ES2295230T3

ES2295230T3 - Proteina fosfatasa relacionada con el estres y metodos de uso en las plantas.

Info

Publication number: ES2295230T3
Application number: ES01989068T
Authority: ES
Inventors: E Silva Oswaldo Da Costa; Hans J. Bohnert; Manabu Ishitani; Nocha Van Thielen; Ruoying Chen
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-04-06
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2021-04-06
Also published as: DE60124880T2; EP1294912A2; EP1783229A2; CA2767239A1; US7803987B2; US20090100540A1; DE60131772D1; US7259294B2; US20100011466A1; AU2001249941A1; US20100325759A1; CA2767275A1; US20080189806A1; CA2405750A1; US6689939B2; US20030097675A1; ATE475715T1; US7166767B2; US20080168578A1; US6720477B2

Abstract

Una célula vegetal transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica una Proteína Fosfatasa Relacionada con el Estrés (PHSRP) el cual es un ácido nucleico que codifica una Proteína Fosfatasa 2A-4, en donde la expresión del ácido nucleico en la célula vegetal resulta en el incremento de la tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de célula vegetal de tipo salvaje, en donde la PHSRP es una PP2A-4 como se define en la SEQ ID NO:13 y las secuencias que son al menos 96% homólogas a la secuencia total del aminoácido mostrada en la SEQ ID NO:13.

Description

Proteína fosfatasa relacionada con el estrés y métodos de uso en las plantas.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención se relaciona usualmente con las secuencias del ácido nucleico que codifican las proteínas que se asocian con respuestas al estrés abiótico y tolerancia al estrés abiótico en plantas. En particular, esta invención se relaciona con las secuencias del ácido nucleico que codifica las proteínas, que confiere tolerancia a la sequía y/o temperatura, a las plantas.

Antecedentes del oficio

El estrés ambiental abiótico, tal como estrés por sequía, estrés por salinidad, estrés por calor, y estrés por frío, son los principales factores limitantes de crecimiento y productividad de la planta. Las pérdidas de cosechas y pérdidas del rendimiento de los cultivos de importantes cultivos tales como arroz, maíz (com) y trigo causadas por el estrés representan un significante factor económico y político y contribuyen a la escasez de alimentos en muchos países subdesarrollados.

Las plantas usualmente se exponen durante su ciclo de vida a condiciones de reducción del contenido de agua ambiental. La mayoría de las plantas han desarrollado estrategias para protegerse contra estas condiciones de deshidratación. Sin embargo, si la severidad y duración de las condiciones de sequía son demasiados grandes, los efectos en el desarrollo, crecimiento y producción de la planta de la mayoría plantas de cultivo son profundos. Adicionalmente, la mayoría de las plantas de cultivo son muy susceptibles a las altas concentraciones de sal en el suelo. La continua exposición a la sequía y sal elevada causa alteraciones importantes en el metabolismo de la planta. Estos grandes cambios en el metabolismo finalmente conducen a muerte celular y por lo tanto pérdidas de rendimiento.

El desarrollo de plantas tolerantes al estrés es una estrategia que tiene el potencial para solucionar o mediar al menos alguno de estos problemas. Sin embargo, las estrategias tradicionales de reproducción de plantas para desarrollar nuevas líneas de plantas que muestren resistencia (tolerancia) a este tipo de tensiones son relativamente lentas y requieren líneas resistentes específicas para cruzar con la línea deseada. Los limitados recursos de germoplasma para la tolerancia al estrés y la incompatibilidad en los cruces entre especies de plantas relacionadas lejanamente representan problemas significantes encontrados en la reproducción convencional. Adicionalmente, los procesos celulares conducen a la tolerancia a la sequía, el frío y la sal en modelo, plantas tolerantes a la sequía y/o la sal son complejos en la naturaleza e involucran múltiples mecanismos de adaptación celular y numerosas rutas metabólicas. Esta naturaleza multi-componente de la tolerancia al estrés no ha hecho de la reproducción para la tolerancia ampliamente exitosa, sino que también ha limitado la capacidad de la ingeniería genética de plantas tolerantes al estrés utilizando métodos biotecnológicos.

Es bien conocido que la fosforilación reversible de las proteínas controla muchos procesos celulares en plantas y animales. El estado de fosforilación de las proteínas se regula por las actividades opuestas de las proteínas quinasas y proteínas fosfatasas. La fosforilación de las proteínas eucarióticas ocurre predominantemente en los residuos de serina y treonina, y en menor medida, en los residuos de tirosina. En animales, la fosforilación de las proteínas desempeña papeles muy conocidos en diversos procesos celulares tal como metabolismo del glucógeno, control del ciclo celular, y transducción de señales (Smith, R.D. and Walker, J.C., 1996, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47:101-125).

Las actividades de la proteína fosfatasa han sido reportados en más compartimientos subcelulares de la planta, incluyendo mitocondria, cloroplasto, núcleo y el citosol, y se asocian con varias membranas y fracciones particuladas. Algunas proteínas fosfatasas se caracterizan pobremente y pueden representar enzimas novedosas que son únicas para las plantas. Otras tienen propiedades bioquímicas que son muy similares a las proteínas fosfatasas de mamífero bien conocidas, tal como proteínas serina/treonina fosfatasas citosólicas (MacKintosh C. and Cohen P. 1989 Biochem. J. 262:335-339). Dos de dichas serina/ treonina fosfatasas de la planta se han identificado, por tener una función similar a las proteínas serina/treonina fosfatasas de los mamíferos tipo-1 (PP1) y tipo-2 (PP2). Estudios bioquímicos y genéticos en plantas implican la actividad de PP1 y/o PP2 en la transducción de señales, regulación hormonal, mitosis, y control del metabolismo del carbono y nitrógeno (Smith, R.D. and Walker, J.C., 1996, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47:101-125).

La evidencia experimental ha implicado la participación de las proteínas fosfatasas en la cascada de señales de estrés en la planta, y más en concreto, en la percepción del estrés y transducción de señales ligadas a los mecanismos fisiológicos de adaptación en plantas. Por ejemplo, se ha demostrado que la proteína fosfatasa 2C (PP2C) se involucra en las respuestas de estrés en plantas (Sheen, J 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:975-980). También se ha demostrado que, en levadura, la fosfatasa calcineurina PP2B (CaN) es un componente focal de una ruta de transducción de señales dependiente del Ca^{2+} que media la tolerancia de Na^{+}, Li^{-}, y Mn^{2+} de Saccharomyces cerecisiae (Cunningham, K.W. and Fink, G.R. 1996 Mol. Cell. Biol. 16: 2226-2237). Las funciones de CaN para limitar la acumulación de Na+ intracelular regulando los procesos que restringen el influjo y potencian eflujo de este catión a través de la membrana plasmática. CaN también participa en homeostasis de Ca^{2+} citosólico a través de la regulación positiva del aparato Golgi y las bombas de iones tipo-P localizadas en la membrana vacuolar y el control negativo de un intercambiador de H+/Ca^{2+} vacuolar. Interesantemente, la sobre expresión de CaN de la levadura confiere tolerancia a la sal en plantas, fuertemente indicando que la modulación de rutas de señalización del estrés por expresión de una proteína fosfatasa activada aumenta sustancialmente la tolerancia al estrés en la planta (Pardo, J.M. et al. 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9681-9686).

Aunque algunos genes que se involucran en respuestas al estrés en plantas han sido caracterizados, la caracterización y clonación de genes de plantas que confieren tolerancia al estrés permanece ampliamente incompleta y fragmentada. Por ejemplo, ciertos estudios han indicado que el estrés por sequía y por sal en algunas plantas, puede deberse a efectos aditivos del gen, en contraste con otras investigaciones indican que los genes específicos se activan transcripcionalmente en tejido vegetativo de plantas bajo condiciones de estrés osmótico. Aunque usualmente se asume que las proteínas estrés-inducidas tienen un papel en la tolerancia, no obstante se carece de evidencia directa, y se desconocen las funciones de muchos genes sensibles al estrés.

Andreeva et al., 1999 revela la detección de cuatro isoformas de Proteína Fosfatasa 2A en Physcomitrella patens. La detección se ha desarrollado utilizando reacción en cadena de la polimerasa en Physcomitrella patens genómico y cADN. Los resultados proporcionan primero datos estructurales aproximados de las proteínas Ser/Thr fosfatasas en plantas de tierra pequeñas.

XP 2272735 revela un mARN que es 77% idéntico con el cADN de PP2A-4.

WO 00/36121 revela las proteínas fosfatasas 2A, en particular las subunidades reguladoras A o B de estas, los polinucleótidos aislados que contienen una secuencia de nucleótido que codifica la proteína fosfatasa 2A y un método de selección de un polinucleótido aislado que afecta el nivel de una proteína fosfatasa 2A.

Existe una necesidad, por consiguiente, de identificar los genes expresados en plantas tolerantes al estrés que tienen la capacidad de conferir resistencia al estrés a su planta huésped y a otras especies de plantas. Recientemente las plantas tolerantes al estrés generadas tendrán muchas ventajas, tal como aumento del rango de plantas de cultivo que se pueden cultivar por, por ejemplo, disminución de la demanda de agua de una especie de planta.

Resumen de la invención

Esta invención cumple, en parte, la necesidad de identificar nuevas, fosfatasas únicas capaces de conferir la tolerancia al estrés a las plantas en la sobre-expresión. La presente invención proporciona una célula vegetal transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica la Proteína Fosfatasa Relacionada con el Estrés (PHSRP), en donde la expresión de la secuencia del ácido nucleico en la célula vegetal resulta en el incremento a la tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de célula vegetal de tipo salvaje, en donde la PHSRP es una PP2A-4 como se define en la SEQ ID No: 13 y las secuencias que son al menos 96% homólogas a la secuencia total del aminoácido mostrada en la SEQ ID No: 13. Particularmente, se describe aquí la proteína fosfatasa Proteína Fosfatasa 2A-4 (PP2A-4) del Physcomitrella patens.

La invención proporciona en algunas modalidades que la PHSRP y el ácido nucleico codificado son aquellos encontrados en los miembros del género Physcomitrella. En otra modalidad preferida, el ácido nucleico y la proteína son de un Physcomitrella patens. La invención proporciona que el estrés ambiental puede ser por sequía o temperatura.

La invención además proporciona una semilla producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica la PHSRP, en donde la planta de línea genéticamente pura incrementa la tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de la planta de tipo salvaje. La invención además proporciona una semilla producida por una planta transgénica que expresa una PHSRP, en donde la planta de línea genéticamente pura incrementa la tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de la planta de tipo salvaje.

La invención además proporciona el uso de partes de la planta o semillas de las plantas transgénicas descritas abajo para la producción de un producto agrícola. La invención además proporciona una PHSRP aislada como se describe arriba. La invención además proporciona un ácido nucleico aislado que codifica la PHSRP, en donde el ácido nucleico que codifica la PHSRP codifica para una PHSRP como se describe a continuación.

La invención además proporciona un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico que codifica la PHSRP como se describe abajo, en donde la expresión del vector en una célula huésped resulta en el incremento de la tolerancia al estrés por la sequía y/o la temperatura en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula huésped. La invención además proporciona una célula huésped que contiene el vector y una planta que contiene la célula huésped.

La invención además proporciona un método de producción de una planta transgénica con un ácido nucleico que codifica la PHSRP, en donde la expresión del ácido nucleico en la planta resulta en el incremento de la tolerancia al estrés por la sequía y/o la temperatura en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta que comprende: (a) transformación de una célula vegetal con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la PHSRP, y (b) producción de la célula vegetal de una planta transgénica con un incremento de la tolerancia al estrés por la sequía y/o la temperatura en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. En modalidades preferidas, la PHSRP y ácido nucleico que codifica la PHSRP son como se describen abajo.

La presente aplicación además proporciona un método de identificación de una PHSRP novedosa, que comprende (a) construcción de una respuesta específica del anticuerpo a una PHSRP, o un fragmento de esta, como se describe arriba; (b) selección material de PHSRP putativa con el anticuerpo, en donde el enlace específico del anticuerpo al material indica la presencia de una PHSRP potencialmente novedosa; y (c) identificación del material unido a una PHSRP novedosa en comparación con la PHSRP conocida. Como alternativa, la hibridación con sondas del ácido nucleico como se describe abajo se pueden utilizar para identificar los ácidos nucleicos de la PHSRP novedosa.

La presente invención también proporciona los métodos para modificar la tolerancia a la sequía y/o el estrés de la temperatura de una planta que comprenden, modificar la expresión de una PHSRP en la planta, en donde la PHSRP es como se describe abajo. La invención proporciona que este método se puede realizar de modo que la tolerancia al estrés ya sea se incremente o disminuya. Preferiblemente, la tolerancia al estrés se incrementa en una planta a través del aumento de la expresión de una PHSRP.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 muestra la secuencia de cADN parcial de PP2A-4 (SEQ ID NO: 3) del Physcomitrella patens.

Figura 2 muestra la secuencia de cADN de longitud completa de PP2A-4 (SEQ ID NO: 8) del Physcomitrella patens.

Figura 3. muestra la secuencia de aminoácidos deducida de PP2A-4 (SEQ ID NO: 13) del Physcomitrella patens.

Figura 4 muestra un diagrama del vector de expresión de la planta pBPSsc022 que contiene el super promotor que conduce la expresión de la SEQ ID NO 8 ("Gen Deseado"). Los componentes son: gen de resistencia a la kanamicina NPTII (Bevan M, Nucleic Acids Res. 26: 8711-21, 1984), AtAct2-i promotor (An YQ et al., Plant J 10: 107-121 1996), terminador OCS3 (During K, Transgenic Res. 3: 138-140, 1994), terminador NOSpA (Jefferson et al., EMBO J 6:3901-7 1987).

Figura 5 muestra los resultados de una prueba de estrés por sequía con plantas transgénicas PpPP2A-4 de sobre-expresión y líneas Arabidopsis de tipo salvaje. Las líneas transgénicas muestran un fenotipo tolerante. Se muestran las líneas transformantes individuales.

Figura 6 muestra los resultados de una prueba de estrés a la congelación con plantas transgénicas PpPP2A-4 de sobre-expresión y líneas Arabidopsis de tipo salvaje. Las líneas transgénicas muestran un fenotipo tolerante. Se muestran las líneas transformantes individuales.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se puede entender más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la invención y los Ejemplos incluidos aquí. También se debe entender que la terminología utilizada aquí tiene el propósito de las modalidades específicas descritas solamente y no tiene la intención de ser limitante. En particular, la designación de la secuencia de aminoácidos como proteína " Proteinasa Relacionadas con el Estrés Fosfatasa" (PHSRPs), de ninguna manera limita la funcionalidad de aquellas secuencias.

La presente invención proporciona una célula vegetal transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica la PHSRP, que es la Proteína Fosfatasa 2A-4, en donde la expresión de la secuencia del ácido nucleico en la célula vegetal resulta en el incremento de la tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de célula vegetal de tipo salvaje, en donde la PHSRP es una PP2A-4 como se define en la SEQ ID No: 13 y las secuencias que son al menos 96% homólogas a la secuencia total del aminoácido mostrada en la SEQ ID No: 13. La invención además proporciona partes de la planta transgénica y plantas transgénicas que contienen las células de la planta descritas aquí. También se proporciona una semilla de la planta producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica la PHSRP, en donde la semilla contiene el ácido nucleico que codifica la PHSRP, y en donde la planta de línea genéticamente pura incrementa la tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La invención además proporciona una semilla producida por una planta transgénica que expresa una PHSRP, en donde la semilla contiene la PHSRP, y en donde la planta de línea genéticamente pura incrementa la tolerancia al estrés por la sequía y/o la temperatura en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La invención también proporciona el uso de cualquiera de las plantas transgénicas descritas arriba o abajo, partes de la planta y semilla de la plantas para la producción de un producto agrícola.

Como se utiliza aquí, el término "variedad" se refiere a un grupo de plantas dentro de una especie que comparte caracteres constantes que los separan de la forma típica y de otras variedades posibles dentro de aquella especie. Mientras que posee al menos un rasgo distintivo, una variedad también se caracteriza por alguna variación entre individuos dentro de la variedad, basado en primer lugar en la segregación Mendeliana de rasgos entre la progenie de las siguientes generaciones. Una variedad se considera "línea genéticamente pura" para un rasgo particular si es genéticamente homocigoto para este rasgo al grado que, cuando la variedad de línea genéticamente pura se auto-polinice, no se observe, una cantidad significante de segregación independiente del rasgo entre la progenie. En la presente invención, el rasgo se origina de la expresión transgénica de una o más secuencias del ADN introducido en una variedad de planta.

La presente invención describe por primera vez que el Physcomitrella patens PHSRP PP2A-4 es útil para aumentar una tolerancia de la planta al estrés por sequía y/o temperatura. La PHSRP PP2A-4 tiene homología con la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 2A como se muestra en la Tabla 2. Por consiguiente, la presente invención incluye una célula vegetal transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica la PHSRP, en donde la expresión de la secuencia del ácido nucleico en la célula vegetal resulta en el incremento de la tolerancia al estrés por la sequía y/o la temperatura en comparación con una variedad de célula vegetal de tipo salvaje y en donde la PHSRP es una proteína proteína fosfatasa 2A o un homólogo o un ortólogo de esta.

Como se utiliza aquí, el término "estrés por sequía y/o temperatura" se refiere a cualquier condición de crecimiento sub-óptimo e incluye, pero no se limita a, condiciones sub-óptimas asociadas con la sequía, temperatura o combinaciones de estas. En modalidades preferidas, el estrés por sequía puede ser bajo contenido de agua y el estrés de la temperatura puede ser temperatura baja. También se debe entender que como se utiliza en la especificación y en las reivindicaciones, "un" puede significar uno o más, dependiendo del contexto en el cual se utiliza. Así, por ejemplo, referencia a "una célula" puede significar que al menos una célula se puede utilizar.

La invención además describe una PHSRP aislada. En una modalidad preferida, la PHSRP se aísla del género Physcomitrella de la planta. En otra modalidad preferida, la PHSRP es a partir de una planta Physcomitrella patens (P. patens). La presente invención describe por primera vez la predicha proteína PP2A-4 de P. patens (SEQ ID NO: 13) que es homóloga a la proteína fosfatasa 2A. En otra modalidad preferida, la PHSRP se selecciona del grupo que consiste de PP2A-4 (SEQ ID NO: 13) y los homólogos y ortólogos de estas. Los homólogos y ortólogos de la secuencia de aminoácidos se definen abajo.

La PHSRP preferiblemente se produce por técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína se clona en un vector de expresión (como se describe abajo), el vector de expresión se introduce en una célula huésped (como se describe abajo) y la PHSRP se expresa en la célula huésped. La PHSRP luego se puede aislar de las células por un apropiado esquema de purificación utilizando técnicas estándar de purificación de proteínas. Alternativa a la expresión del recombinante, un polipéptido de PHSRP, o péptido se puede sintetizar químicamente utilizando técnicas estándar de síntesis de péptidos. Adicionalmente, la PHSRP nativa se puede aislar de las células (por ejemplo, Physcomitrella patens), por ejemplo utilizando un anticuerpo anti-PHSRP, que se puede producir por técnicas estándar utilizando una PHSRP o un fragmento de esta, respectivamente.

