ES2298128T3

ES2298128T3 - Composiciones de vacuna neisseriana y metodos.

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Publication number: ES2298128T3
Application number: ES00905182T
Authority: ES
Inventors: Andrew Microbiol. Res. Authority CAMR ROBINSON; Andrew Richard Microbio. Res. Authority GORRINGE; Michael John Microbio. Res. Authority HUDSON; Philippa Microbio. Res. Authority BRACEGIRDLE; John Simon Imperial College School Med. KROLL; Keith Public Health Lab. Service CARTWRIGHT; Steven Anthony Rochford Webb; Paul Richard Langford; Cliona Anne O'dwyer
Original assignee: Health Protection Agency; Imperial Innovations Ltd
Current assignee: Ip2ipo Innovations Ltd; Public Health England
Priority date: 1999-02-22
Filing date: 2000-02-22
Publication date: 2008-05-16
Anticipated expiration: 2020-02-22
Also published as: JP4982009B2; AU779086B2; EP1154791B1; CY1107950T1; CA2371928A1; CA2371928C; EP1154791A2; AU2681100A; EP1852125A2; WO2000050074A2; ATE386541T1; EP1852125A3; PT1154791E; DE60038099T2; DK1154791T3; DE60038099D1; JP2002537352A; US20030026809A1; WO2000050074A3; US7157245B2

Abstract

Una composición de vacuna que comprende una Neisseria comensal o una de sus preparaciones de la membrana externa, en la que dicha Neisseria comensal se selecciona del grupo consistente en N. lactamica, N. cinerea, N. elongata, N. flavescens, N. polysaccharea, N. sicca y N. subflava.

Description

Composiciones de vacuna Neisseriana y métodos.

La presente invención se refiere a vacunas y a métodos para preparar vacunas que estimulan una respuesta inmunitaria. En particular, la presente invención se refiere a vacunas que proporcionan inmunidad protectora de amplio espectro contra la infección microbiana.

La infección por organismos patógenos es una de las principales causas de enfermedad crónica y aguda. En particular, la infección resultante de fuentes microbianas, tales como bacterias, virus y protozoos, continúa reivindicando millones de vidas en todo el mundo. Con especies microbianas en aumento que se vuelven resistentes a los antibióticos convencionales, sería deseable proporcionar medios de protección y lucha alternativos y preferentemente profilácticos contra la infección microbiana.

La meningitis meningocócica es de particular importancia como problema sanitario mundial y en muchos países la incidencia de la infección está creciendo. Neisseria meningitidis (meningococo) es el organismo que produce la enfermedad y es también responsable de la septicemia meningocócica, que está asociada con el comienzo rápido y gran mortalidad, con alrededor del 22% de casos mortales.

Actualmente, las vacunas dirigidas a proporcionar inmunidad protectora contra la enfermedad meningocócica proporcionan sólo protección limitada a causa de las muchas cepas diferentes de N. meningitidis. Las vacunas basadas en antígenos del serogrupo, los polisacáridos capsulares, ofrecen solamente una breve protección de vida contra la infección y no protegen contra muchas cepas encontradas frecuentemente en Norteamérica y Europa. Un inconveniente adicional de estas vacunas es que proporcionan bajos niveles de protección a los niños con edad inferior a 2 años, uno de los grupos más vulnerables que son normalmente sensibles a la infección. Las vacunas conjugadas más recientes actualmente en utilización en el Reino Unido solucionarán algunos de estos problemas pero solamente serán eficaces contra el serogrupo C del meningococo.

Gold et al. (Journal of Infectious Diseases, volumen 137, nº 2, febrero de 1978, páginas 112-121) han descrito que el transporte de N. lactamica puede ayudar al desarrollo de inmunidad natural de N. meningitidis por inducción de anticuerpos con reacción cruzada. Esta conclusión se basó en la observación de anticuerpos con reacción cruzada que tienen actividad bactericida dependiente del complemento producida en respuesta a la infección por N. lactamica. Sin embargo, Cann y Rogers (J. Med. Microbiol., volumen 30, 1989, páginas 23-30) detectaron anticuerpos contra antígenos comunes de especies de neisseria patógena y comensal, pero observaron también que el anticuerpo contra los mismos antígenos estaba presente tanto en los sueros bactericidas como en los no bactericidas. Así, no fue posible identificar ningún anticuerpo bactericida con reacción cruzada.

Las vacunas de microbios vivos atenuadas para la enfermedad meningocócica han sido sugeridas por Tang et al. (Vaccine 17, 1999, páginas 114-117) en las que una cepa viva atenuada de N. meningitidis podría administrarse a través de las mucosas. Tang también comentó la utilización de bacterias comensales para proteger contra la infección por bacterias patógenas, concluyendo que los epítopos con reacción cruzada que inducen protección contra la infección meningocócica no han sido definidos y por consiguiente sería preferible la utilización de cepas genéticamente modificadas de N. meningitidis.

Es deseable proporcionar una vacuna adicional que proporcione inmunidad protectora contra la infección de N. meningitidis. Además es deseable proporcionar una vacuna que proporcione inmunidad protectora a lactantes así como a adultos y cuya protección sea de larga duración. También puede presentar ventajas proporcionar una vacuna que proteja contra la infección subclínica, es decir en la que los síntomas de la infección meningocócica no sean inmediatamente evidentes y el individuo infectado pueda actuar como vehículo del patógeno. Sería además ventajoso proteger contra todas o una amplia gama de cepas de N. meningitidis.

