ES2298269T3 - Modulacion de la actividad inmunoestimulante de analogos oligonucleotidicos inmunoestimulantes mediante cambios quimicos posicionales. - Google Patents
Modulacion de la actividad inmunoestimulante de analogos oligonucleotidicos inmunoestimulantes mediante cambios quimicos posicionales. Download PDFInfo
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Abstract
Compuesto oligonucleotídico inmunoestimulante, que comprende un dinucleótido inmunoestimulante de fórmula C*pG, en la que C* es un análogo de citidina de la fórmula (I): en la que D es un dador de enlaces de hidrógeno, D'' se selecciona de entre el grupo constituido por hidrógeno, un dador de enlaces de hidrógeno, un aceptor de enlaces de hidrógeno, un grupo hidrófilo, un grupo hidrófobo, un grupo extractor de electrones y un grupo dador de electrones, A es un aceptor de enlaces de hidrógeno o un grupo hidrófilo, X es carbono o nitrógeno, y S es un anillo de azúcar de pentosa o de hexosa, incluyendo el análogo de citidina de la fórmula (I) una base de citosina de origen no natural seleccionada de entre el grupo constituido por 5-hidroxicitosina, 5-hidroximetilcitosina, N4-alquilcitosina, y 4-tiouracilo, o comprendiendo arabinosa como una fracción de azúcar de origen no natural, y en la que G es guanosina, 2''-desoxiguanosina, o un análogo de guanosina, y p es una unión internucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por fosfodiéster, fosforotioato, y fosforoditioato.
Description
Modulación de la actividad inmunoestimulante de
análogos oligonucleotídicos inmunoestimulantes mediante cambios
químicos posicionales.
La invención se refiere a oligonucleótidos o
análogos de oligonucleótidos como agentes inmunoestimulantes en
aplicaciones de inmunoterapia.
Los oligonucleótidos se han convertido en
herramientas indispensables en la biología molecular moderna,
utilizándose en una amplia variedad de técnicas, desde los
procedimientos de exploración diagnóstica a la PCR, la inhibición
antisentido de la expresión génica y aplicaciones de inmunoterapia.
Este amplio uso de los oligonucleótidos ha conducido a una demanda
creciente de procedimientos rápidos, baratos y eficientes de
síntesis de oligonucleótidos.
La síntesis de oligonucleótidos para
aplicaciones antisentido y de diagnóstico se puede llevar a cabo
rutinariamente en la actualidad. Véase, por ejemplo, Methods in
Molecular Biology, vol. 20: Protocols for Oligonucleotides
and Analogs, páginas 165-189 (editor S. Agrawal,
Humana Press, 1993); Oligonucleotides and Analogues: A Practical
Approach, páginas 87-108 (editor F. Eckstein,
1991); y Uhlmann y Peyman, Methods Mol. Biol. 20:
355-389 (1993); Agrawal e Iyer, Curr. Op. in
Biotech. 6:12 (1995); y Antisense Research and
Applications (editores Crooke y Lebleu, CRC Press, Boca Raton,
1993). Los primeros enfoques sintéticos incluían químicas de
fosfodiéster y fosfotriéster. Khorana et al., J. Molec. Biol.
72: 209 (1972), describen la química de fosfodiéster para la
síntesis de oligonucleótidos. Reese, Tetrahedron Lett. 34:
3143-3179 (1978), describe la química de
fosfotriéster para la síntesis de oligonucleótidos y
polinucleótidos. Estos primeros enfoques en gran parte han dejado
paso a enfoques más eficientes de la síntesis, tales como los
enfoques del fosforamidito y del H-fosfonato.
Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:
1859-1862 (1981), describen el uso de fosforamiditos
de desoxinucleósidos en la síntesis de polinucleótidos. Agrawal y
Zamecnik, patente US nº 5.149.798 (1992), describen la síntesis
optimizada de oligonucleótidos mediante el enfoque del
H-fosfonato.
Estos dos enfoques modernos se han usado para
sintetizar oligonucleótidos que presentan una diversidad de uniones
internucleotídicas modificadas. Agrawal y Goodchild, Tetrahedron
Lett. 28: 3539-3542 (1987), dan a conocer la
síntesis de metilfosfonatos de oligonucleótidos mediante el uso de
la química del fosforamidito. Connolly et al.,
Biochemistry 23: 3443 (1984), dan a conocer la síntesis de
fosforotioatos de oligonucleótidos mediante el uso de la química
del fosforamidito. Jager et al., Biochemistry 27: 7237
(1988), dan a conocer la síntesis de fosforamidatos de
oligonucleótidos mediante el uso de la química del fosforamidito.
Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:
7079-7083 (1988), dan a conocer la síntesis de
fosforamidatos y fosforotioatos de oligonucleótidos mediante el uso
de la química del H-fosfonato.
Más recientemente, varios investigadores han
demostrado la validez del uso de oligonucleótidos como agentes
inmunoestimulantes en aplicaciones de inmunoterapia. La observación
de que los fosfodiéster y fosforotioato oligonucleótidos pueden
inducir la estimulación inmunológica ha generado interés en el
desarrollo de este efecto secundario como herramienta terapéutica.
Estos esfuerzos se han centrado en los fosforotioato
oligonucleótidos que contienen el dinucleótido CpG.
Kuramoto et al., Jpn. J. Cancer
Res. 83: 1128-1131 (1992), dan a conocer que los
fosfodiéster oligonucleótidos que contienen un palíndromo que
incluye un dinucleótido CpG pueden inducir la síntesis de
interferón-alfa y gamma, y potenciar la actividad
citotóxica natural. Krieg et al., Nature 371:
546-549 (1995), describen que los fosforotioato
oligonucleótidos que contienen CpG son inmunoestimulantes. Liang
et al., J. Clin. Invest. 98:
1119-1129 (1996), describen que dichos
oligonucleótidos activan las células B humanas.
Pisetsky, D. S. y Reich C. F., Life Sci.
54: 101 (1994), dan a conocer que la actividad inmunoestimulante de
CpG-oligos está potenciada adicionalmente por la
presencia de la cadena principal de fosforotioato (PS) en estos
oligonucleótidos. Tokunaga, T.; Yamamoto, T.; Yamamoto, S., Jap.
J. Infect. Dis. 52:1 (1999), dan a conocer que la actividad
inmunoestimulante de CpG-oligos depende de la
posición del motivo de CpG, y de las secuencias que flanquean el
motivo de CpG. El mecanismo de activación de la estimulación
inmunitaria por los CpG-oligos no se ha comprendido
bien. Yamamoto, T.; Yamamoto, S.; Kataoka, T.; Tokunaga, T.,
Microbiol. Immunol. 38:831 (1994), sin embargo, sugieren que
los CpG-oligos ponen en marcha la cascada
inmunitaria mediante la unión a un receptor/proteína intracelular,
que aún no está caracterizada.
Varios investigadores han encontrado que esto
pone en marcha finalmente las rutas de la estrés quinasa, la
activación de NF-\kappaB y la inducción de
diversas citoquinas, tales como IL-6,
IL-12, \gamma-IFN, y
TNF-\alpha. (Véase, por ejemplo, Klinman, D. M.;
Yi, A. K.; Beaucage, S. L.; Conover, J.; Krieg, A. M., Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 2879 (1996); Sparwasser, T.;
Miethke, T.; Lipford, G. B.; Erdmann, A.; Haecker, H.; Heeg, K.;
Wagner, H., Eur. J. Immunol. 27: 1671 (1997); Lipford, G. B.;
Sparwasser, T.; Bauer, M.; Zimmermann, S.; Koch, E. S.; Heeg, K.;
Wagner, H. Eur. J. Immunol. 27: 3420 (1997); Sparwasser, T.;
Koch, E. S.; Vabulas, R M.; Lipford, G. B.; Heeg, K.; Ellart, J. W.;
Wagner, H., Eur. J. Immunol. 28: 2045 (1998); and Zhao, Q.;
Temsamani, J.; Zhou, R. Z.; Agrawal, S., Antisense Nucleic Acid
Drug Dev. 7:495 (1997)).
Se ha dado a conocer el uso de
CpG-PS-oligos como agentes
antitumorales, antivíricos, antibacterianos y antiinflamatorios, y
como adyuvantes en inmunoterapia. (Véase, por ejemplo, Dunford, P.
J.; Mulqueen, M. J.; Agrawal, S., Antisense 97: Targeting the
Molecular Basis of Disease, (Nature Biotechnology) Conference
abstract, 1997, p. 40; Agrawal, S.; Kandimalla E. R., Mol. Med.
