ES2286886T3 - Expresion de peptidos eucarioticos en plastidos de plantas. - Google Patents
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Abstract
Un constructo que comprende los componentes siguientes en la dirección 5'' a 3'' de la transcipción: a) una secuencia promotora del operón ARN ribosómico 16S (Prrn); b) un sitio de unión al ribosoma unido a dicho componente promotor (a), en el que dicho sitio de unión al ribosoma obtenido a partir de la secuencia conductora del gen 10 del bacteriófago T7; c) una secuencia de ADN que codifica un péptido obtenido a partir de un organismo eucariótico; y d) una región de terminación de transcripción, en el que dicho péptido eucariótico es distinto de un péptido de una planta.
Description
Expresión de péptidos eucarióticos en plástidos
de plantas.
Esta invención se refiere a la aplicación de
técnicas de ingeniería genética a plantas. Específicamente, la
invención se refiere a composiciones y procedimientos para potenciar
la expresión de proteínas en plástidos de plantas.
Los plástidos de plantas superiores son una
diana atractiva para la ingeniería genética. Los plástidos de
plantas (cloroplastos, amiloplastos, elaioplastos, etioplastos,
cromoplastos, etc.) son los centros de biosíntesis principales que,
además de la fotosíntesis, son responsables de la producción de
compuestos industrialmente importantes tales como aminoácidos,
carbohidratos complejos, ácidos grasos, y pigmentos. Los plástidos
derivan a partir de un precursor común conocido como un
protoplástido y, de acuerdo con ello, los plástidos presentes en
una especie de planta dada tienen todos el mismo contenido genético.
Las células de plantas contienen 500-10.000 copias
de un pequeño genoma circular de 120-160 kilobases,
cada molécula del cual tiene una repetición invertida grande (de
aproximadamente 25 kb). De acuerdo con ello, es posible manipular
mediante ingeniería genética células de plantas para que contengan
hasta 20.000 copias de un gen particular de interés que
potencialmente pueda dar como resultado muy altos niveles de
expresión de gen extraño. Además, los plástidos de la mayoría de
las plantas son maternalmente heredados. En consecuencia, a
diferencia de los genes heterólogos expresados en el núcleo, los
genes heterólogos expresados en plástidos no son diseminados por el
polen y, por ello, un rasgo introducido dentro de un plástido de
una planta no será transmitido a parientes de tipo salvaje.
Existe aún una necesidad de mejorar los
elementos reguladores para la expresión de genes en un plástido de
planta. Hasta la fecha, las señales de expresión usadas de manera
rutinaria para la expresión de transgenes de plástidos derivan a
partir de genes de plástidos endógenos. Las señales de expresión de
plástidos derivan típicamente a partir de regiones promotoras de
genes de plástidos altamente expresados tales las regiones
promotoras procedentes del operón ARN ribosómico 16S (Prrn),
el gen psbA (PpsbA) o el gen rbcL (PrbcL). Los genes psbA y rbcL
están altamente transcriptos, pero su traducción está controlada por
factores específicos del tejido y regulados por la luz que limitan
su utilidad. En el caso del Prrn, se ha usado típicamente
para dirigir la traducción un sitio de unión al ribosoma sintético
(RBS) usado como molde después del conductor del gen rbcL de
plástido. Sin embargo, este Prrn/RBS no está traducido de
manera eficaz debido a la pobre unión al ribosoma.
Los plástidos de plantas superiores presentan
una diana atractiva para la ingeniería genética. Tal como se ha
mencionado anteriormente, los plástidos de las plantas superiores
son maternalmente heredados. Esto ofrece una ventaja para la
ingeniería genética de plantas para la tolerancia o la resistencia a
condiciones naturales o químicas, tales como tolerancia a
herbicidas, ya que sus rasgos no serán transmitidos a parientes de
tipo salvaje. Además, el alto nivel de expresión de gen extraño es
atractivo para la manipulación mediante ingeniería genética de
rasgos tales como la producción de proteínas importantes
farmacéuticamente.
La expresión de secuencias de ácido nucleico que
codifican enzimas que proporcionan tolerancia herbicidas así como
proteínas farmacéuticas a partir del genoma del plástido de plantas
ofrece una alternativa atractiva a la expresión a partir del genoma
nuclear de plantas.
La presente invención proporciona secuencias de
ácidos nucleicos útiles en la potenciación de la expresión de una
amplia variedad de genes, tanto eucarióticos como procarióticos, en
plástidos de plantas. Además, se proporcionan constructos de
expresión de plástidos que son útiles para la ingeniería genética de
células de plantas y que proporcionan la expresión potenciada de
proteínas EPSP sintasa o la proteína hGH en plástidos de células
de plantas. Los plástidos transformados deberían ser plástidos
activos metabólicamente, y preferiblemente mantenidos a un alto
número de copias en el tejido de la planta de interés, lo más
preferiblemente los cloroplastos que se encuentran en los tejidos
de las plantas verdes, tales como hojas y cotiledones.
De acuerdo con ello, la invención
proporciona:
(1) un constructo que comprende los componentes
siguientes en la dirección 5' a 3' de la transcipción:
- a)
- una secuencia promotora del operón ARN ribosómico 16S (denominado aquí más adelante "Prrn");
- b)
- un sitio de unión al ribosoma unido a dicho componente promotor (a), en el que dicho sitio de unión al ribosoma está derivado a partir de la secuencia conductora del gen 10 del bacteriófago T7;
- c)
- una secuencia de ADN que codifica un péptido derivado a partir de un organismo eucariótico; y
- d)
- una región de terminación de transcripción,
en el que dicho péptido eucariótico es distinto
de un péptido de una planta;
(2) un procedimiento de producción de una
proteína en una célula de una planta, en el que dicho procedimiento
comprende la transformación de los plástidos de dicha célula de
planta con un constructo que comprende lo siguiente como
componentes unidos de manera operable en la dirección 5' a 3' de
transcripción:
- a)
- una secuencia promotora del operón ARN ribosómico 16S (Prrn);
- b)
- un sitio de unión al ribosoma unido a dicho componente promotor (a), en el que dicho sitio de unión al ribosoma está derivado a partir de la secuencia conductora del gen 10 del bacteriófago T7;
- c)
- una secuencia de ADN que codifica un péptido derivado a partir de una célula eucariótica distinta de un péptido de un plástido de una planta; y
- d)
- una región de terminación de transcripción,
y el crecimiento de células de plantas que
comprenden dichos plastidios transformados bajo condiciones en las
que dicha secuencia que codifica el ADN está expresada para producir
dicho péptido eucariótico en dicho plástido;
(3) un procedimiento para la producción de una
proteína N-terminal no metionina en un plástido, en
el que dicho procedimiento comprende:
la transformación de un plástido con un
constructo que comprende, como componentes unidos de manera operable
en la dirección 5' a 3' de transcripción:
- a)
- una secuencia promotora del operón ARN ribosómico 16S (Prrn);
- b)
- un sitio de unión al ribosoma unido a dicho componente promotor (a), en el que dicho sitio de unión al ribosoma está derivado a partir de la secuencia conductora 10 del gen bacteriófago T7;
- c)
- una secuencia de ADN que codifica un péptido ubiquitina escindible,
- d)
- una secuencia de ADN que codifica una proteína de interés, y
- e)
- una región de terminación de transcripción; y
el crecimiento de una célula de planta que
comprende dicho plástido transformado bajo condiciones adecuadas
para la expresión de dicha proteína de interés y dicha secuencia
ubiquitina escindible en dicho plástido; y
(4) un procedimiento de producción de una
proteína N-terminal no metionina en un plástido, en
el que dicho procedimiento comprende:
la transformación de un plástido con un
constructo que comprende, como componentes unidos de manera operable
en la dirección 5' a 3' de transcripción:
- a)
- una secuencia promotora del operón ARN ribosómico 16S (Prrn);
- b)
- un sitio de unión al ribosoma unido a dicho componente promotor (a), en el que dicho sitio de unión al ribosoma está derivado a partir de la secuencia conductora del gen 10 del bacteriófago T7;
- c)
- una secuencia de ADN que codifica una proteína de interés, en el que dicha proteína de interés es capaz de ser reconocida por una metionina amino peptidasa de célula de planta, y
- d)
- una región de terminación de transcripción; y
el crecimiento de una célula de planta que
comprende dicho plástido transformado bajo condiciones adecuadas
para la expresión de dicha proteína de interés que tiene una
N-terminación no metionina.
Los constructos de expresión de plástidos para
uso en esta invención incluyen una región promotora de plástido
capaz de proporcionar la expresión potenciada de una secuencia de
ADN, una secuencia de ADN que codifica una proteína EPSP o una
hormona del crecimiento humano (hGH), y una región de terminación de
la transcripción capaz de terminar la transcripción en un plástido
de planta.
La región promotora del plástido de la presente
invención está ligada a un sitio de unión al ribosoma que
proporciona la traducción potenciada de transcriptos de ARNm en un
plástido de planta.
El constructo de expresión de plástido de esta
invención está ligado, preferiblemente, a un constructo que tiene
una secuencia de ADN que codifica un marcador seleccionable que
puede expresarse en un plástido de planta. La expresión del
marcador seleccionable permite la identificación de células de
plantas que comprenden un plástido que expresa el marcador.
En una realización preferida, los vectores para
la transferencia del constructo dentro de una célula de planta
incluyen medios para la inserción de los constructos de expresión y
selección dentro del genoma del plástido. Preferiblemente, los
vectores comprenden regiones de homología con el genoma del plástido
diana que flanquean a los constructos.
Los constructos de la presente invención
comprenden una secuencia promotora Prrn ligada a un sitio de unión
al ribosoma capaz de potenciar la traducción de transcriptos de ARNm
en el plástido de planta. El sitio de unión al ribosoma está
derivado a partir de la secuencia conductora del gen 10 del
bacteriófago T7.
De particular interés en la presente invención
es el alto nivel de expresión de secuencias de ácido nucleico en
plástidos de plantas. De particular interés es el alto nivel de
expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican enzimas
implicadas en la tolerancia a herbicidas y que codifican proteínas
farmacéuticas.
Los constructos de la presente invención
comprenden, preferiblemente, una secuencia de ADN que codifica
5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato
sintasa (Patente de EE.UU. 5.633.435), nitrilasa, fitoeno
desaturasa, aprotinina o una secuencia de ADN que codifica la
hormona del crecimiento humano (Patente de EE.UU. 5.424.199).
Los plástidos de células de plantas que
contienen los constructos están igualmente contemplados en la
invención, tal como son las plantas, semillas de plantas, células
de plantas o progenies de las mismas que contienen en plástidos que
comprenden el constructo.
La presente invención incluye, igualmente,
procedimientos para la expresión potenciada de secuencias de ADN en
plástidos de plantas.
La invención incluye, igualmente, un
procedimiento para la expresión potenciada de una enzima que
codifica la hGH en plástidos de la célula de la planta.
La presente invención incluye, además,
procedimientos para la obtención de una proteína expresada a partir
de una célula de planta, incluyendo un plástido, que tiene un
N-terminal no metionina. Además, se contemplan
células de plantas y plástidos que incluyen proteínas
N-terminales no metionina.
De acuerdo con ello, la presente invención se
refiere a un gen quimérico que contiene una secuencia que codifica
una proteína farmacéutica, un vector de expresión de plástido de
planta que contiene un promotor Prrn ligado de manera operable a un
sitio de unión al ribosoma del gen 10 polimerasa del bacteriófago T7
capaz de expresión potenciada en un plástido de planta ligado de
manera operable a un gen que codifica la tolerancia a herbicidas o
compuestos farmacéuticos, un vector de transformación de plantas que
tiene insertado en él un gen que codifica la tolerancia a
herbicidas o producto farmacéutico expresado a partir de un promotor
Prrn ligado a un sitio de unión al ribosoma del gen 10 polimerasa
del bacteriófago T7, células de plantas transformadas usando dichos
vectores y plantas regeneradas a partir de los mismos que muestran
un grado substancial de expresión de secuencias de ácido nucleico y
proteínas y procedimientos para la producción de dichas plantas y
dichas plantas.
La Figura 1 muestra la secuencia nucleótida del
sitio de unión al ribosoma G10L.
La Figura 2 proporciona una secuencia de
aminoácidos que codifica la aprotinina.
La Figura 3 proporciona los resultados del
análisis mediante RP-HPLC para la caracterización de
la proteína de lhGH expresada en el plástido. El pico I (pico más
alto) indica el tiempo de retención esperado para la GP2000 de 22
kDa nativa, adecuadamente plegada.
La Figura 4 proporciona un análisis mediante
espectrometría de masas (EM) de ionización por electropulverización
usando un espectrómetro de masa de duración de la trayectoria por
electropulverización Micromass Q-Tof. En
particular, se proporcionan unas series de iones que corresponden a
las especies presentes en la muestra con números variables de
protones unidos. Los ejes del espectro son intensidad frente a la
relación masa a carga de las especies presentes.
La Figura 5 proporciona una representación
gráfica de la bioactividad de la hGH expresada a partir de un
plástido de planta. Las muestras representadas sobre el gráfico son
prolactina bovina (bPL), hGH expresada a partir de E. coli
(Ala-hGH), y transgénico nulo inoculado con
prolactina bovina (SPFF nulo inoculado) como controles positivos,
un transgénico nulo (SPFF nulo) como un control negativo, y muestras
transgénicas a partir de una columna de Sepharosa (SPFF muestra,
SPFF muestra) y una muestra transgénica eluida a partir de la
columna de Sepharosa a pH 3,5 (SPFF pH3,5 Eln).
De acuerdo con el sujeto de la invención, se
proporcionan constructos de expresión de plástidos que comprenden
un promotor Prrn que es funcional en un plástido de planta, un sitio
de unión al ribosoma derivado a partir del conductor del gen 10
polimerasa del bacteriófago T7, una secuencia de ADN que codifica un
gen de interés, y una región de terminación de transcripción capaz
de terminación de la transcripción en un plástido de planta. Estos
elementos se proporcionan como componentes unidos de manera operable
en la dirección 5' a 3' de transcripción.
Además, los constructos de la presente invención
pueden incluir igualmente una secuencia de ácido nucleico que
codifica un péptido capaz de identificar dicha secuencia de ADN que
codifica una proteína contra el lumen tilacoide dentro del
cloroplasto.
De particular interés en la presente invención
son procedimientos para la producción de proteínas en un plástico
de célula de planta huésped que tiene un N-terminal
no metionina. Generalmente, dichos procedimientos implican el uso
de proteínas de fusión que tienen una secuencia
N-terminal que está reconocida por una proteasa
endógena. En particular, una secuencia de ADN que codifica un
péptido ubiquitina escindible está fusionada a una secuencia de ADN
que codifica una proteína de interés. Después de la expresión de la
proteína de fusión en el plástido, una proteasa endógena actúa
sobre la fusión para escindir la porción ubiquitina de la
proteína.
Igualmente de interés en la presente invención
es el uso de constructos de expresión de plástidos para dirigir la
transcripción y traducción (expresión) de alto nivel de secuencias
de ácidos nucleicos. Dichos constructos de expresión de plástidos
encuentran su uso en la dirección de la expresión de alto nivel de
secuencias de ADN que codifican enzimas implicadas en la tolerancia
a herbicidas o que codifican la producción de proteínas
farmacéuticas.
