164, 1998 y referencias citadas en el mismo).
El factor de crecimiento placentario (P1GF) posee una secuencia aminoacídica que exhibe una homología significativa con la secuencia del VEGF (Park et al., J. Biol. Chem. 269:25646-54, 1994; Maglione et al., Oncogene 8:925-31, 1993). Al igual que sucede con el VEGF, surgen diferentes especies de P1GF del empalme alternativo del ARNm, y la proteína existe en forma dimérica (Park et al., supra). El P1GF-1 y el P1GF-2 se unen al Flt-1 con una alta afinidad, y el P1GF-2 se une también ávidamente a la neuropilina-1 (Migdal et al., J. Biol. Chem. 273(35): 22272-22278), pero ninguno de ellos se une al FLK-1/KDR (Park et al., supra). Se ha informado de que el P1GF potencia tanto la permeabilidad vascular como el efecto mitogénico del VEGF en las células endoteliales cuando se encuentra presente el VEGF en bajas concentraciones (supuestamente debido a la formación del heterodímero) (Park et al., supra).
El VEGF-B es producido como dos isoformas (de 167 y 185 residuos) que según parece también se unen al Flt-1/VEGFR-1. Esto puede jugar un papel en la regulación de la degradación de la matriz extracelular, en la adhesión celular y en la migración a través de la modulación de la expresión y actividad del activador del plasminógeno de tipo uroquinasa y el inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 (Pepper et al., Proc. Natl. Acad. Scie. U.S.A. (1998), 95(20):11709-11714).
El VEGF-C fue clonado originalmente como un ligando para el VEGFR-3/Flt-4, el cual es expresado principalmente por las células endoteliales linfáticas. En su forma procesada completa, el VEGF-C puede unirse también al KDR/VEGFR-2 y estimular la proliferación y migración de las células endoteliales en modelos in vitro y la angiogénesis en modelos in vivo (Lymboussaki et al., Am. J. Pathol. (1998), 153(2):395-403; Witzenbichler et al., Am. J. Pathol. (1998), 153(2), 381-394). La sobreexpresión transgénica del VEGF-C causa la proliferación y aumento únicamente de los vasos linfáticos, mientras que los vasos sanguíneos no se ven afectados. A diferencia del VEGF, la expresión del VEGF-C no es inducida por hipoxia (Ristimaki et al., J. Biol. Chem. (1998), 273(14), 8413-8418).
El más recientemente descubierto VEGF-D es estructuralmente muy similar al VEGF-C. Se ha informado de que el VEGF-D se une y activa, al menos, el VEGFRs, el VEGFR-3/Flt-4 y el KDR/VEGFR-2. Originalmente fue clonado como un mitógeno inducible de c-fos para los fibroblastos y es predominantemente expresado por las células mesenquimales del pulmón y de la piel (Achen et al., Proc. Nalt. Acad. Sci. U.S.A (1998), 95(2), 548-553 y referencias en el mismo).
En cuanto al VEGF, VEGF-C y VEGF-D, se ha reivindicado que inducen incrementos en la permeabilidad vascular in vivo en un ensayo de Miles, cuando son inyectados en tejido cutáneo (PCT/US97/14696; WO98/07832, Witzenbichler et al., supra). Siguen siendo inciertos el papel fisiológico y la importancia de estos ligandos en la modulación de la hiperpermeabilidad vascular y en las respuestas endoteliales en tejidos donde son expresados.
Ha sido informado recientemente un factor de crecimiento endotelial vascular de tipo novel, codificado viralmente, el VEGF-E (NZ-7 VEGF). Éste utiliza de forma preferente el receptor KDR/Flk-1 y porta una potente actividad mitótica careciendo del dominio de unión a la heparina (Meyer et al., EMBO J. (1999), 18(2), 363-374; Ogawa et al., J. Biol. Chem. (1998), 273(47), 31273-31282). Las secuencias VEGF-E poseen un 25% de homología con respecto al VEGF de mamífero, y son codificadas por el parapoxvirus, virus Orf (OV). Este parapoxvirus, que afecta a las ovejas y cabras y, ocasionalmente, a los humanos, genera lesiones por medio de la angiogénesis. El VEGF-E es un dímero de alrededor de 20 kDa que carece de dominio básico y no presenta afinidad con la heparina, pero posee el motivo característico de "nudo de cisteína" presente en todos los VEGFs de mamífero, y sorprendentemente se descubrió que posee potencia y bioactividades similares a las de la isoforma VEGF165 de unión a la heparina del VEGF-A, i.e., ambos factores estimulan la liberación del factor tisular (TF), la proliferación, quimiotaxis y aparición de células endoteliales vasculares cultivadas in vitro, y la angiogénesis in vivo. Al igual que el VEGF165, se descubrió que el VEGF-E se une con una alta afinidad al receptor VEGF-2 (KDR), dando como resultado la autofosforilación del receptor y un aumento bifásico en las concentraciones de Ca2+ intracelular libre, mientras que, a diferencia del VEGF165, el VEGF-E no se une al receptor VEGF-1 (Flt-1).
Basándose en recientes descubrimientos de otros homólogos del VEGF y del VEGFRs, y en los precedentes de heterodimerización de ligando y receptor, las acciones de tales homólogos del VEGF pueden implicar la formación de heterodímeros ligando de VEGF y/o la heterodimerización de receptores, o la unión a un VEGFR aún no descubierto (Witzenbichler et al., supra). Asimismo, recientes informes sugieren que la neuropilina-1 (Migdal et al., supra) o el VEGFR-3/Flt-4 (Witzenbichler et al., supra), o receptores distintos del KDR/VEGFR-2 pueden estar involucrados en la inducción de permeabilidad vascular (Stacker, S.A., Vitali, A., Domagala, T., Nice, E., y Wilks, A.F., "Angiogenesis and Cancer" Conference, Amer. Assoc. Cancer Res., enero 1998, Orlando, FL; Williams, Diabetelogia 40:S118-120 (1997)). Hasta ahora, no ha sido revelada evidencia directa del papel esencial del KDR en la hiperpermeabilidad vascular mediada por VEGF.
Las Tirosinas Quinasas no Receptoras. Las tirosinas quinasas no receptoras representan una colección de enzimas celulares que carecen de secuencias extracelular y transmembranosa. Hasta el momento, han sido identificadas alrededor de veinticuatro tirosinas quinasas no receptoras individuales, comprendiendo once (11) subfamilias (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap 70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack y LIMK). En la actualidad, la subfamilia Src de tirosinas quinasas no receptoras está compuesta del mayor número de PTKs e incluye Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr e Yrk. La subfamilia de enzimas Src ha sido ligada a la oncogénesis y a las respuestas inmunes. Es proporcionado un estudio más detallado de las tirosinas quinasas no receptoras en Bolen, 1993, Oncogene 8:2025-2031, el cual es incorporado aquí a modo de referencia.
Se ha descubierto que muchas de estas tirosinas quinasas -tanto si es una tirosina quinasa RTK como si es una no receptora- están involucradas en rutas de señalización celular implicadas en numerosas afecciones patogénicas, incluyendo el cáncer, la psoriasis y otros desórdenes hiperproliferativos o respuestas hiperinmunes.
Desarrollo de Compuestos para Modular las PTKs. En vista de la inferida importancia de las PTKs en el control, regulación y modulación de la proliferación celular, las enfermedades y trastornos asociados con la proliferación celular anormal, ha sido realizados muchos intentos para identificar los "inhibidores" de las tirosinas quinasas receptoras y no receptoras, utilizando una variedad de enfoques, incluyendo el uso de ligandos mutantes (Solicitud U.S. nº 4.966.849), de receptores y anticuerpos solubles (Solicitud nº WO94/10202; Kendall y Thomas, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10705-09; Kim et al., 1993, Nature 362:841-844), de ligandos ARN (Jellinek, et al., Biochemistry 33: 10450-56; Takano, et al., 1993, Mol. Bio. Cell 4:358A; Kinsella, et al., 1992, Exp. Cell Res. 199: 56-62; Wright, et al., 1992, J. Cellular Phys. 152: 448-57) y de inhibidores de la tirosina quinasa (WO94/03427; WO92/21660; WO91/15495; WO94/14808; Patente U.S. nº 5.330.992; Mariani, et al., 1994, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 35:2268).
Más recientemente, han sido hechos intentos para identificar pequeñas moléculas que actúan como inhibidores de la tirosina quinasa. Por ejemplo, compuestos arilo bis monocíclicos, bicíclicos o heterocíclicos (PCT WO92/20642) y derivados vinileno-azaindólicos (PCT WO94/14808) han sido descritos por lo general como inhibidores de la tirosina quinasa. Los compuestos de estirilo (Patente U.S. nº 5.217.999), los compuestos piridilo sustituidos con estirilo (Patente U.S. nº 5.302.606), ciertos derivados de la quinazolina (Solicitud EP nº 0 566 266 A1; Expert Opin. Ther. Pat. (1998), 8(4):475-478), los selenoindoles y los selenidos (PCT WO94/03427), compuestos polihidroxílicos tricíclicos (PCT WO92/21660) y los compuestos de ácido bencil fosfónico (PCT WO91/15495) han sido descritos como compuestos para su utilización como inhibidores de la tirosina quinasa, para uso en el tratamiento del cáncer. Las anilino cinolinas (PCT WO97/34876) y los compuestos derivados de la quinazolina (PCT WO97/22596; PCT WO97/42187) han sido descritos como inhibidores de la angiogénesis y de la permeabilidad vascular.
Adicionalmente, han sido realizados intentos para identificar pequeñas moléculas que actúan como inhibidores de la serina/treonina quinasa. Por ejemplo, los compuestos bis(indolilmaleimida) han sido descritos como inhibidores de isoformas determinadas de la serina/treonina quinasa PKC, cuya función de transducción de señal se encuentra asociada con la permeabilidad vascular alterada en enfermedades relacionadas con el VEGF (PCT WO97/40830; PCT WO97/40831).
Inhibidores de la Plk-1 Quinasa
La Plk-1 es una serina/treonina quinasa, la cual es un importante regulador de la progresión del ciclo celular. Juega papeles cruciales en el ensamblaje y función dinámica del aparato de separación mitótica. La Plk-1 y quinasas asociadas han demostrado también que se encuentran muy involucradas en la activación y desactivación de otros reguladores del ciclo celular, tales como las quinasas dependientes de ciclina. Unos altos niveles de expresión de Plk-1 son asociados a las actividades de proliferación celular. Esto es descubierto a menudo en tumores malignos de distintos orígenes. Se espera que los inhibidores de la Plk-1 bloqueen la proliferación celular cancerosa al interrumpir los procesos que implican las escisiones mitóticas y las quinasas dependientes de ciclina inadecuadamente activadas.
Inhibidores de Cdc2/Ciclina B Quinasa (Cdc2 es conocido también como cdkl)
La Cdc2/ciclina B es otra enzima serina/treonina quinasa, la cual pertenece a la familia de las quinasas dependientes de ciclina (cdks). Estas enzimas se encuentran implicadas en la transición crítica entre distintas fases de la progresión del ciclo celular. Se cree que la proliferación celular incontrolada, que es el sello del cáncer, depende de las elevadas actividades de cdk en estas células. La inhibición de actividades elevadas de cdk en las células cancerígenas por medio de los inhibidores de cdc2/ciclina B quinasa podría suprimir la proliferación y podría restaurar el control normal de la progresión del ciclo celular.