Today 6: 72 (2000); Chu. R S.; Targoni, O. S.; Krieg, A. M.;
Lehmann, P. V.; Harding, C. V., J. Exp. Med. 186:1623
(1997); Zimmermann, S.; Egeter, O.; Hausmann, S.; Lipford, G. B.;
Rocken, M.; Wagner, H.; Heeg, K, J. Immunol. 160: 3627
(1998)). Moldoveanu et al., Vaccine 16:
1216-124 (1998), dan a conocer que los fosforotioato
oligonucleótidos que contienen CpG potencian la respuesta
inmunitaria frente al virus de la gripe. McCluskie y Davis, J.
Immunol. 161: 4463-4466 (1998), dan a conocer
que los oligonucleótidos que contienen CpG actúan como potentes
adyuvantes, potenciando la respuesta inmunitaria frente al antígeno
de superficie de la hepatitis B.
Zhao, Q.; Temsamani, J.; Idarola, P.; Jiang, Z.;
Agrawal, S., Biochem. Pharmacol. 51: 173 (1996), dan a
conocer que la sustitución de desoxinucleósidos en un motivo de CpG
por 2'-O-metilribonucleósidos
suprime la actividad inmunoestimulante, sugiriendo que una
conformación C3'-endo rígida, inducida por la
modificación 2'-O-metílica, no
permite el reconocimiento apropiado y/o la interacción del motivo de
CpG con las proteínas implicadas en la ruta inmunoestimulante. Esta
referencia da a conocer además que la sustitución de un grupo
metilo por un oxígeno que no forma parte de un puente, en el grupo
fosfato, entre C y G de un motivo de CpG, suprime la actividad
inmunoestimulante, sugiriendo que la carga negativa en el grupo
fosfato es esencial para el reconocimiento e interacción de las
proteínas.
Zhao, Q.; Yu, D.; Agrawal, S, Bioorg. Med.
Chem. Lett. 9: 3453 (1999), dan a conocer que la sustitución de
uno o dos 2'-desoxinucleósidos adyacentes al motivo
de CpG por 2'- o
3'-O-metilribonucleósidos, en el
lado 5', provoca una disminución de la actividad inmunoestimulante,
mientras que las mismas sustituciones tienen un efecto
insignificante cuando se realizan en el lado 3' del motivo de CpG.
Sin embargo, Zhao, Q.; Yu, D.; Agrawal, S., Bioorg. Med. Chem.
Lett. 10: 1051 (2000), dan a conocer que la sustitución de un
desoxinucleósido, dos o tres nucleósidos alejados del motivo de
CpG, en el lado 5', por uno o dos
2'-O-metoxietil- o 2'- o
3'-O-metilribonucleósidos da como
resultado un aumento significativo de la actividad
inmunoestimulante.
Agrawal, S.J. Zhao, Q., Current Opinion in
Chemical Biology 2(4), 519-528 (1998),
describen oligonucleótidos químicamente modificados que incluyen un
dinucleótido de CG.
Todavía no se han estudiado con detalle los
requisitos estructurales precisos y los grupos funcionales
específicos del motivo de CpG necesarios para el reconocimiento del
factor proteínico/receptor que es responsable de la estimulación
inmunitaria. Por lo tanto, existe la necesidad de nuevos motivos
inmunoestimulantes que puedan proporcionar una actividad
inmunoestimulante mejorada.
La invención se refiere a la potenciación de la
respuesta inmunitaria provocada por compuestos oligonucleotídicos
inmunoestimulantes. La invención permite aumentar el efecto
inmunoestimulante para aplicaciones inmunoterapéuticas.
Los inventores han descubierto sorprendentemente
que la modificación posicional de oligonucleótidos
inmunoestimulantes afecta drásticamente a sus capacidades
inmunoestimulantes.
En un primer aspecto, la invención proporciona
un compuesto oligonucleotídico inmunoestimulante, que comprende un
dinucleótido inmunoestimulante de fórmula C*pG,
en la que C* es un análogo de citidina de la
fórmula (I):
en la que D es un dador de enlaces
de hidrógeno, D' se selecciona de entre el grupo constituido por
hidrógeno, un dador de enlaces de hidrógeno, un aceptor de enlaces
de hidrógeno, un grupo hidrófilo, un grupo hidrófobo, un grupo
extractor de electrones y un grupo dador de electrones, A es un
aceptor de enlaces de hidrógeno o un grupo hidrófilo, X es carbono
o nitrógeno, y S es un anillo de azúcar de pentosa o de
hexosa,
incluyendo el análogo de citidina de la fórmula
(I) una base de citosina de origen no natural seleccionada de entre
el grupo constituido por 5-hidroxicitosina,
5-hidroximetilcitosina,
N4-alquilcitosina, y 4-tiouracilo,
o comprendiendo arabinósido como una fracción de azúcar de origen no
natural,
y en la que G es guanosina,
2'-desoxiguanosina, o un análogo de guanosina, y p
es una unión internucleotídica seleccionada de entre el grupo
constituido por fosfodiéster, fosforotioato, y fosforoditioato.
En una forma de realización del compuesto
oligonucleotídico inmunoestimulante de la invención, la base de
citosina de origen no natural se selecciona de entre el grupo
constituido por 5-hidroxicitosina y
N4-etilcitosina. En una forma de realización
adicional del compuesto oligonucleotídico inmunoestimulante de la
invención, el análogo de citidina es aracitosina.
En algunas formas de realización, el compuesto
oligonucleotídico inmunoestimulante de la invención comprende una
unión 3'-3'.
En un segundo aspecto, la invención proporciona
el uso de un compuesto oligonucleotídico inmunoestimulante de la
invención para la preparación de una composición farmacéutica para
generar una respuesta inmunitaria en un paciente.
En una forma de realización, la composición
farmacéutica preparada según la invención es para administrar el
compuesto oligonucleotídico inmunoestimulante en combinación con un
antibiótico, antígeno, alérgeno, vacuna, anticuerpo, agente
citotóxico, oligonucleótido antisentido, vector de terapia génica,
vacuna de ADN, adyuvante, o una combinación de los mismos. En una
forma de realización, el compuesto oligonucleotídico
inmunoestimulante se conjuga con un antígeno o vacuna, en el que
dicha conjugación se realiza preferentemente al extremo 3' del
compuesto oligonucleotídico.
En un tercer aspecto, la invención proporciona
el uso de un compuesto oligonucleotídico inmunoestimulante de la
invención para la preparación de una composición farmacéutica para
tratar terapéuticamente un paciente que tiene una enfermedad
provocada por un patógeno. Preferentemente, el patógeno es un virus,
un parásito o una bacteria.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona
el uso de un compuesto oligonucleotídico inmunoestimulante de la
invención para la preparación de una composición farmacéutica para
tratar un paciente con cáncer. En algunas formas de realización, la
composición farmacéutica preparada según la invención es para
administrar el compuesto oligonucleotídico inmunoestimulante en
combinación con un compuesto quimioterapéutico.
En un quinto aspecto, la invención proporciona
el uso de un compuesto oligonucleotídico inmunoestimulante de la
invención para la preparación de una composición farmacéutica para
tratar un trastorno autoinmunitario. En una forma de realización,
el trastorno autoinmunitario es asma autoinmunitario.
En un sexto aspecto, la invención proporciona el
uso de un compuesto oligonucleotídico inmunoestimulante de la
invención para la preparación de una composición farmacéutica para
tratar la inflamación de las vías respiratorias o alergia.
La Figura 1 muestra los resultados de ensayos de
proliferación que usan oligonucleótidos que tienen sustituciones de
1',2'-didesoxirribosa en diversas posiciones.
La Figura 2 muestra los resultados de los
ensayos de peso del bazo que usan oligonucleótidos que usan
oligonucleótidos que tienen sustituciones de
1',2'-didesoxirribosa en diversas posiciones.
La Figura 3 muestra los resultados de ensayos de
proliferación que usan diferentes oligonucleótidos que tienen
sustituciones de 1',2'-didesoxirribosa en diversas
posiciones.
La Figura 4 muestra los resultados de ensayos de
peso del bazo que usan diferentes oligonucleótidos que tienen
sustituciones de 1',2'-didesoxirribosa en diversas
posiciones.
La Figura 5 muestra los resultados de ensayos de
proliferación que usan oligonucleótidos que tienen sustituciones de
ligador de C3 en diversas posiciones.