Además a la PHSRP aislada, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica la PHSRP. Como se utiliza aquí, los términos "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" tienen la intención de incluir las moléculas de ADN (por ejemplo, cADN o genómico ADN) y moléculas de ARN (por ejemplo, mARN) y los análogos del ADN o ARN generados utilizando los análogos del nucleótido. Este término también abarca secuencia no traducida localizada en ambos terminales 3' y 5' de la región codificante del gen: al menos aproximadamente 1000 nucleótidos de la dirección a 5' de la secuencia del terminal 5' de la región codificante y al menos aproximadamente 200 nucleótidos de la secuencia en dirección a 3' del terminal 3' de la región codificante del gen. La molécula del ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es un ADN bicatenario.

Una molécula de ácido nucleico "aislado" es aquella que se separa sustancialmente de otras moléculas de ácido nucleico que se presentan en el origen natural del ácido nucleico. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" es libre de alguna de las secuencias que naturalmente flanquean el ácido nucleico (i.e., secuencias localizadas en los terminales 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo de la cual el ácido nucleico se deriva. Por ejemplo, en varias modalidades, la molécula de ácido nucleico aislada de PHSRP puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de la secuencia de nucleótidos que naturalmente flanquea la molécula del ácido nucleico en el ADN genómico de la célula, de la cual el ácido nucleico se deriva (por ejemplo, una célula de Physcomitrella patens). Adicionalmente, una molécula de ácido nucleico "aislado", tal como una molécula de cADN, puede ser libre de algún otro material celular con el cual se asocia naturalmente, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:8. o una porción de esta, se puede aislar utilizando técnicas estándar de biología molecular y la información de la secuencia proporcionada aquí. Por ejemplo, un cADN de laPHSRP de P. patens se puede aislar de una genoteca de P. patens utilizando toda o una porción de la secuencia de la SEQ ID NO:3. Adicionalmente, una molécula de ácido nucleico que abarca toda o una porción de la secuencia: de la SEQ ID NO:3 se puede aislar por la reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores de oligonucleótido designados, basados en esta secuencia. Por ejemplo, el mARN se puede aislar de células de la planta (por ejemplo, por el procedimiento de extracción de guanidino-tiocianato de Chirgwin et al., 1979 Biochemistry 18:5294-5299) y el cADN se puede preparar utilizando la transcriptasa reversa (por ejemplo, Moloney MLV transcriptasa reversa, disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD; o AMV transcriptasa reversa, disponible de Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Los cebadores sintéticos del oligonucleótido para la reacción en cadena de amplificación de la polimerasa se puede designar basado en la secuencia de nucleótido, mostrada en la SEQ ID NO:3. Una molécula de ácido nucleico de la invención puede ser amplificada utilizando el cADN o, alternativamente, el ADN genómico, como una plantilla y los cebadores apropiados del oligonucleótido de acuerdo con técnicas estándar de amplificación PCR. La molécula de ácido nucleico así amplificada se puede clonar en un vector apropiado y caracterizado por una análisis de la secuencia ADN. Adicionalmente, los oligonucleótidos correspondientes a una secuencia de nucleótido de PHSRP se pueden preparar por técnicas estándar sintéticas, por ejemplo, utilizando un sintetizador de ADN automatizado.

En una modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico aislado de la invención comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:8. Estos cADNs comprenden una secuencia que codifican la PHSRP (i.e., la "región codificante", indicada en la Tabla 1), así como secuencias no traducidas 5' y secuencias no traducidas 3'. Se debe entender que la SEQ ID NO:8 comprende ambas regiones codificantes y las regiones no traducidas 5' y 3'. Como alternativa, la molécula de ácido nucleico de la presente invención puede comprender solamente la región codificante de la secuencia en la SEQ ID NO:8 o puede contener todos los fragmentos genómicos aislados a partir del ADN genómico. Una región codificante de esta secuencia se indica como una "posición ORF". La presente invención también incluye un ácido nucleico codificante de la PHSRP que codifica la PHSRP según se describe aquí. Se prefiere un ácido nucleico codificante de la PHSRP que codifica la PHSRP PP2A-4 (SEQ ID NO:13).

Adicionalmente, la molécula de ácido nucleico puede comprender solamente una porción de la región codificante de la secuencia en la SEQ ID NO: 8, por ejemplo, un fragmento que se puede utilizar como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una porción activa biológicamente de una PHSRP. La secuencia de nucleótidos determinada a partir de la clonación de los genes de la PHSRP a partir de P. patens dando ocasión a la generación de sondas y cebadores designados para usar en la identificación y/o clonación de homólogos de la PHSRP en otros tipos de células y organismos, así como homólogos de la PHSRP a partir de otra especie relacionada y musgos.

Las porciones de las proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico de PHSRP son preferiblemente porciones activas biológicamente de una de las PHSRPs descritas aquí. Como se utiliza aquí, el término "porción activa biológicamente de" una PHSRP se pretende para incluir una porción, por ejemplo, un dominio/motivo, una PHSRP que participa en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, tiene una actividad como se publica en la Tabla 1, o participa en la transcripción de una proteína involucrada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta. Para determinar si una PHSRP, o una porción activa biológicamente de esta, pueden participar en la transcripción de una proteína involucrada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, se puede realizar, un análisis de estrés de una planta que comprende la PHSRP. Tales métodos de análisis son bien conocidos por aquellos de habilidad en el oficio, como se detalla en el Ejemplo 7. Más específicamente, los fragmentos de ácido nucleico que codifican porciones activas biológicamente de una PHSRP se pueden preparar por aislamiento de una porción de la secuencia en la SEQ ID NO:13, que expresa la porción codificada de la PHSRP o el péptido (por ejemplo, por expresión recombinante in vitro) y valorando la actividad de la porción codificada de la PHSRP o el péptido.

Las porciones activas biológicamente de una PHSRP incluyen péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia del aminoácido de una PHSRP de la SEQ ID NO: 13 o la secuencia del aminoácido de una proteína homóloga u ortóloga de una PHSRP, que incluye menos aminoácidos que una PHSRP de longitud completa o la proteína de longitud completa que es homóloga u ortóloga a una PHSRP, y muestra al menos una actividad de una PHSRP. Usualmente, las porciones activas biológicamente (por ejemplo, péptidos que son, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 o más aminoácidos de longitud) comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de una PHSRP. Adicionalmente, otras porciones activas biológicamente en las cuales otras regiones de la proteína se suprimen, se pueden preparar por técnicas recombinantes y evaluar para una o más de las actividades descritas aquí. Preferiblemente, las porciones activas biológicamente de una PHSRP incluyen uno o más dominios/motivos o porciones de estos seleccionados que tienen actividad biológica.

También se contemplan, las proteínas de fusión o quimérica de PHSRP. Como se utiliza aquí, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" de PHSRP comprende un polipéptido de PHSRP ligado operativamente a un polipéptido no-PHSRP. Un polipéptido PHSRP se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia del aminoácido que corresponde a una PHSRP, mientras que un polipéptido no-PHSRP se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia del aminoácido que corresponde a una proteína que no es sustancialmente homóloga a la PHSRP, por ejemplo, una proteína que es diferente de la PHSRP y se deriva del mismo u otro organismo diferente. Dentro de la proteína de fusión, el término "ligado operativamente" se pretende para indicar que el polipéptido de PHSRP y el polipéptido de no- PHSRP se fusionan a cada otro así luego ambas secuencias cumplen a cabalidad la función propuesta atribuida a la secuencia utilizada. El polipéptido de no-PHSRP se puede fundir a los N-terminal o C-terminal del polipéptido de la PHSRP. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST-PHSRP en la cual las secuencias de PHSRP se fusionan al C-terminal de las secuencias GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de PHSRPs recombinante. En otra modalidad, la proteína de fusión es una PHSRP que contiene una secuencia señal heteróloga en su N-terminal. En ciertas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero), la expresión y/o secreción de una PHSRP se puede incrementar a través del uso de una secuencia señal heteróloga.

Preferiblemente, una proteína quimérica o de fusión de PHSRP se produce por técnicas estándar de ADN recombinante. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican para las diferentes secuencias de polipéptido se ligan juntas en marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo empleando terminal de extremo romo o extremo en zigzag para la unión, digestión de enzima de restricción para proporcionar para el terminal apropiado, completando los terminales cohesivos como sea apropiado, tratamiento de fosfatasa alcalina para evitar el acoplamiento y la unión enzimática indeseables. En otra modalidad, El gen de fusión se puede sintetizar por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Como alternativa, amplificación de PCR de los fragmentos de gen se puede realizar utilizando cebadores de anclaje que dan origen a salientes complementarias entre dos fragmentos de gen consecutivo que pueden posteriormente ser apareados y re-amplificados para generar una secuencia de gen quimérica (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Adicionalmente, muchos vectores de expresión que son comercialmente disponibles ya codifican una fracción de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST). Un ácido nucleico que codifica la PHSRP se puede clonar en dicho vector de expresión de modo que la fracción de fusión se liga en marco a la PHSRP.

Adicionalmente, también se contemplan, los fragmentos y las proteínas de fusión de las PHSRPs descritas aquí, los homólogos y análogos de las PHSRPs que ocurren naturalmente y los ácidos nucleicos codificados por la PHSRP en una planta. Los "homólogos" se definen aquí como dos ácidos nucleicos o proteínas que tienen similares, u "homólogos", nucleótidos o secuencia de aminoácidos, respectivamente. Los homólogos incluyen variantes alélicas, ortólogos, parálogos, agonistas y antagonistas de PHSRPs como se define más adelante. El término "homólogo" además abarca moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:8 (y las porciones de esta) debido a la degeneración del código genético y de esta manera codifican la misma PHSRP como aquella codificada por la secuencia de nucleótido mostrada en la SEQ ID NO: 8.

Un agonista de la PHSRP puede retener sustancialmente la misma, o un subconjunto, de las actividades biológicas de la PHSRP. Un antagonista de la PHSRP puede inhibir una o más de las actividades de la forma de PHSRP que ocurre naturalmente. Por ejemplo, el antagonista de PHSRP puede competitivamente unir a un miembro en dirección a 3' o dirección a 5' de la cascada metabólica componente de la membrana celular que incluye la PHSRP, o unir a una PHSRP que transporta el medio de los compuestos a través de tales membranas, por consiguiente previene el desplazamiento del lugar tomado.

Como se utiliza aquí una PHSRP "que ocurre naturalmente" se refiere a una secuencia del aminoácido de PHSRP que ocurre en la naturaleza. Preferiblemente, una PHSRP que ocurre naturalmente comprende la secuencia del aminoácido de la SEQ ID NO:13.

Las moléculas de ácido nucleico que corresponden a variantes alélicas naturales y análogos, ortólogos y parálogos de un cADN de la PHSRP se pueden aislar basándose en su identidad a los ácidos nucleicos de la PHSRP de Physcomitrella patens descritos aquí utilizando cADNs de la PHSRP, respectivamente, o una porción de estos, como una sonda de hibridación de acuerdo con técnicas estándar de hibridación bajo condiciones estrictas de hibridación. En una modalidad alternativa, los homólogos de la PHSRP se pueden identificar por selección bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes de truncamiento, de la PHSRP para actividad agonista o antagonista de PHSRP. En una modalidad, una genoteca variada de las variantes de PHSRP se genera por mutagénesis combinatoria en el nivel del ácido nucleico y se codifica por una genoteca variada del gen. Una genoteca variada de las variantes de PHSRP se puede producir por, por ejemplo, la unión enzimáticamente de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias de genes de modo que un grupo degenerado de las secuencias de PHSRP potenciales es expresable como polipéptidos individuales, o alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión grandes (por ejemplo, para mostrar fagos) que contienen el conjunto de secuencias de PHSRP en esta. Existe una variedad de métodos que se pueden utilizar para producir bibliotecas de homólogos potenciales de PHSRP a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerados. La síntesis química de una secuencia degenerada de genes se puede realizar en un sintetizador de ADN automático, y el gen sintético luego se liga en un vector de expresión apropiado. El uso de un conjunto degenerado de genes permite la provisión, en una mezcla, de todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de las secuencias potenciales de PHSRP. Los métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados se conocen en el oficio (ver, por ejemplo, Narang, S.A., 1983 Tetrahedron 39:3; Itakura et al., 1984 Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., 1984 Science 198:1056; Ike et al., 1983 Nucleic Acid Res. 11:477).

Además, las bibliotecas de los fragmentos de las regiones codificantes de la PHSRP se pueden utilizar para generar una variada población de fragmentos de PHSRP para la selección y subsiguiente selección de homólogos de una PHSRP. En una modalidad, una genoteca de fragmentos de la secuencia codificante se puede generar tratando un fragmento PCR de doble cadena de una secuencia codificante de PHSRP con una nucleasa bajo condiciones en donde el corte ocurre solo aproximadamente una vez por molécula, la desnaturalización del ADN bicatenario, la renaturalización del ADN para formar el ADN bicatenario, que pueden incluir pares sentido/antisentido de diferentes productos de corte inicial, removiendo las porciones de cadena sencilla de las dobles reformadas por el tratamiento con nucleasa S1, y uniendo la genoteca del fragmento resultante en un vector de expresión. Por este método, una genoteca de expresión se puede derivar cuales codifican los fragmentos N-terminal, C-terminal e internos de varios tamaños de
la PHSRP.

Varias técnicas se conocen en el oficio para la selección de productos génicos de bibliotecas combinatorias hechas por mutaciones de punto o truncamiento, y para la selección de bibliotecas de cADN para productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Tales técnicas son adaptables para selección rápida de las bibliotecas de genes generadas por la mutagénesis combinatorias de los homólogos de PHSRP. La mayoría de técnicas utilizada ampliamente, que son sensibles a un análisis de alto rendimiento, para la selección de bibliotecas de genes grandes usualmente incluyen clonación de la genoteca en vectores de expresión reproducibles, transformación de células apropiadas con la genoteca resultante de vectores, y que expresa los genes combinatorios bajo condiciones en los cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. Mutagénesis de conjunto recursiva (REM), una nueva técnica que incrementa la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, se pueden utilizar en combinación con los ensayos de selección para identificar los homólogos PHSRP (Arkin and Yourvan, 1992 PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al., 1993 Protein Engineering 6(3):327-331). En otra modalidad, los ensayos basados en células se pueden explotar para analizar una genoteca variada de PHSRP, utilizando métodos bien conocidos en el oficio. Un método de identificación de una PHSRP novedosa, comprende (a) construcción de una respuesta específica del anticuerpo para una PHSRP, o un fragmento de esta, como se describe arriba; (b) selección del material de PHSRP putativa con el anticuerpo, en donde el enlace específico del anticuerpo con el material indica la presencia de una PHSRP novedosa potencialmente; y (c) análisis del material unido en comparación con la PHSRP conocida, para determinar su novedad.

Para determinar el porcentaje de homología de dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo, la secuencia de la SEQ ID NO:13 y una forma mutante de estas), las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir vacíos en la secuencia de una proteína o un ácido nucleico para un alineamiento óptimo con la otra proteína o ácido nucleico). Los residuos de aminoácidos en las posiciones de aminoácido correspondiente o las posiciones de nucleótido luego se comparan. Cuando una posición en una secuencia (por ejemplo, la secuencia, de la SEQ ID NO:13) se ocupa por el mismo residuo de aminoácido como la posición correspondiente en la otra secuencia (por ejemplo, una forma mutante de la secuencia del polipéptido de la SEQ ID NO:13), entonces las moléculas son homólogas en esta posición (i.e., como se utiliza aquí la "homología" del aminoácido o ácido nucleico es equivalente a la "identidad" del aminoácido o el ácido nucleico). El mismo tipo de comparación se puede hacer entre dos secuencias del ácido nucleico.

El porcentaje de homología entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartida por las secuencias (i.e., % de homología = números de posiciones idénticas/total números de posiciones x 100). La secuencia del aminoácido incluida en la presente invención es al menos 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a una secuencia total del aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 13. En otra modalidad, al menos 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a una secuencia total del aminoácido codificado por una secuencia del ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 8. En otras modalidades, la longitud preferible de comparación de secuencia para las proteínas es al menos de 15 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de al menos 25 residuos de aminoácidos, y más preferiblemente al menos 35 residuos de aminoácidos.

En otra modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico aislado de la invención comprende una secuencia de nucleótido que es al menos 90%, o 90-95%, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a una secuencia de nucleótido mostrada en la SEQ ID NO:8 sobre la región codificante total o una porción de estas. La longitud preferible de comparación de la secuencia para los ácidos nucleicos es al menos de 75 nucleótidos, más preferiblemente al menos de 100 nucleótidos y más preferiblemente la longitud total de la región codificante.

También es preferible que una molécula homóloga del ácido nucleico codifique una proteína, o porción de esta, que incluya una secuencia del aminoácido la cual es suficientemente homóloga a una secuencia del aminoácido de la SEQ ID N0:13 de modo que la proteína o porción de esta mantenga la misma función o una similar como la secuencia del aminoácido a la cual esta se compara. Las funciones de la secuencias de aminoácidos de la PHSRP de la presente invención incluyen la capacidad de participar en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o más particularmente, de participar en la transcripción de una proteína involucrada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta de Physcomitrella patens. Ejemplos de tales actividades se describen en la Tabla 1.

Además de los métodos descritos arriba, una determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido, no-limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877). Dicho algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, et al. (1990 J. Mol. Biol. 215:403-410).

Búsquedas de ácido nucleico BLAST se puede realizar con el programa NBLAST, puntuación=100, longitud de la palabra =12 para obtener las secuencias del ácido nucleico homólogas a las moléculas de ácido nucleico de la PHSRP de la invención. Adicionalmente, las búsquedas de la proteína BLAST se puede realizar con el programa XBLAST, puntuación=50, longitud de la palabra=3 para obtener la secuencia de aminoácidos homóloga a las PHSRPs de la presente invención. Para obtener alineaciones incompletas para propósitos de comparación, se puede utilizar, Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar, los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo no-limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS 1989). Tal algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de programas GCG de secuencia alineamiento. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar la secuencia de aminoácidos, se pueden utilizar, una tabla del residuo de peso PAM120, una penalización de la longitud del hueco de 12 y una penalización de hueco de 4, para obtener la secuencia de aminoácidos homóloga a las PHSRPs de la presente invención. Para obtener alineaciones discontinuas para propósitos de comparación, se puede utilizar, Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) se pueden utilizar. Otro ejemplo preferido, no-limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS 1989). Tal algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de programas de alineamiento de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar la secuencia de aminoácidos, se pueden utilizar, una tabla del residuo de peso PAM120, una penalización de la longitud del hueco de 12 y una penalización del hueco de 4.