El documento WO-A-96/29412 describe el aislamiento de un antígeno de superficie de 22 kDa de N. meningitidis que es inmunológicamente accesible. Se demuestra que el antígeno de 22 kDa se conserva en otras especies neisserianas incluyendo la N. lactamica comensal.

Aoun et al. (Annals de l'Institut Pasteur Microbiol. vol. 139, págs. 203-212 (1988)) se refiere a la identificación de anticuerpos en pacientes humanos para un antígeno de superficie meningocócico de 70 kDa y su valor como componente de la vacuna. Se demostró que los sueros de convalecencia de portadores humanos se unen también a la proteína de 70 kDa de N. gonorrhoeae. Sin embargo, las especies de Neisseria no patógenas aunque poseen el antígeno de 70 kDa produjeron menos frecuentemente una respuesta del anticuerpo en niños.

Gómez et al. (Vaccine, vol. 14, págs. 1340-1346 (1996)) describe la purificación de la proteína (Fbp) de 37 kDa reprimible por hierro de N. meningitidis. Se demuestra que los anticuerpos de ratón producidos contra Fbp de Neisseria patógena se unen a Fbps de N. lactamica y N. sicca comensales.

Es deseable además proporcionar una vacuna contra otra infección neisseriana, principalmente la gonorrea.

\newpage

Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar composiciones que contienen componentes inmunoestimulantes, y vacunas basadas en los mismos, que cumplen o por lo menos mejoran los inconvenientes en la técnica.

La presente invención se basa en la utilización de una Neisseria comensal en una vacuna contra la enfermedad. Por consiguiente, una especie comensal de Neisseria tal como N. lactamica puede utilizarse como vacuna atenuada o vacuna de células completas destruidas o en una vacuna que contiene fracciones de N. lactamica. Se ha demostrado sorprendentemente que los ratones inmunizados según la presente invención con células completas destruidas de N. lactamica y preparaciones de la membrana externa son protegidos de la prueba de provocación meningocócica intraperitoneal letal, y estas vacunas compuestas de un extracto en detergente de células de N. lactamica o fracciones de ésta, separadas por electroforesis de preparación, también protegen a los ratones de la prueba de provocación meningocócica letal. Estos resultados se han obtenido utilizando ratones y el modelo de ratón utilizado es considerado como pronóstico de los correspondientes efectos inmunógenos y de vacunación en seres humanos.

Por consiguiente, un primer aspecto de la presente invención proporciona una composición de vacuna que comprende una Neisseria comensal o una de sus preparaciones de la membrana externa. Las Neisseria comensales se seleccionan del grupo consistente en N. lactamica, N. cinerea, N. elongata, N. flavescens, N. polysaccharea, N. sicca y N. subflava. También se da a conocer una composición inmunógena, que comprende una Neisseria comensal o un componente, extracto o derivado inmunógeno de ésta y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La composición de la invención es particularmente adecuada para la vacunación contra la infección de un animal. El término "infección" tal como se utiliza en la presente memoria debe entenderse que incluye la proliferación de un organismo patógeno dentro y/o en los tejidos de un organismo hospedador. Dichos organismos patógenos incluyen por lo general bacterias, virus, hongos y protozoos, aunque el crecimiento de cualquier microbio dentro y/o en los tejidos de un organismo se considera que están incluidos dentro del término "infección".

Los microorganismos comensales son aquellos que pueden colonizar un organismo hospedador sin señales de enfermedad. Numerosas Neisseria comensales diferentes son adecuadas para su utilización en la invención, y estas Neisseria comensales se seleccionan del grupo consistente en N. lactamica, N. cinerea, N. elongata, N. flavescens, N. polysaccharea, N. sicca y N. subflava. Diferentes especies de estos organismos comensales se sabe que colonizan las zonas bucal o nasal u otras superficies de mucosas y por consiguiente cada especie puede administrarse según el área conocida del cuerpo que coloniza normalmente. Por consiguiente también, la utilización de una composición de la invención puede producir estimulación de la producción de anticuerpos protectores de novo o si el individuo ha sido ya colonizado en una cierta medida puede producir un aumento de anticuerpos existentes en la naturaleza.

El "extracto" o "componente" es un extracto o componente que es inmunógeno tal como los anticuerpos producidos contra el extracto o componente de una Neisseria comensal con reacción cruzada con una Neisseria patógena, en particular N. meningitidis.

El término "derivado" se utiliza para describir tipos de cepas de Neisseria comensal que son modificadas o atenuadas de alguna manera a fin de diferenciarse de las especies naturales; por ejemplo, una composición de vacuna que comprende una Neisseria comensal recombinante que presenta resistencia a determinados tipos de compuestos antibióticos, que puede utilizarse con ventaja en combinación con dichos antibióticos en el tratamiento de la infección.

Una ventaja de la invención consiste en que esta vacunación contra las enfermedades neisserianas puede conseguirse de este modo utilizando una especie no patógena de Neisseria, que hace que la vacunación sea un procedimiento más seguro. Además, la protección proporcionada sorprendentemente puede no estar limitada a un serotipo, subgrupo o serogrupo específicos del meningococo pero es de eficacia protectora general.

