TW201620927A - Ｕｓｐａ２蛋白質構築體及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於包含卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis/M.catarrhalis)普遍存在的表面蛋白A2(UspA2)之組合物。更特定言之，本申請案係關於UspA2蛋白質構築體及包含該等構築體之免疫原性組合物、包含該等免疫原性組合物之疫苗及其治療用途。本發明進一步係關於包含UspA2與至少一種來自流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)之抗原組合之組合物、包含該等抗原之免疫原性組合物、包含該等免疫原性組合物之疫苗及其治療用途。
Description
本發明係關於包含卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis，M.catarrhalis，M.cat.)普遍存在的表面蛋白A2(UspA2)之組合物。更特定言之，本申請案係關於UspA2蛋白質構築體及包含該等構築體之免疫原性組合物、包含該等免疫原性組合物之疫苗及其治療用途。
普遍存在的表面蛋白A2(UspA2)為一種在電子顯微圖中呈現為棒棒糖共用結構之三聚自轉運體(Hoiczyk等人EMBO J.19：5989-5999(2000))。其包含N末端頭部，接著為以兩親性螺旋結束之莖稈及C末端膜域。(Hoiczyk等人EMBO J.19：5989-5999(2000))。UspA2含有極佳保守域(Aebi等人，Infection & Immunity 65(11)4367-4377(1997))，其藉由在小鼠卡他莫拉菌攻毒模型中之被動轉移時顯示保護性之單株抗體識別(Helminnen等人J Infect Dis.170(4)：867-72(1994))。
已顯示UspA2與宿主結構及細胞外基質蛋白，如纖維結合蛋白(Tan等人，J Infect Dis.192(6)：1029-38(2005))及層黏連蛋白(Tan等人，J Infect Dis.194(4)：493-7(2006))相互作用，表明其可在卡他莫拉菌感染初期起作用。
UspA2亦似乎涉及卡他莫拉菌抵抗正常人類血清之殺菌活性之能力。(Attia AS等人Infect Immun 73(4)：2400-2410(2005))。其(i)結合
補體抑制劑C4bp，使得卡他莫拉菌能夠抑制經典補體系統，(ii)藉由吸收來自血清之C3阻止替代補體路徑之活化及(iii)藉由結合補體調節蛋白玻璃連結蛋白干擾補體系統之終末期攻膜複合物(MAC)。(de Vries等人，Microbiol Mol Biol Rev.73(3)：389-406(2009))。
卡他莫拉菌為與成人之慢性阻塞性肺病(COPD)之惡化之增加的風險相關之重要及常見呼吸道病原體。(Sateesh等人，Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease 3：109-115(2006))。
需要用於卡他莫拉菌之疫苗。
作為第一態樣，本發明提供式(I)之蛋白質。
A-(R1)m-(B)n (式I)
其中：A為來自卡他莫拉菌之UspA2或其免疫原性片段；R1為胺基酸；m為0、1或2；B為組胺酸；及n為0、1、2、3、4、5或6。
作為第二態樣，本發明提供包含式(I)之蛋白質及本發明蛋白質之免疫原性組合物。該組合物可進一步包含醫藥學上可接受之佐劑。該組合物可包含賦形劑。
在第三態樣中，本發明提供一種治療或預防完全或部分由卡他莫拉菌引起的病狀或疾病之方法。該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之式(I)之蛋白質或本發明蛋白質。
在第四態樣中，本發明提供一種治療或預防中耳炎之方法。該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之式(I)之蛋白質或本發明蛋白質。
在第五態樣中，本發明提供一種治療或預防慢性阻塞性肺病之惡化之方法。該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之式(I)之蛋白質或本發明蛋白質。
在第六態樣中，本發明提供一種治療或預防肺炎之方法。該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之式(I)之蛋白質或本發明蛋白質。
在第七態樣中，本發明提供一種包含式(I)之蛋白質或本發明蛋白質之醫藥組合物，其用於治療或預防完全或部分由卡他莫拉菌引起之病狀或疾病。醫藥組合物可進一步包含醫藥學上可接受之佐劑。
在第八態樣中，本發明提供編碼本發明蛋白質之核酸。
在第九態樣中，本發明提供一種產生本發明之核酸之方法。
在第十態樣中，本發明提供一種包含至少一種來自卡他莫拉菌之抗原及至少一種來自流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)之抗原之組合物。該組合物可進一步包含醫藥學上可接受之佐劑。該組合物可包含賦形劑。
在另一態樣中，本發明提供一種治療或預防完全或部分由卡他莫拉菌和/或流感嗜血桿菌引起之病狀或疾病之方法。該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之式(I)之蛋白質或本發明蛋白質。
在另一態樣中，本發明提供一種治療或預防慢性阻塞性肺病之惡化之方法。該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之式(I)之蛋白質或本發明蛋白質及治療有效量之至少一種來自流感嗜血桿菌之抗原。
本發明亦提供一種包含式(I)之蛋白質或本發明蛋白質之醫藥組合物，其用於治療或預防完全或部分由卡他莫拉菌以及至少一種來自流感嗜血桿菌之抗原引起之病狀或疾病。醫藥組合物可進一步包含醫藥學上可接受之佐劑。
本發明之其他態樣描述於下文特定實施例、實例及請求項之詳細描述中。
圖1：在高細胞密度誘導(HCDI)方法之情況下之典型醱酵概況及在20L規模補料分批醱酵期間監測之參數。
圖2：在低細胞密度誘導(LCDI)方法之情況下之典型醱酵概況及在20L規模補料分批醱酵期間監測之參數。
圖3：在醱酵槽中評估的來自蛋白質構築體MC-001、MC-002、MC-004、MC-005、MC-006、MC-007、MC-008及MC-010之UspA2產量；資料來自表4。
圖4：藉由沈降速度分析型超速離心法測定之純化MC-005之分子量分佈。發現大多數蛋白質呈三聚體形式，以及較小比例的可對應於三聚體之二聚體之較高分子量寡聚物。MW=分子量。kDa=千道爾頓。
圖5：藉由沈降速度分析型超速離心法測定之純化MC-001之分子量分佈。發現大多數蛋白質呈三聚體形式。
圖6：藉由沈降速度分析型超速離心法測定之純化MC-001之分子量分佈。樣品呈現多種物質且為高度多分散的。偵測之主要物質之沈降係數不對應於通常在其他批次中偵測之三聚體中之一者。
圖7：藉由沈降速度分析型超速離心法測定之純化MC-001之分子量分佈。發現大多數蛋白質呈三聚體形式。
圖8：藉由沈降速度分析型超速離心法測定之純化MC-007之分子量分佈。發現大多數蛋白質呈三聚體形式。
圖9：UspA2構築體之遠紫外線圓二色性(CD)光譜出示蛋白質二級結構之指示。
圖10：在MC-005(UspA2△螺旋+6His)之熱去摺疊期間藉由圓二
色性(CD)監測之二級結構。光譜之視覺分析明顯地顯示蛋白質在33℃下失去其大部分二級結構。
圖11：在MC-007(UspA2完全螺旋+6His)之熱去摺疊期間藉由圓二色性(CD)監測之二級結構。光譜之視覺分析顯示二級結構之損失相比於無螺旋之構築體較慢。結構變化在加熱至33℃時可偵測，但完全去摺疊似乎出現在35℃與37℃之間。
圖12：MC-001批次opt-01之MALDI光譜。在57427Da處觀測之質量可與去甲硫胺醯基化蛋白質一致，而57620Da處之峰值可對應於完全蛋白質。
圖13：MC-011批次BMP37之MALDI光譜。觀測之質量可與去甲硫胺醯基化蛋白質一致。+186Da及+366Da處之兩個其他峰為未鑑別的。
圖14：MC-001及MC-007在肺定殖之小鼠模型中之保護功效。
圖15：針對在小鼠中之肌肉內投與之後誘導的UspA2之抗體反應，其中PII及PIII分別指示在第28天(post II)及第42天(post III)收集之血清中之抗-IgG水準。
圖16：相對於以不同佐劑(AS01E、AS04C及AlPO4)調配之同源菌株藉由UspA2誘導之殺菌效價。
圖17：針對使用不同抗原及佐劑調配物，在小鼠中之肌肉內投與之後誘導的UspA2之抗體反應。
圖18：相對於使用不同抗原及佐劑調配物之同源菌株藉由UspA2誘導之殺菌效價。
圖19：藉由用不同佐劑調配之PD-PEPilA-UspA2疫苗(三價NTHi-卡他莫拉菌疫苗)相對於小鼠中之PD誘導之IgG反應。
圖20：藉由用不同佐劑調配之PD-PEPilA-UspA2疫苗(三價NTHi-卡他莫拉菌疫苗)相對於小鼠中之PE誘導之IgG反應。
圖21：藉由用不同佐劑調配之PD-PEPilA-UspA2疫苗(三價NTHi-卡他莫拉菌疫苗)相對於小鼠中之PilA誘導之IgG反應。
圖22：PE在藉由AS01E之二價PD-PEPilA及三價PD-PEPilA-UspA2調配物中之免疫原性。
圖23：PilA在藉由AS01E之二價PD-PEPilA及三價PE-PilA-UspA2調配物中之免疫原性。
圖24：PD在藉由AS01E之二價PD-PEPilA及三價PE-PilA-UspA2調配物中之免疫原性。
圖25：四價PD/PEPilA/UspA2/AS01E疫苗調配物對經熱去活化卡他莫拉菌預敏化之小鼠肺之作用-經PBS免疫小鼠中之血管周炎及細支氣管周炎。
圖26：四價PD/PEPilA/UspA2/AS01E疫苗調配物對經熱去活化卡他莫拉菌預敏化之小鼠肺之作用-免疫接種後第2天。
圖27：四價PD/PEPilA/UspA2/AS01E疫苗調配物對經熱去活化卡他莫拉菌預敏化之小鼠肺之作用-免疫接種後第7天。
圖28：四價PD/PEPilA/UspA2/AS01E疫苗調配物對經熱去活化卡他莫拉菌預敏化之小鼠肺之作用-免疫接種後第14天。
圖29：四價PD/PEPilA/UspA2/AS01E疫苗調配物對經熱去活化卡他莫拉菌預敏化之小鼠肺之作用-詳細結果。
圖30：接種疫苗後之肺CD4 T細胞在卡他莫拉菌WC再刺激時之反應。肺CD4細胞表現IL17。藉由熱去活化卡他莫拉菌全細胞(WC)或培養基再刺激。
圖31：接種疫苗後之肺CD4 T細胞在卡他莫拉菌WC再刺激時之反應。肺CD4細胞表現TNFα。藉由熱去活化卡他莫拉菌全細胞(WC)或培養基再刺激。
圖32：接種疫苗後之肺CD4 T細胞在卡他莫拉菌WC再刺激時之
反應。肺CD4細胞表現IFNγ。藉由熱去活化卡他莫拉菌全細胞(WC)或培養基再刺激。
圖33：接種疫苗後之肺CD4 T細胞在卡他莫拉菌WC再刺激時之反應。肺CD4細胞表現IL13。藉由熱去活化卡他莫拉菌全細胞(WC)或培養基再刺激。
圖34：攻毒後之肺CD4 T細胞在卡他莫拉菌WC再刺激時之反應。肺CD4細胞表現IL17。藉由熱去活化卡他莫拉菌全細胞(WC)或培養基再刺激。
圖35：攻毒後之肺CD4 T細胞在卡他莫拉菌WC再刺激時之反應。肺CD4細胞表現TNFα。藉由熱去活化卡他莫拉菌全細胞(WC)或培養基再刺激。
圖36：攻毒後之肺CD4 T細胞在卡他莫拉菌WC再刺激時之反應。肺CD4細胞表現IFNγ。藉由熱去活化卡他莫拉菌全細胞(WC)或培養基再刺激。
圖37：攻毒後之肺CD4 T細胞在卡他莫拉菌WC再刺激時之反應。肺CD4細胞表現IL13。藉由熱去活化卡他莫拉菌全細胞(WC)或培養基再刺激。
除非在本文中另外解釋或定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。舉例而言，分子生物學中之常用術語之定義可發現於Benjamin Lewin,Genes V,Oxford University Press出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(編)，The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；及Robert A.Meyers(編)，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.出版，1995(ISBN
1-56081-569-8)中。
除非上下文另外明確指示，否則單數術語「一(a/an)」及「該」包括多個指示物。類似地，除非上下文另外明確指示，否則字語「或」意欲包括「及」。應進一步瞭解對核酸或多肽所出示之所有鹼基大小及胺基酸大小、及所有分子量或分子質量值均為近似值，且係出於描述之目的而提供。另外，就物質(諸如抗原)之濃度或含量而言給定之數值限制可為近似的。因此，當濃度指定為(例如)大致200pg，希望濃度包括略微地大於或略微小於(「約(about或~)」)200pg之值。
儘管與本文所述之彼等類似或相等之方法及材料可用於實踐或測試本發明，但下文描述適合方法及材料。
術語「包含」意謂「包括」。因此，除非上下文另外要求，否則「包含(comprises)」一詞及變化形式(諸如「comprise」及「comprising」)應理解為暗示包括所述化合物或組合物(例如核酸、多肽、抗原)或步驟、或化合物或步驟之群，但不排除任何其他化合物、組合物、步驟或其群。縮寫「例如(e.g.)」源自拉丁語例如(exempli gratia)，且在本文中用於指示非限制性實例。因此，縮寫「例如(e.g.)」與術語「舉例而言(for example)」同義。
為了促進檢閱本發明之各種實施例，提供術語之以下解釋。其他術語及解釋提供於本發明之上下文中。
如本文所用之「個體」為哺乳動物，包括人類、非人類靈長類動物及非靈長類哺乳動物，諸如嚙齒動物屬之成員(包括(但不限於)小鼠及大鼠)及兔形目(order Lagomorpha)之成員(包括(但不限於)家兔)。
如本文所用，「UspA2」意謂來自卡他莫拉菌之普遍存在的表面蛋白A2。UspA2可由來自ATCC 25238之胺基酸序列SEQ ID NO：1組成或包含該胺基酸序列。
(SEQ ID NO：1)
以及經整個長度與SEQ ID NO：1具有至少或恰好63%、66%、70%、72%、74%、75%、77%、80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之序列。比較來自卡他莫拉菌屬之UspA2之38個序列(表1，SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：38)表明與如SEQ ID NO.1中闡述之UspA2大致63%至大致100%之一致性。