De interés más particular en la presente
invención es el uso de los constructos de expresión de plástidos
para dirigir la traducción de alto nivel del ARN mensajero
transcrito.
La secuencia de ADN y los datos bioquímicos
revelan una similitud de las maquinarias de transcripción y
traducción de los orgánulos de plástidos y de las señales de
iniciación con los encontrados en sistemas procarióticos. De hecho,
se ha informado que las secuencias promotoras derivadas de plástidos
dirigen la expresión de genes informadores en células
procarióticas. Además, los genes de plástidos están frecuentemente
organizados dentro de operones policistrónicos tal como existen en
procariotes.
A pesar de las aparentes similitudes entre
plástidos y procariotes, existen diferencias fundamentales en los
procedimientos usados para controlar la expresión de genes en
plástidos y procariotes. En oposición a los mecanismos de control
de transcripciones típicamente observados en procariotes, la
expresión del gen del plástido está predominantemente controlada al
nivel de traducción y estabilidad del ARNm mediante proteínas
codificadas de trans-actuacion nuclear.
La traducción es un procedimiento
multi-etapa que implica, primeramente, la unión del
ARN mensajero (ARNm) a ribosomas. Comenzando por el codón iniciador
de la traducción, los codones ARNm se leen secuencialmente conforme
los ribosomas se desplazan a lo largo de la molécula de ARNm. A
continuación, los aminoácidos especificados se agregan
secuencialmente a la cadena péptida en desarrollo para proporcionar
la proteína o polipéptido codificado en el ARNm.
Tal como se ha mencionado, la primera etapa en
el procedimiento de traducción es la unión de la molécula de ARNm
al ribosoma. La naturaleza de esta interacción (es decir, unión) ha
sido únicamente descubierta parcialmente. El análisis de
oligonucleótdos resistentes a ARNasa aislada a partir de complejos
de iniciación de traducción bacterianos, indica que un fragmento de
ARN de aproximadamente 30 a 40 nucleótidos de longitud comprende el
sitio de unión al ribosoma (RBS) inicial. De acuerdo con ello, se
entiende aquí más adelante que un RBS comprende una secuencia de
ARNm que rodea el codón iniciador de traducción, el cual es
responsable de la unión al ribosoma y de la iniciación de
traducción.
Recientemente, se han identificado sitios de
unión a ribosomas que son capaces de dirigir la traducción en
procariotes. Por ejemplo, se ha identificado un sitio de unión al
ribosoma a partir del conductor del gen 10 del bacteriófago T7,
G10L (Patente de EE.UU. 5.232.840), el cual potencia la expresión de
secuencias de ácido nucleico en procariotes.
Los herbicidas tales como
N-fosfonometilglicina, hidroxibenzonitrilos
halogenas, y norflurazon, han sido el objeto de una gran cantidad
de investigaciones.
La N-fosfonometilglicina,
comúnmente denominada como glifosato, inhibe la vía del ácido
siquímico que conduce a la biosíntesis de compuestos aromáticos que
incluyen aminoácidos, hormonas de plantas y vitaminas.
Específicamente, el glifosato reprime la conversión del ácido
fosfoenolpirúvico (PEP) y el ácido 3-fosfosiquímico
a ácido
5-enolpiruvil-3-fosfosiquímico
mediante la inhibición de la enzima
5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato
sintasa (denominada aquí más adelante como EPSP sintasa o
EPSPS).
Se han producido plantas tolerantes al glifosato
mediante la transformación de diversos genes de EPSP sintasa dentro
del genoma nuclear de una planta. Se ha clonado un gen de EPSP
sintasa a partir de Agrobacterium tumefaciens sp cepa CP4
(Patente de EE.UU. 5.633.435) y confiere un alto nivel de tolerancia
al glifosato en plantas. Además, se han logrado altos niveles de
tolerancia al glifosato en un cierto número de plantas de cultivo
mediante la fusión de EPSPS a un péptido de tránsito de cloroplasto
(CTP) para expresión dirigida en plástidos. Además, se han aislado
variantes de la enzima EPSPS de tipo salvaje que son tolerantes al
glifosato como un resultado de alteraciones en la secuencia que
codifica los aminoácidos de EPSPS (Kishore y Shah, Ann. Rev.
Biochem., vol. 57, págs. 627-663, (1988); Shulze
y otros, Arch. Microbiol., vol. 137, págs.
121-123, (1984); Kishore y otros, Fed.
Proc., vol 45, pág. 1506, (1986)). Típicamente, estas variantes
tienen un K_{i} más alto por el glifosato que la enzima EPSPS de
tipo salvaje la cual confiere fenotipo tolerante al glifosato, pero
estas variantes se caracterizan igualmente por un K_{m} alto para
PEP lo cual hace que la enzima sea cinéticamente menos eficaz
(Kishore y Shah, Ann. Rev. Biochem., vol. 57, págs.
627-663, (1988); Sost y otros, FEBS Lett.,
vol. 173, págs. 238-241, (1984); Shulze y otros,
Arch. Microbiol., vol. 137, págs. 121-123,
(1984); Kishore y otros, Fed. Proc., vol. 45, pág. 1506,
(1986); Sost y Amrhein, Arch. Biochem. Biophys., vol. 282,
págs. 433-436, (1990)).
Además de las plantas manipuladas genéticamente
para su tolerancia al glifosato, se han manipulado genéticamente
plantas para tolerar otras clases de herbicidas tales como
hidroxibenzonitrilos halogenados, y norflurazon, usando secuencias
de ácido nucleico expresadas en el núcleo.
Los hidroxibenzonitrilos halogenados, tal como
Bromoxinil, se ha sugerido que actúan herbecidamente mediante la
inhibición del complejo de proteína de unión con quinona del
fotosistema II, mediante la inhibición de la transferencia de
electrones (Van Rensen, Physiol. Plant, vol. 54, págs.
515-520, (1982), y Sanders y Pallett, Pestic.
Biochem. Physiol., vol. 26, págs. 116-122,
(1986)). Los herbicidas tal como norflurazon inhiben la producción
de carotenoides.
Se han producido plantas que son resistentes al
Bromoxynil mediante la expresión de secuencias de ADN que codifican
enzimas capaces de destoxificación del Bromoxynil (nitrilasas) en el
núcleo de la célula de la planta. Las secuencias de ADN que
codifican dichas nitrilasas han sido clonadas a partir de bacterias
tal como Klebsiella pneumoniae y usadas para construir
vectores para dirigir la expresión de la secuencia de ADN en el
núcleo de la célula de la planta (Patente de EE.UU. 4.810.648).
Se han manipulado genéticamente plantas que son
resistentes al Norflurazon, mediante la expresión de secuencias de
ácido nucleico que codifican enzimas en la vía de la biosíntesis de
carotenoides en núcleos de células de plantas. Por ejemplo, la
expresión de una fitoeno desaturasa a partir de Erwinia
uredovora proporciona tolerancia al Norflurazon.
Aunque las plantas transformadas para expresar
secuencias de ácido nucleico que codifican duchas enzimas a partir
del genoma nuclear han encontrado utilidad en la manipulación
genética de plantas tolerantes a herbicidas, sería con creces
beneficioso obtener plantas tolerantes a herbicidas mediante la
expresión de plástidos.
En los ejemplos aquí proporcionados, las
secuencias de ADN que codifican enzimas implicadas en la tolerancia
a herbicidas se han usado en constructos para dirigir la expresión
de las secuencias a partir del plástido de la planta. Las
secuencias de ADN que codifican la
5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS), bromoxinil nitrilasa (Bxn), fitoeno desaturasa
(crtI (Misawa y otros, Plant Journal, vol. 4, págs.
833-840, (1993), y Plant Jour, vol. 6, págs.
481-489, (1994)), y acetohidroxiácido sintasa (AHAS
(Sathasiivan y otros, Nucl. Acids Res., vol. 18, págs.
2188-2193, (1990)) se usan en los constructos de
expresión de la presente invención para dirigir la expresión de
dichas secuencias nucleótidas de tolerancia al herbicida procedentes
del plástido de la planta.
Se han identificado plantas de tabaco
transplastómicas que son homoplásmicas para las secuencias de ADN
que codifican los genes de tolerancia al herbicida. Las plantas
homoplásmicas demuestra un alto nivel de expresión de proteína a
partir del plástido. Además, las plantas homoplásmicas demuestran un
alto nivel de tolerancia por el herbicida respectivo. Por ejemplo,
tal como se describe con más detalle en el ejemplo más adelante,
las plantas transformadas para expresar EPSPS a partir del plástido
demuestran un alto nivel de tolerancia por el glifosato herbicida.
Además, las líneas de tabaco homoplásmicos que expresan nitrilasa o
fitoeno desaturasa demuestran altos niveles de tolerancia por los
herbicidas Bromoxynil y Norflurazon, respectivamente.
Un técnico experto en la técnica al cual
pertenece la presente invención, reconocerá que pueden usarse
secuencias adicionales en los constructos de expresión de plástidos
de la actual invención para producir plantas tolerantes a
herbicidas. Otra secuencia de ácido nucleico que puede encontrar uso
en los constructos de expresión de plástidos de plantas tolerantes
a herbicidas incluye el gen bar para tolerancia al
glufosinato (DeBlock y otros, EMBO J., vol. 6, págs.
2513-2519, (1987)).
Aún más, pueden usarse genes de tolerancia al
glifosato adicionales en los constructos de la presente invención.
Los genes EPSPS tolerantes al glifosato adicionales se describen en
la Patente de EE.UU. No. 5.627.061, en Padgette y otros,
Herbicide Resistant Crops, Lewis Publishers, págs.
53-85, (1996), y en Penaloza-Vazquez
y otros, Plant Cell Reports, vol. 14, págs.
482-487, (1995).
Debería indicarse que los constructos de
tolerancia a herbicidas de la presente invención pueden incluir
igualmente secuencias que codifican genes implicados en otros genes
de tolerancia al estrés, por ejemplo genes de resistencia/tolerancia
a insectos o enfermedades. Tal como se describe con más detalle en
los ejemplos que siguen, se han usado constructos de expresión de
plástidos para regenerar plantas que son resistentes al herbicida
Buctril, y que igualmente expresan la proteína cry1Ac del
Bacillus thuringensis.
Además, los constructos de expresión de
plástidos encuentran uso igualmente en la dirección de la producción
de proteínas biológicas humanas (proteínas farmacéuticas) a partir
del plástido de plantas. Tal como se establece con detalle en los
ejemplos, se proporcionan constructos para expresión de aprotinina y
de hormona del crecimiento humano en el plástido de plantas. Otras
secuencias que pueden encontrar uso en los constructos de expresión
de la presente invención para la producción de productos biológicos
humanos incluyen secuencias que codifican insulina o precursores de
insulina. Sin embargo, el técnico experto reconocerá que pueden
usarse muchas secuencias de nucleótidos que codifican productos
biológicos en los constructos de la presente invención para dirigir
su expresión a partir de un plástido de planta, tales como los
descritos por Goodman y Gelman en Pharmacological Basis of
Therapeutics, Pergamon Press, 8ª Edición, Secciones 14 y 15,
(1990). Igualmente, se contempla que cualquier proteína para la
cual se ha identificado la secuencia nucleótida pueda ser usada en
los constructos de la presente invención.
La presente invención proporciona, igualmente,
procedimientos para la producción de una proteína farmacéutica con
un N-terminal no metionina en un plástido de planta.
En general, los procedimientos comprenden la expresión de una
proteína de fusión que incluye un gen de ubiquitina fusionado a una
proteína de interés en un plástido. El gen de ubiquitina se obtiene
a partir de una fuente natural y se clona dentro de un vector
apropiado, tal como se describe en el Documento WO 88/02406, véase
anteriormente, o se sintetiza químicamente, usando, por ejemplo, el
procedimiento descrito por Ecker y otros, J. Biol. Chem.,
vol. 262, págs. 3524-3527, (1987) y Ecker y otros,
J. Biol. Chem., vol. 262, págs. 14213-14221,
(1987), cuyas descripciones se incorporan como referencia. Las
proteínas de fusión de ubiquitina son reconocidas por la ubiquitina
proteasa, contrariamente a los informes previos (Vierstra, Plant
Mol. Biol., vol. 32, págs. 275-302, (1996)),
las cuales se escinden inmediatamente más abajo del resto glicina
de carboxi-terminación de ubiquitina. Esta propiedad
ha permitido la producción de proteínas recombinantes que contienen
restos N-terminales distintos de la metionina
(Baker, Current Opin. Biotech., vol. 7, págs.
541-546, (1996)).
Igualmente, se proporcionan procedimientos
adicionales para la producción de proteínas farmacéuticas con un
N-terminal no metionina en un plástido de planta.
Tal como se describe más completamente en los Ejemplos más
adelante, se prepararon constructos para dirigir la producción de
una metionina-hGH (M-hGH) en un
plástido de célula de planta. Generalmente, los constructos
comprenden una región de iniciación de transcripción y una
secuencia de ADN que codifica la hGH. De manera sorprendente, la
secuenciación del aminoácido N-terminal de la hGH
extraída producida en las plantas transplastómicas revela que la
metionina N-terminal se escinde a paritr de la
proteína hGH madura, produciendo hGH con una alanina
N-terminal (A-hGH). Este resultado
indica la interacción de la hGH expresada con una metionina amino
peptidasa (MAP) en la célula de la planta. Aunque se espera que
cualquier aminoácido puede seguir al N-terminal de
metionina, preferiblemente, el segundo aminoácido se selecciona
entre el grupo constituido por alanina, cisteína, glicina, prolina,
serina, treonina, y valina.
Tal como se describe con más detalle más
adelante, se han usado secuencias de ácido nucleico que codifican
la hormona del crecimiento humano (hGH) en los constructos de
expresión de plástidos de la presente invención. Además, las
plantas de tabaco transplastómicas que contienen dichos constructos
demuestran un alto nivel de expresión de hGH. Así mismo, la
proteína de hGH expresada a partir del plástido de la planta muestra
características de procesamiento adecuado así como plegado
apropiado de la proteína.
La hormona del crecimiento humano (hGH)
participa mucho de la regulación del crecimiento y desarrollo humano
normal. Esta hormona de la pituitaria de 22.000 dalton muestra una
multitud de efectos biológicos que incluyen el crecimiento lineal
(somatogénesis), lactancia, activación de macrófagos, efectos
diabetogénicos y de tipo insulina entre otros (Chawla, Ann. Rev.
Med., vol. 34, pág. 519, (1983); Edwards y otros,
Science, vol. 239, pág. 769, (1988); Thorner y otros, J.
Clin. Invest., vol. 81, pág. 745, (1988)). La hGH es un miembro
de una familia de hormonas homólogas que incluyen lactógenos
placentales, prolactinas, y otras variantes genéticas y de especies
de la hormona del crecimiento (Nicoll y otros, Endocrine
Reviews, vol. 7, pág. 169, (1986)). La hGH es inusual entre
estas dado que muestra especificidad por un amplio número de
especies y se une o bien al receptor somatogénico clonado (Leung y
otros, Nature, vol. 33, pág. 537, (1987)) o bien al receptor
de prolactina (Boutin y otros, Cell, vol. 53, pág. 69,
(1988)). El uso principal de hGH es en el tratamiento del enanismo
hipopituitario en niños. Las indicaciones adicionales son en el
tratamiento del síndrome de Turner, fallo renal crónico, síndrome
de agotamiento por VIH y el tratamiento de los enfermos de edad
avanzada y críticos (Tritos y otros, Am. J. Med., vol. 105,
págs. 44-47, (1998)).