La Figura 6 muestra los resultados de ensayos de
peso del bazo que usan oligonucleótidos que tienen sustituciones de
ligador de C3 en diversas posiciones.
La Figura 7 muestra los resultados de ensayos de
proliferación que usan oligonucleótidos que tienen sustituciones
del espaciador 9 o del espaciador 18 en diversas posiciones.
La Figura 8 muestra los resultados de los
ensayos de peso del bazo que usan oligonucleótidos que tienen
sustituciones del espaciador 9 o del espaciador 18 en diversas
posiciones.
La Figura 9 muestra los resultados de ensayos de
proliferación que usan oligonucleótidos que tienen sustituciones de
ligadores de amino en diversas posiciones.
La Figura 10 muestra los resultados de ensayos
de peso del bazo que usan oligonucleótidos que tienen sustituciones
de ligador de amino en diversas posiciones.
La Figura 11 muestra resultados de ensayos de
proliferación que usan oligonucleótidos que tienen sustituciones de
3'-desoxinucleósido en diversas posiciones.
La Figura 12 muestra resultados de ensayos de
peso del bazo que usan oligonucleótidos que tienen sustituciones de
3'-desoxinucleósidos en diversas posiciones.
La Figura 13 muestra resultados de ensayos de
proliferación que usan oligonucleótidos que tienen sustituciones de
metilfosfonato en diversas posiciones.
La Figura 14 muestra resultados de ensayos de
peso del bazo que usan oligonucleótidos que tienen sustituciones de
metilfosfonato en diversas posiciones.
La Figura 15 muestra resultados de ensayos de
proliferación que usan oligonucleótidos que tienen sustituciones de
2'-O-metilribonucleósido o
2'-O-metoxietilo en diversas
posiciones.
La Figura 16 muestra resultados de ensayos de
peso del bazo que usan oligonucleótidos que tienen sustituciones de
2'-O-metilribonucleósido o
2'-O-metoxietilo en diversas
posiciones.
La Figura 17 muestra resultados de ensayos de
proliferación que usan oligonucleótidos que tienen sustituciones de
uniones de 5'-3', 5'-5', o
3'-3' en diversas posiciones.
La Figura 18 muestra resultados de ensayos de
peso del bazo que usan oligonucleótidos que tienen sustituciones de
\beta-L-desoxinucleótido en
diversas posiciones.
La Figura 19 muestra resultados de ensayos de
peso del bazo que usan oligonucleótidos que tienen sustituciones de
2'-O-propargilo en diversas
posiciones.
La Figura 20 muestra resultados de ensayos de
peso del bazo que usan oligonucleótidos que tienen diversas
sustituciones en diversas posiciones.
La Figura 21 muestra resultados de ensayos de
peso del bazo que usan oligonucleótidos que tienen una sustitución
de 7-desazaguanina dentro del dinucleótido
inmunoestimulante.
La Figura 22 muestra resultados de ensayos de
proliferación que usan oligonucleótidos que tienen sustitución de
6-tioguanina dentro del dinucleótido
inmunoestimulante.
La Figura 23 muestra resultados de ensayos de
peso del bazo que usan oligonucleótidos que tienen sustitución de
5-hidroxicitosina o N4-etilcitoxina
dentro del dinucleótido inmunoestimulante.
La Figura 24 muestra resultados de ensayos de
peso del bazo que usan oligonucleótidos que tienen sustitución de
5-hidroxicitosina o N4-etilcitosina
dentro del dinucleótido inmunoestimulante.
La Figura 25 muestra resultados de ensayos de
proliferación que usan oligonucleótidos que tienen sustitución de
arabinofuranosilcitosina (aracitidina; Ara-C) dentro
del dinucleótido inmunoestimulante.
La Figura 26 muestra resultados de ensayos de
peso del bazo que usan oligonucleótidos que tienen sustitución de
4-tiouracilo dentro del dinucleótido
inmunoestimulante.
La Figura 27 muestra la estructura química de un
motivo de CpG, que muestra grupos funcionales sobre la citosina que
sirven como grupos aceptores de enlaces de hidrógeno y dadores de
enlaces de hidrógeno.
La Figura 28 muestra las estructuras químicas de
citosina (1) y análogos de citosina (2-7). En los
nucleósidos citidina, desoxicitidina, y análogos relacionados, el
sustituyente R es ribosa o 2'-desoxirribosa.
La invención se refiere a oligonucleótidos y
análogos de oligonucleótidos como agentes inmunoestimulantes para
aplicaciones de inmunoterapia. Las patentes y publicaciones citadas
aquí reflejan el nivel de conocimiento en el campo. En el caso de
conflicto entre cualquier enseñanza de cualquier referencia citada
aquí y la presente memoria descriptiva, prevalecerá esta última,
para los fines de la invención.
\newpage
La invención se refiere a la potenciación de la
respuesta inmunitaria provocada por compuestos oligonucleotídicos
inmunoestimulantes para aplicaciones de inmunoterapia. De este modo,
la invención proporciona compuestos oligonucleotídicos que tienen
niveles óptimos de efecto inmunoestimulante para inmunoterapia, y el
uso de dichos compuestos oligonucleotídicos.
Los inventores han descubierto sorprendentemente
que las modificaciones químicas de posición introducidas en
oligonucleótidos inmunoestimulantes afectan drásticamente a sus
capacidades inmunoestimulantes.
Para los fines de todos los aspectos de la
invención, el término "oligonucleótido" incluye polímeros de
dos o más desoxirribonucleósidos, o cualquier nucleósido
modificado, incluyendo nucleósidos sustituidos en 2' o en 3',
ribonucleósidos sustituidos en 2'- o 3'-O,
desazanucleósidos, o cualquier combinación de los mismos. Dichos
monómeros se pueden acoplar entre sí mediante cualquiera de las
numerosas uniones internucleosídicas conocidas. En ciertas formas
de realización preferidas, estas uniones internucleosídicas pueden
ser uniones de fosfodiéster, fosfotriéster, fosforotioato,
fosforoditioato, o fosforamidito, incluyendo uniones
3'-5', 2'-5',
3'-3', y 5'-5' de cualquiera de los
anteriores, o sus combinaciones. El término oligonucleótido también
engloba dichos polímeros que tienen bases o azúcares químicamente
modificados, y/o que tienen sustituyentes adicionales, incluyendo
sin limitación grupos lipófilos, agentes intercalantes, diaminas y
adamantano. El término oligonucleótido también engloba ácidos
nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos peptídicos con grupos
fosfato (PHONA), ácidos nucleicos cerrados (LNA), ácidos
morfolinonucleicos, y oligonucleótidos que comprenden cadenas
principales o secciones de cadenas principales de azúcar que no sea
una pentosa (por ejemplo hexosa) o de azúcar abásico, así como
también oligonucleótidos que incluyen secciones de cadena principal
con un ligador que no sea un azúcar o con grupos espaciadores, como
se describirá posteriormente aquí abajo.
Para los fines de la invención, las expresiones
"sustituido en 2'" y "sustituido en 3'" significan
(respectivamente) sustitución de la posición 2' (o 3') de la
fracción de pentosa con un halógeno (preferentemente Cl, Br o F), o
un grupo -O-alquilo inferior que contiene
1-6 átomos de carbono saturados o insaturados, o con
un grupo -O-arilo o alilo que tiene
2-6 átomos de carbono, en la que dicho grupo
alquilo, arilo o alilo puede estar no sustituido, o puede estar
sustituido, por ejemplo, con grupos halo, hidroxi, trifluorometilo,
ciano, nitro, acilo, aciloxi, alcoxi, carboxilo, carbalcoxi, o
amino; o dicha sustitución de 2' puede ser con un grupo hidroxi
(para producir un ribonucleósido) o con un grupo amino, pero no con
un grupo 2' (o 3') H.
Para los fines de la invención, la expresión
"compuesto oligonucleotídico inmunoestimulante" significa un
compuesto que comprende un dinucleótido inmunoestimulante, sin el
cual el compuesto no tendría un efecto inmunoestimulante. Un
"dinucleótido inmunoestimulante" es un dinucleótido que tiene
la fórmula
5'-pirimidina-purina-3',
en la que "pirimidina" es un nucleósido pirimidínico natural o
no natural, y "purina" es un nucleósido purínico natural o no
natural. Uno de dichos dinucleótidos inmunoestimulantes es CpG. Los
términos "CpG" y "dinucleótido de CpG" se refieren al
dinucleótido
5'-desoxicitidina-desoxiguanosina-3',
en el que p es una unión internucleotídica, seleccionada
preferentemente de entre el grupo constituido por fosfodiéster,
fosforotioato, y fosforoditioato.
