ES2279810T3

ES2279810T3 - Proteinas relacionadas con el estres del ciclo celular y metodos de utilizacion en plantas.

Info

Publication number: ES2279810T3
Application number: ES01928389T
Authority: ES
Inventors: Oswaldo Da Costa E Silva; Hans J. Bohnert; Nocha Van Thielen; Ruoying Chen; Rodrigo Sarria-Millan
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-04-06
Publication date: 2007-09-01
Anticipated expiration: 2021-04-06
Also published as: DE60124880T2; EP1294912A2; EP1783229A2; CA2767239A1; US7803987B2; US20090100540A1; DE60131772D1; US7259294B2; US20100011466A1; AU2001249941A1; US20100325759A1; CA2767275A1; US20080189806A1; CA2405750A1; US6689939B2; US20030097675A1; ATE475715T1; US7166767B2; US20080168578A1; US6720477B2

Abstract

Una célula de planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de una Proteína Relacionada con el Estrés del Ciclo Celular (CCSRP), en donde la CCSRP se selecciona del grupo constituido por CC-1 como se define en SEQ ID NO:7 y un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:7 en toda su longitud, y en donde la expresión del ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado una tolerancia incrementada de la célula de la planta al estrés por sequía y/o por helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la planta.

Description

Proteínas relacionadas con el estrés del ciclo celular y métodos de utilización en plantas.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención se refiere en general a secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que están asociadas con respuestas al estrés abiótico y la tolerancia al estrés abiótico en las plantas. En particular, esta invención se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que confieren a las plantas tolerancia a la sequía y/o el frío.

Técnica anterior

Los estados de estrés abiótico ambiental, tales como estrés por sequía, estrés por salinidad, estrés por calor y estrés por frío, son factores importantes limitantes del crecimiento y la productividad de las plantas. Las pérdidas de cosecha y las pérdidas de rendimiento de cosecha en cosechas importantes tales como arroz, maíz dulce (cereal) y trigo causadas por estos estados de estrés representan un factor económico y político importante y contribuyen a la escasez de alimentos en muchos países subdesarrollados.

Las plantas se ven expuestas típicamente durante su ciclo vital a condiciones de contenido reducido de agua en el ambiente. La mayoría de las plantas han desarrollado estrategias para protegerse a sí mismas contra estas condiciones de desecación. No obstante, si la severidad y duración de las condiciones de sequía son demasiado grandes, los efectos sobre el desarrollo, el crecimiento y el rendimiento de la mayoría de las plantas de cosecha son profundos. Adicionalmente, la mayoría de las plantas de cosecha son muy sensibles a concentraciones más altas de sal en el suelo. La exposición continua a sequía y contenido elevado de sal causa alteraciones importantes en el metabolismo de las plantas. Estos grandes cambios en el metabolismo conducen finalmente a la muerte celular y por consiguiente a pérdidas de rendimiento.

El desarrollo de plantas tolerantes al estrés es una estrategia que tiene el potencial de resolver o mediar al menos algunos de estos problemas. Sin embargo, las estrategias tradicionales de reproducción de las plantas para desarrollar nuevas líneas de plantas que exhiban resistencia (tolerancia) a estos tipos de estrés son relativamente lentas y requieren líneas resistentes específicas para cruzamiento con la línea deseada. Los recursos limitados de germoplasma para tolerancia al estrés e incompatibilidad en los cruzamientos entre especies de plantas remotamente emparentadas representan problemas importantes encontrados en la reproducción convencional. Adicionalmente, los procesos celulares que conducen a la tolerancia a la sequía, el frío y la sal en plantas modelo tolerantes a la sequía y/o la sal son de naturaleza compleja e implican mecanismos múltiples de adaptación celular y numerosos caminos metabólicos. Esta naturaleza multi-componente de la tolerancia al estrés no sólo ha hecho infructuosa en gran parte la reproducción orientada a la tolerancia, sino que ha limitado también la posibilidad de modificar por bioingeniería plantas tolerantes al estrés utilizando métodos biotecnológicos.

Por esta razón, lo que se necesita es la identificación de los genes y proteínas implicados en estos procesos multi-componente que conducen a la tolerancia al estrés. La dilucidación de la función de los genes expresados en las plantas tolerantes al estrés no sólo aumentará la comprensión actual de la adaptación y tolerancia de las plantas a los estados de estrés ambiental, sino que puede proporcionar también información importante para el diseño de nuevas estrategias para mejora de las cosechas.

Un grupo de proteínas que parece estar asociado con las respuestas al estrés en plantas y animales son las proteínas relacionadas con la división celular y el ciclo celular. La evidencia de esta relación se encuentra en el hecho de que los diferentes estados de estrés ambiental relacionados con el contenido de agua en el suelo, la luz incidente y la temperatura variable de las hojas dan todos ellos como resultado un cambio en la tasa de división celular. Por ejemplo, en las hojas del girasol, existe una prolongación del ciclo celular asociada con el estrés y el envejecimiento. Las células en las hojas de girasol tienden a detenerse en la fase G1 del ciclo celular, sin cambio alguno en la duración de las fases S-G2-M del ciclo celular. Observaciones análogas se han efectuado en otras especies de plantas expuestas a estados de estrés ambiental tales como el agotamiento de sacarosa (Van't Hof 1973 Bookhaven Symp. 25: 152), estrés oxidante (Reichheld et al. 1999 Plant J. 17: 647), y empobrecimiento en agua (Schuppler et al. 1998 Plant Physiol. 117: 667). Estas observaciones y resultados sugieren que existe un importante "punto de control" en la regulación del ciclo celular en la transición G1-S, si bien otros estudios sugieren otro "punto de control" en la transición G2-M con una parada de las células en la fase G2. Se ha determinado también que la temperatura afecta a la duración de todas las fases del ciclo celular en una proporción similar sin parada preferencial en ninguna fase particular del ciclo celular (Tardieu y Granier, 2000 Plant Mol. Biol. 43: 555). Aunque estas respuestas arriba mencionadas a los estados de estrés ambiental difieren, cada uno de estos resultados demuestra la interconexión del sistema de respuesta al estrés de estas plantas y las proteínas de división de la célula en ellas.

La técnica anterior describe varias proteínas asociadas con la división celular y el ciclo celular. Una de dichas proteínas, o complejo proteínico, es el complejo ciclina-CDK, que controla la progresión de las fases del ciclo celular. Las proteína-quinasas dependientes de ciclina (CDKs) requieren la fijación de ciclina para actividad y son actualmente actores bien reconocidos en los puntos de control del ciclo de las células eucariotas. La importancia generalizada de las CDKs se comprobó hace aproximadamente 10 años a partir de enfoques genéticos independientes en estudios de levaduras y bioquímicos de controles mitóticos en huevos fertilizados de invertebrados marinos.

Un componente conocido de un complejo CDK es una proteína Cdc2 denominada P34^{cdc2}, que es requerida en ambos puntos de control (G1-S y G2-M). Varios otros homólogos de Cdc2 han sido aislados de la especie humana y de plantas con inclusión de levadura. Un homólogo de levadura de este tipo es Cdc48, que juega un papel en la separación del cuerpo polar del huso en Saccharomyces cerevisiae. Otro homólogo de Cdc2 ha sido descrito en Arabidopsis (Feiler et al. 1995 EMBO J. 14: 5626) que se expresa abundantemente en las células proliferantes del vástago vegetativo, la raíz, la inflorescencia floral y las flores y en las células que crecen rápidamente. El gen Cdc48 de Arabidopsis está regulado en sentido creciente en las microsporas y óvulos en desarrollo y regulado en sentido decreciente en la mayoría de los tipos de células diferenciados. Adicionalmente, este gen ha sido localizado en el núcleo y durante la citoquinesis al fragmoplasto.

Otro grupo de proteínas implicadas en la división celular y el ciclo celular son las proteínas pRB. Evidencias crecientes sugieren que las proteínas afines a pRB en las plantas podrían encontrarse entre las dianas nucleares de las CDKs de las plantas. En los mamíferos, la pRB es fundamental para la regulación de la transición G1-a-S. La fosforilación de pRB de mamífero por quinasas dependientes de ciclina D y ciclina E hace la pRB inactiva y reprime por tanto la fase S promoviendo la replicación del DNA. Significativamente, el motivo LXCXE de fijación de pRB (donde X denota cualquier aminoácido) se encuentra en todas las ciclinas D conocidas de plantas. En las plantas, interacciones dependientes de LXCXE entre las ciclinas D de Arabidopsis y las proteínas pRB del maíz han sido demostradas in vitro y en un ensayo de dos híbridos de levadura. El papel de las pRBs en las cascadas de señalización relacionadas con la división de las células vegetales está respaldado adicionalmente por el hecho de que varias pRBs, y en particular, la pRB de maíz, contienen sitios múltiples supuestos de fosforilación de CDK y son fosforilados eficientemente in vitro por CDKs específicas de G1 y S de mamífero. Se sabe también que las proteínas pRB del maíz sufren cambios en la fosforilación durante la transición a la endorreduplicación en el endospermo. Sin embargo, la fosforilación por CDKs de plantas no está demostrada todavía.

Por consiguiente, aunque varias proteínas del ciclo celular de las plantas han sido dilucidadas, la técnica anterior no ha descrito todavía en detalle las cascadas de transducción de señales del ciclo celular de las plantas. La técnica anterior falla también en describir la relación entre las proteínas del ciclo celular de las plantas y una respuesta de las plantas al estrés ambiental de tal modo que pueda generarse una planta tolerante al estrés. De acuerdo con ello, existe necesidad de identificar los genes expresados en las plantas tolerantes al estrés que tienen la capacidad de conferir resistencia al estrés a su planta hospedadora y a otras especies de plantas. Las plantas tolerantes al estrés de nueva generación tendrán muchas ventajas, tales como aumentar la extensión en que pueden cultivarse plantas de cosecha mediante por ejemplo, disminución de los requerimientos de agua de una especie de planta.

Sumario de la invención

Esta invención satisface en parte la necesidad de identificar nuevas proteínas, exclusivas del ciclo celular, capaces de conferir por sobre-expresión tolerancia al estrés por sequía y/o helada a las plantas. La presente invención proporciona una célula de planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de una Proteína Relacionada con el Estrés del Ciclo Celular (CCSRP) y seleccionada del grupo constituido por CC-1 como se define en SEQ ID NO:7 y un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:7 en toda su longitud, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la planta. Se describen en esta memoria las proteínas del ciclo celular 1) Ciclo Celular-1 (CC-1); 2) Ciclo Celular-2 (CC-2) y 3) Ciclo Celular-3 (CC-3), todas ellas de Physcomitrella patens. CC-2 y CC-3 no son objeto de la invención.

La invención estipula en algunas realizaciones que la CCSRP y el ácido nucleico codificante son los encontrados en miembros del género Physcomitrella. En otra realización preferida, el ácido nucleido de la proteína son de una Physcomitrella patens. La invención estipula que el estrés ambiental es sequía o temperatura baja.

La invención proporciona adicionalmente una semilla producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleido codificante de CCSRP, en donde la planta es progenie auténtica para tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La invención proporciona adicionalmente una semilla producida por una planta transgénica que expresa una CCSRP, en donde la planta es progenie auténtica para tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

La invención proporciona adicionalmente un producto agrícola producido por cualquiera de las plantas transgénicas, partes de plantas o semillas descritas más adelante. La invención proporciona adicionalmente una CCSRP aislada como se describe más adelante. La invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico codificante de CCSRP, en donde el ácido nucleico codificante de CCSRP codifica una CCSRP como se describe más adelante.

La invención proporciona adicionalmente un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico codificante de CCSRP como se describe más adelante, en donde la expresión del vector en una célula hospedadora da como resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora. La invención proporciona adicionalmente una célula hospedadora que contiene el vector y una planta que contiene la célula hospedadora.

La invención proporciona adicionalmente un método de producción de una planta transgénica con un ácido nucleico codificante de CCSRP, en donde la expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta que comprende: (a) transformar una célula de la planta con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de CCSRP, y (b) generar a partir de la célula de la planta una planta transgénica con una tolerancia incrementada al estrés por sequía y/o helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La CCSRP y el ácido nucleico codificante de CCSRP son como se describe más adelante.

La presente invención proporciona también métodos de modificación de la tolerancia al estrés por sequía y/o helada de una planta que comprenden modificar la expresión de una CCSRP en la planta, en donde la CCSRP es como se describe más adelante. La invención estipula que este método puede realizarse de tal manera que la tolerancia al estrés por sequía y/o helada se incrementa. Preferiblemente, la tolerancia al estrés por sequía y/o helada se incrementa en una planta por aumento de la expresión de una CCSRP.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1(A-C) muestran las secuencias parciales de cDNA de CC-1 (SEQ ID NO:1), CC-2 (SEQ ID NO:2), y CC-3 (SEQ ID NO:3) de Physcomitrella patens.

Las Figuras 2(A-C) muestran las secuencias de cDNA de longitud total de CC-1 (SEQ ID NO:4), CC-2 (SEQ ID NO:5), y CC-3 (SEQ ID NO:6) de Physcomitrella patens.

Las Figuras 3(A-H) muestran las secuencias de aminoácidos deducidas de CC-1 (SEQ ID NO:7), CC-2 (SEQ ID NO:8), y CC-3 (SEQ ID NO:9) de Physcomitrella patens.

La Figura 4 muestra un diagrama del vector de expresión de plantas ppBPSsc022 que contiene el super-promotor que dirige la expresión de SEQ ID NOs: 4, 5 y 6 ("Gen Deseado"). Los componentes son: gen NPTII de resistencia a la kanamicina, promotor AtAct2-i, terminador OCS3, terminador NOSpA (Jefferson et al. 1987 EMBO J 6: 3901-7).

La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con plantas transgénicas que sobre-expresan PpCC-1 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales.

La Figura 6 muestra los resultados de un ensayo de estrés por helada con plantas transgénicas que sobre-expresan PpCC-1 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales.

La Figura 7 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con plantas transgénicas que sobre-expresan PpCC-2 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales.

La Figura 8 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con plantas transgénicas que sobre-expresan PpCC-3 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales.

Descripción detallada de la invención

La presente invención puede entenderse más fácilmente haciendo referencia a la descripción detallada que sigue de las realizaciones preferidas de la invención y los ejemplos incluidos en esta memoria. Debe entenderse también que la tecnología utilizada en esta memoria tiene por objeto describir únicamente realizaciones específicas y no debe entenderse como limitante. En particular, la designación de las secuencias de aminoácidos como proteína "PROTEÍNAas Relacionadas con el Estrés del ciclo Celular" (CCSRPs), no limita en modo alguno la funcionalidad de dichas secuencias. De acuerdo con la invención, CCSRP se selecciona del grupo constituido por CC-1 como se define en SEQ ID NO:7 y un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:7 en toda su longitud.

La presente invención proporciona una célula de planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de CCSRP, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la planta. La invención proporciona adicionalmente partes de plantas transgénicas y plantas transgénicas que contienen las células de planta descritas en esta memoria. Se proporciona también una semilla de planta producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de CCSRP, en donde la semilla contiene el ácido nucleico codificante de CCSRP, y en donde la planta es progenie auténtica para tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La invención proporciona adicionalmente una semilla producida por una planta transgénica que expresa una CCSRP, en donde la semilla contiene la CCSRP, y en donde la planta es progenie auténtica para tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La invención proporciona además un producto agrícola producido por cualquiera de las plantas transgénicas descritas más adelante, partes de plantas y semillas de plantas.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "variedad" se refiere a un grupo de plantas dentro de una especie que comparten caracteres constantes que las separan de la forma típica y de otras variedades posibles dentro de dicha especie. Si bien posee al menos un rasgo distintivo, una variedad se caracteriza también por cierta variación entre los individuos dentro de la variedad, basada fundamentalmente en la segregación mendeliana de rasgos entre la progenie de generaciones sucesivas. Una variedad se considera "progenie auténtica" para un rasgo particular si la misma es genéticamente homocigótica para dicho rasgo en tal grado que, cuando la variedad de progenie auténtica se auto-poliniza, no se observa una cantidad significativa de segregación independiente del rasgo entre la progenie. En la presente invención, el rasgo procede de la expresión transgénica de una o más secuencias de DNA introducidas en una variedad de planta.

La presente invención describe por primera vez que la CCSRP CC-1 de Physcomitrella patens es útil para aumentar la tolerancia de una planta al estrés ambiental. De acuerdo con ello, la presente invención proporciona CCSRPs aisladas seleccionadas del grupo constituido por una proteína del Ciclo Celular-1 (CC-1) como se define en SEQ ID NO:7 y homólogos y ortólogos de la misma. Homólogos y ortólogos de secuencias de aminoácidos se definen más adelante.

Homólogos y ortólogos de secuencias de aminoácidos se definen más adelante.

Las CCSRPs de la presente invención se producen preferiblemente por técnicas de DNA recombinante. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína se somete a clonación en un vector de expresión (como se describe más adelante), se introduce el vector de expresión en una célula hospedadora (como se describe más adelante) y se expresa la CCSRP en la célula hospedadora. La CCSRP puede aislarse luego de las células por un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas estándar de purificación de proteínas. Como alternativa a la expresión recombinante, un polipéptido o péptido CCSRP puede sintetizarse químicamente utilizando técnicas estándar de síntesis de péptidos. Además, una CCSRP nativa puede aislarse de células (v.g., Physcomitrella patens), por ejemplo utilizando un anticuerpo anti-CCSRP, que puede producirse por técnicas estándar utilizando una CCSRP o fragmento de la misma.

La invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico codificante dee CCSRP aislado. El ácido nucleico codificante de CCSRP se selecciona de un ácido nucleico del Ciclo Celular-1 (CC-1) como se define en SEQ ID NO:4.

Homólogos y ortólogos de las secuencias de nucleótidos se definen a continuación. En una realización preferida, el ácido nucleico y la proteína se aislan del género de plantas Physcomitrella. En otra realización preferida, el ácido nucleico y la proteína son de una planta Physcomitrella patens (P. patens).

Como se utiliza en esta memoria, el término "estrés ambiental" hace referencia a cualquier condición de crecimiento sub-óptima e incluye, pero sin carácter limitante, condiciones sub-óptimas asociadas con estados de estrés por salinidad, sequía, temperatura, metales, productos químicos, patógenos y oxidantes, o combinaciones de los mismos. De acuerdo con el objeto de la invención reivindicado, el estrés ambiental es contenido de agua bajo o temperatura baja. Debe entenderse también que, tal como se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, "un" o "uno" puede significar uno o más, dependiendo del contexto en el que se utilice. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" puede significar que se puede utilizar como mínimo una célula.