A medida que se produce en la glándula
pituitaria, la hGH entra en el sistema secretor, comidiendo con la
eliminación de su péptido señal y la formación de dos enlaces
disulfuro (Chawla y otros, (1983), véase anteriormente). En la
glándula pituitaria, la separación del péptido señal de la hGH
(también denominada como somatotropina humana o hST) durante la
secreción libera fenilalanina como el aminoácido de
N-terminación (Chawla y otros, Annu. Rev.
Med., vol. 34, págs. 519-547, (1983)). Como la
traducción normal en plástidos se inicia en la metionina, se diseñó
una fusión ubiquitina-hGH para proporcionar una
fenilalanina N-terminal (F-hGH) en
el producto hGH final.
De manera sorprendente, aunque se ha informado
anteriormente que la ubiquitina proteasa no está presente en
cloroplastos (Vierstra, Plant Mol. Biol., vol. 32, págs.
275-302, (1996)), la fusión
ubiquitina-hGH se procesó durante la síntesis,
acumulación o purificación a partir de las plantas para producir un
producto hGH de fenilalanina N-terminal
(F-hGH). El constructo de control que porta el ADNc
de longitud completa codifica metionina y alanina como los primeros
aminoácidos de hGH.
Tal como se describe en los Ejemplos más
adelante, los constructos que comprenden secuencias de ácido
nucleico que codifican aprotinina (también conocida como inhibidora
de tripsina pancreática bovina, BPTI) se usaron en constructos de
expresión de plástidos de la presente invención. La aprotinina es
una proteína básica presente en diversos órganos y tejidos bovinos,
tales como nódulos linfáticos, páncreas, pulmones, glándula
parótida, bazo e hígado. Se sabe que la aprotinina inhibe diversas
serina proteasas, incluyendo tripsina, quimotripsina, plasmina y
calicreína, y se usa terapéuticamente en el tratamiento de
pancreatitis aguda, diversas fases del síndrome de choque,
hemorragia hiperfibrinolítica e infarto de miocardio. Además, la
administración de aprotinina en dosis altas reduce de manera
significativa la pérdida de sangre en relación con la cirugía
cardíaca, incluyendo el bypass cardiopulmonar (Bidstrup y otros,
Cardiovasc. Surg., vol. 44, págs. 640-645,
(1989)).
En el desarrollo de los constructos, los
diversos fragmentos que comprenden las regiones reguladoras y el
marco de lectura abierto pueden someterse a diferentes condiciones
de procesado, tales como ligamiento, digestión de enzima de
restricción, PCR, mutagénesis in vitro, adición de ligadores
y adaptadores. De acuerdo con ello, pueden llevarse a cabo
transiciones, transversiones, inserciones, deleciones, o similares,
de nucleótidos, sobre el ADN que se esté usando en las regiones
reguladoras o las secuencias del ADN de interés para expresión en
los plástidos. Los procedimientos para digestos de restricción,
tratamientos de extremos romos de Klenow y ligamientos, son bien
conocidos para los expertos en la técnica y se encuentran descritos,
por ejemplo, por Maniatis y otros (en Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY, (1989)).
Durante la preparación de los constructos, los
diversos fragmentos de ADN se clonarán frecuentemente en un vector
de clonación apropiado, lo cual permite la amplificación del ADN, la
modificación del ADN o la manipulación del ADN mediante secuencias
de unión o separación, o ligadores. Preferiblemente, los vectores
serán capaces de replicación hasta al menos un número relativamente
alto de copias en E. coli. Se encuentran fácilmente
disponibles un cierto número de vectores para clonación, los cuales
incluyen vectores tales como pBR322, vectores de las series pUC,
vectores de las series M13, y vectores pBluescript (Stratagene, La
Jolla, CA).
Con el fin de proporcionar unos medios de
selección de las células de plantas deseadas, los vectores de
transformación de plástidos contienen, típicamente, un constructo
que proporciona la expresión de un gen marcador seleccionable. Los
genes marcadores son secuencias de ADN expresables en plantas que
expresan un polipéptido que resiste una inhibición natural,
mediante la atenuación o inactivación de una substancia selectiva,
incluyendo, pero sin limitarse a ellas, antibiótico y
herbicida.
Como alternativa, un gen marcador puede
proporcionar alguna otra respuesta reactiva visible, es decir, puede
ocasionar un aspecto o un patrón de crecimiento distintivo con
relación a plantas o células de plantas que no expresan el gen
marcador seleccionable en la presencia de alguna substancia, bien
sea aplicado directamente a la planta o células de plantas o bien
presente en la planta o en el medio de crecimiento de la célula de
planta.
En ambos casos, las plantas o células de plantas
que contienen dichos genes marcadores seleccionables mostrarán un
fenotipo distintivo para fines de identificación, es decir, serán
distinguibles de las células no transformadas. El fenotipo
característico permite la identificación de células, grupos de
células, tejidos, órganos, partes de plantas o plantas completas
que contienen el constructo.
La detección del fenotipo marcador hace posible
la selección de células que tienen un segundo gen al cual se ha
ligado el gen marcador. Típicamente, este segundo gen comprende un
fenotipo deseable el cual no es fácilmente identificable en células
transformadas, pero el cual está presente cuando la célula de planta
o un derivado de la misma crece hasta la madurez, incluso bajo
condiciones en las que el propio fenotipo marcador seleccionable no
es evidente.
El uso de un marcador de este tipo para la
identificación de células de plantas que contienen un constructo de
plástido ha sido descrito por Svad y otros (1993, véase
anteriormente). En los Ejemplos proporcionados más adelante, se
expresa un gen aadA bacteriano como el marcador bajo el
control regulador de las regiones promotora 5' y de terminación de
transcripción 3' del cloroplasto, específicamente las regiones
reguladoras del gen psbA (descrito por Staub y otros, en
EMBO J., vol. 12 (nº 2), págs. 601-606,
(1993)). Igualmente, pueden usarse numerosas regiones promotoras
adicionales para impulsar la expresión del gen marcador
seleccionable, incluyendo diversos promotores de plástidos y
promotores bacterianos los cuales se ha mostrado que funcionan en
plástidos de plantas.
La expresión del gen aadA confiere
resistencia a la espectinomicina y estretomicina, y, de acuerdo con
ello, permite la identificación de células de plantas que expresan
este marcador. El producto del gen aadA permite el
crecimiento continuo y el verdeamiento de células cuyos cloroplastos
comprende el producto del gen marcador seleccionable. Las células
que no contienen el producto del gen marcador seleccionable están
blanqueadas. De acuerdo con ello, la selección para el gen marcador
aadA está basada en la identificación de células de plantas
que no son blanqueadas por la presencia de estreptomicina, o más
preferiblemente de espectomicina, en el medio de crecimiento de la
planta.
Se han desarrollado un cierto número de
marcadores para uso con células de plantas, tales como de
resistencia al cloranfenicol, al aminoglicósido G418, o a
higromicina. Igualmente, pueden usarse como marcadores
seleccionables otros genes que codifican un producto implicado en
el metabolismo del cloroplasto. Por ejemplo, los genes que
proporcionan resistencia a herbicidas para plantas tales como
glifosato, bromoxynil o imidazolinona pueden encontrar un uso
particular. Se ha informado de dichos genes (Stalker y otros, J.
Biol. Chem., vol. 260, págs. 4724-4728, (1985)
(EPSP resistente al glifosato); Stalker y otros, J. Biol.
Chem., vol. 263, págs. 6310-6314, (1985) (gen
nitrilasa resistente al bromoxynil); y Sathasivan y otros, Nucl.
Acid. Res., vol. 18, pág. 2188, (1990) (gen de resistencia a
imidazolinona AHAS)).
Se ha informado de la transformación estable de
genomas de plástidos del tabaco mediante bombardeo de partículas
(Svab y otros, (1990), véase anteriormente, y Svad y otros, (1993),
véase anteriormente). Los procedimientos allí descritos pueden
usarse para obtener plantas homoplásmicas para constructos de
expresión de plástidos.
Generalmente, el tejido bombardeado se cultiva
durante aproximadamente 2 días sobre un medio que promueve la
división celular, después de lo cual el tejido de la planta es
transferido a un medio selectivo que contiene una cantidad
inhibidora del agente selectivo particular, así como las hormonas
particulares y otras substancias necesarias para obtener la
regeneración de dichas especies de plantas particulares. A
continuación, los vástagos son subcultivados sobre el mismo medio
selectivo para asegurar la producción y selección de vástagos
homoplásmicos.
Las plantas de tabaco transplastómicas son
analizadas para determinar una población pura de genomas de
plástidos transformados (líneas homoplásmicas). La homoplasmia se
verifica usando el análisis Southern que usa sondas de ácido
nucleico de ligamiento a una región del transgen y del genoma del
cloroplasto (es decir, la región de inserción). Las plantas
transplastómicas que son heteroplásmicas (es decir, que contienen
una mezcla de genomas de plástidos que contienen y carecen del
transgen) se caracterizan mediante un patrón de hibridación de
bandas tipo salvaje y transgénicas. Las plantas homoplásmicas
muestran un patrón de hibridación que carece de la banda de tipo
salvaje.
Como alternativa, la homoplasmia puede
virificarse usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se
usan cebadores de PCR que están dirigidos para amplificar a partir
de secuencias procedentes de la región de inserción. Por ejemplo,
puede usarse un par de cebadores en una reacción PCR. Un cebador
amplifica a partir de una región en el transgen, en tanto que el
segundo cebador amplifica a partir de una región próxima a la
región de inserción en dirección de la región de inserción. Usando
cebadores diseñados para amplificar la región de inserción, se
lleva a cabo una segunda reacción PCR. Las líneas transplastómicas
identificadas como homoplásmicas producen el fragmente del tamaño
deseado en la primera reacción, mientras que no producen el
fragmento del tamaño predicho en la segunda reacción.
En los casos que se han adaptado procedimientos
de transformación y regeneración para una especie de planta dada,
bien mediante transformación mediada por Agrobacterium, o
bien por bombardeo o algún otro procedimiento, las técnicas
establecidas pueden ser modificadas para uso en procedimientos de
selección y regeneración con el fin de producir plantas
transformadas con plástidos. Por ejemplo, los procedimientos aquí
descritos para tabaco son fácilmente adaptables a otras especies
solanáceas, tales como tomate, petunia y patata.
Para la transformación de soja, se ha descrito
el bombardeo de partículas así como protocolos de transformación y
regeneración nuclear mediados por Agrobacterium (Hinchee y
otros, Patente de EE.UU. 5.416.011, y Christou y otros, Patente de
EE.UU. 5.015.580). El técnica experto reconocerá que pueden usarse
los protocolos descritos para la transformación de la soja.
En Brassica, los protocolos de
transformación y regeneración mediados por Agrobacterium
implican, generalmente, el uso de tejido hipocotilo, un tejido no
verde que podría contener un bajo contenido de plástido. De acuerdo
con ello, para Brassica, los tejidos diana preferidos
incluirían tejidos hipocotilo derivados de microesporas o
cotiledonarios (los cuales son verdes y, por ello, contienen
numerosos plástidos) de explantes de tejido de hoja. Aunque las
proporciones de regeneración a partir de dichos tejidos puedan ser
bajas, no son de esperar efectos posicionales, tales como los
observados con transformación mediada por Agrobacterium, por
lo cual, no sería necesario rastrear numerosas plantas
satisfactoriamente transformadas con el fin de obtener un fenotipo
deseado.
Para el algodón, se ha descrito la
transformación de cotiledones de Gossypium hirsurtum L.
mediante co-cultivo con Agrobacterium
tumefaciens por Firoozabady y otros, Plant Mol. Bio.,
vol. 10, págs. 105-116, (1987) y Umbeck y otros,
Bio/Technology, vol. 5, págs. 263-266,
(1987). De nuevo, al igual que para la Brassica, este tejido
puede contener un contenido en plástido insuficiente para la
transformación del cloroplasto. De acuerdo con ello, al igual que
para la Brassica, puede ser deseable un procedimiento
alternativo para transformación y regeneración de tejido diana
alternativo que contenga cloroplastos, por ejemplo para
identificación de tejido embriogénico verde.
Otras especies de plantas pueden ser
transformadas de manera similar usando técnicas relacionadas. Como
alternativa, pueden usarse igualmente procedimientos de bombardeo
mediante microproyectiles, tal como los descritos por Klein y otros
(Bio/Technology, vol. 10, págs. 286-291) para
obtener plantas transformadas nucleares que comprenden los
constructos de expresión de ARN polimerasa de la subunidad única
viral descrita aquí. La transformación de algodón mediante
bombardeo por partículas ha sido informada en el documento WO
92/15675, publicado el 17 de Septiembre de 1992. Las plantas
adecuadas para la práctica de la presente invención incluyen, pero
sin limitarse a ellas, soja, algodón, alfalfa, aceite de colza,
lino, tomate, remolacha azucarera, girasol, patata, tabaco, maíz,
trigo, arroz y lechuga.
Los vectores para uso en la transformación de
plástidos incluyen, preferiblemente, medios para proporcionar una
transferencia estable del constructo de expresión del plástido y el
constructo marcador seleccionable dentro del genoma del plástido.
Este es proporcionado lo más convenientemente por regiones de
homología al genoma del plástido diana. Las regiones de homología
flanquean el constructo a transferir y proporcionan la
transferencia al genoma del plástido mediante recombinación de
homólogos, a través de un doble entrecruzamiento dentro del genoma.
Se ha informado sobre la secuencia de ADN completa del genoma del
plástido del tabaco (Shinozaki y otros, EMBO J., vol. 5,
págs. 2043-2049, (1986)). Igualmente, se ha
informado sobre las secuencias del ADN completo de los genomas de
plástidos procedentes de la agrimonia (Ohyama y otros,
Nature, vol. 322, págs. 572-574, (1986) y
del arroz (Hiratsuka y otros, Mol. Gen. Genet., vol. 217,
págs. 185-194, (1989).
Cuando se encuentran presentes regiones de
homología en las regiones repetidas invertidas del genoma del
plástido (conocidas como IRA y IRB), son de esperar dos copias del
transgen por plástido transformado. Cuando las regiones de
homología están presentes fuera de las regiones repetidas invertidas
del genoma del plástido, es de esperar una copia del transgen por
plástido transformado. Las regiones de homología de dentro del
genoma del plástido son de un tamaño de aproximadamente 1 kb.
Igualmente, pueden usarse regiones de homología más pequeñas, y tan
pequeñas como de 100 bp pueden proporcionar la recombinación de
homólogos dentro del genoma del plástido. Sin embargo, la
frecuencia de recombinación y, por ello, la frecuencia de obtención
de plantas que tienen plástidos transformados disminuye al
disminuir el tamaño de las regiones de homología.
Los ejemplos de constructos que tienen regiones
de homología dentro del genoma del plástido han sido descritos por
Svad y otros (1990, véase anteriormente), Svad y otros (1993, véase
anteriormente) y Zoubenko y otros, Nuc. Acids Res., vol. 22,
(no. 19), págs. 3819-3824, (1994)).