Para los fines de la invención, un "análogo
dinucleotídico" es un dinucleótido inmunoestimulante como se
describe anteriormente, en el que cualquiera o ambos nucleósidos de
pirimidina y de purina es un nucleósido no natural. Un nucleósido
"no natural" es el que incluye una base de origen no natural,
y/o una fracción de azúcar de origen no natural. Para los fines de
la invención, una base se considera no natural si no se selecciona
de entre el grupo constituido timina, guanina, citosina, adenina y
uracilo. Los términos "C*pG" y "CpG*" se refieren a
análogos dinucleotídicos inmunoestimulantes que comprenden,
respectivamente, un análogo de citidina (nucleósido de pirimidina
no natural) o un análogo de guanosina (nucleósido de purina no
natural).
La Figura 27 muestra la estructura química de un
motivo de CpG, que muestra los grupos funcionales en la citosina
que sirven como grupos aceptores de enlaces de hidrógeno y dadores
de enlaces de hidrógeno. La citosina tiene dos grupos aceptores de
enlaces de hidrógeno en las posiciones 2 (oxígeno del grupo ceto) y
3 (nitrógeno), y un grupo dador de enlaces de hidrógeno en la
posición 4 (grupo amino). Estos grupos pueden servir como grupos
potenciales de reconocimiento y de interacción con receptores que
son responsables de la estimulación inmunitaria. La Figura 28
muestra análogos de citosina que son isoestructurales con la
citosina natural, incluyendo
5-metil-desoxicitosina (2),
5-metil-desoxiisocitosina (3),
5-hidroxi-desoxicitosina (4),
dexosiuridina (5),
N4-etil-desoxicitosina (6) y
desoxi-base P (7).
El dinucleótido inmunoestimulante presente en el
compuesto oligonucleotídico inmunoestimulante de la invención
comprende un nucleósido de pirimidina de estructura (I):
en la que D es un dador de enlaces
de hidrógeno, D' se selecciona de entre el grupo constituido por
hidrógeno, un dador de enlaces de hidrógeno, un aceptor de enlaces
de hidrógeno, un grupo hidrófilo, un grupo hidrófobo, un grupo
extractor de electrones y un grupo dador de electrones, A es un
aceptor de enlaces de hidrógeno o un grupo hidrófilo, X es carbono
o nitrógeno, y S es un anillo de azúcar de pentosa o de hexosa unido
a la base de pirimidina, en la
que
la fracción de la base en (I) es una base
de pirimidina de origen no natural seleccionada de entre el grupo
constituido por 5-hidroxicitosina,
5-hidroximetilcitosina,
N4-alquilcitosina, preferentemente
N4-etilcitosina, y 4-tiouracilo, o
en la que la fracción de azúcar S en (I) es arabinosa como
fracción de azúcar de origen no natural. Para los fines de la
presente invención, una "fracción de azúcar de origen natural"
es ribosa o 2'-desoxirribosa, y una "fracción de
azúcar de origen no natural" es cualquier azúcar distinto de
ribosa o 2'-desoxirribosa, que se puede usar en la
cadena principal para un oligonucleótido. La arabinosa y derivados
de arabinosa son ejemplos de fracciones de azúcar de origen no
natural preferidos.
Los inventores han descubierto que los
compuestos que tienen dos unidades oligonucleotídicas unidas por
medio de una unión 3'-5' o 3'-3'
tienen una mayor actividad inmunoestimulante que los compuestos en
los que las dos unidades oligonucleotídicas están unidas por medio
de una unión 5'-5'. Por lo tanto, en algunas formas
de realización preferidas, el oligonucleótido inmunoestimulante
según la invención comprende una unión 3'-3'. En
algunas de dichas formas de realización, los oligonucleótidos tienen
uno o dos extremos 5' accesibles.
Los compuestos oligonucleotídicos
inmunoestimulantes de la invención son útiles para generar una
respuesta inmunitaria en un paciente.
Según este aspecto de la invención,
preferentemente, la administración de compuestos se realiza de forma
parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal,
intratraqueal, intravaginal, o intrarrectal. La administración de
las composiciones terapéuticas se puede llevar a cabo usando
procedimientos conocidos, a dosis y durante períodos de tiempo
eficaces para reducir los síntomas o sustituir marcadores de la
enfermedad. Cuando se administra sistémicamente, la composición
terapéutica se administra preferentemente a una dosis suficiente
para lograr un nivel sanguíneo de oligonucleótido desde alrededor
de 0,001 micromolar hasta alrededor de 10 micromolar. Para la
administración localizada, pueden ser eficaces concentraciones mucho
más bajas que éstas, y se pueden tolerar concentraciones mucho
mayores. Preferentemente, una dosis total de oligonucleótido
oscilará desde alrededor de 0,1 mg de oligonucleótido por paciente
por día hasta alrededor de 40 mg de oligonucleótido por kg de peso
corporal por día. Puede ser deseable administrar simultánea o
secuencialmente a un individuo una cantidad terapéuticamente eficaz
de una o más de las composiciones terapéuticas como un episodio de
tratamiento único. En algunos casos, las dosis por debajo de los
intervalos definidos anteriormente aún pueden proporcionar
eficacia. En una forma de realización preferida, después de que se
administra la composición en cuestión, se toma una o más medidas de
efectos biológicos seleccionados de entre el grupo constituido por
activación del complemento, mitogénesis e inhibición de formación
de coágulo de
trombina.
trombina.
En ciertas formas de realización preferidas, los
compuestos según la invención se administran en combinación con
antibióticos, antígenos, alérgenos, vacunas, anticuerpos, agentes
citotóxicos, oligonucleótidos antisentido, vectores de terapia
génica, vacunas de ADN y/o adyuvantes para potenciar la
especificidad o magnitud de la respuesta inmunitaria. Tanto el
compuesto o la vacuna, o ambos, se pueden unir opcionalmente a una
proteína inmunógena, tal como hemocianina de lapa californiana, la
subunidad B de la toxina del cólera, o cualquier proteína portadora
inmunógena. Se puede usar cualquiera de un conjunto amplio de
adyuvantes, incluyendo, sin limitación, adyuvante completo de
Freund, monofosforil lípido A (MPL), saponinas, incluyendo
QS-21, alumbre, y sus combinaciones. Ciertas formas
de realización preferidas inducen citoquinas mediante administración
de compuestos oligonucleotídicos inmunoestimulantes. En ciertas
formas de realización, los compuestos oligonucleotídicos
inmunoestimulantes se conjugan con un antígeno, hapteno o vacuna.
Como se ha explicado anteriormente, los inventores han descubierto
que un extremo 5' accesible es importante para la actividad de
ciertos compuestos oligonucleotídicos inmunoestimulantes. En
consecuencia, para una actividad inmunoestimulante óptima, el
oligonucleótido se conjuga preferentemente con un antígeno o vacuna
por medio del extremo 3' del compuesto oligonucleotídico.
Para los fines de este aspecto, "en
combinación con" significa durante el transcurso del tratamiento
de la misma enfermedad en el mismo paciente, e incluye administrar
el oligonucleotídico y/o la vacuna y/o el adyuvante en cualquier
orden, incluyendo la administración simultánea, así como el orden
temporalmente espaciado de hasta varios días de separación. Dicho
tratamiento de combinación puede incluir también más de una única
administración del oligonucleótido, y/o independientemente la
vacuna, y/o independientemente el adyuvante. La administración del
oligonucleótido y/o vacuna y/o adyuvante se puede realizar mediante
la misma vía, o por diferentes vías.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar
adicionalmente ciertas formas de realización preferidas de la
invención, y no pretenden limitar el alcance de la invención. Los
ejemplos que no están cubiertos por el material objeto de las
reivindicaciones se proporcionan únicamente con fines
comparativos.