Una ventaja más de la invención consiste en que la Neisseria comensal que es el asunto de la invención pueden no revertir en tipos virulentos. En el campo de la vacunación se sabe utilizar patógenos vivos y atenuados y esta utilización conlleva el riesgo de que el organismo atenuado puede revertir en virulencia. La presente invención evita el riesgo. Además, N. meningitidis posee muchos factores de virulencia, cuyas funciones exactas en patogénesis son desconocidas y puede poseer factores de virulencia no reconocidos hasta ahora. Por consiguiente, una ventaja adicional de la invención consiste en que una composición de la invención puede utilizarse con confianza en su nivel de
seguridad.

El procedimiento de la invención es de aplicación a la vacunación contra varias infecciones, preferentemente pero no solamente infecciones neisserianas. En una realización específica de la invención, se ha demostrado la protección contra la enfermedad meningocócica. La invención es también de aplicación en vacunación generalmente contra la infección neisseriana, incluyendo la infección por gonorrea y también en la infección procedente de otros organismos microbianos patógenos. La invención proporciona además la vacunación que se aspira para estimular o desensibilizar el sistema inmunitario.

La composición puede comprender específicamente Neisseria comensal destruida, que por ejemplo puede obtenerse calentando o poniendo en suspensión Neisseria comensal en una mezcla de agentes bactericidas tales como tiomersal y formaldehído.

La composición puede comprender también Neisseria comensal atenuada. Como se menciona, es opcional pero no se requiere normalmente utilizar Neisseria comensal atenuada ya que estos organismos no son virulentos.

En una realización de la invención, un componente o extracto inmunógeno de una Neisseria comensal se selecciona de una preparación vesicular de la membrana externa, una preparación de la membrana externa, lipooligosacáridos y una fracción proteica.

La preparación de la membrana externa y la fracción proteica de N. lactamica, por ejemplo, puede obtenerse a partir de N. lactamica cultivada en presencia o ausencia de hierro. La fracción proteica de N. lactamica dada a conocer en la presente memoria se obtiene de manera conveniente poniendo en suspensión células o membranas de N. lactamica en presencia de detergente e incubando la suspensión a fin de extraer las proteínas de N. lactamica.

Alternativamente, se conocen otras numerosas técnicas para la extracción de los componentes de la membrana externa, tales como las fracciones proteicas, lipooligosacáridos y lipopolisacáridos, procedentes de preparaciones celulares y son adecuadas para obtener los componentes o extractos inmunógenos de Neisseria comensal. Ejemplos de técnicas convencionales para este fin incluyen la utilización de la variación en la concentración de sales, agentes caótropos, variación de pH (alto o bajo), digestión enzimática y disgregación mecánica.

Numerosas fracciones diferentes dadas a conocer en la presente memoria son adecuadas para su utilización en vacunación contra la enfermedad meningocócica. Particularmente las fracciones adecuadas son aquellas de peso molecular inferior a 50 kDa, de peso molecular superior a 40 kDa

\hbox{e inferior a 70
kDa y de peso molecular  superior a 60 kDa.}

Como se da a conocer en la presente memoria, se proporciona una composición para provocar una respuesta inmunitaria y adecuada para utilizar en la vacunación de un individuo contra la infección neisseriana, más específicamente la enfermedad meningocócica, que comprende un componente antigénico o componentes antigénicos que tienen las propiedades siguientes:

(a) peso molecular 50 kDa o inferior;

(b) que puede obtenerse a partir de N. lactamica; y

(c) anticuerpos contra el/los componente(s) obtenido(s) a partir de N. lactamica con reacción cruzada con N. meningitidis.

En la utilización de una composición que contiene dicho componente, extraido utilizando detergente, todos los ratones tratados con este componente sobrevivieron a una dosis de la prueba de provocación de 2 \times 10^{7} CFU de N. meningitidis y tres de cada cinco ratones sobrevivieron a una dosis de la prueba de provocación mayor de 6 \times 10^{8} CFU.

Asimismo se da a conocer una composición para provocar una respuesta inmunitaria y adecuada para su utilización en la vacunación de un individuo contra la infección neisseriana, más específicamente la enfermedad meningocócica, que comprende un componente antigénico o componentes antigénicos que tienen las propiedades siguientes:

(a) peso molecular de al menos 40 kDa y hasta 70 kDa;

(b) que puede obtenerse a partir de N. lactamica; y

En la utilización de dicho componente, obtenido utilizando detergente extracto de N. lactamica, cuatro de cada cinco ratones tratados con el componente sobrevivieron a una dosis de provocación de 2 \times 10^{7} CFU de N. meningitidis y los ratones que recibieron una dosis de provocación superior de 6 \times 10^{8} CFU sobrevivieron más tiempo que un grupo de referencia.

(a) peso molecular de al menos 60 kDa;

(b) que puede obtenerse a partir de N. lactamica; y

En la utilización de dicho componente, obtenido utilizando un extracto de detergente, uno de cada cinco ratones sobrevivieron a una dosis de provocación de 2 x 10^{7} de CFU, de N. meningitidis y, mientras que todos los ratones sucumbieron a una dosis de provocación mayor de 6 \times 10^{8} CFU, su tiempo de supervivencia fue mayor que el de un grupo de referencia que no recibió el componente.