Finalmente, la homología entre las secuencias del ácido nucleico también se puede determinar utilizando técnicas de hibridación conocidas por aquellos de habilidad en el oficio. Por consiguiente, una molécula de ácido nucleico aislado comprende una secuencia de nucleótido que hibridiza, por ejemplo, hibridiza bajo condiciones rigurosas, a la secuencia de nucleótido mostrada en la SEQ ID NO:8 o una porción de esta. Más particularmente, una molécula de ácido nucleico aislado tiene al menos 15 nucleótidos de longitud e hibridiza bajo condiciones rigurosas a la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 8. En otras modalidades, el ácido nucleico tiene al menos 30, 50, 100, 250 o más nucleótidos de longitud.

Como se utiliza aquí, el término "hibridiza bajo condiciones rigurosas" se pretende para describir las condiciones de hibridación y lavado bajo las cuales la secuencia de nucleótidos es al menos 60% homóloga a cada una usualmente permanece hibridizada a cada una. Preferiblemente, las condiciones son de modo que las secuencias al menos aproximadamente 65%, más preferiblemente al menos aproximadamente 70%, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 75% o más homólogas a cada una, usualmente permanecen hibridizadas a cada una. Tales condiciones rigurosas se conocen por aquellos de habilidad en el oficio y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, 6.3.1-6.3.6, John Wiley & Sons, N.Y. (1989). Un ejemplo preferido, no-limitante de las condiciones estrictas de hibridación son, hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por uno o más lavados en 0.2 X SSC, 0.1% de SDS a 50-65ºC. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislado que hibridiza bajo condiciones rigurosas a una secuencia de la SEQ ID NO:8 corresponde a una molécula de ácido nucleico que ocurre naturalmente. Como se utiliza aquí, una molécula de ácido nucleico "que ocurre naturalmente" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótido que ocurre en la naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína natural). En una modalidad, el ácido nucleico codifica una PHSRP de Physcomitrella patens que ocurre naturalmente.

Utilizando los métodos arriba descritos, y otros conocidos por aquellos de habilidad en el oficio, alguien de ordinaria habilidad en el oficio puede aislar homólogos de la PHSRP que comprenden una secuencia del aminoácido mostrada en la SEQ ID NO:13 y los ácidos nucleicos de PHSRP que comprenden una secuencia del ácido nucleico como se muestra en la SEQ ID NO : 8. Un subconjunto de estos homólogos son variantes alélicas. Como se utiliza aquí, el término "variante alélica" se refiere a una secuencia del nucleótido que contiene polimorfismos que conducen a cambios en la secuencia de aminoácidos de una PHSRP y que existe dentro de una población natural (por ejemplo, una especie o variedad de planta). Tales variaciones alélicas naturales pueden resultar usualmente en una variación de 1-5% en un ácido nucleico de PHSRP. Las variantes alélicas se pueden identificar por secuenciación de la secuencia del ácido nucleico de interés en un número de diferentes plantas, que se pueden realizar fácilmente utilizando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético de PHSRP en aquellas plantas. Cualquiera y todas las variaciones de ácidos nucleicos y polimorfismos o variaciones de aminoácido resultantes en una PHSRP que son el resultado de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional de una PHSRP, se pretenden para estar dentro del alcance de la invención.

Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico que codifican las PHSRPs a partir de la misma u otra especie tal como análogos, ortólogos y parálogos, de PHSRP son: contempladas. Como se utiliza aquí, el término "análogos" se refiere a dos ácidos nucleicos que tienen la misma o similar función, pero que han evolucionado individualmente en organismos no-relacionados. Como se utiliza aquí, el término "ortólogos" se refiere a dos ácidos nucleicos de diferentes especies, pero que han evolucionado de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican las proteínas que tienen la misma o similar función. Como también se utiliza aquí, el término "parálogos" se refiere a dos ácidos nucleicos que se relacionan por duplicado dentro de un genoma. Los parálogos usualmente tienen diferentes funciones, pero estas funciones se pueden relacionar (Tatusov, R.L. et al. 1997 Science 278(5338):631-637). Los análogos, ortólogos y parálogos de una PHSRP que ocurren naturalmente puede diferir de la PHSRP que ocurre naturalmente por modificaciones pos-translacionales, por diferencias de secuencia del aminoácido, o por ambos. Las modificaciones pos-translacionales incluyen derivatización química in vivo e in vitro de los polipéptidos, por ejemplo, acetilación, carboxilación, fosforilación, o glicosilación, y tales modificaciones pueden ocurrir durante la síntesis o elaboración del polipéptido o siguiente tratamiento con enzimas modificadas aisladas. En particular, los ortólogos usualmente mostraran al menos 80-85%, más preferiblemente 90%, y más preferiblemente 95%, 96%, 97%, 98% o aún 99% de identidad u homología con toda o parte de una secuencia del aminoácido de PHSRP que ocurre naturalmente y mostrarán una función similar a una PHSRP. Los ortólogos también son capaces preferiblemente de participar en la respuesta de estrés en plantas. En una modalidad, los ortólogos de PHSRP mantienen la capacidad de participar en el metabolismo de los compuestos necesarios para la construcción de las membranas celulares en Physcomitrella patens, o en el transporte de moléculas a través de estas membranas.

Además de las variantes de una secuencia de PHSRP que ocurre naturalmente que puede existir en la población, el artesano de habilidad además apreciará que se puedan introducir cambios por mutación en una secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:8, por consiguiente conducen a cambios en la secuencia del aminoácido de la PHSRP codificada, sin alterar la capacidad funcional de la PHSRP: Por ejemplo, las sustituciones del nucleótido conducen a sustituciones del aminoácido en los residuos de aminoácidos "no-esencial" se pueden hacer en una secuencia de la SEQ ID NO:8. Un residuo de aminoácido "no-esencial" es un residuo que se puede alterar a partir de la secuencia de tipo salvaje de una de las PHSRPs sin alterar la actividad de dicha PHSRP, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" se requiere para la actividad de PHSRP. Otros residuos de aminoácidos, sin embargo, (por ejemplo, aquellos que no se conservan o solamente se semi-conservan en el dominio que tiene actividad de PHSRP) no pueden ser esenciales para la actividad y de esta manera probablemente sean susceptibles a la alteración, sin alterar la actividad de PHSRP.

Por consiguiente, otro aspecto de la invención pertenece a las moléculas de ácido nucleico que codifican las PHSRPs que contienen cambios en los residuos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad de PHSRP. Tales PHSRPs difieren en la secuencia del aminoácido a partir de una secuencia contenida en la SEQ ID NO:13, no obstante retienen al menos una de las actividades de PHSRP descritas aquí. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico aislado comprende una secuencia de nucleótido que codifica una proteína, en donde la proteína comprende una secuencia del aminoácido al menos aproximadamente 96% homóloga a una secuencia del aminoácido de la SEQ ID NO:13. Preferiblemente, la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico es al menos 96%, 97%, 98%, o 99% homóloga a la secuencia de la SEQ ID NO:13. Los homólogos de PHSRP preferidos de la presente invención son preferiblemente capaces de participar en la respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o más particularmente, participar en la transcripción de una proteína involucrada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta de Physcomitrella patens, o tienen una o más de las actividades publicadas en la Tabla 1.

Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica una PHSRP homóloga a una proteína secuencia de la SEQ ID NO:13: se puede crear introduciendo una o más sustituciones de nucleótido, adiciones o deleciones en una secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:8 de modo que una o más sustituciones, adiciones o deleciones del aminoácido se introducen en la proteína codificada. Las mutaciones se pueden introducir en una de la secuencias de la SEQ ID NO:8 por técnicas estándar, tal como mutagénesis de sitio dirigido y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácido conservadoras se hacen en uno o más residuos predichos de aminoácidos no-esenciales. Una "sustitución de aminoácido conservador" es una en la cual el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar.

Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en el oficio. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, un residuo de aminoácido no-esencial predicho en una PHSRP preferiblemente se reemplaza con otro residuo de aminoácido a partir de la misma familia de cadena lateral. Como alternativa, en otra modalidad, las mutaciones se pueden introducir aleatoriamente a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante de PHSRP, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden seleccionar para una actividad de PHSRP descrita aquí para identificar los mutantes que retienen la actividad de PHSRP. Continuando la mutagénesis de la secuencia de la SEQ ID NO : 8 la proteína codificada se puede expresar de manera recombinante y la actividad de la proteína se puede determinar por análisis de la tolerancia al estrés de una planta que expresa la proteína como se describe en el Ejemplo 7.

Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican la PHSRPs descritas arriba, las moléculas de ácido nucleico aislado que son antisentido a estas se contemplan. Un ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a un ácido nucleico "sentido" que codifica una proteína, por ejemplo, complementaria a la que codifica la cadena de una molécula de cADN bicatenaria o complementaria a una secuencia de mARN. Por consiguiente, un ácido nucleico antisentido puede unir un hidrógeno a un ácido nucleico sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una cadena codificante de PHSRP, o a solamente una porción de esta. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido a una "región codificante" de la cadena codificante de una secuencia de nucleótido que codifica una PHSRP. El término "región codificante" se refiere a la región de la secuencia de nucleótido que comprende los codones que son traducen en residuos de aminoácidos (por ejemplo, la región codificante total de ``comprende los nucleótidos 1 a ....). En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido a una "región no codificante" de la cadena codificante de una secuencia de nucleótido que codifica una PHSRP. El término "región no codificante" se refiere a las secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificante que no se traduce en aminoácidos (i.e., también se refiere a las regiones 5' y 3' no traducidas).

En una modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico aislado comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótido mostrada en la SEQ ID NO:8, o una porción de estas. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la secuencia de nucleótido mostrada en la SEQ ID NO:8 es una que es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótido mostrada en la SEQ ID NO:8 de modo que esta puede hibridizar a la secuencia de nucleótido mostrada en la SEQ ID NO:8, por consiguiente formar un dúplex estable.

Dadas las secuencias de la cadena codificante que codifican la PHSRP reveladas aquí (por ejemplo, la secuencia divulgada en la SEQ ID NO:8), los ácidos nucleicos antisentido se pueden designar de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases de Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la región codificante total de un mARN de PHSRP, pero más preferiblemente es un oligonucleótido el cual es antisentido a solamente una porción de la región codificante o no codificante de un mARN de PHSRP. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región circundante del sitio inicial de traducción del mARN de PHSRP. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos de longitud.

Un ácido nucleico antisentido se puede construir utilizando síntesis química y reacciones de unión enzimática utilizando procedimientos conocidos en el oficio. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) se puede sintetizar químicamente utilizando los nucleótidos que ocurren naturalmente o nucleótidos modificados de diferente modo, designados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ejemplo, se pueden utilizar, derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos de acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden utilizar para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-clorouracil, 5-yodouracil, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracil, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracil, dihidrouracil, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracil, 5-metoxiaminometil-2-tiouracil, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracil, 5-metoxiuracil, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracil, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, ácido uracil-5-oxiacético metilester, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracil, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Como alternativa, el ácido nucleico antisentido se puede producir biológicamente utilizando un vector de expresión en el cual un ácido nucleico ha sido subclonado en una orientación antisentido (i.e., ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado será de una orientación antisentido para un ácido nucleico diana de interés, descrito además en el siguiente apartado).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido usualmente se administran a una célula o generan in situ de modo que hibridizan con o se unen a un mARN celular y/o ADN genómico que codifica una PHSRP para inhibir, por consiguiente la expresión de la proteína, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser por complementariedad convencional del nucleótido para formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se una a ADN dobles, a través de interacciones específicas en la ranura principal de la doble hélice. La molécula antisentido se puede modificar de modo que esta, se una específicamente a un receptor o un antígeno expresados sobre una superficie celular seleccionada, por ejemplo, uniendo la molécula del ácido nucleico antisentido a un péptido o un anticuerpo que se une a un receptor o antígeno de la superficie celular. La molécula de ácido nucleico antisentido también se puede entregar a las células utilizando los vectores descritos aquí. Para lograr concentraciones intracelulares de las moléculas antisentido suficientes, se prefieren, construcciones del vector en el cual la molécula de ácido nucleico antisentido se coloca bajo el control de un promotor fuerte procariota, viral, o eucariota (incluyendo planta).

En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico antisentido es una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica. Una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con el ARN complementario en el cual, contrario a las unidades-\beta usuales, las cadenas corren paralelas a cada una (Gaultier et al., 1987 Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede contener un 2'-o-metilribonucleótido (Inoue et al., 1987 Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) o una análogo quimérico de ARN-ADN (Inoue et al., 1987 FEBS Lett. 215:327-330).

No obstante en otra modalidad, un ácido nucleico antisentido es una ribozima. Las ribozimas son moléculas catalíticas de ARN con actividad ribonucleasa que son capaces de dividir un ácido nucleico monocatenario, tal como un mARN, al cual ellas tienen una región complementaria. Así, las ribozimas (por ejemplo, las ribozimas de cabeza de martillo descritas en Haselhoff y Gerlach, 1988 Nature 334:585-591) se pueden utilizar para dividir catalíticamente las transcripciones de mARN de PHSRP para inhibir, por consiguiente la traducción del mARN de PHSRP. Una ribozima que tiene especificidad para un PHSRP- ácido nucleico codificante se puede designar basándose en la secuencia de nucleótido de un cADN de la PHSRP, como se revela aquí (i.e., SEQ ID NO:8) o con base en una secuencia heteróloga que se aísla de acuerdo con métodos explicados en esta invención. Por ejemplo, un derivado de un ARN de Tetrahymena L-19 IVS se puede construir en el cual la secuencia de nucleótido del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótido que se divide en un PHSRP-mARN codificante. Ver, por ejemplo, Cech et al. Patente U.S. No. 4,987,071 y Cech et al. Patente U.S. No. 5,116,742. Como alternativa, se pueden utilizar un mARN de la PHSRP para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad ribonucleasa específica a partir de mezclas de moléculas de ARN. (Ver, por ejemplo, Bartel, D. y Szostak, J.W., 1993 Science 261:1411-1418).

Como alternativa, la expresión génica de PHSRP se puede inhibir dirigiendo la secuencia de nucleótidos complementaria a la región reguladora de una secuencia de nucleótido de PHSRP (por ejemplo, un promotor y/o potenciador de PHSRP) para formar estructuras helicoidales triples que previenen la transcripción de un gen de PHSRP en células diana. Ver usualmente, Helene, C., 1991 Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. et al., 1992 Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; and Maher, L.J., 1992 Bioassays 14(12):807-15.

Además de los ácidos nucleicos y proteínas de PHSRP descritos arriba, estos ácidos nucleicos y proteínas unidos a una fracción también se contemplan. Estas fracciones incluyen, pero no se limitan a, fracciones de detección, fracciones de hibridación, fracciones de purificación, fracciones de entrega, fracciones de reacción, fracciones de enlace, y similares. Un ácido nucleico típico unido a una fracción es una sonda/cebador. La sonda/cebador usualmente comprende una región de la secuencia de nucleótido que hibridiza bajo condiciones rigurosas a al menos aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 25, más preferiblemente aproximadamente 40, 50 o 75 nucleótidos consecutivos de una cadena sentido de la secuencia divulgada en la SEQ ID NO:8, una secuencia anti-sentido de la secuencia divulgada en la SEQ ID NO:8, o mutantes de estas que ocurren naturalmente. Los cebadores basados en una secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:8 se pueden utilizar en reacciones PCR para clonar los homólogos de PHSRP. Las sondas basadas en la secuencia de nucleótidos de PHSRP se pueden utilizar para detectar transcripciones o secuencias genómicas que codifican la misma o las proteínas homólogas. En modalidades preferidas, la sonda además comprende un grupo marcador unido a esta, por ejemplo el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un co-factor de la enzima. Tales sondas se pueden utilizar como parte de un kit de prueba de marcador genómico para identificar células que expresan una PHSRP, tal como midiendo un nivel de un ácido nucleico codificante de PHSRP, respectivamente, en una muestra de células, por ejemplo, detectando los niveles del mARN de la PHSRP o determinando si un gen de PHSRP genómico se ha mutado o suprimido.

En particular, un método útil para determinar el nivel de transcripción del gen (un indicador de la cantidad de mARN disponible para la traducción al producto génico) es para realizar un Northern blot (para referencia ver, por ejemplo, Ausubel et al., 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). Esta información al menos parcialmente demuestra el grado de transcripción del gen transformado. El ARN celular total se puede preparar a partir de células, tejidos u órganos por varios métodos, todos bien conocidos en el oficio, tal como el que se describe en Bormann, E.R. et al., 1992 Mol. Microbiol. 6: 317-326. Para evaluar la presencia o cantidad relativa de proteína traducida de este mARN, técnicas estándar, tal como un Western blot, se pueden emplear. Estas técnicas son bien conocidas por alguien de ordinaria habilidad en el oficio. (Ver, por ejemplo, Ausubel et al., 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York).

La invención además proporciona un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico de PHSRP como se describe arriba, en donde la expresión del vector en una célula huésped resulta en el incremento de la tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula huésped. Como se utiliza aquí, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual esta ha sido ligada. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el cual los segmentos de ADN adicionales se pueden ligar. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los segmentos de ADN adicionales se pueden ligar en el genoma viral. Ciertos vectores tienen la capacidad de la replicación autónoma en una célula huésped dentro de la cual se introducen (por ejemplo, los vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamífero episomal). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no-episomal) se integran en el genoma de una célula huésped en la introducción en la célula huésped, y por consiguiente se replican a lo largo del genoma huésped. Adicionalmente, ciertos vectores son capaces de direccionar la expresión de genes a los cuales ellos se ligan operativamente. Tales vectores se refieren aquí como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante está a menudo en la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" se pueden utilizar de forma intercambiable como el plásmido es la forma de vector más utilizada comúnmente. Sin embargo, la invención se pretende para incluir otras formas de vectores de expresión, tal como vectores virales (por ejemplo, replicación defectuosa retrovirus, adenovirus y adeno-virus asociada), que presta funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma apropiada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionados con base en las células huésped que se utilizaran para la expresión, que se ligan operativamente a la secuencia del ácido nucleico para ser expresada. Dentro de un vector de expresión recombinante, "ligado operablemente" tiene el sentido de que la secuencia de nucleótido de interés se liga a la(s) secuencia(s) reguladora(s) de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótido (por ejemplo, en un sistema de transcripción/ traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped). El término "secuencia reguladora" se pretende para incluir promotores, potenciadores y otros elementos control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) o ver: Gruber and Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, eds. Glick and Thompson, Chapter 7, 89-108, CRC Press: Boca Raton, Florida, incluyendo las references en esta. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótido en muchos tipos de células huésped y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótido solamente en ciertas células huésped o bajo ciertas condiciones. Será apreciado por aquellos de habilidad en el oficio que el diseño del vector de expresión puede depender de tales factores como el cambio de la célula huésped que se transformará, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en células huésped para producir por consiguiente las proteínas o péptidos, incluyendo proteínas de fusión o péptidos, codificados por un ácido nucleico según se describe aquí (por ejemplo, PHSRP, formas mutantes de PHSRP, proteínas de fusión, etc.).