Tal como se describe con más detalle en los
Ejemplos más adelante, se describen constructos que proporcionan la
expresión potenciada de secuencias de ADN en plástidos de plantas.
Se han usado diversas secuencias de promotor/sitios de unión al
ribosoma para dirigir la expresión en plástidos de plantas. En
particular, las secuencias promotoras del operón de ARN ribosómico
16S (Prrn) están ligadas a un sitio de unión al ribosoma
(RBS) derivado a partir de la secuencia conductora del gen 10 del
bacteriófago T7 (G10L). Las secuencias de ADN expresadas bajo el
control regulador de la secuencia Prrn/G10L muestran un nivel
de expresión de proteína significativamente más alto que los
niveles obtenidos bajo el control de otras combinaciones
promotor/RBS, mientras que la expresión del ARNm puede ser o no ser
más alta en estas plantas.
En los Ejemplos de más adelante, las secuencias
de ácido nucleico que codifican la EPSP sintasa de CP4 (Patente de
EE.UU. 5.633.435) están situadas dentro de constructos de expresión
para expresión de la enzima EPSP sintasa de CP4 a partir del
plástido de la planta. Además, una secuencia de ADN que codifica la
hGH (Patente de EE.UU. 5.424.199) está igualmente situada dentro
del constructo de expresión para la expresión de la hormona del
crecimiento humano a partir del plástido de la planta. Los
constructos preparados usan un sitio de unión al ribosoma diseñado
después del conductor del gen 10 del bacteriógafo T7 (G10L) para
incrementar la expresión de las secuencias de ácido nucleico en el
plástido de la planta.
Los constructos de expresión de plástidos que
codifican la expresión de EPSPS y hGH se introducen a través de un
vector de transformación de cloroplasto.
Las líneas de tabaco que contienen la secuencia
nativa que codifica a la enzima EPSPS expresada en plástidos bajo
el control de la secuencia promotor/sitio de unión al ribosoma
Prrn/G10L, demuestran un nivel de expresión de proteína
significativamente más alto que los niveles obtenidos a partir de
EPSPS expresada bajo el control de la secuencia
Prrn/rbcL(RBS). Sin embargo, el ARNm de EPSPS está
expresado a un nivel más alto en plantas que expresan EPSPS de CP4
a partir del plástido bajo el control de
Prrn/rbcL(RBS). Estos resultados indican que la
traducción a partir de transcriptos que contienen el sitio de unión
ribosoma del gen 10 del bacteriófago T7 es más eficaz. Además, los
niveles de expresión de proteína de EPSPS obtenidos a partir de
líneas de tabaco transplastómicas que expresan EPSPS bajo el control
de Prrn/G10L(RBS), proporcionan un nivel más alto de
tolerancia al glifosato.
Además, las líneas de tabaco transplastómicas
transformadas para expresadas hGH bajo el control de la secuencia
promotor/sitio de unión al ribosoma Prrn/G10L, demuestran un
nivel de expresión de proteína significativamente más alto que los
niveles obtenidos a partir de hGH expresada bajo el control de la
secuencia promotor PpsbA/RBS.
Pueden obtenerse incrementos en los niveles de
expresión de proteína de al menos aproximadamente 200 veces a
partir de constructos que usan el Prrn/sitio de unión al
ribosoma G10L para la expresión de EPSPS y hGH sobre los niveles de
expresión obtenidos a partir de otras combinaciones promotor/RBS
para la expresión de plástidos. Además, los niveles de proteína
obtenidos a partir de constructos de expresión de plástidos que
usan la secuencia promotor/RBS Prrn/G10L pueden acumular
niveles 50 a 3500 veces más altos que los constructos de expresión
nuclear. De acuerdo con ello, la inclusión del sitio de unión al
ribosoma G10L en constructos de expresión de plástidos puede
encontrar uso para incrementar los niveles de expresión a partir de
plástidos de plantas.
Más aún, los constructos de la presente
invención pueden igualmente incluir secuencias para identificar la
proteína expresada en una región suborganular particular, por
ejemplo, el lumen tilacoide del cloroplasto. Por ejemplo, tal como
se describe en los Ejemplos más adelante, una secuencia nucleótida
que codifica un péptido procedente del genoma del plástido del
citocromo f identifica la proteína aproteína expresada contra
la membrana tilacoide. Dicha identificación de proteínas expresadas
puede proporcionar una compartimentación de la proteína lo que
permite el incremento de estabilidad oxidativa y un plegado
apropiado de la proteína.
La invención se describe a continuación de
manera general, y será más fácilmente entendida con referencia a
los Ejemplos siguientes.
Los constructos y procedimientos para uso en la
transformación de plástidos de plantas superiores han sido
descritos por Zoubenko y otros (Nucl. Acids Res., vol. 22,
(no. 19), págs. 3819-3824, (1994), Svab y otros
(Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 87, págs.
8526-8530, (1990) y Proc. Natl. Acad. Sci.,
vol. 90, págs. 913-917, (1993) y Staub y otros
(EMBO J., vol. 12, págs. 601-606, (1993)).
Los constructos y procedimientos para uso en la transformación de
plástidos de plantas superiores para expresar secuencias de ADN bajo
el control de una T7 polimerasa identificada por plástido,
codificado nuclearmente, se encuentran descritos en la Patente de
EE.UU. 5.576.198. Las secuencias del ADN completo del genoma del
plástido del tabaco han sido informadas por Shinozaki y otros
(EMBO J., vol. 5, págs. 2043-2049, (1986)).
Todas las referencias al ADN del plástido en la descripción que
sigue son al número de nucleótidos procedentes del tabaco.
La secuencia de nucleótidos completa que
codifica el citocromo f del tabaco (petA) ha sido
descrita por Bassham y otros, en J. Biol. Chem., vol. 266,
págs. 23606-23610, (1991) y por Konishi y otros, en
Plant Cell Physiol., vol. 34, págs.
1081-1087, (1993).
La región promotora del operón de ARN ribosómico
del plástido 16S (Prrn) está ligada a un sitio de unión al
ribosoma (RBS) sintético usado como molde sobre el conductor del gen
rbcL del plástido para crear el fragmento de Prrn/rbcLRBS.
La secuencia de Prrn/rbcLRBS es tal como ha sido descrita por
Svab y otros (1993, véase anteriormente) para el fragmento
Prrn/rbcL(S).
La región promotora de las secuencias del
promotor (PpsbA) y de terminación (TpsbA) del plástido psbA han
sido descritas por Staub y otros (EMBO J., vol. 12, págs.
601-606, (1993)).
La secuencia Prrn/G10L se construyó
mediante la reasociación de dos secuencias de oligonucleótidos,
conductor 1 de T7 y conductor 2 de T7 (Tabla 1), para crear el
sitio de unión al ribosoma del plástido G10L (Figura 1). La
secuencia G10L se ligó a la terminación 3' de la secuencia promotora
Prrn como un fragmento EcoRI/NcoI para crear
la secuencia Prrn/G10L.
Preferiblemente, los genes quiméricos se
insertaron dentro del vector de expresión para dirigir su
transcripción a partir del promotor Prrn. De acuerdo con
ello, en el genoma del plástido, los genes quiméricos son
transcriptos a partir del promotor Prrn/RBS, o el promotor
Prrn/G10L en el plástido de la planta.
Se construyó un vector de expresión del plástido
pMON30117 a partir de un vector precursor pPRV111B (Zoubenko y
otros, 1994, véase anteriormente, registro de GenBank U12813). El
vector pMON30117 porta un sitio de clonación múltiple para la
inserción de un gen pasajero en una caja de expresión
Prrn/rbcLRBS/Trps16. La secuencia
Prrn/rbccLRBS se clonó dentro del vector pPRV111B como un
fragmento EcoRI/NcoI, y la región de terminación
procedente del gen rps16 del plástido (Trps16) se
clonó 3' con respecto del promotor Prrn como un fragmento
HindIII/NcoI. El fragmento Trps16 comprende la
región reguladora 3' del gen rps16 desde los nucleótidos
5.087 a 4.939 en el ADN plásmido del tabaco.
La estructura principal del pPRV111B del vector
pMON30117 contiene un gen marcador, aadA, para la selección
de espectinomicina y estreptomicina, y el rps 7/12 para la
integración, mediante recombinación de homólogos, del ADN pasajero
dentro de la región intergénica trnV-rps7/12.
El constructo de expresión del plástido
pMON30118 se preparó mediante clonación del gen de EPSPS de CP4
nativo fusionado con los cinco (5) aminoácidos
N-terminales procedentes del plástido rbcL
(descrito por Svab y otros, 1993, véase anteriormente) como un
fragmento NcoI/SmaI dentro del sitio de clonación
multiple del vector pMON30117.
El constructo de expresión del plástido
pMON30123 es, esencialmente, el mismo que pMON30118 con la excepción
de la deleción de los cinco (5) aminoácidos
N-terminales procedentes del plástido
rbcL.
El constructo de expresión del plástido
pMON30130 se creó reemplazando la EPSPS de CP4 nativa de pMON
30123, con un gen CP4 sintético. Este constructo carece, igualmente, de la fusión de los 5 aminoácidos N-terminales procedentes del gen rbcL del plástido.
30123, con un gen CP4 sintético. Este constructo carece, igualmente, de la fusión de los 5 aminoácidos N-terminales procedentes del gen rbcL del plástido.
El constructo de expresión del plástido
pMON38773 se construyó reemplazando la secuencia Prrn/RBS de
pMON
30123 con la secuencia promotora Prrn/G10L descrita anteriormente. La secuencia de ADN de EPSPS de pMON38773 carece, igualmente, de la fusión de los 5 aminoácidos N-terminales procedentes del gen rbcL del plástido.
30123 con la secuencia promotora Prrn/G10L descrita anteriormente. La secuencia de ADN de EPSPS de pMON38773 carece, igualmente, de la fusión de los 5 aminoácidos N-terminales procedentes del gen rbcL del plástido.
Se construyó un constructo de expresión de
plástido, el pMON38766, usando el promotor procedente del gen 10
del fago T7 (P-T7), que incluye G10L, la región que
codifica el gen CP4 (nativo), y la secuencia de terminación
procedente del gen rps16 del plástido (Trps16).
Se construyó un constructo de expresión de
plástido, el pMON38797, usando el promotor procedente del gen 10
del fago T7 (P-T7), que incluye G10L, la región que
codifica el gen CP4 (sintético), y el terminador procedente del gen
rps16 del plástido (Trps16).
Se construyó un constructo de expresión de
plástido, el pMON38798, usando el promotor del operón de ADN de
16Sr (Prrn), G10L, la región que codifica el gen CP4 (sintético), y
el terminador procedente del gen rps16 del plástido (Trps16).
Se construyó un constructo de expresión de
plástido, el pMON38793, usando el promotor del operón de ADN de16Sr
(Prrn), un sitio de unión al ribosoma (RBS) sintético usado como
molde procedente del gen rbcL del plástido, el gen EPSP sintasa de
petunia (P-EPSPS, Padgette y otros, Arch.
Biochem. Biophys., vol. 258, págs. 564-573,
(1987)) tolerante al glifosato, que porta la mutación de glicina a
alanina en la posición del aminoácido 101, y el terminador
procedente del gen rps16 del plástido (Trps16).
Se construyó un constructo de expresión de
plástido, el pMON38796, usando el promotor del operón de ADN de16Sr
(Prrn), un sitio de unión al ribosoma (RBS) sintético usado como
molde procedente del gen rbcL del plástido, el gen EPSP sintasa de
Achromobacter (cepa LBAA) tolerante al glifosato (Patente de
EE.UU. 5.627.061), que porta la mutación de glicina a alanina en la
posición del aminoácido 100, y el terminador procedente del gen
rps16 del plástido (Trps16).
Se construyó un constructo de expresión de
plástido, el pMON45204, usando el promotor del operón de ADN de
16Sr (Prrn) con G10L, el gen EPSP sintasa de Pseudomonas
(cepa LBAA) tolerante al glifosato, que porta la mutación de
glicina a alanina en la posición del aminoácido 100, y el terminador
procedente del gen rps16 del plástido (Trps16).
Se construyó un constructo de expresión de
plástido, el pMON45201, usando el promotor del operón de ADN de16Sr
(Prrn), un sitio de unión al ribosoma (RBS) sintético usado como
molde procedente del gen rbcL del plástido, el gen (EPSPS) de
Bacillus subtilis aroE tolerante al glifosato de tipo salvaje
(Patente de EE.UU. 5.627.061), y el terminador procedente del gen
rps16 del plástido (Trps16).
El gen de resistencia al herbicida bxn
(Patente de EE.UU. 4.810.648) se separó del plásmido pBrx47 como un
fragmento de restricción NcoI a Asp718 y se clonó
dentro del corte Nco/Asp718 de pUC120, dando como resultado el
plásmido pBrx87. A continuación, el plásmido pBrx87 se digirió con
Nco/Xba y se clonó dentro de los sitios
Nco/Xba del plásmido pLAA21 que contiene el promotor
del plástido Prrn y la región 3' de rpsL para la
expresión del plástido. El plásmido resultante se le designó como
pBrx89. El plásmido pBrx89 se digirió con SacI y
HindIII y el gen bxn quimérico de 1,5 kb con señales
de expresión del plástido se insertó dentro de los sitios
Sac/HindIII del vector de homología del plástido del
tabaco pOVZ44B (Zoubenko y otros, Nuc. Acids Res., vol. 22,
págs. 3819-3824, (1994)) para crear el plásmido
pCGN5175.
Para construir el plásmido pCGN6114, el plásmido
pBrx90 (un plásmido Bluescript que contiene el gen bxn que
codifica la nitrilasa específica de bromoxinilo) se digirió con
NcoI/AscI y el gen estructural bxn se
substituyó por el gen GUS en el plásmido pCGN5063 digerido con
Nco/Asc, dando como resultado el plásmido pCGN6107.
Este plásmido contiene el gen bxn bajo el control del
conductor gen 10/promotor T7 en el extremo 5' y el terminador de
transcripción híbrido psbA/T7 en el extremo 3' del gen
quimérico. Este gen quimérico promotor T7/bxn se escindió a
partir del pCGN6107 como un segmento de ADN Hindi/NotI
y se desplazó dentro del plásmido BCSK+ (Stratagene) de
cloroanfenicol en los sitios Hindi/Not para crear el
plásmido pCGN6109. A continuación, el gen quimérico se desplazó como
un fragmento HindIII/Not procedente del pCGN6109
dentro del vector de homología de cloroplasto pOVZ44B descrito
anteriormente, para crear el plásmido pCGN6114. Las plantas de
tabaco transformadas con pCGN6114 requieren que el ARN polimerasa
de T7 sea suministrado dentro de la estructura principal del
plástido de la planta para activar la transcripción del gen
bxn quimérico a través del promotor T7. Este sistema ha sido
ya detallado por McBride y otros, en PNAS, vol. 91, págs.
7301-7305, (1994) y McBride y otros, en la Patente
de EE.UU. 5.576.198.