En un ejemplo de las composiciones dadas a conocer en utilización, descrito con más detalle a continuación, las proteínas en los intervalos de tamaño de 25 a 35 kDa y de 35 a 43 kDa, extraídas de una Neisseria comensal, proporcionaron un nivel significativo de protección inmunitaria cuando se administraban a ratones como composición de vacuna.

A modo de ejemplo de un método de extracción de un componente antigénico descrito en la presente memoria, un método de extracción comprende:

(i): poner en suspensión células de N. lactamica en una solución acuosa de detergente;

(ii): incubar la suspensión a fin de extraer el componente antigénico de la N. lactamica;

(iii): centrifugar la suspensión para separar la suspensión en un sobrenadante y un sedimento; y

(iv): fraccionar el componente antigénico del sobrenadante.

Este método específico puede modificarse según el protocolo de extracción seleccionado por el usuario, por ejemplo utilizando concentración salina elevada en la etapa inicial (i). En otras formas de realización de la invención el componente antigénico se obtiene utilizando tecnología recombinante mediante la expresión de una secuencia de N. lactamica en un hospedador adecuado tal como E. coli.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a una composición para la vacunación contra la infección neisseriana que comprende una Neisseria comensal o uno de sus componentes, extractos o derivados inmunógenos y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que la Neisseria comensal comprende y expresa un gen de una Neisseria patógena.

Este aspecto de la invención ofrece la ventaja de la utilización de un organismo comensal para administrar y/o presentar al receptor un antígeno procedente de una Neisseria patógena. El gen opcionalmente codifica un antígeno de superficie o una proteína que es segregada, por ejemplo, por N. meningitidis o N. gonorrhoeae y puede codificar un antígeno procedente de éstas. La Neisseria comensal puede estar viva o muerta.

En una realización del segundo aspecto de la invención se proporciona una composición para la vacunación contra la enfermedad meningocócica que comprende una Neisseria comensal y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que la Neisseria comensal comprende y expresa un gen de N. meningitidis.

El gen de N. meningitidis puede codificar por ejemplo una proteína que se fija a la transferrina, una superóxido dismutasa (SOD) por ejemplo una Cu, Zn SOD, proteína A neisseriana de superficie ("NspA"), una porina u otra proteína de la membrana externa. Las secuencias génicas para la mayoría de estos antígenos son conocidas en la bibliografía. Kroll et al. en Microbiology 141 (pt 9), 2271-2279 (1995) describen la secuencia de Cu, Zn-SOD. Martin et al., en J. Exp. Med., 7 de abril de 1997, 185(7), págs. 1173-1183 describen la secuencia de NspA de N. meningitidis.

La invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende una composición según el primer o segundo aspecto de la invención más un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En un tercer aspecto, la invención proporciona la utilización de una composición según el primer y segundo aspectos de la invención para la preparación de un medicamento destinado a la vacunación contra la infección neisseriana.

En la utilización de una realización de la invención descrita en un ejemplo a continuación, el medicamento está destinado a la vacunación contra la enfermedad meningocócica y comprende una composición según el primer y segundo aspectos de la invención.

La invención se refiere asimismo a una cepa de una Neisseria comensal, tal como N. lactamica, modificada genéticamente a fin de expresar un gen procedente de una Neisseria patógena. El gen de N. meningitidis puede codificar, por ejemplo, una proteína seleccionada de una proteína de unión a la transferrina, una SOD, por ejemplo, una Cu,Zn-SOD, NspA, una porina u otra proteína de la membrana externa.

Asimismo se da a conocer un método de extracción de una proteína para la incorporación en una composición adecuada para vacunación contra la enfermedad meningocócica, que comprende:

(i): poner en suspensión la Neisseria comensal, por ejemplo N. lactamica, células en presencia de detergente; y

(ii): incubar la suspensión a fin de extraer una fracción proteica de las células.

La fracción proteica puede ser en consecuencia de peso molecular 50 kDa o inferior, por lo menos 40 kDa y hasta 90 kDa o al menos 80 kDa.

La composición puede combinarse con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo el adyuvante alúmina, aunque cualquier vehículo adecuado para administración por vía oral, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica o cualquier otra vía de administración es adecuado para producir una composición para el tratamiento de la enfermedad meningocócica. Las Neisseria comensales que son colonizadores bucales se pueden administrar en un colutorio y los colonizadores nasales en un pulverizador nasal.

Las proteínas que se unen a la transferrina son conocidas porque están localizadas en las membranas externas de numerosas bacterias Gram negativas tal como N. meningitidis. Las formulaciones de la composición de la presente invención con vehículos o adyuvantes convencionales y opcionalmente además enriquecidas con uno o más antígenos de la especie Neisseria, opcionalmente producida de manera recombinante, por ejemplo, Cu-Zn SOD, la NspA de 22 kD, porinas, antígenos de gonorrea o proteínas que se fijan a la transferrina proporcionan una composición para el tratamiento de la infección por estas bacterias.

En la presente invención, la terminología "proteína que se fija a la transferrina" o "Tbp" se refiere a una proteína que se una sola a la transferrina o puede formar parte de un complejo de proteínas que se unen a la tranferrina.

Una vacuna atenuada según la presente invención puede administrarse por vía parenteral o a las mucosas, por ejemplo, por vía intranasal o inoculación oral. Una bacteria muerta o una vacuna subunitaria puede administrarse también por esta vía, o formularse para la administración oral. Una vacuna subunitaria se administra de manera conveniente por vía parenteral.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición que comprende una Neisseria comensal o uno de sus componentes, extractos o derivados inmunógenos, en la que dicha Neisseria comprende un producto génico heterólogo.