Los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden designar para la expresión de PHSRPs en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, los genes PHSRP se pueden expresar en células bacterianas tal como C. glutamicum, células de insecto (utilizando vectores de expresión de baculovirus), levadura y otras células fúngicas (ver Romanos, M.A. et al., 1992 Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. et al., 1991 Heterologous gene expression in filamentous fungi, in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego; and van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J., 1991 Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatore et al., 1999 Marine Biotechnology 1(3):239-251), ciliados de los tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella, y Stylonychia, especialmente del género Stylonychia lemnae con los vectores siguiendo un método de transformación como se describe en WO 98/01572 y células de planta multicelulares (ver Schmidt, R. and Willmitzer, L., 1988 High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants, Plant Cell Rep. 583-586); Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, chapter 6/7, S.71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. Kung und R. Wu, 128-43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42:205-225 y referencias citadas en esta) o células de mamífero. Las células huésped apropiadas se discuten además en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990). Como alternativa, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo utilizando secuencias reguladoras promotor T7 y polimerasa T7.

La expresión de proteínas en procariotas la mayoría de las veces se realiza con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que direccionan la expresión de ya sea proteínas de fusión o no-fusión. Los vectores de fusión adicionan un número de aminoácidos a una proteína codificada en esta, usualmente al amino terminal de la proteína recombinante pero también al C-terminal o fusionado dentro de regiones apropiadas en las proteínas. Tales vectores de fusión usualmente prestan tres propósitos: 1) incrementan la expresión de una proteína recombinante; 2) incrementan la solubilidad de una proteína recombinante; y 3) ayudan en la purificación de una proteína recombinante actuando como un ligando en purificación de afinidad. Frecuentemente, en los vectores de expresión de fusión, un sitio de división proteolítica se introduce en el empalme de la fracción de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante de la fracción de fusión subsiguiente a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento consanguíneas, incluyen el Factor Xa, trombina y enteroquinasa.

Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Johnson, K.S., 1988 Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan la glutationa S-transferasa (GST), proteína de enlace E maltosa, o proteína A, respectivamente, a la proteína diana recombinante. En una modalidad, la secuencia codificante de la PHSRP se clona dentro de un vector de expresión pGEX para crear un vector que codifica una proteína de fusión que comprende, a partir del N-terminal al C-terminal, el sitio de división GST-trombina-proteína X. La proteína de fusión se puede purificar por cromatografía de afinidad utilizando resina glutationa-agarosa. La PHSRP recombinante sin fundir a la GST se puede recuperar por división de la proteína de fusión con trombina.

Ejemplos de apropiados vectores de expresión de E. coli no-fusión inducible incluyen pTrc (Amann et al., 1988 Gene 69:301-315) y pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). La expresión génica dirigida del vector pTrc depende de la transcripción de la polimerasa del ARN huésped a partir de un promotor de fusión trp-lac híbrido. La expresión génica dirigida a partir del vector pET 11d depende de la transcripción de un promotor de fusión T7 gn10-lac mediado por una polimerasa de ARN viral co-expresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral se suple por cepas huéspedes BL21(DE3) o HMS174(DE3) de un profago \lambda residente que hospeda un gen T7 gn1 bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5.

Una estrategia para maximizar la expresión de la proteína recombinante es expresar la proteína en una bacteria huésped con una capacidad deteriorada para dividir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia del ácido nucleico que se insertará en un vector de expresión así que los codones individuales para cada aminoácido son aquellos utilizados preferentemente en la bacteria seleccionada para la expresión, tal como C. glutamicum (Wada et al., 1992 Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Tal alteración de secuencias del ácido nucleico de la invención se puede realizar por técnicas estándar de síntesis de ADN.

En otra modalidad, el vector de expresión de PHSRP es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para la expresión en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari, et al., 1987 Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982 Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987 Gene 54:113-123), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Los vectores y métodos para la construcción de vectores apropiados para utilizar en otros hongos, tal como el hongo filamentoso, incluyen aquellos detallados en: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) ``Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.

Como alternativa, las PHSRPs de la invención se puede expresar en células de insecto utilizando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células Sf 9) incluyen las series pAc (Smith et al., 1983 Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y las series pVL (Lucklow y Summers, 1989 Virology 170: 31-39).

En otra modalidad, un ácido nucleico de PHSRP de la invención se expresa en las células de mamífero utilizando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, B., 1987 Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al., 1987 EMBO J. 6:187-195). Cuando se utiliza en células de mamífero, las funciones control del vector de expresión son a menudo proporcionadas por elementos reguladores virales. Por ejemplo, comúnmente se utilizan los promotores derivados del polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y Simian Virus 40. Para otros sistemas de expresión apropiados para las células procariota y eucariota ver capítulos 16 y 17 de Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor-Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

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En otra modalidad, el vector de expresión de mamífero recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (por ejemplo, se utilizan elementos reguladores específicos de tejido para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos de tejido se conocen en el oficio. Los ejemplos no-limitantes de apropiados promotores específicos de tejido incluyen el promotor de albúmina (hígado-específico; Pinkert et al., 1987 Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos de linfoide (Calame and Eaton, 1988 Adv. Immunol. 43:235-275), en particular promotores de los receptores de célula T (Winoto and Baltimore, 1989 EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et al., 1983 Cell 33:729-740; Queen and Baltimore, 1983 Cell 33:741-748), promotores específicos de neurona (por ejemplo, el promotor de neurofilamento; Byrne and Ruddle, 1989 PNAS 86:5473-5477), promotores específicos de páncreas (Edlund et al., 1985 Science 230:912-916), y promotores específicos de glándulas mamarias (por ejemplo, promotor de suero de leche; Patente U.S. No. 4,873,316 y European Aplicación Publication No. 264,166). También se abarcan los promotores reguladores del crecimiento, por ejemplo, los promotores hox murine (Kessel and Gruss, 1990 Science 249:374-379) y el promotor de proteína fetal (Campes and Tilghman, 1989 Genes Dev. 3:537-546).

En otra modalidad, la PHSRP de la invención se puede expresar en células de la planta unicelulares (tal como algas) (ver Falciatore et al., 1999 Marine Biotechnology 1(3):239-251 y referencias en esta) y células de la planta de plantas superiores (por ejemplo, los espermatofitos, tal como plantas de cultivo). Ejemplos de vector de expresión de la plantas incluyen aquellos detallados en: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R., 1992 New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; and Bevan, M.W., 1984 Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12:8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

Un casete de expresión de la planta preferiblemente contiene secuencias reguladoras capaces de conducir la expresión génica en células de la planta y ligar operablemente así que cada secuencia puede cumplir a cabalidad su función, por ejemplo, la terminación de la transcripción por señales de poliadenilación. Las señales de poliadenilación preferidas son aquellas que se originan del t-ADN del Agrobacterium tumefaciens tal como el gen 3 conocido como octopina sintasa del Ti-plásmido pTiACH5 (Gielen et al., 1984 EMBO J. 3:835) o equivalentes funcionales de este pero también todos los terminadores funcionalmente activos en plantas son apropiados.

Como la expresión génica de la planta es muy frecuente no se limita a los niveles transcripcionales, un casete de expresión de la planta preferiblemente contiene otras secuencias ligadas operablemente como potenciadores translacionales tal como la secuencia superdirecta que contiene las 5'-secuencia líder no traducida del virus del mosaico del tabaco que potencia la proteína por en índice de ARN (Gallie et al., 1987 Nucl. Acids Research 15:8693-8711).

La expresión génica de la planta se ha ligado operablemente a un promotor apropiado que confiere la expresión génica en el momento, célula o tejido específico. Se prefieren los promotores que conducen la expresión constitutiva (Benfey et al., 1989 EMBO J. 8:2195-2202) como los derivados de los virus de las plantas como el 35S CAMV (Franck et al., 1980 Cell 21:285-294), el 19S CaMV (ver también Patente U.S. No. 5352605 y Aplicación PCT No. WO 8402913) o promotores de la planta como aquellos de la subunidad pequeña de Rubisco descritos en la Patente U.S. No. 4,962,028.

Otras secuencias preferidas para utilizar en casetes de expresión génica de la planta son secuencias dirigidas necesarias para dirigir el producto génico en su compartimiento celular apropiado (para revisión ver Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 15(4): 285-423 y las referencias citadas en esta) tal como la vacuola, el núcleo, todos los tipos de plástidos como amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, el espacio extracelular, mitocondria, el retículo endoplasmático, cuerpos oleosos, peroxisomas y otros compartimientos de las células de la planta.

La expresión génica de la planta también se pueden facilitar vía un promotor inducible (para revisión ver Gatz, 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108). Los promotores químicos inducibles son especialmente apropiados si se quiere que la expresión génica se produzca de manera específica en un tiempo. Ejemplos de tales promotores son un promotor inducible de ácido salicílico (Aplicación PCT No. WO 95/19443), un promotor inducible de tetraciclina (Gatz et al., 1992 Plant J. 2:397-404) y un promotor inducible de etanol (Aplicación PCT No. WO 93/21334).

También, los promotores apropiados que responden a condiciones de estrés biótico o abiótico son aquellos tal como el promotor PRP1-gen inducible por patógeno (Ward et al., 1993 Plant. Mol. Biol. 22:361-366), el promotor-hsp80 inducible por calor a partir del tomate (Patente U.S. No. 5187267), promotor alfa-amilasa inducible por frío a partir de la patata (Aplicación PCT No. WO 96/12814) o el promotor-pinII inducible por lesión (Patente Europea No. 375091). Para otros ejemplos de promotores inducibles por sequía, frío, y sal, tal como el promotor RD29A, ver Yamaguchi-Shinozalei et al. (1993 Mol. Gen. Genet. 236:331-340).

Se prefieren especialmente aquellos promotores que confieren la expresión génica en tejidos y órganos específicos, tal como células oclusivas y las células de la raíz capilar. Los promotores apropiados incluyen el promotor del gen napin a partir del semilla de colza (Patente U.S. No. 5608152), el promotor-USP a partir de la Vicia faba (Baeumlein et al., 1991 Mol Gen Genet. 225(3):459-67), el promotor-oleosin de la Arabidopsis (Aplicación PCT No. WO 98/45461), el promotor-faseolin del Phaseolus vulgaris (Patente U.S. No. 5504200), el promotor-Bce4 del Brassica (Aplicación PCT No.WO91/13980) o el promotor B4 de legumina (LeB4; Baeumlein et al., 1992 Plant Journal, 2(2):233-9) así como los promotores que confieren la expresión específica de la semilla en plantas monocotiledóneas como el maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Los promotores apropiados para percibir son, los promotores de gen 1pt2 o 1pt1 a partir de la cebada (Aplicación PCT No. WO 95/15389 y Aplicación PCT No. WO 95/23230) o aquellos descritos en la Aplicación PCT No.WO99/16890 (promotores del gen hordein de la cebada, gen glutelin del arroz, gen oryzin del arroz, gen prolamin del arroz, gen gliadin del trigo, gen glutelin del trigo, gen zein del maíz, gen glutelin de la avena, gen kasirin del Sorghum y gen secalin del centeno).

También son especialmente apropiados los promotores que confieren expresión génica específica del plástico, dado que los plástidos son el compartimiento donde la biosíntesis de lípidos ocurre. Son promotores apropiados, el promotor de polimerasa de ARN viral descrito en la Aplicación PCT No.WO95/16783 y Aplicación PCT No.WO97/06250 y el promotor-clpP de la Arabidopsis descrito en la Aplicación PCT No. WO 99/46394.

La invención además proporciona un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de PHSRP de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Es decir, la molécula de ADN se liga operativamente a una secuencia reguladora de una manera que permite la expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido a un mARN de PHSRP. Las secuencias reguladoras ligadas operativamente a una molécula de ácido nucleico clonada en la orientación antisentido puede ser seleccionada, la cual dirige la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en una variedad de tipos de células. Por ejemplo, promotores y/o potenciadores virales, o secuencias reguladoras pueden ser seleccionados para dirigir la expresión constitutiva, específica al tejido o específica al tipo de célula del ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede ser en la forma de un plásmido recombinante, fagómido o virus atenuado en donde los ácidos nucleicos antisentido se producen bajo el control de una región reguladora de alta eficiencia. La actividad de la región reguladora se puede determinar por el tipo de célula en la cual el vector se introduce. Para una discusión de la regulación de expresión génica utilizando genes antisentido ver Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1 (1) 1986 and Mol et al., 1990 FEBS Letters 268:427-430.

Otro aspecto de la invención pertenece a las células huésped en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula huésped" y " célula huésped recombinante " se utilizan de forma intercambiable aquí. Se entiende que dichos términos no solamente se refieren a la célula del sujeto particular sino también aplican a la progenie o progenie potencial de tal célula. Debido a ciertas modificaciones pueden ocurrir en las siguientes generaciones debido a la mutación o las influencias ambientales, tal progenie no puede, de hecho, ser idéntica a la célula madre, pero no obstante se incluye dentro del alcance del término como se utiliza aquí.

Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, una PHSRP se puede expresar en células bacterianas tal como C. glutamicum, células de insecto, células fungicas o células de mamífero (tal como células de ovario de hámster Chino (CHO) o células COS), algas, ciliados, células de la planta, hongo u otros microorganismos como C. glutamicum. Otras células huésped apropiadas se conocen por aquellos de habilidad en el oficio.

Un Vector de ADN se puede introducir en las células procariotas o eucariotas vía técnicas convencionales de transformación o transfección. Como se utiliza aquí, los términos "transformación", "transfección", "conjugación" y "transducción" se pretenden para referirse a una variedad de ténicas reconocidas en el oficio para introducir el ácido nucleico foráneo (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, incluyendo co-precipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección DEAE-dextran-mediada, lipofección, competencia natural, tranferencia química-mediada y electroporación. Los métodos apropiados para la transformación o transfección de células huésped incluyendo las células de la planta se pueden encontrar en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, ed: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Como tolerancia al estrés biótico y abiótico es un rasgo general deseado para ser heredado en una amplia variedad de plantas como el maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, soja, maní, algodón, semilla de colza y canola, yuca, pimienta, girasol y tagetes, plantas solanacéas como patata, tabaco, berenjena, y tomate, especie Vicia, guisante, alfalfa, plantas de arbusto (café, cacao, té), especie Salix, árboles (aceite palma, coco), hierbas perennes y cultivos de forraje, estas plantas de cultivo también son plantas objetivo preferidas para una ingeniería genética como otra modalidad de la presente invención.

En particular, la invención proporciona un método de producción de una planta transgénica con un ácido nucleico que codifica la PHSRP, en donde la expresión del ácido nucleico(s) en la planta resulta en el incremento de la tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta que comprende: (a) transformación de una célula vegetal con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de PHSRP, y (b) producción de la célula vegetal de una planta transgénica con un incremento de la tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La invención también proporciona un método de aumento de la expresión de un gen de interés dentro de una célula huésped en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula huésped, en donde el gen de interés se transcribe en respuesta a una PHSRP, que comprende: (a) transformación de la célula huésped con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la PHSRP, y (b) que expresa la PHSRP dentro de la célula huésped, por consiguiente aumento de la expresión del gen transcrito en respuesta a la PHSRP, en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula
huésped.

Para dicha transformación de la planta, se pueden utilizar vectores binarios tal como pBinAR (Höfgen and Willmitzer, 1990 Plant Science 66:221-230). La construcción de los vectores binarios se puede realizar por la unión del cADN en orientación sentido o antisentido en el T-ADN. El cebador-5 en el cADN de una planta promotor activa la transcripción del cADN. Una secuencia de poliadenilación se localiza en el cebador-3 en el cADN. La expresión de tejido-específico se puede lograr utilizando un promotor específico al tejido. Por ejemplo, la expresión de semilla-específica se puede lograr por clonación del cebador-5 del promotor napin o LeB4 o USP en el cADN. También, cualquier otro elemento del promotor semilla específico se puede utilizar. Para la expresión constitutiva se puede utilizar dentro de la planta completa, el promotor CaMV 35S. La proteína expresada se puede dirigir a un compartimiento celular utilizando un péptido señal, por ejemplo para plástidos, mitocondria o retículo endoplasmático (Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 4 (15): 285-423). El péptido señal es el cebador-5 clonado en marco en el cADN para comprimir la localización subcelular de la proteína de fusión. Adicionalmente, los promotores que son sensibles a tensiones abióticas se pueden utilizar con, tal como el promotor RD29A de Arabidopsis, las secuencias del ácido nucleico reveladas aquí. Alguien de habilidad en el oficio reconocerá que el promotor utilizado debería ser ligado operativamente al ácido nucleico de modo que el promotor causa la transcripción del ácido nucleico que resulta en la síntesis de un mARN que codifica un polipéptido. Como alternativa, el ARN puede ser un ARN antisentido para un uso posterior, en cuanto a la expresión del mismo u otro gen o genes.

Los métodos de transfección alternos incluyen la transferencia directa del ADN en las flores desarrolladas vía electroporación o transferencia génicamediada del Agrobacterium. La transformación mediada de Agrobacterium de la planta se puede realizar utilizando por ejemplo la cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101(pMP90) (Koncz and Schell, 1986 Mol. Gen. Genet. 204:383-396) o LBA4404 (Clontech). La transformación se puede realizar por técnicas estándar de transformación y regeneración (Deblaere et al., 1994 Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788; Gelvin, Stanton B. and Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2nd Ed. - Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. - in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton : CRC Press, 1993. - 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Por ejemplo, la semilla de colza se puede transformar vía transformación de cotiledón o hipocotil (Moloney et al., 1989 Plant cell Report 8:238-242; De Block et al., 1989 Plant Physiol. 91: 694-701). El uso de antibiótico para el Agrobacterium y la selección de la planta dependen del vector binario y la cepa de Agrobacterium utilizada para la transformación. La selección de la semilla de colza normalmente se realiza utilizando kanamicina como un marcador genético de planta. La transferencia génica mediada de Agrobacterium para lino se puede realizar utilizando, por ejemplo, una técnica descrita por Mlynarova et al., 1994 Plant Cell Report 13:282-285. Adicionalmente, la transformación de la soja se puede realizar utilizando por ejemplo una técnica descrita en Patente Europea No. 0424 047, Patente U.S. No. 5,322,783, Patente Europea Aplicación No. 0397 687, Patente U.S. No. 5,376,543 o Patente U.S. No. 5,169,770. La transformación del maíz se puede lograr por bombardeo de partículas, reabsorción del ADN mediado de polietilenglicol o vía la técnica de fibra de carburo de silicona. (Ver, por ejemplo, Freeling and Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Un ejemplo específico de la transformación del maíz se encuentra en la Patente U.S. No. 5,990,387 y un ejemplo específico de la transformación del trigo se puede encontrar en la Aplicación PCT No. WO 93/07256.

