ES2282304T3

ES2282304T3 - Procedimiento para seleccionar antiplaquetas.

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Publication number: ES2282304T3
Application number: ES01978964T
Authority: ES
Inventors: Jun c/o Astellas Pharma Inc. TAKASAKI; Mitsuyuki c/o Astellas Pharma Inc. MATSUMOTO; Masazumi c/o Astellas Pharma Inc. KAMOHARA; Tetsu c/o Astellas Pharma Inc. SAITO; Takahide c/o Astellas Pharma Inc. OHISHI; Takatoshi c/o Astellas Pharma Inc. SOGA
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2000-11-01
Filing date: 2001-10-31
Publication date: 2007-10-16
Anticipated expiration: 2021-10-31
Also published as: JP3519078B2; DE60127435D1; WO2002036631A1; EP1331228A1; AU2002210982A1; US7405051B2; JPWO2002036631A1; EP1331228A4; DE60127435T2; US20030124626A1; EP1331228B1; ATE357457T1

Abstract

El uso de (1) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº 2. (2) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos en la que entre uno y diez aminoácidos están borrados, sustituidos y/o añadidos en la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº 2, y muestran una actividad supresora de una actividad de la adenilato ciclasa por enlace con ADP y acoplamiento con Gi; o (3) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con una secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº 2, y muestran una actividad supresora de una actividad de la adenilato ciclasa por enlace en ADP y acoplamiento con Gi como herramienta de selección de un agente antiplaquetas.

Description

Procedimiento para seleccionar antiplaquetas.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para seleccionar agentes antiplaqueta.

Técnica anterior

Las plaquetas fueron descubiertas en 1842 por Donne [C.R. Acad. Sci. (París), 14, 336-368, 1842] y durante mucho tiempo se ha considerado un componente de la sangre necesario para la hemostasis. Se sabe en la actualidad que las plaquetas no solo juegan un papel principal en el sistema hemostático, sino también papeles multifuncionales, por ejemplo, un generación clínicamente notable de arteriosclerosis, enfermedades circulatorias entre las que se incluyen enfermedades trombóticas, metástasis del cáncer, inflamación, rechazo tras injerto, participación en la reacción inmune, o similares.

En la actualidad, la revascularización por procedimientos farmacológicos o físicos se realiza para tratar las enfermedades trombóticas y las enfermedades isquémicas. Sin embargo, se ha encontrado de manera reciente que la activación, adhesión, y/o agregación de las plaquetas se promueve mediante el colapso del tejido de los vasos sanguíneos que incluye una célula endotelial tras la revascularización, o un colapso de un equilibrio de fibrinolisis-coagulación producido por un medicamento per se, que llega a ser un problema clínico. Por ejemplo, se conoce que, tras la revascularización por una terapia trombolítica usando t-PA o similar, se activan la actividad fibrinolítica y/o la actividad coagulativa, y a continuación, el equilibrio sistémico fibrinolisis-coagulación colapsa. Clínicamente, esto produce la reoclusión y llega a ser un problema terapéuticamente crítico (J. Am. Coll. Cardiol. 12, 616-623, 1988).

De manera adicional, la terapia PTCA (Angioplastia coronaria transluminal percutánea) ha llegado rápidamente a ser muy usada, y ha conseguido buenos resultados en el tratamiento de las enfermedades basadas en la aortostenosis o estenosis coronaria tal como angina, infarto de miocardio, o similar. Sin embargo, la terapia lesiona el tejido de los vasos sanguíneos que incluyen una célula endotelial, y la obstrucción coronaria aguda, y la restenosis, que se observan en aproximadamente un 30% de los casos, llegan a ser un problema.

Las plaquetas juegan un papel importante en estos diversos trastornos trombóticos (tales como la reoclusión o similares) tras la terapia de revascularización. Por tanto, se desea un agente antiplaqueta como agente como para tratar o prevenir estos trastornos trombóticos.

En relación con esto, se conoce el 5' difosfato de adenosina (ADP) como un factor importante que induce o promueve la activación, adhesión, y agregación de las plaquetas. El ADP se elimina de la plaquetas activadas mediante colágeno, trombina o similar, o a partir de los hemocitos, las células endoteliales vasculares, o los órganos lesionados por la revascularización o similares. Se considera que el ADP activa las plaquetas mediante una proteína G acoplada al receptor P2T del ADP localizado en la membrana de las plaquetas (Biochem. J., 336, 513-523, 1998).

Se ha sugerido que el receptor P2T_{PLC} del ADP de las plaquetas que se acopla con Gq, una de las proteínas G, e incrementa la concentración intracelular de Ca^{2+} mediante la fosfolipasa C (PLC), y un receptor P2T_{AC} del ADP de las plaquetas que se acopla con Gi, una de las proteínas G, y suprime la actividad de la adenilato ciclasa (AC) están presentes como receptores del ADP de las plaquetas. En la actualidad se ha identificado el receptor P2T_{LC} del ADP de las plaquetas como el receptor que se conoce como receptor P2Y1 del ADP de las plaquetas, pero no se ha identificado en su totalidad el receptor P2T_{AC} del ADP de las plaquetas (Kunapuli, S. P. y col., Trenes Pharmacol. Sci., 19, 391-394, 1988).

Se considera que Ticlopidine o Clopidogrel usados como agentes antiplaquetas actúan por inhibición del receptor P2T_{AC} del ADP mediante su metabolito en un cuerpo (Savi, P. J., Pharmacol. Exp. Ther., 269, 772-777, 1994). Además, el ARL67085, cuando se sintetiza como derivado de trifosfato de adenosina (ATP) que es un antagonista del receptor ADP en un cuerpo, muestra actividad supresora de la agregación de plaquetas por actividad agonista frente al receptor P2T_{AC} del ADP de las plaquetas, y la eficacia del mismo se demuestra usando un modelo de trombosis. (Mills, D. C., Thromb. Hemost., 76, 835-856, 1996; y Humphries, R. G., Trends Pharmacol. Sci., 16, 179-181, 1995). Además, un derivado del Ap4A [P^{1},P^{4}-di(adenosina-5')tetrafosfato] muestra actividad supresora de la agregación de las plaquetas por el ADP, mediante la actividad antagonista frente al receptor P2T_{AC} del ADP de las plaquetas, y la eficacia del mismo se demuestra usando un modelo de trombosis (Kim, B. K., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 2370-2373, 1992).

A partir de la información anterior, se desea un antagonista frente al receptor P2T_{AC} del ADP de las plaquetas que sea un fuerte agente antiplaquetas. Sin embargo, Ticlopidine o Clopidogrel muestran una débil actividad antiplaquetas y tienen problemas tales como fuertes efectos secundarios o similares. Además, el ARL67085 o derivados del mismo (análogos del ATP), los derivados del Ap4A, o similares, que se han estudiado como antagonistas del receptor del ADP son derivados de nucleótidos y por tanto su biodisponibilidad oral no es suficiente, y aparecen problemas adicionales tales como, una débil actividad supresora de la agregación de plaquetas. Por tanto, se desea intensamente un antagonista del receptor del ADP que tenga una fuerte biodisponibilidad oral (CAPRIE STEERING COMMITTEE, Lancet, 348, 1329-1339, 1996). Sin embargo, no se ha identificado todavía la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP. Por tanto, es difícil construir un sistema conveniente para seleccionar dicho compuesto y, más aún, no ha progresado el desarrollo de antagonistas P2T_{AC} del receptor de ADP.

En relación con esto, respecto a un ADN que codifique un polipéptido constituido por la misma secuencia de aminoácidos que la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP humano, que se pueda usar en la presente invención, y una secuencia de aminoácidos deducida a partir del ADN, hay varios informes (Documento WO 00/22131, Documento WO 00/31258, Documento WO 00/28028, y Documento WO 98/50549). Sin embargo, no se elucidan los ligandos en los informes, y ninguno de los informes describe que la proteína es un receptor de ADP localizado en las plaquetas.

Descripción de la invención

Por tanto, el objeto de la presente invención es proporcionar un sistema de selección conveniente para obtener un antagonista P2T_{AC} del receptor del difosfato de adenosina (ADP) que sea útil como agente antiplaquetas, y un nuevo agente antiplaquetas.

Con el deseo de resolver los problemas anteriormente mencionados, los inventores de la presente invención han realizado intensos estudios y, como resultado, han aislado con éxito un ácido nucleico (más concretamente un gen HORK3) que codifica el receptor P2T_{AC}, y han determinado la secuencia de nucleótidos del mismo y la secuencia de aminoácidos deducida. Además, los inventores han preparado un vector que comprende el ácido nucleico que codifica el receptor y una célula huésped que comprende el vector, y han hecho posible la producción de un nuevo receptor P2T_{AC} recombinante, mediante la expresión del receptor P2T_{AC} por uso de la célula huésped. Los inventores confirmaron que el receptor mostraba una actividad P2T_{AC} del receptor de ADP, y por tanto el receptor y la célula que expresa el receptor, podrían usarse como herramienta de selección de un agente antiplaquetas. Los inventores establecieron un procedimiento para detectar si un compuesto de ensayo es o no es un ligando, antagonista, o agonista del P2T_{AC} del receptor de ADP mediante el uso del receptor o de la célula que expresa el receptor, y un procedimiento para seleccionar un agente antiplaquetas usando el procedimiento de detección. Los inventores confirmaron que los compuestos por mostrar una actividad antiplaquetas (de manera más particular 2MeSAMP o AR-C69931MX) mostraron una actividad antagonista del receptor, mediante el uso del procedimiento de detección y demostraron que un antagonista del receptor era ciertamente útil como agente antiplaquetas. Además, los inventores establecieron un procedimiento para la fabricación de una composición farmacéutica para antiplaquetas, que comprende la etapa de detección y completaron la presente invención.

A saber, la presente invención se refiere a:

[1] una herramienta de selección para un agente antiplaqueta, en el que la herramienta es

(1): un polipéptido (denominado algunas veces a partir de ahora en el presente documento como "proteína P2T_{AC} del receptor de ADP humano") que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 2, o

(2): un polipéptido (denominado a partir de ahora en el presente documento como "variación funcionalmente equivalente") que tiene una secuencia de aminoácidos en la que se borran, sustituyen y/o añaden uno o varios aminoácidos en una o varias posiciones en una secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº 2, y que presentan una actividad (denominada a partir de ahora en el presente documento como "actividad P2T_{AC} del receptor de ADP") de supresión de una actividad de la adenilato ciclasa por enlace con el ADP y acoplamiento con Gi:

[2] una herramienta de selección de un agente antiplaquetas, en la que la herramienta es un polipéptido (denominada a partir de ahora en el presente documento como "proteína homóloga") que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 90% o más con la secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 2, y presenta una actividad de supresión de la actividad de la adenilato ciclasa por enlace con el ADP y acoplamiento con Gi (a partir de ahora en el presente documento, las herramientas de selección de los puntos [1] y [2] de un agente antiplaquetas y denominadas colectivamente como "herramienta de selección tipo polipéptido de un agente antiplaquetas");

[3] una herramienta de selección para un agente antiplaquetas, en la que la herramienta es un transformante que está transformado con un vector de expresión que comprende un ADN que codifica (1) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 2 (es decir, la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP humano) o (2) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos en la que se borran, sustituyen, y/o añaden uno o varios aminoácidos en una o varias posiciones en una secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 2, y que presentan una actividad de supresión de la actividad de la adenilato ciclasa por enlace con el ADP y acoplamiento con Gi (es decir, la variación funcionalmente equivalente), y se expresa el polipéptido;

[4] una herramienta de selección de un agente antiplaquetas, en la que la herramienta es un transformante que está transformado con un vector de expresión que comprende un ADN que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 90% o superior con la secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 2, y muestra actividad supresora de la actividad de la adenilato ciclasa por enlace con el ADP y acoplamiento con Gi (es decir, la proteína homóloga), y expresa el polipéptido partir de ahora en el presente documento las herramientas de selección de los puntos [3] y [4] de un agente antiplaquetas se denominan colectivamente como "herramienta de selección tipo transformante de un agente antiplaquetas");

[5] un procedimiento para detectar si un compuesto a ensayar es o no un ligando de la P2T_{AC} del receptor de ADP, que comprende las etapas de:

: poner en contacto un polipéptido de los puntos [1] ó [2] (es decir, la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP humano, una variación funcionalmente equivalente, o una proteína homóloga), una fracción de membrana celular que comprende el polipéptido, o un transformante de los puntos [3] ó [4], con el compuesto a ensayar, en presencia de un ligando marcado de un P2T_{AC} del receptor de ADP,

: y

: analizar la variación de la cantidad de ligando marcado que se enlaza con el polipéptido, la fracción de membrana celular, o el transformante (denominado a partir de ahora en el presente documento como "procedimiento de detección del ligando");

[6] un procedimiento para detectar si un compuesto a ensayar es o no un antagonista o agonista del P2T_{AC} del receptor de ADP, que comprende las etapas de:

: poner en contacto el compuesto a ensayar con un transformante de los puntos [3] ó [4] que coexpresan una proteína G quimérica que comprende un fragmento del polipéptido que tiene una actividad estimulante de la actividad de una fosfolipasa C de una proteína G que estimula la actividad de la fosfolipasa C y un fragmento de polipéptido que tiene actividad acoplada al receptor de Gi, dicha proteína G quimérica tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 11 en el término C; y

: analizar la variación de la concentración de Ca^{2+} en el transformante (denominado a partir de ahora en el presente documento como "procedimiento de detección tipo Ca^{2+}");

[7] un procedimiento para detectar si un compuesto a ensayar es o no un antagonista o agonista del P2T_{AC} del receptor de ADP, que comprende las etapas de:

: poner en contacto un transformante de los puntos [3] ó [4] con el compuesto a ensayar, en presencia de un agonista del P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas, y

: analizar la variación de la concentración de AMPc intracelular en el transformante (denominado a partir de ahora en el presente documento como "procedimiento de detección tipo AMPc");

[8] un procedimiento para seleccionar un agente antiplaquetas que comprende las etapas de:

: detectar si un compuesto a ensayar es o no un ligando antagonista o agonista del P2T_{AC} del receptor de ADP, mediante el procedimiento de detección del ligando, el procedimiento de detección tipo Ca^{2+}, o el procedimiento de detección tipo AMPc, o una combinación de los mismos, y seleccionar el antagonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP; y

[9] un procedimiento para fabricar una composición farmacéutica para antiplaquetas, que comprende las etapas de: detectar si un compuesto a ensayar es o no un ligando antagonista o agonista del P2T_{AC} del receptor de ADP, mediante el procedimiento de detección del ligando, el procedimiento de detección tipo Ca^{2+}, o el procedimiento de detección tipo AMPc, o una combinación de los mismos, y preparar un medicamento.

La "Gi" es una subfamilia de las proteínas G que se acoplan a un receptor, y funcionan como una señal de transducción y factor de amplificación en una célula, y una proteína G que suprime la actividad de la adenilato ciclasa. Cuando se suprime, por ejemplo, la actividad de la adenilato ciclasa, disminuye la concentración intracelular de AMPc.

La "proteína G" que estimula la actividad de la fosfolipasa C es una subfamilia de las proteínas G que se acoplan a un receptor, y funcionan como una señal de transducción y factor de amplificación en una célula, y una proteína G que estimula la actividad de la fosfolipasa C. Cuando se induce la actividad de la fosfolipasa C, por ejemplo, aumenta la concentración intracelular de Ca^{2+}. Como proteína G que estimula la actividad de la fosfolipasa C se puede mencionar, por ejemplo, la Gq.

El "P2T_{AC} del receptor de ADP " significa un polipéptido que tiene el P2T_{AC} del receptor de ADP.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un gráfico que muestra el efecto de 2MeSAMP sobre la agregación de plaquetas inducida por ADP en un plasma rico en plaquetas (PRP) derivado de sangre humana tratado con citrato de sodio.

La Fig. 2 es un gráfico que muestra el efecto de AR-C69931MX sobre la agregación de plaquetas inducida por ADP en PRP derivado de sangre humana tratado con citrato de sodio.

Mejor modo de realizar la invención

La presente invención se explicará en detalle a partir de ahora en el presente documento.

(1) La herramienta de selección de un agente antiplaquetas

La herramienta de selección de la presente invención de un agente antiplaquetas incluye una herramienta de selección de tipo polipéptido de un agente antiplaquetas y una herramienta de selección de tipo transformante de un agente antiplaquetas.

1) La herramienta de selección de tipo polipéptido de un agente antiplaquetas

La herramienta de selección de tipo polipéptido de la presente invención de un agente antiplaquetas incluye

(i) una herramienta de selección de un agente antiplaquetas, en la que la herramienta es el P2T_{AC} del receptor de la proteína ADP humana, es decir, el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 2;

(ii) una herramienta de selección de un agente antiplaquetas, en la que la herramienta es una variación funcionalmente equivalente, es decir, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se han borrado, sustituido, y/o añadido en una o varias posiciones de la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 2, y muestra la actividad del P2T_{AC} del receptor de ADP; y

(iii) una herramienta de selección de un agente antiplaquetas, en la que la herramienta es una proteína análoga, es decir, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 90% o más con la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 2, y muestra la actividad P2T_{AC} del receptor de ADP.

El polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 2, que se puede usar como la herramienta de selección de tipo polipéptido de la presente invención de un agente antiplaquetas, es una proteína P2T_{AC} del receptor de ADP humana constituida por 342 residuos de aminoácido. Aunque se ha sugerido que la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP proteína existe en las plaquetas, la realidad de la misma no se ha identificado hasta que los inventores de la presente invención elucidaron su función por vez primera.

Por tanto, se publicó por primera vez en una referencia tras la fecha de prioridad de la presente solicitud que el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 2 receptor del ADP de las plaquetas [Nature, 409, 11 enero 2001, 202-207; J. B. C., 276, (11), marzo 16, 8608-8615, 2001; Documento WO01/46454]. En la solicitud de patente básica de la prioridad del Documento WO01/46454, aunque se clonó un gen del receptor de ADP de rata, y se determinó la secuencia de la misma, como para el receptor de ADP humano, solamente se obtuvo un clon que contenía una secuencia parcial, y se determinó la secuencia de la misma. Por tanto, se lleva a cabo por primera vez por parte del solicitante actual la obtención de la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP humano y del polinucleótido que codifica la anterior, se elucidó la función de las misma, y se ha presentado una solicitud de patente referida a la invención del procedimiento para seleccionar un agente antiplaquetas.

La variación funcionalmente equivalente que se puede usar como la herramienta de selección de tipo polipéptido de la presente invención de un agente antiplaquetas no está limitada en particular, siempre que sea un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos en la que uno o más aminoácidos (preferiblemente entre 1 y 10, más preferiblemente entre 1 y 5) están borrados, sustituidos, y/o añadidos en una o varias posiciones de la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 2, y muestra la actividad P2T_{AC} del receptor de ADP. Demás, el origen de la variación funcionalmente equivalente no se limita al ser humano.

La variación funcionalmente equivalente incluye, por ejemplo, variaciones humanas de la P2T_{AC} del receptor de ADP humano, y P2T_{AC} de receptores de ADP derivados de organismos diferentes al ser humano (tal como un ratón, una rata, un hámster, o un perro), o variaciones de los mismos, y otras proteínas obtenidas mediante modificación artificial de estas proteínas nativas, (es decir, variaciones humanas, o P2T_{AC} de receptores de ADP derivados de organismos diferentes al ser humano o variaciones de los mismos) o de la P2T_{AC} del receptor de ADP humano por técnicas de ingeniería genética. El término "variación" tal como se usa en el presente documento significa una diferencia individual entre las mismas proteínas en la misma especie o una diferencia entre proteínas homólogas en varias especies.

Las variaciones humanes de la P2T_{AC} del receptor de ADP humano, o las P2T_{AC} de receptores de ADP derivados de organismos diferentes al ser humano se pueden obtener por las personas expertas en la técnica basándose en la información de una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de la SEC. DE ID. Nº: 1) del gen de la P2T_{AC} del receptor de ADP. En relación con esto, se pueden llevas a cabo técnicas de ingeniería genética de acuerdo con procedimientos conocidos (por ejemplo, Maniatis, T. y col., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982, o similares), a no ser que se especifique otra cosa.

Por ejemplo, se diseñan una sonda apropiada o cebadores apropiados de acuerdo con la información de la secuencia base del gen de la P2T_{AC} del receptor de ADP. Se lleva a cabo un procedimiento PCR o un procedimiento de hibridación usando una muestra (por ejemplo, ARN total o un resto de ARNm, una biblioteca de ADNc, o una biblioteca de fagos) derivado de un organismo (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano, un ratón, una rata, un hámster, o un perro) de interés, y los cebadores o la sonda para obtener un gen que codifica la proteína. Se puede obtener una proteína deseada expresando el gen resultante en un sistema de expresión adecuado, y confirmando que la proteína expresada suprime la actividad de la adenilato ciclasa por enlace con el ADP y acoplamiento con Gi, por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 3 ó 4.

Además, se puede obtener la proteína modificada de forma artificial por técnicas de ingeniería genética mediante por ejemplo, el siguiente procedimiento. Se obtiene un gen que codifica la proteína mediante un procedimiento convencional tal como la mutagénesis específica del emplazamiento (Mark, D. F. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984). Se puede obtener una proteína deseada expresando el gen resultante en un sistema de expresión adecuado, y confirmando que la proteína expresada suprime la actividad de la adenilato ciclasa por enlace con el ADP y acoplamiento con Gi, por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 3 ó 4.

La proteína homóloga que se puede usar como la herramienta de selección de tipo polipéptido de la presente invención de un agente antiplaquetas no está limitada de forma particular, siempre que sea un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos que tenga una homología del 90% o más con la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 2, y muestra la actividad de la P2T_{AC} del receptor de ADP. La proteína homóloga puede tener una secuencia de aminoácidos que tenga preferiblemente una homología del 95% o más, más preferiblemente una homología del 98% o más, lo más preferible una homología del 99% o más, con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 2.

El término "homología" tal como se usa en el presente documento significa un valor que se puede obtener mediante el paquete BLAST [Basic local alignment search tool; Altschul, S. F. y col., J. Mol. Biol., 215, 403-410, (1990)]. La homología en la secuencia de aminoácidos se puede calcular mediante el algoritmo de búsqueda BLAST. De manera más concreta, este valor se puede obtener usando un programa bl2seq (Tatiana A. Tatusova y Thomas L. Madden, FEMS Microbiol. Lett., 174, 247-250, 1999) con un parámetro por defecto en un paquete BLAST (edición sgi32bit, versión 2,0,12; obtenida de NCBI). Los parámetros por defecto en el programa bl2seq incluyen "blastp" como el programa de búsqueda, "0" como el coste de extender una separación, "SEG" como filtro de la secuencia de petición, y "BLOSUM62" como matriz.

Los polipéptidos que se pueden usar como la herramienta de selección de tipo polipéptido de la presente invención de un agente antiplaquetas (es decir, la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP humano, las variaciones funcionalmente equivalentes, y las proteínas homólogas; denominados partir de ahora en el presente documento como "el polipéptido de la herramienta de selección") se pueden obtener mediante diferentes procedimientos conocidos, tales como técnicas conocidas de ingeniería genética usando un gen que codifica la proteína de interés. Más concretamente, el polipéptido de la herramienta de selección se puede preparar mediante el cultivo de un transformante que se describe más adelante (es decir, un transformante que se transforma con un vector de expresión que comprende un ADN que codifica que el polipéptido de la herramienta de selección y expresa el polipéptido) en condiciones en las que se puede llevar a cabo la expresión del polipéptido de la herramienta de selección, y separando y purificando la proteína de interés del cultivo resultante mediante procedimientos comúnmente usados para la separación y purificación de proteínas del
receptor.

Cuando se prepara el polipéptido de la herramienta de selección, el procedimiento para obtener el gen que codifica el polipéptido no está limitado en particular. Por ejemplo, cuando se prepara la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP humano, se puede usar por ejemplo, el ADN constituido por la secuencia de nucleótidos de la SEC. DE ID. Nº: 1 como el gen que codifica la proteína. A este respecto, se conocen codones para cada aminoácido, y de manera opcional se pueden selección y determinar por procedimientos convencionales, por ejemplo, tomando un uso del codón de cada huésped para tomar en consideración Crantham, R. y col., Nucleic Acids Res., 9, r43-r74, 1981).