Los productos génicos heterólogos de la invención por lo general incluyen péptidos, proteínas y secuencias complementarias que están codificadas por una secuencia génica que no es natural para la Neisseria comensal. Los producto génicos heterólogos de la invención incluyen, por ejemplo, proteínas bacterianas, proteínas víricas o péptidos de superficie, antígenos y anticuerpos y fragmentos de los mismos. El producto génico heterólogo de la invención puede ser también cualquier antígeno hallado en un organismo patógeno.

En una realización de la invención, la composición comprende una Neisseria comensal en la que se ha transformado un vector de expresión que contiene una secuencia génica que codifica un producto génico heterólogo. Las proteínas específicas adecuadas para su utilización en la invención por lo general incluyen:

Proteínas víricas, tales como el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B; la glucoproteína G del virus de la rabia; la glucoproteína D del virus del herpes simple; la glucoproteína del virus de Epstein-Barr; la glucoproteína del virus de la gripe; la nucleoproteína del virus de la estomatitis vesicular; la glucoproteína G del virus del sincitio respiratorio humano; la envoltura del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH); las subunidades de rotavirus; las subunidades

\hbox{del virus
del sarampión y las subunidades del virus de la
vacuna.}

: Proteínas bacterianas, tales como las subunidades segmentadas de Bordetella pertussis; las proteínas de superficie de Bordetella pertussis; las subunidades del Bacillus anthracis; las subunidades de Escherichia coli y las subunidades de Yersinia pestis.

: Proteínas protozoarias, tales como proteínas de Plasmodium falciparum; proteínas del tripanosoma; y proteínas de Cryptosporidium.

En un ejemplo adicional de la invención en uso, descrito con más detalle a continuación, el vector de expresión pJSK422 se utiliza para expresar la proteína verde fluorescente, bajo el control del activador groES/EL, en la N. cinerea comensal.

La invención proporciona además una Neisseria comensal que se transforma con un vector de expresión que comprende una secuencia señal que dirige el producto génico heterólogo a la membrana externa de una célula neisseriana. Otras secuencias señal son también adecuadas para su utilización en la invención, tal como las señales de secreción o las señales de localización del subcompartimento celular, p. ej. señales de localización periplásmica.

Los aspectos adicionales de la invención proporcionan métodos para preparar composiciones. Dichos métodos son adecuados para preparar composiciones de vacuna que producen inmunidad protectora contra la infección microbiana cuando se administran a un animal.

Un ejemplo de la invención en uso, descrito con más detalle más adelante, proporciona un método de preparar una composición que comprende las etapas siguientes:

a): insertar un gen que codifica un producto génico heterólogo en un vector de expresión;

b): transformar dicho vector de expresión en una Neisseria comensal de modo que dicho producto génico heterólogo se expresa en dicha Neisseria; y

c): combinar la Neisseria de (b) con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Asimismo se da a conocer un método de preparación de una composición que comprende las etapas siguientes:

c): obtener un componente o extracto inmunógeno a partir de la Neisseria de (b); y

d): combinar el componente o extracto inmunógeno de (c) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Se da a conocer también un método de preparación de una composición que comprende las etapas siguientes:

a): obtener un componente o extracto inmunógeno a partir de una Neisseria comensal; y

b): combinar el componente inmunógeno o extracto de (a) con un producto génico heterólogo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Asimismo se dan a conocer (a) métodos y composiciones en las que un extracto es extraído de una Neisseria comensal que expresa un producto génico heterólogo, y (b) procedimientos y composiciones en los que un extracto se obtiene de una Neisseria comensal y el producto génico heterólogo expresado en otra parte (en otro organismo) se combina con este último extracto.

La invención se refiere asimismo a la utilización de Neisseria comensal en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la infección neisseriana y para la utilización de una Neisseria comensal, o un componente, extracto o derivado inmunógeno de la misma, en la que dicha Neisseria comprende un producto génico heterólogo, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la infección o para la inmunoestimulación en un
animal.

Las realizaciones específicas de la invención se exponen con más detalle mediante los ejemplos descritos más adelante. Los resultados citados en los ejemplos están ilustrados mediante los dibujos adjuntos, en los que:

La Fig. 1 presenta la protección de ratones contra la infección intraperitoneal ("IP") con la cepa K454 de N. meningitidis mediante la utilización de células completas de N. lactamica y fracciones de la membrana externa;

la Figura 2A presenta la protección de ratones contra la infección por IP con la cepa K454 de N. meningitidis mediante la utilización de detergente y extractos de peso molecular alto, medio y bajo de células de N. lactamica (panel superior = prueba de provocación con 2 \times 10^{7} CFU, panel inferior = prueba de provocación con 6 \times 10^{8} CFU);

la Fig. 2B presenta los componentes de las fracciones de peso molecular alto, medio y bajo de la fig. 2A;

la Fig. 3 presenta una inmunoelectrotransferencia que ilustra la reacción cruzada de anticuerpos en el suero de pacientes con enfermedad meningocócica con proteínas de N. lactamica.