Los oligonucleótidos se sintetizaron en una
escala de 1 micromolar usando un sintetizador automatizado de ADN
(Expedite 8909, PerSeptive Biosystems, Foster City, CA). Los
fosforamiditos de desoxinucleósidos estándar se obtienen de
PerSeptive Biosystems. El fosforamidito de
1',2'-didesoxirribosa, el
propil-1-fosforamidito, el
fosforamidito de
2'-desoxi-5-nitroindol-ribofuranosilo,
el fosforamidito de
2'-desoxi-uridina, el fosforamidito
de 2'-desoxi-P, el fosforamidito de
2'-desoxi-2-aminopurina,
el fosforamidito de
2'-desoxi-nebularina, el
fosforamidito de
2'-desoxi-7-desazaguanosina,
el fosforamidito de
2'-desoxi-4-tiouridina,
el fosforamidito de
2'-desoxi-isoguanosina, el
fosforamidito de
2'-desoxi-5-metilisocitosina,
el fosforamidito de
2'-desoxi-4-tiotimidina,
el fosforamidito de 2'-desoxi-K, el
fosforamidito de
2'-desoxi-2-aminoadenosina,
el fosforamidito de
2'-desoxi-N4-etil-citosina,
el fosforamidito de
2'-desoxi-6-tioguanosina,
el fosforamidito de
2'-desoxi-7-desaza-xantosina,
el fosforamidito de
2'-desoxi-8-bromoguanosina,
el fosforamidito de
2'-desoxi-8-oxoguanosina,
el fosforamidito de
2'-desoxi-5-hidroxicitosina,
el fosforamidito de arabinocitosina y el fosforamidito de
2'-desoxi-5-propincitosina
se obtuvieron de Glen Research (Sterling, VA). El fosforamidito de
2'-desoxi-inosina se obtuvo de
ChemGenes (Ashland, MA).
Para todos los fosforamiditos, se usaron ciclos
de acoplamiento normales o un ciclo de acoplamiento recomendado por
el fabricante del fosforamidito. Como antioxidante para obtener la
modificación de fosforotioato, se usó el reactivo de Beaucage.
Después de la síntesis, los oligonucleótidos se desprotegieron
incubando el oligonucleótido unido a CPG con disolución concentrada
de hidróxido de amonio durante 1,5-2 horas a
temperatura ambiente, e incubando después el sobrenadante de
hidróxido de amonio durante 12 horas a 55 grados C o según
recomienda el fabricante del fosforamidito. La disolución de
hidróxido de amonio se evaporó hasta sequedad en un concentrador
centrífugo de tipo Speed-Vac, y los
5'-DMTr-oligonucleótidos se
purificaron mediante HPLC en una matriz de fase inversa C18 usando
un sistema de disolventes de acetato de amonio 0,1 M y una relación
1:5 de acetato de amonio 0,1 M en acetonitrilo. Después, los
oligonucleótidos se trataron con ácido acético al 80%, para
eliminar el grupo DMTr, se convirtieron en la forma sódica, y se
desalaron mediante diálisis frente a agua doblemente destilada. Los
oligonucleótidos se filtraron a través de filtros de 0,4 \mu, se
liofilizaron y se redisolvieron en agua doblemente destilada. La
caracterización se logró mediante PAGE desnaturalizante y mediante
espectrometría de masas MALDI-TOF.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes oligonucleótidos se sintetizaron
siguiendo los procedimientos esquematizados en el Ejemplo 1:
Los oligonucleótidos se caracterizaron mediante
CGE y espectrometría de masas MALDI-TOF
(espectrómetro de masas MALDI-TOF Brucker Proflex
III con láser de N2 de 337 nm). Los pesos moleculares observados y
calculados (mostrados entre paréntesis) para cada oligonucleótido
son los siguientes: oligonucleótido 1, 5704 (5704,8);
oligonucleótido 2, 5720 (5720,8); oligonucleótido 3, 5681 (5680,7);
oligonucleótido 4, 5733 (5733); oligonucleótido 5, 5694 (5693).
\vskip1.000000\baselineskip
En el estudio se usaron ratones hembra BALB/c
(4-5 semanas, 19-21 g, Charles
River, Wilmington, MA). Los animales se alimentaron con una dieta
comercial y agua a voluntad. A los animales se les inyectaron
intraperitonealmente 5 ó 10 mg/kg de dosis de compuesto
oligonucleotídico inmunoestimulante disuelto en PBS estéril. Un
grupo de ratones recibió PBS solo, para servir como control (PBS).
Para cada compuesto oligonucleotídico inmunoestimulante, se usaron
cuatro animales. Los animales se sacrificaron 72 h después, se
recogieron los bazos y se pesaron.
Como fuente de linfocitos se usaron bazos de
ratones CD-1, BALB/c, C57BL/6 (4-8
semanas). Se prepararon suspensiones de una sola célula picando
suavemente con los extremos congelados de portaobjetos de vidrio.
Las células se cultivaron entonces en medio RPMI completo [medio
RPMI suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) (inactivado
por calor a 56ºC durante 30 min.), 50 \muM de
2-mercaptoetanol, 100 U/ml de penicilina, 100
\mug/ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina].
Las células se colocaron entonces en placas de 96 pocillos, a una
densidad de 10^{6} células/ml, en un volumen final de 100 \mul.
Se añadieron los compuestos oligonucleotídicos inmunoestimulantes o
LPS (lipopolisacárido) al cultivo celular en 10 \mul de tampón de
TE (10 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM de EDTA). Las
células se dejaron entonces cultivar a 37ºC. Después de 44 h, se
añadió 1 \muCi de ^{3}H-uridina (Amersham,
Arlington Heights, IL) al cultivo en 20 \mul de medio RPMI, y las
células se marcaron mediante pulso durante otras 4 h. Las células
se cosecharon mediante un cosechador automático de células
(Skatron, Sterling, VA), y los filtros se contaron mediante un
contador de centelleo. Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado.
Se estudió la actividad inmunoestimulante de los
CpG-PS-oligos 1-5
(Ejemplo 2) usando un ensayo de proliferación de linfocitos de
ratón BALB/c. De forma breve, las células de bazo de ratón se
cultivaron y se incubaron con
CpG-PS-oligos a una concentración de
0,1, 0,3, 1,0 y 3,0 \mug/ml durante 48 horas, y la proliferación
celular se midió mediante la incorporación de
^{3}H-uridina.
La Figura 23 muestra la actividad proliferante
de las células, dependiente de la dosis, de los oligos
1-5 en cultivos de linfocitos de ratón. A una dosis
de 3,0 \mug/ml, el oligo 1, con citidina natural, mostró un
índice de proliferación de 29,5 \pm 2,1. El oligo 2, en el que la
base de citosina de la desoxicitidina del motivo de CpG se
sustituyó por una 5-hidroxicitosina, también mostró
una proliferación linfocítica dependiente de la dosis. Para el
oligo 2 se observó un índice de proliferación de 23,7 \pm 2,9 a
una dosis de 3,0 \mug/ml. El PS-oligo 4, que
contenía N4-etil-citosina en lugar
de la base de citosina en el motivo de CpG, también mostró una
actividad de proliferación celular dependiente de la dosis. El
índice de proliferación de 18,7 \pm 1,6 observado para el oligo
4, a una dosis de 3 \mug/ml, sugiere que la presencia de una
sustitución hidrófoba voluminosa sobre el grupo
4-amino de la citosina en un motivo de CpG impide
ligeramente la actividad inmunoestimulante.
El oligo 3, en el que la
5-hidroxi-desoxicitidina se colocó
en la posición de la desoxiguanosina en lugar de la posición de la
desoxicitidina del motivo de CpG, mostró un índice de proliferación
que fue similar al observado para el control formado por los medios
(Figura 23). De forma similar, el oligo 5 del control, en el que la
desoxiguanosina en el motivo de CpG se sustituyó por
N4-etildesoxicitidina, mostró una proliferación
celular similar a la del control de los medios.
Otros oligos, en los que la base de citosina en
el motivo de CpG se sustituyó por
5-metil-desoxicitosina (2; véase
Figura 28), por
5-metil-desoxiisocitosina (3), por
desoxiuridina (5), o por desoxi-base P (7), no
mostraron, o mostraron de forma insignificante, actividad
proliferante celular en el mismo sistema de ensayo. Estos resultados
sugieren que (i) la actividad proliferante celular se mantiene
cuando la base de citosina del motivo de CpG se sustituye por
5-hidroxicitosina o N4-etilcitosina
(oligos 2 y 4, respectivamente), pero (ii) la sustitución de la
base de guanina por estos análogos de citosina da como resultado una
pérdida de la actividad proliferante celular.