Se puede obtener el ADN constituido por la secuencia de nucleótidos de la SEC. DE ID. Nº: 1 por ejemplo, enlazando fragmentos de ADN preparados mediante un procedimiento de síntesis química, o un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa PCR) (Saiki, R. K. y col., Science, 239, 487-491, 1988) usando una biblioteca de ADN derivados de una célula o tejido capaz de producir la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP humano como plantilla, y un conjunto adecuado de cebadores diseñados de acuerdo con la secuencia de nucleótidos de la SEC. DE ID. Nº: 1. Como célula o tejido capaz de producir la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP humano se pueden mencionar, por ejemplo, plaquetas humanas, el cerebro humano, o similares. Como el conjunto de cebadores, se pueden mencionar, por ejemplo, una combinación de un oligonucleótido constituido por la secuencia de nucleótidos de la SEC. DE ID. Nº: 3 y un oligonucleótido constituido por la secuencia de nucleótidos de la SEC. DE ID. Nº: 4.

El procedimiento de purificación y separación que se puede usar para preparar el polipéptido de la herramienta de selección no está particularmente limitado, sino que se puede realizar, por ejemplo, de acuerdo con el siguiente procedimiento. Por ejemplo, se puede obtener un resto de membrana celular que contiene el polipéptido de la herramienta de selección cultivando células que expresan el polipéptido de la herramienta de selección en la superficie de las mismas, suspender las células cultivadas en un tampón, homogeneizar la suspensión, y centrifugar el homogenato. Tras la solubilización del resto de membrana celular resultante, se puede purificar el polipéptido de la herramienta de selección tratando la mezcla con un tratamiento usado normalmente con un precipitante de proteína, ultrafiltración, diferentes técnicas de cromatografía líquida tal como la cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de afinidad, o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), o diálisis, o una combinación de las mismas. A este respecto, cuando se solubiliza el resto de membrana celular, se pueden mantener las características del receptor tras la solubilización usando un agente solubilizante tan suave como sea posible (tal como CHAPS, Triton X-100, digitonina o similares).

Cuando se prepara el polipéptido de la herramienta de selección, se puede llevar a cabo con facilidad la confirmación de la localización intracelular del mismo, la purificación del mismo, o similar, expresando el polipéptido de la herramienta de selección en forma de proteína de de fusión con una secuencia de marcación marco adecuada, si es necesario. Como secuencia de marcación se puede mencionar, por ejemplo, un epítopo FLAG, una marca de hexa-histidina, una marca de hemoaglutinina, un epítopo myc, o similares. Además, mediante la inserción de una secuencia específica que se puede reconocer mediante una proteasa tal como una enteroquinasa, factor Xa, trombina, o similares entre la secuencia de marcación y el polipéptido de la herramienta de selección, se puede eliminar la secuencia de marcación mediante la proteasa. Por ejemplo, hay un informe en el que el receptor muscarínico de la acetilcolina y una marca de hexa-histidina se conectaron mediante una secuencia de reconocimiento de la trombina (Hayashi, M. K. y Haga, T., J. Biochem., 120, 1232-1238, 1996).

2) La herramienta de selección de tipo transformante de un agente antiplaquetas

La herramienta de selección de tipo transformante de la presente invención de un agente antiplaquetas incluye

(i) una herramienta de selección de un agente antiplaquetas, en la que la herramienta es un transformante que se transforma con un vector de expresión que comprende un ADN que codifica la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP humano y que expresa el polipéptido;

(ii) una herramienta de selección de un agente antiplaquetas, en la que la herramienta es un transformante que se transforma con un vector de expresión que comprende un ADN que codifica la variación funcionalmente equivalente y que expresa el polipéptido; y

(iii) una herramienta de selección de un agente antiplaquetas, en la que la herramienta es un transformante que se transforma con un vector de expresión que comprende un ADN que codifica la proteína homóloga y que expresa el polipéptido.

Una célula huésped que se puede usar para la preparación de los transformantes (denominados a partir de ahora en el presente documento como "transformante de la herramienta de selección") que se puede usar como la herramienta de selección de tipo transformante de la presente invención de un agente antiplaquetas no está limitada en particular, siempre que se pueda expresar el polipéptido de la herramienta de selección. Como célula huésped, se pueden mencionar, microorganismos conocidos de uso habitual tales como Escherichia coli o Saccharomyces cerevisiae, o células cultivadas conocidas, tales como células de vertebrados, por ejemplo, una célula CHO, una célula HEK293, o una célula COS) o células de insectos (por ejemplo, una célula Sf9l). Como la célula de vertebrado se pueden mencionar, por ejemplo, una célula COS como una célula de simio (Gluzman, Y., Cell, 23, 175-182, 1981), una cepa de ovario de hámster chino defectiva en dihidrofolato reductasa (CHO) (Urlaub, G. y Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220, 1980), una célula HEK293 derivada de riñón de embrión humano, una célula 293-EBNA (Invitrogen) obtenida introduciendo un gen EBNA-1 de virus Epstein Barr en la célula HEK293.

Un vector de expresión que se puede usar para la preparación del transformante de la herramienta de selección no está limitado en particular, siempre que se pueda expresar el polipéptido de la herramienta de selección. Se puede seleccionar un vector de expresión apropiado de acuerdo con la célula huésped a usar.

Como vector de expresión de una célula de vertebrado, se puede usar por lo general un vector que contiene un promotor colocado corriente arriba del gen a expresar, un emplazamiento de ayustado del ARN, un emplazamiento de poliadenilación, una secuencia de finalización de la transcripción y similares. El vector puede contener además un origen de replicación, si es necesario. Como vectores de expresión se pueden mencionar, por ejemplo, el vector pSV2dhfr que contiene un promotor temprano SV40 (Subramani, S. y col., Mol. Cell. Biol., 1, 854-864, 1981), pEF-BOS que contiene un factor promotor de elongación humano (Mizushima, S. y Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18,5322, 1990), pCEP4 que contiene un promotor de citomegalovirus (Invitrogen), o similares.

De forma más particular, cuando se usa COS como célula huésped, se puede usar como el vector de expresión un vector que tiene un origen de replicación SV40, capaz de realizar una replicación autónoma en la célula COS, y que tiene un promotor de transcripción, una señal de finalización de la transcripción y un emplazamiento de ayustado del ARN. Como vectores, se pueden mencionar, por ejemplo, pME18S (Maruyama, K. y Takebe, Y., Med. Immunol., 20, 27-32, 1990), pEF-BOS (Mizushima, S. y Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990), pCDM8 (Seed, B., Nature, 329, 840-842, 1987), o similares.

El vector de expresión se puede incorporar en las células COS mediante, por ejemplo, un procedimiento DEAE-dextrano (Luthman, H. Y Magnusson, G., Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308, 1983), un procedimiento de coprecipitación de fosfato de calcio - ADN (Graham, F. F. y van der Ed, a, J. Virology, 52, 456-457, 1973), un procedimiento que usa un reactivo de liposoma catiónico (lipofectamine; Gibco BRL), un procedimiento de electroporación (Neumann, E. y col., EMBO J., 1, 841-845, 1982), o similares.

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Cuando se usa la célula CHO como célula huésped, se puede obtener un transformante capaz de producir de manera estable el polipéptido de la herramienta de selección llevando a cabo la cotransfectación de un vector de expresión que comprende el ADN que codifica el polipéptido de la herramienta de selección, junto con un vector capaz de expresar un neogen que funciona como un marcador de resistencia a G418 tal como pRSVneo (Sambrook, J. y col., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989), pSV2-neo (Southern, P. J. y Berg, P., J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341,1982), o similares, y seleccionar una colonia resistente a G418.

Cuando se usa la célula 293-EBNA como célula huésped, por ejemplo, se puede usar pCEP4 (Invitrogen) que contiene origen de replicación de virus Epstein Barr y es capaz de realizar una replicación autónoma en la célula 293-EBNA o similares como el vector de expresión.

El transformante de la herramienta de selección se puede cultivar de acuerdo con un procedimiento convencional, y el polipéptido de la herramienta de selección se produce en la célula o en la superficie celular. Como medio a usar en el cultivo, se puede seleccionar de manera apropiada un medio habitualmente usado en una célula huésped seleccionada, se pueden usar por ejemplo, un medio tal como un medio RPMI-1640, un medio mínimo esencial de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), o similares, suplementándolos con un componente seral tal como suero fetal bovino (FBS) o similares si es necesario. En el caso de las células 293-EBNA, se puede usar un medio tal como un medio mínimo esencial de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) o similar suplementándolo con un componente seral tal como suero fetal bovino (FBS) o similares, y G418.

El transformante de la herramienta de selección no está limitado en particular, siempre que se exprese el polipéptido de la herramienta de selección. Como transformante de la herramienta de selección, es preferible que exprese una proteína G en la que la secuencia de aminoácidos en el término C sea la de la SEC. DE ID. Nº: 11 (Asp-Cys-Gly-Leu-Fe), además de la del polipéptido de la herramienta de selección. La secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 11 es aquella que está constituida por cinco residuos de aminoácido en el término C de Gi. A partir de ahora en el presente documento, la "proteína G en la que la secuencia de aminoácidos en el término C sea la de la SEC. DE ID. Nº: 11" se denomina como "proteína G de tipo Gi en el término C".

Como Proteína G de tipo Gi en el término C, se pueden mencionar, por ejemplo,

(1) Gi, o

(2) una proteína G quimérica que comprende un fragmento de polipéptido que tiene actividad estimulante de la fosfolipasa C de una proteína G (tal como Gq) que estimula la actividad de la fosfolipasa C y un fragmento de polipéptido que tiene la actividad de Gi acoplada con el receptor, y que además tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 11 en el término C. A partir de ahora en el presente documento, la proteína G quimérica que comprenden un fragmento de polipéptido que tiene la actividad estimulante de la actividad de la fosfolipasa C y un fragmento de polipéptido que tiene la actividad de Gi acoplada con el receptor se denominará como Gqi.

El polipéptido de la herramienta de selección reconoce la secuencia de aminoácidos constituida por cinco residuos de aminoácido en el término C de Gi (es decir, la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 11), y se enlaza con Gi. Por tanto, el polipéptido de la herramienta de selección se puede enlazar no solamente con Gi, sino también con Gqi. Cuando el polipéptido de la herramienta de selección y la Proteína G de tipo Gi en el término C se expresan en el transformante de la herramienta de selección, estos polipéptidos se pueden enlazar entre sí en la célula.

El "fragmento de polipéptido que tiene la actividad estimulante de la actividad de la fosfolipasa C de Gq" no está limitado en particular, siempre que o comprenda una secuencia de aminoácidos en el término C que sea necesaria para enlazarse a una P2T_{PLC} del receptor del ADP de las plaquetas acoplada con Gq, y muestra la actividad estimulante de la actividad de la fosfolipasa C. Se pueden mencionar, por ejemplo, un fragmento de polipéptido en el lado del término N de Gq en el que se borra la secuencia de aminoácidos constituida por cinco residuos de aminoácido en el término C.

El "fragmento de polipéptido que tiene una actividad acoplada a receptor de Gi" no está limitada en particular, siempre que comprenda la secuencia de aminoácidos constituida por cinco residuos de aminoácido en el término C de Gi, y no muestre actividad supresora de la actividad de de la adenilato ciclasa. Se pueden mencionar, por ejemplo, un fragmento de polipéptido en el lado del término C de Gi, constituida por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 11.

(2) El procedimiento de detección de un ligando, antagonista, o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP

Se puede detectar si un compuesto de ensayo es o no un ligando, antagonista, o agonista, de la P2T_{AC} del receptor de ADP usando el polipéptido de la herramienta de selección o el transformante de la herramienta de selección como herramienta de detección.

El procedimiento de la presente invención para detectar si un compuesto de ensayo es o no un ligando, antagonista, o agonista, de la P2T_{AC} del receptor de ADP incluye:

1) un procedimiento para detectar si un compuesto de ensayo es o no un ligando de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas (es decir, procedimiento de detección de ligando);

2) un procedimiento para detectar si un compuesto de ensayo es o no un antagonista o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas, mediante el uso de las variaciones de la concentración de Ca^{2+} intracelular en el transformante como indicador (es decir, procedimiento de detección tipo Ca^{2+});

3) un procedimiento para detectar si un compuesto de ensayo es o no un antagonista o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas, mediante el uso de las variaciones en el contenido de AMPc intracelular en el transformante como indicador (es decir, procedimiento de detección tipo AMPc); y

4) un procedimiento para detectar si un compuesto de ensayo es o no un antagonista o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas, mediante el uso de un procedimiento de enlace GTP\gammaS (es decir, procedimiento de detección tipo GTP GTP\gammaS).