Se preparó un constructo de expresión de
plástido, el pCGN5026, para dirigir la expresión de BXN y AHAS a
partir del plástido de la planta. La secuencia nucleótida AHAS
(descrita en el documento EP-A 0 525 384 A2) se
ligó mediante traducción a la secuencia nucleótida BXN (Patente de
EE.UU. 4.810.648). La acetohidroxiácido sintasa que codifica el gen
estructural de AHAS se clonó a partir del plásmido pCGN4277 como un
fragmento de ADN NcoI a Age dentro de los sitios
Nco/Xma del plásmido pUC120 para crear el plásmido pCGN5022.
A continuación, este plásmido se digirió con las enzimas
BamHI y Pst y un segmento de ADN Bam/Pst de
1,3 kb que contiene el gen bxn que codifica la nitrilasa
específica de bromoxinil se escindió a partir del plásmido pBrx26 y
se clonó dentro de los sitios Bam/Pst del pCGN5022 para crear el
plásmido pCGN5023. El plásmido pCGN5023 contenía un segmento de ADN
de 3,3 kb conteniendo el segmento operón AHAS/bxn y este
fragmento. Este plásmido se cortó en el sitio único Pst y este sitio
Pst se separó y reemplazó con un ligador sintético conteniendo un
único sitio de restricción XbaI generándose el plásmido pCGN5024. El
plásmido pCGN5024 se digirió con Nco/Xba y el fragmento de
ADN Nco/Xba de 3,3 kb se clonó dentro del vector de la caja
del promotor del plastidio pLAA21 (Pst) que había sido digerido con
Nco y Xba para separar el gen GUS. El plásmido
resultante de esta clonación se designó como plásmido pCGN5025 y
contenía el operón herbicida bajo el control del promotor
Prrn del plástido y el segmento de ADN 3' de rpsL. El
operón herbicida quimérico entero bajo el control de los elementos
de expresión del plástido se escindió a partir del pCGN5025 como un
fragmento de ADN SacI/Pst y se clonó dentro de los
sitios Sac/Pst del vector de la caja de homología del
plástido pOVZ44B (Zoubenko y otros, Nuc. Acids Res., vol. 22,
págs. 3819-3824, (1994)) para facilitar la
transferencia dentro del genoma del cloroplasto del tabaco.
El plásmido pBrx9 (Stalker y McBride, J.
Bacteriol., vol. 169, págs. 955-960, (1987)), un
clon original procedente de Klebsiella conteniendo un
segmento de ADN del gen bxn, se usó como un molde para
generar un fragmento de ADN de PCR BamHI/ClaI de
\sim450 bp que abarca el extremo de N-terminación
del gen bxn e incluye 44 bp de la porción no traducida 5'
del gen nativo. Este fragmento se intercambió con el fragmento
Bam/Cla de \sim400 bp en el plásmido pBrx90 dando como
resultado el plásmido pBrx90.1. Este plásmido contiene el gen
bxn entero y el segmento de ADN 5' no traducido de 44 bp. El
gen bxn se escindió a partir del plásmido pBrx90.1 como un
segmento de ADN Bam/AscI y se insertó dentro del plásmido
pCGN5146 en los sitios BglII/AscI para generar el
plásmido pCGN5191. El plasmido pCGN5146 es un derivado de
pKK233-2 (Pharmacia) que contiene el gen de
longitud completa cryIAc que codifica la protoxina de Bt
HD-73. Es decir, el plásmido pCGN5191 contiene los
genes cryIAc y bxn en una configuración de operón
siendo el gen bxn el gen distal en el operón. Ambos genes
están bajo el control de promotor Ptac para expresión de
E. coli en 5191. El plásmido pCGN5191 se digirió con
Nco/Asc y el fragmento de ADN Nco/Asc que contenía el
operón Bt/bxn se clonó dentro de los sitios Nco/Asc
del vector de homología de cloroplasto pCGN5155, un derivado de
pOVZ44B. El plásmido resultante, pCGN5197, contiene el operón
Bt/bxn bajo el control de las regiones promotora y de
terminación de transcripción rpsL del plástido Prrn.
Este plásmido facilitó la transferencia del operón quimérico
Bt/bxn dentro del genoma del plástido del tabaco.
El gen crtI se obtuvo como un fragmento
de PCR HindIII/SalI a partir del plasmidio original
que contenía el operón crt de Erwinia carotova
(Misawa y otros, Plant Jour, vol. 6, págs.
481-489, (1994)) y se clonó como un segmento de ADN
HindiIII/Sal dentro de BSCK+ (Stratagene) en los
sitios HindIII/Sal para generar el plásmido pCGN5172.
Este fragmento crtI se clonó a partir de pCGN5172 como un fragmento
NcoI/SalI dentro de pCGN5038 (un derivado de pOVZ44B)
para crear el constructo de expresión del plástido pCGN5177. Este
constructo dirige la expresión de la secuencia crtI a parir del
promotor Prrn y la secuencia de terminación rps16. Este
plásmido facilitó la transferencia del gen crtI quimérico
dentro del genoma del plástido del tabaco.
El constructo pWRG4747 se construyó para dirigir
la expresión de hGH en el genoma nuclear de la planta. Este vector
contiene la hGH ligada de manera operable al promotor del virus del
mosaico de la celidonia menor (Patente de EE.UU. 5.378.619) y el
conductor CTP2 para la dirección de la proteína de hGH dentro del
plástido. El fragmento FMV/CTP2L::hGH::NpA se clonó conjuntamente
con la secuencia de ADN que confiere resistencia a la kanamicina
entre los bordes derecho e izquierdo (RB y LB) del ADN de
transferencia (tADN) del Agrobacterium tumefaciens para
dirigir la integración dentro del genoma nuclear.
El vector de transformación nuclear pWRG4744
contiene esencialmente los mismos elementos que el pWRG4747,
excepto que el constructo carece del conductor CTP2 y que la
proteína de hGH está dirigida al citoplasma de la célula de la
planta.
El vector de expresión de plástido pWRG4838 se
construyó usando el gen de longitud completa de hGH expresado a
partir de la región promotora y de terminación del gen psbA, PpsbA
y TpsbA, respectivamente (descrita por Staub y otros, ((1993),
véase anteriormente). Esta fusión
promotor-gen-terminador quimérica
(PpsbA::hGH::TpsbA) se clonó adyacente al gen marcador
seleccionable aadA igualmente impulsado por los elementos de
expresión del plástido del gen psbA. Las dos secuencias gen
quimérico se clonaron dentro de un vector entre dos secuencias que
dirigen la integración de las secuencias del gen quimérico dentro
del genoma del plástido del tabaco más arriba del ADN del plástido
16Sr. Este se unió a un gen de resistencia a la ampicilina de 1 kb
que proporciona la selección de E. coli conteniendo el
constructo y origen de replicación de pUC para mantenimiento del
plásmido en E. coli.
Este constructo de expresión de plástido
pMON38755 se preparó usando la secuencia de ADN de hGH fusionada a
modo de traducción en el N-terminación con el gen
ubiquitina de levadura (Ozkaynak y otros, Nature, vol. 312,
págs. 663-666, (1984)), creándose el gen de fusión
Ubi-hGH. El gen de fusión Ubi-hGH se
clonó a continuación al gen aadA para la selección de tabaco
transplastómico sobre medios que contenían espectinomicina o
estreptomicina (a partir del pPRV112B descrito por Zoubenko y
otros, (1994), véase anteriormente). Las secuencias se incluyeron
para la recombinación de homólogos de secuencias que codifican la
expresión de hGH y aadA. Estas secuencias se obtuvieron a
partir del vector pPRV112B descrito por Zoubenko y otros ((1994),
véase anteriormente). Estas secuencias se unieron a un gen de
resistencia a la ampicilina de 1 kb, el cual proporciona la
selección de E. coli conteniendo el constructo y el origen
de replicación de pUC para mantenimiento del plásmido en E.
coli.
El constructo de expresión de plástido pMON38794
contiene, esencialmente, los mismos elementos que pMON
38775, con la excepción de que la secuencia promotora psbA de 0,15 kb está reemplazada con la secuencia promotora Prrn/G10L descrita anteriormente.
38775, con la excepción de que la secuencia promotora psbA de 0,15 kb está reemplazada con la secuencia promotora Prrn/G10L descrita anteriormente.
Se prepararon una serie de constructos para
dirigir la expresión de la proteína farmacéutica aprotinina a
partir del plástido. La secuencia de ácido nucleico que codifica la
aprotinina (Figura 2) se clonó dentro de un constructo de expresión
del plástido para controlar la expresión de aprotinina a partir del
promotor del conductor del gen 10 de T7, que se indujo a partir una
T7 polimerasa identificada del plástido, expresada nuclearmente.
Los constructos usados, en los cuales se clono la secuencia de
aprotinina, son tal como se describen en la Patente de EE.UU.
5.576.198. El vector de transformación del plástido pCGN6146 se
diseñó mediante el reemplazo de la secuencia de ADN que codifica
GUS a partir de pCGN4276 (descrito en la Patente de EE.UU.
5.576.198) con la secuencia que codifica la aprotinina. El
constructo de transformación del plástido del tabaco pCGN6147
contiene los mismos elementos que pCGN6146, excepto que el pCGN6147
contienen los seis aminoácidos 5' de la secuencia que codifica GUS
ligados en el extremo 5' de la secuencia que codifica la aprotinina.
Los seis aminoácidos del extremo 5' de la secuencia del nucleótido
GUS se incluyeron con el fin de ayudar a la traducción de la
proteína aprotinina. El vector de transformación del plasmidio del
tabaco pCGN6156 es, esencialmente, el mismo que pCGN4276, excepto
que la región que codifica la aprotinina se clonó en el extremo 3'
de la secuencia que codifica GUS. De acuerdo con ello, el pCGN6156
contiene ligado de manera operable el promotor T7, una secuencia de
ADN que codifica el GUS fusionado con la secuencia de ADN que
codifica la aprotinina y la secuencia de terminación de
transcripción 3' de
psbA.
psbA.
Se construyó un constructo de expresión de
plástido, el pCGN6154, a partir del pCGN4276 mediante el reemplazo
de la secuencia que codifica GUS con la proteína aprotinina ligada
de manera operable a la terminación 3' de la secuencia que codifica
el citocromo f (petA) del cloroplasto del tabaco. De acuerdo
con ello, el pCGN6154 contiene la secuencia promotora T7 ligada de
manera operable a la secuencia nucleótida de petA y aprotinina. La
secuencia petA se incluyó para dirigir la proteína aprotinina
expresada al tilacoide.
Las plantas de tabaco transformadas para
expresar los constructos pWRG4744 y pWRG4747 en el núcleo de una
célula de planta pueden obtenerse tal como se describe por Horsch y
otros (Science, vol. 227, págs. 1229-1232,
(1985)).
Los plástidos de tabaco se transformaron
mediante el suministro con pistola de partículas de microproyectiles
tal como se describe por Svab y Maliga (Proc. Natl. Acad.
Sci., vol. 90, págs. 913-917, (1993)), y se
describe aquí.
Se cortaron hojas redondas, de color verde
oscuro, preferiblemente desde la mitad de los vástagos, procedentes
de Nicotiana tabacum cv. Havana de 3 semanas de edad que se
habían mantenido in vitro en medio MS libre de hormonas
(Murashige y Skoog, Physiol Plant., vol. 15, págs.
473-497, (1962)) suplementado con vitaminas B5 en
Phytatrays o copas de helado con un fotoperíodo de 16 horas a 24ºC.
A continuación, cada hoja cortada se colocó adaxialmente con la
cara hacia arriba sobre papel de filtro estéril sobre medio de
regeneración de vástagos de tabaco (medio TSO: sales MS, 1 mg/l de
N^{6}-benciladenina, 0,1 mg/l de ácido
1-naftalenoacético, 1 mg/l de tiamina, 100 mg/l de
inositol, 7 g/l de agar, pH 5,8 y 30 g/l de sacarosa).
Preferiblemente, las hojas se colocaron en el centro de la placa
con tanto contacto con el medio como fue posible. Preferiblemente,
las placas se prepararon inmediatamente antes de su uso, pero pueden
prepararse hasta 1 día antes de la transformación mediante
bombardeo por partículas envolviéndolas en bolsas de plástico y
almacenándolas a 24ºC durante la noche.
Las partículas de tungsteno u oro se
esterilizaron para uso como microportadores en experimentos de
bombardeo. Las partículas (50 mg) se esterilizaron con 1 ml de
etanol al 100%, y se almacenaron a -20ºC o -80ºC. Inmediatamente
antes de su uso, las partículas se sedimentaron por centrifugación,
se lavaron con 2 a 3 lavados de 1 ml de agua destilada desionizada
estéril, se batieron y centrifugaron entre cada lavado. Las
partículas lavadas se resuspendieron en 500 \mul de glicerol al
50%.
Las partículas esterilizadas se recubrieron con
ADN para transformación. Se agregaron partes alícuotas de 25
microlitros de partículas esterilizadas a un tubo de microcentrífuga
de 1,5 ml, y se agregaron 5 \mug del ADN de interés y mezclaron
mediante sacudidas. A la mezcla de partículas/ADN se agregaron 35
microlitros de una solución recién preparada de CaCl_{2} 1,8 M y
espermidina 30 mM, se mezclaron cuidadosamente, y se incubaron a
temperatura ambiente durante 20 minutos. Las partículas recubiertas
se sedimentaron mediante una breve centrifugación. Las partículas
se lavaron dos veces mediante la adición de 200 \mul de etanol al
70%, se mezclaron suavemente y se centrifugaron brevemente.. Las
partículas recubiertas se resuspendieron en 50 \mul de etanol al
100% y se mezclaron suavemente. Para cada bombardeo se usaron 5 a 10
microlitros de partículas recubiertas.
La Transformación mediante bombardeo de
partículas se llevó a cabo usando la pistola PDS 1000 Helium (Bio
Rad., Richmond CA) usando un protocolo modificado descrito por el
fabricante.
Las placas que contenían las muestras de hojas
se colocaron sobre el segundo estante a partir de la parte inferior
de la cámara de vacío y se bombardearon usando el disco de rotura de
7,79 N/mm^{2}. Después del bombardeo, las placas Petri que
contenían las muestras de hoja se envolvieron en bolsas de plástico
y se incubaron a 24ºC durante 48 horas.
Después de la incubación, las hojas bombardeadas
se cortaron en piezas de aproximadamente 0,5 cm^{2} y se
colocaron abaxialmente con la cara hacia arriba sobre medio TSO
suplementado con 500 \mug/ml de espectinomicina. Después de 3 a 4
semanas sobre el medio de selección, aparecieron sobre el tejido de
la hoja vástagos resistentes a la espectinomicina de color verde,
pequeños. Estos vástagos continuaron creciendo sobre el medio que
contenía espectinomicina y a los cuales se les denomina como
transformantes putativos primarios.
Cuando los transformantes putativos primarios
habían desarrollado 2 a 3 hojas, se cortaron de cada hoja 2
pequeñas piezas (de aproximadamente 0,5 cm^{2}) y se usaron o bien
para selección o bien para una segunda ronda de regeneración de
vástagos. Una pieza se colocó abaxialmente con la cara hacia arriba
sobre placas que contenían medio TSO suplementado con 500 \mug/ml
de espectinomicina, y la otra pieza se colocó abaxialmente con la
cara hacia arriba sobre medio TSO suplementado con 500 \mug/ml de
espectinomicina y estreptomicina. Los transformantes positivos se
identificaron como los vástagos que forman callo de color verde
sobre medio TSO que contenía espectinomicina y estreptomicina.
Después de 3 a 4 semanas, el tejido colocado
sobre medio TSO que contenía únicamente espectinomicina, el cual se
había identificado como positivo sobre el medio TSO con
espectinomicina y estreptomicina, desarrolló vástagos de color
verde. Se seleccionaron dos a cuatro vástagos de cada transformante
y se transfirieron a medio TSO suplementado con 500 \mug/ml de
espectinomicina para la generación de raíces Se llevó a cabo el
análisis Southern sobre 2 vástagos para confirmar la homoplasia tal
como se describe más adelante. Los vástagos procedentes de
episodios homoplásmicos se transfirieron al invernadero para la
producción de semillas, en tanto que los transformantes que no
fueron homoplásmicos se enviaron a una segunda ronda o regeneración
sobre medio TSO con 500 \mug/ml de espectinomicina para alcanzar
la homoplasmia.
Las plantas transformadas seleccionadas para la
expresión del gen marcador aadA, se analizaron para
determinar si se había transformado el contenido completo del
plástido de la planta (transformantes homoplásmicos). Típicamente,
después de dos rondas de formación de vástagos y selección a
espectinomicina, aproximadamente el 50% de las plántulas
transgénicas que se había analizado eran homoplásmicas, tal como se
determinó mediante análisis de transferencia Southern del ADN del
plástido. Las plántulas homoplásmicas se seleccionaron para
posterior cultivo.
El ADN genómico se aisló a partir de plantas de
tabaco transformadas, se electroforetizó, y se transfirió a filtros
tal como se ha descrito por Svab y otros, Proc. Natl. Acad.
Sci., vol. 90, págs. 913-917, (1993).
Las plantas de tabaco homoplásmicas
transformadas para expresar EPSPS de CP4 en plástidos se
identificaron usando una sonda preparada a partir de un fragmento
EcoRI/EcoRV de 2,4 kb procedente del vector pOVZ2
(similar al POVZ15 descrito por Zoubenko y otros, (1994), véase
anteriormente). El fragmento de sonda de 2,4 kb abarca parte de la
secuencia de identificación.
Los resultados de las hibridaciones Southern
identificaron 3 líneas homplásmicas procedentes del tabaco
transformado con los constructos pMON30123 y pMON30130 y 1 línea
procedente del tabaco transformado con pMON38773 para análisis
posterior.
La desaparición completa del fragmento
BamHI de tabaco nativo de 3,27 kb en las líneas
30123-19-1A,
30123-23-2A,
30123-18-1B,
30130-51-2A,
30130-51-2P,
30130-57-1P, y
38773-6 con una sonda que cubre la región de
integración, y la aparición de las bandas del tamaño esperado para
los fragmentos de ADN insertados en esos transformantes, de 5,14 kb
y 0,9 kb, establece que las plantas transformadas son homplásmicas
para los constructos deseados.
Los resultados de las hibridaciones Southern
identificaron 3 líneas homoplásmicas procedentes de tabaco
transformado con pCGN5177, las líneas
74-1B-P, 74-2 y
74-7.
Las líneas de tabaco 5175 y 6114
transplastómicas se analizaron mediante hibridación Southern para
determinar la homoplasmia tal como se ha descrito anteriormente.
Los resultados de las hibridaciones Southern identificaron 4 líneas
homoplásmicas procedentes de tabaco transformado con pCGN6114.
Los resultados a partir de las hibridaciones de
las líneas de tabaco 5175 transplastómicas identificaron una línea,
la 76-4A-F, como homoplásmica, y una
segunda línea como 95% homoplásmica.
Las plantas de tabaco homoplásmicas
transformadas para expresar BXN/AHAS en plastdios, se identificaron
usando hibridaciones Southern tal como se ha descrito
anteriormente.
Los resultados de las hibridaciones Southern
identificaron 14 líneas homoplásmicas procedentes de tabaco
transformado con pCGN5026. Los filtros se volvieron a sondar con un
fragmento de gen BXN, y se encontraron 21 líneas que contenían BXN,
14 líneas de las cuales fueron homoplásmicas.
Con el fin de determinar el nivel de
transcripción del ARNm de EPSPS, BXN o AHAS expresado en plantas de
tabaco transplastómico, se llevaron a cabo hibridaciones por
transferencia Northern con el ARN total aislado procedente de cada
una de las líneas identificadas. El ARN total se aisló usando
reactivo TRIzol (Gibco-BRL, Life Technologies,
Gaithersburg, MD) de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. El
ARN total, 2 \mug, se separó sobre un gel de agarosa
desnaturalizado y se transfirió a una membrana de nilón (Maniatis y
otros, (1989), véase anteriormente). Las sondas radiactivas para
las hibridaciones se prepararon usando fragmentos marcados con
cebador aleatorio (usando el kit de marcado Random Primer de
Boehringer Mannheim) de EPSPS de CP4, fitoeno desaturasa, BXN, o
AHAS y las hibridaciones se llevaron a cabo en 2x SSPE (Maniatis y
otros, (1989), véase anteriormente), a 60ºC. Los filtros se
retiraron y volvieron a sondar con una sonda de gen de ARN
ribosómico 16S de plástido (procedente de pPRV112A, Zoubenko y
otros, (1994), véase anteriormente) para confirmar la carga
homogénea de ARN sobre el filtro.
Los resultados de las hibridaciones Northern
llevadas a cabo con sondas EPSPS demuestran que las siete (7)
líneas examinadas expresan ARNm de EPSPS de CP4. Las hibridaciones
llevadas a cabo con sonda de ribosoma 16S confirman que los geles
desnaturalizados estaban cargados con cantidades similares de ARN
total para cada muestra. Además, las líneas de tabaco
transplastómicas que expresan EPSPS a partir de los elementos
reguladores Prrn/rbcL(RBS) (pMON30123), expresan ARNm
de EPSPS a niveles más altos que plantas de tabaco homoplásmicas
para EPSPS controlado mediante las secuencias promotor
Prrn/G10L (pMON38773)/RBS.
Los resultados de las hibridaciones Northern
llevadas a cabo con sondas BXN, AHAS y crtI demuestran que
todas las líeas de tabaco 5026, 5175 y 5177 homoplásmicas expresaron
ARNm de crtI, BXN y/o AHAS.
Para determinar la expresión de la EPSPS, se
llevaron a cabo análisis por transferencia Western sobre una única
línea procedente de cada constructo, pMON3012, pMON30130, y
pMON38773.
La proteína soluble total se extrajo a partir de
tejido de hoja congelada mediante trituración de 250 mg de tejido
en 250 \mul de tampón PBS (KH_{2}PO_{4} 1 mM,
Na_{2}HPO_{4}, NaCl 0,137 M, KCl 2,7 mM, pH 7,0) conteniendo
inhibidores de proteasa. El homogenato se centrifugó durante 5
minutos, y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo. La
concentración de la proteína en el sobrenadante se determinó usando
un ensayo de concentración de proteína (BioRad, Richmond, CA).
La proteína total extraída se electroforetizó
sobre un gel SDS-PAGE al 4-20%
(Sigma, St Louis, MO), y se transfirió a una membrana de PVDF en
tampón 1x SDS-PAGE (Maniatis y otros, (1989), Cold
Spring Harbor Press). Se usaron patrones de proteína de EPSPS de
CP4 purificada cuantificada para cuantificar la expresión de la
EPSPS de CP4 tal como se expresó en el plástido de la planta.
Las hibridaciones Western se llevaron a cabo tal
como han descrito Staub y Maliga en EMBO Journal, vol. 12,
(no. 2), págs. 601-606, (1993), excepto que se
usaron anticuerpos generados contra EPSPS. Las membranas de PVDF
conteniendo la proteína electroforetizada transferida se incubaron
en una solución de bloqueo de tampón PBS conteniendo
Tween-20 (PBS-T) al 0,05% y leche al
5% durante una noche a 4ºC. A continuación, las membranas se
incubaron en una solución de PBS-T conteniendo leche
al 1% y un anticuerpo primario generado en cabras contra la EPSPS
de CP4 durante 2 horas a temperatura ambiente. Las membranas se
lavaron tres veces en una solución de PBS-T
conteniendo leche al 0,1%, con una duración cada lavado de 5 minutos
a temperatura ambiente. A continuación, las membranas se incubaron
en una solución de PBS-T conteniendo leche al 1% y
anticuerpo anti-cabra de oveja durante 1 hora a
temperatura ambiente, y se lavaron nuevamente en
PBS-T conteniendo leche al 0,1%, tres veces durante
10 minutos a temperatura ambiente. Se llevó a cabo un lavado final
usando únicamente PBS-T antes del revelado de las
membranas usando un kit de detección no radiactivo (ECL,
Amersham).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados listados en la Tabla 2 demuestran
que pueden obtenerse incrementos significativos en el nivel de
proteína de EPSPS a partir de plantas transformadas para expresar
EPSPS a partir del promotor Prrn/G10L. Estos resultados
demuestran que la expresión de EPSPS impulsada por las secuencias
reguladoras Prrn/rbcLRBS pueden producir aproximadamente
0,001% de la proteína soluble total como EPSPS, en tanto que en
plantas que expresan EPSPS a partir de las secuencias reguladoras
Prrn/G10L expresan 0,2% de la proteína soluble total como
EPSPS. Las líneas subsiguientes han demostrado una proteína soluble
total de aproximadamente 1% de EPSPS cuando se expresan a partir de
las secuencias reguladoras Prrn/G10L. Estos resultados,
considerados conjuntamente con los resultados de las hibridaciones
Northern anteriores, indican que puede obtenerse una traducción más
eficaz a partir del sitio de unión al ribosoma G10L.
Igualmente, se llevó a cabo la hibridación por
inmunotransferencia Western sobre 2 líneas de tabaco 5026
homoplásmicas tal como se ha descrito anteriormente, usando
anticuerpos generados contra bromoxynil. Los resultados del
análisis por inmunotransferencia Western de la proteína soluble
total extraída a partir de líneas de tabaco transformadas con
pCGN5026, demostraron que ambas líneas homoplásmicas produjeron
nitrilasa proteína.
El análisis por inmunotransferencia Western se
llevó a cabo tal como se ha descrito anteriormente a partir de
proteína total extraída a partir de líneas de tabaco transformadas
con pCGN6114 y pCGN5197.
Los resultados de los análisis demostraron que
el bromoxynil que se produjo en líneas de tabaco 6114 contenía del
1% al 2% de la proteína de hoja soluble total.
Los resultados del análisis Western de las 20
líneas de tabaco 5197 demostraron que tanto el bromoxynil como Bt
produjeron igualmente 1% de la proteína de hoja soluble total.
La actividad de la enzima de EPSPS en plantas de
tabaco transplastómicas que contenían el vector de expresión del
plástido pMON38773 se determinó usando un ensayo de cromatografía
líquida de alta presión (HPLC).
Los procedimientos para el análisis de la enzima
de EPSPS están descritos por Padgette y otros en J. Biol.
Chem., vol. 263, págs. 1798-1802, (1988) y
Arch. Biochem. Biophys., vol. 258, págs.
564-573, (1987) y por Wibbenmeyer y otros, en
Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 153, págs.
760-766, (1988). Los resultados se resumen en la
Tabla 3 a continuación.
Estos resultados demuestran que la expresión de
EPSPS en plástidos produce enzima de EPSPS activa.
Se ensayó in vitro una línea de tabaco
transplastómico homoplásmica para el constructo pMON38773 para
determinar el nivel más alto de tolerancia al glifosato. El tejido
de explante se preparó a partir de piezas de hojas de plantas de
control de tabaco de tipo salvaje no transgénico, Havana, y
la línea de tabaco homoplásmico 38773-6 y se
cultivaron para la regeneración de vástagos sobre medio TSO
(descrito anteriormente) suplementado con niveles de glifosato de
50 \muM, 75 \muM, 100 \muM, 150 \muM y 200 \muM. Los
resultados se resumen en la Tabla 4 a continuación. El número de
explantes que producen los vástagos se determinó a las 3 semanas y
6 semanas después de la preparación y cultivo del explante sobre
medio que contenía glifosato.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados anteriores demuestran que todos
los niveles de glifosato examinados, regeneraron vástagos a partir
de explantes preparados a partir de una línea de tabaco homoplásmica
para pMON38773, en tanto que no regeneraron vástagos a partir de
explantes preparados a partir de plantas de control no
transformadas. Estos resultados sugieren que las plantas de tabaco
que expresan EPSPS en plástidos demuestran tolerancia a niveles de
glifosato de al menos 200 \muM.
Se ensayaron in vitro líneas
transplastómicas adicionales para determinar la tolerancia al
glifosato tal como se ha descrito anteriormente. Los resultados se
muestran en la Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados demuestran que estas líneas
transplastómicas muestran tolerancia al glifosato. Los números
entre paréntesis son el número de vástagos resistentes a la
selección al glifosato 1 mM. De acuerdo con ello, tal como puede
observarse en la Tabla 5, se generaron líneas de tabaco que son
tolerantes a la selección a glifosato 1 mM.
Se pulverizaron plantas de tabaco homoplásmicas
de la línea 38773-6 con glifosato usando un tractor
pulverizador a concentraciones que corresponden a 0 kg/ha, 1,12
kg/ha, 2,24 kg/ha y 4,48 kg/ha, para ensayar la tolerancia de la
planta completa. La altura de la planta se midió antes y después de
la pulverización con glifosato. Los datos de daños vegetativos se
recogieron dos semanas después de la pulverización, en tanto que lo
datos de daños reproductivos se recogieron a la madurez de la
planta.
Los resultados iniciales indican que las líneas
de tabaco homoplásmicas pulverizadas son tolerantes al glifosato a
la concentración de 1,12 kg/ha, tal como se demuestra en el daño de
tejido vegetativo (Tabla 6). Tal como puede observarse en la Tabla
5, se generaron líneas transplastómicas que demostraron un buen
nivel de tolerancia al glifosato a 2,24 kg/ha. En experimentos
subsiguientes con líneas transformadas adicionales, las líneas
transplastómicas han mostrado tolerancia al glifosato a un nivel de
4,4 kg/ha.
La tolerancia se caracterizó por el crecimiento
continuo y verdeamiento de los tejidos pulverizados con glifosato.
Sin embargo, conforme se incrementó la concentración del glifosato
aplicado, existió un incremento correspondiente en el nivel de daño
vegetativo. Por el contrario, las plantas de control no
transformadas fueron altamente susceptibles a concentraciones de
glifosato tan bajas como de 1,12 kg/ha.
0 = planta normal
1 = ligera clorosis de nuevas hojas y
atrofiamiento
2 = severa clorosis de nuevas hojas,
malformación de nuevas hojas,
y severo atrofiamiento
3 = marchitamiento de la planta
4 = planta muerta
0 = fértil, sin retraso en la madurez, lotes de
semillas
1 = algún aborto, ligero retraso en la formación
de semilla, semilla
2 = aborto significativo, retraso significativo
en la formación de semilla, alguna semilla
3 = aborto muy severo, tiestos de semillas
inmaduras, unas pocas semillas
4 = flores malformadas; si florecen, extremo
retraso en la floración y sin producción de semillas
5 = planta muerta
\vskip1.000000\baselineskip
Se pulverizaron plantas de tabaco homoplásmicas
de las líneas 5175 y 5197 con herbicida Buctril a una concentración
del 4% para ensayar la tolerancia de la planta completa.
Los resultados del ensayo de pulverización con
Buctril demostraron que todas las líneas 5197 que expresan
bxn fueron completamente resistentes cuando se pulverizaron
con una solución conteniendo herbicida Buctril al 4%.
Dos líneas de las seis líneas 5175 ensayadas
fueron completamente resistentes cuando se pulverizaron con una
solución conteniendo herbicida Buctril al 4%.
Se puso a punto un experimento para determinar
la eficacia del rasgo CrtI con respecto a la resistencia al
herbicida Norflurazon. Se plantaron tres líneas transformadas 5177,
la 74-1B-P,
74-2-A, y
74-7-C, y tres líneas de control.
Las plantas se dejaron crecer durante siete semanas y, a
continuación, se mojaron con solución de Norflurazon 3 \muM. Las
plantas negativas a la presencia del gen que porta el plástido
crtI se blanquearon mediante tratamiento con Norflurazon,
las plantas positivas se mantuvieron verdes y continuaron
creciendo.
Los resultados muestran que tres líneas de
tabaco 5177 homoplásmicas fueron resistentes a la solución de
Norflurazon 3 \muM, mientras que las plantas de control fueron
todas ellas susceptibles a la solución (Tabla 7).
Las plantas transformadas seleccionadas para la
expresión del gen marcador aadA se analizaron para determinar
si se había transformado el contenido de plástido completo de la
planta (transformantes homoplásmicos). Las plantas homoplásmicas se
seleccionaron usando la hibridación Southern para posterior
cultivo.
El ADN genómico se aisló a partir de plantas de
tabaco transformadas, se electroforetizó, y se transfirió a filtros
tal como se ha descrito por Svab y otros, en Proc. Natl. Acad.
Sci., vol. 90, págs. 913-917, (1993).
Las plantas de tabaco homoplásmicas
transformadas para expresar hGH se identificaron usando una sonda
preparada a partir de un fragmento EcoRI/EcoRV de 2,4
kb procedente del vector pOVZ2 (similar al pOVZ15 descrito por
Zoubenko y otros, (1994), véase anteriormente). El fragmento de
sonda de 2,4 kb abarca parte de la secuencia de identificación.
La desaparición completa del fragmento
BamHI de tabaco nativo de 3,27 kb en las líneas con una sonda
que cubre la región de integración, y la aparición de la banda del
tamaño esperado para los fragmentos de ADN insertados en dichos
transformantes, de 5,6 kb, establece que las plantas transformadas
son homoplásmicas para los constructos destinados.
Se usaron líneas de tabaco homoplásmicas que
expresan hGH y transformantes de tabaco nucleares para determinar
la expresión de la proteína hGH. El análisis por transferencia
Western se llevó a cabo sobre líneas de tabaco que contenían los
constructos pWRG4838, pMON38755 y pMON38794 para la expresión del
plástido y se usó un ensayo ELISA para las líneas de tabaco
transgénico que contenían el pWRG4744 y pWRG4747 para la expresión
nuclear de hGH.
Las extracciones de proteína total y los
procedimientos por transferencia Western se llevaron a cabo tal como
se ha descrito anteriormente, con la excepción de que el anticuerpo
primario se generó contra hGH.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados del análisis Western (Tabla 8)
demuestran que la hGH expresada en plástidos de células de plantas
se acumula a niveles significativamente más altos que la hGH
expresada en el núcleo y dirigida tanto al citoplasma como al
plástido de células de plantas. Las plantas de tabaco transformadas
para expresar hGH en el núcleo acumulan niveles de hGH de 0,002%
(citoplásmico identificado) hasta 0,025% (plástido identificado) de
la proteína de hoja soluble total, en tanto que las plantas de
tabaco que expresan hGH en el plástido acumulan niveles de hGH de
0,2% hasta 7,0% de proteína de hoja soluble total como hGH. Además,
las plantas de tabaco homoplásmicas que expresan hGH dirigida a
partir de las secuencias reguladoras Prrn/G10L acumulan
niveles 35 veces más altos de hGH que las plantas de tabaco
homoplásmicas que expresan hGH dirigido a partir de la secuencia
promotora PpsbA. El nivel más alto de expresión puede ser debido al
fuerte promotor Prrn y/o a la traducción potenciada del gen
de fusión mediada por la región rbs del conductor del gen 10. Las
hojas de diferentes edades mostraban patrones de acumulación de hGH
variados, con hojas maduras y viejas conteniendo niveles similares y
hojas más jóvenes con mucho menos hGH. Esto está de acuerdo con el
índice de cloroplasto más bajo en las hojas jóvenes.
De manera ineresante, tanto la
ubiquitina-hGH como la hGH procesada se acumularon
en los extractos post-recolectados de las líneas
Nt-38755 y Nt-38794. El
procesamiento de ubiquitina se observó frecuentemente en >50% de
las especies de proteína hST total, dependiendo de las condiciones
de extracción. Este resultado confirma la utilidad de la vía de
proteína de fusión en proteínas expresadas en cloroplastos. La
aparición de una banda extra observada en la muestra
Nt-4838 concuerda con un dímero de hGH.
Para la comparación de sistemas de expresión en
plantas, se generaron plantas transgénicas nucleares que expresan
hGH a partir de dos conjuntos diferentes de señales de expresión.
Los constructos wrg4747 y wrg4776 expresan hGH que usan el promotor
del virus del mosaico de celidonia menor fuerte o el promotor 35S
del virus del mosaico de la coliflor, respectivamente. El
constructo wrg4747 usa un péptido de tránsito de cloroplasto contra
hGH identificada post-traducción contra
cloroplastos (FMV::CTP-hGH), en tanto que el
constructo wrg4776 identifica la hGH a través del retículo
endoplásmico (ER) contra la vía secretora
(35S::ER-hST). Las líneas transgénicas para ambos
constructos se obtuvieron a través del bombardeo de partículas. La
expresión de hST se cuantificó mediante ensayo ELISA y mostró que
era menos de 0,025% de tsp (proteína soluble total). Este nivel de
expresión es al menos 300 veces más bajo que el de las líneas
pMON38794, lo que prueba la viabilidad del sistema de expresión de
cloroplasto para la producción potencial de hST.
Con el fin de determinar si la hGH expresada a
partir de plástidos estaba adecuadamente procesada, se llevaron a
cabo experimentos para determinar el correcto plegamiento y
bioactividad.
Se usaron dos hojas de la parte baja de líneas
de tabaco transplastómico conteniendo pMON38794 para extraer y
purificar hGH. Los nervios grandes se separaron de las hojas
arrancadas, y el tejido de la hoja se cortó en pequeñas secciones
(de aproximadamente 0,5 cm^{2}). Las piezas de hoja se congelaron
rápidamente en nitrógeno líquido y se molieron hasta un polvo fino
en un mortero y pistilo refrigerados. Se agregaron diez gramos de
tejido de hoja molido, congelado, a solución base de Tris 100 mM (30
ml) enfriada en hielo y se mezcló vigorosamente mediante batido
durante 5 minutos. La solución se filtró a través de una capa
sencilla de muselina.
A partir de la solución filtrada, se prepararon
tres muestras separadas. La primera muestra se preparó centrifugando
4 ml del filtrado durante 1 minuto a 16.000 rpm. El centrifugado se
repartió en partes alícuotas dentro de viales de 1 ml y se congeló
en hielo seco. El filtrado remanente se centrifugó durante 10
minutos a 4.800 rpm, y se congelaron diversas partes alícuotas de
0,5 ml tal como anteriormente para la segunda muestra. Al filtrado
centrifugado remanente (aproximadamente 25 ml), se agregaron 200
\mul de ácido acético glacial para bajar el pH desde 8,2 hasta
4,56. La solución se centrifugó a 4.800 rpm durante 30 minutos, y el
sobrenadante se congeló sobre hielo seco para la tercera
muestra.
La proteína soluble total (TSP, Tabla 9) se
calculó en estas muestras mediante procedimientos de ensayo de
proteína convencionales (Maniatis), y el por ciento de pureza de hGH
se calculó en base a los resultados del análisis por transferencia
Western usando concentraciones conocidas del material de
partida.
El extracto con pH ajustado y centrifugado se
purificó mediante HPLC de fase inversa (RP-HPLC)
para espectrometría de masa por electropulverización y
secuenciación de aminoácido amino-terminal. La
RP-HPLC se llevó a cabo usando una bomba y
tomamuestras automático Perkin-Elmer serie 200 y una
columna de RP-HPLC Vydac C8 (250 por 4,6 mm). Se
cargaron 750 microlitros de muestra sobre la columna equilibrada con
ácido trifluoroacético (TFA) 20 mM y acetonitrilo al 50%. Después
de cargarla, la columna se lavó durante 2 minutos con acetonitrilo
al 50% y TFA 20 mM seguido de un gradiente lineal de acetonitrilo
al 2% durante 10 minutos, seguido de un gradiente de acetonitrilo
al 10% durante 1 minuto. La velocidad de flujo se mantuvo constante
a 1,5 ml/min con el eluato de la columna controlado a 278 nm con un
detector 785 de Perkin-Elmer. Los datos se
recogieron y analizaron con un sistema de datos Turbochrom de
PE-Nelson.
Los resultados del análisis mediante
RP-HPLC se muestran en la Figura 3. El pico I (pico
más alto) tiene el tiempo de retención esperado para GP2000 de
22kDa nativa, plegada adecuadamente. Este pico se recogió y secó en
un Savant Speed-Vac para la secuenciación
amino-terminal y espectrometría de masas por
electropulverización.
En el análisis de espectrometría de masa (MS) de
ionización por electropulverización se usó un espectrómetro de masa
de duración de la trayectoria por electropulverización Micromass
Q-Tof. Las muestras se prepararon mediante
resuspensión en metanol al 50% + ácido acético al 2%, y se
infundieron dentro de la fuente del espectrómetro de masa a una
velocidad de 4 ml/min. Los datos brutos mostrados en la Figura 4
muestran una serie de iones que corresponden a las especies
presentes en la muestra con números variables de protones unidos.
Los ejes de este espectro son intensidad frente a relación de masa
a carga de la especie presente. Se usó un algoritmo de
desenrrollamiento para convertir estas series de iones múltiplemente
cargados en un espectro de peso molecular.
Los resultados de la espectrometría de masa del
pico I de RP-HPLC muestran 4 especies de proteína
principales de diferente masa molecular. Las especies de 21,997 kDa
representan la masa predicha de hGH con el Phe
N-terminal predicho separado mediante
sobre-escisión de la ubiquitina proteasa con un
resto prolina N-terminal (P-hGH).
Las especies de 22,124 kDa representan la masa predicha de la
secuencia de aminoácido correcta, adecuadamente procesada, de hGH
conteniendo la fenilalanina N-terminal
(F-hGH). Las especies de 22,507 kDa y 22.664 kDa se
estima que representan una hGH con la Phe N-terminal
y hGH que ha sido modificada durante los procedimientos de
extracción de la planta, respectivamente. La masa molecular
calculada de las proteínas sugiere que la hGH expresada a partir
del plástido está adecuadamente plegada (es decir, se han creado los
enlaces disulfuro correctos).
La movilidad equivalente a la proteína producida
por E. coli replegada indica la formación de los dos enlaces
disulfuro y el adecuado plegado de la hGH derivada de cloroplasto.
Este resultado fue sorprendente dada la naturaleza procariótica de
los cloroplastos. No existen proteínas expresadas en plástidos
conocidas que tengan enlaces disulfuro. Sin embargo, las enzimas
importadas, codificadas nuclearmente, pueden ser activadas mediante
ciclos de oxidación/reducción de enlaces disulfuro, presumiblemente
usando el sistema tioredoxina del cloroplasto (Jacquot y otros,
New Phytol., vol. 136, págs. 543-570, (1997))
o una disulfuro isomerasa de proteína del cloroplasto recientemente
descubierta (Kim y Mayfield, Science, vol. 278, págs.
1954-1957, (1997)). Este resultado sugiere que el
orgánulo procariótico tiene la maquinaria necesaria para plegar el
complejo de proteínas eucarióticas en el compartimiento del estroma
del cloroplasto soluble. Esto es distinto del E. coli, en
donde las proteínas recombinantes tienden a acumularse dentro de
cuerpos de inclusión y, por ello, requieren la solubilización y el
repliegamiento.
La secuenciación amino-terminal
se llevó a cabo mediante degradación de Edman convencional, y
confirmó las secuencias N-terminales expuestas
anteriormente.
La bioactividad del extracto ajustado el pH y
centrifugado se ensayó usando células procedentes de la línea de
células Nb2. Estas células proliferan en la presencia de la hormona
del crecimiento y otros compuestos de tipo estrogénico. El ensayo
implica la preparación de diversas concentraciones de extracto que
contienen la hormona del crecimiento en una placa de 96 pocillos. A
continuación, se agregaron a cada pocillo una cantidad constante de
células. La placa se incubó durante 48 horas y, a continuación, se
agregó un reactivo denominado MTS. Las células metabolizantes
retienen el MTS y lo convierten en una substancia de color azul.
Cuantas más células existan mayor es el color azul del pocillo. El
color azul se midió usando un espectrofotómetro. El número de
células debería ser proporcional a la concentración de la hormona
del crecimiento en el medio. A una concentración algo elevada es de
esperar que las células se saturen con la hormona del crecimiento y
que la respuesta a la dosis se igualará. A concentraciones de hGH
muy bajas no se observa un crecimiento esencialmente potenciado. Se
supone que se ha de producir una gráfica de forma sigmoidea que
represente gráficamente el número de células (o absorbancia) frente
a la concentración de hGH.
El adecuado emparejamiento disulfuro en la hGH
de cloroplasto implica que la proteína debería ser biológicamente
activa. Para comprobar esta hipótesis in vitro, se usó una
línea de células de linfoma de rata, la Nb2, la cual prolifera en
la presencia de somatotropina (hGH) y otros compuestos de tipo
estrogénico, La proliferación de esta línea de células es
proporcional a la cantidad de somototropina en el medio de cultivo,
hasta que se alcanza la saturación. Al medio de cultivo de célula
Nb2 se agregó el eluato de la columna de intercambio de iones
procedente de plantas Nt-4838 y
Nt-38794 transplastómicas o plantas de tipo salvaje
tratadas de manera idéntica. Como control, se usó hGH replegado,
producido en E. coli. El extracto de planta de tipo salvaje
no mostró actividad en este ensayo, lo cual indica que no existe
compuesto de planta endógeno capaz de estimular el crecimiento de
la línea de células Nb2. Por el contrario, ambos extractos
Nt-4838 y Nt-38794 estimularon la
proliferación de la línea de células hasta un grado igual que los
controles positivos: ya sea el extracto de planta de tipo salvaje
que había sido inoculado con hGH de E. coli purificado o bien
la hGH pura sola.