如SEQ ID NO：1中所述之UspA2含有信號肽(例如SEQ ID NO：1之胺基酸1至29)、層黏連蛋白結合域(例如SEQ ID NO：1之胺基酸30至177)、纖維結合蛋白結合域(例如SEQ ID NO：1之胺基酸165至318)(Tan等人JID 192：1029-38(2005))、C3結合域(例如SEQ ID NO：1之胺基酸30至539(WO2007/018463)或SEQ ID NO：1之胺基酸30至539之片段，例如SEQ ID NO：1之胺基酸165至318(Hallström T等人J.Immunol.186：3120-3129(2011))、兩親性螺旋(例如SEQ ID NO：1之胺基酸519至564或SEQ ID NO：1之胺基酸520-559，使用不同預測方法鑑別)及C末端錨定域(例如SEQ ID NO：1之胺基酸576至630胺基酸(Brooks等人，Infection & Immunity,76(11),5330-5340(2008))。
已對於各種卡他莫拉菌物種描述UspA2胺基酸差異。參見例如J Bacteriology 181(13)：4026-34(1999),Infection and Immunity 76(11)：5330-40(2008)及PLoS One 7(9)：e45452(2012)。
UspA2可由在選自由以下組成之群的任何一或多個胺基酸處不同於SEQ ID NO.1之胺基酸序列組成或包含該胺基酸序列：AA(胺基酸)30至298、AA 299至302、AA 303至333、AA 334至339、AA 349、AA 352至354、AA 368至403、AA 441、AA 451至471、AA 472、AA 474至483、AA 487、AA 490、AA 493、AA 529、AA 532或AA 543。UspA2可由不同於SEQ ID NO：1之處在於相比於SEQ ID NO.1，含有至少一個胺基酸插入之胺基酸序列組成或包含該胺基酸序列。UspA2可由以SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：38中之任一胺基酸差異不同於SEQ ID NO.1之胺基酸序列組成或包含該胺基酸序列。舉例而言，SEQ ID NO.1可在胺基酸70處含有K而非Q，在胺基酸135處含有Q而非G及/或在胺基酸216處含有D而非N。
UspA2可為來自卡他莫拉菌菌株ATCC(美國註冊商標)25238TM、American 2933、American 2912、American 2908、Finnish 307、Finnish 353、Finnish 358、Finnish 216、Dutch H2、Dutch F10、Norwegian 1、Norwegian 13、Norwegian 20、Norwegian 25、Norwegian 27、Norwegian 36、BC5SV、Norwegian 14、Norwegian 3、Finish 414、Japanese Z7476、Belgium Z7530、German Z8063、American O12E、Greek MC317、American V1122、American P44、American V1171、American TTA24、American O35E、American SP12-6、American SP12-5、Swedish BC5、American 7169、Finnish FIN2344、American V1118、American V1145或American V1156之UspA2。UspA2可為如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：38中之任一者中所闡述之UspA2。UspA2可為來自對應於SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：38中之任一者中之UspA2之序列之另一來源的UspA2。對應UspA2序列可由熟習此項技術者使用各種算法測定。舉例而言，Gap程式或
Needle程式可用於測定對應於SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：38中之任一者之UspA2序列。
UspA2可為經整個長度與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：38中之任一者具有至少95%一致性之序列。
UspA2之免疫原性片段包含SEQ ID NO：1之至少450個相鄰胺基酸、SEQ ID NO：1之490個相鄰胺基酸(例如MC-004或MC-005之UspA2片段)、SEQ ID NO：1之511個相鄰胺基酸(例如構築體MC-001、MC-002、MC-003或MC-004之UspA2片段)、SEQ ID NO：1之534個相鄰胺基酸(例如MC-009或MC-011之UspA2片段)或SEQ ID NO：1之535個相鄰胺基酸(例如MC-007、MC-008或MC-010之UspA2片段)之免疫原性片段。免疫原性片段可引出可結合SEQ ID NO：1之抗體。
UspA2之免疫原性片段可包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：38中之任一者之至少450、490、511、534或535個相鄰胺基酸之免疫原性片段。UspA2之免疫原性片段可包含來自SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：38中之任一者之UspA2之免疫原性片段，其對應於UspA2構築體MC-001、MC-002、MC-003、MC-004、MC-005、MC-006、MC-007、MC-008、MC-009、MC-010或MC-011中之任一者中之SEQ ID NO：1之UspA2片段。免疫原性片段可引出可結合衍生該片段之全長序列之抗體。
可藉由各種程式計算多肽之間的比對。舉例而言，可使用來自EMBOSS套裝軟體(免費軟體；EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite(2000).Trends in Genetics 16(6)：276-277)之Needle程式及來自GCG(美國註冊商標)套裝軟體(Accelrys Inc.)之Gap程式。
Gap及Needle程式為Needleman,S.B.及Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453中所述之Needleman-Wunsch算法之實施例。此
等程式經常使用空位開放及擴展罰分分別為8及2之BLOSUM62計分矩陣(Steven Henikoft及Jorja G.Henikoft(1992),「Amino acid substitution matrices from protein blocks」),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(Biochemistry)：10915-10919)。有時，亦使用PAM250計分矩陣(Dayhoft等人，(1978),「A model of evolutionary changes in proteins」,「Atlas of Protein sequence and structure」5(3)M.O.Dayhoft(編)，345-352,National Biomedical Research Foundation,Washington)。
計分矩陣藉由計數各胺基酸突變為另一個或保守性之趨勢來描述。此等數值一般計算自忠實成對或多個比對或甚至多個比對之片段中觀測之突變之統計量。一般而言，在此等表中，若高正數與一對相同胺基酸相關，則其表明此殘基具有較低突變趨勢。相反地，與一對不同胺基酸相關之高正數表明在此二者之間的高突變趨勢。且此稱作「保守取代」。
觀察成對比對，可觀測到在兩個序列之間對準的相同殘基(「一致性」)。可藉由將(1)一致性數目與比對長度之間的商(例如在Needle程式計算輸出中)，或(2)一致性數目與最長序列之長度之間的商，或(3)一致性數目與最短序列之長度之間的商，或(4)一致性數目與對準殘基數目之間的商(例如在Gap程式計算輸出中)乘以100計算一致性百分比。
已根據前述段落之定義(3)，使用藉由Gap軟體計算之成對比對計算表8之一致性百分比。
如本文中所用，「佐劑」意謂當與疫苗、免疫治療劑或其他含抗原或免疫原組合物結合向個體投與時增加或增強個體對所投與抗原或免疫原之免疫反應(相較於沒有佐劑之情況下所得之免疫反應)之化合物或物質。此點與美國國家衛生研究院癌症研究所(National Cancer
Institute of the United States Institutes of Health)在癌症治療中作為初始治療之後為降低癌症復發風險給予額外治療的情況下所定義之「佐劑療法」有區別。
本發明進一步提供含有保守胺基酸取代之式(I)之蛋白質。舉例而言，式(I)之蛋白質可含有來自如本文中闡述之任一序列中所述之卡他莫拉菌之UspA2(例如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.38中闡述之任何UspA2序列)之任何胺基酸之保守取代。
如本文所用，「信號肽」係指存在於前體蛋白質上(典型地處於N末端)之短(小於60個胺基酸，例如3至60個胺基酸)多肽，且其在成熟蛋白質中通常不存在。信號肽(sp)通常富含疏水性胺基酸。信號肽導引轉譯蛋白質貫穿膜之轉運及/或分泌。信號肽亦可稱為靶向信號、轉運肽、定位信號或信號序列。舉例而言，信號序列可為共轉譯或轉譯後信號肽。
異源信號肽可在蛋白質轉運或分泌期間或之後藉由信號肽肽酶自蛋白質構築體裂解。舉例而言，信號肽肽酶為信號肽肽酶I。「異源」信號肽為當其存在於自然界中時與蛋白質不相關之信號肽。
如本文所用，「治療」意謂預防個體之病狀或疾病之症狀之出現、預防個體之病狀或疾病之症狀之復發、延遲個體之病狀或疾病之症狀之復發、減小個體之病狀或疾病之症狀之嚴重程度或頻率、減緩或消除病狀之進展及部分或完全消除個體之疾病或病狀之症狀。
如本文中所用，「視情況」意謂隨後描述之事件可能發生且可能不發生，且包括發生之事件及不發生之事件二者。
中耳炎為80%之所有小於3歲之兒童之發病的主要起因。(Expert Rev.Vaccines 5：517-534(2006))。超過90%之兒童在7歲之前產生中耳炎(Current Opinion in Investigational Drugs 4：953-958(2003))。在2000年，美國有1600萬例由於中耳炎而向門診醫師的就診且大致分配1300
萬個抗菌處方。(Pediatrics 113：1451-1465(2004))。在歐洲國家，報導之急性中耳炎比率範圍在每兒童每年0.125至1.24次之間。(Expert Review of Vaccines 8：1479-1500(2009))。中耳炎為代價高的感染且為兒童接受抗生素之最常見原因。(Current Infectious Disease Reports 11：177-182(2009))。細菌造成大致70%之急性中耳炎病例，其中肺炎鏈球菌、非分型流感嗜血桿菌(NTHi)及卡他莫拉菌作為占主導地位的病原體(Expert Review of Vaccines 5：517-534(2006))。一個子組的兒童經歷復發性及慢性中耳炎且具有與聽覺喪失以及言語及語言發展遲緩相關的持久中耳積液的兒童易於遭受此等耳炎。(Current Infectious Disease Reports 11：177-182(2009))。近來的抗生素壓力及疫苗接種肺炎球菌共軛物疫苗已導致出現產生β-內醯胺酶之流感嗜血桿菌及卡他莫拉菌，其作為在北美引起急性中耳炎之主要有機體，接著為肺炎鏈球菌(Pediatr Clin N Am 60(2013)391-407)。
由於中耳炎為多因素疾病，已質疑使用疫苗接種策略預防中耳炎之可行性。(Current Infectious Disease Reports 11：177-182(2009))。
絨鼠模型為中耳炎及其預防之穩固及證實之動物模型(Expert Review of Vaccines 8：1063-1082(2009))。儘管絨鼠模型可模擬人類感染之天然過程，但其他者已表明絨鼠模型中之結果可在一個實驗室至下一個實驗室間變化。(Current Opinion in Investigational Drugs 4：953-958(2003))。
各種其他嚙齒動物亦已用於誘發中耳炎且概述於Vaccine 26：1501-1524(2008)中。鼠類動物模型通常在中耳炎研究中經研究。
殺菌抗體之存在與針對由於非分型流感嗜血桿菌的中耳炎之保護相關(Current Opinion in Infectious Disease 16：129-134(2003))。然而，免疫反應不必為殺菌的以針對NTHi有效。僅與NTHi表面黏附素反應之抗體可減少或消除絨鼠中之中耳炎。(Current Opinion in
Investigational Drugs 4：953-958(2003))。
慢性阻塞性肺病為肺部之慢性發炎疾病及世界範圍內發病及死亡之一個主要病因。在2005年，美國的20例死亡中大致有一例以COPD作為潛在病因。(Drugs and Aging 26：985-999(2009))。預計到2020年，COPD將上升為失能調整壽命年、慢性失效疾病之第五主要病因，及死亡之第三最重要的病因(Lancet 349：1498-1504(1997))。
COPD之病程之特徵為氣流受限之進行性惡化及肺功能之下降。COPD可與頻繁及復發性急性惡化(AE)併發，該等急性惡化與巨大醫療保健支出及高發病率相關。(Proceedings of the American Thoracic Society 4：554-564(2007))。一個研究表明大致50% COPD之症狀之急性惡化係由非分型流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)造成。(Drugs and Aging 26：985-999(2009))。流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae，H.influenzae)發現於20-30%之COPD之惡化中；肺炎鏈球菌發現於10-15%之COPD之惡化中；且卡他莫拉菌發現於10-15%之COPD之惡化中。(New England Journal of Medicine 359：2355-2365(2008))。已顯示流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌及卡他莫拉菌為香港、南韓及菲律賓之支氣管炎之急性惡化的主要病原體，而克雷伯氏菌屬(Klebsiella spp.)、綠膿桿菌及不動桿菌屬(Acinetobacter spp.)在包括印度尼西亞、泰國、馬來西亞及臺灣之其他亞洲國家/區域構成病原體之較大比例(Respirology,(2011)16,532-539；doi：10.1111/j.1440.1843.2011.01943.x)。在孟加拉國，20%患有COPD之患者對於假單胞菌、克雷伯氏菌、肺炎鏈球菌及流感嗜血桿菌顯示陽性痰培養，而65%患有AECOPD(COPD之急性惡化)之患者對於假單胞菌、克雷伯氏菌屬、不動桿菌屬、腸桿菌屬、卡他莫拉菌及其組合顯示陽性培養。(Mymensingh Medical Journal 19：576-585(2010))。然