Estos procedimientos de detección se explicarán en este orden a partir de ahora en el presente documento.

1) El procedimiento de detección de ligando

El procedimiento de detección de ligando de la presente invención no está limitado en particular, siempre que

(i) la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP humano, variación funcionalmente equivalente, o proteína homóloga (a partir de ahora en el presente documento denominado como "polipéptido de la herramienta de detección"), un resto de membrana celular que comprende el polipéptido de la herramienta de detección, o un transformante que expresa el polipéptido de la herramienta de detección (a partir de ahora en el presente documento el polipéptido de la herramienta de detección, el resto de membrana celular, y el transformante se denominan colectivamente como "herramienta de detección de ligando") y

(ii) se usa un ligando marcado. Se puede llevar a cabo, por ejemplo, de acuerdo con el siguiente procedimiento.

Se prepara la herramienta de detección de ligando. Se optimizan las condiciones de ensayo (por ejemplo, el tampón a usar y concentración del mismo, iones a añadir al tampón y concentración de las mismas, y el pH del sistema de ensayo). La herramienta de detección de ligando y un ligando marcado se incuban en el tampón optimizado, junto con un compuesto de ensayo, durante un tiempo predeterminado. Como ligando marcado se puede usar por ejemplo, [^{3}H] 2-tío-ADP (2mesadp). Tras la reacción, el conjunto se mezcla con un filtro de vidrio o similar, y el filtro se lava con un volumen apropiado del tampón. Se mide la radiactividad remanente en el filtro mediante un contador de centelleo en medio líquido o similar. Se puede detectar si el compuesto de ensayo es o no un ligando de la P2T_{AC} del receptor de ADP, mediante la inhibición del enlace obtenida con el ligando radiactivo como indicador. De manera más concreta, cuando la radiactividad residual en el filtro en presencia del compuesto de ensayo es menor que en ausencia del compuesto de ensato, se puede decidir que el compuesto de ensayo es un ligando de la P2T_{AC} del receptor de ADP. Se puede llevar a cabo, por ejemplo, en las condiciones que se describen en el Ejemplo 6.

2) El procedimiento de detección tipo Ca^{2+}

En el procedimiento de detección tipo Ca^{2+} de la presente invención, un transformante (a partir de ahora en el presente documento denominado como transformante de la detección tipo Ca^{2+}) se coexpresan:

(i) el polipéptido de la herramienta de detección y

(ii) se usa como transformante una proteína G quimérica (tal como Gqi) que comprende un fragmento de polipéptido que tiene la actividad estimulante de la actividad de la fosfolipasa C de una proteína G estimulante de la actividad de la fosfolipasa C y un fragmento de polipéptido que tiene una actividad acoplada a receptor de Gi, y que además tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 11 en el término C. Como transformante, es preferible usar como célula huésped una célula en la que la concentración intracelular de Ca^{2+} no aumente debido al ADP antes de la transformación. Como célula huésped, se pueden mencionar, por ejemplo, C6-15, una de las líneas de glioma de rata (Change, K. y col., J. Biol. Chem., 270, 26152-26158, 1995).

En el caso de detectar si un compuesto de ensayo es o no un agonista en el procedimiento de detección tipo Ca^{2+} de la presente invención, el transformante del procedimiento de detección tipo Ca^{2+} se pone en contacto con un compuesto de ensayo, y a continuación se analizan las variaciones en la concentración intracelular de Ca^{2+} (es decir, medidas o detectadas), de forma directa o indirecta. Las variaciones en la concentración intracelular de Ca^{2+} se pueden, por ejemplo, analizar directamente mediante el uso de un reactivo fluorescente que se enlace con el calcio, (tales como fura2, fluo3, o similares), o analizar indirectamente analizando la actividad transcripcional de un gen [tal como un gen obtenido mediante la introducción de una secuencia responsable de una proteína activadora 1 (AP1) corriente arriba de un gen de la luciferasa] en la que la regulación de la transcripción es dependiente de la concentración de Ca^{2+}.

Cuando el transformante del procedimiento de detección tipo Ca^{2+} se pone en contacto con un compuesto de ensayo, y a continuación aumenta la concentración intracelular de Ca^{2+} en su interior, se puede decidir si el compuesto de ensayo es un agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP. A este respecto, como control, se lleva a cabo un procedimiento similar usando un transformante de control que no expresa el polipéptido de la herramienta de detección pero que expresa Gqi, o una célula huésped antes de la transformación, en lugar del transformante del procedimiento de detección tipo Ca^{2+} coexpresando el polipéptido de la herramienta de detección y Gqi, y por lo tanto esto es preferible para confirmar si no se ha incrementado mediante el compuesto de ensayo la concentración intracelular de Ca^{2+} en el transformante de control o célula huésped.

En el caso de detectar si un compuesto de ensayo es o no un antagonista en el procedimiento de detección tipo Ca^{2+} de la presente invención, el transformante del procedimiento de detección tipo Ca^{2+} se pone en contacto con un compuesto de ensayo en presencia de un agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas (tales como 2MeSADP o ADP), y a continuación se analizan las variaciones en la concentración intracelular de Ca^{2+} de forma directa o indirecta. Cuando se pone en contacto el transformante del procedimiento de detección tipo Ca^{2+} con un compuesto de ensayo en presencia de un agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas, y a continuación el incremento en la concentración intracelular de Ca^{2+} en el interior del mismo por el agonista está estimulado o suprimido mediante el compuesto de ensayo, puede decidirse que el compuesto de ensayo es un antagonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP. Esto se lleva a cabo, por ejemplo, en las condiciones descritas en el Ejemplo 3.

A este respecto, como control, el transformante para la detección mediante Ca^{2+} se pone en contacto con el agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas en ausencia del compuesto de ensayo, y a continuación es necesario confirmar el grado de aumento en la concentración intracelular de Ca^{2+} en el interior del mismo mediante el
agonista.

Tal como se ha descrito más arriba en el procedimiento de detección de tipo Ca^{2+} de la presente invención, no se usa Gi per se como la proteína acoplada, sino que se usa Gqi. Por tanto, es posible detectar si un compuesto de ensayo es o no un antagonista o agonista mediante el análisis de la concentración de Ca^{2+} y no la concentración de AMPc. En general, la medida se puede llevar a cabo más fácil y rápidamente usando la concentración de Ca^{2+}, en comparación con la concentración de AMPc.

3) El procedimiento de detección de tipo AMPc

En el procedimiento de detección de tipo AMPc de la presente invención, se usa como transformante un transformante que expresa el polipéptido de la herramienta de detección (a partir de ahora en el presente documento denominado como "transformante de la detección tipo AMPc"). Gi se expresa de forma constitutiva en una célula huésped normalmente usada, y así se puede obtener el transformante de la detección tipo AMPc transformando una célula huésped con un vector de expresión que comprenden a ADN que codifica el polipéptido de la herramienta de detección. Como transformante, es preferible usar una célula en la que no disminuya debido al ADP la concentración intracelular de AMPc tal como una célula huésped antes de la transformación. Como célula huésped, se pueden mencionar, por ejemplo, una célula CHO.

En el caso de detectar si un compuesto de ensayo es o no un agonista en el procedimiento de detección de tipo AMPc de la presente invención, el transformante de la detección tipo AMPc se pone en contacto con un compuesto de ensayo, y a continuación se analizan las variaciones de la concentración intracelular de AMPc en el transformante de la detección tipo AMPc (es decir, medidas o detectadas) directa o indirectamente. Es preferible que el transformante de la detección tipo AMPc se ponga en contacto con un compuesto de ensayo en presencia de un compuesto (tal como forskolin) capaz de aumentar la concentración de AMPc.

Las variaciones en la concentración de AMPc pueden, por ejemplo, analizarse de forma directa mediante el uso de un kit de medida de AMPc comercialmente disponible (Amersham o similares), o indirectamente analizando la actividad transcripcional de un gen 8tal como un gen obtenido introduciendo un elemento de respuesta AMPc (CRE) corriente arriba de un gen de la luciferasa) en el que la regulación de la transcripción es dependiente de la concentración de AMPc.

Cuando el transformante de la detección tipo AMPc se pone en contacto con un compuesto de ensayo, y entonces disminuye la concentración intracelular de AMPc en el anterior, se puede decidir que el compuesto de ensayo es un agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP. En este caso, la disminución en la concentración de AMPc mediante un compuesto puede decidirse fácilmente cuando coexiste un compuesto (tal como forskolin) capaz de incrementar la concentración de AMPc. A este respecto, como control, se lleva a cabo un procedimiento similar usando una célula huésped que no expresa el polipéptido de la herramienta de detección, en lugar del transformante de la detección tipo AMPc que expresa el polipéptido de la herramienta de detección y Gi, y entonces es preferible confirmar que la concentración intracelular de AMPc no se disminuye mediante el compuesto de ensayo.

En el caso de detectar si un compuesto de ensayo es o no un antagonista en el procedimiento de detección de tipo AMPc de la presente invención, el transformante de la detección tipo AMPc se pone en contacto con un compuesto de ensayo en presencia de un agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas (tales como 2MeSADP o ADP), y entonces se analizan las variaciones en la concentración intracelular de AMPc (es decir, medidas o detectadas) directa o indirectamente. Cuando el transformante de la detección tipo AMPc se pone en contacto con un compuesto de ensayo en presencia de un agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas (tales como 2MeSADP o ADP) y entonces la disminución en la concentración intracelular de AMPc en el mismo debido al agonista se inhibe o suprime mediante el compuesto de ensayo, se puede decidir que el compuesto de ensayo es un antagonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP. Se puede llevar a cabo, por ejemplo, en las condiciones descritas en el Ejemplo 4 ó 5.

Además, como control, el transformante de la detección tipo AMPc se pone en contacto con el agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas en ausencia del compuesto de ensayo, y entones es necesario confirmar el grado de disminución en la concentración intracelular de AMPc de la anterior mediante el agonista.

4) El procedimiento de detección tipo enlace de GTP\gammaS

En el procedimiento de detección tipo enlace de GTP\gammaS de la presente invención, se puede detectar si un compuesto de ensayo es o no un antagonista o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas mediante un procedimiento de enlace de GTP\gammaS (Lazareno, S. y Birdsall, N. J. M., Br. J. Pharmacol., 109, 1120-1127, 1993), usando el polipéptido de la herramienta de detección, un resto de membrana celular que comprende el polipéptido, o un transformante que expresa el polipéptido, por ejemplo, de acuerdo con el siguiente procedimiento:

Se mezcla una membrana celular que expresa el polipéptido de la herramienta de detección con GTP\gammaS marcado con ^{35}S (400 pmol/L) en una solución mezclada de 20 mmol/L de HEPES (pH 7,4), 100 mmol/L de NaCl, 10 mmol/L de MgCl2, y 50 mmol/L de GDP. Tras incubación en presencia de compuesto de ensayo y en ausencia de compuesto de ensayo, cada líquido de reacción se filtró usando un filtro de vidrio o similar, y a continuación se midió la radiactividad del GTP\gammaS remanente en el filtro usando un contador de centelleo en medio líquido o similar. Se puede detectar si el compuesto de ensayo es o no un agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP usando el incremento específico del enlace GTP\gammaS en presencia del compuesto de ensayo como indicador. Además, se puede detectar si el compuesto de ensayo es o no un antagonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP usando la supresión del aumento del enlace GTP\gammaS mediante un ligando de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas (tales como 2MeSADP o ADP) en presencia del compuesto de ensayo, como indicador.

(3) El procedimiento de selección de un agente antiplaquetas

Se puede seleccionar un ligando, antagonista, o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas usando la herramienta de selección (incluyendo tanto la herramienta de selección de tipo polipéptido de un agente antiplaquetas y la herramienta de selección de tipo transformante de un agente antiplaquetas) de la presente invención de un agente antiplaquetas.