Los resultados de la célula Nb2 muestran que la
hGH derivada de cloroplasto es biológicamente activa. Los estudios
previos de somatotropina recombinante producida en E. coli
mostraron farmacocinéticas equivalentes de la proteína tanto con
una metionina como una metionina o fenilalanina
N-terminal (Moore y otros, Endocrinology,
vol. 122, págs. 2920-2926, (1988)). En este estudio,
la escisión ubiquitina de la proteína de fusión en las líneas
Nt-38794 generó predominantemente
P-hST, lo que sugiere que esta especie es también
bioactiva. Igualmente, se caracterizó la hST procedente de
extractos de Nt-4838. Un análisis de aminoácidos
indicó >95% de especies de proteína con alanina en el
N-terminal. Este resultado sugiere que una actividad
metionina aminopeptidasa generó la alanina-hST, la
cual es igualmente bioactiva. Una actividad aminopeptidasa similar
existe en E. coli (Meinnel y otros, Biochimie, vol.
75, págs. 1061-1075, (1993)). Este hallazgo en
plástidos puede ser explotado en el futuro como un medio alternativo
para generar un N-terminal no metionina.
Los resultados del ensayo de bioactividad
(Figura 5) demuestran que la hGH expresada a partir de un plástido
de planta tiene una forma sigmoidea cuando se representa
gráficamente como absorbancia frente a concentración de hGH.
Se usó la expresión de líneas de tabaco
homoplásmicas para determinar la expresión de la proteína
aprotinina. El análisis por transferencia Western se llevó a cabo
sobre líneas de tabaco que contienen los constructos pCGN6146,
pCGN6147, pCGN6154 y pCGN6156 para la expresión de plástidos de
aprotinina.
Las extracciones de proteína total y los
procedimientos por transferencia Western se llevaron a cabo tal como
se han descrito anteriormente, con la excepción de que el
anticuerpo primario se generó contra aprotinina.
En la Figura 6 se muestran los resultados del
análisis Western. Estos resultados indican que la aprotinina se
expresó a partir del promotor T7 polimerasa cuando la secuencia que
codifica la aprotinina se fusionó o bien con PetA o bien con el gen
GUS de longitud completa. Además, estos resultados indican que la
secuencia petA identifica de manera eficaz la proteína aprotinina
contra el tilacoide de la célula de la planta.
<110> Calgene LLC
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Expresión de péptidos eucarióticos
en plástidos de plantas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 15346WO
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Nueva solicitud
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-07-07
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/316847
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-05-21
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/113244
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-07-10
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> a partir del bacteriófago T7
procedente del gen 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattgtagaa ataattttgt ttaactttaa gaagagata taccttaaca tctttattaa
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacaattga aattcttcct ctatatgg
\hfill88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (70)
1. Un constructo que comprende los componentes
siguientes en la dirección 5' a 3' de la transcipción:
a) una secuencia promotora del operón ARN
ribosómico 16S (Prrn);
b) un sitio de unión al ribosoma unido a dicho
componente promotor (a), en el que dicho sitio de unión al ribosoma
obtenido a partir de la secuencia conductora del gen 10 del
bacteriófago T7;
c) una secuencia de ADN que codifica un péptido
obtenido a partir de un organismo eucariótico; y
d) una región de terminación de
transcripción,
en el que dicho péptido eucariótico es distinto
de un péptido de una planta.
2. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho constructo comprende además:
(e) un gen que codifica un marcador
seleccionable para la selección de células de plantas que comprende
un plástido que expresa dicho marcador y (f) regiones de ADN de
homología al genoma de dicho plástido, en el que dichas regiones de
homología en (f) flanquean los componentes (a), (b), (c), (d) y
(e).
3. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho sitio de unión al ribosoma es el
sitio de unión al la secuencia conductora del gen 10 del
bacteriófago T7.
4. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ADN codifica un
péptido nuclear de planta.
5. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que dicho péptido nuclear de planta es un
gen del ciclo del carbono.
6. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que dicho gen del ciclo del carbono está
seleccionado entre el grupo constituido por fructosa,
1,6-bisfosfatasa aldolasa y seduheptulosa
bisfosfatasa.
7. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que dicho péptido nuclear de planta es un
péptido antifúngico.
8. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ADN codifica un
péptido de mamífero.
9. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que dicho péptido de mamífero es una
proteína seleccionada entre el grupo constituido por interferones,
anticuerpos monoclonales, agentes hematopoyéticos, hormonas de la
pituitaria, hormonas del tiroides, hormonas hipotalámicas, albúminas
y hormonas pancreáticas.
10. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que dicho péptido de mamífero es la insulina
de hormona pancreática.
11. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que dicho péptido de mamífero es una hormona
de la pituitaria seleccionada entre el grupo constituido por
hormonas somatomamotrópicas, hormonas gonadotrópicas, hormonas
tirotrópicas y hormonas corticotrópicas.
12. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 11, en el que dicha hormona de la pituitaria es una
hormona gonadotrópica seleccionada entre el grupo constituido por
gonadotropinas coriónicas, hormonas luteinizantes y hormonas
estimulantes del folículo.
13. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 11, en el que dicha hormona de la pituitaria es una
hormona somatomamotrópica seleccionada entre el grupo constituido
por prolactina y hormonas del crecimiento.
14. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 13, en el que dicha hormona somatomamotrópica es la
hormona del crecimiento bGH.
15. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 13, en el que dicha hormona somatomamotrópica es la
hormona del crecimiento hGH.
16. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 13, en el que dicha hormona somatomamotrópica es la
hormona del crecimiento pBL.
\newpage
17. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que dicho péptido de mamífero es un agente
hematopoyético seleccionado entre el grupo de eritropoyetinas,
interleucinas, y factores de estimulación de colonias.
18. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 17, en el que dicho péptido de mamífero es el factor
de estimulación de colonias G-CSF.
19. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que dicho anticuerpo monoclonal es un
anticuerpo variable de cadena F sencilla.
20. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que dicho péptido de mamífero es una
proteína de coagulación no enzimática seleccionada entre el grupo
constituido por proteínas cofactores del factor V y el factor
VIII.
21. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que dicho péptido de mamífero es un
inhibidor de proteinasa.
22. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 21, en el que dicho inhibidor de proteinasa es
aprotinina.
23. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que dicho marcador seleccionable está
seleccionado entre el grupo de aadA, resistencia a la
espectinomicina, resistencia a la estreptomicina, resistencia a la
kanamicina y un gen de tolerancia al glifosato.
24. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicha secuencia que codifica el ADN es
la secuencia nativa que codifica a dicho gen.
25. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicha secuencia que codifica el ADN es
la secuencia sintética que codifica dicho gen.
26. Un procedimiento de producción de una
proteína en una célula de planta, comprendiendo dicho procedimiento
la transformación de los plástidos de dicha célula de planta con un
constructo que comprende lo siguiente como componentes unidos de
manera operable en la dirección 5' a 3' de transcripción:
a) una secuencia promotora del operón ARN
ribosómico 16S (Prrn);
b) un sitio de unión al ribosoma unido a dicho
componente promotor (a), habiendose obtenido dicho sitio de unión
al ribosoma a partir de la secuencia conductora del gen 10 del
bacteriófago T7;
c) una secuencia de ADN que codifica un péptido
obtenido a partir de una célula eucariótica distinta de un péptido
de un plástido de una planta; y
d) una región de terminación de
transcripción,
y el crecimiento de células de plantas que
comprenden dichos plástidos transformados bajo condiciones en las
que dicha secuencia que codifica el ADN está expresada para producir
dicho péptido eucariótico en dicho plástido.
27. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 26, en el que dicho constructo comprende además:
(e) un gen que codifica un marcador
seleccionable para la selección de células de plantas que comprende
un plástido que expresa dicho marcador y (f) regiones de ADN de
homología al genoma de dicho plástido, en el que dichas regiones de
homología en (f) flanquean los componentes (a), (b), (c), (d) y
(e).
28. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 26, en el que dicho sitio de unión al ribosoma es el
sitio de unión de la secuencia conductora del gen 10 del
bacteriófago T7.
29. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 26, en el que dicho constructo comprende además:
(g) una secuencia que codifica a una proteína
secundaria fusionada a dicha secuencia de ADN que codifica un
péptido de una célula eucariótica en (c).
30. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 29, en el que dicha proteína secundaria es la
terminación de identificación tilacoide del citocromo f.
31. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 29, en el que dicha proteína secundaria es ubiquitina
N-terminal escindible.
32. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 31, por el que dicha fusión ubiquitina
N-terminal escindible está escindida a partir de
dicho péptido eucariótico mediante la etapa de recolección de dichas
células de plantas y exposición de los contenidos de dicho plástido
transformado al citosol de dicha célula de planta.
33. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 32, por el que la expresión de dicho péptido
eucariótico está potenciada.
34. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 26, en el que dicho péptido eucariótico distinto de
un péptido de un plástido de planta expresado en dicho plástido de
planta está plegado con el número correcto de enlaces disulfuro.
35. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 34, en el que dicho péptido eucariótico es hGH.
36. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 26, en el que dicho péptido eucariótico distinto de
un péptido de un plástido de planta expresado en dicho plástido de
planta transformada es bioactivo cuando se aísla a partir de dicho
plástido de planta transformada.
37. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 36, en el que dicho péptido eucariótico es hGH.
38. El procedimiento de la reivindicación 26, el
cual es adecuado para la producción de una proteína
N-terminal no metionina en un plástido de célula de
planta, comprendiendo dicho procedimiento:
la transformación de un plástidio de célula de
planta con un constructo que comprende, como componentes unidos de
manera operable en la dirección 5' a 3' de transcripción:
a) una secuencia promotora del operón ARN
ribosómico 16S (Prrn);
b) un sitio de unión al ribosoma unido a dicho
componente promotor (a), en el que dicho sitio de unión al ribosoma
está obtenido a partir de la secuencia conductora del gen 10 del
bacteriófago T7;
c) una secuencia de ADN que codifica un péptido
ubiquitina escindible;
d) una secuencia de ADN que codifica una
proteína de interés, y
e) una región de terminación de transcripción;
y
el crecimiento de una célula de planta que
comprende dicho plástido transformado bajo condiciones adecuadas
para la expresión de dicha proteína de interés y dicha secuencia
ubiquitina escindible en dicho plástido.
39. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 38, en el que dicho constructo comprende además (f)
al menos dos regiones de ADN de homología al genoma de dicho
plástido.
40. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 38, en el que dicho constructo comprende además (g)
un gen que codifica un marcador seleccionable para la selección de
una célula de planta que comprende un plástido que expresa dicho
marcador.
41. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 38, en el que dicho sitio de unión al ribosoma es el
sitio de unión de la secuencia conductora del gen 10 del
bacteriófago T7.
42. Un plástido de célula de planta que contiene
el constructo de acuerdo con la reivindicación 1.
43. Una planta, semilla de planta, parte de
planta, célula de planta o progenie de la misma que contiene un
plástido de planta de acuerdo con la reivindicación 42.
44. La célula de planta de la reivindicación 43,
que está producida de acuerdo con el procedimiento de la
reivindicación 27 y comprende más de aproximadamente 0,01% de la
proteína soluble total como dicho péptido eucarió-
tico.
tico.
45. La célula de planta de la reivindicación 44,
que comprende más de aproximadamente 0,2% de la proteína soluble
total como dicho péptido eucariótico.
46. La célula de planta de la reivindicación 44,
que comprende más de aproximadamente 1% de la proteína soluble
total como dicho péptido eucariótico.
47. La célula de planta de la reivindicación 44,
que comprende 7% o más de la proteína soluble total como dicho
péptido eucariótico.
48. La célula de planta de la reivindicación 43,
que está producida de acuerdo con el procedimiento del
reivindicación 27, en la que dicho marcador seleccionable comprende
una
5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato
sintasa tolerante del glifosato.
\newpage
49. La célula de planta de la reivindicación 43,
que tiene un plástido transformado de acuerdo con el procedimiento
del reivindicación 26.
50. La planta, semilla de planta o parte de
planta de la reivindicación 43, que comprende una célula de planta
de acuerdo con la reivindicación 49.
51. El plástido de planta de la reivindicación
42 que tiene una proteína de interés producida de acuerdo con la
reivindicación 47.
52. El plástido de planta de acuerdo con la
reivindicación 51, en el que dicha proteína de interés comprende al
menos aproximadamente 1% de la proteína soluble total en dicho
plástido.
53. El plástido de planta de acuerdo con la
reivindicación 52, en el que dicha proteína de interés comprende al
menos aproximadamente 7,0% de la proteína soluble total en dicho
plástido.
54. El plástido de planta de la reivindicación
42, que tiene incorporado de manera estable el constructo tal como
se ha definido en la reivindicación 38 dentro de su genoma.
55. La célula de planta de la reivindicación 43,
que comprende un plástido de planta que tiene incorporado de
manera estable el constructo tal como se ha definido en la
reivindicación 38 dentro de su genoma.
56. La célula de planta de la reivindicación 43,
que comprende un plástido de planta transformado producido de
acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 38.
57. La planta, semilla de planta o parte de
planta de la reivindicación 43 que comprende un plástido de planta
de acuerdo con la reivindicación 51 ó 54.
58. La planta, semilla de planta o parte de
planta de la reivindicación 43 que comprende una célula de planta
de acuerdo con la reivindicación 55 ó 56.
59. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 38, en el que dicha proteína de interés está plegada
con el número correcto de enlaces disulfuro.
60. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 38, en el que dicha proteína de interés es hGH.
61. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 38, en el que dicha proteína de interés es bioactiva
cuando se aísla a partir de dicha célula de planta.
62. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 61, en el que dicha proteína de interés es hGH.
63. El plástido de planta de la reivindicación
42, que tiene un constructo tal como se ha definido en la
reivindicación 38 integrado de manera estable dentro de su genoma; y
una proteína N-terminal no metionina.
64. La célula de planta de la reivindicación
43, que comprende un plástido de planta que tiene un constructo tal
como se ha definido en la reivindicación 38 integrado de manera
estable dentro de su genoma; y una proteína
N-terminal no metionina.
65. El procedimiento de la reivindicación 26, el
cual es adecuado para la producción de una proteína
N-terminal no metionina en un plástido de célula de
planta, en el que dicho procedimiento comprende:
la transformación de un plástido de célula de
planta con un constructo que comprende, como componentes unidos de
manera operable en la dirección 5' a 3' de transcripción:
(a) una secuencia promotora del operón ARN
ribosómico 16S (Prrn);
(b) un sitio de unión al ribosoma unido a dicho
componente promotor (a), en el que dicho sitio de unión al ribosoma
está obtenido a partir de la secuencia conductora del gen 10 del
bacteriófago T7 o es el sitio rbcLRBS;
(c) una secuencia de ADN que codifica una
proteína de interés, siendo dicha proteína de interés capaz de ser
reconocida por una metionina amino peptidasa de célula de planta,
y
d) una región de terminación de transcripción;
y
el crecimiento de una célula de planta que
comprende dicho plástido transformado bajo condiciones adecuadas
para la expresión de dicha proteína de interés que tiene un
N-terminal no metionina.
66. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 65, que comprende además la etapa de crecimiento de
una planta que tiene dicha célula de planta.
67. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 66, que comprende además la etapa de recolección de
dicha planta y el someter las células de dicha planta a medios para
la purificación de manera substancial de dicha proteína de
interés.
68. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 65, en el que dicha metionina amino peptidasa de
célula de planta escinde la metionina
N-terminal.
69. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 65, en el que el segundo aminoácido de dicha proteína
está seleccionado entre el grupo constituido por alanina, cisteína,
glicina, prolina, serina, treonina y valina.
70. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 69, en el que dicho segundo aminoácido es
alanina.
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