La Fig. 4 presenta una fotografía de un gel en el que se han introducido subfracciones del extracto de la proteína de la membrana externa de bajo peso molecular; y

la Fig. 5 presenta la protección de ratones contra la infección por IP con la cepa K454 de N. meningitidis cuando se inmunizan con subfracciones de peso molecular bajo (panel superior = prueba de provocación con 5 \times 10^{6} CFU, panel inferior = prueba de provocación con 1 \times 10^{8} CFU).

La Fig. 6 presenta un histograma que compara la fluorescencia de la NRL 32165 de N. cinerea que contiene pJSK411 (GFP sin activador) con pJSK422 (pJSK411 con activador groEL/ES).

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Ejemplo 1

Preparación de vacuna que contiene células completas muertas

Se cultivó la cepa Y92-1009 de Neisseria lactamica en caldo de cultivo Mueller Hinton (MHB) que contenía 5 \mugml^{-1} de etilendiamin-di(ácido o-hidroxifenil-acético) (EDDHA), se incuba a 37ºC con agitación (140 rpm) durante aproximadamente 6 h.

Se recogieron a continuación las bacterias por centrifugación y se volvieron a poner en suspensión en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía formaldehído al 1% (v/v) y tiomersal al 0,1% (p/v) y se dejó reposar durante la noche entre 2 y 8ºC. Las células muertas se volvieron a poner en suspensión a continuación en PBS hasta una D.O._{650} de 1,0 (equivalente a 2 \times 10^{9} CFUml^{-1}) y se añadió alhidrogel hasta el 25% (V/V), proporcionando un producto adecuado para la administración subcutánea.

Este método es adecuado también para N. cinerea, N. elongata, N. flavescens, N. polysaccharea, N. sicca y N. subflava.

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Ejemplo 2

Preparación de vacuna que contiene preparaciones de membrana externa (OM) de N. lactamica

La cepa Y92-1009 de N. lactamica se cultivó en MHB con y sin la adición de 5 \mugml^{-1} de EDDHA durante la noche a 37ºC con agitación. Las células limitadas en hierro (con EDDHA) y repletas de hierro se trataron a continuación por separado. Se recogieron bacterias de 1,5 litros por centrifugación y se volvieron a poner en suspensión en 20 ml de acetato de litio 200 mM, EDTA 5 mM, pH 6,0 y se incubó durante 3 h a 37ºC con agitación. Las bacterias se atenuaron a continuación 7 veces mediante una aguja de calibre 21 y se centrifugaron a 8.000 g durante 10 min.

Se recuperó el sobrenadante y se sedimentaron las membranas por centrifugación a 100.000 g durante 1 h a 4ºC. Se volvieron a poner en suspensión a continuación las membranas en HEPES 10 mM, pH 7,4, que contenía PMSF 10 mM al 0,1% (v/v), proporcionando preparaciones para vacunación que contienen OM. Se determinó el contenido en proteínas de las preparaciones de vacuna OM utilizando el ensayo del ácido bicinconínico (Sigma, R.U.). Se diluyeron las OM en agua desionizada estéril para dar una concentración proteica de 100 \mugml^{-1}. Esto se mezcló a continuación con un volumen igual de adyuvante de Freund, para dar una concentración en proteína final de 50 \mugml^{-1} y se emulsionó intensamente. Se utilizó adyuvante completo de Freund para la dosis primaria e incompleto de Freund para los refuerzos posteriores.

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Ejemplo 3

Preparación de vacuna que contiene lipooligosacáridos (LOS)

Se llevó a cabo la purificación de LOS de la cepa Y92-1009 de N. lactamica utilizando el método de Gu, X-X y Tsai, C.M. (1991) Anal. Biochem. 196; 311-318. Se preparó la vacuna utilizando adyuvante de Freund como anteriormente con LOS a una concentración final de 10 \mugml^{-1}.

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Ejemplo 4

Vacunación y programa de prueba de provocación

Se vacunaron grupos de 5 ratones con una preparación como la siguiente:

Cebador:-: Día 0

Primer refuerzo:-: Día 21

Segundo refuerzo:-: Día 28

Los ratones vacunados con células muertas del Ejemplo 1 recibieron 0,5 ml por vía subcutánea, equivalente a 1 \times 10^{9} CFU. Los ratones vacunados con OM del Ejemplo 2 y LOS del Ejemplo 3 recibieron 0,2 ml por vía subcutánea; equivalente a 10 \mug de proteína y 2 \mug de LOS.

El día 35, los ratones se sometieron a la prueba de provocación mediante inyección intraperitoneal con aproximadamente 10^{8} CFU de K454 de N. meningitidis preparada en MHB que contenía transferrina a una concentración final de 20 mg/ml. Se examinaron a continuación los ratones y se anotaron el número de supervivientes y los resultados se presentan en la fig. 1. Después de 4 días los 5 ratones sobrevivieron en los grupos vacunados con células completas y las OMP (sin hierro) y 3 sobre-vivieron en el grupo vacunado con las OMP (con hierro). Después de 5 días todos los miembros del grupo de referencia y del grupo vacunado con LOS (LPS marcada en la figura) habían muerto.