Como se utiliza también en esta memoria, debe entenderse que los términos "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" incluyen moléculas de DNA (v.g., cDNA o DNA genómico) y moléculas de RNA (v.g., mRNA) y análogos del DNA o RNA generados utilizando análogos de nucleótidos. Este término abarca también una secuencia no traducida localizada en ambos extremos 3' y 5' de la región codificante del gen: al menos aproximadamente 1000 nucleótidos de secuencia aguas arriba del extremo 5' de la región codificante y al menos aproximadamente 200 nucleótidos de la secuencia aguas abajo del extremo 3' de la región codificante del gen. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente se trata de DNA bicatenario.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una que está sustancialmente separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está exento de algunas de las secuencias que flanquean naturalmente al ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el DNA genómico del organismo del que se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en varias realizaciones, la molécula de ácido nucleico CCSRP aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el DNA genómico de la célula de la que se deriva el ácido nucleico (v.g., una célula de Physcomitrella patens). Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de cDNA, puede estar exenta de algo del resto del material celular con el que está asociada naturalmente, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, v.g., una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:4 o una porción de la misma, puede aislarse utilizando técnicas estándar de biología molecular y la información de secuencias proporcionada en esta memoria. Por ejemplo, un cDNA de CCSRP de P. patens puede aislarse a partir de una genoteca de P. patens utilizando la totalidad o una porción de la secuencia de SEQ ID NO:1.

Además, una molécula de ácido nucleico que abarca la totalidad o una porción de la secuencia de SEQ ID NO:1 puede aislarse por la reacción en cadena de la polimerasa utilizando iniciadores oligonucleotídicos diseñados sobre la base de esta secuencia. Por ejemplo, puede aislarse mRNA a partir de células de plantas (v.g., por el procedimiento de extracción con tiocianato de guanidinio de Chirgwin et al. 1979 (Biochemistry 18: 5294-5299) y puede prepararse cDNA utilizando transcriptasa inversa (v.g., transcriptasa inversa de MLV de Moloney, disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD; o transcriptasa inversa de AMV, disponible de Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Pueden diseñarse iniciadores oligonucleotídicos sintéticos para amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa sobre la base de la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:1. Una molécula de ácido nucleico de la invención puede amplificarse utilizando cDNA o, alternativamente, DNA genómico, como molde e iniciadores oligonucleotídicos apropiados de acuerdo con técnicas estándar de amplificación PCR. La molécula de ácido nucleico así amplificada puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por análisis de la secuencia de DNA. Adicionalmente, pueden prepararse oligonucleótidos correspondientes a una secuencia de nucleótidos de CCSRP por técnicas de síntesis estándar, v.g., utilizando un sintetizador automático de DNA.

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende las secuencias de nucleótidos que se muestran en SEQ ID NO:4.

Estos cDNAs comprenden secuencias que codifican las CCSRPs, es decir, la ´"región codificante", indicada en la Tabla 1), así como secuencias no traducidas 5' y secuencias no traducidas 3'. Debe entenderse que SEQ ID NO:4 comprende a la vez regiones codificantes y regiones no traducidas 5' y 3'. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden comprender únicamente la región codificante de la secuencia en SEQ ID NO:4, o pueden contener fragmentos genómicos enteros aislados de DNA genómico. Una región codificante de estas secuencias se indica como una "posición ORF". Se prefiere un ácido nucleico codificante de CCSRP que codifica la CCSRP CC-1 (SEQ ID NO:7).

Además, la molécula de ácido nucleico puede comprender solamente una porción de la región codificante de una de las secuencias en SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6, por ejemplo, un fragmento que puede utilizarse como una sonda o iniciador o un fragmento que codifica una porción biológicamente activa de una CCSRP. Las secuencias de nucleótidos determinadas por la clonación de los genes CCSRP de P. patens permiten la generación de sondas e iniciadores diseñados para uso en la identificación y/o clonación de homólogos de CCSRP en otros tipos de células y organismos, así como homólogos de CCSRP de otros musgos y especies afines.

Porciones de proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico de CCSRP son preferiblemente porciones biológicamente activas de una de las CCSRPs descritas en esta memoria. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "porción biológicamente activa de "una CCSRP tiene por objeto incluir una porción, v.g., un dominio/motivo, de una CCSRP que participa en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, tiene una actividad como se ilustra en la Tabla 1, o participa en la transcripción de una proteína implicada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta. Para determinar si una CCSRP, o una porción biológicamente activa de la misma, puede participar en la transcripción de una proteína implicada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, puede realizarse un análisis de estrés de una planta que comprende la CCSRP. Tales métodos de análisis son bien conocidos por los expertos en la técnica, como se detalla en el Ejemplo 7. Más específicamente, pueden prepararse fragmentos de ácido nucleico que codifican porciones biológicamente activas de una CCSRP por aislamiento de una porción de la secuencia en SEQ ID NO:7, expresión de la porción codificada de la CCSRP o péptido (v.g., por expresión recombinante in vitro) y evaluación de la actividad de la porción codificada de la CCSRP o péptido.

Porciones biológicamente activas de una CCSRP abarcan e incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de aminoácidos de una CCSRP, v.g., una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, o la secuencia de aminoácidos de una proteína homóloga a una CCSRP, que incluyen menos aminoácidos que una CCSRP de longitud total o la proteína de longitud total que es homóloga a una CCSRP, y exhiben al menos una actividad de una CCSRP. Típicamente, porciones biológicamente activas (v.g., péptidos que tienen, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 o más aminoácidos de longitud) comprenden un dominio o motivo que tiene al menos una actividad de una CCSRP. Además, otras porciones biológicamente activas en las cuales se han delecionado otras regiones de la proteína, pueden prepararse por técnicas recombinantes y evaluarse respecto a una o más de las actividades descritas en esta memoria. Preferiblemente, las fracciones biológicamente activas de una CCSRP
incluyen uno o más dominios/motivos seleccionados o porciones de los mismos que tienen actividad biológica.

Pueden proporcionarse proteínas CCSRP quiméricas o de fusión. Como se utiliza en esta memoria, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" CCSRP comprende un polipéptido CCSRP enlazado operativamente a un polipéptido que no es CCSRP. Un polipéptido CCSRP hace referencia a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una CCSRP, mientras que un polipéptido que no es CCSRP hace referencia a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una proteína que no es sustancialmente homóloga a la CCSRP, v.g., una proteína que es diferente de la CCSRP y se deriva del mismo organismo o un organismo diferente. Dentro de la proteína de fusión, el término "enlazada operativamente" tiene por objeto indicar que el polipéptido CCSRP y el polipéptido que no es CCSRP están fusionados uno a otro de tal manera que ambas secuencias desempeñan la función propuesta atribuida a la secuencia utilizada. El polipéptido que no es CCSRP puede fusionarse al término N o el término C del polipéptido CCSRP. Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST-CCSRP en la cual las secuencias CCSRP están fusionadas al término C de las secuencias GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de CCSRPs recombinantes. En otra realización, la proteína de fusión es una CCSRP que contiene una secuencia señal heteróloga en su término N. En ciertas células hospedadoras (v.g., células hospedadoras de mamífero), la expresión y/o secreción de una CCSRP puede aumentarse por el uso de una secuencia señal heteróloga.

Preferiblemente, una proteína CCSRP quimérica o de fusión se produce por técnicas estándar de DNA recombinante. Por ejemplo, fragmentos de DNA que codifican las diferentes secuencias de polipéptidos se ligan uno a otro en marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo empleando términos de extremos romos o extremos cohesivos para ligación, digestión con enzimas de restricción para proporcionar los términos apropiados, rellenado de extremos cohesivos en caso apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar unión y ligación enzimática indeseables. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores automáticos de DNA. Alternativamente, puede llevarse a cabo amplificación por PCR de fragmentos de genes utilizando iniciadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos de gen consecutivos que pueden reasociarse posteriormente y reamplificarse para generar una secuencia de gen quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Además, están disponibles comercialmente muchos vectores de expresión que codifican ya un resto de fusión (v.g., un polipéptido GST). Un ácido nucleico codificante de CCSRP puede clonarse en un vector de expresión de este tipo de tal modo que la proteína de fusión está enlazada en marco a la CCSRP.

Además de fragmentos y proteínas de fusión de las CCSRPs descritas en esta memoria, pueden proporcionarse homólogos y análogos de CCSRPs existentes naturalmente y ácidos nucleicos codificantes de CCSRP en una planta. Los "homólogos" se definen en esta memoria como dos ácidos nucleicos o proteínas que tienen secuencias similares, u "homólogas", de nucleótidos o aminoácidos, respectivamente. Los homólogos incluyen variantes alélicas, ortólogos, parálogos, agonistas y antagonistas de las CCSRPs como se definen más adelante. El término "homólogo" abarca adicionalmente moléculas de ácido nucleico que difieren de una de las secuencias de nucleótidos que se muestran en SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6 (y porciones de las mismas) debido a la degeneración del código genético y codifican por tanto las mismas CCSRP que la codificada por las secuencias de nucleótidos que se muestran en SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6. Como se utiliza en esta memoria, una CCSRP "existente naturalmente" hace referencia a una secuencia de aminoácidos de CCSRP que existe en la naturaleza. Preferiblemente, una CCSRP existente naturalmente comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9.

Un agonista de la CCSRP puede retener sustancialmente las mismas, o un subconjunto de las actividades biológicas de la CCSRP. Un antagonista de la CCSRP puede inhibir una o más de las actividades de la forma de la CCSRP existente naturalmente. Por ejemplo, el antagonista de CCSRP puede fijarse competitivamente a un miembro situado aguas abajo o aguas arriba de la cascada metabólica de componentes de la membrana celular que incluye la CCSRP, o fijarse a una CCSRP que media el transporte de compuestos a través de tales membranas, impidiendo con ello que tenga lugar translocación.

Moléculas de ácido nucleico correspondientes a variantes alélicas naturales y análogos, ortólogos y parálogos de un cDNA de CCSRP pueden aislarse sobre la base de su identidad con los ácidos nucleicos de CCSRP de Physcomitrella patens descritos en esta memoria utilizando cDNAs de CCSRP, o una porción de los mismos, como una sonda de hibridación de acuerdo con técnicas estándar de hibridación en condiciones de hibridación severa. En una realización alternativa, pueden identificarse homólogos de la CCSRP por escrutinio de genotecas combinatorias de mutantes, v.g., mutantes de truncación, de la CCSRP respecto a actividad agonista o antagonista de CCSRP. En una realización, se genera una genoteca diversificada de variantes de CCSRP por mutagénesis combinatoria al nivel de ácido nucleico, y se codifica por una genoteca de genes diversificada. Una genoteca diversificada de variantes de CCSRP puede producirse, por ejemplo, por ligación enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos a secuencias de genes de tal modo que puede expresarse un conjunto degenerado de secuencias potenciales de CCSRP como polipéptidos individuales, o alternativamente, como una serie de proteínas de fusión mayores (v.g., para presentación de fago) que contienen la serie de secuencias CCSRP en ellas. Existen una diversidad de métodos que pueden utilizarse para producir genotecas de homólogos potenciales de CCSRP a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de una secuencia de genes degenerada puede realizarse en un sintetizador automático de DNA, y el gen sintético se liga luego a un vector de expresión apropiado. El uso de una serie degenerada de genes permite la provisión, en una sola mezcla, de todas las secuencias que codifican la serie de secuencias de CCSRP potenciales deseada. Métodos para la síntesis de oligonucleótidos degenerados se conocen en la técnica (véase, v.g., Narang, S.A., 1983 Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. 1984 Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al. 1984 Science 198: 1056; Ike et al. 1983 Nucleic Acid Res. 11: 477).

Adicionalmente, pueden utilizarse genotecas de fragmentos de las regiones codificantes de CCSRP para generar una población diversificada de fragmentos de CCSRP para escrutinio y selección subsiguiente de homólogos de una CCSRP. En una realización, puede generarse una genoteca de fragmentos de secuencias codificantes por tratamiento de un fragmento PCR bicatenario de una secuencia codificiante de CCSRP con una nucleasa en condiciones en las cuales se produce mella sólo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalización del DNA bicatenario, renaturalización del DNA para formar DNA bicatenario, que puede incluir pares sentido/antisentido de productos con mellas diferentes, separación de las porciones monocatenarias de los dúplex nuevamente formados por tratamiento con nucleasa S1, y ligación de la genoteca de fragmentos resultante a un vector de expresión. Por este método, puede derivarse una genoteca de expresión que codifica fragmentos N-terminales, C-terminales e internos de diversos tamaños de la CCSRP.

Se conocen en la técnica varios métodos para escrutar productos génicos de genotecas combinatorias producidas por mutaciones puntuales o truncación, y para el escrutinio de genotecas de cDNA en cuanto a productos génicos que tengan una propiedad seleccionada. Dichos métodos pueden adaptarse para escrutinio rápido de las genotecas de genes generadas por las mutagénesis combinatoria de homólogos de CCSRP. Las técnicas utilizadas más generalmente, que son susceptibles de análisis de alta capacidad, para escrutinio de grandes genotecas de genes incluyen típicamente la clonación de la genoteca de genes en vectores de expresión replicables, transformación de células apropiadas con la genoteca de vectores resultante, y expresión de los genes combinatorios en condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se ha detectado. La mutagénesis recurrente de conjunto (REM), una nueva técnica que mejora la frecuencia de mutantes funcionales en las genotecas, puede utilizarse en combinación con los ensayos de escrutinio para identificar homólogos de CCSRP (Arkin y Yourvan, 1992 PNAS 89: 7811-7815; Delgrave et al. 1993 PROTEÍNA Engineering 6 (3): 327-331). En otra realización, pueden exportarse los ensayos basados en células para analizar una genoteca diversificada de CCSRP, utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Puede proporcionarse un método de identificación de una nueva CCSRP, que comprende (a) generar una respuesta específica de anticuerpos a una CCSRP, o un fragmento de la misma, como se ha descrito arriba; (b) escrutar un material de CCSRP supuesto con el anticuerpo, en donde la fijación específica del anticuerpo al material indica la presencia de una CCSRP potencialmente nueva; y (c) analizar el material fijado en comparación con CCSRP conocidas, para determinar su novedad.

Para determinar el porcentaje de homología de dos secuencias de aminoácidos (v.g., la secuencia de SEQ ID NO:7 y una forma mutante de la misma), las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima (v.g., pueden introducirse lagunas en la secuencia de una proteína o ácido nucleico para alineación óptima con la otra proteína o el otro ácido nucleico. Se comparan luego los residuos de aminoácidos en posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en una secuencia (v.g., la secuencia de SEQ ID NO:7), está ocupada por el mismo residuo de aminoácido que la posición correspondiente en la otra secuencia (v.g., una forma mutante de la secuencia del polipéptido de SEQ ID NO:7), entonces las moléculas son homólogas en dicha posición (es decir, tal como se utiliza en esta memoria, "homología" de aminoácido o ácido nucleido es equivalente a "identidad" de aminoácido o ácido nucleico''). El mismo tipo de comparación puede hacerse entre dos secuencias de ácido nucleico.

El porcentaje de homología entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % homología = números de posiciones idénticas/números totales de posiciones x 100). Las secuencias de aminoácidos incluidas en la presente invención son al menos 80-90%, 90-95%, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más homólogas a una secuencia entera de aminoácidos representada en SEQ ID NO:7. En otra realización adicional, al menos 80-90%, 90-95%, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más homólogas a una secuencia entera de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO:4.

En otra realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 80-90%, o 90-95%, y de modo todavía más preferible al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a una secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:4. La longitud de comparación de las secuencias para ácidos nucleicos es la región codificante entera del ácido nucleico.

Es también preferible que la molécula de ácido nucleico homóloga codifique una proteína o porción de la misma que incluye una secuencia de aminoácidos que es suficientemente homóloga a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 de tal modo que la proteína o porción de la misma mantiene la misma función, o una similar que la secuencia de aminoácidos con la que se compara. Funciones de las secuencias de aminoácidos de CCSRP incluyen la capacidad para participar en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o más particularmente, para participar en la transcripción de una proteína implicada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta de Physcomitrella patens. Ejemplos de tales actividades se describen en la Tabla 1.

Además de los métodos arriba descritos, puede realizarse una determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido y no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877). Un algoritmo de este tipo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al. (1990 J. Mol. Biol. 215: 403-410).

Las búsquedas de ácidos nucleicos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, registro = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de ácido nucleico homólogas a las moléculas de ácido nucleico de CCSRP de la invención. Adicionalmente, las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, registro = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las CCSRPs de la presente invención. Para obtener alineaciones que incluyen lagunas para propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden utilizarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (v.g., XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS 1989). Dicho algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) que forma parte del paquete de soporte lógico de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, pueden utilizarse una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad por longitud de laguna de 12 y una penalidad por laguna de 4 a fin de obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las CCSRPs de la presente invención. Para obtener alineaciones que incluyen lagunas para fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden utilizarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (v.g., XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS 1989). Dicho algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) que forma parte del paquete de soporte lógico de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparación de secuencias de aminoácidos, pueden utilizarse una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad por longitud de laguna de 12 y una penalidad por laguna de 4.

Por último, puede determinarse también la homología entre secuencias de ácido nucleico utilizando métodos de hibridación conocidos por los expertos en la técnica. De acuerdo con ello, una molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida, v.g. se hibrida en condiciones severas, a la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:4, o una porción de la misma. De modo más particular, una molécula de ácido nucleico aislada tiene al menos 15 nucleótidos de longitud y se hibrida en condiciones severas a la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:4. En otras realizaciones, el ácido nucleico tiene al menos 30, 50, 100, 250 o más nucleótidos de longitud.

Como se utiliza en esta memoria, la expresión "se hibrida en condiciones severas" tiene por objeto describir condiciones para hibridación y lavado en las cuales secuencias de nucleótidos que tienen al menos una homología de 60% entre sí se mantienen típicamente hibridadas una a otra. Con preferencia, las condiciones son tales que las secuencias que son al menos aproximadamente 65%, de modo más preferible al menos aproximadamente 70%, y de modo todavía más preferible al menos aproximadamente 75% o más homólogas entre sí se mantienen típicamente hibridadas una a otra. Tales condiciones severas son conocidas por los expertos en la técnica y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, 6.3.1-6.3.6, John Wiley & Sons, N.Y. (1989). Un ejemplo no limitante preferido de condiciones severas de hibridación son hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguida por uno o más lavados en 0,2 X SSC, 0,1% SDS a 50-65ºC. Con preferencia, una molécula de ácido nucleico aislada que se hibrida en condiciones severas a una secuencia de SEQ ID NO:4 corresponde a una molécula de ácido nucleico existente naturalmente. Como se utiliza en esta memoria, una molécula de ácido nucleico "existente naturalmente" hace referencia a una molécula de RNA o DNA que tiene una secuencia de nucleótidos que existe en la naturaleza (v.g., codifica una proteína natural). En una realización, el ácido nucleico codifica una CCSRP de Physcomitrella patens existente naturalmente.