Para la transfección estable de células de mamífero, se conoce que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección utilizada, solamente una pequeña fracción de células puede integrar el ADN foráneo en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador genético (por ejemplo, resistencia a los antibióticos) usualmente, se introduce en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores genéticos preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato o en plantas que confieren resistencia hacia un herbicida tal como glifosato o glufosinato. Las moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador genético se pueden introducir en una célula huésped en el mismo vector como aquel que codifica una PHSRP o se puede introducir en un vector separado. Las células transfectadas establemente con la molécula de ácido nucleico introducida se pueden identificar por, por ejemplo, selección de fármaco (por ejemplo, células que tienen incorporado el gen del marcador genético sobrevivirán, mientras las otras células morirán).

Para crear un microorganismo recombinante homólogo, se prepara un vector que contiene al menos una porción de un gen de PHSRP en el cual se ha introducido una deleción, adición o sustitución para alterar por consiguiente, por ejemplo, desestabiliza funcionalmente, el gen de PHSRP. Preferiblemente, el gen de PHSRP es un gen dePHSRP de Physcomitrella patens, pero, puede ser un homólogo de una planta relacionada o aún de una fuente de un mamífero, levadura, o insecto. En una modalidad preferida, el vector se designa de modo que, bajo recombinación homóloga, el gen de PHSRP endógeno se desestabiliza funcionalmente (i.e., ya no codifica una proteína funcional; también se refiere como un vector desactivado). Como alternativa, el vector se puede designar de modo que, bajo recombinación homóloga, el gen endógeno de PHSRP se muta o de otra manera se altera pero aún codifica una proteína funcional (por ejemplo, la dirección a 5' región reguladora se puede alterar por consiguiente para alterar la expresión de la PHSRP endógena). Para crear un punto de mutación vía recombinación homóloga, los híbridos de ADN-ARN se pueden utilizar en una técnica conocida como quimeroplastia (Cole-Strauss et al., 1999 Nucleic Acids Research 27(5):1323-1330 and Kmiec, 1999 Gene therapy American Scientist. 87(3):240-247). Los procedimientos de recombinación homólogos en Physcomitrella patens son también bien conocidos en el oficio y se contemplan para utilizar aquí.

Mientras que en el vector de recombinación homóloga, la porción alterada del gen de PHSRP se flanquea en sus terminales 5' y 3' por una molécula adicional de ácido nucleico del gen de PHSRP dando ocasión a que se produzca la recombinación homóloga entre el gen exógeno de PHSRP llevado por el vector y un gen endógeno de PHSRP, en un microorganismo o planta. La molécula de ácido nucleico PHSRP adicional flanqueada es de una longitud suficiente para la exitosa recombinación homóloga con el gen endógeno. Usualmente, varios cientos de pares de bases hasta kilobases del ADN flanqueante (ambos en los terminales 5' y 3') se incluyen en el vector (ver por ejemplo, Thomas, K.R., and Capecchi, M.R., 1987 Cell 51:503 para una descripción de vectores de recombinación homóloga o Strepp et al., 1998 PNAS, 95 (8):4368-4373 para cADN basada en la recombinación en Physcomitrella patens). El vector se introduce en un microorganismo o célula vegetal (por ejemplo, vía ADN mediado de polietilenglicol), y células en las cuales el gen de PHSRP introducido tiene homología recombinada con el gen endógeno de PHSRP se seleccionan utilizando técnicas conocidas en el oficio.

En otra modalidad, los microorganismos recombinantes se pueden producir que contengan sistemas seleccionados los cuales dan ocasión a la expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo, inclusión de un gen de PHSRP sobre un vector colocando este bajo control de la operón lac permite la expresión del gen de PHSRP solamente en la presencia de IPTG. Tales sistemas reguladores son bien conocidos en el oficio.

Una célula huésped de la invención, tal como una célula huésped procariota o eucariota en cultivo, se pueden utilizar para producir (i.e., expresar) una PHSRP. Por consiguiente, la invención además proporciona los métodos para producir las PHSRPs utilizando las células huésped de la invención. En una modalidad, el método comprende el cultivo de la célula huésped de la invención (en la cual un vector de expresión recombinante que codifica una PHSRP ha sido introducido, o en la que el genoma ha sido introducido un gen que codifica una PHSRP de tipo-salvaje o alterada) en un medio apropiado hasta que se produce la PHSRP. En otra modalidad, el método además comprende el aislamiento PHSRPs del medio o la célula huésped.

Otro aspecto de la invención pertenece a la PHSRP aislada, y porciones activas biológicamente de esta. Una proteína "aislada" o "purificada" o porción activa biológicamente de esta es libre de algún material celular cuando se produce por técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La frase "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de PHSRP en las que la proteína se separa de alguno de los componentes celulares de las células en las que se produce naturalmente o de manera recombinante. En una modalidad, la frase "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de una PHSRP que tiene menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de material no-PHSRP (también se refiere aquí como una "proteína contaminante"), más preferiblemente menos de aproximadamente 20% de material no-PHSRP, aún más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de material no-PHSRP, y más preferiblemente menos de aproximadamente 5% material no-PHSRP.

Cuando la PHSRP o porción activa biológicamente de esta, se produce de manera recombinante, también preferiblemente es sustancialmente libre del medio de cultivo, i.e., el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente 10%, y más preferiblemente menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de la proteína. La frase "sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de PHSRP en las que la proteína se separa a partir de precursores químicos u otros productos químicos que se involucran en la síntesis de la proteína. En una modalidad, la frase "sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de una PHSRP que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de precursores químicos o productos químicos no-PHSRP, más preferiblemente menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o productos químicos no-PHSRP, aún más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o productos químicos no-PHSRP, y más preferiblemente menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o productos químicos no-PHSRP. En modalidades preferidas, las proteínas aisladas, o porciones activas biológicamente de estas, carecen de proteínas contaminantes del mismo organismo del cual la PHSRP se deriva. Usualmente, dichas proteínas se producen por expresión recombinante de, por ejemplo, una PHSRP de Physcomitrella patens en plantas diferente de Physcomitrella patens o microorganismos tal como C. glutamicum, ciliados, algas u hongos.

Las moléculas de ácido nucleico, proteínas, homólogos de proteína, proteínas de fusión, cebadores, vectores, y células huésped descritas aquí se pueden utilizar en uno o más de los siguientes métodos: identificación de Physcomitrella patens y organismos relacionados; cartografía de genomas de organismos relacionados a Physcomitrella patens; identificación y localización de secuencias de interés de Physcomitrella patens; estudios evolutivos; determinación de regiones de PHSRP requeridas para la función; modulación de una actividad de PHSRP; modulación del metabolismo de una o más funciones celulares; modulación del transporte de transmembrana de uno o más compuestos; y modulación de la resistencia al estrés.

El musgo Physcomitrella patens representa un miembro de los musgos. Este se relaciona con otros musgos tal como el Ceratodon purpureus que es capaz de crecer en la ausencia de luz. Los musgos como Ceratodon y Physcomitrella comparten un alto grado de homología en la secuencia de ADN y nivel de polipéptido permitiendo el uso de selección heteróloga de moléculas de ADN con sondas que evolucionan de otros musgos u organismos, de esta manera posibilitando la derivación de una secuencia consenso apropiada para la selección heteróloga o anotación funcional y predicción de funciones del gen en la especie tercera. La capacidad de identificar tales funciones puede, por consiguiente tener significante relevancia, por ejemplo, predicción de especificidad del sustrato de enzimas. Adicionalmente, estas moléculas de ácido nucleico se pueden presentar como puntos de referencia para la cartografía de genomas de musgo, o de genomas de organismos relacionados.

La molécula de ácido nucleico de PHSRP de la invención tiene una variedad de usos. La mayoría considerablemente, el ácido nucleico y la secuencia del aminoácido de la presente invención se pueden utilizar para transformar las plantas, por consiguiente induciendo la tolerancia a tensiones tal como sequía. La presente invención por consiguiente proporciona una planta transgénica transformada por un ácido nucleico de PHSRP, en donde la expresión de la secuencia del ácido nucleico en la planta resulta en el incremento de tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La planta transgénica puede ser una monocotiledónea o una dicotiledónea. La invención además proporciona que la planta transgénica puede ser seleccionada del maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, soja, maní, algodón, semilla de colza, canola, yuca, pimienta, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especie Vicia, guisante, alfalfa, café, cacao, té, especie Salix, aceite palma, coco, hierba perenne y cultivos de forraje, por ejemplo.

En particular, la presente invención describe utilizando la expresión de PP2A-4 (SEQ ID NO:13) de Physcomitrella patens para la ingeniería de plantas tolerantes a la sequía. Esta estrategia aquí ha sido demostrada para Arabidopsis thaliana, Semilla de colza/Canola, soja, maíz y trigo pero su aplicación no se restringe a estas plantas. Por consiguiente, la invención proporciona una planta transgénica que contiene una PHSRP seleccionada de una proteína fosfatasa 2A en donde el estrés ambiental es sequía o temperatura. En modalidades preferidas, el estrés ambiental es sequía o disminución de la temperatura.

La presente invención también proporciona métodos para modificar la tolerancia al estrés de una planta que comprende, modificar la expresión de una PHSRP en la planta. La invención proporciona que este método se puede realizar de modo que la tolerancia al estrés es ya sea incrementando o disminuyendo. En particular, la presente invención proporciona los métodos de producción de una planta transgénica que tiene un incremento de tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta que comprende aumento de la expresión de una PHSRP en una planta.

Los métodos para aumentar la expresión de PHSRPs se pueden utilizar en donde la planta es tanto transgénica como no transgénica. En casos cuando la planta es transgénica, la planta se puede transformar con un vector que contiene cualquiera de los ácidos nucleicos codificados por la PHSRP descritos arriba, o la planta se puede transformar con un promotor que dirige expresión de la PHSRP nativa en la planta, por ejemplo. La invención proporciona que dicho promotor puede ser específico al tejido. Adicionalmente, tal promotor puede ser en el aspecto del desarrollo regulado. Como alternativa, las plantas no-transgénicas pueden tener expresión de PHSRP nativa modificada induciendo un promotor nativo.

La expresión de PP2A-4 (SEQ ID NO:13) en plantas objetivo se puede lograr por, pero no se limita a, uno de los siguientes ejemplos: (a) promotor constitutivo, (b) promotor inducible por estrés, (c) promotor inducido por productos químicos, y (d) sobre-expresión de promotor diseñado con por ejemplo dedo de zinc derivados de los factores de transcripción (Greisman and Pabo, 1997 Science 275:657). El último caso involucra la identificación de los homólogos PP2A-4 (SEQ ID NO: 13) en la planta diana así como de su promotor. Los factores de transcripción recombinantes que contienen el dedo de zinc se diseñan para interactuar específicamente con el homólogo PP2A-4 (SEQ ID NO : 13) y la transcripción del gen correspondiente se activa.

Además de introducir las secuencias del ácido nucleico de PHSRP en las plantas transgénicas, estas secuencias también se pueden utilizar para identificar un organismo como Physcomitrella patens o un relativo cercano de este. También, se pueden utilizar para identificar la presencia del Physcomitrella patens o un relativo de este en una población mixta de microorganismos. La aplicación proporciona las secuencias del ácido nucleico de un número de genes de Physcomitrella patens; examinando el ADN genómico extraído de un cultivo de una población única o mixta de microorganismos bajo condiciones rigurosas con un sonda que abarca una región de un gen de Physcomitrella patens que es único a este organismo, se puede averiguar, si este organismo está presente.

Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico y la proteína de la invención se pueden presentar como marcadores para regiones específicas del genoma. Esto tiene utilidad no solamente en la cartografía del genoma, sino también en estudios funcionales de las proteínas de Physcomitrella patens. Por ejemplo, para identificar la región del genoma en la cual una proteína particular de enlace de ADN de Physcomitrella patens se une, el genoma de Physcomitrella patens se puede digerir, y los fragmentos incubar con la proteína de enlace de ADN. Aquellos fragmentos que unen la proteína pueden ser adicionalmente probados con las moléculas de ácido nucleico de la invención, preferiblemente con marcadores fácilmente detectables. El enlace de tal molécula de ácido nucleico con el fragmento del genoma permite la localización del fragmento con el mapa del genoma de Physcomitrella patens, y, cuando se realiza múltiples veces con diferentes enzimas, facilita una determinación rápida de la secuencia del ácido nucleico a la cual la proteína se une. Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser suficientemente homólogas a las secuencias de especie relacionada de modo que estas moléculas de ácido nucleico se pueden presentar como marcadores para la construcción de un mapa genómico en musgos relacionados.

Las moléculas de ácido nucleico de PHSRP de la invención también son útiles para estudios evolutivos y estructurales de la proteína. Los procesos metabólicos y de transporte en los que las moléculas de la invención participan, se utilizan por una amplia variedad de células procariotas y eucariotas; comparando las secuencias de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención con aquellas que codifican enzimas similares de otros organismos, se puede evaluar, la relevancia evolutiva de los organismos. De manera similar, tal comparación permite una valoración de cuales regiones de la secuencia se conservan y cuales no, puede ayudar a determinar aquellas regiones de la proteína que son esenciales para el funcionamiento de la enzima. Este tipo de determinación tiene valor para los estudios de ingeniería de
proteínas y puede dar una indicación de cual proteína puede tolerar en términos de mutagénesis sin perder su función.

La manipulación de las moléculas de ácido nucleico de PHSRP de la invención puede resultar en la producción de PHSRPs que tiene diferencias funcionales de las PHSRPs de tipo-salvaje. Estas proteínas se pueden mejorar en eficiencia o actividad, pueden estar presentes en grandes números en la célula que lo usual, o pueden estar disminuyendo en eficiencia o actividad.

Existe un número de mecanismos por los cuales la alteración de una PHSRP de la invención puede directamente afectar la respuesta al estrés y/o tolerancia al estrés. En el caso de plantas que expresan las PHSRPs, el aumento del transporte puede conducir a mejorar la partición sal y/o soluto dentro de los tejidos y los órganos de la planta. Por cualquier aumento del número o la actividad de moléculas transportadoras que exportan moléculas iónicas de la célula, puede ser posible que esto afecte la tolerancia a la sal de la célula.

El efecto de la modificación genética en plantas, C. glutamicum, hongo, algas, o ciliados en tolerancia al estrés se puede evaluar por el crecimiento del microorganismo o planta modificado bajo condiciones menos apropiadas y luego el análisis del características de crecimiento y/o metabolismo de la planta. Tales técnicas de análisis son bien conocidas para alguien de habilidad en el oficio, e incluyen peso seco, peso húmedo, síntesis de proteína, síntesis de carbohidratos, síntesis de lípidos, índices de evapotranspiración, planta general y/o producción de cosecha, floración, reproducción, puesta de semillas, crecimiento de raíz, índices de respiración, índices de fotosíntesis, etc. (Aplicaciones de HPLC en Bioquímica en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17;Rehm et al., 1993 Biotechnology, vol. 3, Chapter III: Product recovery and purification, page 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al., 1988 Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. and Cabral, J.M.S., 1992 Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. and Henry, J.D., 1988 Biochemical separations, in: Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Chapter 11, page 1-27, VCH: Weinheim; and Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).

Por ejemplo, los vectores de expresión de levadura que comprenden los ácidos nucleicos revelados aquí, o fragmentos de estos, se pueden construir y transformar en Saccharomyces cerevisiae utilizando protocolos estándar. Las células transgénicas resultantes se pueden luego ensayar por falla o alteración de su tolerancia al estrés por sequía y temperatura. De manera similar, el vector de expresión de las plantas que comprende los ácidos nucleicos revelados aquí, o fragmentos de estos, se pueden construir y transformar en una célula vegetal apropiada tal como Arabidopsis, soja, colza, maíz, trigo, Medicago truncatula, etc., utilizando protocolos estándar. Las células transgénicas y/o plantas resultantes derivadas de esto, se pueden luego ensayar para la falla o alteración de su tolerancia al estrés por sequía y temperatura.

La ingeniería de uno o más genes de PHSRP de la invención también puede resultar en las PHSRPs que tienen actividades alteradas, las cuales indirectamente impactan la respuesta de estrés y/o tolerancia al estrés de algas, plantas, ciliados u hongos u otros microorganismos como C. glutamicum. Por ejemplo, los procesos bioquímicos normales del metabolismo que resultan en la producción de una variedad de productos (por ejemplo, peróxido de hidrógeno y otra especie de oxígeno reactivo) que puede activamente interferir con estos mismos procesos metabólicos (por ejemplo, peroxinitrito se conoce que las cadenas laterales de nitrato de tirosina, con lo que inactiva algunas enzimas que tienen tirosina en el sitio activo (Groves, J.T., 1999 Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2):226-235). Mientras estos productos son usualmente excretados, las células se pueden alterar genéticamente para transportar más productos lo que es típico para una célula de tipo-salvaje. Optimizando la actividad de una o más PHSRPs de la invención que se involucran en la exportación de moléculas específicas, tal como moléculas de sal, puede ser posible mejorar la tolerancia al estrés de la célula.

Adicionalmente, las secuencias reveladas aquí, o fragmentos de estas, se pueden utilizar para generar mutaciones desactivadas en los genomas de varios organismos, tal como bacterias, células de mamífero, células de levadura, y células de la planta (Girke, T., 1998 The Plant Journal 15:39-48). Las células desactivadas resultantes luego se pueden evaluar por su capacidad o capacidad para tolerar varias condiciones de estrés, su respuesta a varias condiciones de estrés, y el efecto en el fenotipo y/o genotipo de la mutación. Para otros métodos de inactivación génica ver Patente U.S. No. 6004804 "Non-Chimeric Mutational Vectors" and Puttaraju et al., 1999 Spliceosome-mediada ARN trans-splicing as a tool for gen therapy Nature Biotechnology 17:246-252.

Las estrategias de mutagénesis citadas anteriormente para las PHSRPs resultantes en el incremento de resistencia al estrés no tienen la intención de ser limitantes; las variaciones en estas estrategias serán apreciables fácilmente para alguien de habilidad en el oficio. Utilizando dichas estrategias, e incorporando los mecanismos revelados aquí, el ácido nucleico y las moléculas de la proteína de la invención se pueden utilizar para generar algas, ciliados, plantas, hongos u otros microorganismos como C. glutamicum que expresan el ácido nucleico de PHSRP mutado y las moléculas de proteína, de modo que la tolerancia al estrés se mejore.