Por lo tanto, es deseable la identificación de compuestos pequeños efectivos que inhiban específicamente la transducción de la señal y la proliferación celular, por medio de la modulación de la actividad de la tirosina y serina/treonina quinasas receptoras y no receptoras, con el fin de regular y modular la proliferación celular anormal o inapropiada, la diferenciación o metabolismo. En particular, sería beneficioso la identificación de métodos y compuestos que inhiban específicamente la función de una tirosina quinasa, la cual es esencial para los procesos angiogénicos o para la formación de hiperpermeabilidad vascular, que resulta en edema, ascites, efusiones, exudados y extravasación macromolecular y deposición de matriz, así como desórdenes asociados.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un compuesto de Fórmula (I), las mezclas racémicas-diastereoméricas, los isómeros ópticos o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos,
1
en donde:
R_{1} es
2
Z^{100} es un fenilo opcionalmente sustituido,
\quad
donde Z^{100} es opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes, cada uno de ellos seleccionado independientemente de entre el grupo consistente en F, Cl, CN, NO_{2}, alquilo opcionalmente sustituido, -O-(alquilo opcionalmente sustituido), -C(O)H, -CONH_{2}, -NHSO_{2}CF_{3}, heteroarilo opcionalmente sustituido, COOH, -Z^{105}-C(O)N(R)_{2}, -Z^{105}-N(R)-C(O)-Z^{200}, -Z^{105}-N(R)-S(O)_{2}-Z^{200} y -Z^{105}-N(R)-C(O)-N(R)-Z^{200};
\quad
Z^{105} es un enlace covalente o (C_{1}-C_{6});
\quad
Z^{200} es un grupo opcionalmente sustituido, seleccionado de entre el grupo consistente en (C_{1}-C_{6}), fenilo y -(C_{1}-C_{6})-fenilo;
Z^{110} y Z^{111} son independientemente cada uno de ellos un enlace covalente y
A es O;
R_{a} es hidrógeno;
R_{3} es H;
R_{2} es -Z^{101}-Z^{102};
Z^{101} es un enlace covalente;
Z^{102} es un grupo cicloalquilo sustituido o insustituido.
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Los compuestos de esta invención son útiles como inhibidores de las serina/treonina y tirosina quinasas. En particular, los compuestos de esta invención son útiles como inhibidores de las tirosina quinasas, importantes en las enfermedades hiperproliferativas, especialmente en el cáncer y en el proceso de la angiogénesis. Por ejemplo, ciertos de estos compuestos son inhibidores de receptores quinasa tales como KDR, Flt-1, FGFR, PDGFR, c-Met, TIE-2 o IGF-1-R.
Ciertos compuestos de la invención son efectivos como inhibidores de las serina/treonina quinasas.
Adicionalmente, ciertos compuestos son inhibidores efectivos de las quinasas no receptoras, tales como las de la familia Src (por ejemplo, lck, blk y lyn).
La presente invención proporciona un método para inhibir la actividad quinasa de las tirosina quinasas y serina/treonina quinasas, comprendiendo la administración de un compuesto representado por la fórmula I a dicha quinasa, en una concentración suficiente como para inhibir la actividad enzimática de dicha quinasa.
La presente invención incluye adicionalmente la utilización de estos compuestos en composiciones farmacéuticas, con una cantidad farmacéuticamente efectiva de los compuestos anteriormente descritos y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Descripción detallada de la invención
La progresión a través del ciclo celular eucariótico es controlada por una familia de quinasas denominadas quinasas dependientes de ciclina (CDKs) (Myerson et al., EMBO Journal, 11:2909-2917 (1992)). La regulación de la activación de la CDK es compleja, pero precisa de la asociación de la CDK con un miembro de la familia de las ciclinas de subunidades reguladoras (Draetta, Trends in Cell Biology, 3:287-289 (1993); Murray y Kirschner, Nature, 339:275-280 (1989); Solomon et al., Molecular Biology of the Cell, 3:13-27 (1992)). Un nivel adicional de regulación tiene lugar a través tanto de la activación como de la inactivación de las fosforilaciones de la subunidad de CDK (Draetta, Trends in Cell Biology, 3:287-289 (1993); Murray y Kirschner, Nature, 339:275-280 (1989); Solomon et al., Molecular Biology of the Cell, 3:13-27 (1992); Ducommun et al., EMBO Journal, 10:3311-3319 (1991); Gautier et al., Nature 339:626-629 (1989); Gould y Nurse, Nature, 342:39-45 (1989); Krek y Nigg, EMBO Journal, 10:3331-3341 (1991); Solomon et al., Cell, 63:1013-1024 (1990)). La activación y desactivación coordinadas de diferentes complejos de ciclina/CDK es necesaria para la progresión normal a través del ciclo celular (Pines, Trends in Biochemical Sciences, 18:195-197 (1993); Sherr, Cell, 73:1059-1065 (1993)). Ambas transiciones críticas, la G1-S y la G.2-M, son controladas por medio de la activación de diferentes actividades de la ciclina/CDK. En la G1, se cree que tanto la ciclina D/CDK4 como la ciclina E/CDK2 median en la fase de inicio S (Matsushima et al., Molecular & Cellular Biology, 14:2066-2076 (1994); Ohtsubo y Roberts, Science, 259:1908-1912 (1993); Quelle et al., Genes & Development, 7:1559-1571 (1993); Resnitzky et al., Molecular & Cellular Biology, 14:1669-1679 (1994)). La progresión a través de la fase S precisa de la actividad de la ciclina A/CDK2 (Girard et al., Cell, 67:1169-1179 (1991); Pagano et al., EMBO Journal, 11:961-971 (1992); Rosenblatt et al., Proceedings of the National Academy of Science USA, 89:2824-2828 (1992); Walker y Maller, Nature, 354:314-317 (1991); Zindy et al., Biochemical & Biophysical Research Communications, 182:1144-1154 (1992)), mientras que la activación de la ciclina A/cdc2 (CDK1) y de la ciclina B/cdc2 son precisas para la puesta en marcha de la metafase (Draetta, Trends in Cell Biology, 3:287-289 (1993); Murray y Kirschner, Nature, 339:275-280 (1989); Solomon et al., Molecular Biology of the Cell, 3:13-27 (1992); Girard et al., Cell, 67:1169-1179 (1991); Pagano et al., EMBO Journal, 11:961-971 (1992); Rosenblatt et al., Proceedings of the National Academy of Science USA, 89:2824-2828 (1992); Walker y Maller, Nature, 354:314-317 (1991); Zindy et al., Biochemical & Biophysical Research Communications, 182:1144-1154 (1992)). Por lo tanto, no es sorprendente que la pérdida de control de regulación CDK sea un suceso frecuente en las enfermedades hiperproliferativas y en el cáncer (Pines, Current Opinion in Cell Biology, 4:144-148 (1992); Lees, Current Opinion in Cell Biology, 7:773-780 (1995); Hunter y Pines, Cell, 79:573-582 (1994)). Por lo tanto, la inhibición selectiva de CDKs es un objetivo de la presente invención.
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En un subgrupo de compuestos de Fórmula (I), R_{3} es H;
R_{2} es ciclopentilo; y
R_{1} es
3
En otro subgrupo de compuestos de Fórmula (I), Z^{110} es un enlace covalente, A es O; y Z^{100} es fenilo opcionalmente sustituido, donde Z^{100} es opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes, cada uno de ellos independientemente seleccionado de entre el grupo consistente en F, COOH, NO_{2}, OMe, -COOMe, OCF_{3} y CF_{3}.
En otro subgrupo de compuestos de Fórmula (I), Z^{110} es un enlace covalente, A es -O-,
Z^{100} es un fenilo opcionalmente sustituido,
donde Z^{100} es opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes, seleccionados de entre el grupo consistente en alquilo, alcoxi, halo, hidroxi y alcoxicarbonilo.
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En otro subgrupo de compuestos de Fórmula (I), R^{2} es un grupo opcionalmente sustituido, seleccionado de entre el grupo consistente en ciclobutilo y ciclohexilo.
En otro subgrupo de compuestos de Fórmula (I), R^{2} es opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados de entre el grupo consistente en hidroxi, alquilo, hidroxialquilo, carboxialquilo y fenilalcoxialquilo.
En otro subgrupo de compuestos de Fórmula (I), R_{1} es 4-fenoxifenilo.
Un subgrupo de compuestos de fórmula I posee R_{1}= 4-fenoxifenilo, R_{2}= ciclopentilo y ambos R_{3}= H.
Los compuestos de fórmula I pueden existir como sales con ácidos farmacéuticamente aceptables. La presente invención incluye tales sales. Ejemplos de tales sales incluyen los hidrocloruros, los hidrobromuros, los sulfatos, los metanosulfonatos, los nitratos, los maleatos, los acetatos, los citratos, los fumaratos, los tartratos [eg, (+)-tartratos, (-)-tartratos o mezclas de los mismos, incluyendo mezclas racémicas], los sucinatos, los benzoatos y las sales con aminoácidos como el ácido glutámico. Estas sales pueden ser preparadas por medio de métodos conocidos por aquéllos expertos en este campo.
Ciertos compuestos de fórmula I, los cuales poseen sustituyentes acídicos, pueden existir como sales con bases farmacéuticamente aceptables. La presente invención incluye tales sales. Ejemplos de tales sales incluyen las sales de sodio, las sales de potasio, las sales de lisina y las sales de arginina. Estas sales pueden ser preparadas por medio de métodos conocidos por aquéllos expertos en este campo.
Ciertos compuestos de fórmula I y sus sales pueden existir en más de una forma cristalina, y la presente invención incluye cada una de las formas cristalinas y mezclas de las mismas.
Ciertos compuestos de fórmula I y sus sales pueden existir también en forma de solvatos, por ejemplo los hidratos, y la presente invención incluye cada uno de los solvatos y mezclas de los mismos.
Ciertos compuestos de fórmula I pueden contener uno o más centros quirales y existir en diferentes formas ópticas activas. Cuando los compuestos de fórmula I contienen un centro quiral, los compuestos existen en dos formas enantioméricas, y la presente invención incluye ambos enantiómeros y mezclas de enantiómeros, tales como las mezclas racémicas. Los enantiómeros pueden ser resueltos por medio de métodos conocidos por aquéllos expertos en este campo, por ejemplo, por medio de la formación de sales diastereoisoméricas, las cuales pueden se separadas, por ejemplo, por medio de cristalización; por medio de la formación de derivados o complejos diastereoisoméricos, los cuales pueden ser separados, por ejemplo, por medio de cristalización, cromatografía gas-líquida o líquida; por medio de reacción selectiva de un enantiómero con un reactivo específico del enantiómero, por ejemplo, por esterificación enzimática; o por medio de cromatografía gas-líquida o líquida en un ambiente quiral, por ejemplo, en un soporte quiral -por ejemplo sílice-, con un ligando quiral unido, o en presencia de un solvente quiral. Se entenderá que donde el enantiómero deseado es convertido en otra entidad química por medio de uno de los procedimientos de separación anteriormente descritos, se precisa de una fase adicional para liberar la forma enantiomérica deseada. Alternativamente, pueden ser sintetizados enantiómeros específicos por medio de síntesis asimétrica, utilizando reactivos, sustratos, catalizadores o solventes ópticamente activos, o convirtiendo un enantiómero en otro por medio de transformación asimétrica.
Cuando un compuesto de fórmula I contiene más de un centro quiral, éste puede existir en formas diastereoisoméricas. Los pares diastereoisoméricos pueden ser separados por medio de métodos conocidos por aquéllos expertos en este campo, por ejemplo, por medio de cromatografía o cristalización, y los enantiómeros individuales dentro de cada par pueden ser separados conforme es descrito más arriba. La presente invención incluye cada uno de los diastereoisómeros de los compuestos de fórmula I y las mezclas de los mismos.
Ciertos compuestos de fórmula I pueden existir en distintas formas tautoméricas o como diferentes isómeros geométricos, y la presente invención incluye cada uno de los tautómeros y/o isómeros geométricos de los compuestos de fórmula I y las mezclas de los mismos.
Ciertos compuestos de fórmula I pueden existir en diferentes formas conformacionables estables, las cuales pueden ser separables. La asimetría torsional causada por la rotación restringida alrededor de un enlace simple asimétrico -por ejemplo, debido a impedimento estérico o a tensión de anillo- puede permitir la separación de diferentes conformadores. La presente invención incluye cada uno de los isómeros conformacionales de los compuestos de fórmula I y mezclas de los mismos.
Ciertos compuestos de fórmula I pueden existir en forma zwitteriónica, y la presente invención incluye cada una de las formas zwitteriónicas de los compuestos de fórmula I y mezclas de las mismas. Los grupos heteroaromáticos, conforme son aquí utilizados, incluyen sistemas de anillo heteroarilo (e.g., al sólo efecto de ejemplificar, y sin ánimo de que sean interpretados como limitadores del ámbito de esta invención: tienilo, piridilo, pirazol, isoxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, indazolilo, furanos, pirroles, imidazoles, pirazoles, triazoles, pirimidinas, pirazinas, tiazoles, isotiazoles, oxazolilo o tetrazoles) y sistemas de anillo heteroarilo, en los cuales un anillo aromático carbocíclico, un anillo no aromático carbocíclico o un anillo heteroarilo es fusionado con uno o más anillos heteroarilos distintos (e.g., al sólo efecto de ejemplificar, y sin ánimo de que sean interpretados como limitadores del ámbito de esta invención: benzo(b)tienilo, bencimidazolilo, benzoxazolilo, benzotiazolilo, benzotiadiazolilo, benzoxadiazolilo, indol, tetrahidroindol, azaindol, indazol, quinolina, imidazopiridina, quinazolina purina, pirrol[2,3-d]pirimidina, pirazol[3,4-d]pirimidina) y sus N-óxidos. Los grupos heteroarilo sustituidos son sustituidos preferiblemente por uno o más sustituyentes, cada uno de ellos independientemente seleccionado de entre el grupo consistente en halógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi, alquil-O-C(O)-, alcoxialquilo, un grupo heterocicloalquilo, fenilo opcionalmente sustituido, nitro, amino, amino monosustituido o amino disustituido.