Tal como se ha descrito más arriba, se sabe que el ADP es un factor importante que induce o estimula la activación, adhesión, y agregación de las plaquetas. Además, se considera que el ASDP activa las plaquetas mediante un receptor P2T de ADP acoplado a la proteína G localizado en la membrana de las plaquetas (Biochem. J., 336, 513-523, 1998). Además, se considera que Ticlopidine o Clopidogrel, que son conocidos agentes antiplaquetas, actúan inhibiendo la P2T_{AC} del receptor de ADP vía su metabolito en un organismo (Savi, P. J., Pharmacol. Exp. Ther., 269, 772-777, 1994). Se sabe que ARL67085 o derivados del mismo (análogos de ATP), derivados de Ap4A [P^{1},P^{4}-di(adenosina-5')tetrafosfato], o similares muestran una actividad supresora de la agregación de las plaquetas debida al ADP, mediante actividad antagonista de la P2T_{AC} (Mills, D. C., Thromb. Hemost., 76, 835-856, 1996; Humphries, R. G., Trends Pharmacol. Sci., 16, 179-181, 1995; y Kim, B. K., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 2370-2373, 1992). Como se muestra en el Ejemplo 7, los antagonistas de la P2T_{AC} del receptor de ADP (tales como 2MeSAMP o AR-C69931MX) muestran actividad antiplaquetas.

A partir de la información anterior, el ligando o antagonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas es útil como sustancia capaz de controlar la activación, adhesión, y agregación de las plaquetas. Por tanto, el anteriormente mencionado polipéptido de la herramienta de selección per se, o el transformante de la herramienta de selección per se se pueden usar para la selección de un agente antiplaquetas. Más concretamente, el polipéptido de la herramienta de selección per se, o el transformante de la herramienta de selección per se pueden usar como herramienta de selección.

Los compuestos a ensayar que se pueden seleccionar usando la herramienta de selección de la presente invención de un agente antiplaquetas no están limitados en particular, pero se pueden mencionar, por ejemplo, diferentes compuestos conocidos (incluyendo péptidos) registrados en archivos químicos, compuestos obtenidos mediante técnicas de química combinatoria (Terrett, N. K. y col., Tetrahedron, 51, 8135-8137, 1995), o péptidos aleatorios preparados empleando un procedimiento de presentación de fago (Felici, F. y col., J. Mol. Biol., 222, 301-310, 1991) o similares. Además, los sobrenadantes de cultivos de microorganismos, componentes naturales derivados de plantas, o extractos de tejidos animales se pueden usar como compuestos de ensayo para la selección. Además, se pueden usarlos compuestos (incluyendo péptidos) obtenidos modificando compuestos de manera química o biológica (incluyendo péptidos) seleccionados mediante la herramienta de selección de la presente invención de un agente antiplaquetas.

Los procedimientos de selección de la presente invención se pueden dividir principalmente en los siguientes cuatro grupos de acuerdo con el procedimiento de detección a usar. Usando uno cualquiera de los procedimientos de detección, o una combinación de los mismos, se puede seleccionar una sustancia que sea útil como agente antiplaquetas detectando si un compuesto de ensayo es o no un ligando, antagonista, o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP, y seleccionando a continuación un antagonista entre los compuestos de ensayo. Los procedimientos de selección de la presente invención, es decir,

1) un procedimiento para seleccionar un ligando de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas (denominado a partir de ahora en el presente documento como procedimiento de selección de ligando);

2) un procedimiento para seleccionar un antagonista o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas mediante el uso de la variación de la concentración intracelular de Ca^{2+} en el transformante como indicador (denominado a partir de ahora en el presente documento como procedimiento de selección tipo Ca^{2+});

3) un procedimiento para seleccionar un antagonista o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas mediante el uso de la variación en la concentración intracelular de AMPc en el transformante como indicador (denominado a partir de ahora en el presente documento como procedimiento de selección tipo AMPc); y

4) un procedimiento para seleccionar un antagonista o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas mediante el uso de un procedimiento de enlace GTP\gammaS (denominado a partir de ahora en el presente documento como procedimiento de selección tipo enlace GTP\gammaS)

se explicarán en este orden a partir de ahora en el presente documento.

1) El procedimiento de selección de ligando

El procedimiento de selección de ligando de la presente invención no está limitado en particular, siempre que comprenda las etapas de:

detectar si un compuesto de ensayo es o no un ligando de la P2T_{AC} del receptor de ADP usando el procedimiento de detección de ligando de la presente invención, y

seleccionar el ligando de la P2T_{AC} del receptor de ADP.

Se puede seleccionar un ligando de la P2T_{AC} del receptor de ADP mediante el uso de la inhibición del enlace usando del ligando radiactivo obtenido mediante el procedimiento de detección de ligando como indicador. Por ejemplo, un compuesto de ensayo se hace reaccionar en las condiciones descritas en el Ejemplo 6 durante un tiempo predeterminado, y entonces se puede seleccionar como ligando mediante el uso de la inhibición del enlace de [^{3}H]-2MeSADP como indicador un compuesto de ensayo que tenga una CI_{50} de 10 \muM o menos (preferiblemente 1 \muM o
menos).

Se puede seleccionar una sustancia útil como agente antiplaquetas aplicando el ligando que se ha seleccionado mediante el procedimiento de selección de ligando de la presente invención mediante el siguiente procedimiento de selección tipo Ca^{2+}, procedimiento de selección tipo AMPc, y/o procedimiento de detección tipo enlace de GTP\gammaS, y a continuación seleccionar un antagonista.

2) El procedimiento de selección tipo Ca^{2+}

El procedimiento de selección tipo Ca^{2+} de la presente invención no está limitado en particular, siempre que comprenda las etapas de:

detectar si un compuesto de ensayo es o no un antagonista o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP usando el procedimiento de selección tipo Ca^{2+} de la presente invención, y

seleccionar el antagonista o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP.

Se puede seleccionar un agonista mediante el uso del incremento en la concentración intracelular de Ca^{2+} mediante un compuesto de ensayo en el transformante de la detección tipo Ca^{2+} como indicador en el procedimiento de detección tipo Ca^{2+}.

Se puede seleccionar un antagonista mediante un indicador en el que el incremento en la concentración intracelular de Ca^{2+} en el transformante de la detección tipo Ca^{2+} mediante un agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas (tales como 2MeSADP o ADP) se inhiba o suprima mediante un compuesto de ensayo en el procedimiento de detección tipo Ca^{2+}.

Por ejemplo, se hace reaccionar un compuesto de ensayo en las condiciones descritas en el Ejemplo 3 durante un tiempo predeterminado, y entonces se puede seleccionar como una sustancia que muestra una actividad antagonista mediante el uso de la inhibición del aumento de la concentración intracelular de Ca^{2+} mediante 2MeSADP o ADP como indicador un compuesto de ensayo que tenga una CI_{50} de 10 \muM o menos (preferiblemente 1 \muM o menos).

Se puede seleccionar una sustancia útil como agente antiplaquetas seleccionado un antagonista usando el procedimiento de selección tipo Ca^{2+} de la presente invención.

3) El procedimiento de selección tipo AMPc

El procedimiento de selección tipo AMPc de la presente invención no está limitado en particular, siempre que comprenda las etapas de:

detectar si un compuesto de ensayo es o no un antagonista o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP usando el procedimiento de detección tipo AMPc de la presente invención, y

seleccionar el antagonista o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP.

Se puede seleccionar un agonista mediante el uso de la disminución en la concentración intracelular de AMPc mediante un compuesto de ensayo en el transformante de la detección tipo AMPc como indicador en el procedimiento de detección tipo AMPc.

Se puede seleccionar un antagonista mediante un indicador en el que la disminución en la concentración intracelular de AMPc en el transformante de la detección tipo AMPc mediante un agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas (tales como 2MeSADP o ADP) se inhiba o suprima mediante un compuesto de ensayo en el procedimiento de detección tipo AMPc.

Por ejemplo, se hace reaccionar un compuesto de ensayo en las condiciones descritas en el Ejemplo 4 ó 5 durante un tiempo predeterminado, y entonces se puede seleccionar un compuesto de ensayo que tenga una CI_{50} de 10 \muM o menos (preferiblemente 1 \muM o menos) como una sustancia que muestra una actividad antagonista mediante el uso de la inhibición de la disminución de la concentración intracelular de AMPc mediante 2MeSADP o ADP como indicador.

Se puede seleccionar una sustancia útil como agente antiplaquetas seleccionado un antagonista usando el procedimiento de selección tipo AMPc de la presente invención.

4) El procedimiento de detección tipo enlace de GTP\gammaS

El procedimiento de detección tipo enlace de GTP\gammaS de la presente invención no está limitado en particular, siempre que comprenda las etapas de:

detectar si un compuesto de ensayo es o no un antagonista o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP usando el procedimiento de detección tipo enlace de GTP\gammaS de la presente invención, y

seleccionar el antagonista o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP.

Se puede seleccionar un agonista mediante el uso del incremento del enlace GTP\gammaS específico mediante un compuesto de ensayo como indicador en el procedimiento de detección tipo enlace de GTP\gammaS.

Se puede seleccionar un antagonista mediante un indicador en el que en incremento en el enlace GTP\gammaS mediante un agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas (tales como 2MeSADP o ADP) se suprime mediante un compuesto de ensayo.

Se puede seleccionar una sustancia útil como agente antiplaquetas seleccionado un antagonista usando el procedimiento de selección tipo enlace GTP\gammaS de la presente invención.

4) Fabricación de la composición farmacéutica para antiplaquetas

La presente invención incluye un agente antiplaquetas, que contiene, como ingrediente activo, un antagonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP (por ejemplo, compuestos, péptidos, anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo) seleccionados mediante los procedimientos de selección 2) a 4) o mediante una combinación de los procedimientos de selección 1) o 4).

Se puede confirmar si el antagonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP elegido muestra la actividad antiplaquetas por detección de la actividad inhibitoria de la agregación de las plaquetas humanas, por ejemplo, según el procedimiento descrito en el Ejemplo 7.

Además, la presente invención incluye un procedimiento para fabricar una composición farmacéutica antiplaquetas que comprende las etapas de:

detectar, en un ensayo de control de calidad de la composición farmacéutica antiplaquetas, si es o no un ligando, antagonista, o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP mediante el procedimiento de detección de ligando, procedimiento de detección tipo Ca^{2+}, procedimiento de detección tipo AMPc, y/o procedimiento de detección tipo enlace de GTP\gammaS, y

preparar un medicamento.

La preparación de la presente invención que contiene el antagonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP (por ejemplo, compuestos, péptidos, anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo) como ingrediente activo se puede preparar usando vehículos, rellenos, y/u otros aditivos usados en general en la preparación de medicamentos, de acuerdo con el ingrediente activo.

Los ejemplos de administración incluyen administración oral mediante comprimidos, píldoras, cápsulas, gránulos, gránulos finos, polvos, soluciones orales y similares; y la administración parenteral mediante inyecciones (por ejemplo, intravenosa, intramuscular o similares), supositorios, preparaciones transdérmicas, preparaciones de absorción transmucosa, y similares. De manera particular, en el caso de péptidos que se digieren en el estómago, se prefiere una administración parenteral tal como una inyección intravenosa, o similar, o técnicas de preparación en las que el polipéptido no es digerido, tal como la técnica de preparación que se describe en el Documento WO95/28963.

En la composición sólida para uso en administración oral, se pueden mezclar una o más sustancias activas con al menos un diluyente inerte tal como lactosa, manitol, glucosa, celulosa microcristalina, hidroxipropilcelulosa, almidón, polivinil pirrolidona, o silicato de aluminio y magnesio. En el modo habitual, la composición puede contener aditivos diferentes al diluyente inerte, tal como un lubricante, un agente desintegrante, un agente estabilizante, o un solubillizante o un agente de ayuda a la solubilización. Si es necesario, los comprimidos o las píldoras se pueden recubrir con un recubrimiento de azúcar, o una película de sustancia gástrica o entérica.

La composición líquida para administración oral puede incluir, por ejemplo, emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes, y elixires, y puede contener un diluyente inerte generalmente usado tal como agua purificada o alcohol etílico. La composición puede contener aditivos diferentes al diluyente inerte, tal como agentes humectantes, agentes suspensores, endulzantes, aromatizantes o antisépticos.

Las inyecciones para administración parenteral pueden incluir soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas asépticas. Entre los ejemplos de diluyente para uso en soluciones y suspensiones acuosas se incluyen agua destilada para uso de inyección y suero salino fisiológico. Entre los ejemplos de diluyente para uso en soluciones y suspensiones no acuosas se incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal (por ejemplo, aceite de oliva), alcoholes (por ejemplo, etanol), polysorbate 80 y similares. Dicha composición puede contener además un agente humectante, un agente estabilizante, un solubilizante o un agente de ayuda a la solubilización, un antiséptico o similar. Estas composiciones se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, mezcla de un germicida, o mediante irradiación. Alternativamente, se puede usar esterilizando las composiciones sólidas en primer lugar y disolviéndolos en agua estéril u otros solventes estériles para uso en inyección, antes de su uso.