La presente aplicación también proporciona anticuerpos que se unen específicamente a una PHSRP, o una porción de estas, como se codifica por un ácido nucleico descrito aquí. Los anticuerpos se pueden hacer por varios métodos bien conocidos (Ver, por ejemplo Harlow and Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1988)). Brevemente, el antígeno purificado se puede inyectar en un animal en una cantidad y en intervalos suficientes para producir una respuesta inmune. Los anticuerpos pueden ya sea ser purificados directamente, o se pueden obtener células de bazo a partir del animal. Las células luego se pueden fusionar con una línea celular inmortal y seleccionar para la secreción del anticuerpo. Los anticuerpos se pueden utilizar para seleccionar las bibliotecas de clones de ácido nucleico para células que secretan el antígeno. Aquellos clones positivos luego pueden ser secuenciados. (Ver, por ejemplo, Kelly et al., 1992 Bio/Technology 10:163-167; Bebbington et al., 1992 Bio/Technology 10:169-175).

Las frases "unida selectivamente" y "unida específicamente" con el polipéptido se refiere a una reacción de enlace que es definitivo en la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros biológicos. Así, bajo condiciones de inmunoensayo designado, los anticuerpos específicos unidos a una proteína particular no se unen en una cantidad significante a otras proteínas presentes en la muestra. El enlace selectivo de un anticuerpo bajo dichas condiciones puede requerir de un anticuerpo que se selecciona por su especificidad para una proteína particular. Una variedad de formatos de inmunoensayo puede ser utilizada para seleccionar los anticuerpos que selectivamente se unen con una proteína particular. Por ejemplo, inmunoensayos ELISA de fase sólida son rutinariamente utilizados para seleccionar los anticuerpos selectivamente inmunoreactivos con una proteína. Ver Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988), para una descripción de formatos de inmunoensayo y las condiciones que podrían utilizarse para determinar el enlace selectivo.

En algunos ejemplos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales de varios huéspedes. Una descripción de técnicas para preparar dichos anticuerpos monoclonales se pueden encontrar en Stites et al., editors, "Basic and Clinical Immunology," (Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., Fourth Edition) y las referencia citadas en esta, y en Harlow and Lane ("Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988).

La invención además se ilustra por los siguientes ejemplos, que no se deben interpretar en modo alguno como la imposición de limitaciones a su alcance.

Ejemplos Ejemplo 1 Crecimiento de cultivos de Physcomitrella patens

Para este estudio, se utilizaron, las plantas de la especie Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. de la colección de la sección de estudios genéticos de la Universidad de Hamburgo. Ellas se originaron de la cepa 16/14 recolectada por H.L.K. Whitehouse in Gransden Wood, Huntingdonshire (England), las cuales se subcultivaron de una espora por Engel (1968, Am. J. Bot. 55, 438-446). La proliferación de las plantas se realizó por medio de esporas y por medio de regeneración de los gametofitos. El protonema desarrollado de la espora haploide como un cloronema rico en cloroplasto y caulonema bajo en cloroplasto, sobre los brotes formados después de aproximadamente 12 días. Estos crecieron para dar gametoforos que tienen anteridia y arquegonia. Después de la fertilización, resultó el esporofito diploide con una seta pequeña y la cápsula de esporas, en el cual las meiosporas maduraron.

El cultivo se realizó en una cámara climática a una temperatura ambiental de 25ºC e intensidad de luz de 55 micromoles ^{-1m2} (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25) y un cambio de luz/oscura de 16/8 horas. El musgo fue modificado en cultivo líquido utilizando medio Knop de acuerdo con Reski y Abel (1985, Planta 165:354-358) o cultivado en medio sólido Knop utilizando 1% de agar oxoid (Unipath, Basingstoke, England). Los protonemas utilizados para el aislamiento del ARN y el ADN se cultivaron en cultivos líquidos oxigenados. Los protonemas se trituraron cada 9 días y se transfirieron a un medio de cultivo nuevo.

Ejemplo 2 Aislamiento del ADN total a partir de las plantas

Los detalles para el aislamiento del ADN total se relacionan con el tratamiento final de un gramo de peso fresco de material de la planta. Los materiales utilizados incluyen las siguientes soluciones reguladoras: solución reguladora CTAB: 2% (w/v) N-cetil-N,N,N-trimetilamonio bromuro (CTAB); Tris 100 mM HCl pH 8.0; NaCl 1.4 M; EDTA 20 mM; solución reguladora N-Laurilsarcosina: 10% (peso/volumen) N-laurilsarcosina; Tris HCl 100 mM pH 8.0; EDTA 20 mM.

El material de la planta se trituró bajo nitrógeno líquido en un mortero para dar un polvo fino y se transfirió a un recipiente Eppendorf de 2 ml. El material congelado de la planta luego se cubrió con una capa de 1 ml de solución reguladora de descomposición (1 ml de solución reguladora CTAB, 100 \mul de solución reguladora N-laurilsarcosina, 20 \mul de \beta-mercaptoetanol y 10 \mul de solución de proteinasa K, 10 mg/ml) y se incubó a 60ºC por una hora con agitación continua. El homogeneizado obtenido se repartió en dos recipientes Eppendorf (2 ml) y se extrajo dos veces por agitación con el mismo volumen de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Para la fase de separación, se realizó por centrifugación a 8000 x g y a temperatura ambiente por 15 minutos en cada caso. El ADN luego se precipitó a -70ºC por 30 minutos utilizando isopropanol helado. El ADN precipitado se sedimentó a 4ºC y 10,000 g por 30 minutos y se resuspendió en 180 \mul de solución reguladora TE (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Para una purificación adicional, el ADN se trató con NaCl (concentración final1.2 M) y se precipitó otra vez a -70ºC por 30 minutos utilizando dos veces el volumen de etanol absoluto. Después de una etapa de lavado con etanol al 70%, el ADN se secó y posteriormente se llevó en 50 \mul de H_{2}O + RNAse (concentración final 50 mg/ml). El ADN se disolvió durante la noche a 4ºC y la digestión de RNAse posteriormente se realizó a 37ºC por 1 hora. El almacenamiento del ADN se hizo a 4ºC.

Ejemplo 3 Aislamiento de la construcción de la genoteca de ARN total y poli-(A)+ ARN y cADN a partir de Physcomitrella patens

Para la investigación de transcripciones, ambos ARN total y poli-(A)+ARN se aislaron. El ARN total se obtuvo de protonemata de tipo-salvaje de 9 días de edad siguiendo el método-GTC (Reski et al. 1994, Mol. Gen. Genet., 244:352-359). El Poli(A)+ARN se aisló utilizando Dyna BeadsR (Dynal, Oslo, Norway) siguiendo las instrucciones del protocolo del fabricante. Después de la determinación de la concentración del ARN o del poli(A)+ ARN, el ARN se precipitó mediante la adición de 1/10 volúmenes de acetato de sodio 3 M pH 4.6 y 2 volúmenes de etanol y se almacenó a -70ºC.

Para la construcción de la genoteca de cADN, primero la síntesis de la cadena se logró utilizando el Virus de Leucemia Murine transcriptasa reversa (Roche, Mannheim, Germany) y los cebadores-oligo-d (T), segundo la síntesis de la cadena por incubación con ADN polimerasa I, enzima Klenow y digestión de ARNseH a 12ºC (2 horas), 16ºC (1 hora) y 22ºC (1 hora). La reacción se detuvo por incubación a 65ºC (10 minutos) y posteriormente se transfirieron a hielo. Las moléculas de ADN bicatenarias se embotaron por T4-ADN-polimerasa (Roche, Mannheim) a 37ºC (30 minutos). Los nucleótidos se eliminaron por extracción de fenol/cloroformo y columnas de Sephadex G50 spin. Los adaptadores EcoRI (Pharmacia, Freiburg, Germany) se ligaron a los terminales cADN por T4-ADN-ligasa (Roche, 12ºC, durante la noche) y fosforilado por incubación con polinucleótido quinasa (Roche, 37ºC, 30 minutos). Esta mezcla se sometió a separación en un gel agarosa de bajo punto de fusión. Las moléculas de ADN grandes de 300 pares de bases se eluyeron del gel, el fenol se extrajo, se concentró en Elutip-D-columnas (Schleicher y Schuell, Dassel, Germany) y se ligaron a los brazos del vector y empacaron en fagos ZAPII lambda o fagos ZAPExpress lambda utilizando el Kit Gigapack Gold (Stratagene, Amsterdam, Netherlands) utilizando el material y siguiendo las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 4 Anotación de secuenciación y función de Physcomitrella patens ESTs

Las bibliotecas de cADN como se describe en el Ejemplo 3 se utilizaron por ADN la secuenciación de acuerdo con métodos estándar, y en particular, por el método de terminación en cadena utilizando el Kit ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer, Weiterstadt, Germany). La Secuenciación Al azar se realizó después para la recuperación de plásmido preparativa de las bibliotecas de cADN vía excisión de la masa in vivo, retransformación, y subsiguiente revestimiento de DH10B en placas de agar (detalles del material y el protocolo de Stratagene, Amsterdam, Netherlands. El ADN del plásmido se preparó de cultivos de E. coli cultivados durante la noche, cultivados en medio Luria-Broth que contiene ampicilina (ver Sambrook et al. 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) en un robot de preparación de ADN Qiagene (Qiagen, Hilden) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se utilizaron los cebadores de secuenciación con las siguientes secuencias de nucleótidos:

5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3': SEQ ID NO:16

5'-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3': SEQ ID NO:17

5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3': SEQ ID NO:18

Las secuencias se procesaron y anotaron utilizando el paquete de programa EST-MAX comercialmente suministrado por Bio-Max (Munich, Germany). El programa incorpora prácticamente todos los métodos bioinformáticos importantes para la caracterización funcional y estructural de las secuencias de proteína. Para referencia el website en pedant.mips.biochem.mpg.de. La mayoría de algoritmos importantes incorporados en EST-MAX son: FASTA: Very sensitive sequence database searches with estimates of statistical significance; Pearson W.R. (1990) Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA. Methods Enzymol. 183:63-98; BLAST: Very sensitive sequence database searches with estimates of statistical significance. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., and Lipman D.J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215:403-10; PREDATOR: High-accuracy secondary structure prediction from single and multiple sequences. Frishman, D. and Argos, P. (1997) 75% accuracy in protein secondary structure prediction. Proteins, 27: 329-335; CLUSTALW: Multiple sequence alignment. Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680; TMAP: Transmembrane region prediction from multiply aligned sequences. Persson, B. and Argos, P. (1994) Prediction of transmembrane segments in proteins utilizing multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 237:182-192; ALOM2: Transmembrane region prediction from single sequences. Klein, P., Kanehisa, M., and DeLisi, C. Prediction of protein function from sequence properties: A discriminate analysis of a database. Biochim. Biophys. Acta 787:221-226 (1984). Version 2 by Dr. K. Nakai; PROSEARCH: Detection of PROSITE protein sequence patterns. Kolakowski L.F. Jr., Leunissen J.A.M., Smith J.E. (1992) ProSearch: fast searching of protein sequences with regular expression patterns related to protein structure and function. Biotechniques 13, 919-921; BLIMPS : Similarity searches against a database of ungapped blocks. J.C. Wallace and Henikoff S., (1992); PATMAT: A searching and extraction program for sequence, pattern and block queries and databases, CABIOS 8:249-254. Written by Bill Alford.

Ejemplo 5 Identificación de Physcomitrella patens ORF que corresponde a PP2A-4

El cADNparcial de Physcomitrella patens (EST) mostrado en la Tabla 1 abajo, se identificó en el programa de secuenciación Physcomitrella patens EST utilizando el programa EST-MAX a través de un análisis BLAST. El Número de Identificación de Secuencia que corresponde a esta EST es como sigue: PP2A-4 (SEQ ID NO:3) es homóloga a la subunidad reguladora de la proteína fosfatasa 2A de humano y plantas.

Por otra parte, PP2A-4 tiene homología con la subunidad catalítica de varias proteínas fosfatasa 2A de la planta.

TABLA 1

1

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TABLA 2

2

Ejemplo 6 Clonación de la longitud completa de cADN Physcomitrella patens codificante para PP2A-4

Para aislar la PP2A-4 de longitud completa (SEQ ID NO: 8) a partir de Physcomitrella patens, se crearon bibliotecas de cADN con kit SMART RACE cADN Amplification (Clontech Laboratories) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN total aislado como se describe en el Ejemplo 2 se utilizó como la plantilla. Los cultivos se trataron previo al aislamiento de ARN como sigue: Estrés por Sal: 2, 6, 12, 24, 48 horas con medio suplementado con NaCl 1M; Estrés por Frío: 4ºC por las mismas unidades de tiempo como para la sal; Estrés por Sequía: los cultivos se cultivaron en filtro de papel seco las mismas unidades de tiempo como para la sal.

Protocolo 5' RACE

La secuencia 4 EST (SEQ ID NO: 3) identificada de la búsqueda de base de datos como se describe en el Ejemplo 4 se utilizó, para diseñar los oligos para RACE. Las secuencias extendidas para estos genes se obtuvieron realizando una reacción en cadena de la polimerasa de Amplificación Rápida de Terminales de cADN (RACE PCR) utilizando el kit Advantage 2 PCR (Clontech Laboratories) y el kit de amplificación SMART RACE cADN (Clontech Laboratories) utilizando un Biometra T3 Thermocycler siguiendo las instrucciones del fabricante. Las secuencias obtenidas de las reacciones RACE corresponden a las regiones codificantes de longitud completa de PP2A-4 y se utilizaron para diseñar los oligos para la clonación de longitud completa de los genes respectivos (ver a continuación: amplificación de longitud completa).

Amplificación de longitud completa

Los clones de longitud completa que corresponden a PP2A-4 (SEQ ID NO: 3) se obtuvieron realizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores de gen-específico (ver Tabla 3) y la EST original como la plantilla. Las condiciones para la reacción fueron condiciones estándar con polimerasa de ADN PWO (Roche). La PCR se realizó de acuerdo con las condiciones estándar y con los protocolos del fabricante (Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y., Biometra T3 Thermocycler). Los parámetros para la reacción fueron: cinco minutos a 94ºC seguido por cinco ciclos de un minuto a 94ºC, un minuto a 50ºC y 1.5 minutos a 72ºC. Se continuo por veinticinco ciclos de un minuto a 94ºC, un minuto a 65ºC y 1.5 minutos a 72ºC.

Los fragmentos amplificados se extrajeron del gel agarosa con un Kit de Extracción QIAquick Gel (Qiagen) y se ligaron en el vector TOPO pCR 2.1 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los vectores recombinantes se transformaron en células Top10 (Invitrogen) utilizando condiciones estándar (Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY). Las células transformadas se seleccionaron por un agar LB que contiene carbenicillina 100 \mug/ml, 0.8 mg X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosida) y 0.8 mg IPTG (isopropiltio-\beta-D-galactosida) cultivadas durante la noche a 37ºC. Las colonias blancas se seleccionaron y utilizaron para inocular 3 ml de líquido LB que contiene 100 \mug/ml de ampicilina y se cultivaron durante la noche a 37ºC. El ADN del plásmido se extrajo utilizando el Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El análisis de los siguientes clones y la cartografía de restricción se realizaron de acuerdo con técnicas estándar de biología molecular (Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y.).

TABLA 3

4

Ejemplo 7 Ingeniería de plantas de Arabidopsis tolerantes al estrés por sobre-expresión del gen PP2A-4 Construcción del vector binario: kanamicina

El vector pACGH101 (BPS-Cianmid) se digirió con PstI (Roche) y FseI (NEB) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento se purificó por gel agarosa y se extrajo por medio del kit de Extracción Qiaex II ADN (Qiagen). Esto da como resultado un fragmento de vector con el promotor Actin2 de Arabidopsis con un intrón interno y el terminador OCS3. Los cebadores para la amplificación PCR del gen NPTII se diseñaron como sigue:

5'NPT-Pst:

GCG-CTG-CAG-ATT-TCA-TTT-GGA-GAG-GAC-ACG: (SEQ ID NO:34)

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3'NPT-Fse:

CGC-GGC-CGG-CCT-CAG-AAG-AAC-TCG-TCA-AGA-AGG-CG: (SEQ ID NO:35)

El gen NPTII de 0.9 kilobases se amplificó vía PCR a partir del ADN del plásmido pCambia 2301 [94ºC 60 seg, {94ºC 60 seg, 61ºC (-0.1ºC por ciclo) 60 seg, 72ºC 2 min} x 25 ciclos, 72ºC 10 min en Biometra T-Gradient machine], y se purificó con el kit de Extracción Qiaquick PCR (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN de PCR luego se subclonó en el vector pCR-BluntII TOPO (Invitrogen) conforme a las instrucciones del fabricante (construcción NPT-Topo). Estas uniones se transformaron en las células Top10 (Invitrogen) y se cultivaron en las placas LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina durante la noche a 37ºC. Las colonias luego se utilizaron para inocular 2 ml del medio LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se cultivaron durante la noche a 37ºC. ADN del plásmido se recuperó utilizando el kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen) y se secuenciaron en ambas direcciones 5' y 3' utilizando condiciones estándar. El análisis posterior de los datos de la secuencia utilizando el software VectorNTI no reveló errores de PCR presentes en la secuencia de gen NPTII.

La construcción NPT-Topo luego se digirió con PstI (Roche) y FseI (NEB) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento de 0.9 kilobases se purificó en el gel agarosa y se extrajo mediante el kit de Extracción Qiaex II DNA (Qiagen). Luego, el fragmento inserto Pst/Fse a partir de NPT-Topo y el fragmento Pst/Fse del vector de pACGH101 se ligaron juntos utilizando T4 ADN Ligasa (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante. La unión luego se transforma en células Top10 (Invitrogen) bajo condiciones estándar, fabricando la construcción pBPSsc019. Las colonias se seleccionaron en placas LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se cultivaron durante la noche a 37ºC. Estas colonias luego se utilizaron para inocular 2 ml del medio LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se cultivaron durante la noche a 37ºC. El ADN del plásmido se recuperó utilizando el kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

La construcción pBPSSC019 se digirió con KpnI y BsaI (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento se purificó vía gel agarosa y luego se extrajo vía el kit de Extracción Qiaex II ADN (Qiagen) siguiendo sus instrucciones, resultando en un casete Act-NPT de 3 kilobases, que incluye el promotor Actin2 de Arabidopsis con intrón interno, el gen NPTII y el terminador OCS3.

El vector pBPSJH001 se digirió con SpeI y ApaI (Roche) y se rellenó en el extremo romo con enzima Klenow y dNTPs 0.1 mM (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esto produce un fragmento del vector de 10.1 kilobases menos el casete Gentamicina, que se vuele a circular por auto-enlace con T4 ADN Ligasa (Roche), y se transforma en células Top10 (Invitrogen) vía condiciones estándar. Las células transformadas se seleccionaron en el agar LB que contiene 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se cultivaron durante la noche a 37ºC. Las colonias luego se utilizaron para inocular 2 ml del líquido LB que contiene 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se cultivaron durante la noche a 37ºC. El ADN del plásmido se extrajo utilizando el Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El plásmido recircularizado luego se digirió con KpnI (Roche) y se extrajo del gel agarosa vía el kit de Extracción Qiaex II ADN (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

El inserto Act-NPT Kpn-cut y el vector recircularizado Kpn-cut pBPSJH001 luego se ligaron juntos utilizando T4 ADN Ligasa (Roche) y se transformaron en las células Top10 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La construcción resultante, pBPSsc022, ahora contenía el Promotor Super, el gen GUS, el terminador NOS, y el casete Act-NPT. Las células transformadas se seleccionaron por el agar LB que contiene 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se cultivaron durante la noche a 37ºC. Las colonias luego se utilizaron para inocular 2 ml del líquido LB que contiene 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se cultivaron durante la noche a 37ºC. El ADN del plásmido se extrajo utilizando el Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la confirmación de éxito de unión vía digestión de restricción, el ADN del plásmido pBPSsc022 además se propagó y recuperó utilizando el Kit Plasmid Midiprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Subclonación de PP2A-4 en el vector binario

Los fragmentos que contienen las diferentes proteínas fosfatasas de Physcomitrella patens se tomaron por excisión de los vectores recombinantes PCR2.1 TOPO por doble digestión con enzimas de restricción (ver Tabla 4) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El subsiguiente fragmento se tomó por excisión del gel agarosa con un Kit de Extracción QIAquick Gel (QIAgen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se ligó en el vector binario pBPSsc022, se dividió con las enzimas apropiadas (ver Tabla 8) y se sometió a desfosforilación previamente a la unión. El vector recombinante pBPSsc022 resultante contiene la Fosfatasa correspondiente en el sentido de orientación bajo el control del super promotor constitutivo.

TABLA 4

5

Transformación del Agrobacterium

El vector recombinante se transformó en Agrobacterium tumefaciens C58C1 y PMP90 de acuerdo con las condiciones estándar (Hoefgen y Willmitzer, 1990).

Transformación de la Planta

Arabidopsis thaliana ecotipo C24 se cultivaron y transformaron de acuerdo con las condiciones estándar (Bechtold 1993, Acad. Sci. Paris. 316:1194-1199; Bent et al. 1994, Science 265:1856-1860).

Selección de Plantas Transformadas

Las semillas T1 se esterilizaron de acuerdo con protocolos estándar (Xiong et al. 1999, Plant Molecular Biology Reporter 17: 159-170). Las semillas se colocaron en placas en los medios ½ Murashige y Skoog (MS) (Sigma-Aldrich) pH 5.7 con KOH, 0.6% de agar y suplementado con 1% de sacarosa, 0.5 g/L de ácido 2-[N-Morfolino] etansulfónico (MES) (Sigma-Aldrich), 50 \mug/ml kanamicina (Sigma-Aldrich), 500 \mug/ml de carbinicilina (Sigma-Aldrich) y 2 \mug/ml benomil (Sigma-Aldrich). Las semillas en placas se venalizaron por cuatro días a 4ºC. Las semillas se germinaron en una cámara climática a una temperatura ambiental de 22ºC e intensidad de luz de 40 micromoles^{-1m2} (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25) y duración del ciclo 16 horas de luz y S horas oscuridad día. Los semilleros transformados se seleccionaron después de 14 días y se transfirieron al medio ½ MS pH 5.7 con KOH 0.6% de placas de agar suplementado con 0.6% de agar, 1% de sacarosa, 0.5 g/L de MES (Sigma-Aldrich), y 2 \mug/ml de benomil (Sigma-Aldrich) y se dejan recuperar por cinco-siete días.

Selección de Tolerancia a la Sequía

Los semilleros T1 se transfirieron a un filtro de papel seco, estéril en una caja de petri y se dejaron desecar por dos horas a 80% RH (humedad relativa) en una Percieval Growth Cabinet MLR-350H, micromoles^{-1m2} (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25). La RH luego se disminuyó a 60% y los semilleros se desecaron además por ocho horas. Los semilleros luego se removieron y colocaron en ½ MS placas de agar 0.6% suplementado con 2 \mug/ml benomil (Sigma-Aldrich) y 0.5g/L MES (Sigma-Aldrich) y se almacenaron después de cinco días.

Bajo las condiciones de estrés a la de sequía, las plantas de Arabidopsis thaliana PpPP2A-4 sobre expresadas mostraron un índice de supervivencia del 58% a la selección de estrés, (7 supervivientes de 12 plantas estresadas) mientras que el control sin transformar solamente mostró un índice de supervivencia del 28%. Cabe señalar que los análisis de estas líneas transgénicas se realizaron con plantas T1, y por consiguiente, los resultados serán mejores cuando un homocigoto, expresador fuerte se encuentre.

TABLA 5

6

Selección de Tolerancia a la Congelación

Los semilleros se movieron a cajas de petri que contienen ½ MS 0.6% de agar suplementado con 2% de sacarosa y 2 \mug/ml de benomil. Después de cuatro días, los semilleros se cultivaron a 4ºC por 1 hora y luego se cubrieron con hielo granizado. Los semilleros luego se colocaron en una Cámara Ambiental Environmental Specialist ES2000 y se incubaron por 3.5 horas iniciando a -1.0ºC disminuyendo -1ºC por hora. Los semilleros luego se incubaron a -5.0ºC por 24 horas y luego se dejaron descongelar a 5ºC por 12 horas. El agua se vertió completamente y los semilleros se almacenaron después de 5 días.

Bajo condiciones de estrés por congelación las plantas de Arabidopsis thaliana sobre-expresadas PPPP2A-4 mostraron un 90% (9 supervivientes de 10 plantas estresadas), índice de supervivencia, mientras que el control sin transformar solamente mostró un índice de supervivencia de 2% (1 superviviente de 48 plantas probadas). Cabe señalar que los análisis de estas líneas transgénicas se realizaron con plantas T1, y por consiguiente, los resultados serán mejores cuando un homocigoto, espresador fuerte se encuentre.

TABLA 6

7

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Selección de Tolerancia al Estrés

Los semilleros se transfirieron a un filtro de papel remojado en ½ MS y se colocaron en ½ MS 0.6% de agar suplementado con 2 \mug/ml de benomil, la noche antes de la selección de la tolerancia a la sal. Para la selección de tolerancia a la sal, el filtro de papel con el semillero se trasladó a pilas de filtro de papel estéril, remojado en NaCl 50 mM, en una caja de petri. Después de dos horas, el filtro de papel con el semillero se trasladó a las pilas de filtro de papel estéril, remojado con NaCl 200 mM, en una caja de petri. Después de dos horas, el filtro de papel con el semillero se trasladó a las pilas de filtro de papel estéril, remojado en NaCl 600 mM, en una caja de Petri. Después de 10 horas, los semilleros se movieron a las cajas de petri que contienen ½ MS 0.6% de agar suplementado con 2 \mug/ml de benomil. Los semilleros se almacenaron después de 5 días. Las plantas transgénicas luego se seleccionan por su tolerancia a la sal mejorada, demostrando que la expresión del transgen confiere la tolerancia a la sal.

Ejemplo 8 Detección de los transgenes PP2A-4 en las líneas transgénicas de Arabidopsis

Para comprobar la presencia del transgen PpPP2A-4 en las líneas transgénicas de la Arabidopsis, se realizó una PCR en ADN genómico que contamina la muestras de ARN tomadas como se describe en el Ejemplo 9 abajo. 2.5 \mul de la muestra de ARN se utilizaron en una reacción PCR de 50 \mul utilizando Taq ADN polimerasa (Roche Molecular Bioproductos químicos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la PCR se utilizaron, El cebador para la región del vector binario (5'GCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTC3') (SEQ ID NO:36) y el cebador 3' del gen específico para cada transgen que se uso para la RT-PCR de longitud completa (ver Tabla 7). El programa de PCR fue como sigue: 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 70ºC, seguido por 10 minutos a 72ºC. El plásmido del vector binario con los transgenes clonados, se utilizó como control positivo, y el ADN genómico C24 de tipo salvaje se utilizó como control negativo en las reacciones de PCR. Se analizaron 10 \mul de la reacción de PCR en gel 0.8% de agarosa-bromuro de etidio.

Los transgenes con el tamaño esperado (para PpPP2A-2: fragmento de 2.5 kb; PpPP2A-3: fragmento de 2.0 kb; PpPP2A-4: fragmento de 1.4 kb; PpPP2C-1: fragmento de 1.4 kb; PpPP2C-2: fragmento de 1.4 kb) se amplificaron exitosamente de las líneas transgénicas T1, pero no del C24 de tipo-salvaje. Este resultado indica que las plantas transgénicas T1 contienen al menos una copia de los transgenes. No hubo indicios de la existencia de ya sea idénticos o muy similares en Arabidopsis thaliana sin transformar que puede ser amplificado en este método en las plantas de tipo-salvaje.

Ejemplo 9 Detección del mARN del transgen de PP2A-4 en líneas transgénicas de Arabidopsis

La expresión del transgen se detectó utilizando RT-PCR. El ARN total se aisló de plantas tratadas de estrés utilizando un procedimiento adaptado de (Verwoerd et al., 1989 NAR 17:2362). Las muestras de hojas (50-100 mg) se recolectaron y molieron a un polvo fino en nitrógeno líquido. El tejido molido se resuspendió en 500 \mul de una mezcla 1:1 a 80ºC, de fenol en solución reguladora de extracción (LiCl 100 mM, Tris 100 mM pH 8, EDTA 10 mM, 1% de SDS), a continuación se coloca en el vortex brevemente para mezclar. Después de la adición de 250 ml de cloroformo, cada muestra se coloca en un vortex brevemente. Las muestras luego se centrifugaron por 5 minutos a 12,000 x g. La fase acuosa superior se removió a un tubo eppendorf nuevo. El ARN se precipitó adicionando 1/10 volumen de acetato de sodio 3M y 2 volúmenes de etanol al 95%. Las muestras se mezclaron por inversión y se colocaron en hielo por 30 minutos. Se formaron pellets de ARN por centrifugación a 12,000 x g por 10 minutos. El sobrenadante se removió y los pellets brevemente se secaron al aire. La muestra de pellets de ARN se resuspendió en 10 \mul de agua tratada con DEPC.

Para remover el ADN contaminante de las muestras, cada una se trató con RNase-libre de DNase (Roche) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El cADN se sintetizó a partir del ARN total utilizando el Sistema de Síntesis Superscript First-Strand para RT-PCR (Gibco-BRL) siguiendo las recomendaciones del fabricante. La amplificación de PCR de un fragmento de gen específico a partir del cADN sintetizado, se realizó utilizando Taq ADN polimerasa (Roche) y cebadores de gen-específico como se muestra abajo en la siguiente reacción: solución reguladora PCR IX, MgCl_{2} 1.5 mM, 0.2 \muM de cada cebador, 0.2 \muM de dNTPs, 1 unidad de polimerasa, 5 \mul de cADN de la reacción de síntesis. La amplificación se realizó bajo las siguientes condiciones: Pre-desnaturalización, 94ºC, 3 minutos; desnaturalización, 94ºC, 30 segundos; hibridación, 62ºC, 30 segundos; extensión, 72ºC, 2 minutos, 30, ciclos; extensión, 72ºC, 5 minutos; mantener a 4ºC, siempre. Los productos de PCR se corrieron en un gel 1% de agarosa, se tiñeron con bromuro de etidio, y se visualizaron bajo luz UV utilizando el sistema de documentación Quantity-One gel (Bio-Rad).

La expresión de los transgenes se detectó en la línea transgénica T1. Estos resultados indicaron que los transgenes se expresan en las líneas transgénicas y sugieren fuertemente que su producto génico mejora la tolerancia de la planta al estrés en las líneas transgénicas. De acuerdo con la afirmación previa, ninguna expresión de genes endógenos idénticos o muy similares podría ser detectada por este método. Estos resultados están de acuerdo con los datos del Ejemplo 7.

TABLA 7

8

Ejemplo 10 Ingeniería de plantas de soja tolerantes al estrés por sobre-expresión del gen PP2A-4

La construcción pBPSJYW016. se utilizó para transformar la soja como se describe a continuación.

Las semillas de soja se esterilizaron superficialmente con 70% de etanol por 4 minutos a temperatura ambiente con agitación continua, seguido por 20% (v/v) de Clorox suplementado con 0.05% (v/v) de Tween por 20 minutos con agitación continua. Luego, las semillas se enjuagaron 4 veces con agua destilada y se colocaron en un filtro de papel estéril humedecido en una caja de Petri a temperatura ambiente por 6 a 39 horas. Los recubrimientos de la semilla se pelaron completamente, y los cotiledones se desprendieron del eje embrionario. El eje embrionario se examinó para asegurar que la región meristemática no se daña. Los eje embrionarios tomados por excisión se recolectaron en una caja de Petri medio abierta estéril y se secaron al aire para un contenido de humedad menor del 20% (peso fresco) en una caja de Petri sellada hasta otro uso.

El cultivo de Agrobacterium tumefaciens se preparó a partir de una colonia sencilla en medio sólido LB más antibióticos apropiados (por ejemplo 100 mg/l de estreptomicina, 50 mg/l kanamicina) seguido por el crecimiento de la colonia sencilla en medio líquido LB para una densidad óptica a 600 nm de 0.8. Luego, se formaron pellets del cultivo de bacteria a 7000 rpm por 7 minutos a temperatura ambiente, y se resuspendió en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con 100 mM de acetosiringona. Los cultivos de bacterias se cultivaron en este medio de pre-inducción por 2 horas a temperatura ambiente antes de usar. El eje de embriones de semilla zigótica de soja a aproximadamente 15% de contenido de humedad se embebieron por 2 horas a temperatura ambiente con el cultivo de suspensión de Agrobacterium pre-inducido. Los embriones se removieron del cultivo embebido y se transfirieron a las cajas de Petri que contienen medio sólido MS suplementado con 2% de sacarosa y se incubaron por 2 días, en la oscuridad a temperatura ambiente. Como alternativa, los embriones se colocaron encima del filtro de papel estéril humedecido (medio líquido MS) en una caja de Petri y se incubó bajo las mismas condiciones descritas arriba. Después de este periodo, los embriones se transfirieron a cualquier medio MS sólido o líquido suplementado con 500 mg/L carbenicilina o 300 mg/L cefotaxima pata matar la agrobacteria. El medio líquido se utilizó para humidificar el filtro de papel estéril. Los embriones se cultivaron durante 4 semanas a 25ºC, bajo foto periodos de 150 \mumol ^{m-2} seg^{-1} y 12 horas. Una vez los semilleros producen las raíces, se transfieren a suelo metromix estéril. El medio de las plantas in vitro se lavó completamente antes de transferir las plantas al suelo. Las plantas se mantuvieron bajo un plástico cubierto por 1 semana para favorecer el proceso de climatización. Luego las plantas se transfirieron a un cuarto de crecimiento donde se cultivaron a 25ºC, bajo foto periodo de 150 \mumol m^{-2}seg^{-1} de intensidad de luz y 12 horas por aproximadamente 80 días.

Las plantas transgénicas se seleccionaron por su mejorada tolerancia a la sequía, sal y/o frío de acuerdo con el método de selección descrito en el Ejemplo 7 demostrando que la expresión del transgen confiere tolerancia al estrés.

Ejemplo 11 Ingeniería de plantas de Semilla de colzalCanola tolerantes al estrés por sobre-expresión del gen PP2A-4

La construcción pBPSJYW016 se utilizó para transformar la semilla de colza/canola como se describe abajo.

El método de transformación de la planta descrito aquí también es aplicable a la Brassica y otros cultivos. Las semillas de canola se esterilizaron superficialmente con 70% de etanol por 4 minutos a temperatura ambiente con agitación continua, seguido por 20% (v/v) de Clorox suplementado con 0.05 % (v/v) de Tween por 20 minutos, a temperatura ambiente con agitación continua. Entonces, las semillas se enjuagaron 4 veces con agua destilada y colocaron en filtro de papel estéril humedecido en una caja de Petri a temperatura ambiente por 18 horas. Luego los recubrimientos de la semilla se removieron y las semillas se secaron al aire durante la noche en una caja de Petri estéril medio abierta. Durante este periodo, las semillas pierden aprox. 85% de su contenido de agua. Las semillas luego se almacenaron a temperatura ambiente en una caja de Petri sellada hasta otro uso. Las construcciones de ADN y la imbibición del embrión son como se describen en el Ejemplo 10. Las muestras de las plantas transgénicas primarias (T0) se analizaron por PCR para confirmar la presencia del T-ADN. Estos resultados se confirman por hibridación Southern en la cual el ADN se somete a electroforesis en un gel al 1% de agarosa y se transfirió a una membrana de nylon cargada positivamente (Roche Diagnostics). El Kit PCR DIG Probe Synthesis (Roche Diagnostics) se utilizó para preparar una sonda marcada con digoxigenina por PCR, y se utilizó según las recomendaciones del fabricante.

Las plantas transgénicas luego se seleccionan por su mejorada tolerancia al estrés de acuerdo con el método de selección descrito en el Ejemplo 7 demostrando que la expresión transgénica confiere tolerancia a la sequía.

Ejemplo 12 Ingeniería de plantas de maíz tolerantes al estrés por sobre-expresión del gen PP2A-4

La construcción pBPSJYW016 se utilizó para transformar el maíz como se describe abajo.

La transformación del maíz (Sea Mayz L.) se realiza con el método descrito por Asida et al. 1996. Nature Biotch 14745-50. Los embriones inmaduros se co-cultivaron con Agrobacterium tumefaciens que llevan los vectores "super binarios", y las plantas transgénicas se recuperaron a través de organogénesis. Este procedimiento proporciona una eficiencia de transformación entre 2.5% y 20%. Las plantas transgénicas luego se seleccionan por su mejorada tolerancia a la sequía, sal y/o frío de acuerdo con el método de selección descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión trasngénica confiere tolerancia al estrés.

Ejemplo 13 Ingeniería de plantas de trigo tolerantes al estrés por sobre-expresión del gen PP2A-4

Se utilizó la construcción pBPSJYW016 para transformar el trigo como se describe abajo.

La transformación del trigo se realiza con el método descrito por Ishida et al. 1996 Nature Biotch. 14745-50. los embriones inmaduros se co-cultivaron con Agrobacterium tumefaciens que llevan los vectores "super binarios", y las plantas transgénicas se recuperaron a través de organogénesis. Este procedimiento proporciona una eficiencia de transformación entre 2.5% y 20%. Las plantas transgénicas luego se seleccionan por su mejorada tolerancia al estrés de acuerdo con el método de selección descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión trasngénica confiere tolerancia a la sequía.

Ejemplo 14 Identificación de Genes Homólogos y Heterólogos

Las secuencias de genes se pueden utilizar para identificar genes homólogos o heterólogos a partir de bibliotecas de cADN o genómicas. Los genes homólogos (por ejemplo clones de cADN de longitud completa) se pueden aislar vía hibridación de ácido nucleico utilizando por ejemplo bibliotecas de cADN. Dependiendo de la abundancia del gen de interés, 100,000 hasta 1,000,000 bacteriófagos recombinantes se colocan en placas y se transfieren a las membranas de nylon. Después de la desnaturalización con álcali, el ADN se inmoviliza en la membrana por, por ejemplo enlace en cruz UV. La hibridación se realiza a condiciones de severidad alta. En solución acuosa la hibridación y el lavado se realizan a una fuerza iónica de NaCl 1 M y a temperatura de 68ºC. La sondas de hibridación se generan por, por ejemplo marcación de transcripción con mella (^{32}P) radioactivo (High Prime, Roche, Mannheim, Germany). Las señales se detectaron por autoradiografía.

Los genes parcialmente homólogos o heterólogos que se relacionan pero no son idénticos se pueden identificar de una manera análoga al procedimiento descrito arriba utilizando condiciones de hibridación y lavado de baja severidad. Para hibridación acuosa, la fuerza iónica normalmente se mantiene en NaCl 1 M mientras la temperatura se disminuye progresivamente de 68 a 42ºC.

Aislamiento de las secuencias de genes con homologías (o identidad de la secuencia/similaridad) solamente en un dominio distinto de (por ejemplo 10-20 aminoácidos) se puede realizar utilizando sondas sintéticas de oligonucleótido radiomarcado. Los oligonucleótidos radiomarcados se preparan por fosforilación del terminal del cebador-5 de dos oligonucleótidos complementarios con polinucleótido quinasa T4. Los oligonucleótidos complementarios se alinean y se unen para formar los concatemeros. Los concatemeros bicatenarios luego se radiomarcan por, por ejemplo, transcripción con mella. La hibridación normalmente se realiza en condiciones de baja severidad utilizando concentraciones altas de oligonucleótido.

Solución de hibridación del oligonucleótido:

6 x SSC

Fosfato de sodio 0.01 M

EDTA 1 mM (pH 8)

0.5% de SDS

100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado

0.1% leche deshidratada sin grasa

Durante la hibridación, la temperatura se disminuye paso a paso a 5-10ºC bajo el oligonucleótido estimado Tm o debajo de la temperatura ambiente seguido por las etapas de lavado y autoradiografía. El lavado se realiza con baja severidad tal como 3 etapas de lavado utilizando 4 x SSC. Adicionalmente los detalles se describen por Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press o Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons.

Ejemplo 15 Identificación de Genes Homólogos por Bibliotecas de Expresión de Selección con Los anticuerpos

Los clones de c-ADN se pueden utilizar para producir la proteína recombinante por ejemplo en E. coli (por ejemplo sistema Qiagen QIAexpress pQE). Las proteínas recombinantes luego normalmente se purifican por afinidad vía cromatografía de afinidad Ni-NTA (Qiagen). Las proteínas recombinantes luego se utilizan para producir anticuerpos específicos para el ejemplo utilizando técnicas estándar para inmunización de conejo. Los anticuerpos se purifican por afinidad utilizando una columna de Ni-NTA saturada con el antígeno recombinante como se describe por Gu et al., 1994 BioTechniques 17:257-262. El anticuerpo puede que se utilice para seleccionar bibliotecas de expresión de cADN para identificar genes homólogos o heterólogos vía una selección inmunológica (Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press or Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).

Ejemplo 16 Mutagenesis In vivo

La mutagénesis In vivo de microorganismos se puede realizar por pasaje del ADN del plásmido (u otro vector) a través de E. coli u otros microorganismos (por ejemplo Bacillus spp. o levaduras tal como Saccharomyces cerevisiae) que se deterioran en sus capacidades para mantener la integridad de su información genética. Las cepas de mutación típicas tienen mutaciones en los genes por el sistema de reparación del ADN (por ejemplo, mutHLS, mutD, mutT, etc.; para referencia, ver Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms, in: Escherichia coli and Salmonella, p. 2277-2294, ASM: Washington). Tales cepas son bien conocidas por aquellos de habilidad en el oficio. El uso de tales cepas se ilustra, por ejemplo, en Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7: 32-34. La transferencia de moléculas de ADN mutadas en plantas preferiblemente se hace después de la selección y la prueba en microorganismos. Las plantas transgénicas se generan de acuerdo con varios ejemplos dentro de la ejemplificación de este documento.

Ejemplo 17 Análisis In vitro de la Función de Genes de Physcomitrella en Organismos Transgénicos

La determinación de actividades y parámetros cinéticos de enzimas se establece bien en el oficio. Los experimentos para determinar la actividad de una determinada enzima alterada se debe adaptar bien a la actividad específica de la enzima de tipo-salvaje, que está bien dentro de la capacidad de alguien de habilidad en el oficio. La visión general acerca de las enzimas en general, así como los detalles específicos concernientes a la estructura, cinéticas, principios, métodos, aplicaciones y ejemplos para la determinación de muchas actividades enzimáticas se pueden encontrar, por ejemplo, en las siguientes referencias: Dixon, M., and Webb, E.C., (1979) Enzymes. Longmans: London; Fersht, (1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D., ed. (1983) The Enzymes, 3rd ed. Academic Press: New York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2nd ed. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Graß1, M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3rd ed., vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; and Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9, Enzymes. VCH: Weinheim, p. 352-363.

La actividad de las proteínas que se unen al ADN se puede medir por varios métodos bien establecidos, tal como ensayos de desplazamiento de banda de ADN (también llamados ensayos de retraso en gel). El efecto de tales proteínas en la expresión de otras moléculas se pueden medir utilizando ensayos de gen indicador (tal como aquel descrito en Kolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14: 3895-3904 y las referencias citadas en esta). Los sistemas de pruebas del gen indicador son bien conocidos y establecidos para las aplicaciones en las células pro- y eucariota, utilizando enzimas tal como p-galactosidasa, proteína verde fluorescente, y muchas otras.

La determinación de actividad de proteínas de transporte de membranas se puede realizar de acuerdo con técnicas como aquellas descritas en Gennis, R.B. Pores, Channels and Transporters, in Biomembranes, Molecular Structure and Función, pp. 85-137, 199-234 and 270-322, Springer: Heidelberg (1989).

Ejemplo 18 Purificación del Producto Deseado de los Organismos Transformados

La recuperación del producto deseado del material de la planta (i.e., Physcomitrella patents o Arabidopsis thaliana), hongo, algas, ciliados, C. glutamicum células, u otras células bacterianas transformadas con las secuencias del ácido nucleico se describe aquí, o el sobrenadante de los cultivos descritos anteriormente se puede realizar por varios métodos bien conocidos en el oficio. Sí el producto deseado no se secreta de las células, se puede cosechar del cultivo por centrifugación a baja velocidad, las células se pueden lisar por técnicas estándar, tal como fuerza mecánica o sonificación. Los órganos de plantas se pueden separar mecánicamente a partir de otro tejido u órganos. Siguiendo los restos de homogenización celular se remueve por centrifugación, y la fracción del sobrenadante que contiene las proteínas solubles se retiene para otra purificación del compuesto deseado. Sí el producto se secreta de las células deseadas, luego las células se removieron del cultivo por centrifugación a baja velocidad, y la fracción del sobrenadante se retiene para otra purificación.

La fracción del sobrenadante de cualquier método de purificación se somete a cromatografía con una resina apropiada, en la que la molécula deseada se retiene en una resina de cromatografía mientras muchas de las impurezas en la muestra no se retienen, o donde las impurezas se retienen por la resina mientras que la muestra no. Tales etapas de cromatografía se pueden repetir según sea necesario, utilizando la misma o diferentes resinas de cromatografía. Alguien de habilidad en el oficio debería ser bien versado en la selección de resinas apropiadas de cromatografía y en su aplicación más eficaz para una molécula particular que se purifica. El producto purificado se puede concentrar por filtración o ultrafiltración, y se almacenó a una temperatura en la cual la estabilidad del producto se maximiza.

Hay un amplio orden de los métodos de purificación conocidos en el oficio y el método precedente de purificación no tiene la intención de ser limitante. Tales técnicas de purificación se describen, por ejemplo, en Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Ingeniería Fundamentals, McGraw-Hill: NewYork (1986). Adicionalmente, la identidad y pureza de los compuestos aislados pueden ser evaluadas por técnicas estándar en el oficio. Estas incluyen cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), métodos espectroscópicos, métodos de tinción, cromatografía de capa fina, NIRS, ensayo enzimático, o microbiológicamente. Tales métodos de análisis se revisan en: Patek et al., 1994 Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al., 1996 Biotekhnologiya 11:27-32; and Schmidt et al., 1998 Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89-90, p. 521-540, p. 540-547, p. 559-566, 575-581 and p. 581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto.

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<210> 1

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<211> 656

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<212> ADN

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<213> Physcomitrella patens

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9

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<210> 2

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<212> ADN

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<213> Physcomitrella patens

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<212> ADN

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<212> ADN

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<212> ADN

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<213> Physcomitrella patens

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<220>

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<221> base modificada

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<222> (9)

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<223> a, t, c, g, otro o desconocido

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<220>

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<221> base modificada

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<222> (283)

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<223> a, t, c, g, otro o desconocido

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<400> 5

13

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<212> ADN

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<213> Physcomitrella patens

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14

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<210> 7

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<211> 2005

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<212> ADN

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19

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<212> PRT

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22

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24

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27

28

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29

30

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<212> PRT

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<213> Physcomitrella patens

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31

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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18

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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ctaaagggaa caaaagctg

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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tgtaaaacga cggccagt

\hfill

18

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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ctgccgttgg aggcatcctc gccatc

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26

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<210> 20

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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atcccgggca tcgggaagac ggtgtgtgtg tgtg

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34

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<210> 21

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 21

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcgttaacgc taccagcctc gggctgaacc agtc

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34

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<210> 22

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggagcccttg ctgctactgt atgct

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcccgggtg gtggtggcgg tgaagttatt ac

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgttaacat gtacaagctg ttggatgcag c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acatcgggcc ctcgtgcggc acttc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgttaacgc gcggaggaga gcggatcggt tag

\hfill

33

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagctcga gcatgccata tacagtaggt gtg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 28

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgatatcga tttgcaaggg cgaagtgcac aaga

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgatatcga aggcagaagg caactcccag tt

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 30

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\hskip-.1em\dddseqskip

cactcccaca ccacacctac caggca

\hfill

26

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<210> 31

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggcttcgtg agccatgaat ccctt

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 32

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcccgggcg tggaaggaga ggcgaatgtg gagg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagctcct gtgggtgtct agcttcaggt tc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgctgcaga tttcatttgg agaggacacg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 35

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggccggc ctcagaagaa ctcgtcaaga aggcg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgacacgc caagcctcgc tagtc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagacgtat gggaactagc cacct

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgctctacga ttcggtaggt gagagc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggcgacag aggaggacgc gttgt

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgtaggctc ttctacatct cgcaac

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggacgatct tggtggagga gtggaac

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgtcgagcg atggagacag accac

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggatggatg agatgatgaa gggag

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacgaccacc atggacgaag cctcca

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggctgtgctc ggtagattct ctcgca

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagcctcttg gttggacaag tgctc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> BASF PLANT SCIENCE GMBH

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 16313-0033

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/US01/11253

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2001-04-06

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/196,001

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-04-07

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 656

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 807

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 447

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 591

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 587

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otro o desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (283)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otro o desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2559

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2005

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1365

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1346

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1410

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 572

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

47

48

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 532

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

50

51

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

53

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 353

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

55

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 371

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

57

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggaaacag ctatgacc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaaagggaa caaaagctg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtaaaacga cggccagt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgccgttgg aggcatcctc gccatc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcccgggca tcgggaagac ggtgtgtgtg tgtg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgttaacgc taccagcctc gggctgaacc agtc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggagcccttg ctgctactgt atgct

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcccgggtg gtggtggcgg tgaagttatt ac

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgttaacat gtacaagctg ttggatgcag c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acatcgggcc ctcgtgcggc acttc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgttaacgc gcggaggaga gcggatcggt tag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagctcga gcatgccata tacagtaggt gtg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgatatcga tttgcaaggg cgaagtgcac aaga

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgatatcga aggcagaagg caactcccag tt

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cactcccaca ccacacctac caggca

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggcttcgtg agccatgaat ccctt

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcccgggcg tggaaggaga ggcgaatgtg gagg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagctcct gtgggtgtct agcttcaggt tc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgctgcaga tttcatttgg agaggacacg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggccggc ctcagaagaa ctcgtcaaga aggcg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgacacgc caagcctcgc tagtc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagacgtat gggaactagc cacct

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgctctacga ttcggtaggt gagagc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggcgacag aggaggacgc gttgt

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

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gcgtaggctc ttctacatct cgcaac

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26

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<210> 41

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 41

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cggacgatct tggtggagga gtggaac

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27

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<210> 42

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 42

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gtgtcgagcg atggagacag accac

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<210> 43

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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cggatggatg agatgatgaa gggag

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<210> 44

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 44

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cacgaccacc atggacgaag cctcca

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26

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<210> 45

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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ggctgtgctc ggtagattct ctcgca

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 46

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cagcctcttg gttggacaag tgctc

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Claims

1. Una célula vegetal transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica una Proteína Fosfatasa Relacionada con el Estrés (PHSRP) el cual es un ácido nucleico que codifica una Proteína Fosfatasa 2A-4, en donde la expresión del ácido nucleico en la célula vegetal resulta en el incremento de la tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de célula vegetal de tipo salvaje, en donde la PHSRP es una PP2A-4 como se define en la SEQ ID NO:13 y las secuencias que son al menos 96% homólogas a la secuencia total del aminoácido mostrada en la SEQ ID NO:13.

2. La célula vegetal transgénica de la reivindicación 1, en donde la PHSRP es una PP2A-4 como se define en la SEQ ID NO:13.

3. La célula vegetal transgénica de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico que codifica una PHSRP es un ácido nucleico que codifica una PP2A-4 como se define en la SEQ ID NO:8.

4. La célula vegetal transgénica de la Reivindicación 1, en donde el ácido nucleico que codifica una PHSRP es al menos 80% homólogo a la secuencia de SEQ ID NO:8 sobre la región codificante total.

5. La célula vegetal transgénica de la Reivindicación 1, en donde la planta es una monocotiledónea.

6. La célula vegetal transgénica de la Reivindicación 1, en donde la planta es una dicotiledónea.

7. La célula vegetal transgénica de la Reivindicación 1, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, soja, maní, algodón, semilla de colza, canola, yuca, pimienta, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especie Vicia, guisante, alfalfa, café, cacao, té, especie Salix, aceite palma, coco, hierba perenne y cultivos de forraje.

8. Una planta transgénica que comprende una célula vegetal de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7.

9. Una semilla producida por una planta transgénica que comprende una célula vegetal de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en donde la semilla es un cultivo auténtico para el incremento de la tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de célula vegetal de tipo salvaje.

10. Uso de una planta o semilla de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 9 para la producción de un producto agrícola.

11. Una Proteína Fosfatasa Relacionada con el Estrés (PHSRP) aislada, en donde la PHSRP es la Proteína Fosfatasa 2A-4 (PP2A-4) como se define en la SEQ ID NO:13 y las secuencias que son al menos 96% homólogas a la secuencia de aminoácidos total mostrada en la SEQ ID NO:13.

12. La PHSRP de la Reivindicación 11, en donde la PHSRP es PP2A-4 como se define en la SEQ ID NO:13.

13. Un ácido nucleico que codifica una Proteína Fosfatasa Relacionada con el Estrés (PHSRP) aislada, en donde el ácido nucleico que codifica la PHSRP codifica para la Proteína Fosfatasa 2A-4 (PP2A-4) como se define en la SEQ ID NO:13 y las secuencias que son al menos 96% homólogas a la secuencia de aminoácidos total mostrada en la SEQ ID NO:13.

14. El ácido nucleico que codifica la PHSRP de la Reivindicación 13, en donde el ácido nucleico que codifica la PHSRP es PP2A-4 como se define en la SEQ ID NO:8.

15. El ácido nucleico que codifica la PHSRP de la Reivindicación 13, en donde el ácido nucleico que codifica la PHSRP es al menos 90% homóloga a la secuencia de la SEQ ID NO:8 sobre la región codificante total.

16. Un vector de expresión recombinante aislado que comprende el ácido nucleico de las Reivindicaciones 14 o 15, en donde la expresión del vector en una célula huésped resulta en el incremento de la tolerancia al estrés en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula huésped.

17. Un método de producción de una planta transgénica que contiene un ácido nucleico que codifica una Proteína Fosfatasa Relacionada con el Estrés (PHSRP) que es el ácido nucleico que codifica una Proteína Fosfatasa 2A-4 (PP2A-4), en donde la expresión del ácido nucleico en la planta resulta en el incremento de la tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta, que comprende la transformación de una célula vegetal con un vector de expresión que comprende el ácido nucleico, la producción a partir de la célula vegetal de una planta transgénica con un incremento en la tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta, en donde la PHSRP es una PP2A-4 como se define en la SEQ ID NO:13 y las secuencias que son al menos 96% homólogas a la secuencia de aminoácidos total mostrada en la SEQ ID NO:13.

18. El método de la reivindicación 17, en donde la PHSRP es PP2A-4 como se define en la SEQ ID NO:13.

19. El método de la Reivindicación 17, en donde el ácido nucleico que codifica la PHSRP es el ácido nucleico que codifica la PP2A-4 como se define en la SEQ ID NO:8.

20. El método de la Reivindicación 19, en donde el ácido nucleico que codifica la PHSRP es al menos 80% homólogo a la secuencia de la SEQ ID NO: 8 sobre la región codificante total.

21. Un método de modificación de la tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura de una planta que comprende, modificar la expresión de una Proteína Fosfatasa Relacionada con el Estrés (PHSRP) la cual es la Proteína Fosfatasa 2A-4 en la planta, en donde la PHSRP es una PP2A-4 como se define en la SEQ ID NO:13 y las secuencias que son al menos 96% homólogas a la secuencia de aminoácidos total mostrada en la SEQ ID NO:13.

22. El método de la Reivindicación 21, en donde la PHSRP es PP2A-4 como se define en la SEQ ID NO:13.

23. El método de la Reivindicación 21, en donde el ácido nucleico que codifica la PHSRP es ácido nucleico codificante de PP2A como se define en la SEQ ID NO:8.

24. El método de la Reivindicación 21, en donde el ácido nucleico que codifica la PHSRP es al menos 80% homólogo a la secuencia de la SEQ ID NO:8 sobre la región codificante total.

25. El método de la Reivindicación 21, en donde la tolerancia al estrés se incrementa.

26. El método de la Reivindicación 21, en donde la tolerancia al estrés se disminuye.

27. El método de la Reivindicación 21, en donde la planta no es transgénica.

28. El método de la Reivindicación 21, en donde la planta es transgénica.

29. El método de la Reivindicación 28, en donde la planta se transforma con un promotor que dirige la expresión de la PHSRP.

30. El método de la Reivindicación 29, en donde el promotor es específico al tejido.

31. El método de la Reivindicación 29, en donde el promotor se regula en el aspecto del desarrollo.