Utilizando los métodos arriba descritos, y otros conocidos por los expertos en la técnica, una persona con experiencia ordinaria en la técnica puede aislar homólogos de la CCSRP que comprenden la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:7. Un subgrupo de estos homólogos son variantes alélicas. Como se utiliza en esta memoria, el término "variante alélica" hace referencia a una secuencia de nucleótidos que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de una CCSRP y que existen dentro de una población natural (v.g., una especie o variedad de planta). Tales variaciones alélicas naturales pueden dar típicamente como resultado una varianza de 1-5% en un ácido nucleico de CCSRP. Las variantes alélicas pueden identificarse por secuenciación de la secuencia de ácido nucleico de interés en cierto número de plantas diferentes, lo que puede realizarse fácilmente utilizando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético de CCSRP en dichas plantas.

Pueden contemplarse además moléculas de ácido nucleico que codifican CCSRPs de la misma u otra especie tales como análogos, ortólogos y parálogos de CCSRP. Como se utiliza en esta memoria, el término "análogos" hace referencia a dos ácidos nucleicos que tienen la misma o similar función, pero que han evolucionado por separado en organismos no afines. Como se utiliza en esta memoria, el término "ortólogos" hace referencia a dos ácidos nucleicos de especies diferentes, pero que han evolucionado a partir de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican proteínas que tienen la misma o similares funciones. Como se utiliza también en esta memoria, el término "parálogos" hace referencia a dos ácidos nucleicos que están relacionados por duplicación en un mismo genoma. Los parálogos tienen usualmente funciones diferentes, pero estas funciones pueden ser afines (Tatusov, R.L. et al. 1997 Science 278 (5338): 631-637). Análogos, ortólogos y parálogos de una CCSRP existente naturalmente pueden diferir de la CCSRP existente naturalmente por modificaciones posteriores a la traducción, por diferencias en la secuencia de aminoácidos, o por ambas cosas. Modificaciones posteriores a la traducción incluyen derivatización química de polipéptidos in vivo e in vitro, v.g. acetilación, carboxilación, fosforilación, o glicosilación, y tales modificaciones pueden ocurrir durante la síntesis o el procesamiento de los polipéptidos o después del tratamiento con enzimas modificantes aisladas. En particular, los ortólogos exhibirán al menos 80-85%, más preferiblemente 90%, y de modo muy preferible 95%, 96%, 97%, 98% o incluso 99% de identidad u homología con la totalidad o una parte de una secuencia de aminoácidos de CCSRP existente naturalmente y exhibirán una función similar a una CCSRP. Los ortólogos son también preferiblemente capaces de participar en la respuesta al estrés en las plantas. En una realización, los ortólogos de CCSRP mantienen la capacidad para participar en el metabolismo de los compuestos necesarios para la construcción de membranas celulares en Physcomitrella patens, o en el transporte de moléculas a través de estas membranas.

Además de las variantes existentes naturalmente de una secuencia de CCSRP que pueden existir en la población, el experto en la técnica apreciará adicionalmente que pueden introducirse cambios por mutación en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6, conduciendo con ello a cambios en la secuencia de aminoácidos de la CCSRP codificada, sin alterar la capacidad funcional de la CCSRP. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" en una secuencia de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede estar alterado respecto de la secuencia de tipo salvaje de una de las CCSRPs sin alterar la actividad de dicha CCSRP, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" es necesario para la actividad de la CCSRP. Sin embargo, otros residuos de aminoácidos (v.g., aquéllos que no están conservados o están sólo semi-conservados en el dominio que tiene actividad de CCSRP) pueden no ser esenciales para la actividad y por consiguiente son probablemente susceptibles de alteración sin que se altere la actividad de la CCSRP.

De acuerdo con ello, otra realización se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican CCSRPs que contienen cambios en los residuos de aminoácidos que no son esenciales para actividad de CCSRP. Tales CCSRPs difieren en secuencia de aminoácidos de una secuencia contenida en SEQ ID NO:7, pero retienen al menos una de las actividades de CCSRP descritas en esta memoria. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, en donde la proteína comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos homóloga aproximadamente en un 80% a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:7, aún más preferiblemente al menos 80-90%, o 90-95% homóloga a la secuencia SEQ ID NO:7, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, o 99% homóloga a la secuencia de SEQ ID NO:7. Los homólogos de CCSRP preferidos de la presente invención son preferiblemente capaces de participar en la respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o más particularmente participar en la transcripción de una proteína implicada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta de Physcomitrella patens, o tienen una o más actividades indicadas en la Tabla 1.

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un homólogo de CCSRP a una secuencia de proteína de SEQ ID NO:7 puede crearse por introducción de una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:4, de tal modo que se introduzcan una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteína codificada. Pueden introducirse mutaciones en la secuencia de SEQ ID NO:4 por técnicas estándar, tales como mutagénesis orientada y mutagénesis mediada por PCR. Con preferencia, se hacen sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la que el residuo de aminoácido está reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar.

Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (v.g., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (v.g., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (v.g., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales apolares (v.g., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en posición beta (v.g., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (v.g., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, un residuo de aminoácido no esencial predicho en una CCSRP se reemplaza preferiblemente con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Alternativamente, en otra realización, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de la totalidad o parte de una secuencia codificante de CCSRP, por ejemplo por mutagénesis de saturación, y los mutantes que resultan pueden investigarse respecto a una actividad de CCSRP descrita en esta memoria para identificar mutantes que retienen actividad de CCSRP. Después de la mutagénesis de la secuencia SEQ ID NO:4, la proteína codificada puede expresarse recombinantemente y la actividad de la proteína puede determinarse por análisis de la tolerancia al estrés de una planta que expresa la proteína como se describe en el Ejemplo 7.

Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican la CCSRP arriba descrita, otra realización se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que son antisentido respecto a aquéllas. Un ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico "sentido" que codifica una proteína, v.g., complementaria a la cadena codificante de una molécula de cDNA bicatenario o complementaria a una secuencia de mRNA. De acuerdo con ello, un ácido nucleico antisentido puede estar unido por enlaces hidrógeno a un ácido nucleico sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una cadena codificante de CCSRP entera, o sólo a una porción de la misma. En una realización, una molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido para una "región codificante" de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica una CCSRP. El término "región codificante" hace referencia a la región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en residuos de aminoácidos (v.g., la región codificante entera de ,,,,, comprende los nucleótidos 1 a ....). En otra realización, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido para una "región no codificante" de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica una CCSRP. El término "región no codificante" se refiere a secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificante que no se traducen en aminoácidos (es decir, a las que se hace referencia también como regiones 5' y 3' no traducidas).

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de una de las secuencias de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:4 o una porción de la misma. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:4 es una que es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:4, de tal modo que puede hibridarse a la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:4, formando con ello un dúplex estable.

Dadas las secuencias de las cadenas codificantes que codifican las CCSRPs descritas en esta memoria (v.g., la secuencia expuesta en SEQ ID NO:4, los ácidos nucleicos antisentido pueden diseñarse de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases de Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria para la región codificante entera de mRNA de CCSRP, pero de modo más preferible es un oligonucleótido que es antisentido sólo para una porción de la región codificante o no codificante de mRNA de CCSRP. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que rodea el sitio de comienzo de la traducción de mRNA de CCSRP. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos.

Un ácido nucleico antisentido puede construirse utilizando reacciones de síntesis química y ligación enzimática que emplean procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (v.g., un oligonucleótido antisentido) puede sintetizarse químicamente utilizando nucleótidos existentes naturalmente o nucleótidos modificados de diversos modos diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y sentido, v.g., pueden utilizarse derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que pueden utilizarse para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)-uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetil-aminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosil-queosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metil-guanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metil-adenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metil-citosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilamino-metiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxi-uracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, uracil-5-oxiacetato de metilo, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)-uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, el ácido nucleico antisentido puede producirse biológicamente utilizando un vector de expresión en el cual un ácido nucleico se ha subclonado en una orientación antisentido (es decir, el RNA transcrito a partir del ácido nucleico insertado será de orientación antisentido para un ácido nucleico diana de interés, descrito adicionalmente en la subsección siguiente).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido se administran típicamente a una célula o se generan in situ de tal modo que las mismas se hibridan con o se fijan a mRNA y/o DNA genómico celular codificante de una CCSRP para inhibir con ello la expresión de la proteína. v.g., por inhibición de la transcripción y/o la traducción. La hibridación puede realizarse por complementariedad convencional de nucleótidos a fin de formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se fija a los dúplex de DNA, por interacciones específicas en la hendidura mayor de la doble hélice. La molécula antisentido puede modificarse de tal manera que se fije específicamente a un receptor o un antígeno expresado en una superficie celular seleccionada, v.g., por enlace de la molécula de ácido nucleico antisentido a un péptido o un anticuerpo que se fija a un receptor o antígeno de la superficie celular. La molécula de ácido nucleico antisentido puede suministrarse también a las células utilizando los vectores descritos en esta memoria. Para alcanzar concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, se prefieren constructos vectores en los cuales la molécula de ácido nucleico antisentido está puesta esencialmente bajo el control de un promotor fuerte procariota, viral, o eucariota (con inclusión de promotores vegetales).

En otra realización adicional, la molécula de ácido nucleico antisentido es una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica. Una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con RNA complementario en los cuales, contrariamente a las unidades \beta usuales, las cadenas corren paralelas una a otra (Gaultier et al. 1987, Nucleic Acids Res. 15: 6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido puede comprender también un 2'-o-metil-ribonucleótido (Inoue et al. 1987, Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo quimérico RNA-DNA (Inoue et al. 1987 FEBS Lett, 215: 327-330).

En otra realización adicional, un ácido nucleico antisentido de la invención es una ribozima. Las ribozimas son moléculas catalíticas de RNA con actividad de ribonucleasa que son capaces de escindir un ácido nucleico monocatenario, tal como un mRNA, para el cual tienen una región complementaria. Así, las ribozimas (v.g., las ribozimas de cabeza de martillo descritas en Haselhoff y Gerlach, 1988, Nature 334: 585-591) pueden utilizarse para escindir catalíticamente transcritos de mRNA de CCSRP a fin de inhibir con ello la traducción de mRNA de CCSRP. Una ribozima que tiene especificidad para un ácido nucleico codificante de CCSRP puede diseñarse sobre la base de la secuencia de nucleótidos de un cDNA de CCSRP, como se describe en esta memoria (es decir, SEQ ID NO:4),

o sobre la base de una secuencia heteróloga que puede aislarse de acuerdo con métodos expuestos en esta invención. Por ejemplo, puede construirse un derivado de un RNA IVS L-19 de Tetrahymena, en el cual la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos a escindir en un mRNA codificante de CCSRP. Véase, v.g., Cech et al. Patente U.S. No. 4.987.071 y Cech et al. Patente U.S. No. 5.116.742. Alternativamente, puede utilizarse mRNA de CCSRP para seleccionar un RNA catalítico que tiene una actividad específica de ribonucleasa a partir de una agrupación de moléculas de RNA. Véase, v.g., Bartel, D. y Szostak, J.W., 1993, Science 261: 1411-1418.

Alternativamente, la expresión de genes de CCSRP puede inhibirse por direccionamiento de secuencias de nucleótidos complementarias a la región reguladora de una secuencia de nucleótidos de KPSRP (v.g., un promotor y/o intensificador de CCSRP) para formar estructuras de triple hélice que impiden la transcripción de un gen de CCSRP en células diana. Véase generalmente, Helene, C., 1991 Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. et al. 1992 Ann N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher, L.J., 1992; Bioassays 14(12):807-15.

Además de los ácidos nucleicos y proteínas CCSRP arriba descritos, estos ácidos nucleicos y proteínas pueden estar fijados a un resto. Estos restos incluyen, pero sin carácter limitante, restos de detección, restos de hibridación, restos de purificación, restos de suministro, restos de reacción, restos de fijación, etcétera. Un grupo típico de ácidos nucleicos unidos a un resto son sondas e iniciadores. Las sondas y los iniciadores comprenden típicamente un oligonucleótido sustancialmente aislado. El oligonucleótido comprende típicamente una región de secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones severas a al menos aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 25, de modo más preferible aproximadamente 40, 50 ó 75 nucleótidos consecutivos de una cadena sentido de la secuencia expuesta en SEQ ID NO:4, una secuencia antisentido de la secuencia expuesta en SEQ ID NO:4, o mutantes de la misma existentes naturalmente. Iniciadores basados en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:4 pueden utilizarse en reacciones PCR para clonar homólogos de CCSRP. Sondas basadas en las secuencias de nucleótidos CCSRP pueden utilizarse para detectar transcritos o secuencias genómicas que codifican la misma proteína o proteínas homólogas. En realizaciones preferidas, la sonda comprende adicionalmente un grupo marcador unido a ella, v.g. el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. Tales sondas pueden utilizarse como parte de un kit de ensayo de marcadores genómicos para identificar células que expresan una CCSRP, por ejemplo midiendo el nivel de un ácido nucleico codificante de CCSRP, en una muestra de células, v.g., por detección de niveles de mRNA de CCSRP o determinación de si un gen de CCSRP genómico se ha mutado o ha sido delecionado.

En particular, un método útil para averiguar el nivel de transcripción del gen (un indicador de la cantidad de mRNA disponible para traducción al producto génico) consiste en realizar una transferencia Northern (para referencia, véase, por ejemplo, Ausubel et al. 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley; Nueva York). Esta información demuestra al menos parcialmente el modo de transcripción del gen transformado. El RNA celular total puede prepararse a partir de células, tejidos u órganos por varios métodos, todos ellos bien conocidos en la técnica, tales como el descrito en Bormann, E.R. et al. 1992 Mol. Microbiol. 6:317-326. Para evaluar la presencia o cantidad relativa de proteína traducida a partir de este mRNA, pueden emplearse técnicas estándar, tales como una transferencia Western. Estos métodos son bien conocidos por una persona con experiencia ordinaria en la técnica. (Véase, por ejemplo, Ausubel et al. 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley; Nueva York).

La invención proporciona adicionalmente un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico de CCSRP como se ha descrito arriba, en donde la expresión del vector en una célula hospedadora da como resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora. Como se utiliza en esta memoria, el término "vector" hace referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que hace referencia a un bucle circular de DNA bicatenario en donde pueden ligarse segmentos de DNA adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde pueden ligarse segmentos de DNA adicionales al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la que se han introducido (v.g. vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (v.g., vectores de mamífero no episómicos) se integran en el genoma de una célula hospedadora después de introducción en la célula hospedadora, y por consiguiente se replican junto con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que se han enlazado operativamente. A dichos vectores se hace referencia en esta memoria como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de DNA recombinante se encuentran a menudo en la forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse intercambiablemente dado que el plásmido es la forma de vector utilizada más comúnmente. No obstante, la invención tiene por objeto incluir dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (v.g., retrovirus deficientes en replicación, adenovirus y virus adeno-asociados), que desempeñan funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células hospedadoras a utilizar para la expresión, lo cual está enlazado operativamente a la secuencia de ácido nucleico a expresar. En un vector de expresión recombinante, debe entenderse que "enlazado operativamente" significa que la secuencia nucleotídica de interés está enlazada a la o las secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión de la secuencia nucleotídica (v.g., en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora). El término "secuencia reguladora" tiene por objeto incluir promotores, intensificadores y otros elementos de control de la expresión (v.g., señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) o véase: Gruber and Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, compiladores Glick y Thompson, capítulo 7, 89-108, CRC Press, Boca Raton, Florida, con inclusión de las referencias citadas en dicho lugar. Secuencias reguladoras incluyen aquéllas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia nucleotídica en muchos tipos de células hospedadoras y aquéllas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos únicamente en ciertas células hospedadoras o en ciertas condiciones. Será apreciado por los expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células hospedadoras para producir con ello proteínas o péptidos, con inclusión de proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describen en esta memoria (v.g., CCSRPs, formas mutantes de CCSRPs, proteínas de fusión, etc.).

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden diseñarse para expresión de CCSRPs en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, pueden expresarse genes de CCSRP en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insecto (utilizando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura y otras células fúngicas (véase Romanos, M.A. et al. 1992 Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8:423-488; van den Hondel C.A.M.J.J. et al. 1991 Heterologous gene expression in filamentous fungi, en: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet, & L.L. Lasure, compiladores, p. 396-428; Academic Press: San Diego; y van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J., 1991, Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al. compiladores, p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatore et al. 1999 Marine Biotechnology 1(3): 239-251), ciliados de los tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella, y Stylonychia, especialmente del género Stylonychia lemnae, con vectores siguiendo un método de transformación como el descrito en la Solicitud WO 98/01572 y células de plantas multicelulares (véase Schmidt, R. and Willmitzer, L., 1988 High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants, Plant Cell Rep. 583-586); Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, chapter 6/7, S. 71-119 (1993); F.F. White, B.Jenes et al. Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. Kung und R. Wu, 128-43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42:205-225 y las referencias citadas en dichos lugares) o células de mamífero. Células hospedadoras adecuadas se describen más detalladamente en Goeddel, Gene Expresión Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, Ca (1990). Alternativa-mente, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo utilizando secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa T7.

La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo en la mayoría de los casos con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o que no son proteínas de fusión. Los vectores de fusión añaden cierto número de aminoácidos a una proteína codificada en ellos, usualmente al término amino de la proteína recombinante, pero también al término C o se fusionan en regiones adecuadas en las proteínas. Tales vectores de fusión sirven típicamente para tres propósitos: 1) aumentar la expresión de una proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de una proteína recombinante; y 3) facilitar la purificación de una proteína recombinante por actuar como un ligando en la purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión subsiguientemente a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen Factor Xa, trombina y enteroquinasa.

Vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc.; Smith, D.B. y Johnson, K.S., 1988 Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia Piscataway, NJ) que fusionan glutatión-S-transferasa (GST), la proteína E de fijación de maltosa, o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana. En una realización, la secuencia codificante de la CCSRP se clona a un vector de expresión pGEX para crear un vector que codifica una proteína de fusión que comprende, desde el término N al término C, GST-sitio de escisión de trombina-proteína X. La proteína de fusión puede purificarse por cromatografía de afinidad utilizando resina glutatión-agarosa. La CCSRP recombinante no fusionada a GST puede recuperarse por escisión de la proteína de fusión con trombina.

Ejemplos de vectores de expresión de E. coli inducibles y adecuados que no son de fusión incluyen pTrc (Amann et al. 1988 Gene 69:301-315) y pET 11d (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California, (1990) 60-89). La expresión de genes diana a partir del vector pTrc está basada en la transcripción de RNA-polimerasa del hospedador por un promotor de fusión híbrido trp-lac. La expresión del gen diana a partir del vector pET-11d está basada en la transcripción de un promotor de fusión T7 gn10-lac mediada por una RNA-polimerasa viral co-expresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral es suministrada por las células hospedadoras BL21(DE3) o HMS174 (DE3) a partir de un profago \lambda residente que aloja un gen de T7 gn1 bajo el control de transcripción del promotor lacUV5.