La dosis se decide de manera opcional teniendo en cuenta la fortaleza de cada ingrediente activo seleccionado mediante el procedimiento de selección mencionado más arriba, o síntomas, edad, sexo o similares de cada paciente a administrar.

Por ejemplo, en el caso de la administración oral, la dosificación habitual para un adulto (60 kg de peso) es aproximadamente de entre 0,1 y 100 mg, preferiblemente de entre 0,1 y 50 mg por día. En el caso de la administración parenteral, la dosificación habitual es aproximadamente de entre 0,01 y 50 mg, preferiblemente de entre 0,01 y 10 mg por día en forma de inyección.

Ejemplos

La presente invención se ilustrará ahora de manera adicional mediante, pero de manera alguna limitada a, los siguientes Ejemplos. Se pueden llevar a cabo los procedimientos de acuerdo con procedimientos conocidos (Maniatis, T., y col., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982, o similares), a no se que se especifique otra cosa.

Ejemplo 1 Aislamiento del gen HORK3 de la P2T_{AC} del receptor de ADP

En el presente ejemplo, se obtuvo un ADNc de longitud completa de un gen HORK3 de la P2T_{AC} del receptor de ADP (denominado a partir de ahora en el presente documento de manera breve como gen HORK3) mediante el procedimiento PCR que usa un ADNc de cerebro humano (fabricado por Clontech) como una plantilla de acuerdo con el siguiente procedimiento.

De manera más particular, se usó un oligonucleótido constituido por la secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº: 3 como cebador directo, y se usó un oligonucleótido constituido por la secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº: 4 como cebador inverso. Se añadió una secuencia de nucleótidos que contenía la secuencia de reconocimiento XbaI a cada uno de los términos 5' de los cebadores directo e inverso. Se llevó a cabo una PCR usando la Taq ADN Polimerasa (Ex Taq DNA polimerase; fabricada por Takara-shuzo) en presencia de sulfóxido de dimetilo al 5%. En la PCR se repitió 5 veces un ciclo constituido por tratamientos a 94ºC durante 20 segundos, 58ºC durante 20 segundos, y 74ºC durante 1,5 minutos, se repitió 5 veces un ciclo constituido por tratamientos a 94ºC durante 20 segundos, 55ºC durante 20 segundos, y 74º C durante 1,5 minutos, y se repitió 25 veces un ciclo constituido por tratamientos a 94ºC durante 20 segundos, 50ºC durante 20 segundos, y 74ºC durante 1,5 minutos. Como resultado, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,0 Kpb. Se digirió el fragmento de ADN con XbaI, y se insertó en el emplazamiento XbaI de un plásmido pEF-BOS-dhfr (Mizushima, S y Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990) para obtener un plásmido pEF-BOS-dhfr-HORK3.

Se determinó la secuencia de nucleótidos del gen HORK3 en el plásmido pEF-BOS-dhfr-HORK3 usando un secuenciador de ADN (Secuenciador de ADN ABI377; fabricado por Applied Biosystems) mediante un procedimiento de finalizador dideoxi. La secuencia de nucleótidos del gen HORK3 fue la de la SEC DE ID Nº: 1.

La secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº:1 contiene un marco de lectura abierto (ORF) constituido por 1029 bases. La secuencia de aminoácidos (342 aminoácidos) deducida a partir de la ORF fue la de la SEC DE ID Nº: 2.

Ejemplo 2 Confirmación de la distribución de la expresión del gen HORK3 en hemocitos

Se recogió sangre de un voluntario sano usando heparina, y se centrifugó a 400 x g durante 10 minutos. Se tomó la capa superior como plasma rico en plaquetas.

Se añadió a la capa inferior 1/3 de volumen de dextrano al 6% / solución salina fisiológica, y a continuación se dejó reposar el conjunto a temperatura ambiente durante 1 hora. Se tomó el sobrenadante y se centrifugó a 150 x g durante 5 minutos, y a continuación se suspendió el residuo en HBSS (Solución de Sales Equilibradas de Hanks). Se dispuso en capas la suspensión en un volumen igual de Ficoll (Ficoll Paque; Pharmacia) y a continuación se centrifugó el conjunto a 400 x g durante 30 minutos. Se tomaron la capa intermedia resultante y el residuo como "una fracción celular mononuclear" y los leucocitos polimorfonucleares, de manera respectiva.

Se añadieron microperlas CD16 (fabricadas por Daiichi Pure Chemicals) a los leucocitos polimorfonucleares y a continuación se separó "una fracción neutrófila" de "una fracción eosinófila" usando un agitador magnético.

Se añadió EDTA al plasma rico en plaquetas obtenido anteriormente hasta una concentración final de 2 mmol/L, y a continuación se centrifugó el conjunto a 2500 x g durante 15 minutos. Se volvió a suspender el residuo resultante en 120 mmol/L de NaCl / 2 mmol /L de EDTA / 30 mmol/L de Tris-HCl (pH 7,4), y a continuación se centrifugó la suspensión a 2500 x g durante 15 minutos para obtener el residuo como "una fracción de plaquetas". Se lavaron de manera respectiva la fracción celular mononuclear, la fracción neutrófila, y la fracción eosinófila con solución salina fisiológica.

Se purificaron los ARN totales procedentes de la fracción celular mononuclear, la fracción neutrófila, la fracción eosinófila, y la fracción de plaquetas usando un reactivo purificante de ARN total comercialmente disponible (isogen; fabricado por Nippon Gene), de manera respectiva. Se hizo reaccionar el ARN total (5 \mug) derivado de cada fracción con DNasa (fabricada por Nipón Gene) a 37ºC durante 15 minutos. Se convirtió el ARN total tratado con DNasa en ADNc mediante un sistema Superscript de primera cepa (para RT-PCR; fabricado por GIBCO).

Se llevó a cabo un análisis de un nivel de expresión del ARNm de HORK3 en los hemocitos usando cada uno de los anteriores ADNc como plantilla y un detector de secuencia (Detector de Secuencia Prism7700; fabricado por Applied Biosystems). Se usaron como un primer conjunto de cebadores un oligonucleótido constituido por la secuencia de bases de la SEC DE ID Nº: 5 y un oligonucleótido constituido por la secuencia de bases de la SEC DE ID Nº: 6. Se usó como sonda un oligonucleótido constituido por la secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº: 7, en la que se marcó el término 5' de la misma con un indicador de fluorescencia FAM (6-carboxi-fluoresceína) y se marcó el término 3' con un indicador de fluorescencia TAMRA (6-carboxi-tetrametil-rodamina), que reconoce de manera específica el ADNc de HORK3.

Se llevó a cabo la PCR usando un reactivo de PCR comercialmente disponible (Reactivo núcleo de PCR Taqman; fabricado por Applied Biosystems) y repitiendo 50 veces un ciclo constituido por tratamientos a 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 60 segundos en presencia de DMSO al 5%. De manera adicional, se llevó a cabo una PCR para obtener una curva estándar para calcular un nivel de expresión del ARNm, bajo las mismas condiciones, usando un ADN genómico humano como plantilla y el conjunto de cebadores y la sonda anteriores [J. Neurosci. Methods. 98, 9-20 (2000)].

Además, para calcular, como un estándar interno, un nivel de expresión de la \beta-actina humana, se llevó a cabo una PCR bajo las mismas condiciones, usando como plantilla cada ADNc anterior o el ADN genómico humano, un oligonucleótido constituido por la secuencia de bases de la SEC DE ID Nº: 8 y un oligonucleótido constituido por la secuencia de bases de la SEC DE ID Nº: 9 como conjunto de cebadores, y un oligonucleótido constituido por la secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº: 100, en la que se marcó el término 5' de la misma con un indicador de fluorescencia FAM y se marcó el término 3' de la misma con un indicador de fluorescencia TAMRA, como sonda que reconoce de manera específica la \beta-actina.

Los niveles de expresión del ARNm de la \beta-actina en la fracción celular mononuclear, fracción neutrófila, fracción eosinófila, y fracción de plaquetas fueron 15000 copias, 19000 copias, 25000 copias, y 33000 copias por 1 ng de ARN total, de manera respectiva. En contraste, se encontró que el ARNm de HORK3 se expresaba de manera específica en las plaquetas, pero se expresaba poco en las células mononucleares, neutrófilas, y eosinófilas.

Ejemplo 3 Confirmación del aumento de la concentración intracelular de Ca^{2+} mediante 2MeSADP o ADP en células c6-15 que coexpresan la proteína HORK3 y Gqi

Cuando se añaden a una célula la mayor parte de las purinas tales como ADP, 2MeSADP (2-metiltio-ADP, o similares, se observa el aumento del Ca^{2+} intracelular mediante el receptor endógeno de membrana celular. Por tanto, para analizar si reacciona o no una proteína derivada de un gen introducido exógenamente con ADP o 2MeSADP, es preferible expresar la proteína usando una célula que no reaccione con ADP o 2MeSADP. Se conoce que c6-15, una línea celular de glioma de rata, no reacciona con ADP o similares (Change, K. y col., J. Biol. Chem., 270, 25152-26158, 1995). En el presente ejemplo, se usaron las células c6-15 para expresar la proteína HORK3.

De manera adicional, se usó el plásmido pEF-BOS-dhfr-HORK3 obtenido en el Ejemplo 1 como un plásmido de expresión que se va a usar para expresar la proteína HORk3.

Se preparó un vector de expresión para expresar las proteínas quiméricas de Gq y Gi usadas en el presente ejemplo de acuerdo con un procedimiento de Conklin, B. R. y col. (Nature, 363, 274-276, 1993) clonando un gen (denominado a partir de ahora en el presente documento como gen Gqi), que había sido construido sustituyendo cinco aminoácidos (Glu-Tyr-Asn-Leu-Val; la secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 12) en el término C de Gq con cinco aminoácidos (Asp-Cys-Gly-Leu-Phe; la secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 11) en el término C de Gi, en el plásmido pEF-BOS. Se nombró el plásmido construido plásmido pEF-BOS-Gqi.

Se sembraron las células c6-15 en placas de 96 pocillos (placas de fondo negro / transparente con 96 pocillos, recubiertas con colágeno I; fabricadas por BECTON DICKINSON) de tal manera que la concentración de las células llegó a ser de 2 x 10^{4} células / pocillo) tras cultivar durante 48 horas, se llevó a cabo una transfección del gen usando un reactivo de transfección (LipofectAMINE 2000; fabricado por GIBCO BRL) y la combinación del plásmido pEF-BOS-dhfr-HORK3 (50 ng / pocillo) y el plásmido pEF-BOS-Gqi (50 ng / pocillo). Como control, se llevó a cabo una transfección del gen usando la combinación del plásmido pEF-BOS-dhfr (es decir, un vector vacío sin el gen HORK3) y el plásmido pEF-BOS-Gqi, en vez de la combinación del plásmido pEF-BOS-dhfr-HORK3 y el plásmido pEF-BOS-Gqi.

Después de 24 horas a partir del procedimiento de transfección del gen, se eliminó el medio, y a continuación se añadió HBBS (Solución de Sal Equilibrada de Hank; 100 \muL / pocillo) que contenía 4 \mumol/L de Fluo-3, AM (fabricado por Molecular Probe), ácido plurónico al 0,004% (marca comercial = Pluronic F127, fabricado por Molecular Probe), suero bovino fetal (FBS) al 1%, 20 mmol/L de HEPES, y 2,5 mmol/L de probenecid. Tras incubar a 37ºC durante 1 hora, se lavaron las células 4 veces con HBBS (fabricado por GIBCO) que contenía 20 mmol/L de HEPES y 2,5 mmol/L de probenecid, y a continuación se añadió HBBS (100 \muL / pocillo) que contenía 20 mmol/L de HEPES y 2,5 mmol/L de probenecid.

Se midió el curso temporal del cambio en la concentración de Ca^{2+} intracelular usando FLIPR (fabricado por Molecular Device). De manera más particular, tras 10 segundos del comienzo de la medida, se añadieron 2MeSADP o ADP a los pocillos hasta una concentración final de 3 x 10^{-5} mol/L a 1 x 10^{-12} mol/L. Tras la adición, se midió cada intensidad de fluorescencia en un intervalo de 1 segundo durante 50 segundos, y a continuación en un intervalo de 6 segundos durante 4 minutos.