而，已表明預防COPD惡化之兩個最重要之措施為活性免疫接種及長期維持藥物治療。(Proceedings of the American Thoracic Society 4：554-564(2007))。
在美國，社區獲得性肺炎(CAP)已描述為來自感染性疾病之死亡的主要病因及總體而言之第6死亡病因。卡他莫拉菌為與北美之CAP相關之病原體中之一者(Clin Chest Med 26(2005)37-55)及與日本之中度至重度社區獲得性肺炎相關之病原體中之一者(J Infect Chemother.2014年11月20日.pii：S1341-321X(14)00396-1.doi：10.1016/j.jiac.2014.11.006.[電子版先於印刷版])。
需要針對卡他莫拉菌之有效疫苗。
本發明係關於式(I)之蛋白質。
A-(R1)m-(B)n (式I)
其中：A為來自卡他莫拉菌之UspA2或其免疫原性片段；R1為胺基酸；m為0或2；B為組胺酸；及n為0、1、2、3、4、5或6。
在一個特定實施例中，R1及m經定義，其中(R1)m為AS(丙胺酸絲胺酸)。在另一實施例中，R1為非天然胺基酸。
在一個實施例中，式(I)之蛋白質及本發明蛋白質經定義，其中m為0。在一個實施例中，當m為0時，n為2。在本發明之另一實施例中，當m為0時，n不為0。
在一個實施例中，m為2。
在一個特定實施例中，n係選自由1、2及6組成之群。在另一實施例中，n係選自由2及6組成之群。在一個特定實施例中，n為2。在
另一實施例中，n為6。
在一個實施例中，n係選自由0、1、2及6，或其任何子集組成之群。
在一個實施例中，n為0。在另一實施例中，當n為0時，m為2。
在一個實施例中，n為1。在一個實施例中，n為3。在一個實施例中，n為4。在一個實施例中，n為5。
在一個實施例中，式(I)之蛋白質在胺基末端處進一步含有甲硫胺酸(M)；一種具有下式之蛋白質：甲硫胺酸-A-(R1)m-(B)n。此等包括在本發明蛋白質內。在一個特定實施例中，當m為0且n為0時，式(I)之蛋白質及本發明蛋白質為非天然蛋白質。
在一個實施例中，式(I)之蛋白質及本發明蛋白質為非天然蛋白質。
在一個實施例中，式(I)之蛋白質經定義，其中A為來自卡他莫拉菌之UspA2。在另一實施例中，式(I)之蛋白質經定義，其中A為如選自由以下組成之群的胺基酸序列中所闡述之UspA2：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：38之任何子集。在另一實施例中，式(I)之蛋白質經定義，其中A為UspA2，其中UspA2經整個長度
與SEQ ID NO：1具有至少63%、66%、70%、72%、74%、75%、77%、80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在另一實施例中，式(I)之蛋白質經定義，其中A為UspA2，其中UspA2與SEQ ID NO：1中所闡述之UspA2胺基酸序列具有大致75%至100%一致性。在另一實施例中，A為UspA2，其中UspA2與SEQ ID NO：1中所闡述之UspA2胺基酸序列具有大致90%至100%一致性。在另一實施例中，A為UspA2，其中UspA2與SEQ ID NO：1中所闡述之UspA2胺基酸序列具有至少95%一致性。在另一實施例中，式(I)之蛋白質經定義，其中A為UspA2，其中UspA2與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：38中之任一者中所闡述之UspA2胺基酸序列具有大致75%至100%一致性。在另一實施例中，A為UspA2，其中UspA2與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：38中之任一者中所闡述之UspA2胺基酸序列具有大致90%至100%一致性。在其他實施例中，A為UspA2，其中UspA2與如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：38中之任一者中所闡述之UspA2具有至少95%一致性。在一特定實施例中，A為具有SEQ ID NO.1中所闡述之胺基酸序列之UspA2。
在另一實施例中，式(I)之蛋白質經定義，其中A為來自卡他莫拉菌之UspA2之免疫原性片段。在另一實施例中，A為UspA2之免疫原性片段，其中UspA2具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、
SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：38之任何子集。在另一實施例中，A為UspA2之免疫原性片段，其中UspA2 SEQ ID NO：1中所闡述之胺基酸序列具有大致75%至100%一致性。在另一實施例中，A為UspA2之免疫原性片段，其中UspA2與SEQ ID NO.1具有大致90%至100%一致性。在另一實施例中，A為UspA2之免疫原性片段，其中UspA2與SEQ ID NO：1具有至少95%一致性。在另一實施例中，A為UspA2之免疫原性片段，其中UspA2與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：38中之任一者中所闡述之胺基酸序列具有大致75%至100%一致性。在另一實施例中，A為UspA2之免疫原性片段，其中UspA2與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：38中之任一者具有大致90%至100%一致性。在另一實施例中，A為UspA2之免疫原性片段，其中UspA2與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：38中之任一者具有至少95%一致性。在一特定實施例中，A為UspA2之免疫原性片段，其中UspA2具有SEQ ID NO：1中所闡述之胺基酸序列。
在另一實施例中，A為選自由以下組成之群的來自卡他莫拉菌之UspA2之免疫原性片段：SEQ ID NO.1之胺基酸30-540(SEQ ID NO：39)、SEQ ID NO：1之胺基酸31-540(SEQ ID NO：40)、SEQ ID NO：1之胺基酸30-519(SEQ ID NO：41)、SEQ ID NO：1之胺基酸30-564(SEQ ID NO：42)及SEQ ID NO：1之胺基酸31-564(SEQ ID NO：43)。更特定言之，在一個實施例中，A為SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：1之胺基酸31-564。在另一實施例中，A為SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：1之胺基酸30-564。在另一實施例中，A為選自由以下組成之群的來自卡他莫拉菌之UspA2之免疫原性片段：SEQ ID NO.1之胺基酸30-540(SEQ ID NO：39)、SEQ ID NO.1之胺基酸31-540(SEQ ID NO：40)及
SEQ ID NO.1之胺基酸30-519(SEQ ID NO：41)。在另一實施例中，A為與SEQ ID NO.39具有至少52%(American 2908)、55%(Norwegian 25)、57%(Japanese Z7476)、62%(Finnish FIN2344)、64%(American 2912)、69%(American P44)、73%(American 7169)、76%(Norwegian 27)、81%(American V1145)、88%(German Z8063)或100%(Swedish BC5)一致性之UspA2之免疫原性片段。在另一實施例中，A為與SEQ ID NO.43具有至少52%(American 2908)、57%(Dutch F10)、62%(American 2933)、65%(Greek MC317)、67%(American V1122)、70%(American P44)、73%(American 7169)、76%(Norwegian 3)、81%(German Z8063)、100%(Swedish BC5)一致性之UspA2之免疫原性片段。
在另一實施例中，A為來自卡他莫拉菌(SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：38)之UspA2之免疫原性片段，其中該片段包含與SEQ ID NO.1之胺基酸30-540(SEQ ID NO：39)、SEQ ID NO：1之胺基酸31-540(SEQ ID NO：40)、SEQ ID NO：1之胺基酸30-519(SEQ ID NO：41)、SEQ ID NO：1之胺基酸30-564(SEQ ID NO：42)或SEQ ID NO：1之胺基酸31-564(SEQ ID NO：43)對準之胺基酸。在一個實施例中，實施Needleman-Wunsch算法之Gap程式(來自GCG套裝軟體)或Needle程式(來自EMBOSS套裝軟體)可用於比對序列。
UspA2-SEQ ID NO：1
來自SEQ ID NO：1之UspA2之胺基酸30-540，SEQ ID NO：39
來自SEQ ID NO：1之UspA2之胺基酸31-540，SEQ ID NO：40
來自SEQ ID NO：1之UspA2之胺基酸30-519，SEQ ID NO：41
來自SEQ ID NO：1之UspA2之胺基酸30-564，SEQ ID NO：42
來自SEQ ID NO：1之UspA2之胺基酸31-564，SEQ ID NO：43
在另一實施例中，A為來自卡他莫拉菌之UspA2之免疫原性片段，其在以下胺基酸中之一或多者中不同於SEQ ID NO：1：AA(胺基酸)30至298、AA 299至302、AA 303至333、AA 334至339、AA 349、AA 352至354、AA 368至403、AA 441、AA 451至471、AA
472、AA 474至483、AA 487、AA 490、AA 493、AA 529、AA 532或AA 543。在另一實施例中，A為來自卡他莫拉菌之UspA2之免疫原性片段，其與SEQ ID NO：1之不同之處在於相比於SEQ ID NO.1，其含有至少一個胺基酸插入。
在另一實施例中，A為含有層黏連蛋白結合域及纖維結合蛋白結合域之UspA2之免疫原性片段。
在另一實施例中，A為含有層黏連蛋白結合域、纖維結合蛋白結合域及C3結合域之UspA2之免疫原性片段。
在另一實施例中，A為含有層黏連蛋白結合域、纖維結合蛋白結合域、C3結合域及兩親性螺旋之UspA2之免疫原性片段。
層黏連蛋白結合域、纖維結合蛋白結合域、C3結合域或兩親性螺旋可如對於SEQ ID NO：1一般定義或可為SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：38中之任一者中之對應序列。
式(I)之蛋白質及本發明蛋白質適用作個體(諸如哺乳動物，特定言之人類)中之免疫原。特定言之，式(I)之蛋白質及本發明蛋白質適用於誘導針對個體，特定言之人類中之卡他莫拉菌之免疫反應。式(I)之蛋白質及本發明蛋白質適用於治療或預防卡他莫拉菌感染或疾病。更特定言之，式(I)之蛋白質及本發明蛋白質適用於治療或預防中耳炎及/或COPD及/或AECOPD及/或肺炎。
本發明係關於包含來自卡他莫拉菌之UspA2或其免疫原性片段之免疫原性組合物。本發明亦關於包含該等免疫原性組合物之疫苗及其治療用途。本發明之免疫原性組合物及疫苗適用於治療或預防卡他莫拉菌感染或疾病。更特定言之，本文所述之免疫原性組合物及疫苗適用於治療或預防中耳炎及/或COPD及/或AECOPD及/或肺炎。
在一個實施例中，免疫原性組合物包含來自卡他莫拉菌之UspA2。UspA2可為SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：38中之任一者或與
SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：38中之任一者具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之UspA2序列。UspA2亦可為與SEQ ID NO.1之序列具有至少63%(American 2908)、66%(Japanese Z7476)、70%(Dutch F10)、72%(Finnish 358)、74%(American P44)、77%(Finnish 307)、80%(Norwegian 3)、84%(American V1145)、90%(German Z8063)或100%(Swedish BC5)一致性之UspA2序列。
在另一實施例中，免疫原性組合物包含UspA2之免疫原性片段。UspA2之免疫原性片段可為SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO 43，或與SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43中之任一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之序列。UspA2之免疫原性片段可為與SEQ ID NO.39具有至少52%(American 2908)、55%(Norwegian 25)、57%(Japanese Z7476)、62%(Finnish FIN2344)、64%(American 2912)、69%(American P44)、73%(American 7169)、76%(Norwegian 27)、81%(American V1145)、88%(German Z8063)或100%(Swedish BC5)一致性之UspA2序列。UspA2之免疫原性片段亦可為與SEQ ID NO.43具有至少52%(American 2908)、57%(Dutch F10)、62%(American 2933)、65%(Greek MC317)、67%(American V1122)、70%(American P44)、73%(American 7169)、76%(Norwegian 3)、81%(German Z8063)、100%(Swedish BC5)一致性之UspA2序列。胺基酸差異已描述於來自各種卡他莫拉菌物種之UspA2中。
UspA2含有層黏連蛋白結合域(例如SEQ ID NO：1之胺基酸30-177，SEQ ID NO：44)。在一個實施例中，UspA2之片段包含SEQ ID NO：1之層黏連蛋白結合區。在另一實施例中，UspA2之片段包含SEQ
ID NO：2至SEQ ID NO：38中之任一者之層黏連蛋白結合區。
SEQ ID NO：1之胺基酸30-177，SEQ ID NO：44：
UspA2含有纖維結合蛋白結合域(例如SEQ ID NO：1之胺基酸165-318，SEQ ID NO：45)。在一個實施例中，UspA2之片段包含SEQ ID NO：1之纖維結合蛋白結合區。在另一實施例中，UspA2之片段包含SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：38中之任一者之纖維結合蛋白結合區。SEQ ID NO：45之纖維結合蛋白結合域亦具有C3結合特性。
SEQ ID NO：1之胺基酸165-318，SEQ ID NO：45：
UspA2含有補體成分3(C3)結合域(例如SEQ ID NO：1之胺基酸30-539，SEQ ID NO：46，或SEQ ID NO：1之胺基酸165-318，SEQ ID NO：45)。在一個實施例中，UspA2之片段包含SEQ ID NO：1之C3結合區。在另一實施例中，UspA2之片段包含SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：38中之任一者之C3結合域。
SEQ ID NO：1之胺基酸30-539，SEQ ID NO：46：
UspA2含有兩親性螺旋(例如SEQ ID NO：1之胺基酸519-564或
SEQ ID NO：1之胺基酸520-559)。在一個實施例中，UspA2之片段包含SEQ ID NO：1之胺基酸519-564。在另一實施例中，UspA2之片段包含SEQ ID NO：1之胺基酸520-559。在另一實施例中，UspA2之片段包含SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：38中之任一者之兩親性螺旋。
在一個實施例中，免疫原性組合物包含式(I)之蛋白質，其中A為包含層黏連蛋白結合域及纖維結合蛋白結合域之UspA2之免疫原性片段。
在另一實施例中，免疫原性組合物包含式(I)之蛋白質，其中A為包含層黏連蛋白結合域、纖維結合蛋白結合域及C3結合域之UspA2之免疫原性片段。
在另一實施例中，免疫原性組合物包含式(I)之蛋白質，其中A為包含層黏連蛋白結合域、纖維結合蛋白結合域、C3結合域及兩親性螺旋之UspA2之免疫原性片段。
在另一實施例中，免疫原性組合物包含如經式(I)所定義之蛋白質。免疫原性組合物可例如含有在胺基末端處具有另一甲硫胺酸之式(I)之蛋白質。
在一個實施例中，本發明免疫原性組合物可與其他抗原一起投與。舉例而言，本發明免疫原性組合物可與來自流感嗜血桿菌之抗原一起投與。舉例而言，式(I)之蛋白質可與來自流感嗜血桿菌之蛋白D(PD)一起投與。蛋白D可如WO91/18926中所述。本發明免疫原性組合物可與來自流感嗜血桿菌之蛋白E(PE)及菌毛蛋白A(PilA)一起投與。蛋白E及菌毛蛋白A可如WO2012/139225中所述；其內容以引用之方式併入本文中。蛋白E及菌毛蛋白A可呈現為融合蛋白。
在另一實施例中，本發明之免疫原性組合物可與來自亦已知引起中耳炎、COPD、AECOPD或肺炎之其他細菌物種之其他抗原一起投與。
達成所需治療或生物效應所需的免疫原性組合物之量將取決於多種因素，諸如預期用途、投與方法、受者及治療之病狀之類型及嚴重程度，且將最終由巡診醫生或獸醫酌情處理。一般而言，治療人體中完全或部分由卡他莫拉菌引起之病狀之典型劑量可例如預期處於約0.001mg至0.120mg範圍內。更特定言之，治療人體內完全或部分由卡他莫拉菌引起之病狀之典型劑量可處於約0.003mg至約0.03mg蛋白質範圍內。本發明提供一種包含式(I)之蛋白質或本發明蛋白質之免疫原性組合物，其用於治療或預防完全或部分由卡他莫拉菌引起之病狀或疾病。免疫原性組合物可含有其他抗原；治療人體中完全或部分由流感嗜血桿菌引起之病狀之典型劑量可就各其他抗原而言處於約0.005mg至約0.05mg範圍內。此劑量可以單一單位劑量形式投與。亦可投與若干分離的單位劑量。舉例而言，分離的單位劑量可以第一生命年內分離的初次劑量形式或以有規律間隔(例如每1、5或10年)給予之分離的輔助劑劑量形式投與。本發明亦提供一種包含式(I)之蛋白質或本發明蛋白質之免疫原性組合物，其用於治療或預防完全或部分由卡他莫拉菌以及至少一種來自流感嗜血桿菌之抗原引起之病狀或疾病。
包含本發明之免疫原性組合物之調配物可適配成用於藉由適當途徑，例如藉由肌肉內、舌下、經皮、皮內或鼻內途徑投與。該等調配物可藉由此項技術中已知之任何方法製備。
本發明之免疫原性組合物可另外包含佐劑。當術語「佐劑」用於本說明書中時，其係指與免疫原性組合物結合投與以增強患者對組合物之免疫原性組分之免疫反應之物質。
適合之佐劑包括鋁鹽，諸如氫氧化鋁凝膠或磷酸鋁或礬，但亦可為鈣、鎂、鐵或鋅鹽，或可為醯化酪胺酸或醯化糖、陽離子或陰離子衍生化醣或聚磷氮烯於之不溶懸浮液。在一個實施例中，蛋白質可
吸附至磷酸鋁上。在另一實施例中，蛋白質可吸附至氫氧化鋁上。在第三實施例中，礬可用作佐劑。
顯著促進Th1反應之適合之佐劑系統包括：脂質A之無毒衍生物，單磷醯基脂質A(MPL)或其衍生物，特定言之3-去-O-醯化單磷醯基脂質A(3D-MPL)(關於其製備，參見GB 2220211 A)；及單磷醯基脂質A，較佳3-去-O-醯化單磷醯基脂質A連同鋁鹽(例如磷酸鋁或氫氧化鋁)或水包油乳液之組合。在該等組合中，抗原及3D-MPL包含於相同微粒結構中，允許更有效地傳遞抗原及免疫刺激信號。研究已顯示3D-MPL能夠進一步增強礬吸附抗原之免疫原性(Thoelen等人Vaccine(1998)16：708-14；EP 689454-B1)。
AS01為含有MPL(3-O-去醯基-4'-單磷醯基脂質A)、QS21((南美皂皮樹(Quillaja saponaria Molina)，溶離份21)Antigenics,New York,NY,USA)及脂質體之佐劑系統。AS01B為含有MPL、QS21及脂質體(50μg MPL及50μg QS21)之佐劑系統。AS01E為含有MPL、QS21及脂質體(25μg MPL及25μg QS21)之佐劑系統。在一個實施例中，免疫原性組合物或疫苗包含AS01。在另一實施例中，免疫原性組合物或疫苗包含AS01B或AS01E。在一特定實施例中，免疫原性組合物或疫苗包含AS01E。
AS02為於油/水乳液中含有MPL及QS21之佐劑系統。AS02V為於油/水乳液中含有MPL及QS21(50μg MPL及50μg QS21)之佐劑系統。
AS03為於油/水(o/w)乳液中含有α-生育酚及角鯊烯之佐劑系統。AS03A為於o/w乳液中含有α-生育酚及角鯊烯(11.86mg生育酚)之佐劑系統。AS03B為於o/w乳液中含有α-生育酚及角鯊烯(5.93mg生育酚)之佐劑系統。AS03C為於o/w乳液中含有α-生育酚及角鯊烯(2.97mg生育酚)之佐劑系統。在一個實施例中，免疫原性組合物或疫苗包含AS03。
AS04為含有吸附於鋁鹽(500μg Al3+)上之MPL(50μg MPL)之佐劑系統。在一個實施例中，免疫原性組合物或疫苗包含AS04。
涉及使用QS21及3D-MPL之系統揭示於WO 94/00153中。WO 96/33739中揭示一種組合物，其中用膽固醇淬滅QS21。包含水包油乳液中之QS21、3D-MPL及生育酚之另一佐劑調配物描述於WO 95/17210中。在一個實施例中，免疫原性組合物另外包含皂素，其可為QS21。調配物亦可包含水包油乳液及生育酚(WO 95/17210)。含未甲基化CpG之寡核苷酸(WO 96/02555)及其他免疫調節寡核苷酸(WO 0226757及WO 03507822)亦為TH1反應之優先誘導物且適合用於本發明。
其他佐劑為選自下組之彼等佐劑：金屬鹽、水包油乳液、Toll樣受體促效劑(特定言之Toll樣受體2促效劑、Toll樣受體3促效劑、Toll樣受體4促效劑、Toll樣受體7促效劑、Toll樣受體8促效劑及Toll樣受體9促效劑)、皂素或其組合。
本發明提供一種製備免疫原性組合物之方法，其包含組合式(I)之蛋白質或本發明蛋白質與佐劑。
本發明進一步提供含有本發明之免疫原性組合物及醫藥學上可接受之佐劑之疫苗。
可能的賦形劑包括精胺酸、普洛尼克酸(pluronic acid)及/或聚山梨醇酯。在一較佳實施例中，使用聚山梨醇酯80(例如TWEEN(美國註冊商標)80)。在另一實施例中，使用約0.03%至約0.06%之最終濃度。特定言之，可使用約0.03%、0.04%、0.05%或0.06%聚山梨醇酯80(w/v)之最終濃度。
本發明提供一種製備免疫原性組合物或疫苗之方法，其包含組合式(I)之蛋白質或本發明蛋白質與醫藥學上可接受之賦形劑。
本發明亦提供編碼本發明蛋白質之核酸。術語「核酸」係指核
苷酸之聚合形式。核苷酸可為核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸之經修飾形式。該術語包括DNA之單股及雙股形式。核酸較佳實質上不含其他核酸。
本發明提供一種產生本發明之核酸之方法。可藉由熟習此項技術者已知之方法製備本發明之核酸。舉例而言，可部分或整體地合成本發明之核酸。可藉由消化較長胺基酸或接合較短胺基酸製備核酸。
本發明提供一種治療或預防中耳炎之方法。該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之式(I)之蛋白質或本發明蛋白質。
本發明提供一種治療或預防慢性阻塞性肺病之惡化之方法。COPD之惡化可為急性惡化。該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之式(I)之蛋白質或本發明蛋白質。
本發明提供一種治療或預防肺炎之方法。該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之式(I)之蛋白質或本發明蛋白質。
本發明提供一種包含式(I)之蛋白質或本發明蛋白質之醫藥組合物，其用於治療或預防完全或部分由卡他莫拉菌引起之病狀或疾病。醫藥組合物可進一步包含醫藥學上可接受之佐劑。
本發明提供(a)式(I)之蛋白質及本發明蛋白質、(b)包含式(I)之蛋白質或本發明蛋白質之免疫原性組合物或(c)包含(c1)式(I)之蛋白質或本發明蛋白質或(c2)包含式(I)之蛋白質或本發明蛋白質之免疫原性組合物之疫苗用於製造治療或預防卡他莫拉菌感染或疾病之藥物之用途。
本發明提供(a)式(I)之蛋白質及本發明蛋白質、(b)包含式(I)之蛋白質或本發明蛋白質之免疫原性組合物或(c)包含(c1)式(I)之蛋白質或本發明蛋白質或(c2)包含式(I)之蛋白質或本發明蛋白質之免疫原性組合物之疫苗用於製造治療或預防中耳炎之藥物之用途。
本發明提供(a)式(I)之蛋白質及本發明蛋白質、(b)包含式(I)之蛋
白質或本發明蛋白質之免疫原性組合物或(c)包含(c1)式(I)之蛋白質或本發明蛋白質或(c2)包含式(I)之蛋白質或本發明蛋白質之免疫原性組合物之疫苗用於製造治療或預防慢性阻塞性肺病之急性惡化(AECOPD)之藥物之用途。
本發明提供(a)式(I)之蛋白質及本發明蛋白質、(b)包含式(I)之蛋白質或本發明蛋白質之免疫原性組合物或(c)包含(c1)式(I)之蛋白質或本發明蛋白質或(c2)包含式(I)之蛋白質或本發明蛋白質之免疫原性組合物之疫苗用於製造治療或預防肺炎之藥物之用途。
以下實例僅旨在說明而不希望以任何方式限制本發明之範疇。
在實例中，以下術語具有指定含義：6xhis=6個組胺酸；xg=離心力(數值重力)AS=丙胺酸絲胺酸BSA=牛血清白蛋白；℃=攝氏度；CaCl2=氯化鈣；CD=圓二色性；CHCl3=氯仿；CH3CN=乙腈；CO2=二氧化碳；Da=道爾頓；DNA=去氧核糖核酸；DO=溶解氧；DSC=差示掃描熱量測定；EDTA=乙二胺四乙酸；h=小時；
H2O=水；H2O2=過氧化氫；HCDI=高細胞密度誘導；HCl=氯化氫；His=his=組胺酸；IMAC=固定化金屬親和層析；IPTG=異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷；kVolts=千伏特L=公升；LB=魯利亞-貝爾塔尼(Luria-Bertani)；LCDI=低細胞密度誘導；MeOH=甲醇；ml=毫升；NaCl=氯化鈉；RPM=rpm=轉/分鐘；min=分鐘；mM=毫莫耳；μg=微克；μL=微升；MW=分子量；m/z=質量/電荷；NaCl=氯化鈉；NaPO4=磷酸鈉；ng=奈克；NH4OH=氫氧化銨；nm=奈米；
O.D.=光學密度；PBS=磷酸鹽緩衝鹽水；PCR=聚合酶鏈反應；psi=磅/平方吋；PVDF=聚偏氟乙烯；SDS-PAGE=十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳；TFA=三氟乙酸Tm=熔點；Tm1=第一熔點；Tm2=第二熔點；w/v=重量/體積。
在具有及在不具有其他胺基酸的情況下藉由UspA2之不同片段產生蛋白質構築體。下表描述製得之蛋白質構築體。
A.A.=胺基酸
表2中所列之各蛋白質構築體之DNA及胺基酸序列闡述於下文中。
MC-001(DNA)-SEQ ID NO：52
MC-001(蛋白質)-(M)(UspA2胺基酸30-540)(ASHHHHHH)SEQ ID NO：53
MC-002(DNA)-SEQ ID NO：54
MC-002(蛋白質)-(M)(UspA2胺基酸30-540)SEQ ID NO：55
SEQ ID NO：56
SEQ ID NO：57
MC-003(DNA)-SEQ ID NO：87
MC-003(蛋白質)-(M)(UspA2胺基酸30-540)(H)-SEQ ID NO：88
MC-004(DNA)-SEQ ID NO：58
MC-004(蛋白質)-(M)(UspA2胺基酸30-540)(HH)SEQ ID NO：59
MC-005(DNA)-SEQ ID NO：60
MC-005(蛋白質)-(M)(UspA2胺基酸30-519)(ASHHHHHH)SEQ ID NO：61
MC-006(DNA)-SEQ ID NO：62
MC-006(蛋白質)-(M)(UspA2胺基酸30-519)SEQ ID NO：63
MC-007(DNA)-SEQ ID NO：64
MC-007(蛋白質)-(M)(UspA2胺基酸30-564)(ASHHHHHH)SEQ ID NO：65
MC-008(DNA)-SEQ ID NO：66
MC-008(蛋白質)-(M)(UspA2 30-564)(HH)SEQ ID NO：67
MC-009(DNA)-SEQ ID NO：68
MC-009(蛋白質)-(M)(UspA2 31-564)(HH)SEQ ID NO：69
MC-010(DNA)-SEQ ID NO：70
MC-010(蛋白質)-(M)(UspA2胺基酸30-564)SEQ ID NO：71
MC-011(DNA)-SEQ ID NO：72
MC-011(蛋白質)-(M)(UspA2胺基酸31-540)(ASHHHHHH)SEQ ID NO：73
來自菌株ATCC 25238之UspA2之DNA序列-SEQ ID NO：74.
來自菌株ATCC 25238.之UspA2之蛋白質序列-如上文所述之SEQ ID NO.1.
為產生構築體MC-001，編碼UspA2基因片段(來自菌株ATCC 25238之胺基酸30至540)之DNA片段包括NdeI/XhoI限制位點以促進選殖(起始甲硫胺酸係藉由NdeI位點編碼)且對應於AS(丙胺酸絲胺酸)胺基酸連接子及6xhis胺基酸之DNA序列係藉由GENEART(美國註冊商標)經密碼子最佳化(非天然)及合成。密碼子最佳化意謂核苷酸序列在不改變胺基酸序列的情況下自天然序列改變以與大腸桿菌中之密碼子
使用較好地擬合以實現最佳表現。UspA2片段係根據標準方法使用NdeI/XhoI限制位點選殖至pET-26b表現載體中。
為產生MC-002、MC-003及MC-004構築體，分別使用作為模板之MC-001構築體、引物UspA2Nde opt(其含有甲硫胺酸起始密碼子)及引物UspA2opt δ His、A2opt 1His δ AS及A2opt 2His δ AS進行聚合酶鏈反應以擴增UspA2基因片段(來自菌株ATCC 25238之胺基酸30-540)。UspA2片段係根據標準方法使用NdeI/XhoI限制位點選殖至pET-26b表現載體中。
為產生構築體MC-005，使用作為模板之MC-001載體以及引物UspA2Nde opt(其含有甲硫胺酸起始密碼子)及R δ hairpin A2opt His進行聚合酶鏈反應以擴增UspA2基因片段(來自菌株ATCC 25238之胺基酸30-519)。對應於NdeI限制位點之DNA序列係併入5'引物中且XhoI限制位點係併入3'引物中。另外，對應於AS胺基酸連接子及6xhis胺基酸之DNA序列係併入3'引物中。隨後將產生之PCR產物插入至pET-26b(+)選殖載體(NOVAGEN(美國註冊商標))中。
為產生構築體MC-006，使用作為模板之MC-005載體以及引物UspA2Nde opt(其含有甲硫胺酸起始密碼子)及δ His δ hélice進行聚合酶鏈反應以擴增UspA2基因片段(來自菌株ATCC 25238之胺基酸30-519)。對應於NdeI限制位點之DNA序列係併入5'引物中且XhoI限制位點係併入3'引物中。隨後將產生之PCR產物插入至pET-26b(+)選殖載體(NOVAGEN(美國註冊商標))中。
為產生構築體MC-007，編碼UspA2基因片段(來自菌株ATCC 25238之胺基酸30至564)之DNA片段包括NdeI/XhoI限制位點以促進選殖(起始甲硫胺酸係藉由NdeI位點編碼)且對應於AS胺基酸連接子及6xhis胺基酸之DNA序列係藉由GENEART(美國註冊商標)(質體：1026399)經密碼子最佳化及合成。UspA2片段係根據標準方法使用
NdeI/XhoI限制位點選殖至pET-26b表現載體中。
為產生構築體MC-008，使用作為模板之MC-007載體以及引物UspA2Nde opt(其含有甲硫胺酸起始密碼子)及2His hélice δAS進行聚合酶鏈反應以擴增UspA2基因片段(來自菌株ATCC 25238之胺基酸30-564)。對應於NdeI限制位點之DNA序列係併入5'引物中且XhoI限制位點係併入3'引物中。隨後將產生之PCR產物插入至pET-26b(+)選殖載體(NOVAGEN(美國註冊商標))中。
為產生構築體MC-009，使用作為模板之1026399質體及引物N-term cyto Abis(其含有甲硫胺酸起始密碼子)及2His hélice δAS進行聚合酶鏈反應以擴增UspA2基因片段(來自菌株ATCC 25238之胺基酸31-564)。對應於NdeI限制位點之DNA序列係併入包括麩醯胺酸缺失之5'引物中且XhoI限制位點係併入包括兩個組胺酸殘基之3'引物中。隨後將產生之PCR產物插入至pET-26b(+)選殖載體(NOVAGEN(美國註冊商標))中。進行最終構築體之DNA定序以確認適當的序列。
為產生構築體MC-010，使用作為模板之MC-007載體以及引物UspA2 Nde opt(其含有甲硫胺酸起始密碼子)及cyto hélice dHis dAS進行聚合酶鏈反應以擴增UspA2基因片段(來自菌株ATCC 25238之胺基酸30-564)。對應於NdeI限制位點之DNA序列係併入5'引物中且XhoI限制位點係併入3'引物中。隨後將產生之PCR產物插入至pET-26b(+)選殖載體(NOVAGEN(美國註冊商標))中。
為產生構築體MC-011，使用作為模板之MC-001載體以及引物N-term cyto Abis(其含有甲硫胺酸起始密碼子)及N-term reverse進行聚合酶鏈反應以擴增UspA2基因片段(來自菌株ATCC 25238之胺基酸31-540)。對應於NdeI限制位點之DNA序列係併入5'引物中且XhoI限制位點係併入3'引物中。隨後將產生之PCR產物插入至pET-26b(+)選殖載體(NOVAGEN(美國註冊商標))中。
用於擴增之PCR引物序列之詳細清單說明於表3中。使用Expand High Fidelity PCR System套組(Roche)根據製造商之建議進行聚合酶鏈反應。使用Rapid DNA Ligation Kit(Roche)根據製造商之建議進行接合。
大腸桿菌(E.coli)BLR(DE3)、經修飾BLR(DE3)或B834(DE3)細胞係根據CaCl2處理之細胞之標準方法經質體DNA轉型(Hanahan D.«Plasmid transformation by Simanis.»Glover,D.M.(編)，DNA cloning.IRL Press London.(1985)：第109-135頁)。簡言之，BLR(DE3)感受態細胞在冰上溫和地解凍。使用50-100μl感受態細胞混合大致4μl質體(10-100ng)。此後，在冰上培育此調配物5分鐘。為進行轉化反應，調配物在42℃下熱脈衝30秒，隨後在冰上培育2分鐘。將大致0.5ml SOC培養基(具有分解代謝物抑制之Super Optimal培養液)添加至經轉型細胞且在37℃下培育細胞培養物一小時，隨後藉由50ug/ml康黴素(kanamycin)在Luria-Bertani(LB)瓊脂上平板接種。約150μl經轉型細胞培養物經接種且在37℃下培育隔夜。
BLR(DE3)：BLR為BL21(F- ompT hsdSB(rB- mB-)gal dcm(DE3)之recA -衍生物。用於表現重組蛋白質之此大腸桿菌菌株提高質體單體產量且可有助於使含有重複序列或產物可引起DE3原噬菌體之損失之靶向質體穩定化(Studier,F.W.(1991)J.Mol.Biol.219：37-44)。大腸桿菌BLR(DE3)之詳細基因型已由NOVAGEN(美國註冊商標)公佈。(F- ompT hsdSB(rB- mB-)gal dcm △(srl-recA)306：：Tn10(TetR)(DE3)。
B834(DE3)為BL21之親本菌株。此等宿主為甲硫胺酸營養缺陷體且允許藉由35S-甲硫胺酸及硒甲硫胺酸以高比活性標記靶蛋白以用於晶體學。大腸桿菌B834(DE3)之詳細基因型已由NOVAGEN(美國註冊商標)公佈：F- ompT hsdS B(rB- mB-)gal dcm met(DE3)。
經修飾BLR(DE3)：為了防止(磷酸基)葡萄糖酸基化，將Pgl基因插入位於BLR(DE3)基因組中之生物素軌跡中。另外，為防止Ile-Val取代，蘇胺酸脫胺酶基因中之C219Y突變經校正。
基因型：(F- ompT hsdSB(rB- mB-)gal dcm △(srl-recA)306：：Tn10(TetR)；△(bioA-bioD)：：Pgl；TD+(C219Y)(DE3)。
經重組質體轉型之大腸桿菌菌株用於接種100ml LB培養液(Becton,Dickinson and Company)±1%(重量/體積，w/v)葡萄糖(Laboratoire MAT，目錄號：GR-0101)及50μg/ml康黴素(Sigma)。此預先培養物一般在37℃下生長隔夜。12ml預先培養物用於接種500ml LB培養液+50μg/ml康黴素。在37℃下在150RPM之攪拌下培育培養物以達到約0.6之O.D.600nm。
在約0.6之O.D.600nm下，藉由添加1mM異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG；EMD Chemicals Inc.，目錄號：5815)且在23℃下在150RPM之攪拌下培育隔夜誘導BLR(DE3)培養物以表現重組蛋白質。在誘導
時段之後，將培養物在6370g下離心20分鐘且將來自350ml培養物之離心塊分開冷凍在-20℃下。
將在搖瓶中之誘導之後獲得之各菌團再懸浮於30ml含有10mM NaCl及Roche COMPLETE(美國註冊商標)蛋白酶抑制劑混合液(1錠/50ml緩衝液)之20mM磷酸鉀緩衝液(pH 8.0)中。藉由3×French Press提取(20 000psi)進行細胞溶解且藉由在23700g下之30分鐘離心進行澄清。收集上清液且在0.22μm上過濾。
使用XK16管柱及20ml預先藉由含有10mM NaCl之20mM磷酸鉀緩衝液(pH 8.0)或含有500mM精胺酸之PBS緩衝液pH 8.0平衡之NiNTA樹脂(Qiagen)以固定化金屬親和層析(IMAC)純化6xHis標記蛋白質。以至多4ml/min裝載可溶組分(產生「流經溶離份」)。在裝載於管柱上之後，用60ml含有10mM NaCl之20mM磷酸鉀緩衝液(pH 8.0)以4ml/min之速率洗滌管柱，產生「洗滌溶離份1號」。進行使用相同緩衝液+10mM咪唑之第二洗滌，產生「洗滌溶離份2號」。使用含有200或/及500mM咪唑之相同緩衝液進行溶離。
藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析來自溶離份之樣品。相對於5公升含有10mM NaCl之20mM磷酸鉀緩衝液(pH值8.0)透析含有蛋白質之樣品。使用勞立法測定蛋白質濃度。
將在搖瓶(實例3)或醱酵槽(實例5)中之誘導之後獲得的各菌團再懸浮於30ml PBS緩衝液+500mM精胺酸pH 8.0及Roche COMPLETE(美國註冊商標)蛋白酶抑制劑混合液(1錠/50ml緩衝液)中。或者，將醱酵細胞漿料(約7g)再懸浮於90ml含有500mM精胺酸pH 8.0及Roche
COMPLETE(美國註冊商標)蛋白酶抑制劑混合液(1錠/50ml緩衝液)之PBS緩衝液中。
藉由2×或3×French Press提取(20 000psi)進行細胞溶解且藉由在23 700g、4℃下之30分鐘離心進行澄清。收集上清液且在0.22μm上過濾。使用XK16管柱及80ml預先藉由PBS緩衝液+500mM精胺酸pH 8.0平衡之NiNTA樹脂(Qiagen)以固定化金屬親和層析(IMAC)純化6xHis標記蛋白質。以至多4ml/min裝載可溶組分(產生「流經溶離份」)。在裝載於管柱上之後，用相同緩衝液洗滌管柱，隨後用含有10mM NaCl之20mM磷酸鉀緩衝液(pH 8.0)以4-6ml/min之速率洗滌，產生「洗滌溶離份1號」。進行使用相同緩衝液+10mM咪唑之第二洗滌，產生「洗滌溶離份2號」。使用相同緩衝液+200mM咪唑或500mM咪唑進行溶離。在其他溶離小瓶中，添加5mM EDTA最終濃縮物。
藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析來自溶離份之樣品。相對於5公升含有10mM NaCl及5mM EDTA之20mM磷酸鉀緩衝液(pH 8.0)透析含有蛋白質之樣品。使用勞立法測定蛋白質濃度。
此方案可用於其他6xHis標記蛋白質。
可使用以下醱酵程序：
工作種子為燒瓶生長之大腸桿菌BLR(DE3)或BLR(DE3)衍生之菌株之冷凍等分試樣，其藉由含有編碼特異性候選抗原重組蛋白質構築體之序列的pET26b衍生物轉型。
自冷凍儲存倉取出工作種子(WS)，解凍且用於接種含有預培養基之錐形瓶。在層流(LAF)罩或生物安全櫃(BSC)下無菌操作種子及燒瓶培養物。預培養燒瓶通常在30℃至37℃之間在200RPM攪拌速度下
持續培育達到650nm處之光密度(OD650nm)為1.0至3.0之間時的所需時間(通常在4至6小時之間)。
藉由就地清洗(Clean-In-Place)，接著藉由自動化蒸汽殺菌工序來準備20L醱酵槽。將起始培養基在無菌下轉移至醱酵槽中。取填充NH4OH 25%之瓶子在無菌下連接到醱酵槽，用於自動pH控制。藉由添加NH4OH溶液將起始培養基之初始pH調整至目標pH。使用注射器經由頂板中之隔片添加經照射消泡劑。取填充進料培養基之瓶子在無菌下連接到醱酵槽。藉由pO2-級聯(控制溶解氧)或預程式化進料曲線控制進料添加。藉由pO2-級聯或預程式化攪拌曲線控制攪拌。
初始醱酵槽參數通常如下：
‧溫度：28℃-32℃
‧壓力：0.5巴(7psi)
‧氣流速率：2VVM(容器體積/分鐘)
‧pH：藉由添加NH4OH 25%調整至6.8。
採用此預先培養物之等分試樣(通常在5ml-50ml之間)經由醱酵槽頂板上之隔片的注射器添加，來接種起始醱酵槽培養基。醱酵培養之各期為：
‧分批期：使用碳源在起始培養基中積聚生物質。
‧補料分批期：根據pO2-級聯控制或預程式化進料曲線引入補料培養基。在補料培養基中之碳源上繼續生物質積聚。
‧誘導期：藉由添加IPTG溶液至醱酵槽中之培養物誘導重組蛋白質抗原之表現。
在收穫時，培養物通常收集於1L離心瓶中且經離心以將固體離心塊(細胞漿料)溶離份與液體上清液溶離份分離。丟棄上清液，且記錄細胞濕重(固體離心塊)且將細胞漿料袋儲存於-20℃下。
亦可使用以下程序：
使用大腸桿菌菌株之冷凍種子培養物製備各標準預先培養物。此等菌株為經含有編碼待評估之特定構築體之序列之pET26b衍生物轉型的BLR(DE3)菌株。
將種子培養物解凍至室溫且400μl用於接種含有400ml預先培養基之2公升錐形瓶(修改自Zabriskie等人(J.Ind.Microbiol.2：87-95(1987))。
隨後在37℃(±1℃)及200rpm下培育接種之燒瓶。在培育6小時之後停止預先培養。在此步驟處，650nm處之光學密度(OD650nm)為約2。預先培養物用於在一旦停止培養時接種醱酵槽中之培養基。
使用20公升醱酵槽(Biolafitte)。將9公升分批期培養基無菌轉移至醱酵槽中。藉由添加鹼將培養基之pH重新調整至6.8。亦將1ml非經稀釋、經照射之消泡劑(SAG 471)添加至醱酵槽中。隨後在接種之前設定溫度(28℃)、排出壓力(0.5巴)、通氣速率(20公升噴射空氣/分鐘)及初始攪拌速度(300rpm)。此等條件下之溶解氧含量為100%。排出壓力及通氣速率在醱酵期間維持於恆定水準。
藉由添加等效10ml OD650nm=2之預先培養物(如上文實例2中所述製備)遵循下式達成接種：
在分批期(0-15h)期間，將溫度維持於28℃。將溶解氧含量設定於20%。藉由在溶解氧(DO)下降到低於20%時增加攪拌調節溶解氧含量。葡萄糖耗盡導致DO之增加及伴隨的攪拌減少。
當葡萄糖耗盡時，基於增加到7.0以上之pH信號開始進給速率。
自此點向前，藉由氧需求控制進給速率，當溶解氧傾向於下降至低於20%設定點時增加流速。在此步驟處，將攪拌速度維持於900rpm。
在補料分批期期間(在誘導之前)，藉由添加鹼將pH維持於6.8，將溫度調節於30℃。
兩個策略應用於產生蛋白質：
當在通常在培養40小時之後達到的80±5之光學密度下以1mM IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導培養物時應用「高細胞密度誘導」(HCDI)。將溫度維持於28℃且在900rpm之恆定攪拌速度之情況下仍藉由氧需求控制進給速率。
「低細胞密度誘導」(LCDI)方法意謂在通常在培養24小時之後達到的40±5之光學密度下之誘導。將溫度降低至30℃且應用0.5ml/min之恆定進給速率。隨後將1mM IPTG添加至培養物中。在此步驟處，藉由控制攪拌速率將DO含量維持於20%。
在誘導期(72小時)結束時，藉由離心(6,500xg，4℃，持續1小時)收集細胞漿料，且儲存於-20℃下。
圖1及圖2說明在HCDI及LCDI方法之情況下之典型醱酵概況及在20L規模補料分批醱酵期間監測之參數。
表4闡述在醱酵槽中評估之構築體及關於各構築體獲得之UspA2產量。
His=組胺酸
圖3以圖形形式描繪來自醱酵槽中評估之構築體的表4中之UspA2產量。
在此圖中，UspA2產量受存在於構築體中之組胺酸殘基影響。(p<0.05，單因素，三層次，II型方差分析)。觀測到在組胺酸殘基數目與UspA2醱酵產量之間的正相關性，在補料分批醱酵中在0與6個殘基之間具有高於400%之產量增加。
亦觀測到一個添加至半螺旋模型之組胺酸殘基(MC-003構築體)產生約1g/l蛋白質之UspA2產量。
分析型超速離心用於藉由量測分子回應於離心力移動之速率測定蛋白質樣品內之不同物質在溶液中之均質性及粒度分佈。此係基於藉由沈降速度實驗獲得之不同物質之沈降係數的計算，其取決於該等物質之分子形狀及質量。
以下蛋白質樣品於Beckman-Coulter ProteomeLab XL-1分析型超速離心機中在AN-60Ti轉子已平衡至15℃之後以28 000RPM旋轉。
a. MC-005批次BMP53，675μg/ml，於20mM NaPO4，10mM NaCl，pH 8,0中
b. MC-001批次BMP13，545μg/ml，於20mM NaPO4，10mM NaCl，pH 8,0中
c. MC-001批次BMP14，545μg/ml，於20mM NaPO4，10mM NaCl，pH 8,0中
d. MC-001批次BMP54，445μg/ml，於20mM NaPO4，10mM NaCl，pH 8,0中
e. MC-007批次BMP70，510μg/ml，於20mM NaPO4，10mM
NaCl，pH 8,0中
為進行資料收集，每5分鐘在280nm下記錄133至325次掃描。
使用程式SEDFIT(可經由美國國家衛生研究院獲得)進行資料分析以測定C(S)分佈。C(S)分佈為巨分子混合物中由沈降係數分離之不同組分之相對強度之表示，沈降係數為分子尺寸及構形之函數。藉由SEDNTERP軟體自蛋白質之胺基酸序列在15℃下測定蛋白質之部分比容積。SEDNTERP(SEDNTERP係經由位於新罕布什爾大學(University of New Hampshire)之生物分子相互作用技術中心(Biomolecular Interaction Technologies Center)發佈及支持)亦用於測定緩衝液在15℃下之黏度及密度。
藉由將整體分佈之總曲線下面積視為100%樣品且藉由計算由每一物質之作用表示的此總面積之百分比來測定所有物質之相對豐度。C(S)分佈曲線(濃度相對於沈降係數)已用於該計算，考慮到其為相比於C(M)分佈(濃度相對於分子量)對於原始資料之較好表示。
不同純化構築體之分析型超速離心使得觀測到當在純化之前的細胞溶解期間添加500mM L-精胺酸時，具有C末端his標籤之UspA2△螺旋、UspA2 ½螺旋及UspA2完全螺旋主要以三聚體形式存在於溶液中(圖4、圖5、圖7及圖8)。
當在細胞溶解期間未添加L-精胺酸時，已對於UspA2 ½螺旋觀測到異質粒度分佈。觀測到兩個主要種群。不可能在此蛋白質製備之情況下證實藉由AUC(分析型超速離心)偵測之物質之分子量，因為需要自均質樣品計算對分子量評估為至關重要的摩擦比。然而，基於沈降係數，似乎無觀測之物質對應於其他樣品中觀測之三聚體。
圖4說明藉由沈降速度分析型超速離心測定之純化MC-005之分子量分佈。發現大多數蛋白質呈三聚體形式，以及較小比例的可對應於三聚體之二聚體之較高分子量寡聚物。
圖5說明藉由沈降速度分析型超速離心測定之純化MC-001之分子量分佈。發現大多數蛋白質呈三聚體形式。
圖6說明藉由沈降速度分析型超速離心測定之純化MC-001之分子量分佈。樣品呈現多種物質且為高度多分散的。偵測之主要物質之沈降係數不對應於通常在其他批次中偵測之三聚體中之一者。
圖7說明藉由沈降速度分析型超速離心測定之純化MC-001之分子量分佈。發現大多數蛋白質呈三聚體形式。
圖8說明藉由沈降速度分析型超速離心測定之純化MC-007之分子量分佈。發現大多數蛋白質呈三聚體形式。
圓二色性(CD)用於藉由量測由於結構不對稱性所致之左旋偏振光與右旋偏振光之吸收差異來測定蛋白質之二級結構組成。無論蛋白質展現β-片層、α-螺旋或無規線圈結構，遠紫外線區(190-250nm)中之CD光譜之形狀及量值均不同。給定蛋白質樣品中之各二級結構類型之相對豐度可藉由與參考光譜比較來計算。
遠紫外線光譜係使用0.01cm(178至250nm)之光學路徑，以Jasco J-720分光偏振計上之1nm解析度及帶寬測量。藉由Peltier恆溫調節RTE-111單元塊將細胞溫度維持於不同溫度。在量測期間維持10L/min之氮氣流。
在20mM NaPO4，10mM NaCl，pH 8,0緩衝液中將以下蛋白質構築體之濃度調節至400μg/ml。
a. MC-005批次BMP53，於20mM NaPO4，10mM NaCl，pH 8,0中
b. MC-001批次BMP13，於20mM NaPO4，10mM NaCl，pH 8,0中
c. MC-001批次BMP14，於20mM NaPO4，10mM NaCl，pH 8,0
中
d. MC-001批次BMP54，於20mM NaPO4，10mM NaCl，pH 8,0中
e. MC-007批次BMP70，於20mM NaPO4，10mM NaCl，pH 8,0中
已使用以下算法進行二級結構之計算：
Selcon 3(Sreerama及Woody,Anal.Biochem.(1993),209,32；Sreerama及Woody,Biochemistry,33,10022-25(1994)；Sreerama等人Protein Science,8,370-380(1999)；Johnson W.C.Jr.,Proteins：Str.Func.Genet.35,307-312(1999))
CDSSTR(Johnson W.C.Proteins：Struc.Func.Genet.35,307-312(1999)由Sreerama.N.(Anal.Biochem.,287,252(2000)修改)。
顯示之結果為藉由兩種算法計算之百分比之平均值且經受5%誤差容限。
醱酵槽表現蛋白質之二級結構計算之結果顯示於表5中，考慮5%誤差容限。
計算結果與光譜之形狀及視覺分析相容，其中螺旋形含量在208及220nm之強度最小值的情況下增加。蛋白質包含高比例之螺旋形結構，且存在β結構。
疊加於圖9上之光譜未在構築體之間顯示顯著形狀差異。MC-005螺旋之光譜顯示較低強度，其可解釋與不存在C末端螺旋一致之較低α結構。
圖9說明出示蛋白質二級結構之示度的UspA2構築體MC-001、MC-005及MC007之遠紫外線圓二色性光譜。光譜之疊加明顯地顯示含有半C末端螺旋及完全C末端螺旋之構築體在其二級結構中物可偵測差異，而無螺旋之構築體產生具有強度差異之光譜，該強度差異可解釋不同二級結構含量。
在熱去摺疊期間在不同溫度下之遠紫外線CD光譜量測表明MC-005比MC-007較不熱穩定。MC-005在33℃下觀測之光譜與未摺疊蛋白質之典型光譜類似。對於MC-007構築體，即使在33℃下觀測到二級結構之部分損失，完全去摺疊仍似乎出現在35℃與37℃之間。此可為含有構築體MC-007之完全螺旋之較高熱穩定性的指示。
圖10說明在MC-005(UspA2△螺旋+6His)之熱去摺疊期間藉由圓二色性監測之二級結構。光譜之視覺分析明顯地顯示蛋白質在33℃下失去其大部分二級結構。
圖11說明在MC-007(UspA2完全螺旋+6His)之熱去摺疊期間藉由圓二色性監測之二級結構。光譜之視覺分析顯示二級結構之損失相比於無螺旋之構築體較慢。結構變化在加熱至33℃時可偵測，但完全去摺疊似乎出現在35℃與37℃之間。
比較不同UspA2構築體之熱躍遷以評估C末端螺旋修飾對蛋白質之熱穩定性之作用。
在來自MicroCal(GE Healthcare的一部分)之VP-DSC上進行分析。將緩衝液20mM NaPO4，10mM NaCl，5mM EDTA，pH 8用作參考物且從掃描中減去。蛋白質在初始溫度下平衡15分鐘，隨後以90℃/h之加熱速率自10℃至60℃進行緩慢升溫DSC掃描。
在MC-001及MC-007構築體中偵測到兩次躍遷且在MC-005中僅
偵測到一次。不同構築體之躍遷(或Tm)值可發現於表6中。
儘管三種蛋白質之較低Tm為約32℃，但主要差異為第二Tm之值。相比於Tm為34.5℃之半螺旋(MC-001)，含有完全螺旋之構築體(MC-007)具有在37.5℃下之較高Tm。
已表明對於MC-001及MC-007，約32℃之第一Tm為可逆的，而較高Tm為不可逆的。對於MC-005，偵測之唯一Tm為不可逆的。
此可為含有構築體MC-007之完全螺旋之較高熱穩定性的指示。
藉由使用CHCl3/MeOH/H2O系統之蛋白質沈澱製備UspA2蛋白質樣品。蛋白質離心塊在艾本德管(eppendorf tube)底部離心，隨後在氮氣下溫和地乾燥。接著將乾燥離心塊溶解於2μl純甲酸中，隨後用3μl超純水及5μl芥子酸稀釋。用作MALDI-TOF(基質輔助雷射脫附/電離繼之以飛行時間光譜分析儀)分析之基質之芥子酸係製備於補充有TFA 0.1%最終濃度之50% CH3CN/50% H2O中。
將1μl樣品+基質混合物點至Bruker 384研磨MALDI靶材上且使其乾燥以在室溫及常壓下結晶(乾滴法)。
在Bruker Ultraflex 2 MALDI-TOF質譜儀(Bruker Daltonics,Bremen,Germany)上以正電離及線性模式進行UspA2質譜分析。藉由smartbeam雷射照射共結晶於芥子酸基質中之蛋白質樣品。經10.000-100.000Da質量範圍以25kVolt之加速電壓進行完整UspA2蛋白質之質量量測。微調雷射衰減以獲得儘可能最好的蛋白質信號且避免任何分
裂以及背景過電離現象。在與同源基質密切之外部方法中且使用商業Bruker Protein Calibration混合物2，藉由以下校正器上之精確量測值進行質譜儀之校準：蛋白A在m/z 22307Da處之[M+2H]2+(在電離期間添加兩個H+離子至蛋白質之後藉由MS偵測器量測之質量)物質，胰蛋白酶原在m/z 23982Da處之[M+H]+物質，蛋白A在m/z 44613Da處之[M+H]+物質及牛白蛋白在m/z 66431Da°處之[M+H]+物質。呈現之各光譜由500個個別脈衝值之總和產生。
分析以下樣品：
在搖瓶中產生的N末端具有MQAK胺基酸(SEQ ID NO：85)之MC-001構築體，批次opt-01，在搖瓶中產生的N末端具有MAK胺基酸之MC-011構築體，批次BMP37。
在表7及圖12中，如藉由量測之57427Da之分子量所示，相比於57565Da之預期質量，N末端具有MQAK胺基酸(SEQ ID NO：85)之MC-001蛋白質已顯示至少部分去甲硫胺醯基化。57620Da之另一峰值可表示完全非去甲硫胺醯基化蛋白質、N-乙醯化蛋白質或另一經修飾蛋白質群體。
圖12說明MC-001批次opt-01之MALDI光譜。在57427Da處觀測之質量可與去甲硫胺醯基化蛋白質一致，而在57620Da處之峰值可對應於完全蛋白質。
如表7及圖13中所示，相比於基於完整胺基酸序列之預期質量的57437Da，N末端具有MAK胺基酸之MC-011蛋白質在MALDI-MS中獲得主要群體，其可對應於具有57265Da之質量的去甲硫胺醯基化蛋白質。+186Da及+366Da處之兩個其他峰值不接近任何預期轉譯後修飾，因此其無法藉由此實驗鑑別。
表7：如藉由MALDI-MS量測的兩個UspA2構築體之分子量。兩個構築體均具有比自胺基酸序列預期之質量低的主要量測質量。藉由兩個
為了評估N末端區域之最佳化(緊鄰N末端甲硫胺酸之胺基酸序列之最佳化)是否導致蛋白質之去甲硫胺醯基化，已於在其N末端上攜載MAK胺基酸之MC-011構築體上進行N末端定序。
藉由SDS PAGE在來自Invitrogen之Novex 4%-20%聚丙烯醯胺凝膠上分離蛋白質，隨後轉移至Problot PVDF(聚偏氟乙烯)(Bio-Rad)膜上。藉由胺黑對膜染色。隨後切割相關條帶且根據製造商之協定使用Applied Biosystems Procise測序系統進行分析。進行12個循環的埃德曼氏降解。
獲得的N末端胺基酸序列為AKNDITLEDLP(SEQ ID NO：86)，其對應於在初始甲硫胺酸之後兩個胺基酸數目處起始之蛋白質的N末端。此指示成熟蛋白質大部分經去甲硫胺醯基化。
在皮氏培養皿(Petri dish)上於37℃+5% CO2下培養卡他莫拉菌隔夜。將細菌轉移於12ml HBSS-BSA(漢克氏緩衝鹽溶液(Hank's Buffered Salt Solution)以及牛血清白蛋白)0.1%緩衝液中以獲得0.650之OD620。在56℃下加熱血清樣品45分鐘以使內源性補體不活化。將血清於SBA緩衝液(HBSS-BSA 0.1%)中之連續兩倍稀釋液添加於96孔圓底微量滴定盤(25微升/孔)中。隨後，在各孔中添加50μl SBA緩衝液。隨後將25μl以4 10^4cfu/ml之卡他莫拉菌菌株添加至含有血清之
孔中且在室溫下培育15分鐘。最後，添加25μl在HBSS-BSA 0.1%中稀釋至1/8之新解凍嬰兒兔補體以達到125μl之最終體積。在37℃下在迴旋式震盪(210rpm)之情況下培育盤1小時。藉由將微量盤放置於冰上至少5分鐘停止反應。
在均質化之後，將懸浮液(細菌、血清、補體及緩衝液之混合物，體積為125μl，如前文段落中所論述)之各種稀釋液添加至巧克力瓊脂盤上且在37℃以及5% CO2下培育24小時且計數卡他莫拉菌菌落。
將無血清樣品之8個孔用作細菌對照組以測定每孔之卡他莫拉菌菌落數目。測定對照孔之CFU(菌落形成單位)平均數目且用於計算各血清樣品之殺傷活性。殺菌效價表現於誘導50%殺傷之血清之互逆稀釋度。
在相對於20種不同卡他莫拉菌菌株的上文描述之殺菌分析中測試相對於MC-001在小鼠、天竺鼠及家兔中產生之抗-UspA2抗血清，該等菌株分離自各國(美國、芬蘭、荷蘭、挪威、瑞典)之各種組織(血液、痰、鼻子、中耳流體)。
如下文所示，無論任何由測試菌株表現之UspA2之同源性百分比，抗-UspA2抗體均能夠誘發卡他莫拉菌之交叉殺菌殺傷。此外，殺菌活性亦相對於僅表現UspA1或嵌合蛋白質UspA2H之菌株顯示。正如所料，相對於UspA1及UspA2雙基因剔除突變體，未量測到殺菌抗體效價或僅量測到微弱殺菌抗體效價。
表8：抗-UspA2 MC-001抗體之交叉殺菌活性產生於小鼠、天竺鼠及家兔中。1+2 KO為雙基因剔除，UspA1及UspA2。1KO為僅UspA1基因剔除。MEF(AOM)=中耳流體(急性中耳炎)。分離來源欄中之「/」=不瞭解分離來源。
*使用軟體GapL/ClustalX相對於ATCC25238 UspA2片段AA30-540測定.
5週齡雌性Balb/c小鼠(n=8/5組)藉由肌肉內途徑在第0天、第14天及第28天經50μl含有10μg在AS02V內調配之UspA2構築體MC-001的疫苗免疫。小鼠在第42天藉由5.105CFU之各種卡他莫拉菌菌株鼻內攻毒。在攻毒後0、3及6小時收集之肺中計數細菌。使用Dunnet測試分析組之間的差異。
如表10中概述，UspA2構築體MC-001相對於同源及異源菌株二者誘導顯著保護，該等菌株包括表現UspA1但不表現UspA2之菌株43617及表現嵌合蛋白質UspA2H(由來自UspA1之N末端序列及來自UspA2之C末端序列構成)之BBH18菌株。
*使用GapL/ClustalX軟體相對於ATCC25238 UspA2片段AA 30-540測定.