Una estrategia para maximizar la expresión de proteínas recombinantes consiste en expresar la proteína en una bacteria hospedadora con una capacidad deteriorada para escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Otra estrategia consiste en alterar la secuencia del ácido nucleico a insertar en un vector de expresión de tal modo que los codones individuales para cada aminoácido son los utilizados preferentemente en la bacteria seleccionada para expresión, tales como C. glutamicum (Wada et al. 1992 Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Dicha alteración de las secuencias de ácido nucleico de la invención puede llevarse a cabo por técnicas estándar de síntesis de DNA.

En otra realización, el vector de expresión de CCSRP es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari, et al. 1977 EMBO J. 6:229-234, pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982 Cell 30:939-943), pJRY88 (Schultz et al. 1987 Gene 54:113-123), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vectores y métodos para la construcción de vectores apropiados para uso en otros hongos, tales como los hongos filamentosos, incluyen los detallados en: van den Hondel C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991): Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy et al. compiladores., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.

Alternativamente, las CCSRPs de la invención pueden expresarse en células de insecto utilizando vectores de expresión de baculovirus. Vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (v.g., células Sf9) incluyen la serie pAc (Smith et al. 1983 Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers, 1989 Virology 170: 31-39).

En otra realización adicional, un ácido nucleico de CCSRP de la invención se expresa en células de mamífero utilizando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pPCDM8 (Seed, B., 1987 Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al. 1987 EMBO J. 6:187-195). Cuando se utilizan en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión son desempeñadas a menudo por elementos reguladores virales. Por ejemplo, promotores utilizados comúnmente se derivan de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y el Virus 40 de los Simios. Para otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procariotas como eucariotas, véanse los capítulos 16 y 17 de Sambrook J., Fritsch E.F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

En otra realización, el vector de expresión recombinante de mamífero es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (v.g., se utilizan elementos reguladores específicos de tejidos para expresar el ácido nucleico). Elementos reguladores específicos de tejidos se conocen en la técnica. Ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejidos adecuados incluyen el promotor albúmina (específico del hígado; Pinkert et al. 1987 Genes Dev. 1:268-287), promotores específicos de linfoides (Calame y Eaton, 1988 Adv. Immunol. 43:235-275), en particular promotores de receptores de las células T (Winoto y Baltimore, 1989 EMBO J. 8:729-733 e inmunoglobulinas (Banerji et al. 1983 Cell 33:729-740; Queen and Baltimore, 1983 Cell 33:741-748), promotores específicos de neuronas (v.g., el productor de neurofilamentos; Byrne and Ruddle, 1989 PNAS 86:5473-5477), promotores específicos de páncreas (Edlund et al. 1985 Science 230:912-916), y promotores específicos de glándula mamaria (v.g. promotor de lactosuero; patente U.S. No. 4.873.316 y Publicación de Solicitud de Patente Europea No. 264.166). Están comprendidos también promotores regulados evolutivamente, por ejemplo, los promotores hox murinos (Kessel and Gruss, 1990 Science 249:374-379) y el promotor fetoproteína (Campes y Tilghman, 1989 Genes Dev. 3:537-546).

En otra realización, las CCSRPs de la invención pueden expresarse en células de plantas unicelulares (tales como algas) (véase Falciatore et al. 1999 Marine Biotechnology 1 (3):239-251 y las referencias citadas en dicho lugar) y células vegetales procedentes de plantas superiores (v.g., las espermatofitas, tales como plantas de cosecha). Ejemplos de vectores de expresión en plantas incluyen los detallados en: Becker, D., Kemper E., Schell, J. y Masterson, R., 1992 New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; y Bevan, M.W., 1984 Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, compiladores: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993; p. 15-38.

Una casete de expresión en plantas contiene preferiblemente secuencias reguladoras capaces de impulsar la expresión génica en células vegetales y enlazadas operativamente de tal modo que cada secuencia puede desempeñar su función, por ejemplo, terminación de la transcripción por señales de poliadenilación. Señales de poliadenilación preferidas son las procedentes de t-DNA de Agrobacterium tumefaciens tales como el gen 3 conocido como octopina-sintasa del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen et al. 1984 EMBO J. 3:835) o equivalentes funcionales del mismo, pero también son adecuados otros terminadores funcionalmente activos en plantas.

Dado que la expresión de genes vegetales no se limita en muchos casos a niveles de transcripción, una casete de expresión en plantas contiene preferiblemente otras secuencias enlazadas operativamente como mejoradores de la traducción tales como la secuencia superimpulsora ("overdrive") que contiene la secuencia conductora 5' no traducida del virus del mosaico del tabaco, que mejora la relación de proteína a RNA (Gallie et al. 1987 Nucl. Acids Research 15:8693-8711).

La expresión de genes de plantas tiene que estar enlazada operativamente a un promotor apropiado que confiere la expresión génica de una manera oportuna, específica de la célula o del tejido. Se prefieren promotores que impulsan expresión constitutiva (Benfey et al. 1989 EMBO J. 8:2195-2202) como los derivados de virus de plantas tales como el CAMV 35S (Franck et al. 1980 Cell 21:285-294), el CaMV 19S (véase también la patente U.S. No. 5352605 y la solicitud PCT No. WO 8402913) o promotores de plantas tales como los de la subunidad pequeña de Rubisco descrita en la patente U.S. No. 4962028.

Otras secuencias preferidas para uso en casetes de expresión de genes vegetales son secuencias de direccionamiento necesarias para dirigir el producto génico en su compartimiento celular apropiado (para revisión, véase Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 15 (4):285-423 y las referencias citadas en dicho lugar) tales como la vacuola, el núcleo, todos los tipos de plástidos tales como amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, el espacio extracelular, la mitocondria, el retículo endoplasmático, cuerpos de aceite, peroxisomas y otros compartimientos de las células vegetales.

La expresión de genes vegetales puede ser facilitada también por la vía de un promotor inducible (para revisión véase Gatz, 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108). Promotores químicamente inducibles son especialmente adecuados si se quiere que la expresión génica ocurra de una manera específica del tiempo. Ejemplos de tales promotores son un promotor inducible por ácido salicílico (Solicitud PCT No. WO 95/19443), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz et al. 1992 Plant J. 2:397-404) y un promotor inducible por etanol (solicitud PCT No. WO 93/21334).

Asimismo, promotores adecuados que responden a condiciones de estrés bióticos o abióticos son aquéllos tales como el promotor del gen PRP1 inducible por patógenos (Ward et al. 1993 Plant Mol. Biol. 22:361-366), el promotor hsp80 del tomate inducible por calor (patente U.S. No. 5187267), el promotor de \alpha-amilasa de la patata inducible por frío (solicitud PCT No. WO 96/12814) o el promotor pinII inducible por lesiones (patente europea No. 375091). Para otros ejemplos de promotores inducibles por sequía, frío y sal, tales como el promotor RD29A, véase Yamaguchi-Shinozalei et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 236:331-340).

Se prefieren especialmente aquellos promotores que confieren expresión génica en tejidos y órganos específicos, tales como células de guarda y las células de los pelos radiculares. Promotores adecuados incluyen el promotor del gen napin de la colza (patente U.S. No. 5.608.152), el promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al. 1991 Mol. Gen. Genet. 225 (3):459-67), el promotor oleosina de Arabidopsis (solicitud PCT No. WO 98/45461), el promotor faseolina de Phaseolus vulgaris (patente U.S. No. 5.504.200), el promotor Bce4 de Brassica (solicitud PCT No. WO 91/13980) o el promotor B4 de legumina (LeB4; Baeumlein et al. 1992 Plant Journal, 2 (2):233-9) así como promotores que confieren expresión específica de semillas en plantas monocotiledóneas como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etcétera. Promotores adecuados dignos de mención son el promotor del gen lpt2 o lpt1 de la cebada (solicitud PCT No. WO 95/15389 y solicitud PCT No. WO 95/23230) o los descritos en la solicitud PCT No. WO 99/16890 (promotores del gen hordeína de la cebada, el gen glutelina del arroz, el gen orizina del arroz, el gen prolamina del arroz, el gen gliadina del trigo, el gen glutelina del trigo, el gen zeína del maíz, el gel glutelina de la avena, el gen kasirina del sorgo y el gen secalina del centeno).

Son también especialmente adecuados promotores que confieren expresión génica específica de plástidos, dado que los plástidos son el compartimiento en el que tiene lugar la biosíntesis de los lípidos. Promotores adecuados son el promotor de RNA-polimerasa viral descrito en la solicitud PCT No. WO 95/16783 y la solicitud PCT No. WO 97/06250, y el promotor clpP de Arabidopsis descrito en la solicitud PCT No. WO 99/46394.

Una realización adicional es un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de DNA de CCSRP de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Es decir, la molécula de DNA está enlazada operativamente a una secuencia reguladora de una manera que permite la expresión (por transcripción de la molécula de DNA) de una molécula de RNA que es antisentido para un mRNA de CCSRP. Pueden seleccionarse secuencias reguladoras enlazadas operativamente a una molécula de ácido nucleico clonada en la orientación antisentido, que dirigen la expresión continua de la molécula de RNA antisentido en una diversidad de tipos de células. Por ejemplo, pueden seleccionarse promotores y/o intensificadores virales, o secuencias reguladoras que dirigen la expresión constitutiva directa de RNA antisentido, específica de tejido o específica del tipo de célula. El vector de expresión antisentido puede encontrarse en la forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado en donde los ácidos nucleicos antisentido se producen bajo el control de una región reguladora de alta eficiencia. La actividad de la región reguladora puede estar determinada por el tipo de célula en el que se introduce el vector. Para una exposición de la regulación de la expresión génica utilizando genes antisentido véase Weintraub, H. et al. Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986 y Mol et al. 1990 FEBS Letters 268:427-430.

Otro aspecto de la invención se refiere a células hospedadoras en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula hospedadora" y "célula hospedadora recombinante" se utilizan en esta memoria de modo intercambiable. Debe entenderse que dichos términos se refieren no sólo a la célula particular de que se trata, sino que se aplican también a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Dado que pueden producirse ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula originaria, pero se incluye todavía dentro del alcance del término como se utiliza en esta memoria.

Una célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, una CCSRP puede expresarse en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insecto, células fúngicas, o células de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS), algas, ciliados, células de plantas, hongos u otros microorganismos como C. glutamicum. Otras células hospedadoras adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica.

El DNA vector puede introducirse en células procariotas o eucariotas por técnicas convencionales de transformación o transfección. Tal como se utiliza en esta memoria, los términos "transformación", "transfección", "conjugación" y "transducción" tienen por objeto hacer referencia a una diversidad de métodos reconocidos en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (v.g., DNA) en una célula hospedadora, con inclusión de co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, competencia natural, transferencia mediada por productos químicos y electroporación. Métodos adecuados para transformación o transfección de células hospedadoras que incluyen células vegetales pueden encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, vol. 44, Agrobacterium protocols, compiladores: Gartland y Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Dado que la tolerancia al estrés biótico y abiótico es un rasgo general que se desea sea heredado en una gran diversidad de plantas tales como maíz, trigo, centeno, avena, trigo híbrido, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, colza y canola, mandioca, pimiento, girasol y tagetes, plantas solanáceas tales como patata, tabaco, berenjena, y tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, plantas arbustivas (café, cacao, té), especies de Sálix, árboles (palma de aceite, cocotero), hierbas perennes y cosechas forrajeras, estas plantas de cosecha son también plantas diana preferidas para una ingeniería genética como una realización adicional de la presente invención.

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En particular, la invención proporciona un método de producción de una planta transgénica con un ácido nucleico codificante de CCSRP, en donde la expresión del o de los ácidos nucleicos en la planta da como resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta que comprende: (a) transformar una célula de la planta con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de CCSRP, y (b) generar a partir de la célula de la planta una planta transgénica con una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La invención proporciona también un método de incrementar la expresión de un gen de interés en una célula hospedadora en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora, en donde el gen de interés se transcribe en respuesta a una CCSRP, que comprende: (a) transformar la célula hospedadora con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de CCSRP, y (b) expresar la CCSRP en la célula hospedadora, aumentado con ello la expresión del gen transcrito en respuesta a la CCSRP, en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora.

Para dicha transformación de plantas, pueden utilizarse vectores binarios tales como pBinAR (Höfgen y Willmitzer, 1990 Plant Science 66:221-230). La construcción de los vectores binarios puede realizarse por ligación del cDNA en orientación sentido o antisentido en el T-DNA. En posición 5' respecto al cDNA, un promotor de planta activa la transcripción del cDNA. Una secuencia de poliadenilación está localizada en posición 3-prima respecto al cDNA. La expresión específica de tejidos puede conseguirse utilizando un promotor específico de tejido. Por ejemplo, la expresión específica de semilla puede conseguirse por clonación del promotor napin o LeB4 o USP en posición 5' respecto al cDNA. Asimismo, puede utilizarse cualquier otro elemento promotor específico de semilla. Para expresión constitutiva en la planta entera, puede utilizarse el promotor CaMV 35S. La proteína expresada puede ser direccionada a un compartimiento celular utilizando un péptido señal, por ejemplo para plástidos, la mitocondria o el retículo endoplasmático (Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 4(15):285-423). El péptido señal se clona en posición 5' en marco al cDNA para archivar la localización subcelular de la proteína de fusión. Adicionalmente, pueden utilizarse promotores que son sensibles a estados de estrés abiótica tales como el promotor RD29A de Arabidopsis, con las secuencias de ácido nucleico descritas en esta memoria. Un experto en la técnica reconocerá que el promotor utilizado debería estar enlazado operativamente al ácido nucleico de tal modo que el promotor cause la transcripción del ácido nucleico, lo que da como resultado la síntesis de un mRNA que codifica un polipéptido. Alternativamente, el RNA puede ser un RNA antisentido para uso a fines de influir en la expresión subsiguiente del mismo u otro gen o genes.

Métodos alternativos de transfección incluyen la transferencia directa de DNA a flores en desarrollo por electroporación o transferencia de genes mediada por Agrobacterium. La transfección de plantas mediada por Agrobacterium puede realizarse utilizando por ejemplo la cepa GV3101 (pMP90) (Koncz y Schell, 1986 Mol. Gen Genet. 204:383-396) o LBA4404 (Clontech) de Agrobacterium tumefaciens. La transformación puede realizarse por técnicas estándar de transformación y regeneración (Deblaere et al. 1994 Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788; Gelvin, Stanton B. y Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2ª edición, - Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. - in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993, 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Por ejemplo, la colza puede transformarse por la vía de transformación de los cotiledones o del hipocótilo (Moloney et al. 1989 Plant Cell Report 8:238-242; De Block et al. 1989 Plant Physiol. 91:694-701). El uso de antibióticos para la selección de Agrobacterium y de plantas depende del vector binario y de la cepa de Agrobacterium utilizados para la transformación. La selección de la colza se realiza normalmente utilizando kanamicina como marcador de plantas seleccionable. La transferencia de genes mediada por Agrobacterium al lino puede realizarse utilizando, por ejemplo, una técnica descrita por Mlynarova et al. 1994 Plant Cell Report 13:282-285. Adicionalmente, la transformación de la soja puede realizarse utilizando por ejemplo una técnica descrita en la Patente Europea No. 0424047, la patente U.S. No. 5.322.783, la Patente Europea No. 0397687, la patente U.S. No. 5.376.543 o la patente U.S. No. 5.169.770. La transformación del maíz puede realizarse por bombardeo de partículas, absorción de DNA mediada por polietilenglicol o por la vía de la técnica de fibras de carburo de silicio. (Véase, por ejemplo, Freeling y Walbot "The Maize Handbook" Springer Verlag: Nueva York (1993), ISBN 3-540-97826-7). Un ejemplo específico de transformación de maíz se encuentra en la patente U.S. No. 5.990.387 y un ejemplo específico de transformación de trigo puede encontrarse en la solicitud PCT No. WO 93/07256.

Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección utilizada, solamente una pequeña fracción de células puede integrar el DNA extraño en su genoma. Con objeto de identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce generalmente en las células hospedadoras un gen que codifica un marcador seleccionable (v.g., resistencia a antibióticos) junto con el gen de interés. Marcadores seleccionables preferidos incluyen aquéllos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato o en plantas que confieren resistencia frente a un herbicida tal como glifosato o glufosinato. Las moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador seleccionable pueden introducirse en una célula hospedadora en el mismo vector que el que codifica una CCSRP o pueden introducirse en un vector separado. Las células transfectadas de manera estable con la molécula de ácido nucleico introducida pueden identificarse mediante, por ejemplo, selección de fármacos (v.g., las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células mueren).

Para crear un microorganismo recombinante homólogo, se prepara un vector que contiene al menos una porción de un gen de CCSRP en el cual se ha introducido una deleción, adición o sustitución para alterar con ello, v.g., interrumpir funcionalmente, el gen CCSRP. Con preferencia, el gen CCSRP es un gen KPSRP de Physcomitrella patens, pero puede ser un homólogo de una planta afín o incluso de una fuente de mamífero, levadura, o insecto. En una realización preferida, el vector se diseña de tal modo que, después de la recombinación homóloga, el gen CCSRP endógeno queda interrumpido funcionalmente (es decir ya no codifica una proteína funcional; a lo que se hace referencia también como un vector fuera de combate ("knock-out")). Alternativamente, el vector puede diseñarse de tal manera que, después de recombinación homóloga, el gen CCSRP endógeno queda mutado o alterado de cualquier otro modo pero codifica todavía una proteína funcional (v.g., la región reguladora situada aguas arriba puede alterarse, alterando con ello la expresión de la CCSRP endógena). Para crear una mutación puntual por recombinación homóloga, pueden utilizarse híbridos DNA-RNA en una técnica conocida como quimeraplastia (Cole-Straus et al. 1999 Nucleic Acids Research 27(5): 1323-1330 y Kmiec, 1999, Gene therapy American Scientist. 87(3): 240-247). Los procedimientos de recombinación homóloga en Physcomitrella patens son también bien conocidos en la técnica y se contemplan para uso en esta invención.

En cuanto al vector de recombinación homóloga, la porción alterada del gen CCSRP está flanqueada en sus extremos 5' y 3' por una molécula de ácido nucleico adicional del gen CCSRP para permitir que ocurra recombinación homóloga entre el gen CCSRP exógeno transportado por el vector y un gen CCSRP endógeno, en un microorganismo o planta. La molécula de ácido nucleico de CCSRP flanqueante adicional tiene una longitud suficiente para recombinación homóloga con éxito con el gen endógeno. Típicamente, se incluyen en el vector varios centenares de pares de bases hasta kilobases de DNA flanqueante (en ambos extremos 5' y 3') (véase v.g., Thomas, K.R., y Capecchi, M.R., 1987 Cell 51: 503 para una descripción de vectores de recombinación homóloga o Strepp et al. 1998 PNAS, 95(8): 4368-4373 para recombinación basada en cDNA en Physcomitrella patens). El vector se introduce en un microorganismo o una célula de planta (v.g., por la vía de DNA mediado por polietilenglicol), y se seleccionan células en las cuales el gen CCSRP introducido se ha recombinado homólogamente con el gen CCSRP endógeno utilizando métodos conocidos en la técnica.