Conforme es utilizado aquí, muchos restos o sustituyentes son denominados como "sustituidos o insustituidos" u "opcionalmente sustituidos". Cuando un resto es designado por uno de estos términos, el mismo denota que cualquier parte del resto -conocida por un experto en este campo como susceptible de ser sustituida- puede ser sustituida, lo cual incluye uno o más sustituyentes; donde si existe más de un sustituyente, entonces cada sustituyente es seleccionado independientemente. Tales medios de sustitución son de sobra conocidos en este campo y/o se informe sobre ellos en el momento de la publicación. Al sólo efecto de ejemplificar, y sin ánimo de que sean interpretados como limitadores del ámbito de esta invención, algunos ejemplos de grupos que son sustituyentes son: grupos alquilo (los cuales pueden ser asimismo sustituidos, tales como CF_{3}), grupos alcoxi (los cuales pueden ser asimismo sustituidos, tales como OCF_{3}), un grupo halógeno o halo (F, Cl, Br, I), hidroxi, nitro, oxo, CN, COH, COOH, amino, N-alquilamino o N,N-dialquilamino (en los cuales, los grupos alquilo pueden ser sustituidos también), ésteres (-C(O)-OR, donde R es un grupo como el alquilo, arilo, etc., el cual puede ser sustituido), arilo (el más preferido es el fenilo, el cual puede ser sustituido) y arilalquilo (el cual puede ser sustituido).
El Tie-2 (TEK) es un miembro de una familia recientemente descubierta de receptores tirosina quinasa, específico de célula endotelial, el cual se ve involucrado en procesos angiogénicos críticos, tales como la ramificación, brote, remodelado, maduración y estabilidad de los vasos. El Tie-2 es el primer receptor tirosina quinasa de mamífero para el que han sido identificados tanto el ligando(s) agonista (e.g., Angiopoietina 1 ("Ang 1"), la cual estimula la autofosforilación del receptor y la transducción de señal) como el ligando(s) antagonista (e.g., Angiopoietina 2 ("Ang 2")). El silenciamiento por knock-out y la manipulación transgénica de la expresión del Tie-2 y sus ligandos indica que un estrecho control espacial y temporal de la señalización del Tie-2 es esencial para el desarrollo adecuado de la nueva vasculatura. El modelo actual sugiere que la estimulación de Tie-2 quinasa por medio del ligando Ang1 está directamente implicada en la ramificación, brote y crecimiento de nuevos vasos, y en el reclutamiento e interacción de células soporte periendoteliales, importantes a la hora de mantener la integridad de los vasos y de inducir la quiescencia. La ausencia de estimulación Ang1 del Tie-2 o la inhibición de autofosforilación de Tie-2 por medio de Ang2 -la cual es producida a altos niveles en lugares de regresión vascular-, puede causar una pérdida en la estructura vascular y contactos de la matriz, resultando en muerte celular endotelial, especialmente en ausencia de estímulos de crecimiento/supervivencia. Sin embargo la situación es más compleja, ya que recientemente han sido descubiertos, al menos, dos ligandos Tie-2 adicionales (Ang3 y Ang4) y ha sido demostrada la capacidad de hetero-oligomerización de las distintas angiopoietinas agonistas y antagonistas, modificando de esta forma su actividad. De esta manera, se ve menos favorecido el convertir en objetivo las interacciones ligando Tie-2-receptor como un enfoque terapéutico antiangiogénico, siendo preferida una estrategia inhibidora de la quinasa.
El dominio extracelular soluble del Tie-2 ("Ex-Tek") puede actuar para interrumpir el establecimiento de vasculatura tumoral en un xenoinjerto de tumor de mama y modelos de metástasis pulmonar, y en la neovascularización ocular mediada por célula tumoral. Puede ser conseguida durante 7/10 días, por medio de infección adenoviral, la producción in vivo de niveles en mg/ml de ExTek en roedores, sin efectos secundarios adversos. Estos resultados sugieren que la interrupción de las rutas de señalización del Tie-2 en animales sanos normales puede ser tolerada bien. Estas respuestas inhibidoras del Tie-2 al ExTek pueden ser una consecuencia del secuestro del ligando(s) y/o generación de un heterodímero no productivo con un Tie-2 de longitud total.
Los compuestos de esta invención presentan actividad inhibidora hacia las proteínas quinasas. Es decir, estos compuestos modulan la transducción de señal por medio de las proteínas quinasas. Los compuestos de esta invención inhiben a las proteínas quinasas de las clases serina/treonina y tirosina quinasa. En particular, estos compuestos inhiben selectivamente la actividad de las tirosinas quinasas KDR/FLK-1/VEGFR-2. Ciertos compuestos de esta invención inhiben también la actividad de tirosinas quinasas adicionales, tales como Flt-1/VEGFR-1, Flt-4/VEGFR-3, Tie-1, Tie-2, FGFR, PDGFR, IGF-1R, c-Met, la subfamilia Src de las quinasas, tales como Lck, hck, fgr, Src, fyn, yes, etc. Adicionalmente, algunos compuestos de esta invención inhiben de forma significativa las serina/treonina quinasas tales como PKC, quinasas MAP, erk, CDKs, Plk-1 o Raf-1, las cuales juegan un papel esencial en la proliferación celular y en la progresión del ciclo celular. La potencia y especificidad de los compuestos genéricos de esta invención hacia una proteína quinasa determinada pueden ser a menudo alterados y optimizados por medio de variaciones en la naturaleza, número y colocación de los sustituyentes (i.e., R_{1}, R_{2}, R_{3}, A y anillo 1) y de restricciones conformacionales. Además, los metabolitos de ciertos compuestos pueden poseer también una actividad inhibidora significativa de la proteína quinasa.
Se cree que los compuestos de esta invención actúan al inhibir la actividad de la tirosina quinasa KDR, la cual se ve implicada en el proceso de hiperpermeabilidad vascular y formación de edema. La tirosina quinasa KDR pude ser denominada también tirosina quinasa FLK-1, tirosina quinasa NYK o tirosina quinasa VEGFR-2. La tirosina quinasa KDR es activada cuando el factor de crecimiento celular endotelial vascular (VEGF) u otro ligando activador (como el VEGF-C, el VEGF-D, el VEGF-E o la proteína Tat del VIH) se une a un receptor de tirosina quinasa KDR, el cual se encuentra en la superficie de las células endoteliales vasculares. A continuación de esta activación de la tirosina quinasa KDR, tiene lugar la hiperpermeabilidad de los vasos sanguíneos y el fluido se mueve desde el torrente sanguíneo a través de las paredes de los vasos sanguíneos hasta llegar a los espacios intersticiales, formando de esta manera un área de edema. La diapédesis acompaña también a menudo a esta respuesta. De forma similar, una excesiva hiperpermeabilidad vascular puede perturbar el intercambio molecular normal a través del endotelio en tejidos y órganos críticos (e.g., pulmón y riñón), causando de esta forma extravasación y deposición macromoleculares. Después de esta respuesta aguda a la estimulación de la KDR -la cual se cree que facilita el subsiguiente proceso angiogénico-, la prolongada estimulación de la tirosina quinasa KDR da como resultado la proliferación y quimiotaxis de las células endoteliales vasculares y la formación de nuevos vasos. Al inhibir la actividad de la tirosina quinasa KDR, bien bloqueando la producción del ligando activador, bloqueando la unión del ligando activador al receptor de la tirosina quinasa KDR, evitando la dimerización y transfosforilación del receptor, inhibiendo la actividad enzimática de la tirosina quinasa KDR (inhibiendo la función de fosforilación de la enzima) o por medio de algún otro mecanismo que interrumpa su señalización aguas abajo (D. Mukhopedhyay et al., Cancer Res. 58:1278-1284 (1998) y referencias en el mismo), pueden ser inhibidas y minimizadas la hiperpermeabilidad, así como la extravasación asociada, la subsiguiente formación de edema y deposición de matriz, y las respuestas angiogénicas.
Un grupo de compuestos preferidos de esta invención poseen la propiedad de inhibir la actividad de la tirosina quinasa KDR, sin inhibir de forma significativa la actividad de la tirosina quinasa Flt-1 (la tirosina quinasa Flt-1 es denominada también tirosina quinasa VEGFR-1). Tanto la tirosina quinasa KDR como la tirosina quinasa Flt-1 son activadas por medio de la unión del VEGF a los receptores de la tirosina quinasa KDR y a los receptores de la tirosina quinasa Flt-1, respectivamente. Ciertos compuestos preferidos de esta invención son únicos, debido a que inhiben la actividad de un VEGF-receptor de tirosina quinasa (KDR) que es activado al activar los ligandos, pero no inhibe otros receptores de tirosinas quinasas, como el Flt-1, que son activados también por ciertos ligandos activadores. De esta forma, ciertos compuestos preferidos de esta invención son, por lo tanto, selectivos en cuanto a su actividad inhibidora de la tirosina quinasa.
En una realización, la presente invención proporciona un método de tratamiento de una afección mediada por la proteína quinasa en un paciente, comprendiendo la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de uno o más compuestos de Fórmula I.
Una "afección mediada por la proteína quinasa" o una "afección mediada por la actividad de la proteína quinasa" es una afección médica, como una enfermedad u otras afecciones físicas no deseables, cuya génesis o progresión depende, al menos en parte, de la actividad de al menos una proteína quinasa. La proteína quinasa puede ser, por ejemplo, una proteína tirosina quinasa o una proteína serina/treonina quinasa.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad de un compuesto de Fórmula I, o una combinación de dos o más de tales compuestos, la cual inhibe total o parcialmente la progresión de la afección, o alivia, al menos parcialmente, uno o más síntomas de la afección. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede ser también una cantidad que sea profilácticamente efectiva. La cantidad que es terapéuticamente efectiva dependerá del tamaño y género del paciente, la afección a ser tratada, la severidad de la afección y el resultado buscado. Para un paciente dado, una cantidad terapéuticamente efectiva puede ser determinada por medio de métodos conocidos por aquéllos expertos en este campo.
Las familias de quinasas Src, Tec, Jak, Map, Csk, Nf\kappaB y Syk juegan papeles primordiales en la regulación de la función inmune. La familia Scr incluye actualmente Fyn, Lck, Fgr, Fes, Lyn, Src, Yrk, Fyk, Yes, Hck y Blk. La familia Syk actualmente se entiende que incluye únicamente Zap y Syk. La familia TEC incluye Tec, Btk, Rlk e Itk. La familia Janus de quinasas está implicada en la transducción del factor de crecimiento y de señales producidas por la citoquina proinflamatoria, a través de un número de receptores. Aunque la BTK y la ITK -miembros de la familia Tec de las quinasas- juegan un papel menos conocido en inmunobiología, su modulación por un inhibidor puede resultar terapéuticamente beneficiosa. Se cree actualmente que la familia Csk incluye Csk y Chk. Las quinasas RIP, IRAK-1, IRAK-2, NIK, quinasas p38 MAP, Jnk, IKK-1 e IKK-2 están implicadas en las rutas de transducción de señal para citoquinas proinflamatorias esenciales, tales como la TNF y la IL-1.