Para confirmar los efectos in vitro de
los CpG-PS-oligos, se inyectaron
intraperitonealmente (ip) los oligos 1, 2 y 4 (del Ejemplo 2) a
ratones BALB/c, a una dosis de 10 mg/kg, y se midió el cambio en el
peso del bazo como un indicador del nivel de actividad
inmunoestimulante de cada PS-oligo. En la Figura 24
se presenta el cambio del peso del bazo como resultado del
tratamiento con CpG-PS-oligos. Los
ratones hembra BALB/c (4-6 semanas,
19-21 g) se dividieron en grupos diferentes, con
cuatro ratones en cada grupo. Los oligonucleótidos se disolvieron
en PBS estéril, y se administraron intraperitonealmente a los
ratones a una dosis de 10 mg/kg. Después de 72 h, los ratones se
sacrificaron, y se recogieron los bazos y se pesaron. Cada círculo
representa el peso del bazo de un ratón individual, y el +
representa el peso medio del bazo para cada grupo.
El oligo 1, que tiene desoxicitidina natural en
el motivo de CpG, mostró un incremento de alrededor de 45% en el
peso del bazo a una dosis de 10 mg/kg, en comparación con el grupo
de control de ratones que recibieron PBS. El oligo 2, que tiene una
5-hidroxicitosina en lugar de la base de citosina en
el motivo de CpG, mostró un incremento de alrededor de 35% en el
peso del bazo, a la misma dosis. El oligo 4, que tiene
N4-etilcitosina en lugar de la base de citosina en
el motivo de CpG, mostró un incremento de alrededor de 34% en el
peso del bazo, a la misma dosis, en comparación con el grupo de
control. Estos datos confirman los resultados observados en los
ensayos de proliferación de linfo-
citos para estos oligos que contienen análogos de citidina modificados en lugar de desoxicitidina en el motivo de CpG.
citos para estos oligos que contienen análogos de citidina modificados en lugar de desoxicitidina en el motivo de CpG.
La presencia de un grupo metilo en la posición 5
de citosina (5-metil-desoxicitosina,
2 (Figura 28)), en un motivo de CpG, suprime completamente los
efectos inmunoestimulantes relacionados con CpG de los
CpG-PS-oligos. Basándose en los
resultados observados en los experimentos in vitro e in
vivo, se han construido relaciones de estructura y actividad
para los PS-oligos que contienen análogos de
citosina.
La sustitución de la base de citosina (1) en el
motivo de CpG por
5-metil-isocitosina (3) dio como
resultado la pérdida completa de la actividad inmunoestimulante,
como es el caso con 5-metilcitosina (2), lo que
podría ser como resultado del intercambio de los grupos ceto y
amino en las posiciones 2 y 4, respectivamente, y/o de la
colocación de un grupo metilo hidrófobo en la posición 5 de
citosina.
El oligo 2, que contiene una sustitución hidroxi
hidrófila en la posición 5 de la citosina en el motivo de CpG,
mostró actividad inmunoestimulante similar a la del oligo 1, que
contiene la base de citosina natural. Esta observación sugiere que
los grupos hidrófilos voluminosos son mejor tolerados que los grupos
hidrófobos en la posición 5 de citosina para la actividad
inmunoestimulante de CpG-PS-oligos.
Quizá el bolsillo de unión para los CpG-oligos en
el receptor tiene naturaleza hidrófila, y no puede acomodar un grupo
hidrófobo en la posición 5 de citosina.
Cuando la base de citosina en el motivo de CpG
se sustituye por uracilo (5 (véase la Figura 28)), en el que están
presentes grupos ceto en ambas posiciones 2 y 4, no se observó
actividad inmunoestimulante, sugiriendo que un grupo amino dador de
enlaces de hidrógeno, en la posición 4 de citosina, es crítico para
la actividad inmunoestimulante. Cuando se coloca un gran grupo
etilo hidrófobo sobre el grupo 4-amino de citosina
en un motivo de CpG, se observó una reducción de la proliferación
linfocítica y una ligera reducción en el incremento del peso del
bazo en ratones, sugiriendo que un grupo etilo voluminoso en esta
posición no interfiere con la unión del
CpG-PS-oligo a los factores del
receptor responsables de la actividad inmunoestimulante. A pesar de
la sustitución etílica, el grupo 4-amino de
N4-etilcitosina (6) puede participar en la formación
del enlace de hidrógeno con un aceptor. La base pirimidínica
modificada dP, en la que el grupo nitrógeno localizado en la
posición 4 está implicado en una formación de estructura anular con
la posición 5, y que no tiene un grupo amino dador de enlaces de
hidrógeno en la posición 4, no tuvo actividad de proliferación
linfocítica de ratón en cultivos, sugiriendo que el grupo
4-amino de citosina en un motivo de CpG es crítico
para la actividad inmunoestimulante.
En conclusión, los resultados presentados aquí
muestran que los grupos funcionales en las posiciones 2, 3 y 4 de
la citosina son importantes para la actividad inmunoestimulante
relacionada con CpG. Una sustitución hidrófoba en la posición 5 de
citosina suprime completamente la actividad inmunoestimulante de un
CpG-oligo, mientras que un grupo hidrófilo en esta
posición se tolera bien. Además, la actividad inmunoestimulante de
los CpG-PS-oligos que contienen
5-hidroxicitosina o N4-etilcitosina
en lugar de citosina en el motivo de CpG se puede modular
significativamente incorporando las modificaciones químicas
apropiadas en la secuencia de flanqueo de 5', sugiriendo que estos
análogos de citosina en un motivo de CpG son reconocidos como parte
de un motivo inmunoestimulante.
Los
CpG-PS-oligos mostrados en la Figura
17 se sintetizaron usando un sintetizador automatizado y el enfoque
del fosforamidito. El Oligo 1 (16-mero) se sintetizó
usando
nucleósido-5'-\beta-cianoetilfosforamiditos.
El Oligo 2, un 32-mero, se sintetizó usando
nucleósido-3'-\beta-cianoetilfosforamiditos
y un soporte de vidrio de poro controlado (soporte sólido de CPG)
con un nucleósido unido en 3', en el que la secuencia del
16-mero del Oligo 1 se repitió dos veces; por lo
tanto, el Oligo 2 tuvo dos 16-meros (oligo 1) unidos
mediante una unión 3'-5' normal. El Oligo 3, un
32-mero, se sintetizó con dos
16-meros (oligo 1) unidos mediante una unión
5'-5', de forma que el Oligo 3 tuvo dos extremos 3'
y ningún extremo 5'. La síntesis del Oligo 3 se llevó a cabo en dos
etapas: el primer 16-mero se sintetizó usando
nucleósido-3'-\beta-cianoetilfosforamiditos
y un soporte sólido con un nucleósido unido en 3', y después se
continuó la síntesis del segundo segmento de
16-mero usando
nucleósido-5'-\beta-cianoetilfosforamiditos.
El Oligo 4, un 32-mero, comprendía dos
16-meros (oligo 1) unidos mediante una unión
3'-3', de forma que el Oligo 4 tuvo dos extremos 5'
y ningún extremo 3'. La síntesis del Oligo 4 se llevó a cabo en dos
etapas: el primer 16-mero se sintetizó usando
nucleósido-5'-\beta-cianoetilfosforamiditos
y un soporte sólido con un nucleósido unido en 5', y la síntesis
del segundo segmento de 16-mero se continuó usando
nucleósido-3'-\beta-cianoetilfosforamiditos.
La síntesis de los Oligos 5-8 se llevó a cabo usando
los mismos
nucleósido-\beta-cianoetilfosforamiditos
que en el caso de los Oligos 1-4, respectivamente.
Al final de la síntesis, los Oligos 1-8 se
desprotegieron con disolución de amoníaco concentrada, se
purificaron mediante HPLC de fase inversa, se destritilaron, se
desalaron y se dializaron. La pureza de cada
PS-oligo se comprobó mediante CGE, y el peso
molecular se confirmó mediante análisis espectral de masas
MALDI-TOF. La integridad de la secuencia y la
direccionalidad del motivo 5'-CpG, en los Oligos
1-8, se confirmó registrando las temperaturas de
fusión (T_{m}) de los dúplex con sus hebras complementarias de ADN
respectivas (5'-AAGGTCGAGCGTTCTC-3'
para los Oligos 1-4, y
5'-ATGGCGCACGCTGGGAGA-3' para los
Oligos 5-8). Las T_{m} de estos dúplex fueron 53,9
\pm 0,9ºC (oligos 1-4), 61,8ºC (oligo 5), y 58,8
\pm 0,6ºC (oligos 6-8) (nótese que el Oligo 5 fue
un 18-mero, y que los Oligos 6-8
fueron 32-meros, pero no
36-meros).