En otra realización, pueden producirse microorganis-mos recombinantes que contienen sistemas seleccionados que permiten la expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo, la inclusión de un gen de CCSRP en un vector que lo pone bajo control del operón lac permite la expresión del gen de CCSRP únicamente en presencia de IPTG. Tales sistemas reguladores son bien conocidos en la técnica.

Una célula hospedadora de la invención, tal como una célula hospedadora procariota o eucariota en cultivo, puede utilizarse para producir (es decir, expresar) una CCSRP. En una realización, el método comprende cultivar la célula hospedadora de la invención (en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica una CCSRP, o en cuyo genoma se ha introducido un gen que codifica una CCSRP de tipo salvaje o alterada) en un medio adecuado hasta que se produce la CCSRP. En otra realización, el método comprende adicionalmente aislar CCSRPs del medio o la célula hospedadora.

Otra realización se refiere a CCSRPs aisladas, y porciones biológicamente activas de las mismas. Una proteína "aislada" o "purificada" o porción biológicamente activa de la misma está exenta de algo del material celular cuando se produce por técnicas de DNA recombinante, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión "sustancialmente exenta de material celular" incluye preparaciones de CCSRP en las cuales la proteína está separada de una parte de los componentes celulares de las células en las cuales se produce la misma natural o recombinantemente. En una realización, la expresión "sustancialmente exenta de material celular" incluye preparaciones de una CCSRP que tienen menos de aproximadamente 30% (referido a peso seco) de material distinto de CCSRP (a lo que se hace referencia también en esta memoria como una "proteína contaminante"), de modo más preferible menos de aproximadamente 20% de material distinto de CCSRP, de modo todavía más preferible menos de aproximadamente 10% de material distinto de CCSRP, y de modo muy preferible menos de aproximadamente 5% de material distinto de CCSRP.

Cuando la CCSRP o la porción biológicamente activa de la misma se produce recombinantemente, la misma está de modo preferible sustancialmente exenta también de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, de modo más preferible menos de aproximadamente 10%, y de modo muy preferible menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de proteína. La expresión "sustancialmente exenta de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de CCSRP en las cuales la proteína está separada de precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. En una realización, la expresión "sustancialmente exenta de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de una CCSRP que tienen menos de aproximadamente 30% (referido a peso seco) de precursores químicos o productos químicos distintos de CCSRP, de modo más preferible menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o productos químicos distintos de CCSRP, de modo todavía más preferible menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o productos químicos distintos de CCSRP, y de modo muy preferible menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o productos químicos distintos de CCSRP. En realizaciones preferidas, las proteínas aisladas, o porciones biológicamente activas de las mismas, carecen de proteínas contaminantes del mismo organismo del que se deriva la CCSRP. Típicamente, tales proteínas se producen por expresión recombinante de, por ejemplo, una CCSRP de Physcomitrella patens en plantas distintas de Physcomitrella patens o microorganismos tales como C. glutamicum, ciliados, algas u hongos.

Las moléculas de ácido nucleico, proteínas, homólogos de proteínas, proteínas de fusión, iniciadores, vectores, y células hospedadoras descritas en esta memoria pueden utilizarse en uno o más de los métodos siguientes: identificación de Physcomitrella patens y organismos afines; mapeado de genomas de organismos afines a Physcomitrella patens; identificación y localización de secuencias de interés de Physcomitrella patens; estudios de evolución; determinación de regiones de CCSRP requeridas para función; modulación de la actividad de una CCSRP; modulación del metabolismo de una o más funciones celulares; modulación del transporte transmembranal de uno o más compuestos; y modulación de la resistencia al estrés.

El musgo Physcomitrella patens representa un miembro de los musgos. El mismo es afín a otros musgos tales como Ceratodon purpureus que es capaz de crecer en ausencia de luz. Musgos tales como Ceratodon y Physcomitrella comparten un alto grado de homología en la secuencia de DNA y el nivel de polipéptidos, lo que permite el uso de escrutinio heterólogo de moléculas de DNA con sondas procedentes de otros musgos u organismos, haciendo posible con ello la derivación de una secuencia de consenso adecuada para el escrutinio heterólogo o la anotación funcional y predicción de funciones génicas en terceras especies. La posibilidad de identificar tales funciones puede tener por tanto gran importancia, v.g., la predicción de la especificidad de sustrato de las enzimas. Adicionalmente, estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como puntos de referencia para el mapeado de genomas de musgos, o de genomas de organismos afines.

Las moléculas de ácido nucleico de CCSRP de la invención tienen una diversidad de usos. De modo muy importante, las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de la presente invención pueden utilizarse para transformar plantas, induciendo con ello tolerancia a estados de estrés tales como sequía, salinidad alta y frío. La presente invención proporciona por consiguiente una planta transgénica transformada por un ácido nucleico de CCSRP, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta da como resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La planta transgénica puede ser una monocotiledónea o una dicotiledónea. La invención estipula adicionalmente que la planta transgénica puede seleccionarse de maíz, trigo, centeno, avena, trigo híbrido, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, colza, canola, mandioca, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, café, cacao, té, especies de Sálix, palma de aceite, cocotero, hierbas perennes y cosechas forrajeras, por ejemplo.

La presente invención describe el uso de la expresión de CC-1 de Physcomitrella patens para transformar por bioingeniería plantas tolerantes a la sequía y/o tolerantes al frío. Dicha estrategia se ha demostrado en esta memoria para Arabidopsis thaliana, colza/canola, soja, maíz y trigo, pero su aplicación no está restringida a estas plantas. De acuerdo con ello, la invención proporciona una planta transgénica que contiene una CCSRP seleccionada de CC-1 (SEQ ID NO:7), en donde el estrés ambiental es sequía o temperatura baja.

La presente invención proporciona también métodos de modificación de la tolerancia al estrés de una planta que comprenden modificar la expresión de CC-1 en la planta. La invención estipula que este método puede realizarse de tal modo que la tolerancia al estrés se aumenta o se reduce.

Los métodos de aumento de la expresión de CCSRPs pueden utilizarse en los casos en que la planta es transgénica o no transgénica. En los casos en que la planta es transgénica, la planta puede transformarse con un vector que contiene cualquiera de los ácidos nucleicos codificantes de CCSRP descritos anteriormente, o bien puede transformarse la planta con un promotor que dirige la expresión de CCSRP nativa en la planta, por ejemplo. La invención estipula que dicho promotor puede ser específico de un tejido. Adicionalmente, dicho promotor puede estar regulado evolutivamente. De modo alternativo, las plantas no transgénicas pueden tener expresión de CCSRP nativa modificada por inducción de un promotor nativo.

La expresión de CC-1 (SEQ ID NO:7) en plantas diana puede realizarse por, pero sin carácter limitante, uno de los ejemplos siguientes: (a) promotor constitutivo, (b) promotor inducible por estrés, (c) promotor inducido por productos químicos, y (d) sobre-expresión de un promotor modificado por bioingeniería, por ejemplo con factores de transcripción derivados de dedos de cinc (Greisman y Pabo, 1997 Science 275: 657). El último caso implica la identificación de los homólogos de CC-1 (SEQ ID NO:7) en la planta diana así como de su promotor. Los factores de transcripción recombinantes que contienen dedos de cinc se modifican por bioingeniería para interaccionar específicamente con el homólogo de CC-1 (SEQ ID NO:7), activándose la transcripción del gen correspondiente.

Además de introducir las secuencias de ácido nucleico de CCSRP en plantas transgénicas, estas secuencias pueden utilizarse también para identificar un organismo como Physcomitrella patens o un pariente próximo del mismo. Asimismo, aquéllas pueden utilizarse para identificar la presencia de Physcomitrella patens o un pariente del mismo en una población mixta de microorganismos. Se proporcionan las secuencias de ácido nucleico de cierto número de genes de Physcomitrella patens. Por sondeo del DNA genómico extraído de un cultivo de una población singular o mixta de microorganismos en condiciones severas con una sonda que abarque una región de un gen de Physcomitrella patens que es exclusivo de este organismo, puede averiguarse si está presente dicho organismo.

Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico y de proteína de la invención pueden servir como marcadores para regiones específicas del genoma. Esto tiene utilidad no sólo en el mapeado del genoma, sino también en estudios funcionales de las proteínas de Physcomitrella patens. Por ejemplo, para identificar la región del genoma a la cual se fija una proteína particular de fijación de DNA de Physcomitrella patens, podría digerirse el genoma de Physcomitrella patens, e incubarse los fragmentos con la proteína de fijación de DNA. Aquellos fragmentos que fijan la proteína pueden sondarse adicionalmente con las moléculas de ácido nucleico de la invención, preferiblemente con marcadores fácilmente detectables. La fijación de una molécula de ácido nucleico de este tipo al fragmento del genoma permite la localización del fragmento al mapa genómico de Physcomitrella patens y, cuando se realiza múltiples veces con diferentes enzimas, facilita una determinación rápida de la secuencia de ácido nucleico a la que se fija la proteína. Además, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser suficientemente homólogas a las secuencias de especies afines, con lo que estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como marcadores para la construcción de un mapa genómico en musgos afines.

Las moléculas de ácido nucleico de CCSRP CC-1 de la invención son también útiles para estudios evolutivos y estructurales de proteínas. Los procesos metabólicos y de transporte en los cuales participan las moléculas de la invención son utilizados por una gran diversidad de células procariotas y eucariotas; por comparación de las secuencias de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención con aquéllas que codifican enzimas similares de otros organismos, puede estimarse la afinidad evolutiva de los organismos. Análogamente, una comparación de este tipo permite una estimación de cuáles son las regiones de la secuencia que se conservan y cuáles no lo son, lo que puede ayudar a la determinación de aquellas regiones de la proteína que son esenciales para el funcionamiento de la enzima. Este tipo de determinación es valioso para estudios de ingeniería de proteínas y puede proporcionar una indicación de lo que puede tolerar la proteína en términos de mutagénesis sin perder su función.

La manipulación de las moléculas de ácido nucleico de CCSRP de la invención puede dar como resultado la producción de CCSRPs que tienen diferencias funcionales de la CCSRP de tipo salvaje. Estas proteínas pueden estar mejoradas en eficiencia o actividad, pueden estar presentes en la célula en mayores números que lo que es usual, o pueden verse reducidas en eficiencia o actividad.

Existen varios mecanismos por los cuales la alteración de una CCSRP de la invención puede afectar directamente a la respuesta al estrés y/o la tolerancia al estrés. En el caso de plantas que expresan CCSRPs, el transporte incrementado puede conducir a un reparto mejorado de sal y/o soluto en los tejidos y órganos de la planta. Por aumento del número o la actividad de las moléculas transportadoras que exportan moléculas iónicas desde la célula, puede ser posible afectar a la tolerancia de la célula a la sal.

El efecto de la modificación genética en las plantas, C. glutamicum, hongos, algas, o ciliados sobre la tolerancia al estrés puede evaluarse por cultivo del microorganismo o planta modificado(a) en condiciones inadecuadas y analizar luego las características de crecimiento y/o metabolismo de la planta. Tales métodos de análisis son bien conocidos por un experto en la técnica, e incluyen peso seco, peso húmedo, síntesis de proteínas, síntesis de carbohidratos, síntesis de lípidos, tasas de evapotranspiración, rendimiento de la planta en general y/o de la cosecha, floración, reproducción, producción de semillas, crecimiento de raíces, tasas de respiración, tasas de fotosíntesis, etc. (Aplicaciones de HPLC en Bioquímica en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm et al. 1993 Biotechnology, vol. 3, capítulo III: Recuperación y purificación de productos, páginas 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al. 1988 Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. y Cabral, J.M.S., 1992 Recovey processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. y Henry, J.D., 1988 Biochemical Separations, en: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, capítulo 11, páginas 1-27, VCH: Weinheim; y Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).

Por ejemplo, vectores de expresión en levadura que comprenden los ácidos nucleicos descritos en esta memoria, o fragmentos de los mismos, pueden construirse y transformarse en Saccharomyces cerevisiae utilizando protocolos estándar. Las células transgénicas resultantes pueden ensayarse luego en cuanto a fallo o alteración de su tolerancia al estrés por sequía, sal y temperatura. Análogamente, vectores de expresión de plantas que comprenden los ácidos nucleicos descritos en esta memoria, o fragmentos de los mismos, pueden construirse y transformarse en una célula de planta apropiada tal como Arabidopsis, soja, colza, maíz, trigo, Medicago truncatula, etc., utilizando protocolos estándar. Las células transgénicas resultantes y/o las plantas derivadas de ellas pueden ensayarse luego en cuanto a fallo o alteración de su tolerancia al estrés por sequía, sal y temperatura.

La modificación por bioingeniería de uno o más genes de CCSRP de la invención puede dar también como resultado CCSRPs que tengan actividades alteradas que afectan indirectamente a la respuesta al estrés y/o la tolerancia al estrés de algas, plantas, ciliados u hongos u otros microorganismos como C. glutamicum. Por ejemplo, los procesos bioquímicos normales del metabolismo dan como resultado la producción de una diversidad de productos (v.g., peróxido de hidrógeno y otras especies de oxígeno reactivas) que pueden interferir activamente con estos mismos procesos metabólicos (por ejemplo, se sabe que el peroxinitrito nitra las cadenas laterales de la tirosina, desactivando con ello algunas enzimas que tienen tirosina en el sitio activo (Groves, J.T., 1999 Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2): 226-235). Si bien estos productos son excretados típicamente, las células pueden alterarse genéticamente para transportar más productos que lo que es típico para una célula de tipo salvaje. Por optimización de la actividad de una o más CCSRPs de la invención que están involucradas en la exportación de moléculas específicas, tales como moléculas de sal, puede ser posible mejorar la tolerancia de la célula al estrés.

Adicionalmente, las secuencias descritas en esta memoria, o fragmentos de las mismas, pueden utilizarse para generar mutaciones de tipo "fuera de combate" ("knock-out") en los genomas de diversos organismos, tales como bacterias, células de mamífero, células de levadura, y células vegetales (Girke, T., 1998 The Plant Journal 15: 39-48). Las células fuera de combate resultantes pueden evaluarse luego en cuanto a su aptitud o capacidad para tolerar diversas condiciones de estrés, su respuesta a diversas condiciones de estrés, y el efecto sobre de la mutación el fenotipo y/o el genotipo. Para otros métodos de desactivación de genes véase la Patente U.S. No. 6.004.804 "Non-Chimeric Mutational Vectors", y Puttaraju et al. 1999, ``Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy, Nature Biotechnology 17: 246-252.

Las estrategias de mutagénesis mencionadas anteriormente para CCSRPs que dan como resultado una resistencia incrementada al estrés no deben entenderse como limitantes; variaciones en estas estrategias serán fácilmente evidentes para un experto en la técnica. Utilizando tales estrategias, e incorporando los mecanismos descritos en esta memoria, las moléculas de ácido nucleico y proteína de la invención pueden utilizarse para generar algas, ciliados, plantas, hongos u otros microorganismos tales como C. glutamicum que expresan moléculas de ácido nucleico y proteínas CCSRP mutadas tales que se mejora la tolerancia al estrés.

Pueden proporcionarse anticuerpos que se fijan específicamente a una CCSRP, o una porción de la misma, tal como es codificada por un ácido nucleico descrito en esta memoria. Pueden producirse anticuerpos por muchos métodos bien conocidos (véase, v.g. Harlow and Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1988)). Resumidamente, un antígeno purificado puede inyectarse en un animal en una cantidad y en intervalos suficientes para provocar una respuesta inmunitaria. Los anticuerpos pueden purificarse directamente, o pueden obtenerse células de bazo del animal. Las células pueden fusionarse luego con una línea de células inmortales y escrutarse en cuanto a secreción de anticuerpos. Los anticuerpos pueden utilizarse para escrutar genotecas de clones de ácido nucleico respecto a células que secretan el antígeno. Aquellos clones que dan resultado positivo pueden secuenciarse luego. (Véase, por ejemplo, Kelly et al. 1992, Bio/Technology 10: 163-167; Bebbington et al. 1992, Bio/Technology 10: 169-175).

Las expresiones "se fija selectivamente" y "se fija específicamente" con el polipéptido hacen referencia a una reacción de fijación que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otras entidades biológicas. Así, en condiciones de inmunoensayo diseñadas, los anticuerpos especificados fijados a una proteína particular no se fijan en una cantidad importante a otras proteínas presentes en la muestra. La fijación selectiva de un anticuerpo en tales condiciones puede requerir un anticuerpo que se seleccione por su especificidad para una proteína particular. Pueden utilizarse una diversidad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos que se fijan selectivamente con una proteína particular. Por ejemplo, se utilizan rutinariamente inmunoensayos ELISA en fase sólida para seleccionar anticuerpos selectivamente inmunorreactivos con una proteína. Véase Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, (1988), para una descripción de formatos y condiciones de inmunoensayo que podrían utilizarse para determinar fijación selectiva.

En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales a partir de diversos hospedadores. Una descripción de técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales puede encontrarse en Stites et al. compiladores, "Basic and Clinical Immunology", (Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., 4ª Edición) y las referencias citadas en dicho lugar, y en Harlow and Lane ("Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, 1988).

A lo largo de esta solicitud se hace referencia a diversas publicaciones. Debe entenderse también que lo que antecede se refiere a realizaciones preferidas de la presente invención. La invención se ilustra adicio-nalmente por los ejemplos siguientes, que no deben interpretarse en modo alguno como imposición de limitaciones en cuanto al alcance de la misma.

Ejemplos Ejemplo 1 Crecimiento de cultivos de Physcomitrella patens

Para este estudio, se utilizaron plantas de la especie Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. procedentes de la colección de la sección de estudios genéticos de la Universidad de Hamburgo. Las mismas proceden de la cepa 16/14 recogida por H.L.K. Whitehouse en Gransden Wood, Huntingdonshire (Inglaterra), que fue subcultivada a partir de una espora por Engel (1968, Am. J. Bot. 55, 438-446). La proliferación de las plantas se efectuó por medio de esporas y por regeneración de los gametofitos. El protonema se desarrolló a partir de la espora haploide como un cloronema rico en cloroplastos y caulonema pobre en cloroplastos, sobre el cual se formaron yemas al cabo de aproximadamente 12 días. Éstas crecieron para dar gametóforos que llevaban anteridios y arquegonios. Después de la fertilización, se obtuvo el esporofito diploide con una seta corta y la cápsula de esporas, en la cual maduraron las meiosporas.

El cultivo se efectuó en una cámara climatizada a una temperatura del aire de 25ºC y una intensidad de luz de 55 micromoles^{-lm2} (luz blanca; tubo fluorescente; Philips TL 65W/25) y un cambio luz/oscuridad de 16/8 horas. El musgo se modificó en cultivo líquido utilizando medio de Knop de acuerdo con Reski y Abel (1985; Planta 165: 354-358) o se cultivó en medio Knop sólido utilizando agar oxoide al 1% (Unipath, Basingstoke, Inglaterra). Los protonemas utilizados para aislamiento de RNA y DNA se cultivaron en cultivos líquidos aireados. Los protonemas se trituraron cada 9 días y se transfirieron a medio de cultivo fresco.

Ejemplo 2 Aislamiento de DNA total a partir de plantas

Los detalles para el aislamiento del DNA total se refieren al tratamiento de 1 gramo de peso fresco de material de planta. Los materiales utilizados incluyen los tampones siguientes: tampón CTAB: 2% (p/v) de bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio (CTAB); Tris HCl 100 mM de pH 8,0; NaCl 1,4 M; EDTA 20 mM; tampón de N-laurilsarcosina: 10% (p/v) de N-laurilsarcosina; Tris HCl 100 mM de pH 8,0; EDTA 20 mM.

El material de planta se trituró bajo nitrógeno líquido en un mortero para dar un polvo fino y se transfirió a vasos Eppendorf de 2 ml. El material de planta congelado se cubrió luego con una capa de 1 ml de tampón de descomposición (1 ml de tampón CTAB, 100 \mul de tampón de N-laurilsarcosina, 20 \mul de \beta-mercaptoetanol y 10 \mul de solución de PROTEÍNAasa K, 10 mg/ml) y se incubó a 60ºC durante 1 hora con agitación continua mediante sacudidas. El homogeneizado obtenido se distribuyó en dos vasos Eppendorf (de 2 ml) y se extrajo dos veces por agitación mediante sacudidas con el mismo volumen de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Para la separación de fases, se efectuó una centrifugación a 8000 x g y a la temperatura ambiente durante 15 minutos en cada caso. El DNA se precipitó luego a -70ºC durante 30 minutos utilizando isopropanol enfriado con hielo. El DNA precipitado se sedimentó a 4ºC y 10.000 g durante 30 minutos y se resuspendió en 180 \mul de tampón TE (Sambrook et al. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Para purificación ulterior, el DNA se trató con NaCl (concentración final 1,2 M) y se precipitó de nuevo a -70º durante 30 minutos utilizando dos veces el volumen de etanol absoluto. Después de un paso de lavado con etanol al 70%, el DNA se secó y se recogió subsiguientemente en 50 \mul de H_{2}O + RNAsa (concentración final 50 mg/ml). El DNA se disolvió durante una noche a 4ºC y se efectuó subsiguientemente la digestión con RNAsa a 37ºC durante 1 hora. El almacenamiento del DNA tuvo lugar a 4ºC.

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Ejemplo 3 Aislamiento de RNA total y RNA poli-(A)^{+} y construcción de una genoteca de cDNA de Physcomitrella patens

Para la investigación de los materiales transcritos, se aislaron tanto RNA total como RNA poli(A)^{+}. El RNA total se obtuvo a partir de protonemas de tipo salvaje de 9 días siguiendo el método GTC (Reski et al. 1994, Mol. Gen. Genet., 244: 352-359). El RNA poli(A)^{+} se aisló utilizando DynaBeads® (Dynal, Oslo, Noruega) siguiendo las instrucciones del protocolo de los fabricantes. Después de determinar la concentración del RNA o del RNA poli(A)^{+}, el RNA se precipitó por adición de 1/10 volúmenes de acetato de sodio 3 M de pH 4,6 y 2 volúmenes de etanol, y se guardó a -70ºC.

Para construcción de la genoteca de cDNA, se realizó la síntesis de la primera cadena utilizando transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia Murina (Roche, Mannheim, Alemania) e iniciadores oligo-d(T), y la síntesis de la segunda cadena por incubación con DNA-polimerasa I, enzima Klenow y digestión con RNAsaH a 12ºC (2 horas), 16ºC (1 hora), y 22ºC (1 hora). La reacción se paró por incubación a 65ºC (10 minutos) y se transfirió subsiguientemente a hielo. Las moléculas de DNA bicatenario se hicieron romas con DNA-polimerasa T4 (Roche, Mannheim) a 37ºC (30 minutos). Los nucleótidos se separaron por extracción con fenol/cloroformo y columnas rotativas Sephadex G50. Se ligaron adaptadores EcoRI (Pharmacia, Freiburg, Alemania) a los extremos del cDNA por medio de DNA-ligasa T4 (Roche, 12ºC, una noche) y se fosforilaron por incubación con polinucleótido-quinasa (Roche, 37ºC, 30 minutos). Esta mezcla se sometió a separación en un gel de agarosa de punto de fusión bajo. Las moléculas de DNA mayores que 300 pares de bases se eluyeron del gel, se extrajeron con fenol, se concentraron en columnas Elutip-D (Schleicher and Schuell, Dassel, Alemania) y se ligaron a ramas vectoras, después de lo cual se empaquetaron en fagos lambda ZAPII o fagos lambda ZAP-Express utilizando el Kit Gigapack Gold (Stratagene, Amsterdam, Países Bajos) empleando material y siguiendo las instrucciones del fabricante.

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Ejemplo 4 Secuenciación y anotación de la función de ESTs de Physcomitrella patens

Se utilizaron genotecas de cDNA como se describe en el Ejemplo 3 para secuenciación del DNA de acuerdo con métodos estándar, y en particular, por el método de terminación de cadenas utilizando el kit ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer, Weiterstadt, Alemania). La secuenciación aleatoria se llevó a cabo subsiguientemente a la recuperación preparativa de plásmido a partir de genotecas de cDNA por escisión másica in vivo, retransformación, y extensión subsiguiente de DH10B en placas de agar (detalles de material y protocolo de Stratagene, Amsterdam, Países Bajos). Se preparó DNA plasmídico a partir de cultivos de E. coli desarrollados durante una noche, que crecían en Caldo Luria como medio que contenía ampicilina (véase Sambrook et al. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) en un robot de preparación de DNA Qiagene (Qiagen, Hilden) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se utilizaron iniciadores de secuenciación con las secuencias de nucleótidos siguientes:

	5'-CAGGAAACAGCTA TGACC-3'	SEQ ID NO:10

	5'-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3'	SEQ ID NO:11

	5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'	SEQ ID NO:12

Las secuencias se procesaron y anotaron utilizando el paquete de soporte lógico EST-MAX proporcionado comercialmente por Bio-Max (Munich, Alemania). El programa incorpora prácticamente todos los métodos bioinformáticos importantes para caracterización funcional y estructural de secuencias de proteínas. Para referencia se remite al sitio de la web en pedant.mips.biochem.mpg.de. Los algoritmos más importantes incorporados en EST-MAX son: FASTA: Búsquedas de bases de datos de secuencias muy sensibles con estimaciones de significación estadística; Pearson W.R. (1990) Comparación de secuencias rápida y sensible con FASTP y FASTA. Methods Enzymol. 183:63-98; BLAST: Very sensitive sequence database searches with estimates of statistical significance. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., y Lipman D.J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215:403-10; PREDATOR: High-accuracy secondary structure prediction from single and multiple sequences. Frishman, D. and Argos, P. (1997) 75% accuracy in PROTEÍNA secondary structure prediction. PROTEÍNAs, 27:329-335; CLUSTALW: Multiple sequence alignment. Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680; TMAP: Transmembrane region prediction from

100

Ejemplo 5 Identificación de ORFs de Physcomitrella patens correspondientes a CC-1, CC-2 y CC-3. CC-2 y CC-3 son ejemplos comparativos

Los cDNAs parciales de Physcomitrella patens (ESTs) que se muestran en la Tabla 1 siguiente se identificaron en el programa de secuenciación EST de Physcomitrella patens utilizando el programa EST-MAX por análisis BLAST. Los Números de Identificación de Secuencia correspondientes a estos ESTs son como sigue: CC-1(SEQ ID NO:1), CC-2(SEQ ID NO:2), y CC-3 (SEQ ID NO:3).

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TABLA 1

1

* Ejemplo comparativo

TABLA 2 Grado de Identidad y Semejanza de Aminoácidos de PpCC-1 y Otras Proteínas Homólogas (se utilizó el programa GCG Gap; penalidad por laguna: 10; penalidad por extensión de laguna: 0,1; matriz de registro: blosum62)

2

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TABLA 3 Grado de Identidad y Semejanza de Aminoácidos de PpCC-2 y Otras Proteínas Homólogas (se utilizó el programa GCG Gap; penalidad por laguna: 10; penalidad por extensión de laguna: 0,1; matriz de registro: blosum62) (ejemplo comparativo)

3

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TABLA 4 Grado de Identidad y Semejanza de Aminoácidos de PpCC-3 y Otras Proteínas Homólogas (se utilizó el programa GCG Gap; penalidad por laguna: 10; penalidad por extensión de laguna: 0,1; matriz de registro: blosum62) (ejemplo comparativo)

4

Ejemplo 6 Clonación del cDNA de longitud total de Physcomitrella patens codificante de CC-1, CC-2 y CC-3 (CC-2 y CC-3 son ejemplos comparativos)

Para aislar los clones codificantes de PpCC-1 (SEQ ID NO:4), PpCC-2 (SEQ ID NO:5), y PpCC-3 (SEQ ID NO:6), a partir de Physcomitrella patens, se crearon genotecas de cDNA con el kit de Amplificación de cDNA SMART RACE (Clontech Laboratories) siguiendo instrucciones del fabricante. Se utilizó como molde RNA total aislado como se describe en el Ejemplo 3. Los cultivos se trataron antes del aislamiento del RNA como sigue: Estrés por Sal: 2, 6, 12, 24, 48 horas con medio complementado con NaCl 1-M; Estrés por Frío: 4ºC durante los mismos tiempos que en el caso de la sal; Estrés por Sequía: los cultivos se incubaron sobre papel de filtro seco durante los mismos tiempos que en el caso de la sal.

Protocolo 5' RACE

Se utilizaron las secuencias EST CC-2 (SEQ ID NO:2), y CC-3 (SEQ ID NO:3) identificadas por la búsqueda en bases de datos como se describe en el Ejemplo 4, para diseñar oligos para RACE (véase Tabla 5). Las secuencias extendidas para estos genes se obtuvieron por realización de Amplificación Rápida de la reacción en cadena de la polimerasa en los Extremos de cDNA (RACE PCR) utilizando el kit Advantage 2 (Clontech Laboratories) y el kit de amplificación de cDNA SMART RACE (Clontech Laboratories) utilizando un Termociclador Biometra T3 siguiendo las instrucciones del fabricante. Las secuencias obtenidas a partir de las reacciones RACE correspondían a regiones codificantes de longitud total de CC-2 y CC-3 y se utilizaron para diseñar oligos para clonación de longitud total de los genes respectivos (véase la amplificación de longitud total más adelante).

Amplificación de Longitud Total

Clones de longitud total correspondientes a CC-1 (SEQ ID NO:4), CC-2 (SEQ ID NO:5), y CC-3 (SEQ ID NO:6), se obtuvieron por realización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con iniciadores específicos de genes (véase Tabla 5) y el EST original como molde. Las condiciones para la reacción fueron condiciones estándar con DNA-polimerasa PWO (Roche). La PCR se realizó de acuerdo con condiciones estándar y con protocolos del fabricante (Sambrook et al. 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., Termociclador Biometra T3). Los parámetros para la reacción fueron: 5 minutos a 94ºC seguidos por cinco ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 50ºC y 1,5 minutos a 72ºC. Esto fue seguido por 25 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 65ºC y 1,5 minutos a 72ºC.

Los fragmentos amplificados se extrajeron del gel de agarosa con un Kit de Extracción de Gel QIAquick (Qiagen) y se ligaron al vector TOPO pCR2.1 (Invitrogen) siguiendo instrucciones del fabricante. Los vectores recombinantes se transformaron en células Top10 (Invitrogen) utilizando condiciones estándar (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y). Las células transformadas se seleccionaron sobre agar LB que contenía 100 \mug/ml de carbenicilina, 0,8 mg de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido) y 0,8 mg de IPTG (isopropiltio-\beta-D-galactosido) y se desarrollaron durante una noche a 37ºC. Se seleccionaron las colonias blancas y se utilizaron para inocular 3 ml de LB líquido que contenía 100 \mug/ml de amplicilina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Se extrajo el DNA plasmídico utilizando el Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo instrucciones del fabricante. Los análisis de clones subsiguientes y el mapeado de restricción se realizaron de acuerdo con técnicas estándar de biología molecular (Sambrook et al. 1989, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y).

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TABLA 5 Esquema e iniciadores utilizados para clonación de clones de longitud total

5

6

Ejemplo 7 Modificación por bioingeniería de plantas de Arabidopsis tolerantes al estrés por sobre-expresión de los genes CC-1, CC-2 y CC-3 (CC-2 y CC-3 son ejemplos comparativos) Construcción del vector binario: kanamicina

El constructo plasmídico pACGH101 se digirió con PstI (Roche) y FseI (NEB) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El fragmento se purificó en gel de agarosa y se extrajo por medio del kit de Extracción de DNA Qiaex II (Qiagen). Esto dio como resultado un fragmento de vector con el promotor de Arabidopsis Actin2 con un intrón interno y el terminador OCS3. Los iniciadores para la amplificación por PCR del gen NPTII se diseñaron como sigue:

5'NPT-Pst:	GCG-CTG-CAG-ATT-TCA-TTT-GGA-GAG-GAC-ACG	(SEQ ID NO:23)

3'NPT-Fse:	CGC-GGC-CGG-CCT-CAG-AAG-AAC-TCG-TCA-AGA-AGG-CG	(SEQ ID NO:24)

El gen NPTII de 0,9 kilobases se amplificó por PCR a partir de DNA del plásmido pCambia 2301 [94ºC 60s, {94ºC 60s, 61ºC (-0,1ºC por ciclo) 60 s, 72ºC 2 min} x 25 ciclos, 72ºC 10 min en máquina Biometra de Gradiente T], y se purificó por medio del kit de Extracción de PCR Qiaquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El DNA de la PCR se subclonó luego en el vector pCR-BluntII TOPO (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (constructo NPT-Topo). Estas ligaciones se transformaron en células Top10 (Invitrogen) y se dejaron crecer sobre placas LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina durante una noche a 37ºC. Se utilizaron luego las colonias para inocular 2 ml de medio LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. El DNA plasmídico se recuperó utilizando el estuche Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen) y se secuenció en ambas direcciones 5' y 3' utilizando condiciones estándar. El análisis subsiguiente de los datos de secuencia utilizando el soporte lógico VectorNTI reveló la ausencia de errores de PCR presentes en la secuencia del gen NPTII.

El constructo NPT-Topo se digirió luego con PstI (Roche) y FseI (NEB) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El fragmento de 0,9 kilobases se purificó en gel de agarosa y se extrajo por medio del kit de extracción de DNA Qiaex II (Qiagen). El fragmento de inserción Pst/Fse de NPT-Topo y el fragmento vector Pst/Fse de pACGH101 se ligaron luego uno a otro utilizando DNA-ligasa T4 (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante. La ligación se transformó luego en células Top10 (Invitrogen) en condiciones estándar, creando el constructo pBPSsc019. Se seleccionaron las colonias sobre placas LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Estas colonias se utilizaron luego para inocular 2 ml de medio LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. El DNA plasmídico se recuperó utilizando el kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

El constructo pBPSSC019 se digirió con KpnI y BsaI (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento se purificó por medio de gel de agarosa y se extrajo luego mediante el kit de extracción de DNA Qiaex II (Qiagen) de acuerdo con sus instrucciones, dando como resultado una casete Act-NPT de 3 kilobases, que incluía el promotor Actin2 de Arabidopsis con intrón interno, el gen NPTII y el terminador OCS3.

\newpage

El vector pBPSJH001 se digirió con SpeI y ApaI (Roche) y se rellenó para hacer romos los extremos con enzima Klenow y dNTPs (Roche) 0,1 mM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esto produjo un fragmento vector de 10,1 kilobases menos la casete de Gentamicina, que se recircularizó por autoligación con DNA-ligasa T4 (Roche) y se transformó en células Top10 (Invitrogen) en condiciones estándar. Las células transformadas se seleccionaron sobre agar LB que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Se utilizaron luego las colonias para inocular 2 ml de LB líquido que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. El DNA plasmídico se extrajo utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El plásmido recircularizado se digirió luego nuevamente con KpnI (Roche) y se extrajo del gel de agarosa por medio del kit de Extracción de DNA Qiaex II (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

La inserción Act-NPT cortada con Kpn y el vector recircularizado pBPSJH001 cortado con Kpn se ligaron luego uno a otro utilizando DNA-ligasa T4 (Roche) y se transformaron en células Top10 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El constructo resultante, pBPSsc022 contenía ahora el Promotor Super, el gen GUS, el terminador NOS, y la casete Act-NPT. Las células transformadas se seleccionaron sobre agar LB que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Se utilizaron luego las colonias para inocular 2 ml de LB líquido que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. El DNA plasmídico se extrajo utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la confirmación del éxito de la ligación por productos de digestión con restricción, el DNA plasmídico pBPSsc022 se propagó ulteriormente y se recuperó utilizando el Kit Plasmid Midiprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Subclonación de CC-1, CC-2 y CC-3 en el vector binario

Los fragmentos que contenían los diferentes factores de transcripción de Physcomitrella patens se subclonaron a partir de los vectores recombinantes PCR2.1 TOPO por doble digestión con enzimas de restricción (véase la Tabla 6) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento de la subsecuencia se escindió del gel de agarosa con un Kit de Extracción de gel QIAquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se ligó en los vectores binarios pGMSG, se escindió con XmaI y Ec1136II y se desfosforiló antes de la ligación. El pGMSG recombinante resultante contenía el factor de transcripción correspondiente en la orientación de sentido bajo el super-promotor constitutivo.

TABLA 6 A continuación se indican los nombres de los diversos constructos de los factores de transcripción de Physcomitrella patens utilizados para transformación de plantas

7

Transformación de Agrobacterium

Los vectores recombinantes se transformaron en Agrobacterium tumefaciens C58C1 y PMP90 de acuerdo con condiciones estándar (Hoefgen y Willmitzer, 1990).

Transformación de plantas

Se cultivaron y transformaron Arabidopsis thaliana ecotipo C24 de acuerdo con condiciones estándar (Bechtold 1993, Acad. Sci. Paris, 316: 1194-1199; Bent et al. 1994, Science 265: 1856-1860).

Escrutinio de las Plantas Transformadas

Se esterilizaron semillas T1 de acuerdo con protocolos estándar (Xiong et al. 1999, Plant Molecular Biology Reporter 17: 159-170). Las semillas se extendieron sobre medio 1/2 MS (Sigma-Aldrich) con agar al 0,6% complementado con 1% de sacarosa, 50 \mug/ml de kanamicina (Sigma-Aldrich), y 2 \mug/ml de benomil (Sigma-Aldrich). Las semillas se vernalizaron en las placas durante cuatro días a 4ºC. Las semillas se dejaron germinar en una cámara climatizada a una temperatura del aire de 22ºC y con una intensidad lumínica de 40 micromoles^{-1m2} (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25) y ciclo diurno de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Las plantas de semillero transformadas se seleccionaron después de 14 días y se transfirieron a medio 1/2 MS en placas de agar al 0,6% complementado con 1% de sacarosa, y se dejaron recuperar durante cinco-siete días.

Investigación de la Tolerancia a la Sequía

Las plantas de semillero T1 se transfirieron a papel de filtro seco estéril en una cápsula Petri y se dejaron desecar durante 2 horas a 80% RH (humedad relativa) en un Armario de Cultivo Sanyo MLR-350H, micromoles^{-lm2} (luz blanca, tubo fluorescente Philips TL 65W/25). Se redujo luego la RH a 60% y se desecaron ulteriormente las plantas de semillero durante 8 horas. Se retiraron luego las plantas de semillero y se pusieron sobre placas de MS ½ con agar al 0,6% complementadas con 2 \mug/ml de benomil y se evaluaron después de 5 días.

En condiciones de estrés por sequía, las plantas PpCC-1 que sobreexpresaban Arabidopsis thaliana exhibían una tasa de supervivencia de 67% (6 supervivientes de 9 plantas estresadas) al escrutinio de estrés; PpCC-2, 75% (6 supervivientes de 8 plantas estresadas) y PpCC-3, 92% (11 supervivientes de 12 plantas estresadas), mientras que el control exhibía sólo una tasa de supervivencia de 11% (1 superviviente de 9 plantas estresadas) (véase Tabla 7). Es de notar que los análisis de estas líneas transgénicas se realizaron con plantas T1, y por consiguiente, los resultados serán mejores cuando se encuentre un expresante homocigótico fuerte.

TABLA 7 Sumario de los ensayos de estrés por sequía

8

Investigación de Tolerancia a la Helada

Se llevaron plantas de semillero a cápsulas Petri que contenían 1/2 MS con agar al 0,6% complementado con 2% de sacarosa y 2 \mug/ml de benomil. Después de 4 días, las plantas de semillero se incubaron a 4ºC durante 1 hora y se cubrieron luego con hielo en virutas. Se pusieron luego las plantas de semillero en una Cámara Ambiental Environmental Specialist ES2000 y se incubaron durante 3,5 horas comenzando a -1,0ºC, con disminución de la temperatura a -1ºC por hora. Las plantas de semillero se incubaron luego a -5,0ºC durante 24 horas y se dejaron descongelar luego a 5ºC durante 12 horas. El agua se separó por vertido y las plantas de semillero se evaluaron al cabo de 5 días.

En condiciones de estrés por helada, las plantas PpCC-2 que sobreexpresaban Arabidopsis thaliana presentaban una tasa de supervivencia al escrutinio de estrés de 89% (8 supervientes de 9 plantas estresadas), mientras que el control no transformado exhibía sólo una tasa de supervivencia de 2% (1 superviviente de 48 plantas estresadas (véase Tabla 8). Es de notar que los análisis de estas líneas transgénicas se realizaron con plantas T1, y por consiguiente, los resultados serán mejores cuando se encuentre un expresante homocigótico fuerte.

TABLA 8 Sumario de los ensayos de estrés por helada

9

Investigación de la tolerancia a la sal (ejemplo comparativo)

Se transfirieron plantas de semillero a papel de filtro impregnado en ½ MS y se pusieron sobre ½ MS con agar al 0,6% complementado con 2 \mug/ml de benomil la noche anterior a la investigación de la tolerancia a la sal. Para la investigación de la tolerancia a la sal, el papel de filtro con las plantas de semillero se llevó a pilas de papel de filtro estéril, impregnadas en NaCl 50 mM, en una cápsula Petri. Después de 2 horas, el papel de filtro con las plantas de semillero se llevó a pilas de papel de filtro estéril, impregnadas con NaCl 200 mM, en una cápsula Petri. Al cabo de 2 horas, el papel de filtro con las plantas de semillero se llevó a tiras de papel de filtro estéril, impregnadas en NaCl 600 mM en una cápsula Petri. Al cabo de 10 horas, las plantas de semillero se llevaron a cápsulas Petri que contenían ½ MS con agar al 0,6% complementado con 2 \mug/ml de benomil. Las plantas de semillero se investigaron después de 5 días.

Las plantas transgénicas se investigan respecto a su tolerancia mejorada a la sal, demostrando que la expresión de los transgenes confiere tolerancia a la sal.

Ejemplo 8 Detección de los transgenes CC-1, CC-2 y CC-3 en las líneas transgénicas de Arabidopsis (CC-2 y CC-3 son ejemplos comparativos)

Una hoja de una planta de Arabidopsis de tipo salvaje y de una planta transgénica de Arabidopsis se homogeneizaron en 250 \mul de tampón de bromuro de hexadeciltrimetil-amonio (CTAB) (2% CTAB, NaCl 1,4 M, EDTA 8 mM y Tris 20 mM, pH 8,0) y 1 \mul de \beta-mercaptoetanol. Las muestras se incubaron a 60-65ºC durante 30 minutos y se añadieron luego 250 \mul de cloroformo a cada muestra. Las muestras se agitaron enérgicamente durante 3 minutos y se centrifugaron durante 5 minutos a 18.000 x g. Se retiró el sobrenadante de cada muestra y se añadieron 150 \mul de isopropanol. Las muestras se incubaron a la temperatura ambiente durante 15 minutos, y se centrifugaron durante 10 minutos a 18.000 x g. Cada pelet se lavó con etanol al 70%, se secó, y se resuspendió en 20 \mul de TE. Se utilizaron 4 \mul de la suspensión anterior en una reacción PCR de 20 \mul utilizando DNA-polimerasa Taq (Roche Molecular Biochemicals) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los iniciadores utilizados en las reacciones fueron:

PpCC-1
GCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTC	(SEQ ID NO:25)
GCGAGCTCGCGACTGATGCAACTCACCCATGAA	(SEQ ID NO:26)

El programa PCR fue como sigue: 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10 minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 1,6 kb a partir del control positivo y las plantas transgénicas.

PpCC-2
GCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTC	(SEQ ID NO:25)
GCGAGCTCTGGGAATTGCGCATGGGAAACTGG	(SEQ ID NO:27)

Los iniciadores se utilizaron en la primera tanda de reacciones con el programa siguiente: 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10 minutos a 72ºC. Se generó un fragmento de 3 kb a partir del control positivo y las plantas transgénicas T1.

PpCC-3
GCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTC	(SEQ ID NO:25)
GCGAGCTCTGAT ACAAGAGCGTCGATGCTCCA	(SEQ ID NO:28)

El programa PCR fue como sigue: 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10 minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 2,3 kb a partir del control positivo y las plantas transgénicas.

Los transgenes se amplificaron con éxito a partir de las líneas transgénicas T1, pero no del tipo salvaje C24. Este resultado indica que las plantas transgénicas T1 contienen al menos una copia de los transgenes. No había indicación alguna de la existencia de genes idénticos o muy similares en el control de Arabidopsis thaliana sin transformar que pudo amplificarse por este método.

Ejemplo 9 Detección del mRNA de los transgenes CC-1, CC-2 y CC-3 en líneas transgénicas de Arabidopsis (CC-2 y CC-3 son ejemplos comparativos)

La expresión de los transgenes se detectó utilizando RT-PCR. El RNA total se aisló a partir de plantas tratadas por estrés utilizando un procedimiento adaptado de (Verwoerd et al. 1989 NAR 17: 2362). Se recogieron muestras de hojas (50-100 mg) y se molieron en nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino. El tejido molido se resuspendió en 500 \mul de una mezcla 1:1 de fenol a tampón de extracción mantenida a 80ºC (LiCl 100 mM, Tris 100 mM de pH 8, EDTA 10 mM, 1% SDS), seguido por agitación enérgica breve para mezclar. Después de la adición de 250 \mul de cloroformo, cada muestra se agitó brevemente de modo enérgico. Se centrifugaron luego las muestras durante 5 minutos a 12.000 x g. La fase acuosa superior se llevó a un tubo Eppendorf nuevo. El RNA se precipitó por adición de una décima parte del volumen de acetato de sodio 3 M y 2 volúmenes de etanol al 95%. Las muestras se mezclaron por inversión y se dejaron en hielo durante 30 minutos. El RNA se redujo a un pelet por centrifugación a 12.000 x g durante 10 minutos. Se retiró el sobrenadante y los pelets se secaron brevemente al aire. Los pelets de la muestra de RNA se resuspendieron en 10 \mul de agua tratada con DEPC. Para separar el DNA contaminante de las muestras, se trató cada una con DNasa exenta de RNasa (Roche) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se sintetizó cDNA a partir del RNA total utilizando el kit de síntesis de cDNA de la Primera Cadena (Boehringer Mannheim) siguiendo las recomendaciones del fabricante.

La amplificación por PCR de un fragmento de gen específico del cDNA sintetizado se realizó utilizando DNA-polimerasa Taq (Roche) e iniciadores específicos del gen (véase más adelante para los iniciadores) en la reacción siguiente: 1X tampón PCR, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,2 \muM de cada iniciador, 0,2 \muM de dNTPs, 1 unidad de polimerasa, 5 \mul de cDNA de la reacción de síntesis. La amplificación se realizó en las condiciones siguientes: desnaturalización, 95ºC, 1 minuto; reasociación, 62ºC, 30 segundos; extensión, 72ºC, 1 minuto, 35 ciclos; extensión, 72ºC, 5 minutos; mantenimiento, 4ºC, en todos los casos. Los productos PCR se corrieron en un gel de agarosa al 1%, se tiñeron con bromuro de etidio, y se visualizaron bajo luz UV utilizando el sistema de documentación de gel Quantity-One (Bio-Rad)..

La expresión de los transgenes se detectó en la línea transgénica T1. Estos resultados indicaban que los transgenes se expresan en las líneas transgénicas y sugerían fuertemente que su producto génico mejoraba la tolerancia de las plantas al estrés en la línea transgénica. Por otra parte, no pudo detectarse por este método expresión alguna de genes endógenos idénticos o muy similares. Estos resultados están de acuerdo con los datos del Ejemplo 7. Esto respalda sólidamente la afirmación de los inventores de que la tolerancia al estrés observada es debida al transgén
introducido.

En las reacciones arriba descritas se utilizó la combinación de iniciadores siguiente.

PpCC-1:
GATGGTGATGGTGACAGCGAGGATC	(SEQ ID NO:29)
CGACGTGAAGCCTCGCTCTCATTTCC	(SEQ ID NO:30)

\vskip1.000000\baselineskip

PpCC-2:
CGATCTCCTTCAAGGGAACCTAGTGCTG	(SEQ ID NO:31)
GAGTTCACGCATGTGCACCGATGCT	(SEQ ID NO:32)

\vskip1.000000\baselineskip

PpCC-3:
CGTAGCGTCTTCCAGGATGTCCTAC	(SEQ ID NO:33)
GCTTGGCCTCGTCTACTCCCGCAAC	(SEQ ID NO:34)

La amplificación se realizó en las condiciones siguientes: desnaturalización, 95ºC, 1 minuto; reasociación, 62ºC, 30 segundos; extensión, 72ºC, 1 minuto, 35 ciclos; extensión, 72ºC, 5 minutos; mantenimiento, 4ºC, en todos los casos. Los productos PCR se corrieron sobre un gel de agarosa al 1%, se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz UV utilizando el sistema de documentación de gel Quantity-one (Bio-Rad).

La expresión de los transgenes se detectó en la línea transgénica T1. Estos resultados indicaban que los transgenes se expresan en las líneas transgénicas y sugieren fuertemente que su producto génico mejoraba la tolerancia de las plantas al estrés en las líneas transgénicas. De acuerdo con la afirmación anterior, no pudo detectarse por este método expresión alguna de genes endógenos idénticos o muy similares. Estos resultados están de acuerdo con los datos del Ejemplo 7.

Ejemplo 10 Modificación por ingeniería genética de plantas de soja tolerantes al estrés por sobreexpresión de los genes CC-1, CC-2 y CC-3 (CC-2 y CC-3 son ejemplos comparativos)

Se utilizaron los constructos pBPSSY032, pBPSsc335 y pBPSLVM186 para transformar soja como se describe a continuación.

Se esterilizaron superficialmente semillas de soja con etanol al 70% durante 4 minutos a la temperatura ambiente con agitación continua mediante sacudidas, seguido por 20% (v/v) de Clorox complementado con 0,05% (v/v) de Tween durante 20 minutos con agitación continua mediante sacudidas. A continuación las semillas se lavaron cuatro veces con agua destilada y se dejaron sobre papel de filtro estéril húmedo en una cápsula Petri a la temperatura ambiente durante 6 a 39 horas. Se desprendieron las cubiertas de las semillas, y se separaron los cotiledones del eje del embrión. Se examinó el eje del embrión para asegurarse de que la región meristemática no estaba deteriorada. Los ejes del embrión escindidos se recogieron en una cápsula Petri estéril semi-abierta y se secaron al aire hasta un contenido de humedad menor que 20% (peso fresco) en una cápsula Petri sellada hasta su utilización ulterior.

Se preparó un cultivo de Agrobacterium tumefaciens a partir de una sola colonia en medio sólido LB más antibióticos apropiados (v.g. 100 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/l de kanamicina) seguido por crecimiento de la colonia simple en medio LB líquido hasta una densidad óptica de 0,8a 600 nm. A continuación, el cultivo de bacterias se redujo a un pelet a 7000 rpm durante 7 minutos a la temperatura ambiente, y se resuspendió en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) complementado con acetosiringona 100 \muM. Los cultivos bacterianos se incubaron en este medio de pre-inducción durante 2 horas a la temperatura ambiente antes de su utilización. Los ejes de los embriones de las semillas cigóticas de soja con aproximadamente 15% de contenido de humedad se embebieron durante 2 horas a la temperatura ambiente con el cultivo de la suspensión de Agrobacterium pre-inducida. Los embriones se retiraron del cultivo de imbibición y se transfirieron a cápsulas Petri que contenían medio MS sólido complementado con 2% de sacarosa y se incubaron durante 2 días, en la oscuridad a la temperatura ambiente. Alternativamente, los embriones se pusieron sobre papel de filtro estéril húmedo (medio MS líquido) en una cápsula Petri y se incubaron en las mismas condiciones descritas anteriormente. Después de este periodo, los embriones se transfirieron a medio MS sólido o líquido complementado con 500 mg/l de carbenicilina o 300 mg/ml de cefotaximo para destruir las agrobacterias. El medio líquido se utilizó para humedecer el papel de filtro estéril. Los embriones se incubaron durante 4 semanas a 25ºC, bajo 150 \mumol m^{-2}s^{-1} y fotoperiodo de 12 horas. Una vez que las plantas de semillero produjeron raíces, se transfirieron las mismas a suelo Metromix estéril. El medio de las plantas in vitro se eliminó por lavado antes de transferir las plantas al suelo. Las plantas se mantuvieron bajo una cubierta de plástico durante una semana para favorecer el proceso de aclimatación. Las plantas se transfirieron luego a una sala de crecimiento donde se incubaron a 25ºC, bajo 150 \mumol m^{-2}s^{-1} de intensidad lumínica y fotoperiodo de 12 horas durante aproximadamente
80 días.

Las plantas transgénicas se investigaron luego respecto a su tolerancia mejorada a la sequía, la sal y/o el frío de acuerdo con el método de investigación descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión de los transgenes confiere tolerancia al estrés.

Ejemplo 11 Manipulación por ingeniería genética de plantas de colza/canola tolerantes al estrés por sobreexpresión de los genes CC-1, CC-2 y CC-3 (CC-2 y CC-3 son ejemplos comparativos)

Se utilizaron los constructos pBPSSY032, pBPSsc335 y pBPSLVM186 para transformar colza/canola como se describe a continuación.

El método de transformación de plantas descrito en esta memoria es aplicable también a Brassica y otras cosechas. Las semillas de canola se esterilizan superficialmente con etanol al 70% durante 4 minutos a la temperatura ambiente con agitación continua mediante sacudidas, seguido por 20% (v/v) de Clorox complementado con 0,05% (v/v) de Tween durante 20 minutos, a la temperatura ambiente con agitación continua mediante sacudidas. A continuación, se lavan las semillas cuatro veces con agua destilada y se ponen sobre papel de filtro estéril húmedo en una cápsula Petri a la temperatura ambiente durante 18 horas. A continuación, se desprenden las cubiertas de las semillas y se secan al aire las semillas durante una noche en una cápsula Petri estéril semi-abierta. Durante este periodo, las semillas pierden aproximadamente 85% de su contenido de agua. Se guardan luego las semillas a la temperatura ambiente en una cápsula Petri sellada hasta su uso ulterior. Los constructos de DNA y la imbibición de los embriones son como se describe en el Ejemplo 10. Se analizan muestras de las plantas transgénicas primarias (T0) por PCR para confirmar la presencia de T-DNA. Estos resultados se confirman por hibridación Southern en la cual el DNA se somete a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1% y se transfiere a una membrana de nailon cargada positivamente (Roche Diagnostics). Se utiliza el Kit de Síntesis de Muestras PCR DIG (Roche Diagnostics) para preparar una sonda marcada con digoxigenina por PCR, y se utiliza de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Las plantas transgénicas se investigan luego res-pecto a su tolerancia mejorada al estrés de acuerdo con el método de investigación descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión de los transgenes confiere tolerancia a la sequía.

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Ejemplo 12 Modificación por bioingeniería de plantas de maíz tolerantes al estrés por sobre-expresión de los genes CC-1, CC-2 y CC-3 (CC-2 y CC-3 son ejemplos comparativos)

Se utilizaron los constructos pBPSSY032, pBPSsc335 y pBPSLVM186 para transformar transformar maíz como se describe a continuación.

La transformación de maíz (Zea mays L.) se realiza por el método descrito por Ishida et al. 1996. Nature Biotch. 14745-50. Los embriones inmaduros se co-cultivan con Agrobacterium tumefaciens que lleva vectores "super-binarios", y las plantas transgénicas se recuperan por organogénesis. Este procedimiento proporciona una eficiencia de transformación comprendida entre 2,5% y 20%. Las plantas transgénicas se investigan luego res-pecto a su tolerancia mejorada a la sequía, la sal y/o el frío de acuerdo con el método de investigación descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión de los transgenes confiere tolerancia al estrés.