Existe un número de proteínas quinasas que han demostrado ser protooncogénicas. La rotura del cromosoma (en el punto de ruptura de la quinasa Itk en el cromosoma 5), la translocación, como en el caso del gen Abl con el BCR (cromosa Filadelfia), el truncamiento en lugares tales como el c-kit o EGFR, o la mutación (e.g., Met) dan como resultado la creación de proteínas desreguladas, que las convierten de productos protooncogénicos en oncogénicos. En otros tumores, la oncogénesis es conducida a través de interacciones autocrinas o paracrinas entre ligando/receptor de factor de crecimiento. Miembros de la familia Src de las quinasas usualmente se ven implicados en la transducción de señal aguas abajo, potenciando de esta manera la oncogénesis, y ellas mismas pueden transformarse en oncogénicas como resultado de la sobreexpresión o mutación. Inhibiendo la actividad de la proteína quinasa de estas proteínas, puede ser interrumpido el proceso de la enfermedad. La estenosis vascular recurrente puede implicar la proliferación celular endotelial y el músculo laxo promovidos por la FGF y/o la PDGF. La estimulación del ligando de la FGFR, la PDGFR, la IGF1-R y la c-Met in vivo es proangiogénica y potencia los desórdenes que dependen de la angiogénesis. La inhibición de las actividades de las quinasas FGFR, PDGFR, c-Met o IGF1-R, individualmente o en combinación, puede ser una estrategia eficaz a la hora de inhibir estos fenómenos.
La desestabilización vascular del ligando antagonista de la Tie-2 (Ang2) se cree que induce un estado "plástico" inestable en el endotelio. En presencia de altos niveles de VEGF puede aparecer una fuerte respuesta angiogénica; sin embargo, en ausencia de VEGF, o de un estímulo relacionado con VEGF, puede ocurrir una franca regresión vascular y apoptosis endotelial (Genes and Devel. 13:1055-1066 (1999)). De forma análoga, un inhibidor de la quinasa Tie-2 puede ser proangiogénico o antiangiogénico, en presencia o ausencia de un estímulo relacionado con VEGF, respectivamente.
En otro aspecto, la presente invención proporciona compuestos de fórmula I, conforme son definidos inicialmente más arriba, para su uso como medicamentos, particularmente como inhibidores de la actividad de la proteína quinasa, por ejemplo, de la actividad de la tirosina quinasa, de la actividad de la serina quinasa y de la actividad de la treonina quinasa. En otro aspecto más, la presente invención proporciona la utilización de compuestos de fórmula I, conforme son definidos inicialmente más arriba, en la fabricación de un medicamento para su uso en la inhibición de la actividad de la proteína quinasa.
En esta invención, son aplicables las siguientes definiciones:
El término "sales fisiológicamente aceptables" se refiere a aquellas sales que retienen la efectividad y propiedades biológicas de las bases libres, y las cuales son obtenidas por medio de la reacción con ácidos inorgánicos, tales como el ácido hidroclórico, el ácido hidrobrómico, el ácido sulfúrico, el ácido nítrico, el ácido fosfórico, o ácidos orgánicos tales como el ácido sulfónico, el ácido carboxílico, el ácido fosfórico orgánico, el ácido metanosulfónico, el ácido etanosulfónico, el ácido p-toluenosulfónico, el ácido salicílico, el ácido láctico, el ácido tartárico y similares.
Formulaciones Farmacéuticas
Los compuestos de esta invención pueden ser administrados a un paciente humano por sí mismos o en composiciones farmacéuticas, donde son mezclados con portadores o excipiente(s) adecuados, en dosis para tratar o mejorar la hiperpermeabilidad vascular, el edema y los desórdenes asociados. Pueden ser administradas también al paciente mezclas de estos compuestos, como una mezcla simple o en composiciones farmacéuticas formuladas adecuadamente. Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere además a aquella cantidad del compuesto, o compuestos, suficiente como para prevenir o atenuar la neovascularización inapropiada, la progresión de desórdenes hiperproliferativos, el edema, la hiperpermeabilidad asociada a VEGF y/o la hipotensión relacionada con VEGF. Las técnicas para la formulación y administración de los compuestos de la solicitud actual pueden ser encontradas en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.
Rutas de Administración
Las rutas adecuadas de administración pueden incluir, por ejemplo, la administración oral, en gotas para ojos, rectal, transmucosa, tópica o intestinal; la administración parenteral, incluyendo inyección intramuscular, subcutánea, intramedular, así como inyección intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o intraocular.
Alternativamente, se puede administrar el compuesto en una forma local en lugar de sistémica, por ejemplo, a través de inyección del compuesto directamente en un sitio edematoso, a menudo en una formulación depot o de liberación sostenida.
Además, se puede administrar el fármaco en un sistema diana de suministro del fármaco, por ejemplo, en un liposoma recubierto con anticuerpo específico de célula endotelial.
Composición/Formulación
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser fabricadas de una manera por sí conocida, e.g., por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulado, preparación de grageas, levigación, emulsificación, encapsulado, oclusión o liofilización.
Las composiciones farmacéuticas para su uso conforme a la presente invención pueden ser formuladas de esta forma de manera convencional, utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables, comprendiendo excipientes y agentes auxiliares de formulación que faciliten el procesado de los compuestos activos en preparaciones que puedan ser utilizadas farmacéuticamente. La formulación adecuada depende de la ruta de administración escogida.
Para inyección, los agentes de la invención pueden ser formulados en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. Para la administración transmucosa, son utilizados en la formulación penetrantes adecuados para que la barrera pueda ser permeada. Tales penetrantes son generalmente conocidos en este campo.
Para administración oral, los compuestos pueden ser formulados fácilmente combinando los compuestos activos con portadores farmacéuticamente aceptables, de sobra conocidos en este campo. Tales portadores permiten que los compuestos de la invención sean formulados como tabletas, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, emulsiones, suspensiones y similares, para ingestión oral por un paciente a ser tratado. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden ser obtenidas combinando el compuesto activo con un excipiente sólido, moliendo opcionalmente una mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir agentes auxiliares adecuados si así se desea, con el fin de obtener tabletas o grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, rellenos tales como azúcares, incluyendo lactosa, sucrosa, mannitol o sorbitol; preparaciones de celulosa, tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinil pirrolidona (PVP). Si así se desea, pueden ser añadidos agentes desintegrantes, tales como la polivinil pirrolidona reticulada, el agar o el ácido algínico, o una sal de los mismos como el alginato sódico.
Las grageas son proporcionadas con recubrimientos adecuados. A este fin, pueden ser utilizadas soluciones concentradas de azúcar, las cuales pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinil pirrolidona, gel de carbopol, polietileno glicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes. Pueden ser añadidos colorantes o pigmentos a los recubrimientos de tabletas o grageas para identificación o con el fin de caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.
Las preparaciones farmacéuticas que pueden ser utilizadas oralmente incluyen cápsulas de fácil deglución preparadas en gelatina, así como cápsulas blandas selladas preparadas con gelatina y un plastificante, como el glicerol o el sorbitol. Las cápsulas de fácil deglución pueden contener los ingredientes activos junto con relleno -como la lactosa-, aglutinantes -como los almidones- y/o lubricantes tales como el talco o el estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden ser disueltos o suspendidos en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietileno glicoles líquidos. Además, pueden ser añadidos estabilizadores. Todas las formulaciones para administración oral deben encontrarse en dosificaciones adecuadas para tal tipo de administración.
Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas de manera convencional.
Para administración por inhalación, los compuestos para su uso conforme a la presente invención son administrados convenientemente en forma de una presentación de spray en aerosol de paquetes presurizados o un nebulizador, con la utilización de un propelente adecuado, e.g., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede ser determinada proporcionando una válvula que facilite una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos, por ejemplo, de gelatina para su uso en un inhalador o insuflador, pueden ser formulados conteniendo una mezcla de polvo del compuesto y un polvo base adecuado, como la lactosa o el almidón.
Los compuestos pueden ser formulados para administración parenteral por medio de inyección, e.g., inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden ser presentadas en forma de dosificación unitaria, e.g., en ampollas o en contenedores multidosis, con un preservante añadido. Las composiciones pueden presentar formas tales como las de suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes suspensores, estabilizadores y/o dispersantes.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, pueden ser preparadas suspensiones de los compuestos activos como suspensiones oleosas adecuadas en inyección. Solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos tales como el aceite de sésamo, ó ésteres sintéticos del ácido graso, tales como el etil oleato o los triglicéridos, ó liposomas. Las suspensiones acuosas en inyección pueden contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión, tales como la carboximetilcelulosa de sodio, el sorbitol o el dextrán. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizadores o agentes adecuados que incrementen la solubilidad de los compuestos, con el fin de preparar soluciones altamente concentradas.
Alternativamente, el ingrediente activo puede encontrarse en forma de polvo, para reconstituirse antes de su utilización con un vehículo adecuado, e.g., agua estéril libre de pirógeno.
Los compuestos pueden ser formulados también en composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de retención, e.g., conteniendo bases convencionales para supositorio, como la manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones previamente descritas, los compuestos pueden ser formulados también como una preparación depot. Tales formulaciones de actuación lenta pueden ser administradas por medio de implante (por ejemplo, subcutáneamente o intramuscularmente), o por medio de inyección intramuscular. De esta forma, por ejemplo, los compuestos pueden ser formulados con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable), o con resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.
Un ejemplo de un portador farmacéutico para los compuestos hidrofóbicos de la invención es un sistema cosolvente, comprendiendo alcohol de benzilo, un surfactante no polar, un polímero orgánico miscible en agua y una fase acuosa. El sistema cosolvente puede ser el sistema cosolvente VPD. La VPD es una solución al 3% p/v de alcohol de benzilo, 8% p/v del surfactante no polar polisorbato 80 y 65% p/v de polietileno glicol 300, completando el volumen con etanol absoluto. El sistema cosolvente VPD (VPD:5W) consiste en VPD diluido 1:1 con dextrosa al 5% en solución acuosa. Este sistema cosolvente disuelve bien los compuestos hidrofóbicos, y produce por sí mismo una baja toxicidad en administración sistémica. Naturalmente, las proporciones de un sistema cosolvente pueden ser modificadas considerablemente, sin destruir por ello sus características de solubilidad y toxicidad. Además, la identidad de los componentes cosolventes puede ser variada: por ejemplo, pueden ser utilizados otros surfactantes no polares de baja toxicidad en lugar del polisorbato 80; puede ser variado el tamaño de la fracción del polietileno glicol; otros polímeros biocompatibles pueden reemplazar al polietileno glicol, e.g., la polivinil pirrolidona; y otros azúcares o polisacáridos pueden sustituir a la dextrosa.
Alternativamente, pueden ser empleados otros sistemas de administración para compuestos farmacéuticos hidrofóbicos. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de administración o portadores para fármacos hidrofóbicos. Pueden ser utilizados también ciertos solventes orgánicos, tales como el dimetilsulfóxido, aunque usualmente a expensas de una mayor toxicidad. Adicionalmente, los compuestos pueden ser administrados utilizando un sistema de liberación sostenida, como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos conteniendo el agente terapéutico. Han sido establecidos diversos materiales de liberación sostenida y son de sobra conocidos por aquéllos expertos en este campo. Las cápsulas de liberación sostenida, dependiendo de su naturaleza química, pueden liberar los compuestos desde unas pocas semanas hasta alrededor de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, pueden ser empleadas estrategias adicionales para la estabilización de proteínas.
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender también portadores o excipientes adecuados en fase sólida o de gel. Ejemplos de tales portadores o excipientes incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, el carbonato cálcico, el fosfato cálcico, distintos azúcares, almidones, derivados de la celulosa, gelatina y polímeros tales como los polietileno glicoles.
Muchos de los compuestos de la invención pueden ser proporcionados como sales con contraiones farmacéuticamente compatibles. Las sales farmacéuticamente compatibles pueden ser formadas con muchos ácidos, incluyendo, auque sin estar limitados a los mismos, el hidroclórico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en solventes acuosos o protónicos de otro tipo, que lo son las correspondientes formas de base libre.
Dosificación Efectiva
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su utilización en la presente invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos se encuentran en una cantidad efectiva, con el fin de conseguir el propósito buscado. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad efectiva que previene el desarrollo, o alivia, los síntomas existentes en el sujeto sometido a tratamiento. La determinación de las cantidades efectivas se encuentra dentro de las capacidades de aquéllos expertos en este campo.
Para cualquiera de los compuestos usados en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede ser estimada inicialmente a partir de los ensayos celulares. Por ejemplo, una dosis puede ser formulada en modelos celulares y animales, con el fin de conseguir un rango de concentración en circulación que incluya la IC_{50}, conforme es determinado en los ensayos celulares (i.e., la concentración del compuesto sometido a prueba que consiga una inhibición máxima media de la actividad de una proteína quinasa dada). En algunos casos, es adecuado el determinar el IC_{50} en presencia de albúmina sérica del 3 al 5%, ya que una determinación tal aproxima los efectos de unión de la proteína plasmática en el compuesto. Tal información puede ser utilizada para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos. Además, los compuestos más preferidos para administración sistémica inhiben de forma efectiva la señalización de la proteína quinasa en células intactas en niveles que son conseguibles con seguridad en el plasma.
Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a aquélla cantidad del compuesto que da como resultado la mejora de los síntomas en un paciente. La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos pueden ser determinadas por medio de procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimento, e.g., para determinar la dosis máxima tolerada (MTD) y la ED_{50} (dosis efectiva para 50% de respuesta máxima). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y los terapéuticos es el índice terapéutico, y puede ser expresado como la proporción entre la MTD y la ED_{50}. Los compuestos que exhiben índices terapéuticos altos son los preferidos. Los datos obtenidos en estos ensayos de cultivo celular y en estudios con animales pueden ser utilizados a la hora de formular un rango de dosificación para su uso en humanos. La dosificación de tales compuestos entra preferiblemente dentro de un rango de concentraciones en circulación que incluyen la ED_{50} con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango, dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la ruta de administración utilizada. La formulación, ruta de administración y dosificación exactas pueden ser escogidas por el médico en vista del estado del paciente. (Véase, e.g., Fingl et al., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 pl). En el tratamiento de crisis, puede ser requerida la administración en bolo agudo o de una infusión que se aproxime a la MTD, con el fin de obtener una respuesta rápida.
La cantidad e intervalo de dosificación pueden ser ajustados individualmente, con el fin de proporcionar niveles plasmáticos del resto activo que sean suficientes como para mantener los efectos moduladores de la quinasa, o una concentración efectiva mínima (MEC). La MEC variará para cada compuesto, pero puede ser estimada tomando datos in vitro; e.g., la concentración necesaria para conseguir de un 50 a un 90% de inhibición de la proteína quinasa utilizando los ensayos aquí descritos. Las dosificaciones necesarias para conseguir la MEC dependerán de las características individuales y de la ruta de administración. Sin embargo, pueden ser utilizados ensayos HPLC o bio-ensayos para determinar las concentraciones plasmáticas.
Los intervalos de dosificación pueden ser determinados también utilizando el valor MEC. Los compuestos deben se administrados utilizando un régimen que mantenga los niveles plasmáticos por encima de la MEC de un 10 a un 90% del tiempo, preferiblemente entre un 30 y un 90% y, más preferiblemente, entre un 50 y un 90%, hasta que sea conseguida la deseada mejora en los síntomas. En casos de administración local o toma selectiva, la concentración local efectiva del fármaco puede no estar relacionada con la concentración en plasma.
La cantidad de composición administrada dependerá, desde luego, del sujeto en tratamiento, del peso del sujeto, de la severidad de la dolencia, de la forma de administración y del juicio del médico que la prescribe.
Envasado
Las composiciones pueden ser presentadas, si así se desea, en un envase o dispositivo dispensador, que puede contener una o más formas de dosificación individuales conteniendo el ingrediente activo. El envase puede comprender, por ejemplo, una lámina metálica o plástica, como un envase blister. El envase o dispositivo dispensador puede estar acompañado de instrucciones de administración. Las composiciones comprendiendo un compuesto de la invención, formulado en un portador farmacéuticamente compatible, pueden también ser preparadas, colocadas en un contenedor apropiado y marcadas para tratamiento de una dolencia indicada.
En algunas formulaciones puede ser beneficioso el utilizar los compuestos de la presente invención en forma de partículas de tamaño muy pequeño, por ejemplo, las obtenidas por medio de molino de energía fluida.
El uso de compuestos de la presente invención en la preparación de composiciones farmacéuticas es ilustrado por medio de la siguiente descripción. En esta descripción, el término "compuesto activo" denota cualquier compuesto de la invención pero, particularmente, cualquier compuesto que sea el producto final de uno los Ejemplos precedentes.
a) Cápsulas
En la preparación de cápsulas, pueden ser desagregadas y mezcladas 10 partes en peso del compuesto activo y 240 partes en peso de lactosa. La mezcla puede rellenar cápsulas duras de gelatina, conteniendo cada cápsula una dosis unitaria, o parte de una dosis unitaria, del compuesto activo.
b) Tabletas
Las tabletas pueden ser preparadas con los siguientes ingredientes:
Partes en peso
Compuesto activo 10
Lactosa 190
Almidón de maíz 22
Polivinil pirrolidona 10
Estearato de magnesio 3
El compuesto activo, la lactosa y parte del almidón pueden ser desagregados, mezclados y la mezcla resultante puede ser granulada con una solución de polivinil pirrolidona en etanol. El granulado seco puede ser mezclado con el estearato de magnesio y el resto del almidón. A continuación, la mezcla es comprimida en una máquina de tableteado, con el fin de proporcionar tabletas, conteniendo cada una de ellas una dosis unitaria, o una parte de una dosis unitaria, del compuesto activo.
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c) Tabletas revestidas entéricamente
Las tabletas pueden ser preparadas por medio del método anteriormente descrito en (b). Las tabletas pueden ser revestidas entéricamente de una manera convencional, utilizando una solución al 20% de acetato de celulosa ftalato y 3% de dietil ftalato en etanol:diclorometano (1:1).
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d) Supositorios
En la preparación de supositorios, pueden ser incorporadas 100 partes en peso del compuesto activo a 1.300 partes en peso de base de supositorio de triglicérido, y la mezcla puede ser conformada en supositorios, conteniendo cada uno de ellos una cantidad terapéuticamente efectiva del ingrediente activo.
En las composiciones de la presente invención el compuesto activo, si así se desea, puede estar asociado con otros ingredientes farmacológicamente activos compatibles. Por ejemplo, los compuestos de esta invención pueden ser administrados en combinación con uno o más agentes farmacéuticos adicionales que inhiben o evitan la producción de VEGF o angiopoietinas, atenúan las respuestas intracelulares a VEGF o a angiopoietinas, bloquean la transducción de señal intracelular, inhiben la hiperpermeabilidad vascular, reducen la inflamación, o inhiben o evitan la formación de edema o la neovascularización. Los compuestos de la invención pueden ser administrados con anterioridad, seguidamente o simultáneamente, al agente farmacéutico adicional, cualquiera que sea el curso de administración apropiado. Los agentes farmacéuticos adicionales incluyen, pero sin estar limitados a los mismos, los esteroides antiedémicos, NSAIDS, inhibidores de ras, agentes anti-TNF, agentes anti-IL1, antihistaminas, antagonistas PAF, inhibidores COX-1, inhibidores COX-2, inhibidores de no-sintasa, inhibidores de Akt/PTB, inhibidores de IGF-1R, inhibidores de PKC e inhibidores de la PI3 quinasa. Los compuestos de la invención y los agentes farmacéuticos adicionales actúan aditivamente o sinérgicamente.
La presente invención comprende también la utilización de un compuesto de fórmula I como un medicamento.
La potencia in vitro de los compuestos a la hora de inhibir estas proteínas quinasas puede ser determinada por medio de los procedimientos detallados más abajo.
La potencia de los compuestos puede ser determinada por medio de la cantidad de inhibición de la fosforilación de un sustrato exógeno (e.g., péptido sintético (Z. Songyang et al., Nature, 373:536-539) por un compuesto prueba en relación con el de control.
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Producción de Tirosina Quinasa KDR utilizando Sistema de Baculovirus
La secuencia codificadora para el dominio intracelular de la KDR humana (aa789-1354) fue generada a través de PCR, utilizando ADNcs aislados procedentes de células HUVEC. Fue introducida también una secuencia poli-His6 en el N-terminal de esta proteína. Este fragmento fue clonado en el vector de transfección pVL1393, en el sitio Xba 1 y Not 1. El baculorivus recombinante (BV) fue generado por medio de cotransfección, utilizando el reactivo BaculoGold Transfection (PharMingen). El BV recombinante fue purificado en placa y verificado por medio de análisis Western. Para la producción de proteínas, fueron cultivadas células SF-9 en medio SF-900-II (2 x 10^{6}/ml) y fueron infectadas con una cantidad de 0,5 unidades formadoras de placa por célula (MOI). Las células fueron recolectadas a las 48 horas después de la infección.
Purificación de KDR
Células SF-9 expresando (His)_{6}KDR(aa789-1354) fueron lisadas al añadir 50 ml de tampón de tampón de lisis Triton X-100 (20 mM de Tris, pH 8.0, 137 mM de NaCl, glicerol al 10%, Triton X-100 al 1%, 1 mM de PMSF, 10 \mug/ml de aprotinina, 1 \mug/ml de leupeptina) al pellet celular de 1L del cultivo celular. El lisado fue centrifugado a 19.000 rpm en un rotor Sorval SS-34 durante 30 minutos a 4ºC. El lisado celular fue aplicado a una columna de sefarosa quelante de 5 ml de NiCl_{2}, equilibrado con 50 mM de HEPES, pH 7.5, 0,3 M de NaCl. La KDR fue eluída utilizando el mismo tampón conteniendo 0,25 M de imidazol. Fueron analizadas fracciones de columna utilizando SDS-PAGE y un ensayo ELISA (más abajo), el cual mide la actividad de la quinasa. La KDR purificada fue intercambiada en 25 mM de tampón HEPES, pH 7.5, 25 mM de NaCl, 5 mM de DTT y almacenada a -80ºC.
Producción y Purificación de la Tie-2 Quinasa Humana
La secuencia codificadora para el dominio intracelular de la Tie-2 humana (aa775-1124) fue generada a través de PCR utilizando ADNcs aislados procedentes de placenta humana como un templete. Fue introducida una secuencia poli-His_{6} en el N-terminal, y este constructo fue clonado en el vector de transfección pVL1939 en el sitio Xba 1 y Not 1. Fue generado BV recombinante por medio de cotransfección, utilizando el reactivo BaculoGold Transfection (PharMingen). El BV recombinante fue purificado en placa y verificado por medio de análisis Western. Para la producción de proteínas, fueron cultivadas células de insecto SF-9 en medio SF-900-II (2 x 10^{6}/ml) y fueron infectadas con un MOI de 0,5. La purificación de la quinasa etiquetada con His utilizada en el escrutinio fue análoga a la descrita para la KDR.
Producción y Purificación de la Tirosina Quinasa Flt-1 Humana
Fue utilizado el vector de expresión baculoviral pVL1393 (PharMingen, Los Angeles, CA). Una secuencia nucleotídica codificando para el poli-His_{6} fue situada en el 5' de la región nucleotídica codificando el dominio intracelular completo de la quinasa Flt-1 humana (aminoácidos 786-1338). La secuencia nucleotídica codificando el dominio quinasa fue generada a través de PCR, utilizando librerías de ADNc aisladas procedentes de células HUVEC. Los residuos de histidina permitieron la purificación por afinidad de la proteína, de una forma análoga a la realizada con la KDR y la ZAP70. Células de insecto SF-9 fueron infectadas con una multiplicidad de 0,5, y recolectadas 48 horas después de la infección.
Fuente de Tirosina Quinasa EGFR
La EGFR fue adquirida en Sigma (Cat nº E-3641; 500 unidades/50 \mul) y el ligando EGF fue adquirido en Oncogene Research Products/Calbiochem (Cat nº PF011-100).
Expresión de ZAP70
El vector de expresión baculoviral utilizado fue el pVL1393. (Pharmingen, Los Angeles, CA). La secuencia nucleotídica codificando para los aminoácidos M(H)6 LVPP_{9}S fue situada en el 5' de la región codificando el ZAP70 completo (aminoácidos 1-619). La secuencia nucleotídica codificando la región codificadora de ZAP70 fue generada a través de PCR, utilizando librerías de ADNc aisladas procedentes de células T inmortalizadas Jurkat. Los residuos de histidina permitieron la purificación por afinidad de la proteína (vide infra). El puente LVPR_{9}S constituye una secuencia de reconocimiento para el clivaje proteolítico por medio de trombina, permitiendo la eliminación de la etiqueta de afinidad de la enzima. Células de insecto SF-9 fueron infectadas con una multiplicidad de infección de 0,5, y fueron recolectadas 48 horas después de la infección.
Extracción y purificación de ZAP70
Células SF-9 fueron lisadas en un tampón consistente en 20 mM de Tris, pH 8.0, 137 mM de NaCl, glicerol al 10%, Tritón X-100 al 1%, 1 mM de PMSF, 1 \mug/ml de leupeptina, 10 \mug/ml de aprotinina y 1 mM de ortovanadato sódico. El lisado soluble fue aplicado a una columna HiTrap de sefarosa quelante (Pharmacia) equilibrada en 50 mM de HEPES, pH 7.5, 0,3 M de NaCl. La proteína de fusión fue eluida con 250 mM de imidazol. La enzima fue almacenada en tampón conteniendo 50 mM de HEPES, pH 7.5, 50 mM de NaCl y 5 mM de DTT.
Fuente de la proteína quinasa
Lck, Fyn, Src, Blk, Csk y Lyn, y formas truncadas de las mismas, pueden ser obtenidas comercialmente (e.g., de Upstate Biotechnology Inc. (Saranac Lake, N.Y.) y Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, Ca.)) o pueden ser purificadas de fuentes naturales o recombinantes conocidas, utilizando métodos convencionales.
Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA) para PTKs
Fueron utilizados ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para detectar y medir la presencia de la actividad de la tirosina quinasa. Los ELISA fueron llevados a cabo conforme a protocolos conocidos, los cuales son descritos, por ejemplo, en Voller, et al., 1980, "Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay", en: Manual of Clinical Immunology, 2ª edic., editado por Rose y Friedman, págs. 359-371 Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C.
El protocolo publicado fue adaptado para determinar la actividad respecto a una PTK específica. Por ejemplo, los protocolos preferidos para llevar a cabo los experimentos ELISA son proporcionados más abajo. La adaptación de estos protocolos para determinar la actividad de un compuesto para otros miembros de la familia de receptores de la PTK, así como para tirosinas quinasas no receptoras, se encuentra dentro de las habilidades de los expertos en este campo. A efectos de determinar la selectividad del inhibidor, fue utilizado un sustrato universal PTK (e.g., copolímero aleatorio de poli (Glu_{4} Tyr), 20.000-50.000 MW) junto con ATP (usualmente 5 \muM) en concentraciones de aproximadamente el doble de Km aparente en el ensayo.
Fue utilizado el siguiente procedimiento para someter a ensayo el efector inhibidor de los compuestos de esta invención sobre la actividad de la tirosina quinasa KDR, Flt-1, Flt-4, Tie-1, Tie-2, EGFR, FGFR, PDGFR, IGF-1-R, c-Met, Lck, hck, Blk, Csk, Src, Lyn, fgr, Fyn y ZAP70:
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Tampones y Soluciones:
PGTPoli (Glu, Tyr) 4:1
\quad
Almacenar polvo a -20ºC. Disolver polvo en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para 50 mg/ml de solución. Almacenar alícuotas de 1 ml a -20ºC. Al confeccionar las placas, diluir hasta 250 \mug/ml en Gibco PBS.
\quad
Tampón de Reacción: 100 mM de HEPES, 20 mM de MgCl_{2}, 4 mM de MnCl_{2}, 5 mM de DTT, BSA al 0,02%, 200 \muM de NaVO_{4}, pH 7.10.
\quad
ATP: Almacenar alícuotas de 100 mM a -20ºC. Diluir hasta llegar a los 20 \muM en agua.
\quad
Tampón de Lavado: PBS con Tween 20 al 0,1%.
\quad
Tampón de Dilución de Anticuerpo: albúmina de suero bovino al 0,1% (BSA) en PBS Sustrato TMB: mezclar el sustrato TMB y soluciones de Peróxido 9:1 justo antes de utilizar, o utilizar Sustrato K-Blue de Neogen.
\quad
Solución de Parada: 1 M de Ácido Fosfórico.
Procedimiento 1. Preparación de la Placa
Diluir PGT stock (50 mg/ml, congelado) en PBS hasta 250 \mug/ml. Añadir 125 \mul por pocillo de placas para ELISA de alta afinidad de fondo plano modificadas Corning (Corning nº 25805-96). Añadir 125 \mul de PBS a pocillos vacíos. Cubrir con tapa selladora e incubar durante la noche a 37ºC. Lavar una vez con 250 \mul de tampón de lavado y secar durante alrededor de 2 horas en incubador seco a 37ºC. Almacenar las placas revestidas en bolsa sellada a 4ºC hasta que sea utilizada.
2. Reacción de la Tirosina Quinasa
-
Preparar soluciones inhibidoras en una concentración de 4 veces, en DMSO al 20% en agua.
-
Preparar tampón de reacción.
-
Preparar solución de enzima de tal modo que las unidades deseadas se encuentren en 50 \mul, e.g., para KDR preparar hasta 1 ng/\mul para un total de 50 ng por pocillo en las reacciones. Almacenar en hielo.
-
Preparar 4 veces solución ATP hasta 20 \muM de 100 mM de stock en agua. Almacenar en hielo.
-
Añadir 50 \mul de la solución enzimática por pocillo (usualmente 5-50 ng de enzima/pocillo, dependiendo de la actividad específica de la quinasa).
-
Añadir 25 \mul 4 veces del inhibidor.
-
Añadir 25 \mul 4 veces de ATP para el ensayo de inhibidor.
-
Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
-
Parar la reacción añadiendo 50 \mul de 0,05N HCl por pocillo.
-
Lavar la placa.
** Concentraciones Finales para Reacción: 5 \muM ATP, DMSO al 5%.
3. Unión al Anticuerpo
-
Diluir alícuota de 1 mg/ml de anticuerpo PY20-HRP (Pierce) (un anticuerpo fosfotirosina) hasta 50 ng/ml en BSA al 0,1% en PBS por medio de una dilución de dos fases (100x, a continuación 200x).
-
Añadir 100 \mul de Ab por pocillo. Incubar 1 hora a temperatura ambiente. Incubar 1 hora a 4ºC.
-
Lavar 4 veces la placa.
4. Reacción de color
-
Preparar sustrato TMB y añadir 100 \mul por pocillo.
-
Monitorizar OD a 650 nm hasta que es alcanzado 0,6.
-
Parar con 1M de ácido fosfórico. Agitar en lector de placa.
-
Leer OD inmediatamente a 450 nm.
Los tiempos de incubación óptimos y las condiciones de reacción de la enzima varían ligeramente en las preparaciones enzimáticas y son determinados empíricamente para cada lote.
Para Lck, el Tampón de Reacción utilizado fue 100 mM de MOPSO, pH 6.5, 4 mM de MnCl_{2}, 20 mM de MgCl_{2}, 5 mM de DTT, BSA al 0,2%, 200 mM de NaVO_{4,} bajo condiciones de ensayo análogas.
Los compuestos de las fórmulas 1-109 pueden presentar utilidad terapéutica en el tratamiento de enfermedades relacionadas con ambas proteínas tirosina quinasas identificadas, incluyendo aquéllas no mencionadas aquí y las aún no identificadas, las cuales son inhibidas por los compuestos de las fórmulas 1-109.
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Fuente de Cdc2
La enzima humana recombinante y el tampón de ensayo pueden ser obtenidos comercialmente (New England Biolabs, Beverly, MA. USA) o pueden ser purificadas de fuentes naturales o recombinantes conocidas, utilizando métodos convencionales.
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Ensayo Cdc2
Un protocolo que puede ser utilizado es el proporcionado con los reactivos adquiridos, con modificaciones menores. Resumiendo, la reacción es llevada a cabo en un tampón consistente en 50 mM de Tris pH 7.5, 100 mM de NaCl, 1 mM de EGTA, 2 mM de DTT, Brij al 0,01%, DMSO al 5% y 10 mM de MgCl_{2} (tampón comercial), suplementado con concentraciones finales de 300 \muM de ATP fresco (31 \muCi/ml) y 30 \mug/ml de histonas tipo IIIss. Se trabaja con un volumen de reacción de 80 \muL, conteniendo unidades de enzima, durante 20 minutos a 25 grados C en presencia o ausencia de inhibidor. Se termina con la reacción al añadir 120 \mul de ácido acético al 10%. El sustrato es separado del marcador no incorporado al disponer la mezcla sobre papel de fosfocelulosa, seguido de 3 lavados de 5 minutos cada uno de ellos, con 75 mM de ácido fosfórico. Las cuentas son medidas con un contador beta en presencia de líquido de centelleo.
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Fuente de quinasa PKC
La subunidad catalítica de la PKC puede ser obtenida comercialmente (Calbiochem).
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Ensayo para la quinasa PKC
Es utilizado un ensayo radioactivo para quinasa, siguiendo un procedimiento publicado (Yasuda, I., Kirshimoto, A., Tanaka, S., Tominaga, M., Sakurai, A., Nishizuka, Y., Biochemical and Biophysical Research Communication 3:166, 1220-1227 (1990)). Resumiendo, todas las reacciones son llevadas a cabo en un tampón quinasa consistente en 50 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM de MgCl_{2}, 2 mM de DTT, 1 mM de EGTA, 100 \muM de ATP, 8 \muM de péptido, DMSO al 5% y P^{33} ATP (8 Ci/mM). El compuesto y la enzima son mezclados en el recipiente de reacción y la reacción es iniciada por medio de la adición de ATP y de la mezcla del sustrato. Después de haberse terminado la reacción -al añadir 10 \mul de tampón de parada (5 mM de ATP en 75 mM de ácido fosfórico)- una parte de la mezcla es dispuesta sobre filtros de fosfocelulosa. Las muestras dispuestas son lavadas 3 veces en 75 mM de ácido fosfórico a temperatura ambiente de 5 a 15 minutos. La incorporación de radiomarcaje es cuantificada a través de medición por centelleo líquido.
Fuente de la enzima Erk2
La enzima murina recombinante y el tampón de ensayo pueden ser obtenidos comercialmente (New England Biolabs, Beverly MA. USA) o pueden ser purificados tomando fuentes naturales o recombinantes, utilizando métodos convencionales.
Ensayo para la enzima Erk2
Resumiendo, la reacción es llevada a cabo en un tampón consistente en 50 mM de Tris, pH 7.5, 1 mM de EGTA, 2 mM de DTT, 1 mM de EGTA, Brij al 0,01%, DMSO al 5% y 10 mM de MgCl_{2} (tampón comercial), suplementado con 100 mM de ATP fresco (31 Mci/ml) y 30 mM de proteína mielínica básica, bajo condiciones recomendadas por el proveedor. Los volúmenes de reacción y el método de evaluación de la radioactividad incorporada, son conforme es descrito para el ensayo de PKC (vide supra).
Modelos In Vitro para la activación de las células T
Cuando son activadas por mitógeno o antígeno, las células T son inducidas a secretar IL-2, un factor de crecimiento que es el soporte de su subsiguiente fase proliferativa. Por lo tanto, se puede medir la producción de IL-2 o la proliferación celular de células T primarias, o de líneas de células T adecuadas, como un sustitutivo para la activación de células T. Ambos ensayos son descritos adecuadamente en la literatura existente y sus parámetros se encuentran bien documentados (en Current Protocols in Immunology, Vol. 2, 7.10.1-7.11.2).
Resumiendo, las células T pueden ser activadas por medio de cocultivo con células estimuladoras alogénicas, un proceso denominado reacción linfocitaria mixta. Células mononucleares sanguíneas periféricas respondedoras y estimuladoras son purificadas por medio del gradiente Ficoll-Hypaque (Pharmacia) conforme a las directrices del fabricante. Las células estimuladoras son inactivadas mitóticamente por medio de tratamiento con mitomicina C (Sigma) o irradiación gamma. Tanto las células respondedoras como las estimuladoras son cocultivadas en una proporción de dos a una, en presencia o ausencia del compuesto sometido a prueba. Usualmente, son mezcladas 10^{5} respondedoras con 5 x 10^{4} estimuladoras, y son depositadas en placa (volumen de 200 \mul) en una placa de microtítulo con fondo en U (Costar Scientific). Las células son cultivadas en RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal inactivado por calentamiento (Hyclone Laboratories) o con pool de suero AB humano procedente de donantes masculinos, 5 x 10^{-5}M de 2mercaptoetanol y DMSO al 0,5%. Los cultivos son pulsados con 0,5 \muCi de H^{3} timidina (Amersham) un día antes de la recolección (usualmente el día 3). Los cultivos son recolectados (recolector Betaplate, Wallac) y evaluada la captación de isótopos por medio de centelleo líquido (Betaplate, Wallac).
Puede ser utilizado el mismo sistema de cultivo para evaluar la activación de células T, por medio de la medición de la producción de IL-2. De dieciocho a veinticuatro horas después de la iniciación del cultivo, los sobrenadantes son retirados y es medida la concentración de IL-2 por medio de ELISA (Sistemas R y D), siguiendo las directrices del fabricante.