La actividad inmunoestimulante de los
CpG-PS-oligos bloqueados en los
extremos del Ejemplo 8 se estudió inicialmente en un ensayo de
proliferación de linfocitos. Típicamente, se cultivaron linfocitos
de bazo de ratón (Balb-C) con
CpG-PS-oligos a concentraciones de
0,1, 1,0 y 10,0 \mug/ml durante 48 h, y la proliferación celular
se determinó mediante incorporación de
^{3}H-uridina, como se describe en el Ejemplo 3.
Los resultados se muestran en la Figura 17.
El Oligo 1 indujo un efecto dependiente de la
dosis sobre la proliferación celular; a una concentración de 10
\mug/ml (\sim2,0 \muM), el índice de proliferación fue 5,0
\pm 0,32. El Oligo 2, que consistía en dos unidades del Oligo 1
unidas mediante una unión 3'-5', tuvo un índice de
proliferación de 5,8 \pm 0,28 a la misma dosis (\sim1,0
\muM). El Oligo 3, que consistía en dos unidades de Oligo 1 unidas
mediante una unión 5'-5', tuvo un índice de
proliferación de 2,0 \pm 0,26, reflejando una actividad
inmunoestimulante significativamente menor que la observada con los
Oligos 1 y 2. El Oligo 4, que consistía en dos unidades del Oligo 1
unidas mediante una unión 3'-3', tuvo un índice de
proliferación de 7,2 \pm 0,5, reflejando una actividad
inmunoestimulante mayor que la observada con los Oligos 1 y 2.
Se obtuvieron resultados similares con los
Oligos 5-8. El Oligo 5 tuvo un índice de
proliferación de 3,9 \pm 0,12. Los Oligos 6-8, en
los que dos unidades del Oligo 5 están unidas mediante una unión
3'-5' (Oligo 6), una unión 5'-5'
(Oligo 7), y una unión 3'-3' (Oligo 8), tuvieron
índices de proliferación de 4,9 \pm 0,2, 1,74 \pm 0,21, y 7,7
\pm 0,82, respectivamente. La comparación de los resultados
obtenidos con los Oligos 6-8 muestra que los Oligos
6 y 8, en los que dos secuencias del Oligo 5 están unidas mediante
una unión 3'-5' o una unión 3'-3',
tuvieron una mayor actividad inmunoestimulante, mientras que el
Oligo 7, en el que dos Oligo 5 estaban unidos mediante una unión
5'-5', tuvieron una actividad inmunoestimulante
significativamente menor que la que tuvo el Oligo 5.
Basándose en los resultados de la proliferación
de linfocitos de los Oligos 1-8, está claro que
cuando los oligos se unen a través de sus extremos 5', hay una
pérdida significativa de actividad inmunoestimulante, mientras que
si se unen a través de sus extremos 3' hay un aumento de la
actividad inmunoestimulante. Es importante observar que los oligos
unidos mediante 3'-3' han mostrado una estabilidad
sustancialmente mayor con respecto a la degradación mediante
exonucleasas que los oligos que contenían un extremo 3' libre, lo
que también podría dar como resultado un aumento de la actividad
inmunoestimulante. La menor actividad inmunoestimulante de los
Oligos 3 y 7, en los que el extremo 5' de los oligos está bloqueado,
sugiere que la accesibilidad al extremo 5' del oligo es esencial
para la actividad inmunoestimulante de los
CpG-PS-oligos.
Para confirmar la actividad inmunoestimulante de
los Oligos 1-8 (Ejemplo 8) in vivo, se
inyectó intraperitonealmente una dosis de 5 mg/kg de
oligonucleótidos a ratones Balb-C. Los ratones se
sacrificaron 72 horas después de la administración, los bazos se
retiraron, se secaron y se pesaron. El cambio en el peso del bazo,
en ratones tratados y no tratados, se usó como un parámetro para la
determinación de la actividad inmunoestimulante.
La administración de una dosis de 5 mg/kg de
Oligo 1 provocó un incremento de alrededor de 40% en el peso del
bazo, en comparación con los ratones del control que recibieron PBS.
La administración de los Oligos 2 y 4 también provocó un incremento
de alrededor de 50% en el peso del bazo. La administración del Oligo
3 no provocó diferencia en el peso del bazo, en comparación con los
ratones del control. Estos resultados apoyan adicionalmente la
observación de que el Oligo 3, en el que el extremo 5' estaba
bloqueado, tuvo una actividad inmunoestimulante significativamente
menor en comparación con los oligos que tuvieron el extremo 5'
accesible. Estos resultados también se confirmaron con la
administración de los Oligos 5-8. La administración
de los Oligos 5, 6 y 8 provocó un incremento de alrededor de
40-50% en el peso del bazo, mientras que no se
observó ningún cambio en el peso del bazo tras la administración
del Oligo 7.
Los resultados anteriores sugieren que la
actividad inmunoestimulante de los PS-oligos que
contienen un motivo de CpG se minimiza significativamente si el
extremo 5' del oligo no está accesible. Esta pérdida de la actividad
inmunoestimulante de los Oligos 3 y 7 no se puede explicar
basándose en la estabilidad frente a las nucleasas, ya que ambos
oligos tienen dos extremos 3' y no son más susceptibles a la
degradación mediante 3'-exonucleasa que los Oligos
1, 2, 5 y 6, que tienen un extremo 3'. Los PS-Oligos
4 y 8, que tienen sus extremos 3' bloqueados y son muy estables a
la degradación mediante exonucleasas, mostraron una actividad
inmunoestimulante similar. Los Oligos 4 y 8 pueden mostrar
actividad inmunoestimulante sostenida debido a su mayor estabilidad
in vivo, lo cual no es evidente en el presente estudio, ya
que los ratones se sacrificaron sólo 72 horas después de la
administración. Se siguen realizando estudios en los que los ratones
se sacrificarán a tiempos posteriores a las 72 horas después de la
administración.
Los resultados descritos aquí son intrigantes, y
sugieren que el extremo 5' de los
CpG-PS-oligos es crítico para la
actividad inmunoestimulante. Como se ha explicado aquí, se ha
mostrado que la sustitución de desoxinucleósidos en las regiones de
flanqueo 5' por ribonucleósidos modificados, sustituidos en 2' o en
3', da como resultado un aumento de la actividad inmunoestimulante.
Además, la sustitución de desoxinucleósidos inmediatamente corriente
arriba (extremo 5') del motivo de CpG provocó una supresión
significativa, y la sustitución de desoxinucleósidos inmediatamente
corriente abajo (extremo 3') del motivo de CpG no tuvo ningún efecto
sobre la actividad inmunoestimulante. Tomados en conjunto, estos
resultados sugieren que la enzima/receptor responsable de la
inmunoestimulación reconoce el motivo de CpG en oligos desde el
extremo 5', y requiere una accesibilidad al extremo 5'.
Aunque la invención anterior se ha descrito con
cierto detalle con fines de claridad y comprensión, el experto en
la materia apreciará, a partir de la lectura de esta descripción,
que se pueden realizar diversos cambios en la forma y en detalle
sin apartarse por ello del verdadero alcance de la invención ni de
las reivindicaciones adjuntas.
<110> Kandimalla, Ekambar R.