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Ejemplo 5

Preparación de vacuna que comprende fracciones de N. lactamica

Se inocularon placas de agar-agar con infusión cerebro-corazón con 50 \mul de cepa Y92-1009 de N. lactamica y se incubaron durante la noche a 37ºC, con 5% de CO_{2}. Esto se utilizó para inocular un cultivo de partida de 100 ml de MHB que se incubó en agitación a 37ºC durante 6 h. El cultivo de partida (15 ml) se añadió a cada uno de los volúmenes de 6\times500 ml de MHB. Éstos se incubaron a continuación en agitación durante la noche a 37ºC y se pusieron las condiciones de hierro limitado mediante la adición de 5 \mugml^{-1} de EDDHA. Se recogieron las células por centrifugación y se descartó el sobrenadante. Se lavaron las células con 100 ml de PBS y a continuación se sedimentaron por centrifugación. Los sedimentos celulares se volvieron a poner en suspensión en PBS + 0,3% (v/v) de Elugent (Calbiochem, 2 ml por g de peso en húmedo) y se incubaron en agitación a 37ºC durante 20 min. Se separaron a continuación las células por centrifugación y se descartó el sedimento. Se añadieron a continuación EDTA y N-lauroíl sarcosina al sobrenadante hata 10 mM y 0,5% (p/v) respectivamente.

Se utilizó a continuación la Prep Cell de BioRad (marca comercial registrada), modelo 491, para separar las proteínas contenidas en el extracto en detergente. Se fundieron 4 cm de acrilamida natural al 7% que se redisuelve en gel con 2 cm de gel pegajoso. Se sometieron a electroforesis 12 mg de proteína en una muestra de tampón natural utilizando tampón corriente que contenía 0,1% (p/v) de SDS, Tris 0,025 M y glicina 0,192 M a 40 mA y 400 V hasta que el frente colorante alcanzó el fondo del gel. Se recogieron a continuación 3 ml de fracciones de las proteínas eluidas. Una vez recogidas las fracciones se agruparon en grupos consistentes en proteínas de peso molecular aproximadamente inferior a 40 kDa, entre 40 y 67 kDa y más de 67 kDa. Se concentraron las proteínas agrupadas por precipitación en sulfato amónico y se dializaron frente a PBS. Éstas se diluyeron en PBS a una concentración de proteína de 100 \mug/ml y se añadio adyuvante completo de Freund en una proporción de 1:1 (v/v) de adyuvante incompleto de Freund para dosis de refuerzo.

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Ejemplo 6

Programa de vacunación y prueba de provocación

Se vacunaron grupos de 5 ratones con cada preparación de la forma siguiente:

Cebador:-: Día 0

Primer cebador:-: Día 21

Segundo cebador:-: Día 28

Se vacunaron los ratones con pseudovacuna (es decir, grupo de referencia), extracto de Elugent ("marca comercial registrada") o una fracción de peso molecular alto, medio y bajo. Los ratones que recibieron los grupos de fracción proteica recibieron 0,2 ml por vía subcutánea; equivalente a 10 \mug de proteína.

El día 35, los ratones se sometieron a la prueba de provocación por inyección intraperitoneal con aproximadamente 2 \times 10^{7} ó 6 \times 10^{8} CFU de K454 de N. meningitidis preparada en MHB que contiene transferrina a una concentración final de 20 mg/ml. Se examinaron a continuación los ratones durante cuatro días, se anotó el número de supervivientes y los resultados se presentan en la fig. 2A (panel superior prueba de provocación con 2 \times 10^{7} y panel inferior prueba de provocación con 6 \times 10^{8}). Los componentes de las fracciones de peso molecular alto, medio y bajo se presentan en la fig. 2B, después de administrar un gel de SDS-PAGE.

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Ejemplo 7

Se investigaron muestras de sueros humano después de enfermedad meningocócica y éstas demostraron que se producían anticuerpos que reaccionan con una gama de proteínas de N. lactamica. En la fig. 3 se presentan los resultados de la inmunoelectrotransferencia.

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Ejemplo 8

Debido al nivel de protección ofrecido por el grupo de bajo peso molecular en el Ejemplo 6 (véase Fig. 2A), la separación adicional de estas proteínas se llevó a cabo, según el método del Ejemplo 5, para caracterizar más los componentes responsables de la protección. Se agruparon las proteínas en tres grupos consistentes en <25 kDa (g1), 25-35 kDa (g2) y 35-43 kDa (g3) (mostrado en la Fig. 4). La determinación de las concentraciones de lipopolisacárido (LPS) pusieron de manifiesto grandes concentraciones de LPS en la fracción g1 [26.580 unidades de endotoxina por ml (UE ml^{-1})] y concentraciones considerablemente menores en las restantes fracciones (9.149 UE ml^{-1} en g2 y 9.348 UE ml^{-1} en g3).

Como en los ejemplos anteriores, se inmunizaron los grupos de cinco ratones, utilizando un programa de tres dosis con uno de los tres grupos de proteínas descritos anteriormente, proteína >43 kDa y extracto de detergente de células de N. lactamica completas muertas y de N. lactamica completas muertas. Los animales se sometieron a la prueba de provocación con el serogrupo B de N. meningitidis, cepa K454, a una dosis de 5 \times 10^{6} o 1 \times 10^{8} CFU, junto con las referencias no inmunizadas. En la Fig. 5 se presenta el número de supervivientes en cada día después de la prueba de provocación.

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Todos los ratones aparte de los del grupo de referencia y un ratón en el grupo g3, sobrevivieron a la dosis inferior de la prueba de provocación; sin embargo, a la dosis de la prueba de provocación mayor los grupos de proteína g2 y g3 (25-35 kDa y 35-43 kDa respectivamente), ofrecieron mejor protección.