Modelos In-Vivo de la activación de Células T
La eficacia in vivo de los compuestos puede ser sometida a prueba en modelos animales que se sabe miden directamente la activación de células T, o para los cuales las células T han demostrado ser las efectoras. Las células T pueden ser activadas in vivo por medio del ligado de la parte constante del receptor de las células T con un anticuerpo (Ab) monoclonal anti-CD3. En este modelo, a ratones BALB/c se les facilitan 10 \mug de Ab anti-CD3 intraperitonealmente, dos horas antes a la exsanguinación. Los animales que van a recibir un fármaco de prueba son pre-tratados con una dosis única del compuesto una hora antes a la administración del Ab anti-CD3. Son medidos por medio de ELISA los niveles en suero de las citoquinas proinflamatorias interferón-\gamma (IFN-\gamma) y factor de necrosis tumoral-\alpha (TNF-\alpha), indicadores de la activación de células T. Un modelo similar utiliza células T in vivo preparándolas con un antígeno específico, como la hemocianina de lapa californiana (KLH), seguido de una segunda prueba in vitro de drenaje de células del nódulo linfocitario con el mismo antígeno. Al igual que con anterioridad, la medición de la producción de citoquinas es utilizada para evaluar el estado de activación de las células cultivadas. Resumiendo, ratones C57BL/6 son inmunizados subcutáneamente con 100 \mug de KLH emulsificada en adyuvante completo de Freund (CFA) el día cero. Los animales son pre-tratados con el compuesto un día antes de la inmunización y, seguidamente, en los días uno, dos y tres después de la inmunización. Los nódulos linfocitarios drenados son recolectados el día 4 y sus células son cultivadas en una cantidad de 6 x 10^{6} por ml, en medio de cultivo tisular (RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal inactivado por calentamiento (Hyclone Laboratories) 5 x 10^{-5}M de 2-mercaptoetanol y DMSO al 0,5%) durante veinticuatro y durante cuarenta y ocho horas. Los sobrenadantes del cultivo son evaluados a continuación para determinar los niveles del factor de crecimiento autocrino de células T, Interleukin-2 (IL-2) y/o de IFN-\gamma, por medio del ELISA.
Los compuestos principales pueden ser testados también en modelos animales de enfermedades humanas. Éstos son ejemplificados para la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y para la artritis inducida por colágeno (CIA). Los modelos EAE, los cuales mimetizan aspectos de la esclerosis múltiple humana, han sido descritos tanto en ratas como en ratones (reviewed FASEB J. 5: 2560-2566, 1991; murin model: Lab. Invest. 4(3):278, 1981; rodent model:J. Inmunol 146(4):1163-8, 1991). Resumiendo, ratones o ratas son inmunizados con una emulsión de proteína básica mielínica (MBP), o derivados peptídicos neurogénicos de la misma, y CFA. Puede ser inducida enfermedad aguda con la adición de toxinas bacterianas, tales como la bordetella pertussis. La recaída/remisión de la enfermedad es inducida por medio de transferencia adoptiva de células T procedentes de animales inmunizados con MBP/péptido.
La CIA puede ser inducida en ratones DBA/1 por medio de inmunización con colágeno tipo II (J. Immunol:142(7):2237-2243). Los ratones desarrollarán signos de artritis tan pronto como a los diez días de la prueba con antígeno, y pueden ser medidos hasta noventa días después de la inmunización. Tanto en el modelo EAE como en el CIA, puede ser administrado un compuesto profilácticamente o en el momento del comienzo de la enfermedad. Los fármacos eficaces deben reducir la severidad y/o incidencia.
Ciertos compuestos de esta invención, los cuales inhiben uno o más de los receptores angiogénicos de la PTK, y/o una proteína quinasa como la Ick -involucrada en la mediación de respuestas inflamatorias-, pueden reducir la severidad e incidencia de la artritis en estos modelos.
Los compuestos pueden ser sometidos a prueba también en modelos de aloinjertos de ratón, bien de piel (revisado en Ann. Rev. Immunol., 10:333-58, 1992; Transplantation: 57(12): 1701-17D6, 1994) o de corazón (Am. J. Anat.:113:273, 1963). Resumiendo, son transplantados injertos de piel de grosor completo procedentes de ratones C57BL/6 a ratones BALB/c. Los injertos pueden ser examinados diariamente, comenzando el día seis, para determinar la evidencia de rechazo. En el modelo de transplante de corazón neonatal de ratón, corazones neonatales son transplantados ectópicamente de ratones C57BL/6 a los pabellones auriculares de ratones adultos CBA/J. Los corazones comienzan a latir de cuatro a siete días después del transplante y el rechazo puede ser evaluado visualmente utilizando un microscopio de disección para vigilar la parada de latido.
Ensayos Celulares para el Receptor PTK
El siguiente ensayo celular fue utilizado para determinar el nivel de actividad y efecto de los diferentes compuestos de la presente invención en KDR/VEGFR2. Pueden ser diseñados para otras tirosinas quinasas, siguiendo las mismas líneas, ensayos similares de receptor PTK, empleando un estímulo de ligando específico, usando técnicas de sobra conocidas en este campo.
Fosforilación de KDR inducida por VEGF en Células Endoteliales de Vena Umbilical de Humanos (HUVEC), conforme es medido por medio de Western Blots:
1.
Pueden ser adquiridas células HUVEC (procedentes de pools de donantes) en Clonetics (San Diego, CA) y cultivadas conforme a las directrices del fabricante. Únicamente los primeros pasajes (3-8) son utilizados en este ensayo. Las células son cultivadas en placas de 100 mm (Falcon para cultivo tisular; Becton Dickinson; Plymouth, Inglaterra) utilizando medio EBM completo (Clonetics).
2.
Para evaluar la actividad inhibidora de un compuesto, las células son tripsinizadas y sembradas con una concentración de 0,5-1,0 x 10^{5} células/pocillo en cada pocillo de placas cluster de 6 pocillos (Costar; Cambridge, MA).
3.
De 3 a 4 días después de la siembra, las placas son confluyentes usualmente de un 90 a un 100%. El medio es retirado de todos los pocillos, las células son aclaradas con 5-10 ml de PBS e incubadas de 18 a 24 horas con 5 ml de medio básico EBM, sin suplementos añadidos (i.e., consunción del suero).
4.
Son añadidas diluciones en serie de inhibidores en 1 ml de medio EBM (concentración final de 25 \muM, 5 \muM o 1 \muM) a células y son incubadas durante una hora a 37ºC. A continuación, es añadido VEGF_{165} humano recombinante (R & D Systems) a todos los pocillos en 2 ml de medio EBM, con una concentración final de 50 ng/ml, y fueron incubados a 37ºC durante 10 minutos. Las células control no tratadas, o tratadas únicamente con VEGF, son utilizadas para evaluar la fosforilación de fondo y la fosforilación inducida por VEGF.
Todos los pocillos son aclarados a continuación con 5-10 ml de PBS frío conteniendo 1 mM de Ortovanadato de Sodio (Sigma) y las células son lisadas y descartadas en 200 \mul de tampón RIPA (50 mM de Tris-HCl) pH 7, 150 mM de NaCl, NP-40 al 1%, desoxicolato sódico al 0,25%, 1mM de EDTA) conteniendo inhibidores de la proteasa (PMSF 1mM, aprotinina 1 \mug/ml, pepstatina 1 \mug/ml, leupeptina 1 \mug/ml, vanadato de Na 1 mM, fluoruro de Na 1 mM) y 1 \mug/ml de Dnasa (todos los productos químicos proceden de Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). El lisado es hecho girar a 14.000 r.p.m. durante 30 minutos para eliminar los núcleos.
A continuación, cantidades iguales de proteínas son precipitadas por la adición de Etanol (2 volúmenes) frío (-20ºC) durante un mínimo de 1 hora, o un máximo de toda la noche. Los pellets son reconstituidos en tampón de muestra Laemli, conteniendo mercaptoetanol al 5% (BioRad; Hercules, CA) y hervidos durante 5 minutos. Las proteínas son resueltas por electrofóresis en gel de poliacrilamina (6%, 1,5 mm Novex, San Diego, CA) y transferidas a una membrana de nitrocelulosa utilizando el sistema Novex. Después de bloquearlas con albúmina de suero bovino (3%), las proteínas son sondadas durante la noche con anticuerpo policlonal anti-KDR (C20, Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA) o con anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina (4G10, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) a 4ºC. Después de su lavado e incubado durante 1 hora con F(ab)2 conjugado con HRP de IgG de cabra anti-conejo o de cabra anti-ratón, las bandas son visualizadas utilizando el sistema de emisión quimioluminiscente (ECL) (Amersham Life Sciences, Arlington Height, IL).
Modelo in vivo de Edema Uterino
Este ensayo mide la capacidad de los compuestos para inhibir el incremento agudo en el peso uterino en ratones, lo cual tiene lugar durante las primeras pocas horas después de la estimulación con estrógenos. Este temprano comienzo de incremento en el peso uterino se sabe que es debido al edema causado por un incremento en la permeabilidad de la vasculatura uterina. Cullinan-Bove y Koss (Endocrinology (1993), 133:829-837) demostraron que existe una estrecha relación temporal del edema uterino estimulado por estrógenos con un incremento en la expresión del ARNm de VEGF en el útero. Estos resultados han sido confirmados a través de la utilización del anticuerpo monoclonal neutralizante de VEGF, el cual reduce de manera significativa el agudo incremento en el peso uterino después de la estimulación con estrógenos (WO 97/42187). Por lo tanto, este sistema puede servir como un modelo para la inhibición in vivo de la señalización de VEGF y de la hiperpermeabilidad y edema asociados.
Materiales: Todas las hormonas pueden ser adquiridas en Sigma (St. Louis, MO) o en Cal Biochem (La Jolla, CA) como polvos liofilizados, y pueden ser preparadas conforme a las instrucciones del proveedor.
Los componentes del vehículo (DMSO, Cremaphor EL) pueden ser adquiridos en Sigma (St. Louis, MO).
Los ratones (Balb/c, de 8 a 12 semanas de edad) pueden ser adquiridos en Taconic (Germantown, NY) y alojados en una instalación para animales libre de patógenos, conforme a las directrices institucionales del Comité para el Cuidado y Utilización de Animales.
Método
Día 1: A los ratones Balb/c se les facilita una inyección intraperitoneal (i.p.) de 12,5 unidades de gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG).
Día 3: Los ratones reciben 15 unidades de gonadotropina coriónica humana (hCG) i.p.
Día 4: Los ratones son divididos en grupos de 5 a 10 aleatoriamente. Los compuestos de la prueba son administrados por ruta i.p., i.v. o p.o., dependiendo de la solubilidad y del vehículo, en dosis que van de 1 a 100 mg/kg. El grupo de control del vehículo recibe el vehículo únicamente, y dos grupos son dejados sin tratamiento.
Treinta minutos después, al grupo experimental, al del vehículo y a uno de los no tratados se les administró una inyección i.p. de 17-estradiol (500 \mug/kg). Después de 2-3 horas, los animales son sacrificados mediante inhalación de CO_{2}. Después de una incisión en la línea media, cada útero fue aislado y separado por medio de un corte justo por debajo del cérvix y en las uniones del útero con los oviductos. El tejido graso y el conectivo fueron separados con cuidado de no perturbar la integridad del útero con anterioridad a su pesado (peso húmedo). Los úteros son secados para eliminar el fluido, presionando entre dos hojas de papel filtro con una botella de vidrio de un litro llena de agua. Los úteros son pesados después del secado (peso en seco). La diferencia entre los pesos húmedo y en seco es tomada como el contenido de fluido del útero. El contenido medio de fluido de los grupos tratados es comparado con el de los grupos sin tratar, o el de los tratados con vehículo. La significancia es determinada por medio del test de Student. El grupo de control no estimulado es utilizado para monitorizar la respuesta al estradiol.
Ciertos compuestos de esta invención, los cuales son inhibidores del receptor angiogénico de las tirosinas quinasas, pueden verse activos también en un modelo de implante de Matrigel de neovascularización. El modelo de neovascularización de Matrigel implica la formación de nuevos vasos sanguíneos dentro de un mármol claro de matriz extracelular implantado subcutáneamente, el cual es inducido por la presencia de células tumorales productoras de factor proangiogénico (como ejemplos, véase: Passaniti, A., et al., Lab. Investig. (1992), 67(4), 519-528; Anat. Rec. (1997), 249(1), 63-73; Int. J. Cancer (1995), 63(5), 694-701; Vasc. Biol. (1995), 15(11), 1857-6). El modelo se tiene en funcionamiento, preferiblemente, a lo largo de 3-4 días y los puntos finales incluyen el registro de imagen/visual macroscópico de la neovascularización, determinaciones de densidad de microvasos microscópicos y cuantificación de la hemoglobina (método Drabkin), seguido de la retirada del implante contra los controles procedentes de los animales que no han sido tratados con inhibidores. El modelo puede utilizar, alternativamente, bFGF o HGF como los estímulos.
Ejemplo 1 7-Ciclopentil-5-(4-fenoxifenil)-5H-pirrol[3,2-d]pirimidin-4-amina a) 2-ciclopentilacetonitrilo
Una mezcla de hidruro de sodio (2,17 g, 60% en aceite, 54,2 mmol) en dietil éter (100 mL) fue enfriada hasta alcanzar 0ºC, a continuación fue tratada con dietil(cianometil)fosfonato (9,6 g, 54,2 mmol) al tiempo que se mantenía la temperatura de la mezcla a menos de 0ºC. Fue añadida a la mezcla ciclopentanona (4,13 g, 49,3 mmol) en dietil éter (25 mL) a menos de 5ºC, después la reacción fue calentada hasta alcanzar temperatura ambiente y agitada durante 16 horas más. Fue añadido agua (240 mL) a la mezcla y las capas fueron separadas entonces. La capa acuosa fue extraída con dietil éter (50 mL). Las soluciones orgánicas combinadas fueron extraídas con agua (50 mL), a continuación salmuera (50 mL) y, finalmente, secada sobre sulfato de magnesio, filtrada y el filtrado concentrado bajo condiciones de presión reducida. El residuo resultante fue disuelto en etanol (40 mL), a continuación fue añadido paladio sobre carbón 10% (250 mg) y la mezcla fue hidrogenada a presión atmosférica y a temperatura ambiente durante 16 horas. El catalizador fue retirado por medio de filtrado, a través de una almohadilla de celite y el filtrado fue concentrado hasta conseguir un aceite, bajo condiciones de presión reducida. El compuesto del título fue purificado por medio de destilación fraccional para proporcionar 4,08 g (75,6%) como un aceite de color amarillo pálido (punto de ebullición 63ºC a 20 torr.): ^{1}H NMR (Cloroformo-d, 400 MHz) \delta 2,35 (d, 2H), 2,18 (m, 1H), 1,87 (m, 2H), 1,59-1,69 (m, 4H), 1,29 (m, 2H).
b) 1-ciclopentil-2-oxoetilcianida
Una mezcla de 2-ciclopentilacetonitrilo (0,50 g, 4,59 mmol) en tetrahidrofurano (10 mL) fue enfriada hasta alcanzar -60ºC, a continuación fue tratada con 1,7 M de tert-butillitio en pentano (3,25 mL, 5,50 mmol) al tiempo que se mantenía la temperatura de la reacción a menos de -55ºC. La solución fue agitada durante 10 minutos, a continuación fue añadido en forma de gotas etil formato (0,41 g, 5,50 mmol). La mezcla fue calentada hasta alcanzar temperatura ambiente y agitada 16 horas más. La mezcla fue concentrada bajo condiciones de presión reducida y el residuo resultante aplicado a una columna de gel de sílice y eluído con diclorometano/acetato de etilo (95:5). Las fracciones conteniendo material con un R_{f} de 0,1-0,3 [TLC, diclorometano/acetato de etilo (95:5), mancha de permanganato de potasio] fueron combinadas y concentradas para proporcionar un aceite que fue utilizado sin purificación posterior: ^{1}H NMR (Cloroformo-d, 400 MHz) \delta 9,57 (s, 1H), 3,54 (d, 1H), 2,45 (m, 1H), 1,4-1,9 (m, 8H).
c) (4-fenoxianilino)metil cianida
Una mezcla de 4-fenoxianilina (7,0 g, 37,8 mmol), bromoacetonitrilo (4,5 g, 37,8 mmol) y trietilamina (4,2 g, 41,6 mmol) en tetrahidrofurano (50 mL) fue calentada a 85ºC durante 5,25 horas, a continuación enfriada y fue añadida otra parte de bromoacetonitrilo (6,5 g, 5,46 mmol). La mezcla fue calentada a 85ºC durante 18 horas, a continuación fue enfriada y concentrada bajo condiciones de presión reducida. El residuo fue dividido entre diclorometano (50 mL) y agua (50 mL). La capa acuosa fue extraída con diclorometano (30 mL), a continuación las soluciones orgánicas combinadas fueron extraídas con 5 N de hidróxido sódico acuoso (30 mL), secadas sobre sulfato de magnesio, filtradas y el filtrado concentrado bajo condiciones de presión reducida. El residuo fue purificado entonces por medio de cromatografía flash en gel de sílice utilizando diclorometano/acetato de etilo (98:2) como un eluyente, con el fin de proporcionar 3,8 g (45%) del compuesto del título como un sólido marrón oscuro: ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}, 400 MHz) \delta 7,32 (t, 2H), 7,03 (t, 1H), 6,87-6,94 (m, 4H), 6,76 (d, 2H), 6,26 (bs, 2H), 4,25 (s, 2H); RP-HPLC (Hypersil HS-C18, 5 \mum, 100A, 4,6 x 250 mm; 25%-100% acetonitrilo-0,05 M de acetato de amonio durante 25 min, 1 mL/min) t, 18,4 min.; MS: MH^{+} 225,1.
d) 3-amino-4-ciclopentil-1-(4-fenoxifenil)-1H-2-pirrolcarbonitrilo
Una mezcla de (4-fenoxianilino)metil cianida (0,68 g, 3,30 mmol) y 1-ciclopentil-2-oxoetilcianida (0,54 g, 3,94 mmol) en 1,2-dimetoxietano (10 mL) fue tratada con 2 gotas de ácido acético, a continuación calentada a 85ºC durante 45 minutos. La mezcla fue enfriada hasta alcanzar temperatura ambiente, a continuación fue añadido 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-ona (DBN) (1,13 g, 9,09 mmol). La mezcla fue calentada entonces a 65ºC durante 16 horas y a 85ºC durante 6 horas. Fue añadido DBN fresco (0,25 mL) y la mezcla fue calentada a 85ºC durante 18 horas más. El solvente fue retirado bajo condiciones de presión reducida, a continuación el residuo fue aplicado a una columna de gel de sílice y eluído con heptano/acetato de etilo (7:3) para proporcionar 185 mg (17,8%) del compuesto del título como un vidrio: ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}, 400 MHz) \delta 7,42 (m, 4H), 7,17 (t, 1H), 7,04-7,11 (m, 4H), 6,99 (s, 1H), 5,10 (bs, 2H), 2,82 (m, 1H), 1,97 (m, 2H), 1,69 (m, 2H), 1,58 (m, 2H); RP-HPLC (Hypersil HS-C18, 5 \mum, 100A, 4,6 x 250 mm; 25%-100% acetonitrilo-0,05 M de acetato de amonio durante 25 min, 1 mL/min) t, 26,2 min.; MS: MH^{+} 343,9.
e) 7-ciclopentil-5-(4-fenoxifenil)-5H-pirrol[3,2-d]pirimidin-4-amina
Una mezcla de 3-amino-4-ciclopentil-1-(4-fenoxifenil)-1H-2-pirrolcarbonitrilo (185 mg, 0,539 mmol) en etanol absoluto (10 mL) fue tratada con acetato de formamidina (450 mg, 4,33 mmol), a continuación calentada a 85ºC durante 2 horas. El solvente fue evaporado bajo condiciones de presión reducida, después el residuo fue purificado por medio de fase reversa preparativa (HPLC) con el fin de proporcionar 145 mg (73%) del compuesto del título como un sólido blanco después de liofilización: ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}, 400 MHz) \delta 8,19 (s, 1H), 7,44 (m, 5H), 7,19 (t, 1H), 7,13 (m, 4H), 5,79 (bs, 2H), 3,23 (m, 1H), 2,05 (m, 2H), 1,77 (m, 4H), 1,64 (m, 2H); RP-HPLC (Hypersil HS-C18, 5 \mum, 100A, 4,6 x 250 mm; 5%-100% acetonitrilo-0,05 M de acetato de amonio durante 25 min, 1 mL/min) t, 23,3 min.; MS: MH^{+} 371,5.

Claims (13)

1. Un compuesto de Fórmula (I), las mezclas racémicas diastereoméricas, isómeros ópticos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos,
4
en donde:
R_{1} es
5
Z^{100} es un fenilo opcionalmente sustituido,
\quad
donde Z^{100} es opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes, cada uno de ellos independientemente seleccionado de entre el grupo consistente en F, Cl, CN, NO_{2}, -alquilo opcionalmente sustituido, -O-(alquilo opcionalmente sustituido), -C(O)H, -CONH_{2}, -NHSO_{2}CF_{3}, heteroarilo opcionalmente sustituido, COOH, -Z^{105}-C(O)N(R)_{2}, -Z^{105}-N(R)-C(O)-Z^{200}, -Z^{105}-N(R)-S(O)_{2}-Z^{200} y -Z^{105}-N(R)-C(O)-N(R)-Z^{200};
\quad
Z^{105} es un enlace covalente o (C_{1}-C_{6});
\quad
Z^{200} es un grupo opcionalmente sustituido, seleccionado de entre el grupo consistente en (C_{1}-C_{6}), fenilo y -(C_{1}-C_{6})-fenilo;
Z^{110} y Z^{111} son independientemente cada uno de ellos un enlace covalente y
A es O;
R_{a} es hidrógeno;
R_{3} es H;
R_{2} es -Z^{101}-Z^{102};
Z^{101} es un enlace covalente;
Z^{102} es un grupo cicloalquilo sustituido o insustituido.
2. Un compuesto conforme a la Reivindicación 1, en donde R_{2} es ciclopentilo.
3. Un compuesto conforme a la Reivindicación 2, en donde
\quad
Z^{100} es fenilo opcionalmente sustituido, donde Z^{100} es opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes, cada uno de ellos independientemente seleccionado de entre el grupo consistente en F, COOH, NO_{2}, OMe, -COOMe, OCF_{3} y CF_{3}.
4. Un compuesto conforme a la Reivindicación 2, en donde
\quad
Z^{100} es un fenilo opcionalmente sustituido, donde Z^{100} es opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes, cada uno de ellos independientemente seleccionado de entre el grupo consistente en alquilo, alcoxi, halo, hidroxi y alcoxicarbonilo.
5. Un compuesto conforme a la Reivindicación 1, en donde R^{2} es un grupo opcionalmente sustituido, seleccionado de entre el grupo consistente en ciclobutilo y ciclohexilo.
6. Un compuesto conforme a la Reivindicación 5, en donde R^{2} es opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes, seleccionados de entre el grupo consistente en hidroxi, alquilo, hidroxialquilo, carboxialquilo y fenilalcoxialquilo.
7. Un compuesto conforme a la Reivindicación 1, en donde R_{1} es 4-fenoxifenilo.
8. Un compuesto de fórmula I conforme a la reivindicación 1, en donde R_{1}= 4-fenoxifenilo, R_{2}= ciclopentilo y ambos R_{3}= H.
9. La utilización de un compuesto de la reivindicación 1, o de una sal fisiológicamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para inhibir la actividad de una o más proteínas quinasas en un paciente, por medio de la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva a dicho paciente.
10. La utilización de la Reivindicación 9, en donde dicha proteína quinasa es seleccionada de entre el grupo consistente en KDR, FGFR-1, PDGFR\beta, PDGFR\alpha, IGF-1R, c-Met, Flt-1, Flt-4, TIE-2, TIE-1, Lck, Src, fyn, Lyn, Blk, hck, fgr y yes.
11. La utilización de la Reivindicación 9, en donde la proteína quinasa es una proteína serina/treonina quinasa o una proteína tirosina quinasa.
12. La utilización de la Reivindicación 10, en donde la proteína quinasa es Tie-2.
13. La utilización de la Reivindicación 9, en donde la actividad de la proteína quinasa se encuentra implicada en la activación de células T, en la activación de células B, en la desgranulación de mastocitos, en la activación de monocitos, en la potenciación de una respuesta inflamatoria o en una combinación de las mismas.
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