\hskip1cm Zhao, Qiuyan
\hskip1cm Yu, Dong
\hskip1cm Agrawal, Sudhir
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Modulación de la actividad
inmunoestimulante de análogos de fosforotioatos de
oligodesoxinucleótidos modificados inmunoestimulantes mediante
cambios químicos posicionales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> HYZ-479CP
(47508.577)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> US 09/965.116
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
26-09-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 09/712.898
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
15-11-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/235.452
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
26-09-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/235.453
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
26-09-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 112
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> síntesis de
CpG-PS-oligos que contienen análogos
de citosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> síntesis de
CpG-PS-oligos que contienen análogos
de citosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
5-hidroxidesoxicitidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> síntesis de
CpG-PS-oligos que contienen análogos
de citosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
5-hidroxidesoxicitidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacc ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> síntesis de
CpG-PS-oligos que contienen análogos
de citosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
N4-etildesoxicitidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> síntesis de
CpG-PS-oligos que contienen análogos
de citosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
N4-etildesoxicitidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacc ttctctgt
\hfill18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> síntesis de fosforotioato de
CpG-oligodesoxinucleótido modificado con PS,
bloqueado en los extremos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggtcgagc gttctc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> síntesis de fosforotioato de
CpG-oligodesoxinucleótido modificado con PS,
bloqueado en los extremos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggcgcacg ctgggaga
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<223> g =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<223> g =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
1',2'-Didesoxirribosa
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcc ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4,5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ac =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1, 2
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cc =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 14, 15
\vskip0.400000\baselineskip
<223> tc =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4, 7
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a en la posición 4 =
1',2'-Didesoxirribosa, a en la posición 7 =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<223> g = ligador de C3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a = ligador de C3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c = ligador de C3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4, 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a en la posición 4 = ligador de C3,
c en la posición 5 = ligador de C3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1, 2
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cc en las posiciones 1 y 2 = ligador
de C3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t = ligador de C3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t = ligador de C3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 14, 15
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t en la posición 14 = ligado de C3,
c en la posición 15 = ligador de C3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a = ligador de C3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t = ligador de C3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t = ligador de C3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t = espaciador 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t = espaciador 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t = espaciador 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t = espaciador 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a = espaciador 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t = espaciador 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a = espaciador 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t = espaciador 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a = ligador amínico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<223> g = ligador amínico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t = ligador amínico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t = ligador amínico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t = ligador amínico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<223> g =
3'-Desoxinucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
3'-Desoxinucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
3'-Desoxinucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
3'-Desoxinucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<223> g =
3'-Desoxinucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
3'-Desoxinucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<223> g =
3'-Desoxinucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
3'-Desoxinucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
3'-Desoxinucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a =
Metil-fosfonato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<223> g =
Metil-fosfonato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t =
Metil-fosfonato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
Metil-fosfonato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t =
Metil-fosfonato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3, 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a en la posición 3 =
Metil-fosfonato, t en la posición 4 =
Metil-fosfonato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t =
Metil-fosfonato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t =
Metil-fosfonato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
Metil-fosfonato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t =
Metil-fosfonato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
Metil-fosfonato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15, 16
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c en la posición 15 =
Metil-fosfonato, t en la posición 16 =
Metil-fosfonato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgacgt tcctgatgc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a =
2'-O-Metilribonucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgacgt tcctgatgc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t =
2'-O-Metilribonucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgacgt tcctgatgc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2, 3
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c en las posiciones 2 y 3 =
2'-O-Metoxietilribonucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgacgg tcctgatgc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaacgctc gacctt
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión 3'-5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaacgctc gaccttgaga acgctcgacc tt
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión 5'-5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttccagctcg caagaggaga acgctcgacc tt
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión 3'-3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaacgctc gaccttttcc agctcgcaag ag
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctcccagcg tgcgccat
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión 3'-5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcccagcgtg cgccattccc agcgtgcgcc at
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión 5'-5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaccgcgtgc gacccttccc agcgtgcgcc at
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión 3'-3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcccagcgtg cgccattacc gcgtgcgacc ct
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
beta-L-Desoxinucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t =
beta-L-Desoxinucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4, 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t en la posición 4 =
beta-L-Desoxinucleósido, c en la
posición 5 =
beta-L-Desoxinucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 14, 15
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t en la posición 14 =
beta-L-Desoxinucleósido, c en la
posición 15 =
beta-L-Desoxinucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 9, 10
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c en la posición 9 =
beta-L-Desoxinucleósido, g en la
posición 10 =
beta-L-Desoxinucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<223> g =
beta-L-Desoxinucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t =
beta-L-Desoxinucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> todos los nucleótidos =
beta-L-desoxinucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
2'-O-Propargil-ribonucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
2'-O-Propargil-ribonucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4, 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a en la posición 4 =
1',2'-Didesoxirribosa, c en la posición 5 =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4, 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a en la posición 4 = ligador de C3,
c en la posición 5 = ligador de C3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4, 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a en la posición 4 =
3'-metoxirribonucleósido, c en la posición 5 =
3'-metoxirribonucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4, 5, 12
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a en la posición 4 =
1',2'-Didesoxirribosa
\hskip1cm c en la posición 5 =
1',2'-Didesoxirribosa
\hskip1cm t en la posición 12 =
2'-metoxirribonucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactagcg ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión modificada de fosforotioato de
oligodesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactaggc ttctcatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<223> g =
7-desazaguanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<223> g =
7-desazaguanina
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgagc ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctcccagcg tgcgccat
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 10,14
\vskip0.400000\baselineskip
<223> g en las posiciones 10 y 14 =
7-desazaguanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctcccagcg tgcgccat
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c = ligador de C3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<223> g =
7-deazaguanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<223> g = 6-tioguanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<223> g = 6-tioguanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgagc ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c = 4-tiouridina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
1,2-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c = 4-tiouridina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c = Ara-C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c = Ara-C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctactctgac cttctctgt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t =
1',2'-Didesoxirribosa
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fosforotioato de
oligodesoxinucleótido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<223> c =
1',2'-Didesoxirribosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatctgacg ttctctgt
\hfill18
Claims (15)
1. Compuesto oligonucleotídico
inmunoestimulante, que comprende un dinucleótido inmunoestimulante
de fórmula C*pG,
en la que C* es un análogo de citidina de la
fórmula (I):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que D es un dador de enlaces
de hidrógeno, D' se selecciona de entre el grupo constituido por
hidrógeno, un dador de enlaces de hidrógeno, un aceptor de enlaces
de hidrógeno, un grupo hidrófilo, un grupo hidrófobo, un grupo
extractor de electrones y un grupo dador de electrones, A es un
aceptor de enlaces de hidrógeno o un grupo hidrófilo, X es carbono
o nitrógeno, y S es un anillo de azúcar de pentosa o de
hexosa,
incluyendo el análogo de citidina de la fórmula
(I) una base de citosina de origen no natural seleccionada de entre
el grupo constituido por 5-hidroxicitosina,
5-hidroximetilcitosina,
N4-alquilcitosina, y 4-tiouracilo,
o comprendiendo arabinosa como una fracción de azúcar de origen no
natural,
y en la que G es guanosina,
2'-desoxiguanosina, o un análogo de guanosina, y p
es una unión internucleotídica seleccionada de entre el grupo
constituido por fosfodiéster, fosforotioato, y fosforoditioato.
2. Compuesto oligonucleotídico inmunoestimulante
según la reivindicación 1, en el que la base de citosina de origen
no natural se selecciona de entre el grupo constituido por
5-hidroxicitosina y
N4-etilcitosina.
3. Compuesto oligonucleotídico inmunoestimulante
según la reivindicación 1, en el que el análogo de citidina es
aracitosina.
4. Compuesto oligonucleotídico inmunoestimulante
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una
unión 3'-3'.
5. Uso de un compuesto oligonucleotídico
inmunoestimulante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
para la preparación de una composición farmacéutica destinada a
generar una respuesta inmunitaria en un pa-
ciente.
ciente.
6. Uso según la reivindicación 5, en el que la
composición farmacéutica está destinada a administrar el compuesto
oligonucleotídico inmunoestimulante en combinación con un
antibiótico, antígeno, alérgeno, vacuna, anticuerpo, agente
citotóxico, oligonucleótido antisentido, vector de terapia génica,
vacuna de ADN, adyuvante, o una combinación de los mismos.
7. Uso según la reivindicación 5, en el que el
compuesto oligonucleotídico inmunoestimulante se conjuga con un
antígeno o vacuna.
8. Uso según la reivindicación 7, en el que
dicha conjugación se realiza con el extremo 3' del compuesto
oligonucleotídico.
9. Uso de un compuesto oligonucleotídico
inmunoestimulante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
para la preparación de una composición farmacéutica destinada a
tratar terapéuticamente un paciente que padece una enfermedad
provocada por un patógeno.
10. Uso según la reivindicación 9, en el que el
patógeno es un virus, un parásito o una bacteria.
11. Uso de un compuesto oligonucleotídico
inmunoestimulante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
para la preparación de una composición farmacéutica destinada a
tratar un paciente con cáncer.
12. Uso según la reivindicación 11, en el que la
composición farmacéutica está destinada administrar el compuesto
oligonucleotídico inmunoestimulante en combinación con un compuesto
quimioterapéutico.
13. Uso de un compuesto oligonucleotídico
inmunoestimulante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
para la preparación de una composición farmacéutica destinada a
tratar un trastorno autoinmunitario.
14. Uso según la reivindicación 13, en el que el
trastorno autoinmunitario es asma autoinmunitaria.
15. Uso de un compuesto oligonucleotídico
inmunoestimulante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
para la preparación de una composición farmacéutica destinada a
tratar la inflamación de las vías respiratorias o alergia.
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