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Ejemplo 9

Neisseria comensal como vehículo para la expresión de la proteína recombinante

El gen que codifica la proteína de la nucleocápside del virus del sarampión se clonó en el vector lanzadera pMGC18.1 (Webb et al., 1998, circular en la 11^{th} International Pathogenic Neisseria Conference, Niza) y se transformó en DH5alfa de E. coli. La expresión de la proteína de la nucleocápside del virus del sarampión se confirmó por transferencia Western probada con antisuero específico. Este montaje se utilizó a continuación para transformar N. lactamica por conjugación. La expresión de la proteína de la nucleocápside del virus del sarampión se colocó bajo el control del activador frpC neisseriano y se observó la expresión a altas concentraciones cuando las bacterias se cultivaron en condiciones de crecimiento con hierro limitado.

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Ejemplo 10

Expresión de GFP en N. cinerea comensal

Se insertó el gen de la proteína verde fluorescente (GFP) de Aequorea victoria en el plásmido pJSK422 utilizando técnicas de clonación habituales. La GFP estaba bajo el control del activador groES/EL. Como referencia negativa el gen de GFP se insertó también en el plásmido pJSK411 que carece del activador groES/EL del plásmido pJSK422.

N. cinerea se transformó por conjugación (véase el Ejemplo 9) con los plásmidos que contienen GFP pJSK422 o pJSK411 (referencia negativa). Las células transformadas se cultivaron en condiciones apropiadas. Se compararon la fluorescencia de los cultivos transformados por pJSK422 de N. cinerea con la de los cultivos transformados por pJSK411. Los resultados de la comparación se presentan en la Fig. 6. El histograma presenta la intensidad de la fluorescencia de GFP en el eje X y el número de células fluorescentes en el eje Y. Es evidente que el nivel de fluorescencia es mayor en la N. cinerea transformada con pJSK422 que la transformada con pJSK411, indicado por el desplazamiento del pico a la derecha. Esto demuestra la expresión heteróloga del gen GFP en la N. cinerea comensal.

Claims

1. Una composición de vacuna que comprende una Neisseria comensal o una de sus preparaciones de la membrana externa,en la que dicha Neisseria comensal se selecciona del grupo consistente en N. lactamica, N. cinerea, N. elongata, N. flavescens, N. polysaccharea, N. sicca y N. subflava.

2. Una composición de vacuna según la reivindicación 1 que comprende Neisseria muerta.

3. Una composición de vacuna según la reivindicación 2,en la que la N. lactamica muerta se obtiene poniendo en suspensión N. lactamica en una mezcla de agentes bactericidas.

4. Una composición de vacuna según la reivindicación 1 que comprende N. lactamica viva.

5. Una composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que Neisseria es N. lactamica.

6. Una composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicha preparación de la membrana externa comprende vesículas de la membrana externa.

7. Un método de preparación de una composición de vacuna que comprende:

a): obtener una Neisseria comensal o una de sus preparaciones de la membrana externa; y

b): combinar dicha Neisseria comensal o una preparación de la membrana externa con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicha Neisseria comensal se selecciona del grupo consistente en N. lactamica, N. cinerea, N. elongata, N. flavescens, N. polysaccharea, N. sicca y N. subflava.

8. Un método según la reivindicación 7, en el que dicha preparación de la membrana externa comprende vesículas de la membrana externa.

9. Un método según la reivindicación 7, en el que Neisseria es N. lactamica.

10. Una composición de vacuna según las reivindicaciones 1 a 6 o un método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en los que dicha Neisseria o una preparación de la membrana externa de la misma comprende un producto génico heterólogo.

11. Una composición de vacuna o un método según la reivindicación 10, en los que la Neisseria comensal expresa un gen de una Neisseria patógena.

12. Una composición de vacuna o un método según la reivindicación 11, en los que dicha Neisseria patógena es N. meningitidis.

13. Una composición de vacuna o un método según la reivindicación 12, en los que la Neisseria comensal expresa un gen que codifica una proteína de N. meningitidis seleccionada del grupo consistente en una proteína de fijación a la transferrina; una Cu, Zn-SOD; un NspA; una porina y una proteína de la membrana externa.

14. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o 10 a 13 o un método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en los que dicha Neisseria comensal está modificada o atenuada a fin de diferenciarse de la especie natural.

15. Una composición de vacuna que comprende una composición según cualquier de las reivindicaciones 1 a 6 o 10 a 14 más un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o 10 a 15, que comprende además un producto génico heterólogo a dicha Neisseria.

17. Una composición de vacuna según la reivindicación 16, en la que el producto génico heterólogo se combina físicamente con dicha Neisseria comensal.

18. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que comprende:

c): combinar la Neisseria de (b) o una preparación de la membrana externa con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Utilización de una composición según cualquier de las reivindicaciones 6 o 10 a 17 para la preparación de un medicamento destinado a la vacunación contra la infección por Neisseria.

20. Utilización según la reivindicación 19, en la que dicha infección por Neisseria es una infección meningocócica.

21. Utilización según la reivindicación 19 o 20, en la que dicha composición comprende una Neisseria que comprende un producto génico heterólogo.

22. Utilización según la cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que el medicamento es para administración por vía oral, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular o intradérmica.