Se observó el aumento de la concentración de Ca^{2+} intracelular dependiente de la concentración de 2MeSADP o ADP en las células en las cuales se había transfectado la combinación del plásmido pEF-BOS-dhfr-HORK3 y el plásmido pEF-BOS-Gqi. En contraste, no se observó el cambio de la concentración de Ca^{2+} intracelular mediante 2MeSADP o ADP en las células en las cuales se había transfectado la combinación del plásmido pEF-BOS-dhfr (vector vacío) y el plásmido pEF-BOS-Gqi.

Se midió el cambio de la concentración de Ca^{2+} intracelular mediante 2MeSADP o ADP en las células en las cuales se había transfectado el plásmido pEF-BOS-dhfr-HORK3 y el plásmido pEF-BOS-Gqi, se representó gráficamente cada valor punta en diversas concentraciones de 2MeSADP o ADP, y a continuación se analizó la dependencia de la concentración usando un procedimiento logístico de regresión. Como resultado, se encontró que la DE_{50} de 2MeSADP era 5,4 nmol/L, y que la DE_{50} de ADP era 220 nmol/L. Tal como se ha descrito anteriormente, se confirmó que el cambio dependiente de la dosis en la concentración de Ca^{2+} intracelular se indujo haciendo reaccionar el transformante con 2MeSADP o ADP para la detección de tipo Ca^{2+} que coexpresa el polipéptido para una herramienta de detección y Gqi.

Tal como se ha descrito anteriormente, se encontró que la proteína HORK3, uno de los polipéptidos para la detección, es un receptor acoplado a Gi que reacciona con ADP. De manera adicional, como resulta evidente a partir de los resultados del presente ejemplo, llega a ser factible seleccionar un agonista o antagonista midiendo el cambio de la concentración de Ca^{2+} intracelular en la célula C6-15 que coexpresa la proteína HORK3 (uno de los polipéptidos para una herramienta de detección) y Gqi.

Ejemplo 4 Confirmación de la inhibición de la producción de AMPc mediante 2MeSADP o ADP en células CHO que expresan la proteína HORK3

Se encontró a partir del Ejemplo 3 que el receptor de ADP era un receptor acoplado a Gi, y de esta manera se espera que el receptor de ADP tenga una actividad de supresión de la actividad de la adenilato ciclasa. Por tanto, cuando se lleva a cabo el procedimiento de selección de tipo AMPc de la presente invención, es preferible seleccionar una línea celular que no tenga una actividad de supresión de la actividad de la adenilato ciclasa mediante ADP o 2MeSADP, como una célula huésped que se va a usar para expresar la proteína del receptor de ADP. Se encontró que las células CHO eran las más preferibles investigando para una célula en la que una cantidad de AMPc producido mediante un estímulo de forskolina no disminuyó mediante el ADP o 2MeSADP de acuerdo con el siguiente procedimiento, y de esta manera se usaron las células CHO como las células que se van a usar para expresar la proteína del receptor de ADP. A este respecto, se usó en el presente ejemplo la línea celular que carecía de dihidrofolato reductasa [línea CHO-dhfr (-)] (DHFR; un enzima esencial para la síntesis de novo de ácidos nucleicos). Se usó el plásmido pEF-BOS-dhfr-HORK3 como un plásmido de expresión que se va a usar para expresar la proteína HORK3.

Se sembró la línea CHO-dhfr (-) sobre cada placa petri de 10 cm (1 x 10^{6} células / placa) usando un medio \alphaMEM (con ácidos nucleicos. Tras cultivar durante 1 día, se llevó a cabo una transfección del gen usando un reactivo de transfección (LipofectAMINE 2000; fabricado por GIBCO BRL) y el plásmido pEF-BOS-dhfr-HORK3 (8 \mug). Como control, se llevó a cabo una transfección del gen usando el plásmido pEF-BOS-dhfr (es decir, un vector vacío sin el gen HORK3), en vez del plásmido pEF-BOS-dhfr-HORK3.

Después de 24 horas a partir del procedimiento de transfección del gen, se tomaron las células transfectadas y se suspendieron en un medio \alphaMEM (sin ácidos nucleicos) que contenía 100 nmol/L de metotrexato (un inhibidor competitivo de DHFR; fabricado por Wako Pure Chemical Industries). Se diluyó gradualmente cada suspensión y se volvió a sembrar sobre cada placa petri de 10 cm. Se tomaron individualmente las colonias que aparecieron después de 2 semanas, y se usaron como células CHO que expresan la proteína HORK3 o una célula CHO control transfectada con el vector vacío en el siguiente experimento.

Se sembraron las células CHO que expresaban la proteína HORK3 o las células CHO transfectadas con el vector vacío sobre una placa con 24 pocillos (1 x 10^{5} células / pocillo). Tras cultivar durante 1 día, se trataron las células con un medio \alphaMEM (sin ácidos nucleicos) que contenía 1 mmol/L de 3-isobutil-1-metilxantina (fabricada por Sigma) y BSA al 0,1% durante 10 minutos, y a continuación la combinación de 2 \mumol/L de forskolina (fabricada por Wako Pure Chemical Industries) y 2MeSADP (concentración final = 1 x 10^{-12} a 1 x 10^{-7} mol/L), o se añadió gota a gota la combinación de 3 \mumol/L de forskolina y ADP (concentración final = 1 x 10^{-10} a 1 x 10^{-5} mol/L). Tras incubar a 37ºC durante 30 minutos se eliminó el sobrenadante del cultivo, y a continuación se disolvieron las células en un reactivo de lisis celular contenido en un sistema AMPc-EIA (BIOTRAK; fabricado por Amersham).

Se midió la cantidad de AMPc producido en cada célula bajo cada condición usando el sistema AMPc-EIA de acuerdo con un protocolo unido a lo anterior. Cuando se consideró como el 100% la cantidad de AMPc producido por estimulación con 3 \mumol/L de forskolina sola, se trazó una curva dependiente de la concentración para la cantidad de AMPc en presencia de 2MeSADP o ADP. A partir de la curva dependiente de la concentración, la respuesta de 2MeSADP y ADP frente a la proteína HORK3 fue DE_{50} = 0,07 nmol/L y DE_{50} = 35 nmol/L, de manera respectiva.

En contraste, no se observaron cambios en la cantidad de AMPc producido mediante el estímulo de forskolina en la célula CHO transfectada con el vector vacío, incluso si se añadieron 2MeSADP o ADP.

Ejemplo 5 Efectos de los inhibidores y confirmación de la inhibición de la producción de AMPc mediante 2MeSADP o ADP en células C6-15 que expresan la proteína HORK3

Se encontró que la célula C6-15 era también la más preferible como célula en la que no disminuía la cantidad de AMPc producido mediante el estímulo de forskolina mediante ADP o 2MeSADP, y, de esta manera, se usó también la célula C6-15 como célula que se va a usar para expresar la proteína del receptor de ADP.

Se usó el plásmido pEF-BOS-dhfr-HORK3 como vector de expresión que se va a usar para expresar la proteína HORK3.

Se sembraron las células C6-15 sobre en placa petri de 10 cm (1 x 10^{6} células / placa) usando un medio DMEM. Tras cultivar durante 1 día, se llevó a cabo una transfección del gen usando un reactivo de transfección (LipofectAMINE 2000; fabricado por GIBCO BRL), y los plásmidos pEF-BOS-dhfr-HORK3 (8 \mug) y pEF-BOS-neo (Nucleic Acid Res., 18, 5322, 1990; 0,8 \mug):

Después de 24 horas a partir del procedimiento de transfección del gen, se tomaron las células transfectadas y se suspendieron en un medio DMEM que contenía 0,6 mg/mL de G418 (fabricado por GIBCO BRL). Se diluyó gradualmente cada suspensión y se volvió a sembrar sobre cada placa petri de 10 cm. Se tomaron individualmente las colonias que aparecieron después de 2 semanas, y se usaron como una célula C6-15 que expresa la proteína HORK3 en el siguiente experimento.

Se sembraron las células C6-15 que expresaban la proteína HORK3 sobre una placa con 96 pocillos (1 x 10^{4} células / pocillo). Tras cultivar durante 1 día, se trataron las células con un medio DMEM que contenía 1 mmol/L de 3-isobutil-1-metilxantina (fabricado por Sigma) y BSA al 0,1% durante 10 minutos, y a continuación la combinación de 1 \mumol/L de forskolina (fabricado por Wako Pure Chemical Industries) y 2MeSADP (una concentración final = 1 x 10^{-12} a 1 x 10^{-7} mol/L), o se añadió gota a gota la combinación de 1 \mumol/L de forskolina y ADP (concentración final = 1 x 10^{-10} a 1 x 10^{-5} mol/L). Tras incubar a 37ºC durante 30 minutos, se eliminó el sobrenadante del cultivo, y a continuación se disolvieron las células en PBS que contenía Triton X-100 al 0,2%.

Se midió la cantidad de AMPc producido en cada célula bajo cada condición usando un kit AMPc HTRF. (fabricado por CIS bio international) de acuerdo con un protocolo unido a lo anterior. Cuando se consideró como el 100% la cantidad de AMPc producido mediante estimulación con 1 \mumol/L de forskolina sola, se trazó una curva dependiente de la concentración para la cantidad de AMPc en presencia de 2MeSADP o ADP. a partir de la curva dependiente de la concentración, la respuesta de 2MeSADP y ADP frente a la proteína HORK3 fue DE_{50} = 0,08 nmol/L y DE_{50} = 42 nmol/L, de manera respectiva. La célula C6-15 que expresaba la proteína HORK3 presentó casi la misma propiedad que la de la célula CHO que expresaba la proteína HORK3 descrita en el Ejemplo 4.

A continuación, se examinaron los efectos de los compuestos, que se conocen por suprimir la agregación de las plaquetas, sobre la supresión de la cantidad de AMPc producido mediante el estímulo de forskolina en la célula C6-15 que expresa la proteína HORK3 mediante 2MeSADP. Como compuestos que suprimen la agregación de plaquetas, se usaron 2 MeSAMP (monofosfato de 2-metiltio adenosina) (Thromb. Haemost., 81, 111-117, 1999) o AR-C69931MX ácido (N6-[2-metiltioetil]-2-[3,3,3-trifluoropropiltio]-5'-adenílico, monoanhídrido con ácido diclorometilenobifosfónico) (J. Med. Chem., 42, 213-220, 1999). En el sistema de medida anterior, se trataron las células con una solución [preparada disolviendo 2MeSAMP (10^{-7} a 10^{-4} mol/L) o AR-C69931MX (10^{-12} a 10^{-6} mol/L) en medio DMEM que contenía 1 mmol/L de 3-isobutil-1-metilxantina (fabricada por Sigma) y BSA al 0,1%] durante 10 minutos, y a continuación se añadió gota a gota la combinación de 1 \mumol/L de forskolina (fabricada por Wako Pure Chemical Industries) y 10 nmol de 2MeSADP. Tras incubar a 37ºC durante 30 minutos, se eliminó el sobrenadante del cultivo, y a continuación se disolvieron las células en PBS que contenía Triton X-100 al 0,2%. Se midió la cantidad de AMPc producido usando el kit AMPc HTRF de acuerdo con un protocolo unido a lo anterior. Cuando se consideró como 0% la cantidad de AMPc producido por estimulación con 1 \mumol/L de forskolina sola, y que se consideró como 100% por estimulación con la combinación de 1 \mumol/L de forskolina y 10 nmol/L de 2MeSADP, se trazó una curva dependiente de la concentración de cada inhibidor. A partir de la curva dependiente de la concentración, los efectos inhibidores de 2MeSAMP y AR-C69931MX sobre la supresión mediante 2MeSADP en la cantidad de AMPc producido por el estímulo de forskolina fueron DI_{50} = 5 \mumol/L y DI_{50} = 2,4 nmol/L, de manera respectiva.