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Ejemplo 13 Modificación por bioingeniería de plantas de trigo tolerantes al estrés por sobre-expresión de los genes CC-1, CC-2 y CC-3 (CC-2 y CC-3 son ejemplos comparativos)

Se utilizaron los constructos pBPSSY032, pBPSsc335 y pBPSLVM186 para transformar trigo como se describe a continuación.

La transformación del trigo se realiza por el método descrito por Ishida et al. 1996. Nature Biotch. 14745-50. Los embriones inmaduros se co-cultivan con Agrobacterium tumefaciens que lleva vectores "super-binarios", y se recuperan plantas transgénicas por organogénesis. Este procedimiento proporciona una eficiencia de transformación entre 2,5% y 20%. Las plantas transgénicas se investigan luego respecto a su tolerancia mejorada al estrés de acuerdo con el método de investigación descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión de los transgenes confiere tolerancia a la sequía.

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Ejemplo 14 Identificación de Genes Homólogos y Heterólogos

Pueden utilizarse secuencias de genes para identificar genes homólogos o heterólogos a partir de cDNA o genotecas genómicas. Los genes homólogos (v.g., clones de cDNA de longitud total) pueden aislarse por hibridación de ácido nucleico utilizando por ejemplo genotecas de cDNA. Dependiendo de la abundancia del gen de interés, se extienden en placas 100.000 hasta 1.000.000 de bacteriófagos recombinantes y se transfieren a membranas de nailon. Después de desnaturalización con álcali, se inmoviliza el DNA en la membrana mediante, v.g., reticulación por UV. La hibridación se lleva a cabo en condiciones de alta severidad. En solución acuosa, la hibridación y el lavado se realizan a una concentración iónica de NaCl 1 M y una temperatura de 68ºC. Las sondas de hibridación se generan mediante, v.g., marcación por transcripción radiactiva de la mella (^{32}P) (High Prime, Roche, Mannheim, Alemania). Las señales se detectan por autorradiografía.

Los genes parcialmente homólogos o heterólogos que son afines pero no idénticos pueden identificarse de manera análoga al procedimiento arriba descrito utilizando condiciones de hibridación y lavado a baja severidad. Para la hibridación acuosa, la concentración iónica se mantiene normalmente a NaCl 1 M mientras que la temperatura se reduce progresivamente desde 68 a 42ºC.

El aislamiento de secuencias génicas con homologías (o identidad/similitud de secuencias) únicamente en un dominio diferenciado de (por ejemplo 10-20 aminoácidos) puede realizarse utilizando sondas oligonucleo-tídicas sintéticas radiomarcadas. Los oligonucleótidos radiomarcados se preparan por fosforilación del extremo 5-prima de dos oligonucleótidos complementarios con polinucleótido-quinasa T4. Los oligonucleótidos comple-mentarios se reasocian y se ligan para formar concatémeros. Los concatémeros bicatenarios se someten luego a radiomarcación mediante, por ejemplo, transcripción de la mella. La hibridación se realiza normalmente en condiciones de severidad baja utilizando concentraciones altas de oligonucleótidos.

\newpage

Solución de hibridación de oligonucleótidos:

: 6 x SSC

: Fosfato de sodio 0,01 M

: EDTA 1 mM (pH 8)

: 0,5% de SDS

: 100 \mug/ml de DNA desnaturalizado de esperma de salmón

: 0,1% de leche desnatada desecada.

Durante la hibridación, la temperatura se reduce gradualmente a 5-10ºC por debajo del valor Tm estimado de los oligonucleótidos o hasta la temperatura ambiente, seguido por pasos de lavado y autorradiografía. El lavado se realiza con severidad baja tal como tres pasos de lavado utilizando 4 x SSC. Detalles ulteriores han sido descritos por Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press o Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons.

Ejemplo 15 Identificación de Genes Homólogos por Investigación de Genotecas de Expresión con Anticuerpos

Pueden utilizarse clones de c-DNA para producir proteína recombinante por ejemplo en E. coli (v.g. sistema pQE QIAexpress de Qiagen). Las proteínas recombinantes se purifican luego normalmente por afinidad mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA (Qiagen). Las proteínas recombinantes se utilizan luego para producir anticuerpos específicos, por ejemplo utilizando técnicas estándar para inmunización de conejos. Los anticuerpos se purifican por afinidad utilizando una columna Ni-NTA saturada con el antígeno recombinante como ha sido descrito por Gu et al. 1994 BioTechniques 17: 257-262. El anticuerpo puede utilizarse luego para investigar genotecas de expresión de cDNA a fin de identificar genes homólogos o heterólogos por una investigación inmunológica (Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press o Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).

Ejemplo 16 Mutagénesis in vivo

La mutagénesis in vivo de microorganismos puede realizarse por paso de DNA plasmídico (u otro vector) a través de E. coli u otros microorganismos (v.g., Bacillus spp., o levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae) que están deteriorados en sus capacidades para mantener la integridad de su información genética. Las cepas mutantes típicas tienen mutaciones en los genes para el sistema de reparación de DNA (v.g., mutHLS, mutD, mutT, etc.; para referencia, véase Rupp, W.D. (1996) DNA Repair Mechanisms, en: Escherichia coli and Salmonella, p. 2277-2294, ASM: Washington). Tales cepas son bien conocidas por los expertos en la técnica. El uso de dichas cepas se ilustra, por ejemplo, en Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7: 32-34. La transferencia de moléculas de DNA mutadas a plantas se realiza preferiblemente después de selección y ensayo en microorganismos. Se generan plantas transgénicas de acuerdo con diversos ejemplos comprendidos en la sección de ejemplos de este documento.

Ejemplo 17 Análisis in vitro de la Función de los Genes de Physcomitrella en Organismos Transgénicos

La determinación de las actividades y parámetros cinéticos de las enzimas está bien establecida en la técnica. Los experimentos para determinar la actividad de cualquier enzima alterada dada tienen que adaptarse a la actividad específica de la enzima de tipo salvaje, lo que está perfectamente dentro de la capacidad de un experto en la técnica. Revisiones acerca de enzimas en general, así como detalles específicos concernientes a la estructura, cinética, principios, métodos, aplicaciones y ejemplos para la determinación de muchas actividades enzimáticas pueden encontrarse, por ejemplo, en las referencias siguientes:

101

La actividad de las proteínas que se fijan a DNA puede medirse por varios métodos bien establecidos, tales como los ensayos de desplazamiento de bandas de DNA (denominados también ensayos de retardación de gel). El efecto de tales proteínas sobre la expresión de otras moléculas puede medirse utilizando ensayos de genes informadores (tales como el descrito en Kolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14: 3895-3904 y las referencias citadas en dicho lugar). Los sistemas de ensayo de genes informadores son bien conocidos y están bien establecidos para aplicaciones en células tanto pro- como eucariotas, utilizando enzimas tales como \beta-galactosidasa, proteína fluorescente verde, y varias otras.

La determinación de la actividad de las proteínas de transporte de membrana puede realizarse de acuerdo con técnicas tales como las descritas en Gennis R.B. Pores, Channels and Transporters, en Biomembranes, Molecular Structure and Function, pp. 85-137, 199-234 y 270-322, Springer: Heidelberg (1989).

Ejemplo 18 Purificación del Producto Deseado a partir de Organismos Transformados

La recuperación del producto deseado a partir de material de plantas (a saber, Physcomitrella patens o Arabidopsis thaliana), hongos, algas, ciliados, células de C. glutamicum, u otras células bacterianas transformadas con las secuencias de ácido nucleico descritas en esta memoria, o el sobrenadante de los cultivos arriba descritos puede realizarse por diversos métodos bien conocidos en la técnica. Si el producto deseado no es secretado por las células, puede recogerse del cultivo por centrifugación a baja velocidad, y las células pueden lisarse por técnicas estándar, tales como fuerza mecánica o tratamiento por ultrasonidos. Los órganos de las plantas pueden separarse mecánicamente de otros tejidos u órganos. Después de la homogeneización, se separan por centrifugación los residuos celulares, y la fracción sobrenadante que contiene las proteínas solubles se retiene para purificación ulterior del compuesto deseado. Si el producto es secretado por las células deseadas, entonces las células se separan del cultivo por centrifugación a baja velocidad, y la fracción sobrenadante se retiene para purificación ulterior.

La fracción sobrenadante de cualquier método de purificación se somete a cromatografía con una resina adecuada, en la cual la molécula deseada es retenida sobre una resina cromatográfica mientras que muchas de las impurezas contenidas en la muestra no lo son, o donde las impurezas son retenidas por la resina mientras que la muestra no lo es. Dichos pasos de cromatografía pueden repetirse en caso necesario, utilizando las mismas o diferentes resinas cromatográficas. Un experto en la técnica estaría perfectamente versado en la selección de resinas cromatográficas apropiadas y en su aplicación más eficaz para la purificación de una molécula particular. El producto purificado puede concentrarse por filtración o ultrafiltración, y guardarse a una temperatura a la cual se maximiza la estabilidad del producto.

Existe una extensa serie de métodos de purificación conocidos en la técnica y el método precedente de purificación no debe considerarse como limitante. Dichas técnicas de purificación se describen, por ejemplo, en Bailey, J.E. & Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: Nueva York (1986). Adicional-mente, la identidad y pureza de los compuestos aislados pueden evaluarse por métodos estándar en la técnica. Éstos incluyen cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), métodos espectroscópicos, métodos de tinción, cromatografía en capa delgada, NIRS, ensayo enzimático, o microbiológicamente. Dichos métodos de análisis han sido revisados en: Patek et al.

102

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<110> BASF PLANT SCIENCE GMBH

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<120> PROTEINAS RELACIONADAS CON EL ESTRES DEL CICLO CELULAR Y METODOS DE UTILIZACION EN PLANTAS

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<130> 16313-0035

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<140> PCT/USO1/11294

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<141> 2001-04-06

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<150> 60/196,001

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<151> 2000-04-07

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<160> 34

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 887

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<212> DNA

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<213> Physcomitrella patens

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<220>

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<221> base_modificada

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<222> (71)

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<223> a, t, c, g, otra o desconocida

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<400> 1

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10

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<210> 2

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<211> 723

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<212> DNA

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<213> Physcomitrella patens

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<400> 2

11

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<210> 3

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<211> 566

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<212> DNA

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<213> Physcomitrella patens

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<400> 3

12

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<210> 4

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<211> 1564

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<212> DNA

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<213> Physcomitrella patens

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<400> 4

13

14

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<210> 5

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<211> 4348

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<212> DNA

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<213> Physcomitrella patens

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<400> 5

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15

16

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<210> 6

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<211> 2237

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<212> DNA

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<213> Physcomitrella patens

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<400> 6

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17

18

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<210> 7

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<211> 442

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<212> PRT

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<213> Physcomitrella patens

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<400> 7

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19

20

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<210> 8

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<211> 901

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<212> PRT

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<213> Physcomitrella patens

\newpage

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<400> 8

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21

22

23

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<210> 9

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<211> 698

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<212> PRT

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<213> Physcomitrella patens

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<400> 9

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24

25

26

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<210> 10

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<211> 18

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

caggaaacag ctatgacc

\hfill

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<210> 11

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<211> 19

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 11

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ctaaagggaa caaaagctg

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<210> 12

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<211> 18

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 12

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tgtaaaacga cggccagt

\hfill

18

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<210> 13

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 13

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gcgatatcga cccaaggtgt gtagagaagg ggat

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34

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<210> 14

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<211> 33

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 14

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gcgagctcgc gactgatgca actcacccat gaa

\hfill

33

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<210> 15

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 15

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\hskip-.1em\dddseqskip

cccaaatgct tggagccagc gacct

\hfill

25

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<210> 16

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacgtgcacg caatcgatgt aggtc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtcgacccc tgtcagactt cttga

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

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\hskip-.1em\dddseqskip

atggcgcgcc gcactcacgt gaggaattgc acctcc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

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<211> 32

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagctctg ggaattgcgc atgggaaact gg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggctaccc aaaccgcgtc ggaga

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

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<211> 35

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 21

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\hskip-.1em\dddseqskip

atcccgggtg atacgttgtg catatttggt gttgc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

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<211> 32

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 22

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagctctg atacaagagc gtcgatgctc ca

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 23

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcgctgcaga tttcatttgg agaggacacg

\hfill

30

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<210> 24

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<211> 35

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 24

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggccggc ctcagaagaa ctcgtcaaga aggcg

\hfill

35

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<210> 25

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 25

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\hskip-.1em\dddseqskip

gctgacacgc caagcctcgc tagtc

\hfill

25

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<210> 26

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<211> 33

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 26

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagctcgc gactgatgca actcacccat gaa

\hfill

33

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<210> 27

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<211> 32

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 27

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagctctg ggaattgcgc atgggaaact gg

\hfill

32

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<210> 28

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<211> 32

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

<2235 Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 28

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagctctg atacaagagc gtcgatgctc ca

\hfill

32

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<210> 29

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 29

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\hskip-.1em\dddseqskip

gatggtgatg gtgacagcga ggatc

\hfill

25

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<210> 30

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 30

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgacgtgaag cctcgctctc atttcc

\hfill

26

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<210> 31

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<211> 28

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 31

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgatctcctt caagggaacc tagtgctg

\hfill

28

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<210> 32

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 32

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\hskip-.1em\dddseqskip

gagttcacgc atgtgcaccg atgct

\hfill

25

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 33

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cgtagcgtct tccaggatgt cctac

\hfill

25

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<210> 34

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 34

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcttggcctc gtctactccc gcaac

\hfill

25

Claims

1. Una célula de planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de una Proteína Relacionada con el Estrés del Ciclo Celular (CCSRP), en donde la CCSRP se selecciona del grupo constituido por CC-1 como se define en SEQ ID NO:7 y un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:7 en toda su longitud, y en donde la expresión del ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado una tolerancia incrementada de la célula de la planta al estrés por sequía y/o por helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la planta.

2. La célula de la planta transgénica de la reivindicación 1, en donde la CCSRP es como se define en SEQ ID NO:7.

3. La célula de la planta transgénica de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico codificante de CCSRP es como se define en SEQ ID NO:4.

4. La célula de la planta transgénica de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico codificante de CCSRP tiene al menos 80-90% de identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO:4 en toda su región codificante.

5. La célula de la planta transgénica de la reivindicación 1, en donde la planta es una monocotiledónea.

6. La célula de la planta transgénica de la reivindicación 1, en donde la planta es una dicotiledónea.

7. La célula de la planta transgénica de la reivindicación 1, en donde la planta se selecciona del grupo constituido por maíz, trigo, centeno, avena, trigo híbrido, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, colza, canola, mandioca, pimienta, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, eEspecies de Vicia, guisante, alfalfa, café, cacao, té, eEspecies de Sálix, palma de aceite, cocotero, hierbas perennes y cosechas forrajeras.

8. Una planta transgénica que comprende una célula de planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Una semilla producida por una planta transgénica que comprende una célula de planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la semilla es progenie auténtica para una tolerancia incrementada al estrés por sequía y/o helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la planta.

10. Uso de una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 8 o una semilla de acuerdo con la reivindicación 9, para la fabricación de un producto agrícola.

11. Una proteína relacionada con el Estrés del Ciclo Celular (CCSRP) aislada, en donde la CCSRP se selecciona del grupo constituido por una proteína del Ciclo Celular-1 (CC-1) como se define en SEQ ID NO:7 y un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:7 en toda su longitud, y en donde la expresión del ácido nucleico en una planta da como resultado la tolerancia incrementada de la planta al estrés por sequía o helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

12. La CCSRP de la reivindicación 11, en donde la CCSRP es como se define en SEQ ID NO:7.

13. Un ácido nucleico codificante de una PROTEÍNAa Relacionada con el Estrés del ciclo Celular (CCSRP) aislado, en donde el ácido nucleico codificante de CCSRP codifica una CCSRP seleccionada del grupo constituido por una proteína del Ciclo Celular-1 (CC-1) como se define en SEQ ID NO:7 y un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:7 en toda su longitud.

14. El ácido nucleico codificante de CCSRP de la reivindicación 13, en donde el ácido nucleico codificante de CCSRP es como se define en SEQ ID NO:4.

15. El ácido nucleico codificante de CCSRP de la reivindicación 13, en donde el ácido nucleico codificante de CCSRP tiene al menos 80-90% de identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO:4 en toda su región codificante.

16. Un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico de las reivindicaciones 13, 14 ó 15, en donde la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora da como resultado la tolerancia incrementada de la célula hospedadora al estrés por sequía y/o helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora.

17. Un método de producción de una planta transgénica que contiene un ácido nucleico codificante de una Proteína Relacionada con el Estrés del Ciclo Celular (CCSRP), en donde la expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado una tolerancia incrementada de la planta a la sequía y/o el estrés en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta, que comprende,

a.: transformar una célula de la planta con un vector de expresión que comprende el ácido nucleico, y

b.: generar a partir de la célula de la planta una planta transgénica con una tolerancia incrementada al estrés por sequía y/o helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta,

en donde la CCSRP se selecciona del grupo constituido por la proteína del Ciclo Celular-1 (CC-1) como se define en SEQ ID NO:7 y un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO:7 en toda su longitud.

18. El método de la reivindicación 17, en donde la CCSRP es como se define en SEQ ID NO:7.

19. El método de la reivindicación 17, en donde el ácido nucleico codificante de CCSRP es como se define en SEQ ID NO:4.

20. El método de la reivindicación 17, en donde el ácido nucleico codificante de CCSRP tiene al menos 80-90% de identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO:4 en toda su región codificante.

21. Un método de modificación de la tolerancia al estrés de una planta, que comprende modificar la expresión de una Proteína Relacionada con el Estrés del Ciclo Celular (CCSRP) en la planta, en donde la CCSRP se selecciona del grupo constituido por la proteína del Ciclo Celular-1 (CC-1) como se define en SEQ ID NO:7 y un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO:7 en toda su longitud, y en donde la modificación de la expresión del ácido nucleico de CCSRP en la planta da como resultado la tolerancia modificada de la planta al estrés por sequía y/o helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

22. El método de la reivindicación 21, en donde la CCSRP es como se define en SEQ ID NO:7.

23. El método de la reivindicación 21, en donde el ácido nucleico codificante de CCSRP es como se define en SEQ ID NO:4.

24. El método de la reivindicación 21, en donde el ácido nucleico codificante de CCSRP tiene al menos 80-90% de identidad de secuencia con una secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO:4 en toda su región codificante.

25. El método de la reivindicación 21, en donde la tolerancia al estrés se reduce.

26. El método de la reivindicación 21, en donde la planta no es transgénica.

27. El método de la reivindicación 21, en donde la planta es transgénica.

28. El método de la reivindicación 27, en el cual la planta se transforma con un promotor que dirige la expresión de la CCSRP.

29. El método de la reivindicación 28, en donde el promotor es específico de tejido.

30. El método de la reivindicación 28, en donde el promotor está regulado evolutivamente.