粗體之p值為顯著的(p<0.05)
在皮氏培養皿上在37℃+5% CO2下培養卡他莫拉菌25238隔夜。將細菌轉移於12ml HBSS-BSA 0.1%緩衝液中以獲得0.650之OD620。在56℃下加熱血清樣品45分鐘以使內源性補體不活化。將血清於SBA緩衝液(HBSS-BSA 0.1%)中之連續兩倍稀釋液添加於96孔圓底微量滴定盤(25微升/孔)中。隨後，在各孔中添加50μl SBA緩衝液。隨後將25μl以4 10^4cfu/ml之卡他莫拉菌菌株添加至含有血清之孔中且在室溫下培育15分鐘。最後，添加25μl在HBSS-BSA 0.1%中稀釋至1/8之新解凍嬰兒兔補體以達到125μl之最終體積。在37℃下在迴旋式震盪(210rpm)之情況下培育盤1小時。藉由將微量盤放置於冰上至少5分鐘停止反應。在均質化之後，將懸浮液之各種稀釋液添加至巧克力瓊脂盤上且在37℃以及5% CO2下培育24小時且計數莫拉菌菌落。將無血清樣品之8個孔用作細菌對照組以測定每孔之卡他莫拉菌菌落數目。測定對照孔之平均CFU數目且用於計算各血清樣品之殺傷活性。殺菌效價表現於誘導50%殺傷之血清之互逆稀釋度。
在殺菌分析中使用上文所述之方案相對於25238卡他莫拉菌同源
菌株測試藉由UspA2構築體MC-001或MC-007在小鼠中產生之抗-UspA2抗血清。
如表11中所示，MC-007 UspA2構築體引起高殺菌反應，與藉由MC-001誘導之反應類似。
5週齡雌性Balb/c小鼠(每組8隻小鼠，每時間點最大5組)藉由肌肉內途徑在第0天、第14天及第28天經50μl疫苗免疫，該疫苗含有10μg在AS02V內調配之UspA2構築體MC-001或在AS02V內調配之MC-007。小鼠在第42天藉由5.105CFU卡他莫拉菌菌株ATCC(美國註冊商標)25238TM鼻內攻毒。小鼠經10μg來自卡他莫拉菌菌株ATCC(美國註冊商標)25238TM之經殺滅全細胞(作為陽性對照)(圖14中之卡他莫拉菌WC 25238)或經單獨的AS02V(作為陰性對照)免疫。在攻毒後0、3及6小時收集之肺中計數細菌。使用Dunnet測試分析組之間的差異。
如圖14中所示，兩種UspA2構築體相對於ATCC(美國註冊商標)菌株25238TM均為類似地保護性的。
25隻雌性Balb/c小鼠之組藉由肌肉內(IM)途徑在第0天、第14天及第28天經50μl以下調配物免疫：
-MC-009(1μg)AlPO4(1000μg/ml)
-MC-009(1μg)AS04C(AlPO4/MPL 100/100/ml)
-MC-009(1μg)AS01E(QS21/MPL 50/50/ml)
使用以下方案在第28天(PII)及第42天(PIII)收集之個體血清中測定抗-IgG水準：
盤在4℃下塗佈每孔100μl的碳酸鹽緩衝液pH 9.6中4μg/ml之UspA2構築體MC-009隔夜。藉由NaCl 0.09% TWEEN(美國註冊商標)20(聚山梨醇酯20)0.05%洗滌盤三次。在洗滌之後，將連續兩倍稀釋之血清添加至微孔中之PBS TWEEN(美國註冊商標)20 0.05%中。將盤在震盪之情況下置放在室溫下30分鐘。在洗滌之後，添加共軛至過氧化物酶之抗-小鼠IgG抗體(Jackson 115-035-003)(100微升/孔)，且將盤在震盪之情況下置放在室溫下30分鐘。如上洗滌盤且持續15分鐘於黑暗中將新材料之溶液(4mg OPDA Sigma P8787)及5μl H2O2，於10ml檸檬酸鹽0.1M PH(pH)4.5中)添加至各孔(100微升/孔)中。藉由添加50μl HCl 1N停止反應且讀取在490nm處之吸光度(620nm用於參考過濾器)。
藉由4-參數方法使用SOFTMAX(美國註冊商標)Pro軟體計算效價。
如圖15中所示，UspA2在各佐劑調配物之情況下誘導高抗體水準。
使用以下方案相對於表現同源全長UspA2之卡他莫拉菌菌株(ATCC(美國註冊商標)25238TM)進行殺菌分析：在皮氏培養皿上在37℃+5% CO2下培養卡他莫拉菌菌株ATCC(美國註冊商標)25238TM隔夜。將細菌轉移於10ml BHi(心臟浸液)中以獲得0.650之OD620。在56℃下加熱血清樣品45分鐘以使內源性補體不活化。將血清於SBA緩衝液
(HBSS-BSA 0.1%)中之連續兩倍稀釋液添加於96孔圓底微量滴定盤(25微升/孔)中。隨後，在各孔中添加50μl SBA緩衝液。隨後將25μl以4 10^3cfu/ml之卡他莫拉菌菌株25238TM添加至含有血清之孔中且在室溫下培育15分鐘。最後，添加25μl在HBSS-BSA 0.1%中稀釋至1/8之新解凍嬰兒兔補體以達到125μl之最終體積。在37℃下在迴旋式震盪(210rpm)之情況下培育盤1小時。藉由將微量盤放置於冰上至少5分鐘停止反應。隨後將盤之各孔之20μl等分試樣轉移至96孔平底微量盤之對應孔中且將50μl Mueller Hinton培養液-0.9%瓊脂添加至各孔中。添加50μl PBS 0.9%瓊脂作為第二層。在37℃以及5% CO2下3小時之後，在25℃下培育盤隔夜，使用自動化影像分析系統(KS 400,Zeiss,Oberkochen,Germany)計數莫拉菌菌落。將無血清樣品之8個孔用作細菌對照組以測定每孔之莫拉菌數目。測定對照孔之平均CFU數目且用於計算各血清樣品之殺傷活性。殺菌效價表現於誘導50%殺傷之血清之互逆稀釋度。
圖16說明相對於同源菌株藉由UspA2誘導之殺菌效價。在此實驗中，UspA2對於各佐劑調配物誘導高水準之殺菌抗體。血清測試於PIII；測試5種血清樣品之5個集合體。
25隻雌性Balb/c小鼠之組藉由肌肉內(IM)途徑在第0天、第14天及第28天經50μl以下調配物免疫：
- UspA2構築體MC-009(1μg)AlPO4
- UspA2構築體MC-009(1μg)AS04C
- UspA2構築體MC-009(1μg)AS01E
- UspA2-PD-PEPilA(UspA2構築體MC-009，PEPilA構築體LVL-735)AlPO4(UspA2、PD及PEPilA各1μg；1000mg/ml AlPO4)
- UspA2-PD-PEPilA(UspA2構築體MC-009，PEPilA構築體LVL-735)AS04C AlPO4(UspA2、PD及PEPilA各1μg；100/100/ml AlPO4/MPL)
- UspA2-PD-PEPilA(UspA2構築體MC-009，PEPilA構築體LVL-735)AS01E(UspA2、PD及PEPilA各1μg；50/50/ml QS21/MPL)
使用以下方案在第28天及第42天收集之個體血清中測定抗-UspA2 IgG水準。
盤在4℃下塗佈每孔100μl碳酸鹽緩衝液pH 9.6中4μg/ml之UspA2構築體MC-009隔夜。藉由NaCl 0.09% TWEEN(美國註冊商標)20(聚山梨醇酯20)0.05%洗滌盤三次。在洗滌之後，將連續兩倍稀釋之血清添加至微孔中之PBS TWEEN(美國註冊商標)20 0.05%中。將盤在震盪之情況下置放在室溫下30分鐘。在洗滌之後，添加共軛至過氧化物酶之抗-小鼠IgG抗體(Jackson 115-035-003)(100微升/孔)，且將盤在震盪之情況下置放在室溫下30分鐘。如上洗滌盤且持續15分鐘於黑暗中將新材料之溶液(4mg OPDA Sigma P8787)及5μl H2O2，於10ml檸檬酸鹽0.1M PH(pH)4.5中)添加至各孔(100微升/孔)中。藉由添加50μl HCl 1N停止反應且讀取在490nm處之吸光度(620nm用於參考過濾器)。藉由4-參數方法使用SOFTMAX(美國註冊商標)Pro軟體計算效價。
盤在4℃下塗佈每孔100μl的碳酸鹽緩衝液pH 9.6中之2μg/ml UspA2隔夜。用NaCl 0.09% TWEEN(美國註冊商標)0.05%洗滌盤三次。在洗滌之後，將連續兩倍稀釋之血清添加至微孔中之PBS TWEEN(美國註冊商標)20 0.05%中。將盤在震盪之情況下置放在室溫下30分鐘。在洗滌之後，添加共軛至過氧化物酶之抗-小鼠IgG抗體
(Jackson 115-035-003)(100微升/孔)，且將盤在震盪之情況下置放在室溫下30分鐘。如上洗滌盤且持續15分鐘於黑暗中將新材料之溶液(4mg OPDA及5μl H2O2，於10ml檸檬酸鹽0.1M PH 4.5中)添加至各孔(100微升/孔)中。藉由添加50μl HCl 1N停止反應且讀取在490nm處之吸光度(620nm用於參考過濾器)。
藉由4-參數方法使用SOFTMAX(美國註冊商標)Pro軟體計算效價。
盤在4℃下塗佈每孔100μl的碳酸鹽緩衝液pH 9.6中之4μg/ml PilA隔夜。用NaCl 0.09% TWEEN(美國註冊商標)0.05%洗滌盤三次。在洗滌之後，將連續兩倍稀釋之血清添加至微孔中之PBS TWEEN(美國註冊商標)20 0.05%中。將盤在震盪之情況下置放在室溫下30分鐘。在洗滌之後，添加共軛至過氧化物酶之抗-小鼠IgG抗體(Jackson 115-035-003)(100微升/孔)，且將盤在震盪之情況下置放在室溫下30分鐘。如上洗滌盤且持續15分鐘於黑暗中將新材料之溶液(4mg OPDA及5μl H2O2，於10ml檸檬酸鹽0.1M PH 4.5中)添加至各孔(100微升/孔)中。藉由添加50μl HCl 1N停止反應且讀取在490nm處之吸光度(620nm用於參考過濾器)。
藉由4-參數方法使用SOFTMAX(美國註冊商標)Pro軟體計算效價。
盤在4℃下塗佈每孔100μl的碳酸鹽緩衝液pH 9.6中之8μg/ml PD隔夜。用NaCl 0.09% TWEEN(美國註冊商標)0.05%洗滌盤三次。在洗滌之後，將連續兩倍稀釋之血清添加至微孔中之PBS TWEEN(美國註冊商標)20 0.05%中。將盤在震盪之情況下置放在室溫下30分鐘。在洗滌之後，添加共軛至過氧化物酶之抗-小鼠IgG抗體(Jackson 115-
035-003)(100微升/孔)，且將盤在震盪之情況下置放在室溫下30分鐘。如上洗滌盤且持續15分鐘於黑暗中將新材料之溶液(4mg OPDA及5μl H2O2，於10ml檸檬酸鹽0.1M PH 4.5中)添加至各孔(100微升/孔)中。藉由添加50μl HCl 1N停止反應且讀取在490nm處之吸光度(620nm用於參考過濾器)。
藉由4-參數方法使用SOFTMAX(美國註冊商標)Pro軟體計算效價。
使用以下方案在第42天收集之彙集血清(5集合體/組)中量測殺菌效價：在皮氏培養皿上在37℃+5% CO2下培養卡他莫拉菌隔夜。將細菌轉移於10ml BHi(心臟浸液)培養基中以獲得0.650之OD620。在56℃下加熱血清樣品45分鐘以使內源性補體不活化。將血清於SBA緩衝液(HBSS-BSA 0.1%)中之連續兩倍稀釋液添加於96孔圓底微量滴定盤(25微升/孔)中。隨後，在各孔中添加50μl SBA緩衝液。隨後將25μl以4 10^3cfu/ml之卡他莫拉菌菌株25238添加至含有血清之孔中且在室溫下培育15分鐘。最後，添加25μl在HBSS-BSA 0.1%中稀釋至1/8之新解凍嬰兒兔補體以達到125μl之最終體積。在37℃下在迴旋式震盪(210rpm)之情況下培育盤1小時。藉由將微量盤放置於冰上至少5分鐘停止反應。隨後將盤之各孔之20μl等分試樣轉移至96孔平底微量盤之對應孔中且將50μl Mueller Hinton培養液-0.9%瓊脂添加至各孔中。添加50μl PBS 0.9%瓊脂作為第二層。在37℃以及5% CO2下3小時之後，在25℃下培育盤隔夜。使用自動化影像分析系統(KS 400,Zeiss,Oberkochen,Germany)計數莫拉菌菌落。將無血清樣品之8個孔用作細菌對照組以測定每孔之莫拉菌數目。測定對照孔之平均CFU數目且用於計算各血清樣品之殺傷活性。殺菌效價表現於誘導50%殺傷之血清
之互逆稀釋度。
相對於表現同源UspA2之卡他莫拉菌菌株25238TM進行殺菌分析。
在AS04C(post III)及AS01E(post II)調配物中觀測到PD及PE-PilA抗原之存在對UspA2 IgG水準之負面影響(圖17)。然而，影響仍有限(2倍抗體減少)且未在殺菌分析得到確認(圖18)。藉由PE-PEPilA-UspA2疫苗相對於PD、PE及PilA在小鼠中誘導之IgG反應分別顯示於圖19、圖20及圖21中。
因此，UspA2在與PD及PE-PilA組合時為免疫原性的。
25隻雌性Balb/c小鼠之組藉由肌肉內(IM)途徑在第0天、第14天及第28天經50μl以下調配物免疫：
- PD-PEPilA(1μg PD及1μg PEPilA構築體LVL-735)AS01E
- UspA2-PD-PEPilA(1μg UspA2構築體MC-009、PD及PEPilA構築體LVL-735)AS01E
在第28天(PII)及第42天(PIII)收集之個體血清中測定PD、PE及PilA之ELISA IgG水準。
盤在4℃下塗佈每孔100μl的碳酸鹽緩衝液pH 9.6中之2μg/ml UspA2隔夜。用NaCl 0.09% TWEEN(美國註冊商標)0.05%洗滌盤三次。在洗滌之後，將連續兩倍稀釋之血清添加至微孔中之PBS TWEEN(美國註冊商標)20 0.05%中。將盤在震盪之情況下置放在室溫下30分鐘。在洗滌之後，添加共軛至過氧化物酶之抗-小鼠IgG抗體(Jackson 115-035-003)(100微升/孔)，且將盤在震盪之情況下置放在室
溫下30分鐘。如上洗滌盤且持續15分鐘於黑暗中將新材料之溶液(4mg OPDA及5μl H2O2，於10ml檸檬酸鹽0.1M PH 4.5中)添加至各孔(100微升/孔)中。藉由添加50μl HCl 1N停止反應且讀取在490nm處之吸光度(620nm用於參考過濾器)。
藉由4-參數方法使用SOFTMAX(美國註冊商標)Pro軟體計算效價。
盤在4℃下塗佈每孔100μl的碳酸鹽緩衝液pH 9.6中之4μg/ml PilA隔夜。用NaCl 0.09% TWEEN(美國註冊商標)0.05%洗滌盤三次。在洗滌之後，將連續兩倍稀釋之血清添加至微孔中之PBS TWEEN(美國註冊商標)20 0.05%中。將盤在震盪之情況下置放在室溫下30分鐘。在洗滌之後，添加共軛至過氧化物酶之抗-小鼠IgG抗體(Jackson 115-035-003)(100微升/孔)，且將盤在震盪之情況下置放在室溫下30分鐘。如上洗滌盤且持續15分鐘於黑暗中將新材料之溶液(4mg OPDA及5μl H2O2，於10ml檸檬酸鹽0.1M PH 4.5中)添加至各孔(100微升/孔)中。藉由添加50μl HCl 1N停止反應且讀取在490nm處之吸光度(620nm用於參考過濾器)。
藉由4-參數方法使用SOFTMAX(美國註冊商標)Pro軟體計算效價。
盤在4℃下塗佈每孔100μl的碳酸鹽緩衝液pH 9.6中之8μg/ml PD隔夜。用NaCl 0.09% TWEEN(美國註冊商標)0.05%洗滌盤三次。在洗滌之後，將連續兩倍稀釋之血清添加至微孔中之PBS TWEEN(美國註冊商標)20 0.05%中。將盤在震盪之情況下置放在室溫下30分鐘。在洗滌之後，添加共軛至過氧化物酶之抗-小鼠IgG抗體(Jackson 115-035-003)(100微升/孔)，且將盤在震盪之情況下置放在室溫下30分
鐘。如上洗滌盤且持續15分鐘於黑暗中將新材料之溶液(4mg OPDA及5μl H2O2，於10ml檸檬酸鹽0.1M PH 4.5中)添加至各孔(100微升/孔)中。藉由添加50μl HCl 1N停止反應且讀取在490nm處之吸光度(620nm用於參考過濾器)。
藉由4-參數方法使用SOFTMAX(美國註冊商標)Pro軟體計算效價。
如圖22、圖23及圖24中所示，未觀測到添加UspA2對AS01E中之PD及PEPilA免疫原性的重大影響。
為了降低在免疫接種旨在預防由於非分型流感嗜血桿菌(NTHi)及卡他莫拉菌(M.cat.)所致之惡化的候選疫苗時於COPD患者之肺中誘導非所需發炎性反應之風險，開發各種動物模型且用於評估此疫苗之安全性。測試之調配物含有三種NTHi抗原(PD、PE及PilA，其中最後兩個合併為PEPilA融合蛋白)、一種卡他莫拉菌抗原(UspA2)及佐劑系統01E(AS01E)。
兩個模型特定專用於評估疫苗之UspA2組分之安全性。
‧目的
此模型旨在評估在疫苗接種時發炎的肺中可能誘導之非所需免疫反應。
‧研究設計
藉由在第0天、第7天及第14天三次鼻內投與25μg熱去活化卡他莫拉菌菌株ATCC(美國註冊商標)25238TM全細胞(表現與疫苗UspA2 100%同源之UspA2)使C57Bl/6小鼠敏化。此處理在肺中誘導血管周及細支氣管周炎症(伴以淋巴樣聚集體之形成)、肺泡炎、局部肺炎、纖
維化及強力卡他莫拉菌菌株全細胞特異性IL-17+ CD4+ T細胞反應，其一起模擬在COPD患者(除了肺氣腫)之肺中觀測之發炎過程。
小鼠隨後在第42天藉由肌肉內途徑接種人類劑量1/10的以下調配物：
- PD 10μg/PEPilA(LVL735構築體，描述於WO2012/139225中)10μg/UspA2(MC009構築體)10μg/AS01E
- PD 10μg/PEPilA(LVL735構築體)10μg/UspA2(MC009構築體)3.3μg/AS01E
- AS01E(陰性對照)
- PBS(陰性對照)
為評估此等調配物對敏化誘導性肺炎之影響：
- 自第43天至第49天每天監測小鼠以察看死亡率及任何表明誘導不良事件之臨床症狀(衰竭、豎毛、駝背位置)。
- 在接種疫苗後第2天、第7天及第14天進行肺之組織學分析(每組及每時間點5隻小鼠)以察看炎症之可能惡化。
- 在接種疫苗後第7天及第14天對收集之肺之集合體評估潛在非所需T細胞反應之誘導(每時間點每組4個集合體且每集合體3隻小鼠之肺)。藉由UspA2肽、熱去活化卡他莫拉菌全細胞(WC)或培養基(作為陰性對照)再刺激肺T細胞隔夜，接著藉由流動式細胞測量術分析CD5、CD4、CD8、IL-17、IL-13、TNFα及IFNγ之表現。
‧結果
- 未報導死亡或不良事件。
- 肺組織學(圖25至圖29)：
○肺中觀測之改變與所有組中之嚴重程度類似且特徵為輕度至中度血管周/細支氣管單核細胞浸潤。
○未觀測到與疫苗接種相關的肺泡炎及/或局部肺炎。
- T細胞反應：
○當藉由WC再刺激時，在肺中量測到強力CD4+ T細胞反應(主要為產生IL-17及TNFα之細胞)，但無關於投與之調配物(單獨疫苗或佐劑或PBS)(圖30至圖33)。觀測到低肺CD8+ T細胞反應或未觀測到該等反應(資料未示出)。
○無論任何組均未藉由UspA2肽再刺激可偵測T細胞反應，表明在接種疫苗後無UspA2特異性反應經起動或增強(資料未示出)。
‧目的
此模型旨在評估在疫苗接種及卡他莫拉菌攻毒時發炎的肺中可能誘導之非所需免疫反應。
‧研究設計
C57Bl/6小鼠依次：
- 藉由在第0天、第7天及第14天三次鼻內投與25μg熱去活化卡他莫拉菌菌株25238 WC(表現與疫苗UspA2 100%同源之UspA2)敏化(與模型1中一樣)。
- 在第42天藉由肌肉內途徑接種人類劑量1/10的以下調配物(與模型1中一樣)：
‧PD(10μg/PEPilA(LVL735構築體)10μg/UspA2(MC009構築體)10μg/AS01E
‧PD 10μg/PEPilA(LVL735構築體)10μg/UspA2(MC009構築體)3.3μg/AS01E
‧AS01E(陰性對照)
‧PBS(陰性對照)
- 藉由一次鼻內投與25μg熱去活化卡他莫拉菌菌株F10 WC(表現與疫苗UspA2共有53%同源性之UspA2)或藉由一次鼻內投與作為對
照之PBS進行攻毒，二者均在第56天投與。攻毒菌株不同於敏化菌株以模擬由於新獲得之卡他莫拉菌菌株經歷新惡化之COPD患者中觀測到的情況。
為評估疫苗接種及攻毒對敏化誘導性肺炎之影響：
- 自第43天至第63天每天監測小鼠以察看死亡率及任何表明誘導不良事件之臨床症狀(衰竭、豎毛、駝背位置)。
- 在攻毒後第7天及第14天對收集之肺之集合體評估潛在非所需T細胞反應之誘導(每時間點每組4個集合體且每集合體3隻小鼠之肺)。藉由UspA2肽、熱去活化卡他莫拉菌F10 WC或培養基(作為陰性對照)再刺激肺T細胞隔夜，接著藉由流動式細胞測量術分析CD5、CD4、CD8、IL-17、IL-13、TNFα及IFNγ之表現。
‧結果
- 未報導死亡或不良事件。
- T細胞反應：
○當藉由F10 WC再刺激時，在肺中量測到強力攻毒後CD4+ T細胞反應(主要為產生細胞之IL-17及TNFα)，無關於投與之調配物(單獨疫苗或佐劑或PBS)(圖34至圖37)。並非出人意料地，此等反應在藉由不活化細菌攻毒之小鼠中比在藉由PBS刺激之小鼠中高。無論任何攻毒，觀測到低CD8+ T細胞反應或未觀測到該等反應(資料未示出)。
○無論任何組均未藉由UspA2肽再刺激可偵測T細胞反應，表明在攻毒後無UspA2特異性反應經起動或增強(資料未示出)。
測試之PD/PEPilA/UspA2/AS01E調配物且更特定言之此等疫苗之UspA2組分在小鼠卡他莫拉菌肺炎模型中顯示為安全的。
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<213> 卡他莫拉菌
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<212> PRT
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<220>
<223> MC-010構築體之蛋白質序列
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<212> DNA
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<212> PRT
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<220>
<223> MC-011構築體之蛋白質序列
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<212> DNA
<213> 卡他莫拉菌
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物序列
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 82
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 83
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 84
<210> 85
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MC-001之N末端胺基酸序列
<400> 85
<210> 86
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N末端胺基酸序列
<400> 86
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<211> 1542
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MC-003構築體之DNA序列
<400> 87
<210> 88
<211> 513
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MC-003構築體之蛋白質序列
<400> 88
Claims (55)
- 一種式I蛋白質，A-(R1)m-(B)n (式I)其中：A為來自卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)之UspA2或其免疫原性片段；R1為胺基酸；m為0或2；B為組胺酸；及n為0、1、2、3、4、5或6。
- 如請求項1之蛋白質，其中A為UspA2之免疫原性片段。
- 如請求項1或2之蛋白質，其中A為來自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：38中任一者之UspA2。
- 如請求項1或2之蛋白質，其中m為2。
- 如請求項1或2之蛋白質，其中m為0。
- 如請求項1或2之蛋白質，其中(R1)m為AS(丙胺酸絲胺酸)。
- 如請求項1或2之蛋白質，其中n係選自由1、2及6組成之群。
- 如請求項1或2之蛋白質，其中n為2。
- 如請求項1或2之蛋白質，其於胺基末端進一步包含甲硫胺酸。
- 如請求項1或2之蛋白質，其中n為0。
- 如請求項1或2之蛋白質，其中A為UspA2，其中UspA2在整個長度上與SEQ ID NO：1具有至少63%、66%、70%、72%、74%、75%、77%、80%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。
- 如請求項1或2之蛋白質，其中A為選自由以下組成之群的UspA2 之免疫原性片段：SEQ ID NO.1之胺基酸30-540(SEQ ID NO：39)、SEQ ID NO：1之胺基酸31-540(SEQ ID NO：40)、SEQ ID NO：1之胺基酸30-519(SEQ ID NO：41)、SEQ ID NO：1之胺基酸30-564(SEQ ID NO：42)及SEQ ID NO：1之胺基酸31-564(SEQ ID NO：43)。
- 如請求項1或2之蛋白質，其中A為與SEQ ID NO.39具有至少52%、55%、57%、62%、64%、69%、73%、76%、81%、88%或100%一致性之UspA2之免疫原性片段。
- 如請求項1或2之蛋白質，其中A為與SEQ ID NO.43具有至少52%、57%、62%、65%、67%、70%、73%、76%、81%、100%一致性之UspA2之免疫原性片段。
- 如請求項1或2之蛋白質，其中該蛋白質係選自由以下組成之群：SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：88。
- 如請求項1或2之蛋白質，其中A為包含層黏連蛋白結合域及纖維結合蛋白結合域之UspA2之免疫原性片段。
- 如請求項1或2之蛋白質，其中A為包含層黏連蛋白結合域、纖維結合蛋白結合域及C3結合域之UspA2之免疫原性片段。
- 如請求項1或2之蛋白質，其用於治療或預防中耳炎。
- 如請求項1或2之蛋白質，其用於治療或預防慢性阻塞性肺病之急性惡化(AECOPD)。
- 如請求項1或2之蛋白質，其用於治療或預防肺炎。
- 如請求項1或2之蛋白質，其用於治療或預防卡他莫拉菌感染或疾病。
- 一種免疫原性組合物，其包含如請求項1至17中任一項之式(I)之蛋白質。
- 如請求項22之免疫原性組合物，其包含選自由以下組成之群的UspA2之免疫原性片段：SEQ ID NO.1之胺基酸30-540(SEQ ID NO：39)、SEQ ID NO：1之胺基酸31-540(SEQ ID NO：40)、SEQ ID NO：1之胺基酸30-519(SEQ ID NO：41)、SEQ ID NO：1之胺基酸30-564(SEQ ID NO：42)及SEQ ID NO：1之胺基酸31-564(SEQ ID NO：43)。
- 如請求項22之免疫原性組合物，其包含與SEQ ID NO.39具有至少52%、55%、57%、62%、64%、69%、73%、76%、81%、88%或100%一致性之UspA2之免疫原性片段。
- 如請求項22之免疫原性組合物，其包含與SEQ ID NO.43具有至少52%、57%、62%、65%、67%、70%、73%、76%、81%、100%一致性之UspA2之免疫原性片段。
- 如請求項22之免疫原性組合物，其包含選自由以下組成之群的蛋白質：SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：88。
- 如請求項22至26中任一項之免疫原性組合物，其進一步包含至少一種來自流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)之抗原。
- 如請求項27之免疫原性組合物，其中該至少一種抗原為蛋白D。
- 如請求項22至26之免疫原性組合物，其進一步包含蛋白E。
- 如請求項22至26中任一項之免疫原性組合物，其進一步包含PilA。
- 如請求項30之免疫原性組合物，其中PE及PilA係以融合蛋白形 式存在。
- 如請求項22之免疫原性組合物，其進一步包含蛋白D、蛋白E及PilA。
- 如請求項23之免疫原性組合物，其進一步包含蛋白D、蛋白E及PilA。
- 如請求項26之免疫原性組合物，其進一步包含蛋白D、蛋白E及PilA。
- 如請求項22至26及32至34中任一項之免疫原性組合物，其用於治療或預防中耳炎。
- 如請求項22至26及32至34中任一項之免疫原性組合物，其用於治療或預防慢性阻塞性肺病之急性惡化(AECOPD)。
- 如請求項22至26及32至34中任一項之免疫原性組合物，其用於治療或預防肺炎。
- 如請求項22至26及32至34中任一項之免疫原性組合物，其用於治療或預防卡他莫拉菌感染或疾病。
- 一種疫苗，其包含如請求項1至17中任一項之蛋白質或如請求項22至34中任一項之免疫原性組合物。
- 如請求項39之疫苗，其進一步包含佐劑。
- 如請求項40之疫苗，其中該佐劑為AS01E。
- 如請求項39至41中任一項之疫苗，其中該免疫原性組合物含有SEQ ID NO：69之蛋白質、蛋白D及PE-PilA融合蛋白。
- 如請求項39至41中任一項之疫苗，其中該PE-PilA融合蛋白為LVL-735。
- 如請求項39至41之疫苗，其用於治療或預防中耳炎。
- 如請求項39至41之疫苗，其用於治療或預防慢性阻塞性肺病之急性惡化(AECOPD)。
- 如請求項39至41之疫苗，其用於治療或預防肺炎。
- 如請求項39至41之疫苗，其用於治療或預防卡他莫拉菌感染或疾病。
- 如請求項42之疫苗，其用於治療或預防中耳炎。
- 如請求項42之疫苗，其用於治療或預防慢性阻塞性肺病之急性惡化(AECOPD)。
- 如請求項42之疫苗，其用於治療或預防肺炎。
- 如請求項42之疫苗，其用於治療或預防卡他莫拉菌感染或疾病。
- 一種如請求項22至34中任一項之免疫原性組合物或如請求項39至43中任一項之疫苗之用途，其用於製造治療或預防中耳炎之藥物。
- 一種如請求項22至34中任一項之免疫原性組合物或如請求項39至43中任一項之疫苗之用途，其用於製造治療或預防慢性阻塞性肺病之急性惡化(AECOPD)之藥物。
- 一種如請求項22至34中任一項之免疫原性組合物或如請求項39至43中任一項之疫苗之用途，其用於製造治療或預防肺炎之藥物。
- 一種如請求項22至34中任一項之免疫原性組合物或如請求項39至43中任一項之疫苗之用途，其用於製造治療或預防卡他莫拉菌感染或疾病之藥物。
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