Ejemplo 6 Ensayo del enlace de 2MeSADP con la célula C6-15 que expresa la proteína HORK3

Se tomaron y se lavaron las células C6-15 que expresan la proteína HORK3 preparada en el Ejemplo 5, y se suspendieron a continuación en 20 mmol/L de Tris-HCl (pH 7,4) que contenía 5 mmol/L de EDTA y un conjunto de cóctel inhibidor de la proteasa (Complete ^{TM}, fabricado por Boeringer Mannheim). Se homogeneizó el conjunto usando un POLYTRON, y se ultracentrifugó. Se suspendió el residuo en 50 mmol/L de Tris-HCl (pH 7,4) que contenía 1 mmol/L de EDTA, 100 mmol/L de NaCl, BSA al 0,1%, y Complete ^{TM} para obtener una fracción de membrana.

Después se añadió [^{3}H]-2MeSADP (fabricado por Moravek Biochemical) a 20 \mug de la fracción de membrana hasta una concentración final de 0,25 a 50 nmol/L, y se incubó en 250 \muL de 50 mmol/L de Tris-HCl (pH 7,4) que contenía 1 mmol(L de EDTA, 100 mmol/L de NaCl, BSA al 0,1%, y Complete ^{TM} a temperatura ambiente durante 1 hora, se recogió el conjunto en un filtro de vidrio usando un cosechador celular. Se añadió un microcentelleador al filtro de vidrio, y a continuación se midió la cantidad total de enlace a la fracción de membrana usando un contador líquido por centelleo. De manera adicional, se midió una cantidad de enlace no específico de la fracción de membrana añadiendo 2MeSADP (concentración final = 50 \mumol/L) en el ensayo anterior. Como resultado, se encontró que [^{3}H]-2MeSADP se enlazaba de manera específica con la fracción de membrana de la célula C6-15 que expresa la proteína HORK3. Como resultado del análisis Scatchard para el enlace, la constante de disociación de enlace de [^{3}H]-2MeSADP con la fracción de membrana de la célula C6-15 que expresa la proteína HORK3 fue Kd = 0,27 nmol/L, y el enlace máximo fue Bmax = 3,7 pmol/mg. En contraste, no se observó dicho enlace específico en la fracción de membrana de la célula C6-15 huésped que no expresaba la proteína HORK3.

A continuación, se examinó un efecto de 2MeSAMP o AR-C69931MX usando la fracción de membrana de la célula c6.15 que expresaba la proteína HORK3 preparada en el Ejemplo 6, y usando una actividad de inhibición del enlace del [^{3}H]-2MeSADP como indicador. De manera más particular, se añadieron después 2 MeSAMP (10^{-7} a 10^{-4} mol/L) o AR-C69931MX (10^{-12} a 10^{-6} mol/L) y 1 nmol/L de [^{3}H]-2MeSADP a 20 \mug de la fracción de membrana de la célula C6-15 que expresaba la proteína HORK3, y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas, se recogió el conjunto en un filtro de vidrio usando un cosechador celular. Se añadió un microcentelleador al filtro de vidrio, y a continuación se midió la radioactividad usando un contador líquido por centelleo. De manera adicional, se midió la radioactividad pero sin añadir el compuesto y añadiendo 2MeSADP (concentración final = 10 \mumol/L) en el ensayo anterior, como cantidad total de enlace y como cantidad de enlace no específico, de manera respectiva. A partir de la curva dependiente de la concentración de cada compuesto, los efectos inhibidores de 2MeSAMP y AR-C69931MX sobre el enlace de 2MeSADP con la proteína HORK3 fueron DI_{50} = 4,9 \mumol/L y DI_{50} = 9,8 nmol/L, de manera respectiva.

De manera adicional a los resultados del Ejemplo 3, se suprimió en los Ejemplos 4 y 5 la cantidad de AMPc producido por el estímulo de forskolina en las células CHO y C6-15 que expresaban la proteína HORK3 mediante 2MeSADP o ADP, de manera respectiva. Estos resultados hacen más claro que el receptor de ADP se acopló con Gi. De manera adicional, a partir de los resultados de los Ejemplos 4 y 5, llega a ser factible seleccionar un agonista o antagonista midiendo el cambio de la concentración de AMP intracelular en la célula CHO o C6-15 que expresa la proteína HORK3 (uno de los polipéptidos para la herramienta de selección). Además, es posible seleccionar un ligando midiendo la inhibición del enlace de 2MeSADP con la fracción de membrana de la célula C6-15 que expresa la proteína HORK3, de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 6.

Tal como se ha descrito anteriormente, la proteína HORK3 es un receptor acoplado a Gi expresado en las plaquetas, a partir de los resultados en los Ejemplos 2 a 6, y de esta manera, se considera que la proteína HORK3 es una entidad del receptor P2T_{AC} del ADP de la plaqueta en el que se ha sugerido la existencia del anterior.

Ejemplo 7 Confirmación de la actividad de inhibición de la agregación de la plaqueta humana

Se recogió sangre de una persona sana (adulto, varón) usando 1/10 de volumen de citrato de sodio, y a continuación se preparó plasma rico en plaquetas (PRP) de acuerdo con un procedimiento de De Marco y col. (J. Clin. Invest., 77, 1272-1277, 1986). Se usó el PRP tras preparar este con 3 x 10^{8} células/mL usando un contador automático de células sanguíneas (MEK6258; Nihon Kodehen Corporation). Como inductor de la agregación, se usó ADP, que es un producto fabricado por MC Medical Corporation) De manera adicional, se usaron 2MeSAMP o AR-C69931MX, y se usó solución salina fisiológica como solvente que se va a usar para disolver los compuestos. A este respecto, se confirmó en el Ejemplo 5 que 2MeSAMP o AR-C69931MX presentaron una actividad como un antagonista de la proteína HORK3.

Se midió la agregación de plaquetas usando un agregómetro (MCM Hema Tracer 212; MC Medical Corporation). De manera más particular, se incubaron a 37ºC durante 1 minuto PRP (80 \muL) y una muestra (2MeSAMP o AR-C6))31MX) o el solvente (10 \muL), y a continuación se añadieron 10 \muL de ADP (20 a 100 \mumol/L). Se registraron los cambios de luz transmitida durante 10 minutos, y a continuación se calculó una inhibición de la agregación (%) a partir del índice de agregación máxima.

Se muestran en las Figs. 1 y 2, de manera respectiva, los resultados cuando se usaron 2MeSAMP y AR-C69931MX. Se representan los datos para 2MeSAMP (Fig. 1) mediante el "promedio" de los resultados del experimento obtenidos usando dos voluntarios. Se representan los datos para AR-C69931MX (Fig. 2) mediante el "promedio + el error estándar" de los resultados del experimento obtenidos usando tres voluntarios. Ambos agentes inhibieron la agregación de plaquetas inducidas por el ADP dependiente de la concentración. La fuerza inhibidora fue dependiente de la concentración de ADP como inductor.

Es evidente a partir del presente ejemplo que un antagonista de la proteína HORK3 presenta una actividad antiplaquetas.

Aplicabilidad industrial

Una sustancia que inhibe la actividad del receptor P2T_{AC} del ADP de las plaquetas presenta una actividad antiplaquetas, y hace posible tratar trastornos trombóticos.

Por tanto, de acuerdo con la herramienta de selección de la presente invención para un agente antiplaquetas, es posible seleccionar y evaluar un antagonista del receptor P2T_{AC} del ADP de las plaquetas que es útil como un agente antiplaquetas.

Es posible seleccionar un antagonista del receptor P2T_{AC} del ADP de las plaquetas y seleccionar una sustancia que es útil como un agente antiplaquetas, usando el procedimiento de detección del presente procedimiento para un antagonista o agonista, o usando la combinación del procedimiento de detección del ligando de la presente invención y el procedimiento de detección del presente procedimiento para un antagonista o agonista.

Además, es posible fabricar una composición farmacéutica antiplaquetas preparando un medicamento usando la sustancia seleccionada mediante el procedimiento de selección anterior como el ingrediente activo, y vehículos, rellenos, y/u otros aditivos.

Además, es posible usar el procedimiento de detección de la presente invención de un ligando, antagonista, o agonista so sólo para seleccionar la sustancia útil como agente antiplaquetas, sino también como ensayo de control de calidad de la composición farmacéutica antiplaquetas.

Es posible fabricar una composición farmacéutica antiplaquetas por la detección de si un compuesto de ensayo es o no un ligando, antagonista, o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP usando el procedimiento de detección de la presente invención de un ligando, antagonista, o agonista, y a continuación preparando un medicamento usando el antagonista o ligando.

Texto libre en el listado de secuencias

Las características de la "secuencia artificial" se describen con el identificador numérico <223> en el listado de secuencias. De manera más particular, cada oligonucleótido constituido por la secuencia de bases de la SEC. DE ID. Nº: 3 o 4 es una secuencia de cebador artificialmente sintetizada.

Tal como anteriormente, la presente invención se explica con referencia a formas de realización concretas, pero se incluyen en el alcance de la presente invención las modificaciones y mejoras obvias por aquellas personas expertas en la técnica.

<110> Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.

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<120> Procedimiento de selección de agentes antiplaquetas

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<130> YO122-PCT-656

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<150> JP 2000-334721

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<151> 11-01-2001

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<150> JP 2001-3575

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<151> 11-01-2001

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<160> 12

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<210> 1

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<211> 1029

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1029)

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<400> 1

1

2

3

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<210> 2

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<211> 342

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

4

5

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<210> 3

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 3

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cctctagaat gcaagccgtc gacaacctca cctc

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34

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<210> 4

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 4

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cctctagact attacattgg agtctcttca tttg

\hfill

34

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<210> 5

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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gcaagccgtc gacaacc

\hfill

17

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<210> 6

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgattttgta gtctctggtg caca

\hfill

24

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<210> 7

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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cacctctgcg cctggtaaca ccag

\hfill

24

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<210> 8

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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cactgagcgc ggctaca

\hfill

17

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<210> 9

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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cttaatgtca cgcacgattt cc

\hfill

22

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<210> 10

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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cttcaccacc acggccgagc

\hfill

20

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<210> 11

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

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\sa{Asp Cys Gly Leu Phe}

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<210> 12

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

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\sa{Glu Tyr Asn Leu Val}

Claims

1. El uso de

(1): un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº 2.

(2): un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos en la que entre uno y diez aminoácidos están borrados, sustituidos y/o añadidos en la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº 2, y muestran una actividad supresora de una actividad de la adenilato ciclasa por enlace con ADP y acoplamiento con Gi; o

(3): un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con una secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº 2, y muestran una actividad supresora de una actividad de la adenilato ciclasa por enlace en ADP y acoplamiento con Gi como herramienta de selección de un agente antiplaquetas.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la herramienta es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº 2.

3. El uso de un transformante que es transformado con un vector de expresión que comprende un ADN que codifica el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 y que expresa el polipéptido como herramienta de selección de un agente antiplaquetas, en el que el transformante no es un ser humano.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la herramienta es un transformante que es transformado con un vector de expresión que comprende un ADN que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº 2 y que expresa el polipéptido.

5. Un procedimiento para detectar si un compuesto a ensayar es o no un ligando de la P2T_{AC} del receptor de ADP, que comprende las etapas de:

: poner en contacto un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, un resto de membrana transformante que comprende el polipéptido, o un transformante de acuerdo con la reivindicación 3 con el compuesto a ensayar en presencia de un ligando marcado de la P2T_{AC} del receptor de ADP; y

: analizar la variación en la cantidad de ligando marcado que se enlaza con el polipéptido, el resto de membrana transformante, o el transformante.

6. Un procedimiento para detectar si un compuesto a ensayar es o no un agonista o antagonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP, que comprende las etapas de:

: poner en contacto el compuesto a ensayar en contacto con un transformante de acuerdo con la reivindicación 3 que coexpresa una proteína G quimérica que comprende un fragmento de polipéptido que tienen una actividad promotora de una actividad de la fosfolipasa C y un fragmento de polipéptido que tiene una actividad acoplada al receptor de Gi, dicha proteína G quimérica tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC. de ID. Nº 11 en el término C; y

: analizar la variación en concentración intracelular de Ca^{+2} en el transformante.

7. Un procedimiento para detectar si un compuesto a ensayar es o no un agonista o antagonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP, que comprende las etapas de:

: poner en contacto un transformante de acuerdo con la reivindicación 3 con el compuesto a ensayar, en presencia de un agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas; y

: analizar la variación en concentración intracelular de AMPc en el transformante.

8. Un procedimiento para seleccionar un agente antiplaquetas, que comprende las etapas de:

: Detectar si un compuesto a ensayar es un ligando, agonista o antagonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP mediante el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, o una combinación de las mismas; y

: seleccionar el antagonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP.